KR102027636B1 - 마우스에 대한 병원성이 증가된 인플루엔자 a 바이러스 - Google Patents
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Abstract
본원은, 마우스에 대한 병원성이 증가된 인플루엔자 A 바이러스 및 이를 이용한 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델 마우스의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본원은, 마우스에 대한 병원성이 증가된 인플루엔자 A 바이러스 및 이를 이용한 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델 마우스의 제조방법에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 A, B 및 C의 총 3 종의 유형으로 이루어진다. 이 중 인플루엔자 A 바이러스는 인간, 말, 해수, 돼지, 흰담비 및 닭을 포함하는 광범위한 조류 및 포유동물을 감염시킬 수 있다.
인플루엔자 A 바이러스는 표면 당단백질을 암호화하는 두개의 유전자, 즉, 바이러스성 부착 및 세포성 방출에 요구되는 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)의 항원성 영역에서의 알러지성 변이를 기준으로 서브유형으로 분류될 수 있다. 구체적으로는, 특정 항체에 대한 반응 여부에 따라 헤마글루티닌은 H1 내지 H16으로 분류되며, 뉴라미니다제는 N1 내지 N9로 분류될 수 있다. 다른 주요 바이러스성 단백질은 핵단백질, 뉴클레오켑시드 구조 단백질, 막단백질 (M1 및 M2), 중합효소 단백질 (PA, PB1 및 PB2) 및 비-구조적 단백질 (NS1 및 NS2)을 포함한다.
인플루엔자 A 바이러스의 서브타입인 고병원성 조류인플루엔자 H5N8 바이러스는 2014년도 대한민국에서 처음으로 발생하였고 현재까지도 발생하고 있으며, 이로 인해 최근 3 년간 약 1940 여만 마리의 가금류를 살처분하였고 피해액이 약 2500 억 원에 달하는 것으로 추정될 정도로 가금업에 큰 경제적 손실을 야기하고 있다. 이러한 고병원성 H5N8 바이러스와 비슷한 형질의 아종 H5N1과 H5N6의 경우 인체감염 사례가 지속적으로 보고됨에 따라, H5 아종의 바이러스에 대한 백신개발의 필요성이 높아지고 있다. 백신의 개발 과정 중 전 임상단계에서의 백신 보호효능 평가를 위해서는 동물모델에서의 바이러스의 감염 실험이 필수적이다. 그러나 현재 존재하는 고병원성 조류 인플루엔자 H5N8 바이러스의 경우 바이러스 감염 실험에 대표적인 동물모델인 마우스에서 병원성이 높지 않아 보호 효능 평가에 적합하지 않으므로, 신속하고 효율적인 백신 개발을 위한 인플루엔자 H5N8 바이러스 감염 모델 마우스 제조를 위한 신규한 인플루엔자 H5N8 바이러스의 개발이 필요한 실정이다.
Rolling et al., Journal of Virology. 2009, Jul; 83(13): 6673-80
현재 존재하는 고병원성 조류 인플루엔자 H5N8 바이러스의 경우 바이러스 감염 실험에 사용되는 대표적인 동물 모델인 마우스에서 병원성이 높지 않기 때문에, 백신의 보호 효능 평가에 사용되는 동물 모델로서 사용하기에 적합하지 않았다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 고병원성 조류 인플루엔자 H5N8 바이러스를 마우스에 적응시켜 마우스에 대한 병원성을 증가시킴으로써 고병원성 조류 인플루엔자 H5N8 감염 모델 마우스 제조를 위한 H5N8 바이러스주를 개발하고자 하였다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 단백질의 86 번째 위치의 메티오닌(M) 이 돌연변이된 중합효소 산성 단백질 (polymerase acidic protein, PA); 서열번호 3의 염기서열로 코딩되는 단백질의 708 번째 위치의 프롤린(P)이 돌연변이된 중합효소 염기성 단백질 1 (polymerase basic protein 1, PB1); 및 서열번호 4의 염기서열로 코딩되는 단백질의 4 번째 위치의 이소류신(I), 591 번째 위치의 글루타민(Q), 및 701 번째 위치의 아스파르트산(D) 이 돌연변이된 중합효소 염기성 단백질 2 (polymerase basic protein 2, PB2)를 인코딩하는 유전자를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스를 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 인플루엔자 A 바이러스를 마우스에 감염시키는 것을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델 마우스의 제조방법을 제공할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
본원발명에 따르면, 마우스에 대한 병원성이 증가된 고병원성 조류 인플루엔자 H5N8 바이러스주 및 이를 이용한 고병원성 조류 인플루엔자 H5N8 감염 모델 마우스의 제조 방법을 제공할 수 있다.
구체적으로, 본원발명의 H5N8 바이러스주는 바이러스의 중합효소 유전자에 도입된 돌연변이에 의해 바이러스의 중합효소활동량이 증가함으로써 마우스에 대한 병원성이 증가되며, 이에 의해 인플루엔자 H5N8 바이러스주를 이용하여 고병원성 조류 인플루엔자 H5N8 감염 모델 마우스를 제조하고, 상기 모델 마우스를 이용하여 고병원성 조류 인플루엔자 H5N8에 대한 백신 개발이 용이해질 수 있다.
도 1은 마우스에 대한 다양한 종류의 인플루엔자 바이러스의 병원성을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 수행된 H5N8 바이러스의 마우스 적응화 방법의 개략도이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 수행된 H5N8 바이러스의 계대배양 과정 중 마우스의 체중변화를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 마우스 적응형 바이러스의 단일클론 바이러스를 얻기 위하여 수행된 플라크 정제 과정의 개략도이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 마우스 적응형 H5N8 바이러스의 증식률을 야생형 바이러스와 비교하여 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 마우스 적응형 H5N8 바이러스의 중합효소유전자에 존재하는 돌연변이의 영향을 분석한 그래프이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 마우스 적응형 H5N8 바이러스의 병원성을 야생형 바이러스와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 마우스 적응형 H5N8 바이러스와 야생형 바이러스의 백신 보호 효능 평가실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 수행된 H5N8 바이러스의 마우스 적응화 방법의 개략도이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 수행된 H5N8 바이러스의 계대배양 과정 중 마우스의 체중변화를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 마우스 적응형 바이러스의 단일클론 바이러스를 얻기 위하여 수행된 플라크 정제 과정의 개략도이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 마우스 적응형 H5N8 바이러스의 증식률을 야생형 바이러스와 비교하여 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 마우스 적응형 H5N8 바이러스의 중합효소유전자에 존재하는 돌연변이의 영향을 분석한 그래프이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 마우스 적응형 H5N8 바이러스의 병원성을 야생형 바이러스와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 마우스 적응형 H5N8 바이러스와 야생형 바이러스의 백신 보호 효능 평가실험 결과를 나타낸 그래프이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
이하, 본원의 인플루엔자 A 바이러스 및 이를 이용한 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델 마우스의 제조방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, 86 번째 위치의 메티오닌(M) 및 97 번째 위치의 트레오닌(T) 중 하나 이상이 돌연변이된 중합효소 산성 단백질 (polymerase acidic protein, PA); 708 번째 위치의 프롤린(P)이 돌연변이된 중합효소 염기성 단백질 1 (polymerase basic protein 1, PB1); 및 4 번째 위치의 이소류신(I), 591 번째 위치의 글루타민(Q), 627 번째 위치의 글루탐산(E), 및 701 번째 위치의 아스파르트산(D) 중 하나 이상이 돌연변이된 중합효소 염기성 단백질 2 (polymerase basic protein 2, PB2)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스를 제공할 수 있다. 예를 들어, 본원발명의 인플루엔자 A 바이러스는 상기 나열된 각각의 돌연변이들 중 1 개 이상, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상 또는 7 개 모두를 포함하는 것일 수 있다.
상기 돌연변이들은 고병원성 조류인플루엔자 H5N8 바이러스를 마우스에서 계대배양함으로써 마우스에 적응시켜 병원성을 상승시킨 인플루엔자 A/H5N8 바이러스에서 발견된, 중합효소 유전자에 존재하는 돌연변이들로서, 상기 돌연변이들 중 하나 이상을 가짐으로써 조류인플루엔자 H5N8 바이러스는 마우스에 대하여 향상된 병원성을 가지게 될 수 있다.
조류인플루엔자 H5N8 바이러스는 마우스에 대해 낮은 병원성을 나타내기 때문에 (도 1), 대표적인 동물 모델인 마우스를 이용한 백신 개발 및 백신 효능 평가에 어려움이 있었다. 따라서, 마우스에 대한 병원성이 향상된 본원발명의 H5N8 바이러스를 이용함으로써 인플루엔자 H5N8 바이러스에 대한 연구, 치료제 효능 평가 및 백신 개발이 더욱 용이해질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 중합효소 산성 단백질은 M86I 돌연변이 및 T97I 돌연변이 중 하나 이상을 가지거나; 상기 중합효소 염기성 단백질 1은 P708S 돌연변이를 가지거나; 또는 상기 중합효소 염기성 단백질 2는 I4M 돌연변이, Q591K 돌연변이, E627K 돌연변이, 및 D701N 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 중합효소 산성 단백질은 T97I 돌연변이를 가지거나; 상기 중합효소 염기성 단백질 1은 P708S 돌연변이를 가지거나; 또는 상기 중합효소 염기성 단백질 2는 Q591K 돌연변이, E627K 돌연변이, 및 D701N 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 본원의 인플루엔자 A 바이러스는 중합효소 산성 단백질에 T97I 돌연변이를 가지고; 중합효소 염기성 단백질 1에 P708S 돌연변이를 가지고; 및/또는 중합효소 염기성 단백질 2에 Q591K 돌연변이, E627K 돌연변이, 및/또는 D701N 돌연변이를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있따.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H5N8 형일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 PA 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 PB1 유전자, 및 서열번호 4 또는 5로 표시되는 PB2 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스는 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 단백질의 86번째 위치의 메티오닌(M)이 돌연변이된 중합효소 산성 단백질(polymerase acidic protein, PA); 서열번호 3의 염기서열로 코딩되는 단백질의 708 번째 위치의 프롤린(P)이 돌연변이된 중합효소 염기성 단백질 1(polymerase basic protein 1, PB1); 및 서열번호 4의 염기서열로 코딩되는 단백질의 4번째 위치의 이소류신(I), 591번째 위치의 글루타민(Q) 및 701번째 위치의 아스파르트산(D)이 돌연변이된 중합효소 염기성 단백질 2(polymerase basic protein 2, PB2)를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 상기 돌연변이가 도입되지 않은 인플루엔자 바이러스에 비해 마우스에 대한 병원성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기에서 위치가 특정된 돌연변이들은 각각이 마우스 병원성 상승 효과를 가지며, 이들이 조합됨으로 인해 마우스 병원성 상승 효과가 더욱 현저해질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 마우스에 대한 병원성 증가는, 인플루엔자 A 바이러스 내의 중합효소 유전자에 돌연변이가 발생하여 중합효소 활성이 증가됨으로써 유도되는 것일 수 있다. 종래의 다른 연구에서도 중합효소 유전자 돌연변이가 마우스 병원성 증가에 영향을 미칠 수 있다는 사실이 증명된 바 있었다 (Rolling et al., Journal of Virology. 2009, Jul; 83(13): 6673-80). 그러나, 본원에서 청구하는 중합효소 유전자 돌연변이들은 본원에서 최초로 발견한 것으로서, 특히 PA 유전자의 T97I 돌연변이, PB1 유전자의 P708S 돌연변이, PB2 유전자의 E627K 돌연변이, PB2 유전자의 D701N 돌연변이 및 PB2 유전자의 P591K 돌연변이가 각각 발생시 마우스에서의 치사감염율이 각각 50% 또는 그 이상 증가하였다. 따라서, 상기 나열된 돌연변이들이 인플루엔자 A 바이러스의 마우스 병원성 증가에 특히 큰 영향을 미치는 것일 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 인플루엔자 A 바이러스를 마우스에 감염시키는 것을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델 마우스의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 인플루엔자 A 바이러스는 인플루엔자 A/H5N8 바이러스일 수 있으며, 이 경우 마우스에서 약한 병원성을 나타내는 야생형 H5N8 바이러스에 비해 본원발명의 H5N8 바이러스는 마우스에서도 높은 병원성을 나타내므로, 고병원성 조류 인플루엔자 H5N8 바이러스에 대한 치료제 효능평가, 백신 개발 및 백신보호효능 등의 평가에 유용하게 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[
실시예
]
1. H5N8 바이러스의 마우스 적응화
2014 년도 및 2015 년도에 야생 철새로부터 분리된 고병원성 조류인플루엔자 H5N8 바이러스인 W452 및 W468 107.0PFU/ml을 각각 독립적으로 4 마리의 마우스에 30 μl씩 I.N(Intra nasally)로 감염시켰다. 감염 후 5 일을 주기로 감염된 각각의 마우스의 폐를 적출하고 분쇄하여 바이러스를 추출하였다. 진행 과정 중 교차감염(cross contamination)을 방지하기 위하여 각각의 실험 후 실험 공간을 10 분간 자외선에 노출시켰다. 이후, 추출한 바이러스를 독립적으로 새로운 마우스에 감염시켜 계대 배양을 진행하였다.
상기 계대 배양 방법을 총 5 회 진행하였다. 계대 배양 중 바이러스의 병원성이 너무 높아지면 바이러스를 희석하여 다음 계대 배양을 진행하였다. H5N8 바이러스의 마우스 적응화 방법의 개략도가 도 2에 나타나 있다.
그 결과, 각각의 바이러스에 감염된 4 마리의 마우스에 대한 실험결과 모두 계대배양이 2, 3 번만 넘어가도 10% 이하의 체중 감소를 보이던 1 번째 계대 배양에 비해 체중감소가 증가하였으므로 병원성이 증가한 것으로 간주되었다. 더욱이, 4 번째 및 5 번째 계대 배양에서는 바이러스를 1/100 내지 1/1000으로 희석하였음에도 급격한 체중감소를 나타내었으며 5 일 내로 마우스가 모두 치사하였다. 이러한 결과로부터, 5 회의 계대배양에 의해 각각의 바이러스들이 마우스에서 높은 병원성을 가지게 되었음을 확인하였다 (도 3).
2. 마우스 적응형 바이러스의 정제 및 염기서열의 분석
상기 방법에 의해 병원성이 증가한 마우스 적응형 바이러스들을 RT-PCR 기법을 통해 염기서열 분석을 진행하였으며, 마우스 적응형 바이러스의 단일클론 바이러스를 얻기 위하여 플라크 정제(Plaque purification) 방법을 통해 바이러스를 정제하였다. 구체적인 플라크 정제 과정의 개략도가 도 4에 나타나 있다.
플라크 정제 방법에 의해 얻어진 단일클론의 바이러스들을 RT-PCR 기법을 통해 염기 서열 분석을 진행하였으며, 그 중 연구에 적절한 클론들을 선정하여 이후의 실험에 사용하였다. 선정된 단일클론 바이러스들의 마우스적응형 H5N8 유전자 돌연변이를 정리하여 하기 표 1에 나타내었다.
실험 결과, 적응형 바이러스들은 야생형 바이러스와 비교했을 때 여러 유전자들에 돌연변이가 발생하였으며, 발견된 유전자 돌연변이 중에는 이전 연구에서 알려진 포유류 숙주에서 바이러스의 병원성 및 증식을 증가시켜주는 적응형 돌연변이 외에 새로운 돌연변이가 존재한다는 것을 확인하였으며, 이러한 돌연변이들로 인해 적응형 바이러스들이 마우스에서 높은 병원성을 획득하게 되었을 것으로 추정되었다. 이후의 실험들은 PA, PB1 및/또는 PB2에 돌연변이가 도입된 바이러스주인 ma452 G1-1 및 ma468 G1-2를 사용하여 진행하였다.
3. 마우스 적응형 바이러스의 병원성 측정
선별된 마우스 적응형 바이러스주 ma452 G1-1 및 ma468 G1-2의 동물성 세포에서의 증식률을 확인하기 위하여 MDCK 세포, A549 세포 (인간 폐세포) 및 HBE 세포 (인간 기관지 세포)에 감염시킨 후, 7 가지의 시간대에 야생형 바이러스와 비교한 증식률을 확인하였다. 도 5는 MDCK, A549 및 HBE 세포에서 적응형 H5N8 바이러스주의 증식률을 야생형 바이러스주와 비교하여 실험한 결과를 나타낸 것이다. 실험 결과, 3 종류의 세포 모두에서 본 실시예에 따라 선별된 마우스 적응형 바이러스들이 야생형 바이러스에 비해 증식률이 증가하는 것을 확인하였다.
적응형 바이러스들의 중합효소유전자에 존재하는 돌연변이들이 중합효소활동량에 바이러스에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 미니지놈 분석(minigenome assay)를 진행하였다. 구체적으로, 적응형 및 야생형 H5N8 바이러스의 PB2, PB1, PA, NP 유전자, 루시페라제(luciferase) 유전자 그리고 β-gal 유전자관련 플라스미드들을 293T 세포에 형질감염(transfection) 시킨 후 루시페라제를 기반으로 인플루엔자의 vRNP의 생성을 통한 중합효소활동량을 측정하였다 (도 6). 그 결과, 적응형 바이러스에 존재하는 중합효소유전자의 돌연변이를 가지는 세포는, 야생형에 비해 중합효소의 활동량이 급격히 증가하는 것을 확인하였다.
다음으로, 적응형 바이러스주 ma452 G1-1 및 ma468 G1-2의 병원성을 측정하기 위하여 마우스들에 동량의 야생형/적응형 바이러스들을 감염시킨 후 14 일간 마우스의 체중변화와 생존율을 측정하였다 (도 7). 그 결과, 야생형 H5N8 바이러스에 감염된 마우스들에서는 14 일간 체중변화가 거의 없었으며, 14 일 동안 모두 생존하였다. 반면 적응형 H5N8 바이러스에 감염된 마우스들은 감염 후 5 일까지 급격한 체중감소를 보였으며 6 일 내로 모든 마우스가 치사하였으므로, 적응형 바이러스가 마우스에 대해 높은 병원성을 가지게 된 것으로 판단하였다. 따라서, 본원발명에 따른 마우스 적응형 고병원성 조류인플루엔자 H5N8 바이러스는 야생형 바이러스에 비해 마우스에 대한 높은 병원성을 가진다는 사실을 확인하였으며, 추후 백신개발실험에 적합한 병원체로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
4. 백신 보호 효능 평가
본 실시예에 따라 제작된 마우스 적응형 H5N8 바이러스주 ma452 G1-1과 야생형 H5N8 바이러스를 이용하여 같은 농도의 백신에 대해 백신 보호 효능 평가실험을 진행하였다 (도 8).
그 결과, 마우스를 야생형 바이러스로 감염시켰을 때에는 거의 최대농도로 감염시킨 경우에도 대조군 (백신 비처리군)조차 치사율이 50% 미만이었을 뿐 아니라, 0.01 μg 의 낮은 농도의 백신만을 처리해도 마우스는 체중감소만 있을 뿐 100% 생존하였다. 반면, 마우스를 적응형 바이러스로 감염시켰을 때에는 2.0 μ이상의 매우 높은 농도의 백신 처리군에서만 마우스가 100% 생존하였다. 이러한 결과는 본원발명에 따른 마우스 적응형 H5N8 바이러스가 백신 보호 효능평가뿐만 아니라 백신의 최소 농도를 산출하는 데에도 효과적으로 사용될 수 있음을 시사한다. 즉, 본원발명에 따른 마우스 적응형 H5N8 바이러스 전임상과정에서 백신의 효과를 평가하는 데에 유용한 병원체로 활용 될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
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<223> ma452 G1-1 PA
<400> 1
atggaagact ttgtgcgaca atgcttcaat ccaatgatcg tcgagcttgc ggaaaagaca 60
atgaaagaat atggggaaaa tccaaaaatc gaaacgaaca aattcgctgc aatatgcact 120
cacttagagg tctgtttcat gtattcggat ttccacttta ttgatgaacg aggtaaatca 180
ataattgtag aatctggcga tccgaatgca ttattgaaac accgatttga gataattgaa 240
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gataagccta aattcctccc agatttgtat gattacaagg agaaccgatt cattgaaatt 360
ggagtgacaa ggagggaagt tcacacatac tacctagaaa aggcaaataa gataaaatca 420
gagaagacac acattcacat attctcattc actggggagg agatggccac caaagctgac 480
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gaaatggcca ataggggtct gtgggattcc tttcgtcaat ctgagagagg cgaagagaca 600
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gtgaagacaa caccacgccc tctcagatta cctgatggtc ctccttgctc tcagcggtcg 840
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tatgggttca ttataaaagg aagatcccat ttgaggaatg ataccgatgt ggtaaatttt 1560
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tctgtcaaag agaaagacat gaccaaggaa ttctttgaaa ataaatcaga aacgtggcca 1860
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tgctactatt tgctatccat actgtccaaa aaagtacctt gtttctacta ata 2213
<210> 2
<211> 2212
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ma 468 G1-2 PA
<400> 2
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<223> ma452 G1-1 PB1
<400> 3
atggatgtca acccgacttt actcttcttg aaagtgccag cgcaaaatgc tataagtacc 60
acattccctt atactggaga tcctccatac agccatggaa caggaacagg atacaccatg 120
gacacagtca acagaacgca tcaatactca gaaaagggaa agtggacaac aaacaccgag 180
actggagcac cccaactcaa cccaattgat ggaccattac ctgaggataa cgagccaagc 240
ggatatgcac aaacggattg tgtgttggaa gcaatggctt tccttgaaga gtcccaccca 300
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ma452 G1-1 PB2
<400> 4
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caacaaatgc gtgacgtatt ggggacattt gatactattc agataataaa gctgttaccg 1860
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2280
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<211> 2280
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ma 468 G1-2 PB2
<400> 5
atggagagaa taaaagaact aagagatcta atgtctcaat cccgcactcg cgagatacta 60
acaaaaacca ctgtggacca tatggccata atcaagaaat acacatcagg aagacaagag 120
aagaatcctg ctctcagaat gaaatggatg atggcaatga aatatccact cacagcagac 180
aagagaataa tggaaatgat tcctgaaaga aatgaacaag gccagacgct ttggagcaag 240
acaaatgatg ctggatcaga cagagtgatg gtgtctcccc tagctgtaac ttggtggaat 300
agaaatggac cgacagcaag tacagtccat tatccaaagg tctacaaaac atactttgag 360
aaggttgaaa ggttaaagca tggaaccttc ggtcccgttc acttccgaaa ccaaattaaa 420
atacgccgcc gagttgacat aaacccaggc catgcagatc tcagtgccaa agaagcacaa 480
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ctaatggtgg catacatgtt ggaaagagaa ctggtccgca aaaccagatt cctaccagta 660
gcaggtggga caagcagtgt gtacattgag gtactgcact tgacccaagg gacctgctgg 720
gaacagatgt acactccagg cggagaagtg agaaatgacg atgttgacca gagtttgatc 780
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tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggt catcaattag 2280
2280
Claims (7)
- 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 단백질의 86 번째 위치의 메티오닌(M) 이 돌연변이된 중합효소 산성 단백질 (polymerase acidic protein, PA);
서열번호 3의 염기서열로 코딩되는 단백질의 708 번째 위치의 프롤린(P)이 돌연변이된 중합효소 염기성 단백질 1 (polymerase basic protein 1, PB1); 및
서열번호 4의 염기서열로 코딩되는 단백질의 4 번째 위치의 이소류신(I), 591 번째 위치의 글루타민(Q), 및 701 번째 위치의 아스파르트산(D) 이 돌연변이된 중합효소 염기성 단백질 2 (polymerase basic protein 2, PB2)
를 인코딩하는 유전자를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 1 항에 있어서,
상기 중합효소 산성 단백질은 M86I 돌연변이를 가지고,
상기 중합효소 염기성 단백질 1은 P708S 돌연변이를 가지고,
상기 중합효소 염기성 단백질 2는 I4M 돌연변이, Q591K 돌연변이 및 D701N 돌연변이를 가지는, 인플루엔자 A 바이러스.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
H5N8 형인, 인플루엔자 A 바이러스.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 돌연변이가 도입되지 않은 인플루엔자 바이러스에 비해 마우스에 대한 병원성이 증가된, 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 인플루엔자 A 바이러스를 마우스에 감염시키는 것을 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델 마우스의 제조방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020170007302A KR102027636B1 (ko) | 2017-01-16 | 2017-01-16 | 마우스에 대한 병원성이 증가된 인플루엔자 a 바이러스 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170007302A KR102027636B1 (ko) | 2017-01-16 | 2017-01-16 | 마우스에 대한 병원성이 증가된 인플루엔자 a 바이러스 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20180084336A KR20180084336A (ko) | 2018-07-25 |
| KR102027636B1 true KR102027636B1 (ko) | 2019-10-01 |
Family
ID=63058780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170007302A KR102027636B1 (ko) | 2017-01-16 | 2017-01-16 | 마우스에 대한 병원성이 증가된 인플루엔자 a 바이러스 |
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
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| JP2009268471A (ja) | 2009-08-07 | 2009-11-19 | Dnavec Research Inc | センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質 |
| JP2012191948A (ja) | 2012-07-04 | 2012-10-11 | Dnavec Research Inc | センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質 |
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101626798B1 (ko) | 2013-09-26 | 2016-06-02 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 신규한 h3n2 혈청형의 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
-
2017
- 2017-01-16 KR KR1020170007302A patent/KR102027636B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000253876A (ja) * | 1999-03-08 | 2000-09-19 | Dnavec Research Inc | センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質 |
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| JP2012191948A (ja) | 2012-07-04 | 2012-10-11 | Dnavec Research Inc | センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質 |
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|---|---|
| KR20180084336A (ko) | 2018-07-25 |
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