LU83577A1 - Verfahren zur herstellung eines faktor viii(ahf)-hochkonzentrates - Google Patents
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Description
V
\ -1-.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Faktor VIII(AHF)-Hochkonzentrates mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 2,5 Einheiten AHF und einem Fibrinogengehalt von weniger als 0,25 mg/mg Protein aus mensch-5 lichem oder tierischem Plasma durch mehrstufige Fraktionierung des Plasmas, insbesondere durch Kryopräzipitieren und Reinigen mittels Proteinfällungsmittel, wie Polyäthylenglykol, 10 Es sind bereits Faktor VIII(AHF)-Konzentrate bekannt, die aus menschlichem oder tierischem Plasma hergestellt werden und im Vergleich zum nativen Plasma eine erhöhte Aktivität . an Faktor VIII aufweisen. Bekannte Verfahren zur Herstellung von Faktor VIII-Konzentraten bedienen sich als Frak-s 15 tionierungsmaßnahmen einer Behandlung des Plasmas mit Äthanol, mit Äther, mit Polyäthylenglykol und/oder Glycin,.' * Bekannt ist auch die Kryopräzipitation des Plasmas nach
Pool (1965, HThe New England Journal of Medicine" 273, 1443) oder die Kryoäthanolpräzipitation des Plasmas nach 20 Johnson (Congr. Int. Soc. Blood Transf., Sydney, Australia, Abstracts- of Paper, Seite 1109 (1966)).
Es gibt auch noch andere Methoden, um Faktor VIII-Konzen-trate herzustellen, nämlich die Behandlung des Plasmas mit 5 Adsorptionsmitteln, wie Florigel, Bentonit, Ionenaustauschern und permeationschromatographischen Mitteln.
V
- 2 -
Soweit der Stand der Technik die Behandlung des Plasmas mit Äthanol betrifft, wurde diese erstmals von Cohn (J. Amer, Chem. Soc. ¢[8, 459 (1946)) beschrieben. Bei der Behandlung des Plasmas mit Äthanol wird die sogenannte Cohn-Fraktion I 5 erhalten, die jedoch nur eine relativ geringe Faktor VIII-Aktivität besitzt. Die Cohn-Methode wurde von Blombäck (Arkivför Kemi, 12_ 387 (1958)) verbessert, wobei Cohn-Fraktion I durch Extraktion mit einem Äthanol-Glycin-Zitrat-Puffer. weiter gereinigt wurde. Dabei entstand die sogenann-10 te Fraktion 1-0. Diese kann, wie Simonetti et al. (Hémostase 1, 57 (1961)) beschrieben, mit Gerbsäure noch weiter gereinigt werden; auch diese verbesserten Konzentrate haben nur eine relativ geringe Faktor VIII-Aktivität. Diese Konzentrate haben auch den Nachteil, daß sie hohe Fremdprotein-15 gehalte, d. h. Faktor VIII unwirksame Proteingehalte besitzen. So ist in der Cohn-Fraktion I mehr als 60 % des Proteins Fibrinogen und in der Blombäck-Fraktion 1-0 sogar über 80 % Fibrinogen enthalten.
• 20 Was die bekannte Fraktionierung durch Kryopräzipitieren betrifft, wurde diese so vorgenommen, daß menschliches oder tierisches Ausgangsplasma tiefgefroren und wieder aufgetaut wurde. Das Kryopräzipitat wurde in einer Pufferlösung gelöst und gegebenenfalls durch Proteinfällungsmittel, wie i 25 Polyäthylenglykol'und Glycin, weiter gereinigt. Durch die Kryopräzipitation ist es nicht gelungen, die Faktor VIII-Aktivität wesentlich zu steigern. Die Faktor VIII-Aktivität wird durch das Kryopräzipitieren im Vergleich zum Ausgangsplasma nur um etwa das lOfache gesteigert, doch auch die 30 in Kombination mit dem Kryopräzipitieren angewendeten weiteren Maßnahmen haben bisher die Aktivität der erhaltenen Produkte nicht in der Weise steigern können, wie es erwün-schenswert wäre.
35 Mehrstufige Fraktionierungsverfahren in Verbindung mit einer ersten Kryopräzipitationsstufe sind in den US-PSen 4 -· 3 - 3,652,530, 3,631,018, 3/682,881 sowie in der AT-PS-349 639 beschrieben.
Solche Produkte werden als "hochgereinigter AHF" oder 5 als "High Purity AHF" bezeichnet. Ihre Faktor VIII-Aktivi-tät beträgt jedoch auch bloß die 90 bis lOOfache Aktivität gegenüber nativem Plasma, während der Faktor-VIII-unwirksame Proteingehalt (Fibrinogen) immer noch 35 % des Gesamtproteins ausmacht.
10
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung der geschilderten Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, ein Faktor VIII-Hochkonzentrat zu schaffen, in welchem die inerten, nicht-Faktor-VIII-wirksamen Proteine weitestgehend 15 entfernt sind, der Gehalt an Fibrinogen so niedrig wie möglich gehalten ist und die Faktor VIII-Aktivität, bezogen auf das im Konzentrat vorhandene Protein, höher ist als bei den bekannten therapeutisch verwendeten Präparaten.
Im besonderen ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Ver-20 fahren zur Herstellung eines Faktor VIII(AHF)-Hochkonzentrates mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 2,5 Einheiten AHF und einem Fibrinogengehalt von weniger als 0,25 mg/mg Protein zu schaffen, welches Verfahren betriebsmäßig bzw. in technischem Maßstab anwendbar ist und - 25 eine hohe Wirtschaftlichkeit gewährleistet.
Diese Aufgabe wird durch ein mehrstufiges Fraktionierungsverfahren der eingangs bezeichneten Art, bei welchem vorzugsweise als erste Stufe eine Kryopräzipitation angewen-30 det wird, dadurch gelöst, daß eine durch diese Fraktionierungsmaßnahmen gereinigte und an Faktor VIII (AHF) angereicherte Fraktion einer Kryoalkoholfällung unterworfen und der erhaltene Niederschlag in eine haltbare Form aufgearbeitet wird.
35
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
V
- 4 - der gereinigten und an Faktor VIII (AHF) angereicherten· Fraktion bei einem pH-Wert von 5,9 bis 6,3 und einer Temperatur von 0 bis -3° C ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder 5 Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt, die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4° C aufgetaut, worauf, der das AHF-Hochkonzentrat enthaltende - Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisie- ren in haltbare Form gebracht wird.
10
Eine hevo'rzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Kombination der folgenden Maßnahmen·: * daß menschliches oder tierisches Plasma einer ersten Kryopräzipitation unterworfen wird? 15 - das Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung gelöst, auf einen pH-Wert von 6,15 bis 6,25 gestellt und die Lösung einer ersten .Reinigungsfällung mit Polyäthylenglykol unterworfen wird; daß der nach Verwerfen des Niederschlags erhaltene 20 Überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfällung mit Polyäthylenglykol unterworfen und die nach Verwerfen der Niederschläge schließlich erhaltene gereinigte, an Faktor VIII (AHF) angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfällung unterworfen wird, in-ï 25 dem dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt; die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4° C aufgetaut wird, worauf der das AHF-Hochkonzentrat ent-30 haltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird..
Vorteilhaft werden dabei die·erste 'Polyäthylenglykol-Fällung mit 3 G/V %igem Polyäthylenglykol und die zweite bzw. die 35 weiteren Polyäthylenglykol-Fällungen mit 8 G/V %igem Polyäthylenglykol durchgeführt. · - 5 -
Zweckmäßig wird zur .Ausfällung des Faktor VIII-Konzentra-tes eine etwa 10 G/V %ige PLURONIC-Lösung verwendet.
Anstelle von Polyäthylenglykol als Proteinfällungsmittel 5 'kann auch "PLURONIC" verwendet werden, in. welchem Fall die Kombination aus den folgenden Merkmalen besteht.: " - daß menschliches oder tierisches Plasma einer ersten
Kryopräzipitation unterworfen wird; * .
- das Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung ge-10 löst, auf einen pH-Wert von 6,25 gestellt und die Lösung einer ersten Reinigungsfällung mit PLURONIC unterworfen wird; - daß der nach Verwerfen des Niederschlages erhaltene Überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfällung 15 mit PLURONIC unterworfen und die nach Verwerfen der Niederschläge schließlich erhaltene gereinigte, an Faktor VIII (AHF) angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfällung unterworfen wird, indem dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, 20 wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder
Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt; die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur· von 0 bis 4° C aufgetaut wird, worauf der das AHF-Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und 25 Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert: 30 Beispiel 1: 460 1 frisch gefrorenes Plasma werden bei 0° und +4° C aufgetaut. Das entstandene Kryopräzipitat wird durch Zentrifugieren abgetrennt und in 9,6 1 Tri-Natriumcitrat bei 37° C gelöst.
35 * - 6 - "Der pH-Wert der Lösung wird auf 6,2 gestellt und 3 G/V %iges Eolyäthylenglykol 2000 wird zugesetzt. Dabei entsteht ein Niederschlag, der durch Zentrifugieren abgetrennt und verworfen wird.
5
Die Ionenstärke des Überstandes, der Faktor VIII (AHF) enthält, wird durch Zugabe von Tri-Natriumcitrat erhöht.
Die restlichen unerwünschten Proteine werden durch Erhöhung der Polyäthylenglykol 2000-Konzentration auf 8 G/V . 10 % ausgefällt und nach dem Zentrifugieren verworfen.
Durch Zugabe von 8 G/V %igem Äthanol, bei -2° C und einem pH-Wert von 6,1, wird Faktor VIII-Konzentrat ausgefällt; die Suspension wird eingefroren und nach Auftauen bei 15 +4° C wird das Faktor VIII enthaltende Kryoalkoholpräzi- pitat in einem physiologischen Puffer gelöst, sterilfiltriert, abgefüllt und gefriergetrocknet.
Beispiel 2:
20 9600 ml frisch gefrorenes Plasma werden bei 0° bis +4° C
aufgetaut. Das zentrifugierte Kryopräzipitat wird in 240 ml Tri-Natriumcitrat bei 37° C gelöst.
Der pH-Wert der Lösung wird auf 6,2 gestellt und 3 G/V * 25 %iges Polyäthylenglykol 2000 zugesetzt. Der entstandene , Niederschlag wird abgetrennt und verworfen.
¥
Durch Zugabe von Tri-Natriumcitrat wird die Ionenstärke erhöht, durch Zugabe von weiterem Polyäthylenglykol 2000 30 bis auf 8 G/V % fallen unerwünschte Proteine aus; diese werden abgetrennt und verworfen. - · .
Bei pH 6,0 und -2 bis -3° C wird Faktor VIII-Konzentrart mittels 10 G/V %igem Methanol ausgefällt; die Suspension 35 wird eingefroren und nach Auftauen wird das Kryoalkohol- * - 7 - \ präzipitat in einem isotonen Puffer gelöst, sterilfiltriert, abgefüllt und gefriergetrocknet.
Beispiel 3: 5 Die Arbeitsweise des Beispieles 2 wird wiederholt, jedoch wird statt 10 G/V %igem Methanol 12 %iges Polyäthylenglykol zur Ausfällung des Faktor VIII-Konzentrates verwendet.
Beispiel 4: , 10 Die Arbeitsweise des Beispieles 2 wird wiederholt, jedoch wird statt 10 G/V %igem Methanol 10 G/V %iges "PLURONIC" zur Ausfällung des Faktor VIII-Konzentrates verwendet.
Beispiel 5:
15 10,4 1 frisch gefrorenes Plasma werden bei 0° bis +4° C
aufgetaut. Das Kryopräzipitat wird in 250 ml Tri-Natrium-citratpuffer gelöst.
Der pH-Wert der Lösung wird auf 6,3 gestellt und 2,5 G/V
R
20 %iges PLURONIC- zugesetzt. Der Niederschlag wird verworfen. Nach Erhöhung der Ionenstärke wird die PLURONIC-Konzentration auf 7,5 G/V % gesteigert und der Niederschlag abermals verworfen.
i 25 Der überstand wird bei einem pH-Wert von 6,0 und einer Temperatur von -2° C mit 8 G/V %igem Äthanol behandelt, » wobei Faktor VIII-Konzentrat ausfällt. Die Suspension wird.eingefroren und nach Auftauen bei +4° C das Kryo-alkoholpräzipitat abgetrennt.
30
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren wesentlich-erhöhte spezifische Aktivität der erhaltenen Hochkonzentrate bzw. die Anreicherung an AHF um mehr als das 200fache· gegenüber Ausgangsplasma zeigt Tabelle I im Vergleich 35 zu bekannten, im Handel befindlichen AHF-Konzenträten.
'» · » - 8 -
Tabelle I
Spezifität Reinheit im Ver-
Einh./mg gleich zu Plasma 5 Plasma 0,017 1
Kryopräzipitat 0,145 9fache
High Purity AHF 1,667 98fache
Hochkonzentrat, hergestellt nach der Erfin- 10 düng >3,500 206fache
Der geringere Gehalt des erfindungsgemäßen Hochkonzentrates an Fibrinogen gegenüber bekannten Konzentraten ergibt 15 sich aus der Tabelle II.
Tabelle II
Cohn-Fraktion I > 60 % Fibrinogen 20 Blombäck-F'raktion 1-0 ^ 80 % Fibrinogen • gereinigter oder High
Purity AHF > 35 % Fibrinogen'
Hochkonzentrat, hergestellt nach der Erfindung 10 % Fibrinogen * 4·
M
s
Claims (6)
1, Verfahren zur Herstellung eines Faktor VIII(AHF)-Hochkonzentrates mit einer spezifischen Aktivität von minde- 5 stens 2,5 Einheiten AHF und einem Fibrinogengehalt von weniger als 0,25 mg/mg Protein aus menschlichem oder tierischem Plasma durch mehrstufige Fraktionierung des Plasmas, insbesondere durch Kryopräzipitieren und Reinigen mittels Proteinfällungsmittel, wie Polyäthylengly- 10 kol, dadurch gekennzeichnet, daß eine durch diese Frak-•tionierungsmaßnahmen gereinigte und an Faktor VIII (AHF) angereicherte Fraktion einer Kryoalkoholfällung unterworfen und der erhaltene Niederschlag in eine haltbare Form aufgearbeitet wird. 15
2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigten und an Faktor. VIII (AHF) angereicherten Fraktion bei einem pH-Wert von 5,9 bis 6,3 und einer Temperatur von 0 bis -3° C ein ein- oder mehrwertiger
20 Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt wird,, die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4° C aufgetaut wird, worauf der das AHF-Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und >· « 25 durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird, s
3, Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, gekennzeichnet durch die Kombination der folgenden Maßnahmen: 30. daß menschliches oder tierisches Plasma einer ersten Kryopräzipitation unterworfen wird,* - das Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung gelöst, auf einen pH-Wert von 6,15 bis 6,25 gestellt und die Lösung einer ersten Reinigungsfällung mit
35 Polyäthylenglykol unterworfen wird/ * * - 10 - * ” daß der nach Verwerfen des Niederschlags erhaltene Überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfällung mit Polyäthylenglykol unterworfen und - 1die nach Verwerfen der Niederschläge schließlich er-haltene gereinigte, an Faktor VIII (AHF) angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfällung unterworfen wird, indem dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder Polyesterglyk'ol (PLURONIC) zugesetzt; die * Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4° C aufgetaut wird, worauf der das AHF-Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird. 15
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Polyäthylenglykol-Fällung mit 3 G/V %igem Polyäthylenglykol und die zweite bzw. die weiteren Polyr äthylenglykol-Fällungen mit 8 G/V %igem Polyäthylen-2o glykol durchgeführt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausfällung des Faktor VIII-Konzentrates eine etwa 10 G/V %ige PLURONIC-Lösung verwendet wird. * 25
% 6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die s Kombination der folgenden Maßnahmen: ~ daß menschliches oder tierisches Plasma einer ersten Kryopräzipitation unterworfen wird/ 2q “ das Kryopräzipi.tat in einer wässerigen Pufferlösung gelöst, auf einen pH-Wert von 6,25 gestellt und die Lösung einer ersten Reinigungsfällung mit PLURONIC unterworfen wird/ daß der nach Verwerfen des Niederschlages erhaltene 35 Überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfällung mit PLURONIC unterworfen und ψ - 11 - die nach Verwerfen der Niederschläge schließlich erhaltene gereinigte, an Faktor VIII (AHF) angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfällung unterworfen wird, indem dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alko-5 hol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt; die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4° C aufgetaut wird, worauf der das AHF-rHoch-konzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und durch ” ' 10 Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form ge- • bracht wird. > . I *
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