DE2262449A1

DE2262449A1 - Divinylaether-maleinsaeureanhydrid-copolymerisate

Info

Publication number: DE2262449A1
Application number: DE2262449A
Authority: DE
Inventors: David Samuel Breslow
Original assignee: Hercules LLC
Current assignee: Hercules LLC
Priority date: 1971-12-22
Filing date: 1972-12-20
Publication date: 1973-07-05
Also published as: DE2262449B2; CH567532A5; CA987590A; FR2164735A1; US3794622A; DE2262449C3; GB1412290A; JPS4885675A; FR2164735B1; IT971966B; JPS5842202B2

Description

Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-Copolymerisate

Die Erfindung betrifft ein festes zyklisches Copolymerisat aus Divinyläther und Maleinsäureanhydrid in Form einer Zusammensetzung mit einem bestimmten Molekulargewichtsbereich und Molekülbaugruppen, die sich vom Divinyläther und Maleinsäureanhydrid im Verhältnis 1 : 2 ableiten,sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Copolymerisate aus Divinyläther und Maleinsäureanhydrid
sind bekannt und in der US-PS 3 224 943 als auf bösartige

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Tuinore wachstumshemmend wirkend beschrieben. In der US-i^S 3 624 218 sind diese Copolymerisate ausserdem als Mittel zur Bekämpfung des Maul- und Klauenseuchenvirus beschrieben. Obwohl die im Stand der Technik beschriebenen Copolymerisate als wirksame Mittel gegen Tumore und Viren bekannt sind, sind sie doch noch nicht als Arzneimittel im Handel erhältlich, was auf eine Reihe unerwünschter Nebeneffekte zurückzuführen ist. Zu diesen unerwünschten Nebeneffekten gehören vor allem eine akute Toxizität, die Sensibilisierung von Endotoxinen, die Auslösung von Anämie und eine Unterdrückung des Metabolismus.

Es ist dementsprechend die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes festes zyklisches Copolymerisat aus Divinyläther und Maleinsäureanhydrid zur Verfügung zu stellen, das die vorstehend genannten Nachteile nicht aufweist und dennoch wirksam zur Tumorbekämpfung und Virusbekämpfung eingesetzt v/erden kann.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäss ein festes zyklisches Copolymerisat der erwähnten Art vorgeschlagen, das durch ein Zahlenmittel-Molekulargewicht von 5000 bis 30 000 und ein Verhältnis ^L/M von 1,0 bis 3,0 gekennzeichnet ist.

Zur Herstellung dieser Copolymerisate wird erfindungsgemäss vorgeschlagen, dass man zur Diskriminierung zwischen Polymerisaten mit niedrigerem und höherem Molekulargewicht diese selektiv behandelt, und zwar in der Weise, dass man so nach der Anzahl der Molekülbaugruppen im CopolymerisatmolekUl selektiert, dass man ein Produkt mit einem Zahlenmittel-Molekulargewicht von 5000 - 30 000 und ein Verhältnis ^M_n von 1,0 - 3,0 erhält.

Das Prinzip der Erfindung beruht also darauf, dass die Eigen-

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schäften der Polymerisate der eingangs erwähnten Art wesentlich verbessert werden können, wenn man ein Material mit einem engen Holekulargewiclitsbereich und mit einer engen Molekulargewichtsverteilung auswählt. Alle nach dem Stand der Technik bekannt gewordenen Polymerisate sind im wesentlichen Mischungen mit einem breiten Molekulargewichtsverteilungsspektrum, das sich von flüssigen oder halbfesten Copolymerisäten mit einem sehr niedrigen Molekulargewicht bis zu festen Copolymerisaten mit einem durchaus recht hohen Molekulargewicht erstreckt. In diesem breiten Molekulargewichtsspektrum können in den Copolymerisatmischungen einzelne Copolymerisatmoleküle auftreten, deren Molekulargewicht nur einige 100 beträgt, und können am anderen Ende der Skala' Moleküle mit einem Molekulargewicht von einigen 100 000 auftreten. Das Verhältnis KL zu M kann bis zu 7 oder darüber betragen. Beim Fraktionieren derart breiter Gemische können sogar einzelne Fraktionen mit noch grösseren Verhältnissen

11 ,/1'1^, erhalten werden, w η

Die Copolymerisate- gemäss der Erfindung weisen zur Behandlung des festen EHRLICH-Tumors und des Encephalomyocarditisvirus gleiche oder bessere Wirksamkeit auf als die Copolymerisate nach dem Stand der Technik, sind aber im Vergleich zu diesen vor allem sehr viel weniger akut toxisch, sensibilisieren Endotoxine in weit geringerem Mass, verursachen kaum noch Anämie, weisen geringere Serumspiegel an Glutaminpyruvattransaininase auf und unterdrücken in- weit -geringerem Mass den Aminopyrenmetabolismus. Zusätzlich zu diesen wesentlichen Verbesserungen führen die Copolymerisate gemäss der Erfindung auch zu einem geringeren Körpergewichtsverlust, verursachen nur in wesentlich verringertem Ausmass eine Organvergrösserung, insbesondere im Hinblick 'auf die Leber, die Lungen und die Milz, und lösen eine Unterdrückung der Phagocytosis in nur sehr viel geringerem Mass aus.

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Vorzugsweise liegt das Zahlei^ittel-Moiekulargwleht Copolymerisate gemäss der Erfindung 1© Bereich von 10 000 25 000. Das Verhältnis H^ZM_n liegt vorzugsweise zwischen- 1_r und 2,5* Weiterhin sollte vorzugsweise ©it.zunehmende» mittleren Molekulargewicht der Wolekulargewi.chtsv^rtfiiwnge* bereich enger werden. Die erfindungsgemlseen Copolymerisate sind nach der Hydrolyse wasserlöslich·

Die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung g#na»nt#!i Zahlenmittel-Molekulargewichte werden aeffibranpsüOiaetriecti bei 30 '⁰C in einem Hochgeschwindigkeits-f-iefflbranosffloetter water Verwendung von Tetrahydrofuran als Lösungsmittel W-d deacetylierten Acetylcellulos« als Membran bestimmt*

Das Verhältnis \A\ ist ein Mass für die verteilung. In diesem Verhältnis bedeutet M^ .4a* mittel des Molekulargewichts und M_n das Zahlenffli kulargewicht. Beide werden mit dem Methylester der Polymerisate gelchromatographisch bestimmt. Zu dieser Bestimmung des Verhältnisses M^/M werden die Methylesterprobe» in Tetrahydrofuran gelöst und durch ein 10 /ua-Cilter in einen Geldiffusionschromatographen injiziert, der mit einer Bank von vier Styrogelsäulen mit unterschiedlichein Porendurchmesser ausgerüstet ist. Die Verfahren zum Betrieb dieses Chromatographen und die Auswertung der erhaltenen Ergebnisse wurde in J. Cazes. H. Chem. Ed., 43. A576, A62ff (1966) beschrieben. Nähere Ausführungen über das Verhältnis Z sind in Billmeyer,Textbook of Polymer Science^ S_f 7_ffi J science Publishers_t Inc. (1966) zu finden.

Wie bekannt ist, können Divinyläther-Maleinsäureanhydrid-Copolymerisate erhalten werden, indem man Uivinylather mit Maleinsäureanhydrid in einem aromatischen Verdünnungsmittel im Molverhältnis von etwa 1:2 copolymerisiert, wobei man einen Initiator für den Radikalmechanismus (beispielsweise Benzoylperoxid, Azo-bis-(isobutyronitril) o.dgl.) verwendet.

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Unter diesen Bedingungen scheidet sich das Polymerisat bei der Bildung direkt aus dem Lösungsmittel ab. Die so erhaltenen Copolymerisate sollen zyklisch sein und lassen sich durch die nachstehende Baugruppe wiedergeben.

/
^CH₂ -CH

-CH \

CH

\—CH

C C

S VX

CH

-CH

Tatsächlich jedoch sind diese nach dem Stand der Technik erhaltenen Copolymerisate stets ein weites Gemisch von einzelnen Copolymerisatmolekülen mit Molekulargewichten, die von äusserordentlich niedrigen bis zu sehr hohen Werten reichen. Nach keinem der im Stand der Technik bekannt gewordenen Verfahren zum Copolymerisieren von Divinyläther mit Maleinsäureanhydrid war es bisher möglich, einheitliche Copolymerisate mit einem engen Molekulargewichtsverteilungsbereich herzustellen.

Die homogenen und einheitlichen Copolymerisate gemäss der Erfindung haben offensichtlich die vorstehend angegebene zyklische Struktur, müssen jedoch, um tatsächlich die MolekulargewichtsSpezifizierungen gemäss der Erfindung und den erfindungsgemäss erforderlichen engen Molekulargewicht sverte ilungsbereich aufzuweisen, nach besonderen Verfahren hergestellt werden. Dazu kommen eine Reihe von

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Verfahren in Frage₀ So können beispielsweise die nach dem Stand der Technik hergestellten Copolymerisate fraktioniert werden, wozu beispielsweise auf eine Sandsäulenfraktionierung, eine Geldurchdringungschroniatographie, eine Ultrafiltration, eine fraktionierte Fällung oder ähnliche Verfahren herangezogen werden können. Alternativ können die Copolymerisate auch durch Wärmeeinwirkung oder durch Einwirkung chemischer Reagenzien gezielt abgebaut werden. Weiterhin können die erfindungsgemässen Copolymerisate erhalten werden, wenn man die Polymerisation des Divinyläthers mit dem Waleinsäureanhydrid unter direkter Steuerung in Lösung durchführt.

Zur näheren Erläuterung der Erfindung sind nachstehend Ausführungsbeispiele beschrieben.

Beispiel 1

Divinyläther und Maleinsäureanhydrid werden nach einem bekannten Verfahren copolymerisiert. Das so erhaltene Copolymerisatgemisch wird anschliessend durch Sandsäulenfraktionierung in die gewünschten Fraktionen aufgetrennt. Dazu wird ein Polymerisationsgefäss mit 10,3 Teilen Maleinsäureanhydrid, 200 Teilen trocknem Benzol und 7,4-5 Teilen Tetrachlorkohlenstoff beschickt. Nach Auflösen des Maleinsäureanhydrids wird die Lösung mit Stickstoff gespült und werden 3,7 Teile frisch destillierter Divinyläther in bO Teilen Benzol zugegeben. Das Reaktionsgefäss wird auf 80 ⁰C erwärmt. Unter Rühren wird eine Lösung aus 0,073 Teilen Benzoylperoxid in 5,6 Teilen Benzol zugegeben. Die Reaktion wird 4 h lang bei einer Temperatur von 80-90 C durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wird die erhaltene Reaktionsaufschlämmung auf 25-30 C abgekühlt. Das gequollene Copolymerisat wird abgetrennt und wiederholt mit einem Gemisch aus 7,5 Teilen Benzol und 10 Teilen Hexan

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■extrahiert, filtriert und im 'Vakuum getrocknet. Das erhal- · tene Produkt ist ein breites Gemisch zyklischer Divinyl-.

Copol-yiaerisate mit einem Zahlenrwn ca» 35 ^;60ö und einem Verhältnis

von ?64 ■

Das so- erhaltene Üopolymerisat gemisch- "wird auf einer Sandsäule fraktioniert, wobei die allgemeinen ITerfahrensvöi*- - Schriften verwendet wurden,, wie sie von John Elliott in Polymer Fractionation, M* J»E, Cantow Edi-tor, Kapitel BZ₉ Seiten 6? - 93» Academic Srss^» Mew York, ja.Y. (19'67) beschrieben wurden»

Im einseinen wurden;23,7 feile des s© erhal-temen Gopolymerisatgemisches in einem Gemisch aus 460 Teilen Meöiyläiäiyl-- . keton und 105 teilen ivtethylis'pfcutylketon gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde auf eine Mantelsandsäsale bei Zimmertemperatur gegeben* Anschliessend wurden weitere 6Ό Teile des Methyläthylketon-'Methylisobutylketon--LΌSungsmi■ttels. als Laufmittel zugegeben* Die Säule wurde dann auf 69 °€ erwärmt und 1" h auf dieser temperatur gehalten*-Zum Ausspülen des Lösungsmittelgemisches wurde anschliessend Benzol auf die Säule gegeben. Ifech Abkühlen der Säule auf Zimmertemperatur wurde das Copolymerisat mit einem Tetrahydrofuran-n-Hexan-Lösungsmittelgemisch fraktioniert» Die .Anteile des Tetra-' hydrofurans und des η-Hexans im Lösungsmittelgemisch wurden während des Verfahrens variiert, wobei das Ausgangsgemiseh aus 70 % Tetrahydrofuran und 30 % η-Hexan bestand und anschliessend die Tetrahydrof uranteile während des Fraktlonierens in der Weise allmählich erhöht wurden., dass gegen -. Ende der Fraktionierung reines "Tetrahydrofuran verwendet . wurde. Auf diese ¥eise wurden.8 verschiedene Fraktionen zu je etwa 2 1 erhalten. Jede dieser Fraktionen wurde eingeengt und das Copolymerisat durch^Zugabe von trocknem; Benzol ausgefällt. . Die Daten der so erhalteaien Copolymerlsatfraktio;nen

sind nachstehend zusammenfassend dargestellt:

Fraktion	Zahlenmittel-Molekularge	V^ **
	wicht ■* (M_n)	w η
a	16 700	1,66
b	29 400	1,84
C	36 200	2,25 ^;:: '
d	45 300	2,16
e	71 300	2,35
f	95 500	2,59
g	117 000	3,21
h	203 000	4,21

* membranosmometrisch bestimmt

** geldurchdringungschromatographisch bestimmt

Beispiel 2

Es werden Copolymerisatfraktionen, die nach Beispiel 1 erhalten wurden, sowie Proben des uneinheitlichen Ausgangscopolymerisatgemisches im Hinblick auf ihre Aktivität bei der Tumorunterdrückung untersucht. Zu diesen Untersuchungen wurden 10 männlichen weissen schweizer Mäusen intravenös die Copolymerisate in isotonischer Salzlösung (2,5 mg/ml), die auf einen pH von 7,2 eingestellt war, injiziert. Nach 24 h wurde den Versuchstieren eine zweite Injektion appliziert. Jede der Injektionen enthielt 25 mg Copolymerisat pro kg Körpergewicht. Etwa 48 h nach der zweiten Copolymerisatinjektion wurde jedem der Versuchstiere

subkutan eine Menge von 10 festen EHRLICH-Adenocarcinomzellen in Salzlösung injiziert. Die Tumore wurden nach

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Tagen entfernt und gewogen. Die prozentuale. Tumorunterdrückung wird durch Vergleich des mittleren Tumorgewichtes der aus den mit dem Copolymerisat behandelten Mäusen entfernten Tumore mit dem mittleren Gewicht derjenigen Tumore verglichen, die aus einer Gruppe von 10 Kontrollmäusen, die Ms auf die Behandlung mit dem Copolymerisat genau so wie die andere Gruppe.der Versuchstiere behandelt worden war, entfernt wurden. Es wurden die nachstehend zusammengestellten Ergebnisse erhalten:

Copolymerisat M ¥i Prozentuale Tumor·

ψ- unterdrückung

Ausgangsgemisch vor der Frak tionierung	35	600	7,64
a	16	700	1,66
b	29	400	1,84
C	36	200	2,25
d	45	300	2,16
f	95	500	2,59
h	203	000	4,21

50 61 45 45 67 32 75

Wie die vorstehend zusammengestellten Daten zeigen,, sind sämtliche Fraktionen ebenso wie das Ausgangscopolymerisatgeraisch wirksame Tumorinhibitoren.

Beispiel 3

Es wird die Antivirusaktivität der nach Beispiel 1 hergestellten Fraktionen und des Ausgangscopolymerisatgemisches untersucht. Dazu wurden je 10 männlichen weissen schweizer Mäusen eine einzelne intravenöse Injektion des Copolymerisats in isotonischer Salzlösung,wie im Beispiel 2 beschrieben,

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verabreicht. Nach 24 h wurden die Versuchstiere mit einer intravenösen Injektion von etv/a dem 50fachen Wert der LD-50 des Encephalomyocarditisvirus beimpft. Die prozentuale Sterblichkeit der Versuchstiere wurde 13 Tage nach der Virusinfektion bestimmte Dabei wurden die nachstehend zusammengefassten Ergebnisse erhalten:

Copolymerisat	^Mn	7,64	Prozentuale Sterblichkeit
Ausgangsgemisch vor der Fraktio nierung	35 600	-	10
Kontrolle	-	1,66	90
a	16 700	1,84	20
b	29 400	2,25	30
C	36 200	2,16	10
d	45 300	2,35	10
e	71 300	2,59	20
f	95 500	3,21	20
g 1	17 000	20

Der vorstehenden Aufstellung kann entnommen werden, dass sowohl alle Copolymerisatfraktionen als auch das Ausgangscopolymerisatgemisch antiviral wirksam sind.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird der Einfluss von Proben der verschiedenen im Beispiel 1 hergestellten Fraktionen und des Ausgangscopolymerisatgemisches auf das Körpergesaratgewicht und auf das Gewicht verschiedener Körperorgane untersucht» Für die Untersuchungen im Rahmen des Körpergesamtgewichtes wurde ein Gruppe von 10 männlichen weissen schweizer Mäusen zusammen

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mit 10 Mäusen als KontrollVersuchstiergruppe herangezogen« Zu den Versuchen für die Lebervergrösserung» Milzvergrös serung für das Lungen- und Ihymusgewicht wurden Gruppen zu je 5 männlichen weissen schweizer Mäusen mit je 10 dieser !Tiere als Kontrollgruppe verwendet. Das Cöpolymerisat wurde in einer einzigen intravenösen Injektion, wie im Beispiel 2 beschrieben, in einer Menge von 2*? mg Copolymerisat pro kg Körpergewicht appliziert, Zur Bestimmung des Gesamtkörpergewichtes wurde das mittlere Gewicht jeder Gruppe eine Woche nach der Gepolter isatbehandlung mit dem mittleren Gewicht dieser Gruppe vor der Behandlung verglichen« Bei den Versuchen im Rahmen der Lebervergrösserung, Milzvergrösserung, im Rahmen des Lungengewichtes und des Thymusgewichtes wurden die mittleren Gewichte der Organe innerhalb jeder Gruppe mit dem mittleren Körpergesamtgewicht innerhalb der Gruppe verglichen* Im Rahmen dieser Versuche wurden die nachstehend Eusammengestellten Ergebnisse erhalten*

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Copolymerisat

Änderung des Körper- Leber- Milz- Lungen- Thymus-

gesamtgewichts gewicht gewicht gewicht gewicht

g % in % in >6 in % in ^ι,ί

Körper- Körper- Körper- Körpergewicht gewicht gewicht gewicht

	Kontrolle	—	600	—	+2,1
	Ausgangscopo- lymerisat vor der Fraktio nierung	35	700	7,64	-4,0
	a	16	400	1,66	+1,8
	Id	29	20Ü	1,84	+0,2
C*J	C	36	300 000	2,25	-2,6
09827/	e	71 117		2,35 3,21	-0,5 -1,7
^***. O OO

+9,5

6,1

0,34 0,76

0,24

-18,1	7,1	1,35	1,29	0,15
+8,2	6,5	0,63	0,89	0,22
+0,9	6,5	0,71	1,15	0,20
-11,8	6,6	0,59	1,31	0,16
-2,3	3,0	1,46	1,22	0,18
-7,7	8,0	1,15	1,21	0,16

Aus der Tabelle kann entnommen werden, dass die Copolymerisate mit den höheren Molekulargewichten ebenso wie die Ausgangscopolymerisatgemische eine deutliche Abnahme des Körpergesamtgewichtes und des Thymusgewichtes und eine deutliche Zunahme des Lebergewichtes, Milzgewichtes und Lungengewichtes verursachen. Im Vergleich dazu verursachen die Copolymerisate gemäßs der Erfindung nur eine geringere Veränderung des Körpergesamtgewichtes und der Organgewichte.

Beispiel 5

In diesem Beispiel werden Proben der nach Beispiel 1 hergestellten Copolymerisatfraktionen und Proben des Ausgangscopolymerisatgemische s auf ihre akute Toxozität hin -untersucht. Dazu werden Standardtestverfahren zur Bestimmung der LD-50 durch intravenöse Injektion mit weissen männlichen schweizer Mäusen durchgeführt. In üblicher,Weise bezeichnet in diesem Rahmen "LD-50" die für 50 % der untersuchten Tiere letale Dosis. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Zusammenfassung in mg Copolymerisat pro kg Körpergewicht zusammengestellt:

Copolymerisat Mn M LD-50 (mg/kg)

Ausgangscopolymeri- sat vor der Fraktio nierung	35	600	7,	64	74
a	16	700	1,	ob	.131
C	36	200	2,	25	100
e	71	300	2,	35	87

Aus den wiedergegebenen Werten ist zu erkennen, dass die Copolymerisate mit den höheren Molekulargewichten ebenso

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wie die Ausgangscopolymerisatgemische toxischer als die Copolymerisate gemäss der Erfindung sind.

Beispiel 6

In diesem Beispiel werden Proben der Fraktionen, die nach Beispiel 1 hergestellt wurden, und eine Probe des Ausgangscopolymerisatgemisches auf ihre Anämie verursachenden Eigenschaften hin untersucht. Dazu werden je 5 männlichen weissen schweizer Musen eine einzelne intravenöse Injektion des Copolymerisats (25 mg pro kg Körpergewicht) in einer Salzlösung in der im Beispiel 2 beschriebenen Weise verabreicht. Als Kontrollgruppe wurden 25 männlichen weissen schweizer Flausen in gleicher Weise behandelt, nur dass ihnen statt der Copolymerisatesung eine reine Salzlösung injiziert wurde. Nach einer Woche wurde den Versuchstieren Blut entnommen, üs wurde die Menge Hämoglobin in g/100 ml Blut bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in g '■/.> wiedergegeben:

Copolymerisat M I^vu Kämoglobinspiegel

(Gramm A)

Kontrolle - - . 16,8

¹ 12,0 16,3 15,3 14, ό 12,2 g 117 000 3,21 11,7

Der vorstehenden Datenzusammenstellung kann entnommen werden, dass alle Copolymerisate mit einem Molekulargewicht über dem

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Ausgangscopolyme- risat vor Frak tionierung	35	600	7,64
a	16	700	1,66
b	29	400	1,ö4
C	36	200	2,25
e	71	300	2,35

■■■ : 2252449

Ilolekulargewicht .der Copolymerisate _:.gemäss der Erfindung, einschliesslich der Ausgangscopolymerisatgemiscne, einen deutlichen Rückgang des Hämoglobinspiegels verursachen.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird der Einfluss der verschiedenen Copolymerisate auf die Leberfunktionen untersucht. Es wurden zwei Versuchsreihen durchgeführt.

In der ersten Versuchsreihe wurde 24 h nach der. intravenösen Injektion des Copolymer!sates (25 mg Copolymerisat pro kg Körpergewicht) der Serumspiegel der Glutaminpyruvattransaminase bestimmt.' In jeder Gruppe wurden 5 männliche weisse schweizer Mäuse und in jeder Kontrollgruppe 8 dieser Tiere untersucht. Die Bestimmung wurde nach dem in dem Sigma Technical Bulletin No. 505 (Revised März 1971), Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, beschriebenen kolorimetrischen Bestimmungsverfahren durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Sigma-Frankel-Einheiten,wie in dem Sigma Technical Bulletin beschrieben, wiedergegeben. Das Anwachsen dieser Einheiten über 100 zeigt Lebernekrose an.

In der zweiten Versuchsreihe wird die Aktivität des Lebermikrosomenzyms 24 h nach der intravenösen Injektion des Copolymerisates (25 mg Copolymerisat pro kg Körpergewicht) bestimmt. Je 5 männliche weisse schweizer Mäuse bildeten die Versuchstiergruppe und die Kontrolltiergruppe. 24 h nach der Copolymer!satinjektion wurde den Tieren die Leber entfernt und bei 9000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt. In dieser Flüssigkeit sind die Enzyme enthalten, die Aminopyren in Formaldehyd umwandeln können. Ein Rückgang dieser Enzyme deutet auf Leberschäden hin. Die Ergebnisse dieser zweiten Versuchsreihe sind in. B'orm der prozentualen Unterdrückung des Aminopyren-Metabolismus angegeben. ., ■. · .. ■ ... . , ■ ■.,-..·

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Copolymerisat	35	600	k	Sigma- Frankel- Einheiten	Prozentuale Unterdrückung des Aminopyren- metabolismus
Kontrolle	16	700	IHK	32	0
Ausgangscopoly- merisat vor der Fraktionierung	29	400	7,64	200	64
a	36	200	1,66	52	0
b	45	300	1,84	87	7,1
C	71	300	2,25	93	29,5
d	117	000	2,16	*	51,0
e		2,35	96	56,5
g		3,21	205	53

* nicht bestimmt

Wie den Daten der vorstehenden Tabelle entnommen werden kann, üben alle Copolymerisate mit Molekulargewichten über den
Molekulargewichten der Copolymerisate gemäss der Erfindung
schädigende Einflüsse auf die Leber aus.

Beispiel 8

In diesem Beispiel werden die Einflüsse von Proben der nach Beispiel 1 hergestellten Fraktionen und das nicht einheitlichen Ausgangs^polymerisatgemisches auf die auslösende Sensibilisierung von Endotoxinen untersucht. Dazu wurden Gruppen von 25 oder mehr männlichen weissen schweizer Mäusen intravenös eine einzelne Copolymerisatinjektion (25 mg Copolymerisat pro kg Körpergewicht) verabreicht. 24 h später wurden Untergruppen von je 5 Mäusen mit verschiedenen Konzentrationen von Salmonella typhosa-Endotoxin infiziert. Die LD-50 v/urde bestimmt. Die Ergebnisse der Endotoxinsensibilisierung sind nachstehend in Form der LD-50 als mg Salmonella typhosa-Endotoxin pro kg Körpergewicht angegeben.

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Copolymer*^	_	600	_	Sndotoxinsensibili- sierung, LB-50, mg/kg
Kontrolle		700		' 34. ' ·
Ausgangscopolyme- risat vor der Fraktion!erung	16'	400	1,66	0,3ö · ' , ;■
a	29	200	1,84	• - · ^i5 - - ■·■■- ■■
b	36	300	2*25	3,0
C	45	300	2,16	0,38
d	71	500	2,35	- 0,48
e	95	000	2,59	■ 0,48
f	117	000	"3,21	0_t48
g	203		4,21	0,48
h		0,48

Der vorstehenden Tabelle kann ohne weiteres entnommen werden,dass die EndotoxinsensiMlisierung-, die sich durch eine Abnahme der U3-5G bemerkbar macht, deutlich für die Copolymerisate mit Molekulargewichten über 30 000 zunimmt.

Beispiel 9

In diesem Beispiel wird der Einfluss des Molekulargewichts und der Molekulargewichtsverteilung von Copolymerisätproben auf verschiedene biologische Aktivitäten beschrieben. Es wurden 8 verschiedene Copolymerisate mit den nachstehend· aufgeführten Molekulargewichten und untersucht:

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Copolymerisat

A Molekulargewicht unterhalb des Bereiches ge—

mäss der Erfindung,i'L/M im erfindungsgemässen Bereich

B Molekulargewicht unterhalb des Bereiches gemäss der Erfindung, ^L/^L ausserhalb des erfindungsgemässen Bereiches

C Molekulargewicht und R /U im Bereich geiaäss der Erfindung

D Molekulargewicht und H./1U innerhalb des Bereiches gemäss der Erfindung

E Molekulargewicht im Bereich gemäss der Erfindung, ϊ\ΥΜ ausserhalb des erfindungsgemässen Bereiches

F Molekulargewicht oberhalb des Bereiches

der Erfindung und M/M innerhalb des Bereich gemäss der Erfindung

G Molekulargewicht oberhalb des Bereiches gemäss der Erfindung, f'L/KL ausserhalb des Bereiches gemäss der Erfindung

Die Proben wurden wie folgt hergestellt: Copolymerisat

A Direkte Lösungspolymerisation

B direkte Copolymerisation gemäss US-PS 3 224

C direkte Lösungspolymerisation: ein Polymerisationsgefäss wurde mit 14,ö Teilen Maleinsäureanhydrid und 160 Teilen Tetrahydrofuran beschickt. Die erhaltene Lösung wurde mit Stickstoff gespült und mit 5,3 Teilen Divinyläther in 17,7 Teilen Tetrahydrofuran versetzt.

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Die Reaktionslösung wurde auf 15 ⁰C abgekühlt und unter Stickstoff mit einer Sonnenlichtlampe (UV und sichtbarer Bereich) 90 min lang bestrahlt, wobei die Temperatur im Bereich von 15 - 20 ⁰C gehalten wurde. Danach wurden 132 Teile η-Hexan zum Ausfällen des Copolymerisate dazugefügt. Das Copolymerisat wurde -.:. durch Zentrifugieren und Dekantieren, wiederholtes-Waschen mit einem Gemisch aus 3,3 ' Teilen Benzol und 1 Teil η-Hexan gereinigt, filtriert und im Stickstoffstrom getrocknet.

D Sandsäulenfraktionierung, wie in Beispiel 1 beschrieben

E direkte Copolymerisation, wie in US-PS 3 224 beschrieben

F Sandsäulenfraktionierung

(i direkte Copolymerisation nach dem in der US-PS 3 224 943 beschriebenen Verfahren

Jede der Proben wurde hinsichtlich ihrer Einflüsse auf die Antitumoraktivität, antivirale Aktivität, akute Toxozität, Sensibilisierung der Endotoxine, Sigma-Frankel-Einheiten, Hämoglobinspiegel, Lebervergrösserung und MiIzvergrösserung nach den in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Verfahren untersucht. Zusätzlich wurden die weissen Blutkörperchen gezählt. Bei diesem Test wurden 5 Mäuse in jeder Gruppe und 25 Mäuse in der Versuchsgruppe untersucht. Eine Woche nach einer einzigen intravenösen Injektion des Copolymerisate wurden die Blutproben gezogen

■χ

und die Anzahl der weissen Blutzellen pro nmr bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst.

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Copolymerisat IC i-L

Tumor- Antivira» Akute Sndo- Sipaaunterle Akti- Toxi* toxin- Fraiüce drük*- vitätjpro- zität sensibi- Einhei kütig zentuale LD-50 lisie-

Sterb- mg/kg rung

lichkeit LD-50

mg/kg

* nicht bestisaat

	A	3500	2,62	41	60	*	15	34
	B	1500	11,0	65	60	126	15	32
co	C	6800	2,34	67	20	100	. 15	33
Ö CD	D	16700	1,66	61	20	131	■15
OO	E	16800	4,45	67	10	96	0,68	120
-J	B¹	71300 '	2,35	55	20	87	0,48	96
O	G	35600	7,6	62	10	74	0,38	190
OO	Kontrolle			0	93		34	29

co CD CO CO PO

O OO

liämoglobin- spiegel g % *	weisse Blut zellen pro mm*	Lebergewicht in % Körper gewicht	Hilzgewicht . in % Körper gewicht
*	*	*	* ■
16,6	7520	5,4	0,52'
16,3	7300	6_?5	0,63
13,2	11450	7,0	1,14
12,2	10600	8,0·.	1,46
12,3	13500	' 3,4	■1,27
16,8	6466	4,8	0,37. '

ro

* nicht bestimmt

ro

<D

Die vorstehende Tabelle zeigt deutlich die Überlegenheit der Copolymerisate gernäss der Erfindung.

Patentansprüche

309827/081 0

Claims

Patentansprüche

Festes zyklisches Copolymerlsat aus Dliriinyläther^: iaiid !Maleinsäureanhydrid in Form einer Zusammensetzung mit einem bestirnten Molekulargewichtsiaerelch und Moleköli3a«gi?iappe32₃ die sich "rom DIiTinyläther und Maleinsäiareanhydrld im Verhältnis 1 3 2 ableiten;, gekennzeichnet -durela ein Zahleniiiittel—Moleioiiargewicht wob. 5000 — 30 000 %mn. ein. iiältnls U, JK_n WGa 1,0 ~ 3,0.

2, Copolymerisat .nacla iinspruck 1, gefcenmzeieihaäet durch eiaa

von 10 000 - 25 000»^!

3» Copölymerisat nacla einem der iaxsprlMhe 1 ©der 2^ ge&eaam-'zeichiaet diirdh ein ¥erM2±nis M^fM^ won. 1,5 - 2,5«

4. Verfahren zur IferstellMng eines Gopölymerisates

einem der Ansprüclae 1 Ms 3» dadurch -gekennzeieiaBet;, dass man zur Diskriminierumg zwischen Bolymerisaten jniib niedrigerem und höherem Molekulargewicht diese selelrtiir !behandelt., und zwar in der Welse ₃ dass man so aaföla der j&nzahl der MoleMilbaugruppen im Copolymeri-saibmoleMil selektiert, dass man ein Prodiakt Mit einem Zahleninitte wicht Ton .5000 - 30 OGO und ein Verhältnis 3,0 erhält,.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch geicennzei.chnetj dass man eine CDpolymerisatzusammensetzung mit einer laestimmten MolekulargewichtsTareite fraktiomert und'die S,eleictiDii so führt, dass man die entsprechenden Fraktionen -auswählt*

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5* dadurch gekennzeichnet, dass man Copolymerisate mit nicht in den A.uswahlbereich fallenden Molekular/gewichten abbaut«

3:03^;827/D8 1

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man zur selektiven Behandlung der Copolymerisate ihre Bildung so steuert, dass die Molekulargewichte der Produkte im Auswahlbereich liegen*

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Produkt mit einem Molekulargewicht von 10 000 - 25 000 erhält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Produkt mit einem Verhältnis %/\ von 1,5 - 2,5 erhält.

JR/er

309827/0810