DE890700C - Verfahren zur Konzentrierung von Antianaemiaperniziosa'faktoren - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Extraktion und Konzentrierung von Antianaemiaperniziosafaktoren, im folgenden kurz Antiperniziosafaktoren genannt, und betrifft insbesondere ein Verteilungs- oder Extraktionsverfahren, gemäß welchem ein Zweiphasensystem von drei Lösungsmitteln verwendet wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Entdeckung, daß zwischen der unteren und der

ίο oberen Phase von gewissen zweiphasigen ternären Systemen, die ein Phenol, einen Äther und Wasser enthalten, eine ungewöhnlich günstige Verteilung von Antiperniziosafaktoren und den normalerweise mit letzteren vorkommenden Verunreinigungen erfolgt,

is wodurch es möglich wird, bei einer einzigen Extraktion eine größere Reinheit zu erzielen als bei Verwendung von Phenol allein.

Das Vorkommen eines oder mehrerer Antiperniziosafaktoren in verschiedenen tierischen Organen, beispielsweise in der Leber, ist wohl bekannt. Die sogenannten Leberkonzentrate werden in ausgedehntem Maße bei der Behandlung von perniziösen (Addisonsche) und macrocytischen Anaemien vom Typ der perniziösen Anaemie mit megaloblastischem Knochenmark verwendet. Die Antiperniziosafraktion der Leber wurde stark konzentriert [Biochem. Journal (Proceedings) 1946, Vol. 40, S. IV; Nature, 1948, Vol. 161/ S. 638, und Science, 1948, Vol. 107, S. 396]. Da der Antiperniziosafaktor als eine einzige chemische Einheit in Erscheinung tritt, wird er im folgenden, ungeachtet seiner Herkunft, als Vitamin B₁₂ bezeichnet. Diese Einheit kann aus mehreren verwandten aktiven Substanzen bestehen oder andere verwandte aktive Substanzen enthalten. In Überein-

Stimmung mit der gegenwärtigen Praxis wird die Bezeichnung Vitamin B₁₂, unabhängig davon, ob diese Fraktion, die zur Bekämpfung der perniziösen Anaemie als wirksam erkannt wurde, aus einer oder mehreren chemischen Individuen besteht, im folgenden dazu verwendet, jene Substanzen oder Fraktionen zu bezeichnen, die bei der Behandlung der perniziösen Anaemie oder der Addisonschen perniziösen Anaemie klinisch wirksam sind.

ίο Außer in der Leber kommt Vitamin B₁₂ auch in den Mycelien von Streptomyces griseus und Streptomyces fradiae vor, wenn die letzteren auf gewissen künstlichen Nährböden gezüchtet werden, und wurde ferner auch anderswo, beispielsweise in Abfallstoffen von Fleischkonservenfabrikationsanlagen, wie z. B. in Fäkalien von Schweinen, Vieh und Hühnern und im Mageninhalt von geschlachteten Tieren vorgefunden. Die in diesen Abfällen vorkommenden Antiperniziosafaktoren sind unter der Bezeichnung Tierproteinfaktoren (animal protein factors) bekannt. Die ernndungsgemäßen Verfahren sind für die Konzentrierung von aus allen diesen Quellen erhaltenen, Vitamin B₁₂ enthaltenden Fraktionen anwendbar.

Verfahren, mittels welchen Vitamin B₁₂ konzentriert werden kann, sind bisher speziell in bezug auf Leber als Ausgangsmaterial beschrieben worden. Die Herstellung einer wäßrigen Lösung des Antiperniziosaf aktors oder Vitamins B₁₂ ist eine vielen der bekannten Verfahren zur Konzentrierung des Vitamins B₁₂ gemeinsame Operation. Ob die wäßrige Lösung durch Extraktion der ganzen Leber zwecks Erzeugung eines rohen Ausgangspräparates oder durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und Gewinnung aus den Lösungsmitteln durch Extraktion mit Wasser oder Fällung zu verschiedenen Zeitpunkten eines andere Operationen einschließenden Reinigungsvorganges erhalten wird, ist unwichtig. Das Vitamin B₁₂ wird vorzugsweise in wäßriger Lösung vorliegen. Eine solche wäßrige Lösung oder aber die durch teilweise oder vollständige Entfernung des Wassers aus einer solchen Lösung erhaltene Paste oder die trockenen festen Produkte dienen als Ausgangsmaterial für die bekannten Verfahren zur Herstellung von Leber- oder Vitamin-B₁₂-Konzentraten, die beispielsweise in Acta Med. Scand. 1936, Vol. 88, S. 620, durch Laland und Klem und in den USA.-Patenten 2 134 256, 2 125 844 und 2 369 465 beschrieben sind. Obwohl mit diesen und anderen Verfahren brauchbare Leberkonzentrate erhalten werden konnten, welche das Vitamin B₁₂ in einem Reinheitsgrad von mehr als etwa 0,2 Gamma (0,0002 mg) Vitamin-B₁₂-Aktivität pro Milligramm des Gesamtfeststoffgehaltes aufwiesen, haben diese Produkte in der Therapie der Anaemia perniciosa keine große Verbreitung gefunden. Vitamin B₁₂ ist in einer viel größeren Reinheit als der obengenannten erhalten worden, jedoch nur durch Behandlung mittels langwieriger und komplizierter Reinigungsoperationen. Einfachere Verfahren, mittels welchen der Gehalt an Vitamin B₁₂ solcher Präparate erhöht und die Kosten erheblich vermindert werden könnten, wären erwünscht. Es wäre ferner zweckmäßig, ein Verfahren zur Hand zu haben, mittels dessen das in einer verdünnten wäßrigen Lösung enthaltene Vitamin B₁₂ mit Leichtigkeit extrahiert und in Form einer konzentrierten Lösung von stark vermindertem Volumen erhalten werden könnte. Einige der bekannten Verfahren ermöglichen die Herstellung eines konzentrierteren Produktes, sofern sie auf Rohmaterialien angewendet werden, sind hingegen von geringem Wert, wenn sie auf die Konzentrierung von in höherem Maß gereinigten, Vitamin B₁₂ enthaltenden Materialien angewendet werden. Ein Verfahren, welches bei Anwendung auf die Konzentrierung oder Reinigung von in höherem Maß gereinigten, Vitamin B₁₂ enthaltenden Präparaten wirksam ist, wäre ebenfalls erwünscht. Um in hohem Maß gereinigte Vitamin-B₁₂-Präparate zu erhalten, war es bisher erforderlich, das Rohpräparat, das stark konzentriert worden war, zur Entfernung von die weitere Reinigung hindernden Verunreinigungen der weiteren Einwirkung durch gemischte Mikroorganismen zu unterwerfen, beispielsweise in der im J. Biochem. Soc. (Proceedings) 1946, Vol. 40, S. IV. beschriebenen Weise. Es wäre ferner ein Verfahren erwünscht, mittels welchem man ein Vitamin-B₁₂-Konzentrat erhalten könnte, das sich leicht in kristallisiertes Vitamin B₁₂ überführen ließe, und bei welchem derartige Behandlungen mit Mikroorganismen vermieden werden könnten.

Das erfindungsgemäße Verfahren genügt allen diesen Forderungen. Durch diese Erfindung gelangt man zu einer einfachen Methode, mittels welcher sehr rohe Präparate, die Vitamin B₁₂ enthalten, konzentriert und gereinigt werden können, um Produkte zu erhalten, die eine genügende Wirksamkeit aufweisen, um sich für den Handel zu eignen. Das Verfahren eignet sich auch zur Erhöhung der Reinheit von Vitamin B₁₂ enthaltenden Präparaten, beispielsweise zur Überführung eines Produktes mit einem Gehalt von etwa 3,0 bis 5,0 Gamma Vitamin B₁₂ pro Milligramm Feststoffen in ein Produkt mit einem Gehalt von etwa 120 Gamma Vitamin B₁₂ pro Milligramm Feststoffen. Ein derartiges Resultat konnte bisher nicht mittels einer einzigen Behandlung erzielt werden. Außerdem kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Extraktion von Vitamin B₁₂ aus den aus Leber, .den Mycelien von Streptomyces griseus, den Mycelien von Streptomyces fradiae und anderen Ausgangsmaterialien erhaltenen ersten, verdünnten, wäßrigen Extrakten angewendet uo werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit Erfolg für derartige verdünnte Extrakte oder in einem anderen Zeitpunkt in einer Reihe von Stufen von der Konzentrierung bis zur Reinigung des Vitamins B₁₂ angewendet werden. X15

Die erste und wichtige Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, einen rohen, Vitamin B₁₂ enthaltenden Festkörper oder einen wäßrigen, Vitamin B₃₂ enthaltenden Extrakt mit einem bestimmten zweiphasischen ternären System aus Phenol, Äther und Wasser in innige Berührung zu bringen. Man läßt das Gemisch sich in Phasen trennen und entfernt die obere Phase des ternären Systems, die aus dem Äther und dem größten Teil des Phenols besteht und einen beträchtlichen Teil des Vitamins B₁₂ in gereinigtem Zustand enthält. Die untere wäßrige Phase,

die einen kleineren Teil des Vitamins B₁₂ enthält, kann mit weiteren Mengen eines aus Äther und Phenol bestehenden, in seiner Zusammensetzung der oberen Phase entsprechenden Gemisches extrahiert werden, bis sich die Durchführung dieser Operation nicht mehr lohnt. Eine Operation, die in diesem" Stadium eingeschaltet werden kann, besteht darin, die das gereinigte Vitamin S₁₂ enthaltende abgetrennte obere Phase mit einer zusätzlichen Menge ίο frischer Phenol-Wasser-Lösung in innige Berührung zu bringen. Durch diese Operation wird zwar einerseits eine gewisse Menge des Vitamins S₁₂ entfernt und dadurch die Anfangsausbeute vermindert, andererseits wird eine größere Menge Verunreinigungen extrahiert, was zur Folge hat, daß das in der oberen Phase verbleibende Vitamin B₁₂ einen höheren Reinheitsgrad aufweist. Die zweite Stufe, die bei gewissen Arten der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Ausführung kommt, besteht darin, der abgetrennten oberen Phase eine weitere Menge eines Äthers zuzusetzen, wodurch bewirkt wird, daß das bis dahin herrschende Löslichkeitsverhältnis umgekehrt und das Vitamin B₁₂ selektiv in die wäßrige untere Phase in einem Zustand noch höherer Reinheit extrahiert wird.

Unter den phenolischen Verbindungen, die sich für

das erfindungsgemäße Verfahren eignen, befinden sich einwertige Phenole, wie z. B. Phenol (Carbolsäure), die Kresole (0-, m-, und p-Kresol und Gemische dieser Kresole), Xylenole, gereinigte phenolische Kohlenteerfraktionen u. dgl. Die zusammen mit den Phenolen verwendbaren aliphatischen Äther sind

mit Wasser nicht mischbare, aliphatische Äther, wie

z. B. Diäthyläther, Dipropyläther, Diisopropyläther, Dibutyläther, Diamyläther u. dgl. Im allgemeinen

werden niedere aliphatische Äther, die für Phenol gute Lösungsmittel und mit Wasser nicht mischbar sind, bevorzugt (Dimethyläther ist somit ungeeignet);

diese Äther sind an sich keine Lösungsmittel für Vitamin B₁₂.

Obwohl die Mengenverhältnisse von phenolischer Verbindung zu Äther innerhalb weiter Grenzen variiert werden können, sollten diese Verhältnisse, wie noch erklärt werden wird, derart eingestellt werden, daß der maximale Wirkungsgrad des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielt wird. Zur Erläuterung wird im folgenden eine ausführliche Beschreibung der Konzentrationsänderungen für das zweiphasische, ternäre System Phenol, Dibutyläther und Wasser gegeben. Solche Daten können natürlich in ähnlicher Weise für andere Systeme unter Verwendung anderer Äther und anderer Phenolverbindungen erhalten werden. Diese Daten werden sich nur gradmäßig unterscheiden, je nach der im besonderen gewählten Kombination.

Phenol und Wasser sind teilweise mischbar. Bei inniger Vermischung von Phenol und Wasser in gewissen Mengenverhältnissen entsteht ein zweiphasiges, binäres System, dessen Zusammensetzung in der oberen und der unteren Phase bei verschiedenen Temperaturen bekannt ist (s. International Critical Tables, McGraw-Hill Bock Company, New York, 1928, Bd. Ill, S. 389). Wird dem Phenol-Wasser-System ein Äther'oder ein Gemisch von Äthern zugesetzt, söentsteht ein ternäres Zweiphasensystem, dessen obere' Phase vorwiegend aus Äther besteht und den größten Teil des Phenols enthält und dessen untere Phase eine verdünnte wäßrige Lösung von Phenol ist, die eine kleine Menge von gelöstem Äther enthält.

Abb. ι der Zeichnungen zeigt ein Phasendiagramm des ternären Systems Phenol-Dibutyläther-Wasser, bestimmt nach der Methode von Othmer et al, Ind. Engl. Chem. 1941, Bd. 33, S. 1240 bis 1248. Mittels dieses Phasendiagrammes kann die Zusammensetzung der beiden Phasen durch Bestimmung der Prozente der einen Komponente in einer der beiden Schichten des Systems leicht ermittelt werden, wobei aus dem Wert dieses Prozentgehaltes die entsprechenden Prozentgehalte der übrigen Komponenten in der oberen und der unteren Phase aus dem Diagramm abgelesen werden können. So kann man durch Bestimmung des Prozentgehaltes der oberen Phase an Butyläther und Fixierung dieses Wertes auf der linken Kurve der Abb. 1 die Prozentgehalte an Phenol und Wasser, die mit dem Prozentgehalt an Butyläther in der oberen Phase im Gleichgewicht stehen, direkt ablesen. Die Kurven für andere Äther besitzen gleiche allgemeine Form, wobei die spezifischen Unterschiede hauptsächlich auf die verschiedene Löslichkeit des gegebenen Äthers in Wasser zurückzuführen sind.

Die Abb. 2 der Zeichnungen zeigt ein Beispiel der Reinigung und die durch Verwendung" verschiedener zweiphasiger, ternärer Systeme von Phenol, Dibutyläther und Wasser erhältlichen Ausbeuten in Prozenten, aufgetragen als Funktion der Prozente des Dibu ty lathers. An Hand dieses Beispieles wird die die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellende selektive Extraktion von Vitamin B₁₂ aus Wasser mittels Phenol-Dibutyläther-Lösungen erläutert. Aus der Abbildung ist deutlich ersichtlich, daß bei Konzentrationen von bis zu etwa 55 % Butyläther eine bessere Reinigung des Vitamins B₁₂ erzielt wird als bei Verwendung von Phenol allein. Abb. 3 der Zeichnungen erläutert das Rückwaschen des Phenol-Wasser-Extraktes und die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens, die darin besteht, eine weitere Menge von frischem Dibutyläther zuzusetzen, wobei das Vitamin B₁₂ in der unteren Phase leichter löslich wird als in der oberen Phase. Die in Abb. 3 gezeigte obere Phase mit etwa 44,2% Butyläther entspricht der in Abb. 2 gezeigten oberen Phase, die die maximale Reinigung ergibt. Abb. 3 zeigt außerdem, daß, wenn eine Lösung von Vitamin B₁₂ in einem ternären System von Dibutyläther-Phenol-Wasser mit der durch den Gehalt von 44,2 % Dibutyläther bestimmten Zusammensetzung mit frischer unterer Phase oder Wasser gewaschen wird, etwas Vitamin B₁₂ von geringerer Reinheit in die untere Phase übertritt. Dies bedeutet andrerseits, daß das in der oberen Butylätherphase zurückbleibende Vitamin B₁₂ bei dieser Waschoperation eine Reinigung erfährt. Mit zunehmender Konzentration des Dibutyläthers bis zu etwa 46 °/₀ oder mehr in der oberen Phase ist die Reinheit des in die frische untere Phase übergeführten Vitamins B₁₂ gleich der oder größer als die Reinheit in der oberen Phase. Die maximale Steigerung der bei

dieser Stufe erzielten Reinheit erfolgt bei einer Dibutylätherkonzentration von etwa 51 bis 55%.

Bei diesen Dibutylätherkonzentrationen werden mit einer einzigen Extraktion etwa 87 % des Vitamins B_X1_

zurückgewonnen. Wird die Ätherkonzentration auf etwa 75 bis 80 % erhöht, so ist die erzielte Reinheit des Vitamins B₁₂ erheblich geringer als diejenige, die im angeführten Zwischenbereich erzielt wird.

Andere zweiphasische, ternäre Systeme aus Phenol, Wasser und einem wasserunlöslichen Alkohol, Keton, Ester oder halogenieren Kohlenwasserstoff, wie z. B. Chloroform, sind für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht geeignet. Bei den mittleren Konzentrationen dieser letzteren Lösungsmittelkomponenten werden das Vitamin B₁₂ sowie die normalerweise mit diesem auftretenden organischen Verunreinigungen durch diese Systeme gleich gut gelöst, während diese Systeme bei höheren Konzentrationen entweder das Lösen des Vitamins B₁₂ in

ao der oberen Phase verhindern und in dieser Hinsicht ähnlich wie die Äther wirken oder gegenüber dem Vitamin B₁₂ keine selektive Löslichkeit aufweisen. Die Durchführung des erfindungsgeniäßen Verfahrens wird in den folgenden Beispielea erläutert.

Diese Beispiele sollen den Geltungsbereich der Erfindung nicht einschränken.

Beispiel 1

Auf einem geeigneten künstlichen Medium wurden Streptomyces griseus zwecks Erzeugung von Vitamin B₁₂ gezüchtet. Das pH des Kulturmediums wurde mit Schwefelsäure auf etwa 5,3 eingestellt, worauf die Mycelmasse durch Filtrieren abgetrennt wurde. Das auf diese Weise erhaltene Mycel wurde mit Wasser erhitzt und filtriert. Einem aliquoten Teil von 31 dieses Filtrates, der einen Gehalt von 1700 Gamma Vitamin B₁₂ und 48 g Feststoffen aufwies (Reinheit des Vitamins B₁₂ 0,035 Gamma pro Milligramm Feststoff), wurden 345 cm³ einer 75 gewichtsprozentigen Phenol-Wasser-Lösung (270 g Phenol) zugesetzt. Die Lösung wurde mit einer ternären Mischung aus 150 cm³ 75%igem wäßrigem Phenol (117 g Phenol) und 150 cm³ (112,6 g) Dibutyläther extrahiert. Die obere Phase aus Phenol, Butyläther und Wasser (Volumen 360 cm³, Zusammensetzung 30 °/₀ Dibutyläther, 62,5 % Phenol, 7,5 °/₀ Wasser) wurde abgetrennt. Die untere Phase (Volumen 3300 cm³), die etwa 270 Gamma Vitamin B₁₂ enthielt, wurde mit einer ternären Mischung aus 100 cm³ (75,1 g) Dibutyläther und 100 cm³ einer 75°/_oigen wäßrigen Phenollösung (78 g Phenol) extrahiert. Die obere Phase (Volumen 185 cm³), die aus etwa 50% Butyläther, 46 % Phenol, 4 % Wasser zusammengesetzt war, enthielt etwa 5 Gamma Vitamin B₁₂ und 74 Milligramm Feststoffe. Die verbrauchte untere Phase enthielt weniger als 83 Gamma Vitamin B₁₂ und wurde verworfen.

Das Vitamin B₁₂ wurde aus 95 % (Volumen 518 cm³) der vereinigten oberen Dibutylätherphasen aus den beiden obigen Extraktionen extrahiert, indem 260 cm³ (195 g) Dibutyläther (erzielte Zusammensetzung etwa 52 °/₀ Butyläther, 44 % Phenol und 4 °/₀ Wasser) zugesetzt und mit 50 cm³ Wasser extrahiert wurde. Der wäßrige Extrakt enthielt 600 Gamma Vitamin B₁₂ und 378 mg Feststoffe, was einer Reinheit von 1,6 Gamma Vitamin B₁₂ pro Milligramm Feststoffe entspricht. Die obere Phenol-Dibutyläther-Phase wurde erneut mit 50 cm³ Wasser extrahiert. Die untere Phase enthielt 210 Gamma Vitamin B₁₂ bei einem Reinheitsgrad von 3,1 Gamma pro Milligramm Feststoffe.

Die Phenol-Butyläther-Phase wies nun ein Volumen von 760 cm³ auf und enthielt 506 Gamma Vitamin B₁₂ bei einem Reinheitsgrad von 1,1 Gamma pro Milligramm Feststoffe. Es wurden zusätzliche 150 cm³ (113 g) Dibutyläther zugesetzt, so daß die obere ternäre Phenol-Dibutyläther-Phase nun etwa 60 °/₀ Butyläther, 37 % Phenol und 3 % Wasser enthielt. Diese Lösung wurde mit 50 cm³ Wasser innig vermischt, worauf die Phasen getrennt wurden. Die untere Phase enthielt etwa 180 Gamma Vitamin B₁₂ bei einem Reinheitsgrad von etwa 3,5 Gamma pro Milligramm Feststoffe. Die verbrauchte obere Phenol-Butyläther-Phase, die weniger als no Gamma Vitamin B₁₂ und 402 mg Feststoffe enthielt, wurde verworfen.

90 % der ersten beiden aus unteren Phasen erhaltenen Extrakte (101 cm³ mit einem Gehalt von 729 Gamma Vitamin B₁₂ eines Reinheitsgrades von 1,8 Gamma pro Milligramm Feststoffe) wurde mit 10 cm³ 75°/_oiger wäßriger Phenollösung extrahiert. Die wäßrige obere Phase enthielt weniger als 29 Gamma go Vitamin B₁₂ und 172 mg Feststoffe. Die untere Phenolphase (Volumen 4,5 cm³) wurde mit 15 cm³ (3 Volumina oder 11,25 S) Dibutyläther versetzt. Die dabei erhaltene obere Phenol-Butyläther-Phase enthielt etwa 77 °/o Butyläther. Die untere wäßrige Phase von etwa 1 cm³ wurde abgetrennt und mit 19 Volumina Aceton versetzt. Der dabei ausgefällte braune Feststoff wurde aufgenommen. Dieses Produkt wies nach Trocknung unter vermindertem Druck ein Gewicht von 129 mg auf und enthielt 278 Gamma Vitamin B₁₂ mit einem Reinheitsgrad von 2,15 Gamma Vitamin B₁₂ pro Milligramm Feststoffe.

Beispiel 2

Ein ternäres Gemisch von 4,0 cm³ 75°/_oiger wäßriger Phenollösung und 3,5.0m³ Dibutyläther wurde zur Extraktion von 5 cm³ einer wäßrigen Lösung von Vitamin B₁₂, die einen Gehalt von 175 Gamma Vitamin B₁₂ bei einem Reinheitsgrad von 0,33 Gamma Vitamin B₁₂ pro Milligramm Feststoffe aufwies, verwendet. Die obere Schicht des erhaltenen ternären Gemisches (Volumen 6,3 cm³) wies eine Zusammensetzung von 50% Phenol, 45,5% Butyläther und 4»5 % Wasser auf. Diese Zusammensetzung ist als Punkt ι auf der Kurve der Fig. 1 angegeben. Die untere wäßrige Phase wurde mit 3 cm³ einer Mischung, die in ihrer Zusammensetzung der oberen Wasser-Phenol-Butyläther-Phase entsprach und wie vorher 45,5 % Dibutyläther enthielt, extrahiert. Die veriinigten oberen Schichten (Volumen 9,3 cm³) wurden mit 3 cm³ 3,55%igem wäßrigem Phenol gewaschen. Diese Wasser-Phenol-Lösung ist, wie in Fig. 1 gezeigt, im Gleichgewicht mit der oberen Phase von der bei Punkt ι angegebenen Zusammensetzung. Die gewaschene obere Phenol-Dibutyläther-Phase (Volumen 9,0 cm³) wurde mit 4,5 cm³ (0,5 Volumen) Dibutyl-

äther versetzt, wodurch die Dibutyläther-Konzentration der oberen Phase in etwa 64 % abgeändert wurde. Diese Lösung wurde mit 0,45 cm³ Wasser extrahiert, wobei sich eine wäßrige Schicht von 0,6 cm³ abtrennte. Die wäßrige Schicht wurde entfernt und mit 12 cm³ Aceton versetzt. Der dabei erhaltene Niederschlag wurde aufgenommen. Nach Trocknung wies er ein Gewicht von 3,4 mg auf und enthielt 74 Gamma Vitamin B₁₂, entsprechend einem Reinheitsgrad von 22 Gamma pro Milligramm.

Beispiel 3

Ein 225 g wiegender Filterkuchen aus Diatomeenerde, der 660 000 Gamma Vitamin B₁₂ mit einem Reinheitsgrad von 5,3 Gamma pro Milligramm wasserlöslichen Feststoffen enthielt, wurde zwecks weiterer Reinigung des Vitamins B₁₂ in 6,5 und 218,5 gwiegende Teile aufgeteilt.

Methode A: Phenolextraktion,
bekanntes Verfahren

Der 6,5 g wiegende Teil des Filterkuchens, der insgesamt 19 000 Gamma Vitamin B₁₂ mit einem Reinheitsgrad von 5,3 Gamma pro Milligramm wasserlöslichen Feststoffen enthielt, wurde mit 34 cm³ einer 3,55°/_oigen Lösung von Phenol in Wasser extrahiert, wobei das Vitamin B₁₂ vollständig in das Lösungsmittel überging. Diese Lösung wurde mit 7 cm³ einer 75 °/_oigen wäßrigen Phenollösung extrahiert. Die untere Schicht (Volumen 10 cm³) wurde abgetrennt und mit 40 cm³ (30,0 g) Dibutyläther versetzt, wobei die erhaltene ternäre Lösung die ungefähre Zusammensetzung von 80,8 % Butyläther, 17,6 % Phenol und 1,6 °/₀ Wasser aufwies. Diese Lösung wurde mit 3,0 cm³ Wasser extrahiert, worauf die wäßrige Schicht abgetrennt und zur Beseitigung des restlichen Phenols mit 10 cm³ Dibutyläther gewaschen wurde. Die auf diese Weise erhaltene dunkelrote wäßrige Lösung enthielt 18 600 Gamma Vitamin B₁₂ mit einem Reinheitsgrad von 7,5 Gamma pro Milligramm Feststoffe.

Methode B: Butyläther-Phenol-Extraktion

Der 218,5 g wiegende Teil des obengenannten Filterkuchens, der 97,85 g Diatomeenerde, 120,65 S wasserlösliche Verunreinigungen und 641 000 Gamma Vitamin B₁₂ mit einem Reinheitsgrad von 5,3 Gamma pro Milligramm wasserlöslichen Feststoffen, wurde mit einem ternären Gemisch aus 760 cm³ Wasser, 608 cm³ 75%iger wäßriger Phenollösung und 532 cm³ Dibutyläther geschüttelt. Die Lösung schied sich in zwei Schichten, wobei die obere Phase (Volumen 600 cm³) die durch Punkt 1 in Fig. 1 angegebene Zusammensetzung aufwies, nämlich 45,3 °/o Butyläther, 50,0 °/₀ Phenol und 4,7 % Wasser. Die untere Phase enthielt eine Spur Butyläther, 3,55 % Phenol und 96,45 % Wasser. Die untere Phase und der Filterkuchen wurden mit frischen Portionen von 1,0, 1,5, 1,5 und 1,5 1 der in Punkt 1 von Fig. 1 angegebenen Zusammensetzung weiter extrahiert. Die oberen Dibutyläther-Phenol-Wasser-Phasen wurden zu einem Gesamtvolumen von 6,11 vereinigt, die 455 000 Gamma Vitamin B₁₂ und 10,5 g Feststoffe enthielten. Der Reinheitsgrad des Vitamins B₁₂ betrug 43 Gamma pro Milligramm Feststoffe.

95 % der vereinigten oberen Phasen (Volumen 5,8 1) wurde zweimal mit Portionen von 1,41 von 3,55°/_oigem Phenol (frische untere Phase) gewaschen. Diese Waschlösung wurde mit Portionen von 1,4 und 0,71 einer in ihrer Zusammensetzung der oberen Phase entsprechenden Lösung extrahiert. Die vereinigten oberen Dibutyläther-Phenol-Phasen (Volumen 7,5 1) enthielten, wie die Analyse ergab, 368 000 Gamma Vitamin B₁₂ mit einem Reinheitsgrad von 123 Gamma pro Milligramm Feststoffe.

Die 7,5 1 der vereinigten oberen Phasen wurden mit 3,751 Dibutyläther (2806 g Dibutyläther) versetzt. Die erhaltene obere Phase, die etwa 64,0 °/₀ Butyläther, 33,0 °/₀ Phenol und 3,0 °/₀ Wasser enthielt, wurde mit Wasser in Portionen von 450 und 350 cm³ extrahiert. Zur Verminderung des Volumens der Lösung wurden die vereinigten wäßrigen Extrakte mit 160 cm³ 75%iger wäßriger Phenollösung extrahiert, worauf der wäßrige Rückstand verworfen wurde. Dem Phenolextrakt wurden 480 cm³ Dibutyläther zugesetzt. Die sirupöse wäßrige Schicht, die sich abschied, wurde abgetrennt. Dem Sirup wurden 600 cm³ Aceton zugesetzt. Das gefällte feste Material wurde isoliert, getrocknet, gewogen und analysiert. Es wurden auf diese Weise 2,1 g festes Material erhalten, das 264 000 Gamma Vitamin B₁₂ mit einem Reinheitsgrad von 120 Gamma pro Milligramm enthielt.

•n · -1

Beispiel 4

Ein 3,1 Gamma Vitamin B₁₂ pro Milligramm enthaltender, rosaroter, fester Körper wurde in 3,55%iger wäßriger Phenollösung gelöst, um eine 146 Gamma Vitamin B₁₂ pro Kubikzentimeter enthaltende Lösung zu erzeugen.

Portionen von 5 cm³ dieser Lösung wurden mit Portionen von 5 cm³ einer durch Mischen von Dibutyläther und 75°/_oigem Phenol in den in der Tabelle I angegebenen Mengenverhältnissen erhaltenen ternären no Lösung vermischt. Die obere Phase aus Dibutyläther, Phenol und Wasser wurde abgetrennt und analysiert. Der Prozentgehalt an Vitamin B₁₂, die Gesamtmenge der extrahierten Festkörper und die Reinheit des Vitamins B₁₂ sind in der Tabelle Ia angeführt.

In der Tabelle I ist außerdem die Zusammensetzung der oberen bzw. Extraktionsphase angegeben. Die Punkte 2 bis 6 beziehen sich auf die Fig. 1.

Tabelle

Zusammensetzung des ternären Systems:

Vol. 75%iges Phenol ...

Vol. Butyläther

Vol. Vitamin-B_lä-Lösung

1,0	0,8	o,7	0,65	0,6	o,55	o,5	o,45
0,0	0,2	0,3	o,35	o,4	o,45	o,5	o,55
1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0

0,4

0,6
1,0

noch zu Tabelle I

Zusammensetzung der oberen Schicht:

Butyläther %
Phenol ⁰I₀ ....
Wasser

0,0	19,1	29,6	34,2	39.4	44,2	49,5	54,4
71,0	69,9	62,8	59,2	55,0	51.0	46,2	41.9
29,0	11,0	7,6	6,6	5,6	4,8	4,3	3.7

59.¹

37.6 3,4

Es ist zu beachten, daß bei der Extraktion der Ausgangslösung, welcher kein zusätzlicher Dibutyläther zugesetzt wurde, die Reinheit des Vitamins B₁₂ in der wäßrigen Schicht geringer war als diejenige des Ausgangsmaterials. Die Reinheit des in der Dibutylätherschicht verbleibenden Vitamins B₁₂ ist demgemäß größer als in der Ausgangslösung, da eine zusätzliche Reinigung dieses Teiles des Vitamins B₁₂ stattgefunden hat.

Beispiel 7

40 cm³ einer wäßrigen Lösung, die 30 000 Gamma Vitamin B₁₂ und 272 mg Feststoffe enthielt, entsprechend einer Reinheit von 110 Gamma pro MUH- go gramm, wurden zusammen mit 4 cm³ einer 75°/_oigen wäßrigen Phenollösung und 1,2 cm³ Dibutyläther gerührt. Die aus 3 cm³ bestehende obere organische Schicht wurde abgetrennt und einer Gehaltsbestimmung unterworfen, die 22 000 Gamma Vitamin B₁₂ und 48 mg Feststoffe ergab. Diese zurückgewonnene Menge entspricht einer Ausbeute von 73 °/₀ und einer Reinheit des Produktes von 458 Gamma Vitamin B₁₂ pro Milligramm.

Durch weitere Extraktion der unteren wäßrigen Schicht mit einem Gemisch von 3 cm³ 75°/_oigem wäßrigem Phenol mit ein cm³ Dibutyläther wurde eine obere Schicht erhalten, die 8080 Gamma Vitamin B₁₂ und 76 mg Feststoff enthielt, entsprechend einer Ausbeute von 27% und einer Reinheit von 106 Gamma Vitamin B₁₂ pro Milligramm Feststoffe.

Die Erfindung wird durch die vorangehend beschriebenen. Ausführungsformen nicht eingeschränkt. Es können in der üblichen Weise Modifikationen vorgenommen werden, ohne daß dadurch der Geltungsbereich der in den folgenden Patentansprüchen definierten Erfindung überschritten wird.

Punkt in Fig. 1 6	100,0 5,05	5	—	93,o 14,5	83,0 19,0	4	46,5 37,0	3	4.0 10,0	2	—
Extraktion %			72,0 30,5	18,0 24.5
Reinheit Gamma/Milligramm

Beispiel 5
Diäthyläther

4 g rohes Vitamin B₁₂ mit einem Gehalt von 0,3 Gamma pro Milligramm Feststoffe wurden mit der ternären Lösung von 19,0 g Phenol, 6,4 g Wasser und 8,5 g Diäthyläther behandelt. Die obere abgeschiedene organische Schicht enthielt 31 % der ursprünglichen Feststoffe und 79 °/o des Vitamins B₁₂. Zur abgetrennten oberen Phase wurden zusätzlich 8,5 g Diäthyläther zugesetzt, worauf die wäßrige Schicht, die sich bildete, abgetrennt wurde. Es wurden auf diese Weise 46 °/₀ des anfänglich vorhandenen Vitamins B₁₂ erhalten, das eine Reinheit von 0,8 Gamma pro Milligramm aufwies. '.

Beispiel 6

Extraktion aus Dibutyläther-Phenol mit Wasser
(Fig. III)

40 cm³ einer wäßrigen Lösung von Vitamin B₁₂ wurden mit einer gleichen Volummenge eines der oberen Phase entsprechenden 44,2% Dibutyläther enthaltenden ternären Gemisches aus Dibutyläther, Phenol und Wasser extrahiert. Diese Extraktion wurde mit zwei zusätzlichen Portionen von 30 und 31 cm³ der gleichen Zusammensetzung wiederholt. Die vereinigten Dibutylätherschichten (Volumen - 91 cm³) enthielten 8q °/₀ des in der wäßrigen Äusgangslösung enthaltenen Vitamins B₁₂ bei einem Reinheitsgrad von 34 Gamma pro Milligramm.

Dem obigen Extrakt wurden, fünf Portionen von je 10 cm³ entnommen, die mit 0, 2,0, 4,0, 5,6 bzw. 20,0 cm³ Dibutyläther versetzt wurden.. Jede Portion wurde hierauf mit 10 cm³ Wasser extrahiert. In der folgenden Tabelle sind die Prozente des in jeder erhaltenen oberen Phase enthaltenen Dibutyläthers angegeben, woraus mit Hilfe von Fig. 1 die Gesamtzusammensetzung sowohl der oberen als auch der unteren Phase bestimmt werden kann. In der Tabelle II sind ferner die Reinheit des Vitamins B₁₂ in der wäßrigen unteren Phase und die Prozente des mittels einer einzigen Extraktion entfernten Vitamins angeführt.

Tabelle II

% Butyläther

% Extraktion

Reinheit Gamma/mg

44,2	52,0	57,8	61,7
33,5	86,5	96,5	83,5
29,0	47,o	5i,o	43,o

78,8 93,5 36,5

Claims (15)

1. Patentansprüche:

   i. Verfahren zur Konzentration von Antianaemiaperniziosafaktoren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antianaemiaperniziosafaktoren enthaltendes Material mit einem zweiphasigen, ternären Lösungsmittelsystem, dessen Komponenten aus (1) einer monophenolischen Verbindung, (2) Wasser und (3) einem mit Wasser nicht mischbaren Äther bestehen, innig in Berührung gebracht wird, die Phasen des ternären Systems getrennt und die Antianaemiaperniziosa-

   faktoren in konzentrierter Form aus den abgetrennten Phasen gewonnen werden.
2. 2. Verfahren zur Konzentration von Antianaemiaperniziosafaktoren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antianaemiapemiziosafaktoren enthaltendes Material mit einem zweiphasigen, ternären Lösungsmittelsystem, dessen Komponenten aus (i) einer monophenolischen Verbindung, (2) Wasser und (3) einem mit Wasser

   nicht mischbaren Äther bestehen, in innige Berührung bringt, die beiden Phasen des ternären Lösungsmittelsystems trennt, die abgetrennte obere Phase mit einer neuen, in ihrer Zusammensetzung der unteren Phase entsprechenden Menge Lösungsmittel in innige Berührung bringt, die entstandenen Phasen trennt und die Antianaemiapemiziosafaktoren aus den abgetrennten Phasen gewinnt.
3. 3. Verfahren zur Konzentration von Antianaemiaperniziosafaktoren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antianaemiapemiziosafaktoren enthaltendes Material mit einem zweiphasigen, ternären Lösungsmittelsystem, dessen Komponenten aus (1) einer monophenolischen Verbindung, (2) Wasser und (3) einem mit Wasser nicht mischbaren aliphatischen Äther bestehen, in innige Berührung bringt, die beiden Phasen des ternären Systems trennt, die abgetrennte obere Phase mit einer genügenden Menge eines mit

   Wasser nicht mischbaren Äthers verdünnt, um die Antianaemiapemiziosafaktoren vorzugsweise in der unteren Phase löslich zu machen, die neue tertiäre Lösung mit einer zusätzlichen Menge eines in der Zusammensetzung der unteren Phase entsprechenden Lösungsmittels in innige Berührung bringt, die Phasen trennt und die gereinigten Antianaemiapemiziosafaktoren aus der unteren Phase abtrennt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als mit Wasser nicht mischbarer Äther Diäthyläther verwendet wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als mit Wasser nicht mischbarer Äther Dibutyläther verwendet wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als monophenolische Verbindung Phenol verwendet wird.
7. 7. Verfahren zur Konzentration von Antianaemiapemiziosafaktoren, dadurch gekennzeich-net, daß man ein Antianaemiapemiziosafaktoren enthaltendes Material mit einem zweiphasigen, ternären Lösungsmittelsystem, dessen Komponenten aus Phenol, Wasser und Dibutyläther bestehen und das in der oberen Phase eine Dibutylätherkonzentration von nicht mehr als etwa 55 °/₀ aufweist, in innige Berührung bringt, die beiden Phasen des ternären Lösungsmittelsystems trennt und die die gereinigten Antianaemiapemiziosafaktoren enthaltenden Feststoffe aus der oberen Phase isoliert.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Dibutylätherkonzentration in der oberen Phase etwa 30 bis 50 % beträgt.
9. 9. Verfahren - zur Konzentration von Antianaemiapemiziosafaktoren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antianaemiapemiziosafaktoren enthaltendes Material mit einem zweiphasigen, ternären Lösungsmittelsystem, dessen Komponenten aus Phenol, Wasser und Dibutyläther bestehen, und das in der oberen Phase eine Dibutylätherkonzentration von nicht mehr als etwa 55 °/₀ aufweist, in innige Berührung bringt, die Phasen trennt, die abgetrennte obere Phase mit einer neuen Menge Lösungsmittel, das in seiner Zusammensetzung der unteren Phase entspricht, in innige Berührung bringt, die Phasen trennt und die gereinigten Antianaemiapemiziosafaktoren aus der oberen Phase isoliert.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Dibutylätherkonzentration in der oberen Phase etwa 30 bis 50 % beträgt.
11. 11. Verfahren zur Konzentration von Antianaemiapemiziosafaktoren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antianaemiapemiziosafaktoren enthaltendes Material mit einem zweiphasigen, ternären Lösungsmittelsystem, dessen Komponenten aus Phenol, Wasser und Dibutyläther bestehen, wobei die Dibutylätherkonzentration in der oberen Phase nicht mehr als 55 °/₀ beträgt, in innige Berührung gebracht wird, die Phasen getrennt werden, der oberen Phase Dibutyläther in einer Menge zugesetzt wird, die genügt, um die Antianaemiapemiziosafaktoren vorwiegend in der unteren Phase löslich zu machen, das neue tertiäre System mit einer zusätzlichen Menge, der unteren Phase in der Zusammensetzung entsprechenden, Lösungsmittel in innige Berührung gebracht wird, die Phasen getrennt und die gereinigten Antianaemiapemiziosafaktoren daraus isoliert werden.
12. 12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Dibutylanfangskonzentration etwa 30 bis 50 % beträgt.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Dibutyläther zugesetzt wird, bis das zweite ternäre System eine Dibutylätherkonzentration von etwa 46 bis 65 % aufweist.
14. 14. Verfahren zur Konzentration der Antianaemiapemiziosafaktoren in einem Material, das nicht mehr als 5,0 Gamma Vitamin B₁₂ pro Muligramm Feststoffe enthält, unter Bildung eines Produktes, das einen Reinheitsgrad von mehr als etwa 120 Gamma Vitamin B₁₂ pro Milligramm Feststoffe aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Material in einem zweiphasigen, ternären Lösungsmittelsystem, das aus Wasser, Phenol und Dibutyläther besteht -und dessen Dibutylätherkonzentration in der oberen Phase nicht größer als etwa 55 % ist, gründlich verteilt, die beiden Phasen trennt und hierauf die Antianaemiaperniziosafaktoren aus der oberen Phase isoliert.
15. 15. Verfahren zur Konzentration der Antianaemiapemiziosafaktoren in einem Material, das Vitamin B₁₂ mit einem Reinheitsgrad enthält, der etwa 100 Gamma pro Milligramm Feststoffen entspricht, unter Bildung eines Produktes mit

    einem Reinheitsgrad von über etwa 400 Gamma pro MiUigramm Feststoffe, dadurch gekennzeichnet, daß man das Material in einem zweiphasigen, ternären Lösungsmittelsystem, das aus Wasser, Phenol und Dibutyläther besteht und in der oberen

    Phase eine Dibutylätherkonzentration von nicht mehr als etwa 55 °/₀ aufweist, gründlich verteilt, die beiden Phasen trennt und hierauf die Antianaemiaperniziosafaktoren aus der oberen Phase isoliert.

    Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

    I 5427 9.55