NO131754B - - Google Patents

Description

Interferoner er polypeptider med relativt lav molekylvekt som produseres av levende dyreceller, hvilken produksjon stimuleres av viruser, og ved å utsettes for flerstrengede polynucleotider. Interferonene beskytter uinfiserte celler mot virusinfeksjon i lengre tid når gitt før infeksjon. De er bredspektret med hensyn til virusarter, men er relativt vertsart-spesifikke.

r i :rCn~kompleksene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, kan anvendes for å bevirke interferonproduksjon, enten in vivo eller in vitro. Hovedanvendelsen er for administrasjon, enten intranasalt eller ved injeksjon, til et vertsdyr eller menneske slik at interferon dannes in vivo i betraktelige mengder, hvorved det tjener til å beskytte verten mot infeksjon av forskjellige virus.

Det er også verdifullt ved fremstilling av interferon i cellekulturer av levende dyre- eller menneskeceller og det således dannede interferon kan anvendes for administrasjon til de tilsvar-ende arter for å øke resistensen mot virusinfeksjon.

I henhold til foreliggende oppfinnelse har ri^:rCn-komplekser hvori de gjennomsnittlige molekylvekter av komponentene er blitt betraktelig redusert, vist seg å ha høy aktivitet som frembringere av interferon, og har samtidig nedsatt toksisitet. Slike lavmole-kylære ri :rCn-komplekser fremstilles direkte fra ubehandlet kompleks ved å utsette dette for lydbestråling. Slik behandling utføres bekvemt ved å utsette en oppløsning av r±n:rCn-komplekset i en konsentrasjon på ca. 1 mg/ml for lydbestråling frembrakt av en generator utstyrt med en 20 mm sonde og med 210 W effekt. Lydbe-strålingen utføres vanligvis under avkjøling i forskjellige tidslengder avhengig av graden av depolymerisering som det ønskes å oppnå. Lydbestrålingstider fra ca. 30 sekunder opptil ca. 16 minutter er vanligvis tilstrekkelige ved anvendelse av en lydgenerator av ovennevnte effekt.

Undersøkelse av rin:rCn~oppløsninger som således har vært ut-satt for lydbestråling, viser at økende tider fører til ca. eks-ponential nedsettelse i relativ viskositet. Lydbestrålinger i tider opptil 16 minutter bevirket bare en liten minskning i evnen hos det nedbygde r±n: rCn-kompleks til å frembringe interferon i kaniner,, skjønt evnen til å bevirke resistens mot VSV-virus i cellekultur, og mot PMV-infeksjon i mus, er noe nedsatt.

I henhold til en annen side av oppfinnelsen fremstilles rIn:rCn-komplekser i hvilke de individuelle rin~ og rCn-komponenter har redusert gjennomsnittsmolekylvekt. Disse laveremolekylære homopolymerer fremstilles bekvemt ved regulert enzymatisk polymerisasjon av inosin-difosfat og cytidin-difosfat under anvendelse av polynucleotid-fosforylase (PNPase) som den enzymatiske katalysator. Alternativt kan rCn-homopolymerer av relativt lav gjennomsnittsmolekylvekt fremstilles ved å nedbygge høymolekylær rCn ved hjelp av lydbestråling som beskrevet ovenfor. Høymolekylær rCn-homopolymer nedbygges også bekvemt ved behandling med ribonuclease, fortrinns-vis pancreatisk ribonuclease-A- således nedbygges rC n-homopolymer med en gjennomsnittsmolekylvekt på ca. 1,9 x 10 5 , og nrelativ viskositet £f,l (vann = 1,0), til delvis depolymerisert rCn med en relativ viskositet på ca. 1,08 ved 30 minutters oppslutning med ribonuclease.

Eksempel 1

Oppløsninger av polyriboinosinsyre:polyribocytidy1syre - kompleks (ri :rCn) (ca. 200 ml

volum) med en konsentrasjon på 1 mg/ml utsettes under kjøling i forskjellige tidslengder for lydbestråling under anvendelse av en lydgenerator (som en 20.000 cycler "Biosonic III") forsynt med en 20 mm sonde med 210 W effekt. Hver av de delvis depolymeriserte ri :rCn-oppløsninger erholdt efter forskjellige lydbestrålingstider bestemmes så med hensyn på relativ viskositet, sedimenterings-koeffisient, gjennomsnittlig molekylvekt, termisk omvandlingsmidt-punkt (Tm°C), prosent hyperkromisitet, relativ ribonuclease-sensibilitet og ultrafiolette absorpsjonsspektra, og de erholdte verdier er angitt i den efterfølgende tabell.

Relative viskositeter måles under anvendelse av et viskosi-meter (Ostwald) med en strømningstid på 120 sekunder med vann av 25°C. Sedimenteringskoeffisienter bestemmes under anvendelse av en ultrasentrifuge ("Spinco Model E") forsynt med et avsøkende ultra-fiolett system. Molekylvekter beregnes under anvendelse av følgende empiriske ligning som setter sedimenteringskoeffisienten direkte i forhold txl molekylvekt: Mv = 1,15 x 10J ■3 x S 2 0' Q. Prosent hyperkromisitet beregnes som den prosentvise økning i optisk tetthet under termisk dissosiasjon. Tm og RNase-sensibilitet måles,

Eksempel 2

Hver av de delvis depolymeriserte ri n :rCn~produkter (relative viskositeter 1,05 til 2,1) erholdt ved lydbestråling av r±n:rCn-kompleks i det vesentlige som beskrevet i eksempel 1, sammenlignes med ubehandlet r±n:rCn-kompleks (relativ viskositet 3,9) på evnen til å frembringe interferon i kaniner, på interferens med PVM-virusinfeksjon i levende cellekulturer og på frembringelse av resistens overfor PVM-virusinfeksjon i mus. De erholdte resultater er angitt i den følgende tabell: A Serum fra de individuelle kaniner ble oppsamlet 2 timer efter administrasjon av rIn:rCn, og ble undersøkt på interferon ved rør-fortynningsmetoden i primære kaninnyreceller under anvendelse av stomatitis-virus fra blærer som utfordring.

Mus forbehandles med 0,3 ml r In: rCn-oppløsnmger intranasalt

3 timer før intranasal infeksjon med 30 LD^q <p>vm-

Eksempel 3

En oppløsning av polynucleotid (rIn:rCn)-kompleks med en konsentrasjon på 1 mg/ml, som er redusert ved lydbestråling til en relativ viskositet på ca. 1,3, påføres på en kolonne pakket med k% perleformig agarose ("Sepharose B") og elueres med fosfat-koksaltpuffer (0,006m natriumfosfat, 0,l5M natriumklorid, pH = 7), under anvendelse av eluantvolumer (Ve) som er i overskudd over tomroms-volumet (Vo). 9 adskilte fraksjoner fra denne kromatografi, som inneholder lydbehandlet rI :rCn-kompleks med gjennomsnittsmolekyl-vekter fra ca. 6,0 x lcA til over 10^, prøves på evnen til å frembringe kaninseruminterferon , og på påvirkning av PVM-virusinfeksjon i primære kaninnyrecellekulturer. Resultatene er angitt i følgende tabell:

Eksempel 4

Oppløsninger av den individuelle homopolynucleotid-polyribocytidylsyre, rCn (Sw 2Q_^ 2), underkastes lydbestråling i hhv. 5 og 15 minutter, i det vesentlige ved bestrålingsmetoden anvendt for å behandle ri n :rC n -komp c leks i eksempel 1. Den ubehandlede rC n, og den rCn med lavere gjennomsnittsmolekylvekt fremstilt ved lydbe-handling kompleksdannes med rln (Sw 2o=9 2) ' og de relative viskositeter av de erholdte ri n :rC n -komp c lekser, ' deres evne til å bevirke interferonproduksjon i kaniner og deres evne til å motvirke VSV-infeksjon i cellekulturer er angitt i den følgende tabell:

Eksempel 5

En oppløsning av rC (S „ ~) inneholdende 1 mg rC /ml be-

n x w,zo=y,^ n

handles med 0,01 [ag/ml pancreatisk ribonuclease i tider varierende fra O til 30 minutter, og de ribonuclease-avbyggede rC -fraksjoner kompleksdannes med ubehandlet r I (S „ „) i ekvimolar konsen-

n v w,^0=9,2'

trasjon. (Tilsetning av ri -oppløsning straks inhiberer avbygningen av rCn av ribonuclease.) De relative viskositeter, ultrafiolette absorpsjonsspektra, hypokromisiteter og biologiske bestemmelser av rln:rCn-kompleksene er angitt i den følgende tabell:

Eksempel 6

Forskjellige molekylstørrelser av homopolymerer, rln og rCn, ble fremstilt ved regulert enzymatisk polymerisasjon av hhv. inosin-difosfat og cytidin-difosfat under anvendelse av polynucleotid-fosforylase som katalysator. De erholdte ri n - og rC n-homopolymerer av varierende molekylvekt ble kompleksbundet med ekvimolare mengder av hhv. høymoleky' lær rC og 3 ri n. Evnene av de således dannede komplekser til å bevirke motstandsdyktighet mot vesikulær stomatitis-virus (VSV) i primære kaninnyrecellekulturer, og å beskytte mus mot pneumoniavirus for mus (PVM), sammenlignet med rIn:rCn fremstilt under anvendelse av høymolekylære homopolymerer (Sw 20=9 2^ "for D^de ri og rCn, er angitt i de følgende tabeller:

Eksempel 7

Til 250 ml av en oppløsning inneholdende 1 mg/ml rCn(Sw2o=92) i fosfat-koksaltpuffer (PBS) inneholdende 0,006m fosfat, 0.15M natriumklorid og med pH 7,0, tilsettes 0,1 ml av en oppløsning inneholdende 0,25 \ ig pancreatisk ribonuclease-A. Oppløsningen blandes omhyggelig, den enzymatiske oppslutning får lov til å foregå i ca. 90 minutter for å få en oppløsning av nedbygget rCn(Sw 2q_2 5^' Ca. 250 ml av en oppløsning inneholdende 1,07 mg/ml høymolekylær homopolymer rln i PBS tilsettes direkte til den nedbygde rCn~opp-løsning (inneholdende ribonucleaseenzym), og oppløsningen blandes omhyggelig, hvorved ribonucleaseaktiviteten ødelegges, og der dannes komplekset av rl^ og nedbygget rCn. 2 volum kold (-20°C) absolutt ethanol tilsettes til oppløs-ningen inneholdende rl^: nedbygget rCn-komplekset, og blandingen hensettes i ca. 15 timer ved -20°C, og det utfelte materiale ut-vinnes ved sentrifugering, vaskes med 200 ml ethanol og tørres, hvorved man får ca. 500 mg rln= nedbygget rCn som en hvit, fibrøs masse.

Sistnevnte materiale (utgjørende ca. 500 mg) oppløses i

100 ml PBS-oppløsning, og 0,1 ml 0,lM MgCl2-oppløsning tilsettes (sluttkonsentrasjon 0,01M magnesiumklorid), for å få en oppløsning inneholdende ca. 5 mg/ml r 1^:rCn-kompleks. Evnen av dette kompleks

inneholdende det nedbyggede rC til å beskytte mus mot PVM-infeksjon, sammenlianet med ri :rC fremstilt under anvendelse av høyrnole-

n n

kylære homopolymerer for både ri n og rCn, og de relative toksisi-teter av de to komplekser, er angitt i følgende tabell:

Det vil sees at sammenlignet med høymolekylvekts-rl^:rCn~ kompleks, bibeholder rI^-nedbygget rCn-kompleks, uforandret den antivirale vertsresistens-virkning mot PVM i mus, men viser en betraktelig nedsettelse i toksisitet. ld^q beregnet fra disse data viser en gunstig økning på ca. 6,5 ganger for r1^:nedbygget rCn over det høy-MV-materiale, mens aktivitetene som frembringere av vertsresistens er omtrent like.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av dobbeltstrengede komplekser av polyriboinosinsyre (rIn) °9 polyribocytidylsyre ( TCn) med betraktelig redusert gjennomsnittlig molekylvekt av komponentene med i det vesentlige uforminsket interferonfrembringende aktivitet, men nedsatt toksisitet, karakterisert ved at enten a) et normalt r I :rCn-kompleks utsettes for lydbestråling eller b) der foretaes regulert enzymatisk polymerisasjon av inosin-difosfat og cytidin-difosfat under anvendelse av polynucleotid-fosforylase som enzymatisk katalysator.