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Verfahren zum Anreichern von virushemmender Substanz
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von virushemmender Substanz, die aus Ur- harnsack (Allantoissack -) flüssigkeit gewonnen wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann angewandt werden, um virushemmende Substanz, die durch
Züchten eines lebenden Virus in dem Urharnsack von Hühnerembryos hergestellt und in den extraembryonalen Eiflüssigkeiten gesammelt worden ist, anzureichern bzw. zu reinigen.
Es wurde gefunden, dass virushemmende Substanz, die durch Züchten eines lebenden Virus in dem Urharnsack von Hühnerembryos hergestellt worden ist, in hoher Konzentration aus der Urharnsackflüssigkeit abgetrennt werden kann, indem man zunächst ein Proteinfällungsmittel zusetzt, um das Virus und inaktive Proteine aus der die virushemmende Substanz enthaltenen Urharnsackflüssigkeit zu entfernen, und dann die virushemmende Substanz aus der überstehenden Flüssigkeit durch Behandeln mit einem Schwermetallsalz bei einem pH-Wert zwischen etwa 6 und 8 ausfällt. Auf diese Weise wird die virushemmende Substanz um das 10- bis 20fache angereichert, und sie kann in dieser Form als Testmittel oder als virushemmende Substanz für die nachstehend beschriebenen Zwecke verwendet werden.
Es wurde weiter gefunden, dass eine wesentliche Reinigung der virushemmenden Substanz erzielt wird, wenn man die nach dem oben beschriebenen Verfahren angereicherte virushemmende Substanz an einem carboxylgruppenhaltigen Kationenaustauschharz chromatographiert und dann das aktive Material mit Hilfe eines kontinuierlichen Gefälles oder vorzugsweise eines stufenweisen Gefälles unter Verwendung eines wässerigen Acetat- oder Phosphatpuffers als Eluierungsmittel eluiert, wodurch eine etwa 2 OOOfache Anreicherung der virushemmenden Substanz mit einem etwa 1700fachen Reinigungsfaktor erreicht wird.
Die weitere Reinigung und Anreicherung kann durch nochmalige gemeinsame Ausfällung der virushemmenden Substanz mit einem Schwermetallsalz, wie oben beschrieben, erfolgen.
Ein Hauptteil der Restverunreinigungen, die nach der Durchführung der obigen Verfahrensstufen noch in der virushemmenden Substanz enthalten sein können, kann entweder durch lonophorese (für kleine Mengen oder zur Feststellung der Anwesenheit von Restverunreinigungen geeignet) oder durch Zonenelektrophorese (besonders geeignet, wenn es sich um grössere Mengen hochkonzentrierter und gereinigter virushemmender Substanz handelt) entfernt werden.
Die die virushemmende Substanz enthaltende Urharnsackflüssigkeit wird vorzugsweise aus im Embryozustand befindlichen Eiern, vorteilhaft Henneneiern, hergestellt, die 9 - 12 Tage bebrütet worden sind. Dann werden die Eier im Urharnsack mit lebendem Influenzavirus infiziert, vorteilhaft indem man
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West Point, Pa., V. St. A), die in einer Impfdosis von 0,20 m1 enthalten sind, injiziert. An Stelle dieses besonderen Stammes von Influenzavirus kann man andere lebende Viren verwenden, z. B. andere Stämme von lebendem Influenza A B-oder C-Virus, wie den PR8 -Stamm von Influenza A-Virus, den Melbourne-
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werden und die die virushemmende Substanz enthaltende Urharnsackflüssigkeit abgezogen wird.
Die die virushemmende Substanz enthaltende rohe Ernte wird mit einem Proteinfällungsmittel. wie
Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Sulfosalicylsäure, Tetrametaphosphat u. dgl., behandelt, um das Virus (z. B. das Virusimpfmittel) und eine grosse Menge an inaktivem Protein auszufällen. Beim Zusatz des Proteinfällungsmittels wird die rohe Ernte auf einer Temperatur zwischen 0 und 30 C, vorzugsweise je- doch zwischen 0 und 50C, gehalten, und es wird so viel Proteinfällungsmittel zugesetzt, dass die End- konzentration zwischen 1 und 3% beträgt.
Die virushemmende Substanz, die bei niedrigen pH-Werten beständig ist, bleibt in der Oberschicht und kann wieder daraus ausgefällt werden, indem man den PH-Wert mit einer starken Base, vorzugsweise Natrium- oder Kaliumhydroxyd, auf 6-8, vorzugsweise auf 7 - 8, einstellt und dann eine Lösung eines Schwermetallsalzes bis zu einer Konzentration zwischen etwa 5-50 Millimol/1, vorteilhaft zwischen 10 - 20 Millimo1/l, zusetzt.
Zur Ausfällung der virushemmenden Substanz besonders geeignete Metallsalze sind die Kobalt-, Zink-, Calcium-, Quecksilber-, Strontium-, Barium-u. ähnl. Salze von Halogenwasserstoffsäuren und von organischen Säuren, u. zw. insbesondere die Kobalt-, Zink-, Calcium-, Quecksilber-, Strontium- oder Bariu, msa1ze der Essigsäure, des Glycins, der Milschsäure, Propionsäure oder Salzsäure. Für praktische Zwecke kann man mit Zinkacetat arbeiten, da es leicht erhältlich und als Fällungsmittel für die virushemmende Substanz durchaus geeignet ist.
Der die virushemmende Substanz enthaltende Schwermetallsalz-Niederschlag wird vorzugsweise durch Zentrifugieren oder auf andere mechanische Weise abgetrennt. Der so erhaltene feste Körper wird dann bei 0-5 C gerührt und entweder mit so viel starker Säure behandelt, dass der pH-Wert auf etwa 2 - 3 sinkt und die virushemmende Substanz selektiv löslich gemacht wird, oder'mit einem Komplexbildungsmittel behandelt, um das Schwermetallsalz selektiv zu binden, während die virushemmende Substanz in Lösung bleibt. Geeignete Mittel sind starke Mineralsäuren oder organische Säuren, wie Perchlorsäure, Salzsäure, Trichloressigsäure u. dgl., oder Komplexbildungsmittel, wie das Tetranatriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure. 0, 2 normale Salzsäure kann mit Vorteil in dieser Verfahrensstufe angewandt werden.
Die so erhaltene Suspension wird dann durch Zentrifugieren geklärt und die überstehende Flüssigkeit, die sowohl das Metallsalz als auch die virushemmende Substanz in Lösung enthält, wird gegen Kochsalzlösung dialysiert, um restliches Schwermetallsalz zu entfernen.
Die dialysierte Lösung (die nachstehend als dialysierte Lösung I bezeichnet wird) enthält die virushemmende Substanz in etwa 10-bis 20facher Anreicherung.
Gegebenenfalls kann die dialysierte Lösung I der virushemmenden Substanz durch Wiederholung der oben beschriebenen Ausfällung mit einem Schwermetallsalz und der anschliessenden Dialyse weiter konzentriert werden, wodurch man eine 100 fache Anreicherung an virushemmender Substanz und eine 10 - bis 20 fache Reinigung in der dialysierten Lösung II erzielt.
Die dialysierten Lösungen I oder II enthalten eine ausreichende Konzentration an virushemmender Substanz, um die Infektion mit dem Virus der Newcastle-Krankheit zu verhindern, wie nachstehend nachgewiesen wird, oder um die Tumorbildung durch das Rous-Sarkom-Virus in dem Flügelgewebe von 1 Tag alten Hühnern zu verhindern.
Die virushemmende Substanz in der dialysierten Lösung I oder II kann durch Chromatographieren an einem carboxylgruppenhaltigen Kationenaustauschharz mittels eines kontinuierlichen Gefälles oder vorzugsweise eines stufenweisen Gefälles unter Verwendung von wässerigem Acetat- oder Phosphatpuffer als Eluierungsmittel weiter gereinigt werden. Die weitere Anreicherung und Reinigung kann gegebenenfalls durch nochmaliges Ausfällen der virushemmenden Substanz aus dem Eluat mit Hilfe eines Schwermetallsalzes nach dem oben beschriebenen Verfahren erzielt werden. Auf diese Weise erreicht man eine 2 000 fache Reinigung.
Eine Adsorptionskolonne wird vorbereitet, indem man eine wässerige Pufferlösung, z. B. eine Acetatoder Phosphatpufferlösung, mit einem pH-Wert zwischen 5, 8 und 6, 4 durch die Adsorptionsmittelkolonne giesst, bis der Durchlauf einen pH-Wert von etwa 5, 8 bis 6, 4 aufweist. Nun wird eine Lösung von virushemmender Substanz, die eine Aktivität von etwa 3200 bis 25000 Einheiten/ml aufweist und gegen einen Puffer mit einem pH-Wert von 5, 8 bis 6, 4 und einer Ionenstärke von 0, 03 bis 0 ; 08 dialysiert worden ist, in eine mit Carboxymethylcellulose oder einem andern geeigneten schwachen Kationenaustauscher, wie einem carboxylgruppenhaltigen Kationenaustauschharz, beschickte Kolonne eingegeben.
Nach beendetem Zusatz der Lösung wird weitere Pufferlösung mit einem PH-Wert von 5, 8 bis 6, 4 durch die Kolonne gegossen, wodurch eine beträchtliche Menge an Protein ohne virushemmende Substanzaktivität entfernt wird. Die Konzentration des Proteins im Durchlauf wird nach der kolorimetrischen Methode von Lowry bestimmt, die in der Arbeit "Protein Measurement with Folin Phenol Reagent" von O. H. Lowry und Mit-
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arbeiter in der Zeitschrift "Journal of Biological Chemistry", 193 [1951], S. 265 - 275, beschrieben ist.
Eine weitere Menge an Proteinstoffen ohne Aktivität der virushemmenden Substanz wird entfernt, indem man eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5, 8 bis 6, 4 langsam mit stufenweise ansteigender
Ionenstärke bis auf etwa 0, 13 durch die Kolonne giesst, bis der Durchlauf praktisch proteinfrei ist. Diese
Lösung wird aus einer Pufferlösung mit einem PH-Wert von etwa 5, 8-6, 4 durch Zusatz eines an- organischen Salzes, vorzugsweise Natriumchlorid, hergestellt.
Wesentlich gereinigte virushemmende Substanz wird von dem Adsorptionsmittel durch Hindurch- leiten einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 7, 4 bis 8, 8 und einer Ionenstärke von etwa 0, 13 bis 0, 18 durch die Kolonne desorbiert.
Zur Adsorption der virushemmenden Substanz wird vorzugsweise ein carboxylgruppenhaltiges Kationen- austauschharz verwendet, und für die Zwecke der Erfindung können alle erhältlichen carboxylgruppen- haltigen Kationenaustauschharze verwendet werden. Es wurde gefunden, dass die nach der Methode von
Peterson und Sober, Journal of the American Chemical Society, 78,756 [1956] hergestellte Carboxy- methylcellulose (CMC) ein hochwirksames Mittel für die Adsorption und die Freigabe von virushemmen- der Substanz. ist.
Andere geeignete carboxylgruppenhaltige Kationenaustauschharze sind"Amberlite IRC-50"und"Amberlite XE-54", die beide von der Rohm and Haas Company erhältlich sind, ferner "Permutit H -70" der Permutit Company und andere erhältliche carboxylgruppenhaltige Kationenaus- tauschharze.
Die so erhaltene konzentrierte und hochgereinigte virushemmende Substanz verhindert, wie nach- stehend gezeigt wird, die Vervielfältigung des Virus der Newcastle-Krankheit und ist daher als Mittel zur Bekämpfung der Newcastle-Krankheit bei Geflügel verwendbar. Ausserdem wirkt sie der Fähigkeit des Rous-Sarkom-Virus entgegen, Tumorwachstum hervorzurufen.
Der Hauptteil der Restverunreinigungen, falls solche noch vorhanden sind, in-der nach dem obigen Verfahren erhaltenen, virushemmende Substanz enthaltenden Lösung kann entweder durch Ionophorese oder durch Zonenelektrophorese entfernt werden.
Die nach der Chromatographie erhaltene, virushemmende Substanz enthaltende Lösung wird weiter durch Ionophorese unter Verwendung von Celluloseacetatpapier oder einem andern Papier von niedrigem Adsorptionsvermögen für die virushemmende Substanz gereinigt. Die die virushemmende Substanz enthaltende Lösung wird in einer schmalen Zone auf Celluloseacetatpapier oder anderes geeignetes Papier aufgetragen, dessen Enden in Elektrodengefässe eintauchen, die eine Pufferlösung von einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 10, u. zw. vorzugsweise einen Boratpuffer mit einem PH-Wert von 8, 9, enthalten.
An das Papier wird nun ein elektrischer Strom von 0, 4 mA je cm Streifenbreite des Papiers für einen Zeitraum von 1 bis 3 h angelegt. Dann wird das Papier in schmale Streifen zerschnitten und die virushemmende Substanz mit an Essigsäure 0, 05 normaler 0,9tiger Kochsalzlösung oder mit 09%figer Kochsalzlösung, die Rinderserumalbumin und "Tween 80" enthält, extrahiert.
Grössere Mengen von durch Chromatographie gereinigter virushemmender Substanz können durch Zonenelektrophorese an einem Bett oder einer Kolonne aus"Pevikon C-870" (einem von der Stockholm Superfosfat Fabrika A.-B., Stockholm, Schweden, erhältlichen Mischpolymerisat aus Vinylacetat und Vinylchlorid), gepulvertem Celluloseacetatpapier oder andern Medien mit geringem Adsorptionsvermögen für virushemmende Substanz gereinigt werden. Eine konzentrierte Lösung von virushemmender Substanz wird in einen Spalt eines zuvor geformten Bettes von"Pevikon C-870"oder einem andern geeigneten Medium eingetragen, dessen Enden durch Filterpapier mit Elektrodengefässen verbunden sind, die einen geeigneten Puffer im PH-Bereich von 4 bis 10, vorzugsweise einen Boratpuffer mit einem PH-Wert von 8, 9, enthalten.
Eine Spannung von 5 bis 10 V je cm Länge des Bettes wird 6 - 18 h bei 0 - 150C angelegt : vorzugsweise wird die Temperatur jedoch hiebei auf 0 - 50C gehalten. Dann wird das Bett in schmale Scheiben zerschnitten, die mit an Essigsäure 0, 5 normaler 0, 91oiger Kochsalzlösung oder mit 0, 9% tiger Kochsalzlösung, die Rinderserumalbumin und "Tween 80" enthält, extrahiert werden.
"Tween 80" ist ein Polyoxyäthylensorbitanmonooleat-Netzmittel.
Das Fliessdiagramm der Zeichnung zeigt einen typischen Verfahrensgang, bei dem virushemmende Substanz aus Ei-Urharnsackflüssigkeit angereichert und gereinigt wird.
Beispiel : Anreicherung und Reinigung von virushemmender Substanz.
Stufe 1
Zu 501 einer Ernte an Ei-Urharnsackflüssigkeit, die 256 Einheiten an virushemmender Substanzaktivität je ml enthalten (vgl. Anmerkung (1) hinter Tabelle 11) werden unter raschem Rühren bei 50C 5, 5 l l, 5 n Perchlorsäure zugesetzt. Nach 30 min langem Stehenlassen wird das Gemisch in einer ge-
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kühlten Zentrifuge 30 min mit 1500 U/min zentrifugiert.
In dieser Verfahrensstufe erhält man gleiche Ergebnisse bei Verwendung von Trichloressigsäure, Sulfosalicylsäure oder Tetrametaphosphat an Stelle der Perchlorsäure.-
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bis 370C, Kühlen der Eier und Abziehen der die virushemmende Substanz enthaltenden Urharnsackflüssigkeit hergestellt.
Stufe 2
Die überstehende Flüssigkeit (551 mit einem Gehalt an virushemmender Substanzaktivität von 256 Einheiten/ml) wird abgetrennt, mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt und unter Rühren mit 0, 4molarer Zinkacetatlösung bis zu einer Endkonzentration von 20 Millimol/l versetzt. Nach dem Stehenlassen über Nacht bei 50C wird so viel von der überstehenden Flüssigkeit abgesaugt wie
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einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Der abzentrifugierte Niederschlag, der Zinkacetat und virushemmende Substanz enthält, wird mit so viel 0-5 C kalter 0, 2 n Salzsäure verrührt, bis der PH-Wert 2 - 3 beträgt, um den Niederschlag in Lösung zu bringen. Die Lösung wird durch 1 stündiges Zentrifugieren in einer gekühlten Zentrifuge mit 1500 U/min geklärt.
Die so erhaltene, virushemmende Substanz enthaltende Lösung, die um das 20 fache auf 2, 6 1 konzentriert worden ist, wird über Nacht gegen 26 bis 52 1 0, 91piger Kochsalzlösung dialysiert, um die Zinkionen zu entfernen und eine Lösung zu erhalten, die 3 840 Einheiten an virushemmender Substanzaktivität je ml enthält.
Stufe 3
Das 20 fach angereicherte dialysierte Konzentrat wird mit Natriumhydroxyd auf einen PH-Wert von 7, 0 bis 7, 2 eingestellt und unter Rühren mit 0, 4 molarer Zinkacetatlösung bis zu einer Konzentration von 20 Millimol/1 versetzt. Nach 3 h langem oder längerem Stehen bei 50C wird der Niederschlag 1 h mit 2 000 U/min zentrifugiert. Die Oberschicht wird verworfen und der Niederschlag in so viel 0-5 C kalter O, 2n Salzsäure gelöst, bis der PH-Wert 2 - 3 beträgt, worauf die Lösung über Nacht gegen 50 bis 100 Raumteile O, 9%iger Natriumchloridlösung dialysiert wird, um die Zinkionen zu entfernen.
Durch dieses Verfahren wird die Lösung der virushemmenden Substanz (490 ml) bei einer 10-bis 20 fachen Reinigung auf das 100 fache konzentriert und besitzt nun eine Aktivirät von 12 800 Einheiten/ml. Ähnliche Ergebnisse erzielt man mit den oben genannten Schwermetallchloriden oder Schwermetallsalzen von organischen Säuren, insbesondere mit den besonders aufgeführten.
Stufe 4
Die virushemmende Substanz wird weiter durch Chromatographie an Carboxymethylcellulose mit Hilfe eines stufenweisen Natriumchlorid- und pH-Gefälles in einem 0, 01 molaren Phosphatpuffer folgendermassen gereinigt : a. Die 100 fach konzentrierte virushemmende Substanz (490 ml) aus Stufe 3 wird über Nach gegen 30 Raumteile 0, 01 molarer Natriumphosphatlösung vom PH 6 dialysiert. b. Die dialysierte Lösung der virushemmenden Substanz wird in eine Kolonne mit Carboxymethylcellulose (30, 5 cm x 19 mm) eingegeben, die zuvor mit 0, 01 molarer Natriumphosphatlösung vom PH 6 ins Gleichgewicht gebracht worden ist. c.
Die Chromatographie erfolgt durch stufenweisen Zusatz der folgenden Pufferlösungen zur Kolonne :
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<tb>
<tb> Puffer
<tb> Phosphat <SEP> NaCl,
<tb> Mo11l <SEP> pn <SEP> Mol/l <SEP> Volumen, <SEP> ml
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 6-250
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 500
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 2500
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 500
<tb>
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molaremNaCl je l enthält, eluiert. Das Hauptmaximum der Aktivität (19200 Einheiten/ml) ist in einer Fraktion von 120 ml enthalten. Die andern Fraktionen können nochmals chromatographiert werden, um in jeder von ihnen die virushemmende Substanz weiter anzureichern und zu reinigen und auf diese Weise die Ausbeute zu erhöhen.
Stufe 5
Zur Durchführung der zweiten Chromatographie wird die oben genannte Fraktion der virushemmenden Substanz von 120 ml durch Ausfällen mit Zinkacetat gemäss Stufe 3 auf 8,5 ml konzentriert, wobei eine virushemmende Substanz enthaltende Lösung mit einer Aktivität von 153 600 Einheiten/ml anfällt.
Stufe 6
Die mit Zinkacetat konzentrierte Fraktion der virushemmenden Substanz aus der Stufe 5 wird gegen 100 Raumteile eines 0, 01 molaren Phosphatpuffers vom PH-Wert 6 dialysiert und, in eine mit Carboxymethylcellulose beschickte Kolonne (5 cm X 12,7 mm) eingegeben, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist.
Die zweite Chromatographie erfolgt durch stufenweisen Zusatz der folgenden Pufferlösungen zur Kolonne :
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<tb>
<tb> Puffer
<tb> Phosphat <SEP> NaCl,
<tb> Mol/l <SEP> PH <SEP> Mol/l <SEP> Volumen, <SEP> ml
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 6-10 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 10 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> 10
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP> 10
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 08 <SEP> 10
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 50
<tb> 0,01 <SEP> 8 <SEP> 0,10 <SEP> 50
<tb>
Die virushemmende Substanz wird mit einem 0, 01 molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 8, der
0, 1 Mol NaCl je l enthält, eluiert, wobei das Hauptmaximum der Aktivität (76 800 Einheiten/ml) in einer Fraktion von 13, 5 ml enthalten ist.
Die andern Fraktionen können nochmals chromatographiert werden, um in jeder von ihnen die virushemmende Substanz weiter anzureichern und zu reinigen und auf diese Weise die Ausbeute zu erhöhen.
Stufe 7
Die aktive Fraktion wird weiter durch Ausfällen mit Zinkacetat und Dialyse gemäss Stufe 3 bis auf 4 ml konzentriert, wobei man eine Lösung mit virushemmender Substanzaktivität von 225000 Einheiten/ml erhält.
Stufe 8
Die virushemmende Substanz wird von dem Hauptteil der Restverunreinigungen, die noch nach der Verfahrensstufe 7 hinterblieben sind, getrennt, indem 0, 4 ml davon in einen engen Spalt in einem 17 cm X 2 cm messenden Block aus "Pevikon C -870" einpipettiert werden. Ein Ende des"Pevikon"- Blockes ist durch Filterpapier mit einer positiven Elektrode und das andere Ende des Blockes, ebenfalls durch Filterpapier, mit einer negativen Elektrode verbunden. Beide Elektroden tauchen in einen 0,03 molaren Natriumboratpuffer ein, der mit Salzsäure auf einen PH-Wert von 8,9 eingestellt ist. Ein Strom von 3 mA (150-170V) wird 7 h lang durch den"Pevikon"-Block geleitet.
Am Ende des Versuches wird der"Pevikon"-Block in 1 cm oder 0,5 cm breite Scheiben zerschnitten, wie es in der folgenden Tabelle angegeben ist, und jede Scheibe wird gesondert mit einer an Essigsäure 0, 05 normalen, 0, 91eigen Natriumchloridlösung extrahiert, und die Extrakte werden gesondert auf Protein und virus- hemmende Substanz aktivität analysiert. Die hiebei erhaltenen Werte finden sich in der folgenden Tabelle, in der die verschiedenen Stellen des Blockes, aus denen die Scheiben geschnitten worden sind, identifiziert sind. Die mit"+"bezeichneten Scheiben sind von dem mit der Anode verbundenen Ende des Blockes, die mit"-"bezeichneten Scheiben von dem mit der Kathode verbundenen Ende des Blockes abgeschnitten worden.
Die ersten beiden positiven und die letzten beiden negativen Scheiben sind 1 cm dick, die übrigen Scheiben sind je 0,5 cm dick.
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Tabelle 1
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<tb>
<tb> Analysierte <SEP> Scheibe, <SEP> Extraktions- <SEP> Virushemmende <SEP> Substanzaktivität <SEP> Spezifische
<tb> Abstand <SEP> vom <SEP> Ende, <SEP> mittel, <SEP> Aktivität,
<tb> cm <SEP> ml <SEP> Einheiten/ml <SEP> Gesamtaktivität <SEP> mg/ml <SEP> Einheiten/mg
<tb> Protein
<tb> + <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> -
<tb> + <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 48 <SEP> 192 <SEP> 0, <SEP> 0036
<tb> + <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 1280 <SEP> 2560 <SEP> 0, <SEP> 0072 <SEP> 178000
<tb> + <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2560 <SEP> 5120 <SEP> 0, <SEP> 0108 <SEP> 236000 <SEP>
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 1280 <SEP> 2560 <SEP> 0, <SEP> 0086 <SEP> 150000 <SEP>
<tb> - <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 768 <SEP> 1536 <SEP> 0,028
<tb> - <SEP> 1,0 <SEP> 2 <SEP> 256 <SEP> 512 <SEP> 0, <SEP> 027
<tb> - <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 256 <SEP> 512 <SEP> 0,
<SEP> 025
<tb> - <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 016 <SEP>
<tb> - <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 007
<tb>
Anmerkungen siehe hinter Tabelle II.
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Wenn die virushemmende Substanz, wie oben beschrieben, als konzentrierte Lösung hergestellt wird, ist sie bei der Aufbewahrung bei 0-50C beständig.. Wenn das konzentrierte und gereinigte Material verdünnt wird, z. B. wenn es in geringen Konzentrationen anwesend ist, wird es an Glasoberflächen adsorbiert. Dies lässt sich verhindern, indem man der Lösung der virushemmenden Substanz geringe Mengen Albumin, Gelatine, "Tween 80" oder anderer Desorptionsmittel zusetzt oder die verdünnte Lösung in indifferenten Kunststoffbehältern, z. B. solchen aus Polypropylen, lagert.
Der Grad der Anreicherung und Reinigung der virushemmenden Substanz durch die verschiedenen, oben beschriebenen Verfahrensstufen ergibt sich aus der folgenden Tabelle.
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TabelleII
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<tb>
<tb> Spezifische
<tb> Aktivität,
<tb> Aktivität <SEP> (1), <SEP> Protein(2), <SEP> Einheiten/mg <SEP> Gewinnung, <SEP> ReinigungsFraktionierstufe <SEP> Volumen <SEP> Einheiten/ml <SEP> mg/ml <SEP> Protein <SEP> % <SEP> faktor <SEP> (3)
<tb> Rohe <SEP> Ernte <SEP> 501 <SEP> 256 <SEP> 5,0 <SEP> 52
<tb> 1. <SEP> Oberschicht <SEP> von <SEP> der
<tb> Perchlorsäurebehandlung <SEP> der <SEP> rohen <SEP> Ernte <SEP> 55 <SEP> l <SEP> 256 <SEP> 2,2 <SEP> 116 <SEP> 100 <SEP> 2,25
<tb> 2. <SEP> Erste <SEP> Zinkfällung <SEP> 2, <SEP> 61 <SEP> 3840 <SEP> 7,4 <SEP> 520 <SEP> 75 <SEP> 10
<tb> 3. <SEP> Zweite <SEP> Zinkfällung <SEP> 490 <SEP> ml <SEP> 12800 <SEP> 15,6 <SEP> 820 <SEP> 50 <SEP> 16
<tb> 4. <SEP> Erste <SEP> Chromatographie <SEP> an <SEP> Carboxymethylcellulose <SEP> 120 <SEP> ml <SEP> 19200 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> 50 <SEP> 500 <SEP> 18 <SEP> 970
<tb> 5.
<SEP> Konzentrierung <SEP> der
<tb> aktiven <SEP> Fraktion
<tb> aus <SEP> der <SEP> Kolonne
<tb> mit <SEP> Zinkacetat <SEP> 8, <SEP> 5ml <SEP> 153600 <SEP> 2,7 <SEP> 57000 <SEP> 10,2 <SEP> 1100
<tb> 6. <SEP> Zweite <SEP> Chromatographie <SEP> an <SEP> Carboxymethylcellulose <SEP> 13, <SEP> 5mil <SEP> 76800 <SEP> 0, <SEP> 85 <SEP> 92000 <SEP> 8 <SEP> 1750
<tb> 7. <SEP> Konzentrierung <SEP> deraktiven <SEP> Fraktion
<tb> mit <SEP> Zinkacetat <SEP> 4 <SEP> ml <SEP> 225000 <SEP> 2,38 <SEP> 95 <SEP> 000 <SEP> 7,2 <SEP> 1830
<tb> 8.
<SEP> Letzte <SEP> Reinigung
<tb> an"PevikonC-870"20 <SEP> ml <SEP> 2 <SEP> 560 <SEP> 0,0108 <SEP> 236 <SEP> 000 <SEP> - <SEP> 4 <SEP> 000
<tb>
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Anmerkungen zu den Tabellen I und II (1) Eine Aktivitätseinheit wird an Hand des störenden Einflusses auf Eastern Equine Encephalomyelitis (EEE)-Virus in einschichtigen Zellenkulturen des Hühnerembryos bestimmt. Von einer Verdünnungs- reihe von virushemmende Substanz enthaltender Flüssigkeit wird 1 ml zu den Zellenkulturen zu- gesetzt, und die Kulturen werden 6 h bei 370C bebrütet. Nach dem Entfernen der Flüssigkeit
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ACIDVerdünnung der die virushemmende Substanz enthaltenden Flüssigkeit ausgedrückt, die noch die Cytopathologie in der Zellenkultur vollständig verhindert.
(2) Bestimmt nach der in der Arbeit "Protein Measurement with Folin Phenol Reagent" von 0. H.
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herausstellt, dass einige der Hühner gegen den durch das Virus verursachten Tod geschützt werden und ausserdem die Lebensdauer derjenigen Hühner, die durch die virushemmende Substanz nicht vollständig geschützt werden, verlängert wird. Die Untersuchungen werden nach zwei Methoden ausgeführt. Nach einer Methode wird die virushemmende Substanz in zwei Dosen 24 und 6 h vor der Infizierung der Hühner verabfolgt, nach der zweiten Methode wird die virushemmende Substanz ebenfalls in zwei Dosen 24 und 6 h vor der Infizierung der Hühner und dann täglich, beginnend 18 - 20 h nach der Virusinfektion, in der in der nachstehenden Tabelle angegebenen Häufigkeit verabfolgt.
Die angegebenen Einheiten an virushemmender Substanz werden intraperitonal in Form eines Impfstoffes von 0,5 ml verabfolgt. Das Virus
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fektionsdosis von 5 LDso -Dosen des Virus der Newcastle-Krankheit in Form eines Impfstoffes von 0,5 ml erhalten, werden ebenfalls in die Untersuchung eingeschlossen. Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle zu entnehmen.
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Tabelle III Messung der Wirkung der Verabfolgung von roher und angereicherter virushemmender Substanz auf das Virus der Newcastle-Krankheit bei 1 Tag alten Hühnern
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<tb>
<tb> FortBehandlung <SEP> mit <SEP> virushemmender <SEP> Substanz <SEP> Befund <SEP> leben <SEP> Indices <SEP>
<tb> Zahl <SEP> der
<tb> üherlebenden <SEP> Mitt- <SEP> FortTiere <SEP> leres <SEP> Fort- <SEP> leben,
<tb> Fort- <SEP> Fort- <SEP> leben, <SEP> ÜberGesamt <SEP> - <SEP> leben <SEP> Über- <SEP> schuss <SEP>
<tb> Vor <SEP> Virus-Nach <SEP> Virus-Gesamt-zahl <SEP> der <SEP> Fortle-in <SEP> schuss, <SEP> in
<tb> Fraktion <SEP> infektion <SEP> infektion <SEP> einheiten <SEP> Tiere <SEP> ben, <SEP> % <SEP> Tagen <SEP> % <SEP> Tagen
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2
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<tb> Stufe <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> X <SEP> 3 <SEP> 200 <SEP> E <SEP> 5 <SEP> # <SEP> 3 <SEP> 200 <SEP> E <SEP> 72 <SEP> 400 <SEP> 5/15 <SEP> 33 <SEP> 10,5 <SEP> 26,3 <SEP> 2,8
<tb> Kontrolle <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 2/30 <SEP> 6,7 <SEP> 7, <SEP> 7
<tb>
* Zwei Dosen zu je 64 Einheiten an virushemmender Substanz.