SU421202A3 - Способ получения комплексных полинуклеотидов - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к области медицины и касаетс  получени  ирепаратов комплексных полинуклеотидов.

Известен сиособ Получени  комплексных полинуклеотидов из поли С и поли I путем их соединени  в чувствительной системе.

Однако препарат, получепный таким способом , обладает повышенной токсич1 остью и пониженной интерферониндуцируюпдей способностью .

Предлагаемый способ отличаетс  тем, что поли С и поли I до соединени  или после образовани  комплекса обрабатывают рибонуклеазой или ультразвуком. Пример 1. Растворы комплексного соед :НеПИЯ -ПОЛИрибоИНОЗИНОВОЙ кислоты (ПОЛ1ФИбоцитндилова  кислота rIn:rCn); объемом приблизительно 200 мл и концептрацпей 1 мг/мл подвергают при охлаждении действию звукового излучсн 1  в течение различных периодов времени, использу  дл  этого генера0 тор звукового излучени .

Результаты обработки приведены в табл. 1.

Т а б л II ц а 1

3

Пример 2. Каждый из частично деполимеризовсншых продуктов г1„ : гС (с относительными в зкост ми 1,05-2,1), лолучеппых в результате действи  звукового излучеи.и  на комплексное соединение г1п : гСп, сравнив ют

с необработанным комплексным соединением г1|, : гС„, имеюндим относительную в зкость 3,9.

Результаты опыта приведены в табл. 2.

Таблица 2

Пример 3. Раствор полинуклеотидного комилеконого соединени  (г1„ : гСц) концентрацией 1 мг/мл подвергают действию звукового излучени  до относительной в зкости 1,3, пропускают через колонку, заполненную 4%-ной агаровой в виде шаровидных частиц (Сефароза В.), и элюируют сульфатно-сол ным буфериым раствороам (0,006 М фосфата натри , 0,15 М хлорида натри , рП 7), использу  объем элюата (Ve), избыточный по отношепию к объему пор (Vo).

В результате такого хроматографического разделени  получают дев ть отдельных фракций , которые после действи  звукового излучени  включают комплексное соединение г1„ : гСп, имеющее средний молекул рный вес п пределах от 6,0X10 до более 10. Результаты опыта приведены в табл. 3.

Пример 4. Растворы отдельных гомополинуклеотидных полирибоцитидиловых кислот гСп (Sw, 20 9,2) подвергают действию звукового излучени  в течение 5-15 мин. Необработанна  rlj, и гСц, имеюща  более низкий молекул рный вес, полученна  ,в результате действи  звукового излучени , образуют комплекс с соединением rin (Sw, 20 9,2).

Результаты опыта представлены в табл, 4.

Пример 5. Раствор гСп (Sw, 20 9,2), содержащий 1 мг гСп на 1 мл, обрабатывают панкреатической рибонуклеазой концентрацией 0,01 мкг/мл в течение О-30 мин и фракции гСп, .полученные при разложении рнбонуклеазой , образуют комплексное соединение

) Минимальна  доза (в мкг/мл), котора  защищает не .менее 40% обработанных мышей от неизбежного заражени  вирусной пневмонией, SOLDjo ) Приводитс  сравнение с нулевой пробой.

Таблица 3

Таблица 4

с необработанной rin (Sw, 20 9,2) в эквимол рных количествах. (Добавление раствора г1„ тотчас же прекращает разложение гСп под действием рибонуклеазы).

Результаты опыта сведены в табл. 5.

Таблица 5

Пример 6. Гомополимеры различных молекул рных весов rill и гСц синтезируют носредством регулируемой ферментативной ноли .мериза 1,ии дифоофата инозина и дифосфата цитидииа, Соответственно, использу  в качестве катализатора полинужлеотидпую фосфоПример 7. К 250 мл раствора, содержащего 1 мг/мл rCji (Sw, 20 - 9,2) в фосфатносол ном буферном раство)е, состо щем из 0,006 М фосфата, 0,15 М хлорида натри  имеющего рН 7,0 добавл ют 0,1 мл раствора, содержащего 0,25 мкг панкраагнческон рпбонуклеазы А. Этот раствор тщательно неремещик;ают и подвергают ферментативно обработке Е; течение -примерно 90 мин, в результате чего получают соединение гС,, (, 20-2,5). Примерно 250 мл раствора, содержап1 го 1.07 мг/-л вы-сокомолекул рного гомополимера г1п в фо.сфатно-сол ном буферном растворе добавл ют непосредственно к раствору разложившегос  полимера гСп (содержащего эпзим

рилазу. Полученные в результате томополнмеры Iln н гС„ различных молекул рных весов образуют комнлексные соединени  в эквимол рных количес1вах с высокомолекул рными полимерами гС;, н г1„, соответственно. Резул1/гаты опыта сведены и табл. (i и 7.

Т а б л II U а 6

Таблица 7

рнбонуклеазы), и тщательно перемешивают, в 1)езу.т1/гатс чего очень быстро ослабл етс  акчИВНость рибонуклеазы и образуетс  комплексное соедннение г1п и разложивн егос  гСд. К раствору, содержаще.му комплексное соеди11ение г1ц разложпвп1И 1с  гС„, добавл ют двойные объемы охлажденного (до --20°С) абсолютного эта)1ола, н эту с.месь выдерживают в течение приблизительно 15 час при температуре -20°С, осадок отдел ют центрифугированием, промывают 200 м.л этанола и высущивают, в результате чего получаетс  приблизительно 500 мг соедннепп  ripj разложивщийс  гС в виде белой волокнистой .массы.

9

Эту волокнистую массу (в количестве примерно 500 мг) раствор ют в 100 мл фосфатносол ного буферного раствора, и добавл ют к ней 0,1 мл 0,1 М раствора MgCl2 («конечна  концентраци  0,01 М MgCla), в результате чего получаетс  раствор, содержащий примерно 5 мг/мл комплексного соединени  г1„ : гСп. Способность этого соединени , содержащего

Следует отметить, что по сравнению с высокомолекул рным комплексным соединением rin:гСп комплексное соединение rln (разложившийс  тСп) сохран ет неизменную невоспреимчивость к заражению вирусной пневмонией мышей, но значительно снижает токсичность . Данные, рассчитаиные по LD, показывают значительное преимущество примерно в 6,5 раз (в отношении токсичности) комплексного соединени  rln (разложившийс  гСп по сравнению с высокомолекул рным комплексным соединением), в то врем  как активно10

разложившийс  гСп защищать мышей от инфекционного заражени  вирусной пневмонией по сравнению с соединением гЬ, : гСп, полученным при использованин высокомолекул рных гомополимеров как г1„, так и гС,,, а также сравнительные токсичности этих двух комПлексных соединений, приведены в табл. 8.

Таблица 8

сти этих соединений как возбудителей интерферона почти одинаковы.

Предмет изобретени 

Способ получени  комплексных полинуклеотидов путем соединени  поли С и поли I в чувствительной системе, отличающийс  тем, что, с целью снижени  токсичности и повышени  интерферониндуцирующей способности , поли С и поли I до соединени  или после образовани  комплекса обрабатывают рибонуклеазой или ультразвуком.