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Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von
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Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von Poliomyeli- tisvirus enthaltenden Kulturflüssigkeiten, welches darin besteht, dass ein das Virus enthaltendes Gewebe- kulturfiltrat mit Nucleinsäure, vorzugsweise Hefenucleinsäure, in einer Menge, die mindestens ungefähr
2, 5 pg/ml an gereinigter Nucleinsäure entspricht, versetzt, das PH auf einen Wert zwischen 2 und 4, vorzugsweise auf etwa 3,5 eingestellt und das ausgefällte Virus gewonnen wird.
Die bekannten Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Virussubstanzen aus Gewebekultur- filtraten erfordern eine grosse Zahl von Verfahrensschritten, welche mit Ausbeuteverlusten verbunden sind und die Gefahr weiterer Verunreinigungen mit sich bringen. Ausserdem sind sie äusserst zeitraubend. Bei- spielsweise umfasst ein bekanntes Reinigungsverfahren für Poliomyelitisvirus folgende Verfahrensstufen :
1. Wiederholte Fällung des Virus in Gegenwart von Methanol, Filtrierung des ausgefällten Virus mit
Hilfe eines Trägerstoffes (z. B. Celit) und Elution des Filterkuchens;
2. wiederholte Emulgierung in Butanol zur Entfernung von Protein ;
3. Digestion mit Enzymen ;
4. zwei Ultrazentrifugendurchgänge ;
5. abschliessendes Ultrazentrifugieren in Rohrzuckerlösung von abgestufter Dichte und
6. Entfernung des Zuckers.
Es ist leicht ersichtlich, welche Schwierigkeiten derart komplizierte Methoden, auf grosse Mengen hochinfektiöser Virusflüssigkeiten angewendet, für die industrielle Verarbeitung mit sich bringen, und welche Bedeutung einem Verfahren zukommt, das einfach und rasch zu einem im wesentlichen reinen
Virusprodukt führen kann.
Die Nachteile und Gefahren der bekannten Methoden zur Reinigung und Konzentrierung von Polio- myelitisvirus werden durch das erfindungsgemässe Verfahren zur Gänze vermieden, welches die Möglich- keit bietet, Poliomyelitisvirus quantitativ und in hochgereinigter Form aus verdünnten oder konzentrier- ten virushaitigen Rohlösungen durch Zusatz von Nucleinsäure und Einstellen der Lösung auf ein PH zwi- schen etwa 2 und 4 auszufällen.
Wenngleich das durch diese eine Fällungsstufe erhaltene Virusmaterial genügend gereinigt und kon- zentriert ist, um es für die Herstellung von Poliomyelitis-Vaccine zu verwenden, kann eine weitere Reini- gung noch dadurch erreicht werden, dass das ausgefällte Virusmaterial in einer wässerigen, gepufferten
Lösung bei einem pH-Bereich von etwa 4,5 bis 9, vorzugsweise 6, 5 - 8, 5 gelöst wird, worauf restliche
Nucleinsäure und Verunreinigungen von Proteincharakter durch Digestion der Lösung mit Ribonuclease bzw. von Ribonuclease und Desoxyribonuclease in Gegenwart von Magnesiumionen, welche die Desoxy- ribonuclease aktivieren, abgebaut werden.
Die Digestion wird während 1 h bei ungefähr 370C durchge- führt, dann gereinigtes Ficin (vorzugsweise mit Cystein aktiviert) zugesetzt und die Digestion während einer weiteren Stunde bei ungefähr 370C fortgesetzt. Dabei werden die Nucleinsäure und die Proteinsub- stanzen soweit abgebaut, dass sie während der nachfolgenden Ausfällung des Virusmaterials löslich blei- ben. In diesem Stadium ist nahezu die ganze Nucleinsäure verdaut, es bleibt jedoch meist noch eine
Spur übrig, welche eben ausreicht, um das Virusmaterial bei Einstellung des PH zwischen 2 und 4 wieder auszufällen. Die ausgefällte Substanz kann dann, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und der Rück- stand in einer gepufferten Lösung vom PH 4, 5 - 9 aufgenommen werden.
Wenn gewünscht, kann die
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gepufferte Lösung des Virusmaterials ultrazentrifugiert und der Rückstand abermals in einer geringen Menge einer gepufferten Lösung vom pH 4, 5 - 9, aufgenommen werden. Wenn nach der Digestion mit Nuclease und Ficin bei Einstellung des PH auf etwa 2 - 4 keine Fällung erfolgen sollte, so kann durch Einstellen des PH der Lösung auf einen Wert über 4,0 und Zusatz einer sehr geringen Menge von Nucleinsäure das Virusmaterial durch anschliessendes Wiederansäuern ausgefällt werden.
Als Nucleinsäure kann beim erfindungsgemässen Verfahren sowohl Ribonucleinsäure als auch Desoxyribonucleinsäure, d. h. pflanzliche oder tierische Nucleinsäure verwendet werden. Der bei der Ausfällung der Virussubstanz wirksame Anteil der Nucleinsäure ist die unabgebaute, hochpolymere Nucleinsäure.
Diese kann aus einer Nucleinsäure des Handels durch Reinigung nach dem unten beschriebenen Verfahren erhalten werden oder die rohe Nucleinsäure kann in entsprechend grösseren Mengen zur Anwendung kommen. So genügt beispielsweise 1 ug/ml von hochpolymerer Nucleinsäure, erhalten durch Reinigung von handelsüblicher Hefe-Nucleinsäure, zur Ausfällung von Poliomyelitis-Virus aus Gewebekulturfiltrat von Affennierenzellen oder andern Gewebekulturflüssigkeiten. Diese Menge (1 lig) kann aus ungefähr 30 jug roher Säure erhalten werden. Durch Zusatz der letzteren Menge (30 ug) von roher Nucleinsäure wird der gleiche Effekt ohne vorherige Reinigung erzielt.
Die Verwendung von Nucleinsäure zur Konzentrierung von Virussubstanzen aus Gewebekulturflüssig-
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: l. Es werdenstanz ; höhere Konzentrationen können, wenn gewünscht, verwendet werden, sind aber im allgemeinen nicht nötig. 2. Die Nucleinsäure ist leicht erhältlich und billig, insbesondere wenn Hefenucleinsäure verwendet wird. 3. Der Niederschlag von Nucleinsäure und Virus ist in neutralen wässerigen Lösungen leicht löslich. 4. Aufeinanderfolgende Fällungsoperationen können ohne Verluste an Virusmaterial durch- geführt werden. 5. Die Nucleinsäure kann von dem Virusmaterial durch Digestion mit einer Nuclease, wie Ribonuclease oder eine Mischung von Ribonuclease und Desoxyribonuclease, abgetrennt werden.
Die Spaltprodukte der Nucleinsäuredigestion können dann durch Dialyse, Ultrazentrifugieren oder Wiederausfällung des Virusmaterials durch Zusatz eines Alkohols, z. B. Äthanol oder Methanol, entfernt werden, wobei die Digestionsprodukte in der überstehenden Flüssigkeit verbleiben.
Die nachfolgende Digestion mit gereinigtem Ficin oder andern proteolytischen Enzymsn, z. B. Papain, entfernt die proteinartigen Verunreinigungen. Bei Verwendung von gereinigtem Ficin wird dieses vorteilhafterweise durch Zusatz von Cystein aktiviert, wobei im allgemeinen ein Verhältnis von 10 Gew.Teilen Cystein pro Gew. -Teil Ficin angewendet wird.
Die Ausfällung von Virusmaterial bei PH 2 - 4 in Gegenwart von Nucleinsäure wird vorteilhafterweise beieinerTemperatur von ungefähr 1 bis 100Cdurchgeführt. Während der geeignetste pH-Bereich zwischen 2,0 und 4,0 liegt, kann die Acidität auch bis auf pH = 1 erhöht werden und das Virus dabei ausgefällt werden, vorausgesetzt, dass dieser Schritt so rasch wie möglich ausgeführt wird, um einen Abbau des Virus oder virushaitigen Materials durch die Säure zu vermeiden. Die zur Einstellung des pH verwendete Säure kann eine Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure sein, oder eine organische Säure, wie z. B. Zitronensäure oder Oxalsäure.
Da Salzsäure ebenso wirksam ist wie jede andere Säure und ein leicht verfügbares Laboratoriumsreagens darstellt, wurde diese Säure bei dem nachstehend näher beschriebenen Prozess verwendet.
Die Herstellung von gereinigtem Poliomyelitisvirus nach dem erfindungsgemässen Verfahren ist von grosser wirtschaftlicher Bedeutung, weil es dadurch zum ersten Mal möglich wird, die Konzentrierung und Reinigung in wesentlich kürzerer Zeit als bei Anwendung der bekannten Verfahren durchzuführen und das Virus in praktisch quantitativen Ausbeuten zu gewinnen. Die Bedeutung des erfindungsgemäss erhaltenen reinen Virus besteht darin, dass es in eine reine Vaccine überführbar ist. welche gegenüber den bisher hergestellten Vaccinen die nachstehenden Vorteile besitzt : 1. Erhöhte Sicherheit, weil die Reproduzierbarkeit von nicht infektiösem Virusmaterial durch die Verwendung bekannter Konzentrationen von reinem Virus gewährleistet ist ; 2.
Abwesenheit von unerwünschtem fremdem Protein ; 3. es können konstante, vorbestimmte Dosen in jedem beliebigen Volumen verabreicht werden und 4. ist es zum ersten Mal möglich, die gewünschte Menge an reinem, inaktiviertem Virus in Form einer Vaccine andern Vaccinen einzuverleiben, welche. dann alle gleichzeitig in Form einer einzigen Dosierung verabreicht werden können.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert, welche nicht nur die. Reproduzierbarkeit des Prozesses, sondern auch alle Massnahmen zur Herstellung einer wirksamen Vaccine aus reinem Poliomyelitisvirus veranschaulichen.
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Die Herstellung der in den Beispielen verwendeten Reagenzien kann in folgender Weise erfolgen :
Reinigung von roher Hefenucleinsäure : Eine Lösung von 10 g handelsüblicher Hefenucleinsäure, im folgenden als Hefenucleinsäure (Schwarz), bezeichnet, in 1 Liter lagern Phosphatpuffer (PH = 7), der 2% Natriumchlorid enthält, wird mit 10n-Salzsäure auf PH = 3, 0 eingestellt und der gebildete Niederschlag absitzen gelassen. Die überstehende Lösung wird abdekantiert und der Niederschlag in 100 ml lagern Phosphatpuffer (1P = 7,0), der 21o Natriumchlorid enthält, wieder aufgelöst.
Das PH dieser Lösung wird mit 10n-Salzsäure auf 3, 0 eingestellt und die entstandene Suspension während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 20C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und der Niederschlag in 50 ml lagern, 2% Natriumehlorid enthaltendem Phosphatpuffer (PH 7, 0) gelöst. Die spektrophotometri- sche Untersuchung zeigt, dass die Konzentration der gereinigten Hefenucleinsäure in der Lösung 300 lig/ml beträgt.
Die durch dieses Reinigungsverfahren erhaltene Ausbeute an gereinigter Hefenucleinsäure (15 mg aus 10 g Ausgangsmaterial) ist jedoch so gering, dass Versuche über die Eignung der handelsüblichen Hefenucleinsäure zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens unternommen wurden. Dabei ergab es sich, dass das rohe Material zufriedenstellende Ergebnisse liefert (s. z. B. Beispiel 4), wenn es in der 40bis 100fach höheren Konzentration als die gereinigte Nucleinsäure angewendet wurde.
Reinigung von Ficin : 2 g Ficin (Merck & Co., Inc., Rahway. New Jersey, U. S. A.) werden in 20 ml Acetatpuffer (PH 5, 0 Ionenstärke 0, 01) suspendiert. Die Suspension wird ohne zu schäumen während 1 h gerührt, wodurch eine trübe Lösung entsteht, welche während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 100C zentrifugiert wird. Der überstehenden Lösung werden 2 g Celit 503 (Diatomeen-Filterhilfe der Fa. JohnsManville Company) zugesetzt und diese hierauf durch Filterpapier filtriert. Das Filtrat wird auf 1 - 50C abgekühlt und dann mit auf -200C abgekUhltem Methanol unter Rühren bis zu einer Endkonzentration von 40% (Volumen pro Volumen) zugesetzt.
Die Mischung wird bei -100C über Nacht stehen gelassen und dann zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit verworfen und der Niederschlag dreimal mit je 5 ml destilliertem Wasser gewaschen wird, wobei jede Extraktionsmischung bei 20C zentrifugiert wird.
Die vereinigten Extrakte werden während einer Woche bei 50C aufbewahrt, dann der gebildete Niederschlag abzentrifugiert und die überstehende Lösung lyophilisiert. Das vollkommen wasserlösliche lyophilisierte Produkt enthält 70% der ursprünglichen Wirksamkeit.
Prüfmethoden : Bei der Beurteilung der Wirksamkeit eines Reinigungsverfahrens für Poliomyelitisviren ist eine einfache, genaue und rasche Prüfmethode unbedingt erforderlich. Die wichtigsten in Gebrauch stehenden Untersuchungsmethoden beruhen auf a) dem Stoffwechselhemm- (Farb)-Test, auch als Infek- tiositäts- (Farb)-Test bekannt (s. Salk Youngner und Ward, Americ. Joum. of Hygiene 60 [1954], S. 214), b) dem Plättchenbildungs-Test (Hsiung und Melnick, Virologg 1, [1955], S. 533) und c) der Komplement-Fixierungs-Methode (CF).
Die letztgenannte dieser Methoden misst die totale vorhandene antigene Masse, während mit den ersten beiden Methoden nur der kleinere, infektiöse Teil der antigenen Masse bestimmt wird. In der vorliegenden Untersuchung wurden alle drei Methoden mit guter Übereinstimmung angewendet, wie die nachstehende Tabelle A zeigt. Aus Gründen der Einfachheit und Raschheit wurde als Hauptbestimmungsmethode die Komplement-Fixierungs-Methode gewählt und es ist diese Methode, die in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen verwendet wurde.
Tabelle A Übereinstimmung der Prüfmethoden bei Verfolgung der Reinigung von Poliomyelitisvirus
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<tb>
<tb> Material <SEP> Farbtest <SEP> Plättchentest <SEP> Verhältnis
<tb> (x <SEP> 10c) <SEP> (x <SEP> 10c) <SEP> CF <SEP> * <SEP> Plättchen <SEP> x <SEP> 100 <SEP> CF
<tb> Gewebekulturfiltrat <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP> 13 <SEP> 4 <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Teilweise <SEP> gereinigte <SEP> Lösung <SEP> 710 <SEP> 960 <SEP> 180 <SEP> 5,3
<tb> Überstehende <SEP> Flüssigkeit <SEP> nach
<tb> Ultrazentrifugieren <SEP> 870 <SEP> 1560 <SEP> 320 <SEP> 4,9
<tb> Gereinigte <SEP> Lösung <SEP> 13, <SEP> 000 <SEP> 17,000 <SEP> 4800 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
* CF bedeutet Komplement-Fixierungseinheiten
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Rohes virushaltiges Ausgangsmaterial :
Soweit nicht anders angegeben, wurden die in den nachfolgenden Beispielen verwendeten Gewebekulturfiltrate durch Züchtung des Virus auf Affennierenzellen und Ernten nach bekannten Verfahren erhalten.
Beispiel l : 100ml eines Poliomyelitisvirus Typ I (Mahoney) enthaltenden Gewebekulturfiltrates mit einem Gesamtgehalt von 300 CF-Einheiten je 100 ml werden mit 1, 67 ml einer 300 g/ml enthaltenden Lösung von gereinigter Hefenucleinsäure versetzt, auf 50C abgekühlt, mit ln-Salzsäure aufpH 2, 5 eingestellt und während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 2 C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und der feste Rückstand in 5 mll%igem, 20/0 Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer (pH 7, 0) gelöst. In der überstehenden Flüssigkeit lassen sich keine CF-Einheiten nachweisen, während die Lösung des Rückstandes einen Gesamtgehalt von 320 CF-Einheiten aufweist, was einer 20fachen Volumenkonzentration ohne Aktivitätsverlust entspricht.
Zur Kontrolle werden weitere 100 ml dieser Lösung auf 50C abgekühlt, mit 1n-Salzsäure auf pH 2,5 eingestellt und während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 20C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und der Rückstand in 5 ml 1%igem, 2% Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst. In der überstehenden Flüssigkeit finden sich insgesamt 200 CF-Einheiten, die Lösung des Rückstandes zeigt keine Wirksamkeit.
Beispiel 2 : Zu vier Proben von 100-ml eines Gewebekulturfiltrates mit einem Gehalt an Poliomyelitisvirus Typ III- (Saukett) und 250 CF-Einheiten/100 ml werden je 1, 67 ml, 0,84 ml, 0,42 ml und 0,21 ml einer 300 ug/ml enthaltenden, gereinigten Hefenucleinsäurelösung zugegeben, dann wird auf 50C abgekühlt, mit ln-Salzsäure auf pH 2,5 eingestellt und während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 20C zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten werden verworfen und die einzelnen Zentrifugate für sich in 5 ml1%igem, 2% Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer (PH 7,0) gelöst.
Die Untersuchung der Konzentrate gibt die in Tabelle B gezeigten Ergebnisse :
Tabelle B
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<tb>
<tb> Endkonzentration <SEP> der <SEP> gereinigten <SEP> Gesamte <SEP> CF-Einheiten <SEP> Im <SEP> Konzentrat <SEP> vorhandene <SEP> Aktivität
<tb> Hefenucleinsäure <SEP> ( g/ml) <SEP> im <SEP> Konze'at <SEP> in <SEP> % <SEP> der <SEP> ursprünglichen <SEP> Aktivität
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 240 <SEP> 96%
<tb> 2, <SEP> 5 <SEP> 240 <SEP> 96%
<tb> 1,25 <SEP> 140 <SEP> 56%
<tb> 0. <SEP> 625 <SEP> 25 <SEP> 10%
<tb>
Beispiel 3 : 500 ml des in Beispiel 2 verwendeten, Poliomyelitisvirus Typ III (Saukett) enthaltenden Gewebekulturfiltrates werden mit 8,33 ml einer 300 g/ml enthaltenden gereinigten Hefenucleinsäurelösung versetzt.
Die Lösung wird auf 50C abgekühlt, darauf das PH mit ln-Salzsäure auf 2, 5 eingestellt und die Mischung hierauf bei 50C aufbewahrt. In den in der untenstehenden Tabelle C angegebenen Zeitabständen wird die Mischung gerührt, um das ausgefallene Material zu suspendieren, und ein aliquoter Anteil von je 100 ml entnommen. Jeder dieser Anteile wird während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 2 C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und der Rückstand in 5 ml Iloigern, 21o Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer (PH 7, 0) gelöst.
Die Konzentrate ergeben bei CF-Test folgende Resultate :
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Tabelle C
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<tb>
<tb> Zeit <SEP> (Stunden) <SEP> Gesamte <SEP> CF-Einheiten <SEP> Im <SEP> Konzentrat <SEP> vorhandene <SEP> Aktivität
<tb> im <SEP> Konzentrat <SEP> in <SEP> % <SEP> der <SEP> ursprünglichen <SEP> Aktivität
<tb> 0,5 <SEP> 240 <SEP> 96%
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 240 <SEP> 96%
<tb> 2,0 <SEP> 240 <SEP> 96%
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> 200 <SEP> 80%
<tb> 21,0 <SEP> 240 <SEP> 96%
<tb>
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tionen erhalten werden. Alle Anteile werden auf 50C abgekühlt, mit In-Salzsäure auf PH 2,5 eingestellt und während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 2 C zentrifugiert.
Die überstehenden Flüssigkeiten werden verworfen und jeder Rückstand gesondert in 5 ml lagern, 2% Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer (PH 7,0) gelöst. Die Untersuchung der Konzentrate gibt folgende Ergebnisse :
Tabelle D
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<tb>
<tb> Konzentration <SEP> der <SEP> handelsüblichen <SEP> Gesamte <SEP> CF-Einheiten <SEP> Im <SEP> Konzentrat <SEP> vorhandene <SEP> Aktivität
<tb> Hefenucleinsäure <SEP> (j.
<SEP> Lg/ml) <SEP> im <SEP> Konzentrat <SEP> in <SEP> % <SEP> der <SEP> ursprünglichen <SEP> Aktivität <SEP>
<tb> 200 <SEP> 280 <SEP> 112%
<tb> 100 <SEP> 280 <SEP> 112go
<tb> 50 <SEP> 320 <SEP> 128%
<tb> 25 <SEP> 200 <SEP> 80%
<tb>
10 ml einer 20 mg/ml enthaltenden Lösung von Hefenucleinsäure (Schwarz werden zu 1 Liter Ge- webekulturfiltrat, das (Saukett)-Poliomyelitisvirus vom Typ III enthält und eine Aktivität von 4000 CF-
Einheiten/Liter aufweist, zugesetzt, worauf die Lösung auf 50C abgekühlt, mit In-Salzsäure auf PH 3, 5
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20C zentrifugiert. Die klare überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Zentrifugat in 10 ml lagern,
2% Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer (PH 7, 0) gelöst.
Das Konzentrat zeigte bei einer Unter- suchung insgesamt 4000 CF-Einheiten, was einer 100longen Wiedergewinnung der ursprünglich in dem
Gewebekulturfiltrat anwesenden Aktivität in 1/100 des ursprünglichen Volumens entspricht.
Beispiel 6 : 5 ml einer 20 mg/ml enthaltenden Lösung von Hefenucleinsäure (Schwarz) werden zu
1 Liter eines Poliomyelitisvirus vom Typ III (Saukett) enthaltenden Gewebekulturfiltrates zugesetzt, wor- auf die Lösung auf 50C abgekühlt, mit 1n-Salzsäure auf PH 2, 5 eingestellt und während 18 h bei 5 C ab- setzen gelassen wird. Die weitere Verarbeitung erfolgt nach dem Beispiel 5. Ein Teil des erhaltenen Kon- zentrates wird auf Infektiosität und Komplement-Fixierung untersucht, wobei die in Tabelle E (1) ange- führten Ergebnisse erhalten werden.
Der Rest der Lösung wird 1 h bei 370C mit einer Lösung von 1 mg ge- reinigtem Ficin und 10 mg Cystein in 1 ml Wasser behandelt und dann in gleicher Weise (Tabelle unter (2)) untersucht :
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Tabelle E
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<tb>
<tb> Art <SEP> der <SEP> Probe <SEP> Infektionsitäts-Farb-Test <SEP> CF-Einheiten
<tb> (TCID <SEP> pro <SEP> ml) <SEP> (pro <SEP> ml)
<tb> (1) <SEP> Konzentrierte <SEP> Lösung <SEP> von <SEP> Poliomyelitisvirus <SEP> 1. <SEP> 10 <SEP> 280
<tb> (2) <SEP> obige <SEP> Lösung <SEP> nach <SEP> Digestion <SEP> mit
<tb> 100 <SEP> g/ml <SEP> gereinigtem <SEP> Ficin <SEP> 1. <SEP> 10 <SEP> 240 <SEP>
<tb>
Beispiel 7: Ein nach Beispiel 5 erhaltenes Konzentrat wird während 1 h bei 370C mit Ribonuclease (10/lg/ml) digeriert.
Es enthält nach der Digestion mit Ribonuclease 3600 CF-Einheiten. Dann wird mit gereinigtem Ficin (100 g/ml) und 1 mg/ml Cystein versetzt und die Digestion während einer weiteren Stunde bei 370C fortgesetzt. Nach der Digestion mit Ficin enthält die Lösung 2800 CF-Einheiten. Sie wird dann auf 50C abgekühlt, mit 1,5 Vol. kaltem destilliertem Wasser verdünnt, das PH mit ln-Salz- säure auf 2,5 eingestellt und während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 20C'zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Zentrifugat in 11,5 ml 1%igem, 2% Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer (PH 7, 0) gelöst. Die Untersuchung dieser Lösung ergibt einen Gesamtgehalt von 2800 CFEinheiten.
Beispiel 8 : 2 Liter eines Poliomyelitisvirus vom Typ in (Saukett) enthaltenden Gewebekulturfiltrates mit einem Gesamtgehalt von 7000 CF-Einheiten wird auf 50C abgekühlt, mit 10 ml einer 20 mg/ml
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die Lösungwährend 18 h bei 50C stehen gelassen. Nach Abdekantieren der überstehenden Flüssigkeit wird das Sediment während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 20C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Zentrifugal in 10 ml Iloigem, 21o Natriumchlorid enthaltenden Phosp@atpuffer (pH 7, 0) gelöst.
Diese Lösung mit 6400 CF-Einheiten wird mit Ribonuclease (10/lg/ml) während 1 h bei 370C digeriert. Nach der Digestion mit Ribonuclease enthält die Lösung insgesamt 4800 CF-Einheiten. Sie wird mit gereinigtem Ficin (100/lg/ml) und Cystein (1 mg/ml) versetzt und die Digestion eine weitere Stunde bei 370C fortgesetzt. Nach der Digestion mit Ficin enthält die Lösung insgesamt 4000 CF-Einheiten. Sie wird dann auf 50C abgekühlt, mit 1, 5 Vol. kaltem destilliertem Wasser verdünnt, das pH mit In-Salzsäure auf 2,5 eingestellt und während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 20C zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das, Zentrifugat in 11,5 ml 1%igem, 2% Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer (PH 7, 0) gelöst. Diese Lösung weist insgesamt 4000 CF-Einheiten auf. Sie wird während 3 h auf 40 000 Umdr/min bei 20C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, das Zentri-
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wäh-Einheiten.
Tabelle F fasst die Versuchsdaten des obigen Beispieles am Ende jedes einzelnen Verfahrensschrittes zusammen.
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Tabelle F
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<tb>
<tb> probe <SEP> Volumen <SEP> (ml) <SEP> Gesamt-CF-Einheiten <SEP> % <SEP> der <SEP> urspr. <SEP> Aktivität
<tb> Ursprüngl. <SEP> Gewebekulturfiltrat <SEP> 2,000 <SEP> 7,000 <SEP> 100
<tb> Überstehende <SEP> Flüssigkeit <SEP> der <SEP> Fällung <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 000
<tb> Lösung <SEP> der <SEP> Fällung <SEP> (PH <SEP> 3, <SEP> 5) <SEP> 10 <SEP> 6,400 <SEP> 91
<tb> Obige <SEP> Lösung <SEP> nach <SEP> Digestion <SEP> mit
<tb> Ribonuclease <SEP> 10 <SEP> 4,800 <SEP> 69
<tb> Obige <SEP> Lösung <SEP> nach <SEP> Digestion <SEP> mit
<tb> gereinigtem <SEP> Ficin. <SEP> 10 <SEP> 4, <SEP> 000 <SEP> 57
<tb> Überstehende <SEP> Flüssigkeit <SEP> v.
<SEP> Fällung
<tb> bei <SEP> PH <SEP> 2,5 <SEP> 25 <SEP> weniger <SEP> als <SEP> 500 <SEP> weniger <SEP> als <SEP> 7
<tb> Lösung <SEP> der <SEP> Fällung <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 000 <SEP> 57
<tb> Überstehende <SEP> Flüssigkeit <SEP> nach <SEP> Ultrazentrifugieren <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 550 <SEP> 8
<tb> Lösung <SEP> des <SEP> ultrazentrifugierten
<tb> Rückstandes <SEP> 10 <SEP> 3, <SEP> 500 <SEP> 50
<tb>
Die Reinheit des nach obigem Beispiel erhaltenen Poliomyelitisvirus wurde durch einen Vergleich seines Ultraviolett-Spektrums mit dem von Schwerdt & Schaffer (Annals of the New York Academy of
Sciences, 61 [1955], S. 740) veröffentlichten Spektrum nachgewiesen, die beide ein Maximum bei 260 mal und ein Minimum bei 241 mu aufweisen.
Beispiel 9 : 500 ml eines Poliomyelitisvirus vom Typ III (Saukett) enthaltenden Gewebekultur- filtrates mit einem Gesamtgehalt von 1750 CF-Einheiten wird auf 50C abgekühlt, mit 5 ml 20 mg/ml enthaltenden Hefenucleinsäurelösung (Schwarz) versetzt und das pH mit ln-Salzsäure auf 3,5 eingestellt.
Die Lösung wird während 20 h bei 50C stehen gelassen, die überstehende Flüssigkeit verworfen und das
Sediment während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 20C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Zentrifugat in 10 ml lagern, 2% Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer (PH 7, 0) gelöst. Diese Lösung enthält insgesamt 2000 CF-Einheiten. Sie wird während 1 h bei 370C der Digestion mit einer Mischung von Ribonuclease (10 j. tg/ml), Desoxyribonuclease (10 g/ml) und Magnesiumsulfat (MgSO 7H 0, 10 Mg/ml) unterworfen. Nach dieser Digestion enthält die Lösung insgesamt 1600 CF-Ein- heiten.
Sie wird mit gereinigtem Ficin (25 g/ml) und Cystein (250 fig/ml) versetzt und die Digestion während einer weiteren Stunde bei 370C fortgesetzt. Nach der Digestion mit Ficin enthält die Lösung ins- gesamt 2400 CF-Einheiten. Sie wird dann auf 50C abgekühlt, mit 2 Vol. kaltem, destilliertem Wasser verdünnt, das PH mit ln-Salzsäure auf 2,5 eingestellt und während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 2 C . zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Zentrifugat in 10 ml10/oigem, 2f1/0
Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer (PH 7. 0) gelöst. Die Lösung enthält 2660 CF-Einheiten.
Beispiel 10 : Poliomyelitisvirus vom Typ III (Saukett) wird nach üblichen Verfahren auf Rhesus-
Testicularzellen gezüchtet. Nach dem Ernten der Kulturen wird der Zellrückstand abzentrifugiert. Ein aliquoter Anteil der klaren Gewebekulturflüssigkeit wird gegen 0. 85' ge Natriumchloridlösung dialysiert, da die Komplement-Fixiermethode mit der unbehandelten Lösung wegen Farbinterferenzen nicht durch- führbar ist (Probe MT-61, untenstehende Tabelle G). Zu einem weiteren aliquoten Anteil von 100 ml der klaren virushaitigen Flüssigkeit wird 1 ml einer 20 mg/ml enthaltenden Hefenucleinsäurelösung (Schwarz) zugesetzt, die Lösung auf 5% : abgekühlt, das PH mit In-Salzsäure auf 2, 5 eingestellt und während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 20C zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Zentrifugat in 10 ml (1/10 des ursprünglichen Volumens) lloigem, 20/0Natriumchlorid enthalten- den Phosphatpuffer (PH 7, 0) gelöst. Zwei weitere aliquote Anteile (Proben MT-62 und, MT-62-C) werden
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in gleicher Weise wie oben beschrieben, behandelt. In der Tabelle sind die dabei erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt.
Tabelle G
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<tb>
<tb> Probe <SEP> CF-Einheiten/ml <SEP> Wiedergewinnung <SEP> an <SEP> Aktivität
<tb> MT <SEP> -61, <SEP> ursprüngliche <SEP> Flüssigkeit
<tb> (dialysiert) <SEP> 12
<tb> MT-61-C, <SEP> Lösung <SEP> des <SEP> Feststoffanteiles <SEP> aus <SEP> Obigem <SEP> 128 <SEP> 100%
<tb> MT-62, <SEP> ursprüngliche <SEP> Flüssigkeit
<tb> (dialysiert) <SEP> 25 <SEP> --- <SEP>
<tb> MT-62-C. <SEP> Lösung <SEP> des <SEP> Feststoffanteiles <SEP> aus <SEP> Obigem <SEP> 256 <SEP> 100%
<tb>
EMI8.2
11 : Manche virushaitigenTabelle H
EMI8.3
<tb>
<tb> Probe <SEP> Infektiosität <SEP> Infektiosität <SEP> nach <SEP> % <SEP> Rückgewinnung <SEP> CF/ml <SEP>
<tb> nach <SEP> Farbtest <SEP> Plättchentest <SEP> nach <SEP> den <SEP> Infektiositätstests
<tb> 1) <SEP> Ursprüngliche <SEP> Flüssig-antikomkeit <SEP> (dialysiert) <SEP> 10 <SEP> 1. <SEP> 10---plementär
<tb> 2) <SEP> 10fache <SEP> Konzentrierung <SEP> des <SEP> Obigen <SEP> 10'1. <SEP> 10 <SEP> 100'%'56
<tb>
Die Daten in Tabelle H zeigen : l.
Nucleinsäure kann zur Ausfällung von Poliomyelitisvirus aus virushaltigen Flüssigkeiten, die nicht aus Affennierenzellen stammen, verwendet werden ; 2. die durch die
<Desc/Clms Page number 9>
Fällung mit Nucleinsäure erzielte Konzentrierung ist quantitativ ; 3. die Wirksamkeit des Fällungsverfahrens mit Nucleinsäure wird sowohl durch die bei den Infektiositätsmessungen als den bei der KomplementFixierungsmethode erhaltenen Werte bestätigt ; und 4. das Nucleinsäure-Fällverfahren konzentriert VirusAntigen bevorzugt vor antikomplementären Stoffen und gestattet damit die Anwendung der KomplementFixierungsmethode bei Virus-Züchtungsverfahren.
Beispiel 12 : 900 ml einertechnischhergestellten Poliomyelitis-Vaccine (Merck Sharp & Dohme, Lot Nr. 29252) die bei der Auswertung mit der Komplement-Fixierungsmethode trotz Entfernung der Färbung durch entsprechende Dialyse negative Resultate liefert, werden 9 ml Hefenucleinsäure (Schwarz) in Form einer 20 mg/ml enthaltenden Lösung zugesetzt, worauf die Lösung auf 50C abgekühlt, dann das PH mit In-Salzsäure auf 2,5 eingestellt und während 18 h bei 50C stehen gelassen wird. Die klare überste- hende Flüssigkeit wird abdekantiert und das zurückbleibende Sediment während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 20C zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das Zentrifugat in 10 ml 0, 85% figer Natriumchloridlösung gelöst. Diese Lösung wird auf Infektiosität (durch denFarbtest) geprüft und auch mit der Komplement-Fixierungsmethode ausgewertet. Es wird keine Infektiosität gefunden.
Die Probelösung (10 ml) liefert nachstehende CF-Werte gegen :
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<tb>
<tb> Antigen <SEP> Typ <SEP> 1 <SEP> 35, <SEP> entsprechend <SEP> 0, <SEP> 39/ml <SEP> der <SEP> ursprünglichen <SEP> Vaccine
<tb> Antigen <SEP> Typ <SEP> II <SEP> 125, <SEP> entsprechend <SEP> 0,14/ml <SEP> der <SEP> ursprünglichen <SEP> Vaccine
<tb> Antigen <SEP> Typ <SEP> III <SEP> 10, <SEP> entsprechend <SEP> 0, <SEP> 11/ml <SEP> der <SEP> ursprünglichen <SEP> Vaccine <SEP>
<tb>
Beispiel 13 : Zu 1 Liter der Vaccine nach Beispiel 12 werden bei 5C 10 ml einer 20 mg/ml enthaltenden Lösung von Hefenucleinsäure (Schwarz) zugesetzt.
Diese Lösung wird mit 1000 Dosierungsein- heiten von infektiöser Gewebekultur (tissue culture infective doses(TCID)) von PoliomyelitisvirusTyp IIn (Saukett) versetzt, wodurch eine Viruskonzentration von 1, 0 TCID5/ml erhalten wird. Das PH dieser Lö- sung wird mit konz. Salzsäure auf 2,5 eingestellt und die Lösung während 17 - 18 h bei 50C stehen gelassen. Die klare überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und das zurückbleibende Sediment während 15 min mit 3000 Umdr/min bei 20C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und das
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Kolben mit Mahoney-Poliomyelitisvirus und die andere Hälfte mit Parker-Poliomyelitisvirus beimpft.
Aus den nach Ernten der Kulturen erhaltenen Viruslösungen wird von jedem Typ das reine Virus isoliert, dessen Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit demjenigen des nach dem Verfahren nach Beispiel 8 gewonnenen reinen Virus identisch ist. Jedes der reinen Virusmaterialien wird in lagern Phosphatpuffer (PH 7, 0) mit einer Konzentration von 20 ftg/ml gelöst. Diese Viruslösungen werden durch Zusatz von Formaldehyd (1 : 4000 Formalin) bis zu einer Konzentration von 92, 5 ig/ml. Einbringen in Ampullen, welche vollständig mit Lösung gefüllt und zugeschmolzen werden und Inkubation bei 370C während 168 h inaktiviert.
Dann wird der Inhalt der Ampullen mit 0, 850/0iger Natriumchloridlösung auf 1 : 5 entsprechend einer Kon-
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jugtiositäts- (Farb)-Test verwendete Nährlösung dialysiert. Die Ergebnisse des Infektiositäts-Tests sind für jede Vaccine negativ. Diese Vaccinen wurden auf ihre Wirksamkeit bei Affen nach dem vom National Institute of Health (NIH) festgelegten Verfahren geprüft, mit der Ausnahme, dass bei jeder Vaccine Dosierungen von 1 ml der monovalenten Vaccine verwendet und 8 Affen pro Test herangezogen wurden, wobei alle 8 Affen in jedem Falle den Test überlebten.
Das aus den so erhaltenen Daten errechnete durchschnittliche Verhältnis (geometrisches Mittel) beträgt für die Vaccine aus reinem Mahoney-Polio- myelitisvirus 0, 76 und für die Vaccine aus reinem Parker-Poliomyelitisvirus 0, 54 ; das gemäss NIH erforderliche Mindestverhältnis ist 0,29.