DE2124123A1

DE2124123A1 - Polynucleotid und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE2124123A1
Application number: DE19712124123
Authority: DE
Inventors: George Peter Hatfield; Tytell Alfred A. Lansdale; Field Arthur Kirk North Wales; Hilleman Maurice Ralph Lafayette Hill; Pa. Lampson (V.St.A.)
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1970-05-15
Filing date: 1971-05-14
Publication date: 1971-12-02
Also published as: AR199872A1; ES391016A1; GB1355516A; IE35215L; NL7105076A; FR2100660B1; ZA712259B; US3666646A; HU164639B; CA985677A; IE35215B1; FR2100660A1; SU421202A3; IL36772A0; NO131754B; BE767190A

Description

Die Erfindung betrifft neue mehrsträngige Polynucletidkomplexe mit interferoninduzierender Wirksamkeit und pharmazeutische Zubereitungen daraus; Verfahren zur Herstellung der Komplexe und Verfahren zur Stimulierung der Produktion von Interferon in lebenden Zellen von Lebewesen unter Verwendung derartiger Komplexe und Zubereitungen. Insbesondere betrifft die Erfindung doppelsträngige Komplexe von Polyriboinosinsäure und Polyriboeytidylsäure (^rI _n ^:rC _n)» wobei die mittlere MoIekulargröiSe der Polyribocytidylsäurekomponenten des
Komplexes wesentlich geringer ist als die der Polyriboinosinsäurekomponenteii,und die durch (a) kontrollierte Synthese der einzelnen Homopolynucleotide, (b) durch kontrollierte Depolymerisation entv/eder von Homopolynucleotiden oder Polynucleotidkomplexen durch Aussetzung derselben- gegenüber Schallbestrahlung oder (c) durch kontrollierte Depolymerisation der Homopolynucleotidpolyribocytidylsäure, indem diese dem Ribonucleaseabbau unterzogen wird, erzeugt werden, wobei derartige rI_n:rC -Komplexe maximale interferonerzeugende Aktivität bei minimaler Toxizität aufweisen.

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Die Erfindung betrifft neue mehrsträngige Polynucleotidkomplexe, welche in lebenden Zellen die Produktion von Interferon induzieren, sowie pharmazeutische Zubereitungen, welche diese Komplexe enthalten. Insbesondere betrifft die Erfindung doppelsträngige Komplexe von Polyriboinosinsäure und Polyribocytidylsäure (rl :rC ) worin die mittlere Molekülgröße der Polyribocytidylsäurekomponenten des Komplexes wesentlich geringer ist als die der Polyriboinosinsaurekomponenten; Verfahren zur Herstellung dieser neuen rl^rC.^ und Verfahren zur Verabreichung dieser neuen rl :rCl·- Komplexe an lebende Zellen von Lebewesen, wodurch die Produktion von Interferon in. diesen Zellen stimuliert wird und die Beständigkeit derartiger Zellen gegenüber Virusinfektion erhöht wird. Diese rI:rC -Komplexe besitzen maximale interferonerzeugende Wirksamkeit bei erheblich herabgesetzter Toxizität.

Interferone sind Polypeptide mit relativ geringem Molekulargewicht, die von lebenden Lebewesenzellen erzeugt werden, wobei die Produktion durch Viren stimuliert wird und wie früher festgestellt, durch Aussetzung gegenüber mehrsträngigen Polynucleotides Die Interferone schützen nichtinfizierte Zellen vor Virusinfektion während längerer Zeiträume, wenn sie vor der Infektion gegeben werden. Sie besitzen ein breites Wirkungsspektrum mit Bezug auf die Virusarten, sind jedoch relativ spezifisch bezüglich der Wirtsart.

Die rI:rC -Komplexe der Erfindung können als Induziermittel für die Interferonerzeugung, entweder in vivo oder in vitro verwendet werden. Die grundlegende Ver-

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13 227 S

wendung besteht entweder in der intranasalen Verabreichung an ein Wirtstier oder einen Menschen oder in der Verabreichung durch Injektion, so daß Interferon in vivo in wesentlichen Mengen erzeugt wird, wobei sie zum Schutz des Wirtes gegen Infektion durch eine Vielzahl von Viren dient. Sie sind auch wertvoll zur Erzeugung von Interferon in Zellkulturen von Zellen lebender Tiere oder Menschen. Das so erzeugte Interferon kann zur Verabreichung an die entsprechende Species zur Erhöhung der Resistenz gegenüber Virusinfektion verwendet werden.

Gemäß der Erfindung wurde festgestellt, daß ^rI_n ^:rC _n~ Komplexe, in denen das mittlere Molekulargewicht der Bestandteile wesentlich herabgesetzt wurde, hohe Wirksamkeit als Induziermittel von Interferon besitzen und gleichzeitig verringerte Toxizität, Diese ^ΓΙ_η ^:Γ^_η-Komplexe mit niedrigem Molekulargewicht werden direkt aus unbehandeltem Komplex hergestellt, indem er einer Schallbestrahlung unterzogen wird. Diese Behandlung erfolgt in einfacher Weise, indem eine Lösung des ^rI_n ^:I>C_n~ Komplexes mit einer Konzentration von etwa 1 mg/ml der Schallbestrahlung ausgesetzt wird, die von einem mit einer 19 mm Sonde versehenen Generator mit einer Leistung von 210 Watt erzeugt wird. Die Schallbestrahlung wird gewöhnlich unter Kühlen und über verschiedene Zeiträume je nach dem Grad der Depolymerisation, den man erreichen möchte, durchgeführt. Beschallungszeiten von etwa 30 Sekunden bis zu etwa 16 Minuten sind gewöhnlich ausreichend, wenn ein Schallgenerator der oben stehenden Leistung verwendet wird.

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13 227 υ

Die Prüfung von rl :r (^-Lösungen, die auf diese V/eise gegenüber Schalltestrahlung ausgesetzt wurden, zeigt, daß zunehmende Zeiträume zu einem etwa exponentiellen Abfall der relativen Viskosität führen. Schai!behandlung über Zeiträume bis zu 16 Minuten, verursachten lediglich eine geringfügige Verringerung der Fähigkeit des abgebauten rI:rC -Komplexes hinsichtlich der Induzierung von Interferon bei Kaninchen, obgleich die Fähigkeit zur Induzierung von Eesistenz gegenüber YSV Virus in Zellkultur und gegenüber PMV Infektion bei Mäusen etwas verringert ist.

Gemäß einer v/eiteren Ausführungsform der Erfindung Zierden rI:rC -Komplexe hergestellt, wobei die einzelnen rl und rC -Bestandteile ein verringertes mittleres Molekulargewicht besitzen. Diese Homopolymeren mit niedrigem Molekulargewicht v/erden in einfacher V/eise durch geregelte enzymatische Polymerisation von Inosindiphosphat und Cytidin^nosphat unter Verwendung von Polynucleotidphosphorylase (PUPase) als enzymatischer Katalysator hergestellt. rC_n-Homopolymere mit relativ niedrigem mittleren Molekulargewicht können durch Abbau von rC_n mit hohem Molekulargewicht mittels Schallbestrahlung, wie vorstehend angegeben, hergestellt werden. rC^-Homopolymeres mit hohem Molekulargewicht wird auch in einfacher Weise durch Behandlung mit Ribonuclease, vorzugsweise Pancreas-Ribonuclease-A abgebaut; somit wird rC_n-Homopolymeres mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 1,9 x 10 und einer relativen Viskosität von 4,1 (Wasser = 1,0) zu teilweise depolymerisiertem rC_n mit einer relativen Viskosität von etwa 1,08 durch 30-minütige Digerierung mit Ribonuclease abgebaut.

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Die folgenden Beispiele erläutern Verfahren zur Durchführung der Erfindung, ohne sie zu "begrenzen.

Beispiel 1

Polyriboinosinsäure: Polyrxbocytidylsaurekomplex (rl :rC ) wird gemäß der US-Patentanmeldung 684 936 hergestellt. Lösungen dieses Komplexes (Volumen etwa 200 ml) mit einer Konzentration von 1 mg/ml werden unter Kühlen über verschiedene Zeiträume einer Schallbestrahlung ausgesetzt, wobei ein Schallgenerator (z.B. ein Biosonic III mit 20 000 Cyclen) verwendet wird, der mit einer 19 mm Sonde ausgestattet ist. Jede der nach verschiedenen Beschallungszeiträumen erhaltenen teilweise depolymerisierten rI:rC -Lösungen wird dann durch die relative Viskosität, den Sedimentationskoeffizienten, das mittlere Molekulargewicht, den Wärmeübergangsmiftelpunkt (Tm ⁰C), den Prozentgehalt an Hyperchromizität, die relative Eibonucleaseempfindlichkeit und das Ultraviolettabsorptionsspektrum, charakterisiert; die erhaltenen Werte^x sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

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	re lative Viskosi tät	^S20,w	Tabelle	Tm ⁰C	chrbmi- zität	relative RNase- Empfind- lichkeit	(265 nyu)
	3,9	21,1		63,5	71,2	100	140
Be schallungs zeit Minuten	2,1	16,9	mittleres Molekular gewicht	62,5	70,7	114	140
0	1,7	13,7	7,8 χ 10⁶	62,0	71,7	115	139
0,5	1,4	11,1	4,2 χ 10⁶	62,5	67,0	117	140
1,0	1,3	9,3	2,3 x 10⁶	61,5	67,0	■ 129	139
3,0	1,2 .	8,5	1,2 r. iO⁶	61,0	62,0	143	139
4,0	1,1	7,9	7,4 χ 10⁵	60,0	59,0	147	143
6,0	1,05	6,7	5,6 χ 10⁵	58,5	49,0	220 ■	145
12,0		4,6 χ 10⁵
16,0	2,8 χ 10⁵

Die relativen Viskositäten werden unter Verwendung eines Viskosimeters (Ostwald) mit einer Strömungszeit von 120 Sekunden mit Wasser bei 25⁰C gemessen. Die Sedimentationskoeffizienten werden unter Verwendung einer mit einem Ultraviolettabtastsystem ausgestatteten Ultrazentrifuge (Spinco-Modell E) bestimmt. Die Molekulargewichte werden unter Anwendung der folgenden empirischen Gleichung berechnet, die den Sedimentationskoeffizienten direkt mit dem Molekulargewicht in Beziehung bringt : Mi₁V = 1,15 x 1θ3 x^29₂q . Die prozentuale Hyperchromizität wird als der Prozentanstieg der optischen Dichte während der thermischen Dissoziierung berechnet. Tm und RNase-Empfindlichkeit werden gemäß der US-Anmeldung 684 936 gemessen.

Beispiel 2

Jedes der teilweise depolymerisierten rI:rC -Produkte (relative Viskosität 1,05 bis 2,1 ), die durch Ultra-

von

Schallbestrahlung, rI:rC -Komplex praktisch v/ie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurden, wird mit dem unbehandelten rI:rC -Komplex (relative Viskosität 3,9) hinsichtlich der Fähigkeit, Interferon in Kaninchen zu induzieren, hinsichtlich der Beeinflussung bei PVM Virusinfektion in lebenden Zellkulturen und hinsichtlich der Indusierung von Resistenz gegenüber PVM Virusinfektion bei Mäusen verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:

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Tabelle·

oo

verwendetes ^rIn^:rCn

Schall- re- ungebe- lative fähres strahlung Viskosi- Molekumin tat large-

wicht

0,5
1,0
3,0
4,0

2,1

1,7

1,4

3,9 7,8 χ 1cr

4,2 χ 1CT

2,3 x 10^c

1,2 χ 10^c

1,3 7,4 x 10-

Interferoninduktion
bei
Kaninchen

Dosis
xi g/Kaninchen

Interf eron-Titer

5
1

>640 320 160 320

Beeinflussung bei PVM in Zellkultur wiÄsame Windestdosis

0,002-0,004

Schutz von Mäusen gegenüber PVM

³^⁰" xx
sis ^xx

κ g/Maus

4,0
1,0
0,25

Überschuß an Überlebenden gegenüber dem unbehandelten Vergleich

94 80 60

90 75 60

47 55 20

75 42 20

50

45

Tabelle (Portsetzung)

verwendetes
^rIn^:rCn

Schall- re- ungebe- lative fähres
strahlung Vis- Moleku
min kosi- largetät wicht ·

12,0

16,0

Vergleich

1,1 4,6 χ 10'

1,05 2,8 χ 10-

Interferoninduktion bei Kaninchen

Dosis Inter- ύχ g/Ka- f eronninchen Titer

>640 320

5.80

<5

^ Beeinflussung bei PVM in Zellkultur wirksame Mindestdosis 'ml

0,008

Schutz von Mäusen gegenüber PVM

f	sis^X3c	Überschuß an
λλ g/Mau s	Überlebenden
	gegenüber dem unbehandelten
4,0	Vergleich
1,0	30
0,25	15
4,0	5
1,0	24
0,25	12
20

0,0

xx

Das Serum aus den einzelnen Kaninchen wird 2 Stunden nach Verabreichung von rI_n:rC gesammelt und auf Interferon nach der Rohrverdünnungsmethode in primären Kaninchennierenzellen unter Verwendung von vesikularem Stomatitisvirus zur Herausforderung geprüft,

Mäuse wurden mit 0,3 ml rI:rC -Lösungen intranasal 3 Stunden vor der intranasalen Infektion mit 30 LD₅₀ an PVM vorbehandelt.

13 227 212^1

Beispiel 3

Eine Lösung des Polynucleotid (rl :rC )-Koraplexes mit einer Konzentration von 1 mg/ml, die durch Schallbestrahlung auf eine relative Viskosität von etwa 1,3 herabgesetzt wurde, wird auf eine mit 4$iger mit Perlen durchsetzte Agarose (Sepharose B) gepackte Kolonne aufgegeben und mit Phosphat-Salzpuffer (0,006 m-Natriumphosphat; 0,15 m-Natriumchlorid; pH=7) verdünnt, wobei Volumenmengen an Eluiermittel (Ve) verwendet werden, die im Überschuß zum Leervolumeh liegen. Neun getrennte Fraktionen aus dieser Chromatographie, die beschallten rl :rC Komplex mit mittleren Molekulargewichten im Bereich von etwa 6,0 χ 10 bis über 10 enthalten, werden bezüglich der Fähigkeit, Kaninchenserum Interferon zu indizieren und hinsichtlich der Beeinflussung mit PVM-Virusinfektion in primären Kaninchennierenzellkulturen geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:

- 10 -

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Tabelle

	I	Fraktion	ge schätztes Molekular gewicht	Dosis je Kaninchen /ig	Kaninchen serum Interferon Titer	Beeinflussung mit PVM in Zellkulturen	VjJ	*	-*-
	Il	1	>10⁶	2	80. 160	r \	PO
		2 ·	6,4 x 10⁵	2	640. 160	io Wirksamkeit, bezogen auf Fraktion 1
		3	4,4 x 10⁵	2	320. v5	100
		4	2,8 χ 10⁵	2	20 80	-.
		5	2,0 χ 10⁵	2	20 20	200
		6 7	1,2 χ 10⁵ 1,0 χ 10⁵	2 Mi	<*5 160	100
O co		8	7,0 χ 10⁴	2,8	<5 <5	100
co		9	6,0 χ 10⁴	-	-	50
co		Ver gleich			<5. <5	-
M99					12,5

Beispiel 4

Lösungen der einzelnen Homopolynucleotid-polyribocytidylsäure rC (S po=⁰/ 2^ ^wer^^en während Zeiträumen von 5 bzw, 15 Minuten Ultraschallbestrahlung' im wesentlichen gemäß den zur Behandlung des rI:rG -Komplexes in obigem Beispiel 1 angewendeten Schallverfahren ausgesetzt. Das unbehandelte rC und das durch Beschallung" erzeugte rC mit niedrigem mittleren Molekulargewicht werden mit rl_n (S_{w 2}o=9 2^ ^{zum Kom}P^lex überführt, und die relativen Viskositäten der erhaltenen rlrrC -Komplexe, ihre Fähigkeit, Interferonerzeugung bei Kaninchen zu induzieren und ihre Fähigkeit, bezüglich der Beständigkeit gegen VSV-Infektion bei Zellkulturen sind in dor folgenden Tabelle aufgeführt:

12 -

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Tabelle

ο co co

	re lative Viskosität ^rIn^:rCn	Induktion von Inter feron bei Kaninchen Dosis η g/ Kaninchen	Interferon Titer	Beeinflussung mit VSV in Zellkulturen minimale Y/irksam- keit Dosis ( ug/ml)
Be- schallungs« zeit Minuten	3,0 1,7	5 1 5 1 -	20 320 10 40 320 640 5 160	0,002-0,004 0,001-002
0 5	1,5		320 640 160 640	0,002-0,004
15

Vergleich (kein Induziermittel)

<5 <5

227 _1H ' 2124173

Beispiel 5

Eine Lösung von r(i (S,, _{on n o}), die 1 mg rC VmI ent-

n Wjiiu—y , c. η

hält, wird mit 0,01 «g/ml Pancreasribonuclease während im Bereich von O.bis 30 Minuten variierenden Zeiträumen behandelt, und die durch Ribonuclease abgebauten rC Fraktionen werden mit unbehandeltem rl (S ?0=9 2^ in äquimolarer Konzentration in einen Komplex überführt. Zugabe von rI -»Lösung inibiert sofort den Abbau von rC durch Ribonuclease. Die relativen Viskositäten, Ultraviolettabsorptionsspektren, Hypochromizitäten und biologischen Versuche der rI_n:rC_n-Komplexe sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

-H-

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	Zeit der rC_n-Be- handlung Minuten	physikalische von rl :rC	248 mxi	Tabelle	biologische Untersuchung von rI_n:rC_n	VSV in Ka- ninchenzell- kuturen wirksame Mindestdosis (^i g/ml)	rela- ^N tive Aktivi-	INS
	0	're lative Viskosi tät	127		bindest- schutz- dosis, PVM bei Mäusen	0,001-0,002	—
	2,5	4,1	131	Untersuchung	1	0,001-0,002	100
	5,0	1,64	136	Hypo- ^N L chromi- zität *	1	0,001-0,002	100
O co	7,5	1,44 .	145	39,7	4	0,002-0,004	50
OD	10,5	1,31	155	38,0	4	0,004-0,008	25
CO	15,0	1,25	167	35,8	4	0,008-0,015	13
	20,0	1,18	179	31,5	>16	0,03-0,06	3,3
CD I CO	30,0	1,12	196	26,7	-	0,13-0,25	0,8
-		1,08	20,8
		15,3
	7,1

Intranasale Mindestdosis in η g/ml, die wenigstens 40$ der behandelten Mäuse gegen sonst tödliche Infektion mit 30 ^₅₀ an PVM schützt.

Verglichen mit der Probe zur Zeit 0.

ro

ro LO

ff

Beispiel 6

Homopolymere rl und rC mit verschiedenen Molekulargrößen werden durch geregelte enzymatische Polymerisation von Inosindiphosphat bzw, Cytidindiphosphat unter Verwendung von Polynucleotid-phosphorylase als Katalysator synthetisiert. Die erhaltenen rl und rC -Homopolymeren mit variierenden Molekulargewichten werden in äquxmolarer Menge mit rC bzw, rl von hohem Molekulargewicht in Komplexe überführt. Die Fähigkeit der so hergestellten Komplexe, Beständigkeit gegen vesikularen stomatitis Virus (VSV) in primären Kaninchennierenzellkultüren zu induzieren und Mäuse gegen pneumonia Virus von Mäusen (PVM) zu schützen, im Vergleich mit ^rI _n ^:rC _n» hergestellt unter Verwendung von Homopolymeren (S pO=9 ' Molekulargewicht sowohl für rl a. der folgenden Tabelle aufgeführt:

Molekulargewicht sowohl für rl als auch rC , sind in

- 16 -

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Tabelle

	³W, 20	r !^-Komponente	mittlere Anzahl an Nucleotid- einheiten	Γ ^Sw,20	rC -Komponente	mittlere Anzahl an Nucleotid- einheiten	relative Aktivität* gegen VSV in Zellkulturen
	9,2	mittleres Molekular gewicht	550	9,2	mittleres Molekular gewicht	560	100 Vergleich
	9,2 9,2	1,9 x 1(r	550 550	4,0 3,0	1,9 x 10⁵·	110 65	Lweniger 100 JrC_n
	• 9,2	1,9 x 10⁵ 1,9 x 10⁵	550		3,7 x 10⁴ 2,1 χ 10⁴	5	TO,05/
109	6,0 3,0	1,9 χ 10⁵	220 60	9,2 9,2	1,7 x 10⁵	560 560	20-50) c sweniger ⁵ irl
CD 1	—	7,8 χ 10⁴ 2,1 χ 10⁴	3	9,2	1,9 x 10⁵ 1,9 x 10⁵	560	0 J ⁿ
CO-J ^21 co		1,1 χ 10⁵			1,9 x 10⁵
co

Prozentuale Aktivität, verglichen mit dem Vergleich ^Γ*_η ^:Γ(3_η»

dem jede Komponente S

w,

aufwies.

Tabelle

	■	I	Sedimentations koeffizient ^rIn ^rCn	Schutz von	Mäusen gegen PVM-Infekti.on	Überschuß an Überlebenden in io gegenüber Vergleich	VjJ ro
		OQ I	9,2 9,2	Dosis λχg/Maus	Anzahl der Ge~ samtüberlebenden	88,3 78,3 78,3	ro
			9,2 3,0	4 1 0,25	1 9/20 17/20 7/20	87,5 78,3 68,3
O CQ			3,0 9,2	4 1 0,25	16/19 17/20 15/20	33,3 18,3 3,3
OO co		3,0 3,0 Vergleich	4· 0,25	8/20 5/20 2/20	23,3 18,3 0
1994		4 1 0,25 0	6/20 5/20 1/20 4/60

Beispiel 7

Zu 250 ml einer 1 mg/ml rC (S,_{r O}n_o o) enthaltenden lösung in Phosphat-Salzpuffer (PBS), der 0,006 m-Phosphat, 0,15 m-Natriumchlorid und einen pH-Wert von 7,0 aufweist, wird 0,1 ml einer 0,25 jug Pancreas-Ribonuclease-A enthaltenden Lösung zugegeben. Die Lösung wird gründlich gemischt, und man läßt die enzymatische Digerierung während eines Zeitraums von etwa 90 Minuten fortschreiten, wobei eine Lösung von abgebautem rC_n(S_{w 20=2} c) erhalten wird. Etwa 250 ml einer Lösung, die 1,07 mg/ml homopolymeres rl_n mit hohem Molekulargewicht in PBS enthält, werden direkt zu der abgebauten rC_n-Lösung (die Ribonucleaseenzym enthält) gegeben, und die Lösung wird gründlich vermischt, wodurch die Ribonucleasewirksamkeit unterdrückt und der Komplex aus rl und abgebautem rC gebildet wird,

2 Volumen kaltes (-20⁰C) absolutes Äthanol werden zu der den Komplex aus rl und abgebautem rC enthaltenden Lösung gegeben, »an läßt das Gemisch etwa 15 Stunden bei -20⁰C stehen, und das ausgefällte Material wird durch Zentrifugieren gewonnen, mit 200 ml Äthanol gewaschen und getrocknet, und man erhält etwa 500 mg rl_n* abgebautes rC_n-Komplex als eine weiße faserförmige Masse. .

Letzteres Material (das sich auf. etwa 500 mg beläuft) wird in 100 ml PBS-Löaung gelöst, und 0,1 ml 0,1 m-Lösung wird zugegeben (Endkonzentration 0,01 mwobei sich eine Lösung ergibt, die etwa 5 mg/ml rl :rC Komplex enthält. Die Fähigkeit dieses, das abgebaute rC_n enthaltenden Komplexes hinsichtlich des Schutzes von Mäusen gegen FVM-Infektion im Vergleich mit rl :rC , das unter Verwendung sowohl von rl als auch rC mit hohem Molekulargewicht hergestellt wurde^und die relativen Toxizitäten der beiden Komplexe sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:

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■Ε-CD

Tabelle

Schutz von Mäusen "gegen PVM-Infektion

ro O

Komplex aus rl von hohem

Molekulargewicht mit

abgebautes rC

rC mit hohem Molekulargewicht

Vergleich (PBS)

Gesamtdosis

^rIn^:rCn η g/Maus

4 1

0,25

4 1 0,25

Anzahl überlebender behandelter Tiere

15/20

16/20

8/20

13/20

16/20 9/20

3/60

Überlebende in fo gegen«* über Vergleich

70 75 35

60 75 40

Toxizität

Gesamt
dosis

mg/Maus

0,5

0,25

0,5
0,25
0,125
0,063

Anzahl überlebender behandelter Tiere

20/25 25/25 25/25 25/25

ungefährer

We rt mg/kg

30,4

ro ro -j

4,65

Es sei darauf hingewiesen, daß der Komplex aus rl und abgebautem rC im Vergleich mit dem Komplex aus rl von hohem Molekulargewicht und rC die Fähigkeit der Antivirenwirtsresistenz gegen PVM in Mäusen unvermindert beibehält, jedoch eine signifikante Herabsetzung der Toxizität zeigt. Die aus diesen Daten berechneten LD^Q-Werte zeigen einen günstigen Vorteil von etwa dem 6,5-fachen für den Komplex aus rl_n: abgebautem rC gegenüber dem Material mit hohem Molekulargewicht, während die Wirksamkeiten als Induziermittel der Wirtsresistenz etwa gleich sind.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung eines mehrsträngigen Polynucleotide, das sich durch interferoninduzierende Wirksamkeit mit herabgesetzter Toxizität auszeichnet, dadurch gekennzeichnet, daß ein Homopolynucleotid mit wenigstens 500 Nucleotideinheiten in einen Komplex überführt wird.

2, Verfahren zur Herstellung eines rlrrC -Komplexes, der sich durch interferoninduzierende Wirksamkeit bei herabgesetzter loxizität auszeichnet, dadurch gekennzeichnet, daß rl_n mit wenigstens 500 Kucleotideinheiten mit rC von weniger als 100 Uucleotidein'-heiten in einen Komplex überführt wird.

3, Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Sedimentationskoeffizient von rl_n oberhalb 9,2 und der Sedimentationskoeffizient von rC zwischen etwa 2,5 und 4,0 liegt und der erhaltene Komplex rI_n:rC_n verminderte Toxizität und praktisch unverminderte interferoninduzierende Wirksamkeit besitzt.

Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus Homopolynucleotideinheiten mit hohem Molekulargewicht aufgebautes mehrsträngiges Polynucleotid unter Bildung eines mehrsträngigen Polynucleotide Schallbestrahlung ausgesetzt wird, wobei das Polynucleotid Homopolynucleotideinheiten mit wesentlich vermindertem mittleren Molekulargewicht aufweist und sich durch interferoninduzierenden Wirksamkeit bei herabgesetzter Toxizität auszeichnet.

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5. Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß ein rI_n:rC_n-Komplex unter Bildung eines rI:rC -Komplexes, der sich durch einen Gehalt an rl_n und rC^-Homopolymereinheiten mit vermindertem mittleren Molekulargewicht auszeichnet und ferner durch unverminderte interferoninduzierende Wirksamkeit bei herabgesetzter Toxizität gekennzeichnet ist, einer Schallbestrahlung unterworfen wird.

6. Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß ein rC_n-Homopolymeres unter Bildung des entsprechenden rC_n mit vermindertem mittleren Molekulargewicht einer Ultraschallbestrahlung ausgesetzt wird.

7· Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß ein rC -Homo-> polymeres der Einwirkung von Ribonuclease unter Bildung von rO -mit verr:
unterzogen wird·

von rO -mit verringertem mittleren Molekulargewicht

8. Verfahren zur Herstellung von rC_n-Homopolymerem mit relativ geringem mittleren Molekulargewicht, dadurch gekennzeichnet, daß Cytidindiphosphat geregelter enzymatischer Polymerisation unter Verwendung von Polynueleotid-phosphoryla3e als enzymatischer Katalysator unterworfen wird.

9# Verfahren zur Anregung der Erzeugung von Interferon in lebenden Zellen von Lebewesen, dadurch gekennzeichnet, daß an die Zellen rI:rC -Komplex verabreicht wird, wobei die rl -Komponente des Komplexes wenigstens etwa 500 Nucleotideinheiten und die rC_n-Komponente weniger als etwa 100 Nucleotideinheiten enthält.

- 23 -

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227 ■ 212^2-'

10. Verfahren zur Stimulierung der Erzeugung von

Interferon in lebenden Zellen von Lebewesen unter Steigerung ihrer Resistenz gegenüber Vireninfektion, dadurch gekennzeichnet, daß an die Zellen ^ΓΙ_η ^:3?^_η~ Komplex verabreicht wird, intern die rl -Komponente

einen Sediraentationskoeffizienten über etwa 9,2 und die rC -Komponente einen SedimentationskoefJ zienten zwischen etwa 2,5 und 4,0 besitzen.

11. Mehrsträngiges Polynucleotid, gekennzeichnet durch interferoninduzierende Wirksamkeit bei verminderter Toxizität, wobei der Komplex zwei Homopolynucleotide aufweist, von denen eines wenigstens 500 Nucleotideinheiten und das andere weniger als derartige Einheiten enthält.

12. rI_n:rC_n-Komplex, gekennzeichnet durch interferoninduzierende Wirksamkeit bei verminderter Toxizität, wobei die rI_n~Komponente des Komplexes wenigstens 500 Nucleotideinheiten und die rC -Komponente weniger als 100 Nucleotideinheiten enthält.

13. rI:rC -Komplex, gekennzeichnet durch unverminderte interferoninduzierende Wirksamkeit bei herabgesetzter Toxizität, wobei die rI_n~Komponente des Komplexes einen Sedimentationskoeffizienten über etwa 9,2 und die rC_n-Komponente einen Sedimentationskoef fizienten zwischen etwa 2,5 und 4,0 besitzen.

109849/1994

ORIGHNAL