KR20160025553A - 세미-라이브 호흡기 세포융합 바이러스 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 키메라 RSV/SeV F 단백질을 발현하는 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터를 포함하는, 세미-라이브 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 백신에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 제조 방법 및 이의 RSV 감염 또는 RSV 감염과 관련된 질환의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

세미-라이브 호흡기 세포융합 바이러스 백신 {SEMI-LIVE RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINE}
본 발명은 RSV/SeV F 키메라 단백질을 발현하는 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터를 포함하는 세미-라이브 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV: semi-live respiratory syncytial virus) 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 생산 방법 및 RSV 감염 및 RSV 감염과 관련된 질환의 치료에 있어 이의 용도에 관한 것이다.
홍역 백신 및 몇몇 인플루엔자 백신을 포함하여 오늘날 사용되는 다수의 바이러스 백신들은 약독화 바이러스를 기본으로 하며, 양호하고 장기간 지속되는 예방학적인 체액성 및 세포성 면역 반응을 발생시킨다 (Amanna et al., N. Engl. J. Med. 357:1903-1915, 2007). 이러한 약독화 생 백신은 사용되는 바이러스의 병독성은 낮추면서도 생명력은 여전히 유지시킴으로써 (또는 "살아있게 함으로써") 제조된다.
그러나, 생 백신의 안전성은, 유전자 불안정성 및 남아있는 병독성 문제가 연루되어 있기 때문에, 계속적으로 논쟁이 되고 있다 (Ehrenfeld et al., Expert. Rev. Vaccines 8:899-905, 2009). 사빈 소아마비 백신에서 볼 수 있듯이 약독화 돌연변이의 복원 가능성 (Salk, D. and Salk, J., Vaccine 2:59-74, 1984; Kew et al., Annu. Rev. Microbiol. 59:587-635, 2005), 또는 예를 들어 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)의 약독화 생 백신의 개발을 어렵게 하는 적절한 약독성의 균형 확립 (Luongo et al., Vaccines 27:5667-5676, 2009)은 생 백신의 전형적인 문제이다.
생 백신 사용과 관련한 한계들을 감안하여, 약독화 생 백신과 유사한 면역원성 특징을 가진 바이러스 벡터가 강력하고 규명된 접근법으로서 등장하게 되었다 (Abdulhaqq et al., Immunol. Res. 42:219-232, 2008; Liniger et al., Vaccine 27:3299-3305, 2009; Zhan et al., Vaccine 26:3480-3488, 2008; Slobod et al., Vaccine 22:3182-3186, 2004). 그러나, 약독화된 생 바이러스 벡터는 종종 장기간 사용된 약독화 생 백신과 비슷한 안전성 문제에 직면한다.
과거 백신 개발자들로부터 상당한 관심을 받은 바이러스 군은 NNSV (non-segmented negative-strand RNA viruse) 군이다. 이들 바이러스는, RNA 게놈을 가지고 있고 숙주 세포의 세포질에서만 복제하므로 숙주 게놈으로 삽입되어 삽입 돌연변이를 유발할 모든 가능성이 배제되기 때문에, 매우 바람직한 안전 프로파일을 가진다. 아울러, 재조합 현상도 아직까지 관찰되지 않고 있다 (Bukreyev et al., J. Virol. 80:10293-10306, 2006). NNSV는 4개의 패밀리로 구성되며, 이중 랍도비리대 (예로, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 및 광견병 바이러스 (RV)) 및 파라믹소비리대 (예로, 센다이 바이러스 (SeV) 및 인간 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV))에 속하는 바이러스가 후보 바이러스 벡터 백신 개발에 주로 사용되어 왔다 (Schmidt ef al., J. Virol. 75:4594-4603, 2001; Bukreyev et al., J. Virol. 80:10293-10306, 2006).
백신 백본으로서 NNSV를 사용하여 다양한 바이러스 백신 벡터 후보체들이 개발되고 있다. 예를 들어, 세포질 도메인이 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형 (hPIV3)의 대응되는 것으로 대체된 인간 파라인플루엔자 바이러스 2형 (hPIV2)의 HN 및 F 단백질을, hPIV3 기반의 바이러스 벡터에 병합함으로써, hPIV2/hPIV3 바이러스 백신 벡터가 제조되었다 (Tao et al., J. Virol. 74:6448-6458, 2000). 아울러, 보바인 PIV3 (bPIV3) 백본에서 hPIV3의 F 단백질을 발현하는 보바인/인간 약독화 PIV3 백신 벡터도 개시되었다 (Haller et al., J. Virol. 74:11626-35, 2000). 인간 PIV3의 F 및 NH 단백질과, 아프리카 그린 (green) 원숭이에서 RSV 감염에 대한 방어를 부여하는 것으로 알려진, 인간 RSV의 전장 천연 F 단백질을 발현하는, 보바인 PIV3계 백신 후보체도 공지되어 있다 (Tang et al., J. Virol. 79:11198-11207, 2004).
당해 기술 분야에 공지된 또 다른 후보 바이러스 벡터 백신은 게놈 복제-불능 센다이 바이로스 (SeV)를 기초로 한다 (Wiegand et al., J. Virol. 81 :13835-13844, 2007; WO 2006/084746 A1). 이 벡터는 최근 입증된 바와 같이, 시험관내에서 유전자를 여전히 발현할 수 있다 (Bossow et al., Open Virol. J. 6:73-81, 2012). 그러나, 복제-불능의 SeV계 바이러스 백신 벡터는 복제-불능 특성 및 유전자 안정성 측면에서 생체내 안전성 역시 입증되어야 한다. 아울러, 시험관내 유전자 발현이, 벡터의 복제-불능으로 인해, 복제-가능한 센다이 벡터와 비교해 감소된다 (Bossow et al., Open Virol. J. 6:73-81, 2012). 따라서, 생체내에서 바람직한 효과적인 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는 방식으로, 면역계에 선택된 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 효율적으로 발현 및 제시하는 복제-불능 센다이 벡터를 재조합 방식으로 조작하는 것이 도전 과제이다.
널리 알려져 있지만 치료하기 어려운 병원성 바이러스가 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)이다. RSV는 전세계적으로 어린 아이와 노년층에서 중증 호흡기 질환의 주된 요인이다 (Collins P.L. and Crowe J.E. Jr, Respiratory syncytial virus and metapneumovirus, in: Fields Virology, Eds. Knipe D.M. and Howley P., Philadelphia: Lippincott-Williams and Wilkins, Wolters Kluwer Business, 2007:1601-1646). 또한, RSV는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 환자에서 주요 병원체이다 (Hacking, D. and Hull, J., J. Infect. 45:18-24, 2002). 그러나, 최근 상당한 RSV 백신 개발 시도에도 불구하고, 여전히 이 병원체에 대해 현재 사용가능한 백신은 없는 실정이다.
따라서, RSV 감염 및 RSV 감염과 관련된 질환을 앓고 있는 환자, 특히 어린이 및 노년층을 치료하는데 효과적인 안전한 RSV 백신이 시급히 요구되고 있다.
본 발명은, 키메라 RSV/SeV F (융합) 단백질을 발현하는, 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 (이하, "본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터" 또는 "본 발명의 rdSeV 벡터"라 함)를 제공함으로써, 전술한 요구들을 충족시킨다. 본 발명의 rdSeV 벡터는 효율적으로 다량 생산되며, RSV에 대해 강력한 체액성 및 세포성 면역반응을 발휘하면서도, 동시에 안전하다. 따라서, "세미-라이브 (semi-live)" RSV 백신으로서, 즉, ("생 백신"처럼) 예상외로 효과적이면서도 특히 ("사 백신"처럼) 안전한 백신으로 사용하기 매우 적합하다.
제1 측면에서, 본 발명은, 인단백질 (P) 유전자에서 아미노산 2-77이 결핍된 돌연변이 P 단백질을 코딩하도록 변형된 핵산을 포함하는, 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터로서, 핵산이 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) F 엑토도메인 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이, RSV F 막관통 도메인 또는 이의 기능성 단편 또는 돌연변이, 및 SeV F 세포질 도메인 또는 이의 임의의 단편 또는 돌연변이를 포함하는 키메라 F 단백질 (이하, "키메라 F 단백질" 또는 "키메라 RSV/SeV 단백질"이라 함)을 추가로 코딩하거나, 또는 핵산이 RSV F 엑토도메인 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이, 및 RSV F 막관통 도메인 또는 이의 기능성 단편 또는 돌연변이를 포함하는 F 단백질 (이하, "RSV F 단백질"이라 함)을 코딩하는, 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 핵산 또는 이의 상보체, 및/또는 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 핵산 또는 핵산의 상보체를 코딩하는 DNA 분자를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, (i) 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (ii) 세포 배양물로부터 게놈 복제-불능 SeV 벡터를 수집하는 단계를 포함하는, 본 발명의 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터와 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 백신을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포유류, 특히 인간 개체, 보다 구체적으로 인간 유아 또는 어린이, 노인, 면역저하자, 이식 수여체 또는 만성 질환을 앓고 있는 개체에서 RSV 감염 또는 RSV 감염과 관련된 질환을 치료하는데 있어, 본 발명의 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예는 첨부된 종속 청구항들에 기재된다.
전술한 개요와 아래 상세한 설명 및 실시예들은 첨부된 도면과 함께 읽었을 때 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 "rdSeV-FRSV/SeV" 벡터로 지칭되는, 키메라 RSV/SeV F 단백질을 발현하는 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 게놈 구조를 나타낸 개략도이다. SeV F의 엑토도메인과 막관통 도메인은 대응되는 RSV-유래 카운터파트로 치환되어, 다음과 같은 키메라 F ("Fchim2") 단백질이 된다: RSV 엑토도메인 ("ecto"; RSV F의 아미노산 1-524), RSV 막관통 도메인 ("tm"; RSV F의 아미노산 525-550) 및 SeV 세포질 도메인 ("cyto"; SeV F의 아미노산 524-565). "Pmut" ORF에서, 처음 76개의 아미노산이 제거되어 (PΔ2-77), 복제-불능 백신 벡터가 수득되었다.
도 2는 "rdSeV-FRSV/SeV-ΔCT"로 지칭되는, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 변이체의 게놈 구조를 나타낸 개략도이다. 이 변이체는, N-말단의 처음 2개의 아미노산 (SeV F의 아미노산 524-525)을 제외한 전체 세포질 도메인이 결손된 것 외에는 도 1에 도시된 rdSeV-FRSV/SeV와 동일하다. "Pmut" ORF에서, 처음 76개의 아미노산이 제거되어 (PΔ2-77), 복제-불능 백신 벡터가 수득되었다.
도 3은 "rdSeV-sFRSV"로 지칭되는, RSV의 용해성 F (sF) 단백질을 발현하는 게놈 복제-불능 SeV 비교 벡터의 게놈 구조를 나타낸 개략도이다. RSV F 엑토도메인의 ORF (RSV F의 아미노산 1-524)가 P 유전자의 하류에 부가적인 전사 유닛 ("sFRSV")으로서 삽입되었다. "Pmut" ORF에서, 처음 76개의 아미노산이 제거되어 (PΔ2-77), 복제-불능 백신 벡터가 수득되었다.
도 4는 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터 (rdSeV-FRSV/SeV)의 생산 효율을 도시한 막대 그래프이다. rdSeV-FRSV/SeV 벡터는, SeV P 및 N 단백질을 코딩하는 유전자를 함유한 발현 플라스미드로 안정적으로 형질전환된 VPN 세포에서 생산되었다. 여러 계대 배양 단계 ("P")에서 2종의 벡터의 차별적인 생산 회차를 비교로 수행하였고 (P1-1, P1-2, P2-1, P2-2, P3-1), 세포 배양 상층액으로부터 유래된 샘플을 생산 공정 중에 여러 시간대, 예컨대 8-11일 ("d8-11"), 11-12일 ("d11-12") 등에 취하였다. 이후, 수집한 샘플의 벡터 역가 (pfu/ml)를 측정하였다.
도 5는 rdSeV-FRSV/SeV (검정 막대)와 N-말단의 처음 2개의 아미노산을 제외한 전체 세포질 도메인이 결핍된 변이체 ("rdSeV-FRSV/SeV-ΔCT"로 지칭됨) (백색 막대)의 생산 효율을 도시한 막대 그래프이다. 3일 ("d2-3"), 4일 ("d3-4"), 5일 ("d4-5"), 6일 ("d5-6") 및 7일 ("d6-7")에, 세포 배양 상층액의 벡터 역가를 pfu/ml로 측정하였다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터는 RSV 감염 또는 RSV 감염과 관련된 질환에 대한 백신으로서 사용하기 적합한 매우 안전한 바이러스 벡터를 제공한다. 놀랍게도, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터는 인간에게 사용하기에 적합한 세포를 이용해 다량으로 매우 효율적으로 제조할 수 있다. 이로써, 시판 백신에서 가장 중요한 비용 효율적으로 본 발명의 바이러스 백신 벡터를 생산할 수 있다. 아울러, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터는 단순하고 재현가능한 방식으로 생산할 수 있으며, 게놈 크기가 작아 지속적이고 신뢰성 있는 서열 감시가 가능하다.
제1 측면에서, 본 발명은 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터를 제공한다. 이 벡터는, 인단백질 (P) 유전자에서 아미노산 2-77이 결핍된 돌연변이 P 단백질을 코딩하도록 변형된 핵산을 포함하다. 핵산은, 특이적인 키메라 RSV/SeV F 단백질 또는 RSV 엑토도메인과 RSV 막관통 도메인을 포함하는 특이적인 RSV F 단백질을 추가로 코딩한다. 본원에서, "센다이 바이러스 벡터" 또는 "SeV 벡터"는 바이러스 게놈을 포함하는 감염성 바이러스이다. 즉, 본 발명의 재조합 rdSeV 벡터는, RSV 감염에 대해 면역 반응을 유발하기 위해, 세포 및 세포주, 특히 인간 등의 살아있는 동물을 감염시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "핵산"은 가장 광의적인 의미로 사용되며, 단일 가닥 (ss) DNA, 이중 가닥 (ds) DNA, cDNA, (-)-RNA, (+)-RNA, dsRNA 등을 포괄한다. 그러나, 핵산이 본 발명의 rdSeV 벡터의 일부이면서 포함되는 경우에는, 핵산은 네거티브-가닥 RNA ((-)-ssRNA)이다. 이 경우, 핵산은 전형적으로 본 발명의 rdSeV의 게놈에 해당된다. 나아가, 용어 "코딩하는"은, 본원에서, 핵산이 다른 핵산 (예, mRNA, 네거티드-가닥 RNA ((-)-ssRNA) 또는 파지티브-가닥 RNA ((+)-ssRNA)) 및/또는 올리고- 또는 폴리펩타이드 ("단백질")를 합성하기 위해 주형으로서 사용되는 고유한 특성을 지칭한다. 즉, 세포 또는 그외 생물 시스템에서 전사 및 번역으로 단백질이 생산된다면, 단백질은 "코딩된" 것이다.
본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 백본으로서 사용되는 SeV는 임의의 공지된 SeV 균주일 수 있다. 적합한 예로는, 비제한적으로, 센다이 푸시미 균주 (Sendai Fushimi) (ATCC VR105), 센다이 해리스 (Sendai Harris) 균주, 센다이 칸텔 (Sendai Cantell) 균주 또는 센다이 Z 균주를 포함한다. 본 발명의 rdSeV는 또한 복제-불능 (복제-결함)을 특징으로 한다. 이는, 인단백질 (P) 유전자에서 기존에 언급된 바와 같이 N-말단 아미노산 76개를 제거하도록 SeV 백본을 변형 (P 단백질의 PΔ2-77)시킴으로써, 달성된다 (Bossow et al., Open Virol. J. 6:73-81, 2012; WO 2006/084746 A1). 기존에 언급된 바와 같이, 제조되는 SeV/PΔ2-77 벡터는 복제-불능이며, 즉, 비-헬퍼 세포주에서는 새로운 게놈 주형을 합성할 수 없지만, 여전히 전사는 가능한, 즉 일차 전사와 유전자 발현이 가능하다 (Bossow et al., Open Virol. J. 6:73-81, 2012).
임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 바이러스 전사와 바이러스 복제 둘다를 수행하는 바이러스 RNA-의존형 RNA 중합효소 (vRdRp)의 필수 구성 요소인, P 단백질에서의 결손이, vRdRp의 복제 및 전사 활성과 커플링되진 않는 것으로 생각된다. 이는, 복제 능력의 완전한 소실을 유발하면서도, SeV/PΔ2-77 벡터는 초기 및 후기 일차 전사를 포함한, 일차 전사를 여전히 수행할 수 있다. "초기 일차" 전사는, 바이러스 RNA 게놈이 SeV 바이러스 입자에 본래 함유된 vRdRp 분자에 의해 전사되는, 감염된 숙주 세포에서의 첫번째 전사 현상을 지칭한다. "후기 일차 전사"는, 데노보 단백질 합성이 개시되고 새롭게 합성된 vRdRp에 의해 전사가 점점 많이 수행되는, 단계를 지칭한다.
본 발명에서, 본 발명의 rdSeV 벡터의 핵산에 의해 코딩되는 키메라 RSV/SeV 단백질은, (i) 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) F 단백질의 엑토도메인 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이, (ii) RSV F 단백질의 막관통 도메인 또는 이의 기능성 단편 또는 돌연변이, 및 (iii) SeV F의 세포질 도메인 또는 이의 임의의 단편 또는 돌연변이를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 rdSeV 벡터의 핵산에 의해 코딩되는 RSV F 단백질은, RSV F 엑토도메인 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이, 및 RSV F 막관통 도메인 또는 이의 기능성 단편 또는 돌연변이를 포함한다.
용어 "포함한다"는, 본원에서, 개방형 용어 (open-ended term) "함유한다"와 폐쇄형 용어 (closed term) "(로) 구성된다"를 모두 포괄한다. 즉, 본 발명의 rdSeV 벡터의 핵산은 다른 이종 단백질 또는 키메라 단백질을 추가로 코딩하여, 예를 들어, 2가 바이러스 벡터 백신 (예로, RSV 및 hPIV에 대한 백신)을 제조할 수 있다.
본원에서, RSV의 전술한 엑토도메인 및/또는 막관통 도메인은 RSV F 단백질의 각각 아미노산 1-524 및 525-550에 해당될 수 있다. SeV 세포질 도메인은 SeV F 단백질의 아미노산 524-565에 해당될 수 있다. 따라서, 키메라 RSV/SeV F 단백질은, 아미노산 1-524가 RSV 엑토도메인을 정의하고, 아미노산 525-550이 RSV 막관통 도메인을 정의하고, 아미노산 551-592가 SeV 세포질 도메인을 정의하는, 아미노산 592개를 포함할 수 있다. 이러한 592개의 아미노산으로 된 키메라 RSV/SeV F 단백질에 대한 결손 변이체 및 돌연변이도 본 발명의 범위에 포함되며, 엑토도메인, 막관통 고메인 및 세포질 도메인의 "단편" 및 "돌연변이"는 아래에 정의된 바와 같이 정의된다.
바람직하게는, RSV 엑토도메인은 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열 (RSV 균주 ATCC VR-26 (Long 균주) F 단백질의 엑토도메인; GenBank accession no. AY911262, Translation AAX23994)을 가지거나 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이이다. 바람직하게는, RSV 막관통 도메인은 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열 (RSV 균주 ATCC VR-26 (Long 균주) F 단백질의 막관통 도메인; GenBank accession no. AY911262, Translation AAX23994)을 가지거나, 또는 이의 기능성 단편 또는 돌연변이이다. 바람직하게는, SeV 세포질 도메인은 서열번호 3으로 나타낸 아미노산 서열 (SeV 균주 푸시미 F 단백질의 세포질 도메인; GenBank accession no. U06432, Translation AAC54271)을 가지거나, 또는 이의 임의의 단편 또는 돌연변이이다.
또한, RSV 엑토도메인, RSV 막관통 도메인 및 SeV 세포질 도메인이, 상기와 같이 정의되되, 서열번호 1로 나타낸 RSV 엑토도메인의 아미노산 서열이 Glu66Gly, Val76Glu, Asn80Lys, Thr101Ser 및 Ser211Asn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 점 돌연변이 하나 이상, 바람직하게는 모두를 포함하거나, 및/또는 서열번호 3으로 나타낸 SeV 세포질 도메인의 아미노산 서열이 단일 점 돌연변이 Gly34Arg를 포함하는 것이, 바람직하다. 키메라 RSV/SeV F 단백질이 서열번호 1-3으로 정의되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1-3에 의해 정의되되 전술한 점 돌연변이 6개를 모두 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것이, 특히 바람직하다. 마찬가지로, RSV 엑토도메인과 RSV 막관통 도메인을 포함하는 본 발명의 rdSeV 벡터의 RSV F 단백질은, 가장 바람직하게는, 서열번호 1 및 2로 정의되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1 및 2로 정의되되 전술한 엑토도메인의 5개의 점 돌연변이를 모두 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 상기 아미노산 서열의 단편 및 돌연변이도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "단편"은 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단의 결손에 의해 수득되는 폴리펩타이드 또는 단백질 도메인의 일부를 지칭한다. 바람직하게는, 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단의 결손은 아미노산 10개 또는 5개 보다 길지 않으며, 아미노산 1, 2 또는 3개이다. 용어 "면역원성"은, 본원에서, RSV 엑토도메인의 단편 또는 돌연변이가 여전히 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발할 수 있는 것을 의미한다. 바람직하게는, 면역원성 단편 또는 돌연변이는, 이것이 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 막관통 도메인 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 세포질 도메인과 융합되면, 서열번호 1-3의 아미노산 서열들로 정의되는 전장 키메라 RSV/SeV F 단백질에 의해 달성되는 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 10% 이상, 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상 또는 80% 이상에 해당되는 수준으로 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발한다. 용어 "기능성"은 본원에서 막관통 도메인 단편 또는 돌연변이가 막관통 도메인과 기능적으로 동일한 것을 의미하며, 즉, 단편 또는 돌연변이가 본 발명의 rdSeV 벡터의 RSV F 단백질 또는 키메라 RSV/SeV F 단백질을 막에 여전히 고정시킬 수 있음을 의미한다.
본원에서, SeV 세포질 도메인 ("세포질 테일"이라고도 함)의 단편은 아미노산 하나 또는 2-5개 정도로 짧을 수 있다. 이 경우, 해당 키메라 RSV/SeV F 단백질은 "필수 결핍성" 세포질 도메인으로 언급될 수 있다. 아래 실시예에 기술된 바와 같이, N-말단의 첫번째 및 2번째 아미노산 (예, 서열번호 3의 1번 및 2번 아미노산)을 제외한 전체 SeV 세포질 도메인이 결핍된 키메라 RSV/SeV F 단백질의 변이체는, 예상치못하게도, 매우 우수한 생산 효율, 심지어 전장 SeV 세포질 도메인을 가진 RSV/SeV F 단백질에서 달성되는 수준 보다 높은 생산 효율이 가능한 것으로 확인되었다. 따라서, 세포질 도메인은 없어도 되는 것으로 보이므로, 세포질 도메인의 임의 단편(일부)를 포함하거나 또는 세포질 도메인이 필수 결핍된 키메라 RSV/SeV F 단백질은 본 발명에 포함된다.
용어 "돌연변이"는 본원에서 돌연변이된 폴리펩타이드 또는 단백질 도메인을 지칭하는데, 돌연변이는 특정 타입의 돌연변이로 한정되지 않는다. 특히, 돌연변이는 단일-아미노산 치환, N-말단, C-말단 및 내부 결손 등의 하나 또는 수개의 아미노산의 결손, 및 N-말단, C-말단 및 내부 삽입 등의 하나 또는 수개의 아미노산의 삽입, 및 이들의 조합을 포함한다. 삽입되거나 및/또는 결손되는 아미노산의 수는 1-10개, 특히 1-5개일 수 있다. 또한, 1-20개, 특히 1-10개, 보다 구체적으로 1-5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 돌연변이(치환)될 수 있다. 아울러, 용어 "돌연변이"는, 서열번호 1 (RSV 균주 ATCC VR-26 (Long 균주) F 단백질의 엑토도메인), 서열번호 2 (RSV 균주 ATCC VR-26 (Long 균주) F 단백질의 막관통 도메인) 및 서열번호 3 (SeV 균주 Fushimi F 단백질의 세포질 도메인)에 나타낸 아미노산 서열들 각각과 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 97% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 돌연변이된 엑토도메인, 돌연변이된 막관통 도메인 및 돌연변이된 세포질 도메인을 포괄할 수 있다.
백본으로 사용되는 SeV와 세포질 도메인이 기원하는 SeV는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 그러나, 본 발명의 rdSeV는, 통상적으로 SeV 백본의 SeV F 엑토도메인과 막관통 도메인을 각각 대응되는 RSV F 엑토도메인 (또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이) 및 RSV F 막관통 도메인 (또는 이의 기능성 단편 또는 돌연변이)으로 치환함으로써, 구축되며, 키메라 F 단백질의 SeV 영역은 전형적으로 본 발명의 rdSeV 벡터의 백본으로서 사용되는 SeV로부터 유래된다.
백본으로서 사용하거나 또는 키메라 RSV/SeV F 단백질을 구축하기 위해 적합한 SeV 균주로는, 센다이 푸시미 균주 (ATCC VR-105), 센다이 해리스 균주, 센다이 칸텔 균주 및 센다이 Z 균주를 포함한다. 마찬가지로, RSV 엑토도메인은 임의 재조합 또는 천연 RSV 균주, 바람직하게는 인간 SeV 균주, 예컨대 A2, long 또는 B 균주들로부터 유래되는 RSV F 단백질로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 핵산은, RSV 엑토도메인과 RSV 막관통 도메인을 포함하는 RSV F 단백질 또는 키메라 RSV/SeV F 단백질 외에도, 용해성 RSV F 단백질을 코딩한다. 본원에서 "용해성 F 단백질"은, F 단백질을 막에 위치시키는 임의의 아미노산 가닥이 결핍된 F 단백질을 의미하며, 특히, 막관통 도메인과 세포질 도메인 둘다 결핍된 F 단백질을 지칭한다. 따라서, 용해성 RSV F 단백질은 RSV F 단백질의 엑토도메인, 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이일 수 있다. 용어 "단편", "면역원성" 및 "돌연변이"는 상기 정의된 의미와 동일한 의미를 가진다.
바람직한 구현예에서, 용해성 RSV F 단백질은 RSV F 단백질의 아미노산 1-524 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이에 해당된다. 특히 바람직한 구현예에서, 용해성 RSV F 단백질은 서열번호 1로 표시되는, RSV ATCC VR-26 균주 (Long 균주) F 단백질의 엑토도메인, 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이이다.
용해성 RSV F 단백질을 코딩하는 이종 유전자 (이하 "sF 트랜스진"이라 함)의 고 발현이 바람직하다면, 그 서열은 바람직하게는 바이러스 네거티브-가닥 RNA 게놈의 3' 영역으로 삽입된다. 그 이유는, SeV처럼 네거티브-가닥 RNA 바이러스는 자신의 네거티드-가닥 RNA 게놈의 3' 말단에 위치한 전사 유닛을 가장 효율적으로 전사하기 때문이다. 유전자들의 전사체 수준은 하류로 갈수록 점차 적은데, 이는 전사 구배 (transcriptional gradient)라고 하는 현상이다. 이는 바이러스 게놈내 여러 위치에 삽입함으로써 이종 트랜스진의 발현 수준을 조절할 수 있게 한다. 본원에서, sF 트랜스진은 P (즉, Pmut; PΔ2-77) 유전자와 M 유전자 사이에 삽입되는 것이 바람직하다.
sF 트랜스진은, 전사 개시 서열, 전사 종결자 및 바람직하게는 번역 신호와 작동가능하게 연결된 용해성 RSV F 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 전사 카세트로서 삽입될 수 있다. 또한, sF 트랜스진은 mRNA 안정화 요소와 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, Woodchuck 간염 바이러스의 전사 후 조절 인자 (WPRE)를, mRNA를 안정시키고 발현을 연장시키기 위해, sF 트랜스진의 3' UTR 및/또는 5' UTR 영역내로 삽입할 수 있다.
용해성 RSV F 단백질을 코딩하는 sF 트랜스진의 병합으로, RSV 항원을 2가지 다른 방식으로, 즉 바이러스 외막에 박힌 벡터의 구조 성분으로서 RSV 항원을 제시하는 키메라 RSV/SeV 또는 RSV F 표면 단백질로서, 그리고 용해성 RSV F 단백질로서 제시할 수 있다. 따라서, 용해성 RSV F 단백질의 부가적인 발현은 면역계의 체액성 및 세포성 부문을 비롯하여 보다 효과적이고 광범위한 면역 반응을 유도하는데 일조할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 rdSeV 벡터의 핵산은 용해성 RSV F 단백질 또는 이의 단편 또는 돌연변이를 코딩하지 않는다. 아울러, 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 rdSeV 벡터는, 본원에 상세히 기술된 키메라 RSV/SeV F 단백질 또는 이의 단편 또는 돌연변이 이외의, 키메라 F 단백질 또는 이의 단편 또는 돌연변이를 코딩하지 않는 것이 바람직하며, 바람직하게는 용해성 RSV F 단백질 또는 이의 단편 또는 돌연변이를 코딩하지 않는다. 또한, 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 rdSeV 벡터가 본원에 상세히 기술된 RSV F 단백질 또는 이의 단편 또는 돌연변이 외에는, 막-결합형 F 단백질 또는 이의 단편 또는 돌연변이를 코딩하지 않는 것이 것이 바람직하며, 바람직하게는 용해성 RSV F 단백질 또는 이의 임의 단편 또는 돌연변이를 코딩하지 않는다. 또한, 본원에 상세히 기술된 키메라 RSV/SeV F 단백질은 바람직하게는 본 발명의 rdSeV에 의해 발현되는 단독의 이종 단백질이다.
전술한 변형 외에도, 본 발명의 SeV 벡터는 다른 변형을 포함할 수 있다. 구체적으로, 하나 이상의 바이러스 유전자에 부가적인 돌연변이를 가지도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 rdSeV 벡터는 바이러스 외막 단백질을 코딩하는 유전자 하나 이상에 한가지 이상의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 이들 돌연변이는 당해 기술 분야에 공지된 재조합 기법에 의해 도입될 수 있으며, 바이러스 세포 특이성 변형 등의 여러가지 효과를 유도할 수 있다.
또한, 본 발명의 rdSeV 벡터는, C, W 및 V ORF들이 P 유전자의 N-말단 ORF와 중첩되기 때문에, 바이러스 P 단백질에서의 N-말단 결손의 결과로서 C, W 및/또는 V 오픈 리딩 프래임 (ORF)들에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수도 있다. 아울러, 본 발명의 rdSeV 벡터에는 C 유전자의 얼터너티브 개시 코돈 ACG가 추가로 결손될 수 있다. C 유전자는 감염된 세포에서 항-IFV 반응 활성을 발휘하는 것으로 공지된 비-구조 단백질을 코딩한다. C 유전자의 개시 코돈이 결손되면, 감염된 타겟 세포에서 이종 유전자 산물의 발현이 증가된다는 것을 확인하게 되었다.
제2 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 핵산 또는 이의 상보체 및/또는 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 핵산 또는 핵산의 상보체를 코딩하는 DNA 분자를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 목적에서 "상보체"는 핵산의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 (즉, "안티센스" 핵산)을 의미한다. 이와 관련하여, 핵산은 통상적으로 본 발명의 rdSeV의 게놈과 부합됨에 유념한다. 즉, 핵산의 상보체는 통상적으로 본 발명의 rdSeV의 안티게놈과 일치된다.
숙주 세포는 구제 세포 (rescue cell) (또는 "바이러스 생산 세포") 또는 헬퍼 세포 (또는 "증폭 세포") 중 어느 하나일 수 있다. 구제 세포는 본 발명의 rdSeV 벡터를 처음에 생산하는데 사용된다. 구제 세포는 전형적으로 이종의 DNA-의존적인 및/또는 RNA-의존적인 RNA 중합효소, 예컨대 T7 RNA 중합효소 또는 동종의 세포성 RNA 중합효소 II를 통상 발현하는, 진핵생물 세포, 구체적으로 포유류 세포이다. 이종의 DNA-의존적인 RNA 중합효소를 코딩하는 유전자는 구제 세포의 게놈에 삽입되거나, 또는 발현 플라스미드에 존재할 수 있다.
구제 세포는 본 발명의 rdSeV 벡터가 조립될 수 있도록 기능성 SeV P 단백질 뿐만 아니라 SeV N 및 L 단백질을 더 포함하여야 한다. 이들 바이러스 단백질들의 발현은 전형적으로 구제 세포에 해당되는 P, N 및 L 유전자를 보유한 발현 플라스미드 하나 이상을 형질감염시킴으로써 달성된다. 본 발명에 사용하기 적합한 구제 세포는 BSR-T7 세포로서, 이 세포는 게놈에 안정적으로 삽합된 T7 RNA 중합효소의 유전자를 가지고 있으며, SeV P, N 및 L 단백질들에 대한 유전자를 보유한 발현 플라스미드로 형질전환되어 있다 (Buchholz et al., J. Virol. 73:252-259, 1999).
본 발명의 rdSeV 벡터를 먼저 제조하기 위해, 본 발명의 rdSeV 핵산 또는 이의 안티센스 핵산을 코딩하는 DNA 분자로 구제 세포를 형질감염시킨다. 세포 형질감염은 당해 기술 분야에 공지된 절차에 따라, 예를 들어 제조사가 설명한 FuGENE 6 또는 FuGENE HD (Roche) 시약을 이용하여 화학적으로, 또는 전기천공에 의해 수행할 수 있다. 형질감염된 DNA 분자는 전형적으로 본 발명의 rdSeV 핵산의 cDNA를 운반하는 플라스미드이다. DNA 분자는 통상 구제 세포의 이종의 DNA-의존적인 RNA 중합효소에 의해 전사되기 때문에, DNA 분자는 바람직하게는 바이러스 게놈 서열과 작동가능하게 연결된 전사 신호, 예를 들어 T7 프로모터 및 종결자 서열을 더 포함한다. 이는, 바이러스 서열의 3' 말단에서 전사체의 절단을 가능하게 하는 리보자임 서열을 자신의 3' 말단에 더 포함할 수 있다. DNA 분자는 바람직하게는 원핵 헬퍼 세포 (예, 에스케리키아 콜라이) 및/또는 진핵 헬퍼 세포, 특히 포유류 헬퍼 세포에서 증폭하는데에도 또한 적합하다. 구제 세포내에서 재조합 바이러스 게놈을 패킹하여 세포 표면에서 바이러스 입자가 조립된 후, 새롭게 생겨난 rdSeV 벡터는 세포로부터 출아 (budding)를 통해 방출되며, 다음 라운드의 헬퍼 세포 감염에 사용될 수 있다.
헬퍼 세포 (HP)는 구제 세포 안에서 먼저 조립된 SeV 벡터를 증폭시키기 위해 사용되며, 전형적으로 Vero 세포 또는 HEK-293 세포 등의 포유류 세포로부터 유래된다. 이들 헬퍼 세포는 P 단백질을 발현하며, 선택적으로 N 및/또는 L 단백질을 발현한다. 해당 P, N 및 L 유전자는 헬퍼 세포의 게놈에 병합되거나 또는 하나 이상의 발현 플라스미드에 존재할 수 있다. 적합한 세포주의 예로는, SeV P 단백질을 구성적으로 발현하는 HEK-293 세포로부터 유래되는 세포주이다 (Willenbrink et al., J. Virol. 68:8413-8417, 1994). 본 발명에서, P/N 공동-발현이 놀랍게도 최고의 바이러스 생산율을 발생시키는 것으로 확인되었기 때문에, 헬퍼 세포는 바람직하게는 바이러스 L 단백질이 아닌 바이러스 P 및 N 단백질을 발현하도록 유전자 변형된다.
제3 측면에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 본 발명의 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터의 제조 방법을 제공한다:
(i) 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
(ii) 세포 배양물로부터 게놈 복제-불능 SeV 벡터를 수집하는 단계.
게놈 복제-불능 SeV 벡터의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 Wiegand et al., J. Virol. 81 :13835-13844 (2007), Bossow et al., Open Virol. J. 6:73-81 (2012) 및 WO 2006/084746 A1에 기술되어 있다. 배양 단계 (i)에서, 숙주 세포는, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV가 형성되도록 게놈 복제와 전사를 허용하는 조건 하에 적정 배양 배지에서 배양된다. 세포 배양에 사용되는 배지는 숙주 세포를 배양하는데 적합한 임의의 기존 배지일 수 있으며, 예를 들어 10% 열-불활화된 FCS가 첨가된 DMEM (Invitrogen)일 수 있다. 숙주 세포는 상기에서 정의된 규제 세포 또는 헬퍼 세포일 수 있다. 수집 단계 (ii)에서, 본 발명의 형성된 SeV 벡터는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 회수된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터를 생산하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 본 발명의 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터의 핵산 또는 이의 상보체를 코딩하는 DNA 분자를 제1 숙주 세포에 도입하는 단계,
(b) 상기 제1 숙주 세포를 배양하여, 게놈 복제-불능 SeV 벡터를 만드는 단계,
(c) 상기 제1 세포 배양물로부터 게놈 복제-불능 SeV 벡터를 수집하는 단계,
(d) 제2 숙주 세포를 단계 (c)에서 수득된 게놈 복제-불능 SeV 벡터로 감염시키는 단계,
(e) 상기 제2 숙주 세포를 배양하여, 게놈 복제-불능 SeV 벡터를 증폭시키는 단계,
(f) 상기 제2 세포 배양물로부터 게놈 복제-불능 SeV 벡터를 수집하는 단계.
제1 숙주 세포는 바람직하게는 전술한 바와 같은 규제 세포 (바이러스 생성 세포)이고, 제2 숙주 세포는 바람직하게는 전술한 헬퍼 세포 (증폭 세포)이다. 단계 (a)에서 제1 숙주 세포로 DNA 분자를 도입하는 것은 당해 기술 분야에 공지된 형질감염 방법에 의해 수행될 수 있다. 배양 및 수집 단계들은 전술한 바와 같이 수행될 수 있다.
제4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터와 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신에 관한 것이다.
용어 "백신"은, 본원에서, 특정 병원체 또는 질환에 대한 치료학적 수준의 면역성을 개체에서 유도하기에 유효한 활성 성분을 함유한 제제 또는 조성물을 지칭한다. 본 발명의 백신은 "세미-라이브" 백신이며, 이는 복제-불능이기 때문에 생 백신은 아니지만 일차 전사 및 유전자 발현을 여전히 할 수 있기 때문에 불활화 (또는 사) 백신은 아닌, 백신을 의미한다. 본 발명의 세미-라이브 백신은 ("생 백신"처럼) 특출하게 효과적이며, 또한 특히 ("사 백신"처럼) 안전하다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명의 백신의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 용액, 현탁액, 동결건조된 물질 또는 의도한 용도로 적합한 임의의 다른 형태일 수 있다. 예를 들어, 백신은 주사 또는 주입용 수성 또는 비-수성 용액 또는 분산액 등의 비경구 제형의 형태이거나 또는 국소 또는 점막 투여에 적한한 제형의 형태일 수 있다.
백신은 통상적으로 본 발명의 rdSeV를 유효량으로 포함한다. 본 발명에서, 용어 "유효량"은 유리한 또는 원하는 치료학적 결과를 발휘하는데 충분한 화합물의 양을 지칭한다. 치료학적인 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량 (dosages)으로 투여될 수 있으며, 특정 제형 또는 투여 경로로 한정하고자 하는 것은 아니다.
또한, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체가 백신에 포함된다. 용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 본원에서, 화합물 또는 물질이 올바른 의학적 판단 범주 내에서 포유류, 특히 인간의 조직과 접촉하기에 적합하지만 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제성 합병증이 없는 것을 의미한다. 용어 "담체"는, 본원에서, 백신 조성물에 요구되는, 필요한 또는 원하는 희석제, 보강제, 부형제, 비히클 또는 기타 화합물와 관련있다. 적정 담체는 특히 비경구, 점막 또는 국소 투여에 적합한 것이며, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition (2000)에 언급된 바와 같이 주사 및 주입용 멸균 수성 및 비-수성 용액 또는 분산액을 포함한다.
특히, 백신은 보강제 하나 이상을 포함할 수 있다. 용어 "보강제"는, 본원에서, 항원의 면역원성을 강화하지만 반드시 면역원성인 것은 아닌 물질을 지칭한다. 적정 보강제로는, 비제한적인 예로, 1018 ISS, 알루미늄 염, Amplivax®, AS 15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린 또는 플라젤린 유래 TLR5 리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, 인터루킨, 예로 IL-2, IL-13, IL-21, IFN-alpha 또는 -beta, 또는 이들의 페길화 유도체, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac, MALP-2 또는 이의 천연 또는 합성 유도체, MF59, 모노포스포릴 지질 A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, 유중수 및 수중유 에멀젼, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK 및 OspA를 포함한다.
아울러, 백신은 본 발명의 rdSeV 벡터와 함께 투여되는 부가적인 활성 물질을 1종 이상 함유할 수 있다. 또한, 약학 조성물은 부가적인 약제학적으로 허용가능한 물질, 예를 들어, 가용화제, 계면활성제, 장성 변형제 (tonicity modifier) 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다.
제5 측면에서, 본 발명은 포유류에서 RSV 감염 또는 RSV 감염과 관련된 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터에 관한 것이다.
용어 "치료"는, 본원에서, 질환의 치료학적 치료 및 예방학적 치료 (또는 예방) 둘다를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명에서, "치료"는 바람직하게는 예방학적 치료 또는 방지를 의미한다. 본 발명의 목적에서 "치료"는 통상적으로 본 발명의 rdSeV 벡터를 유효량으로 투여하는 것을 수반한다. 바람직하게는, 본 발명의 rdSeV는 본원에 기술된 바와 같은 백신 조성물의 형태로 투여된다.
치료할 포유류는 바람직하게는 인간 개체이다. 특히 중요한 타겟 그룹은 인간 유아와 어린이이며, 특히 조산아 또는 RSV 감염으로 인해 입원 가능성이 있는 인간의 유아이다. 다른 중요한 타겟 그룹은 인간의 노년층, 면역저하된 인간 개체, 이식을 받은 자, 특히 장기 이식을 받은 개체 및 만성 질환을 앓고 있는 개체를 포함한다. 만성 질환은, 예를 들어, 암, 만성 간염, 허혈성 심장 질환, 만성 신부전, 만성 호흡 질환 (예, 천식, 폐색성 폐 질환 (COPD), 폐 고혈압), 만성 이식 편대 숙주 질환 (GVHD) 및 자가면역 질환 (예, 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환 (IBD), 크론 질환)일 수 있다.
RSV 감염은 RSV로 인한 모든 타입의 호흡기 감염을 포함한다. RSV 감염과 관련된 질환은 바람직하게는 중이염, 기관지염, 호산구 증가증, 폐렴, 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적합한 투여 경로는, 비제한적인 예로, 비경구, 점막 및 국소 투여를 포함한다. 비경구 투여는 피하, 정맥내, 복막내 또는 근육내 주입에 의한 것일 수 있다. 점막 투여는 코 표면으로의 점적 투여 또는 설하 투여에 의해 또는 에어로졸화된 입자의 코 표면 또는 그외 기도 경로의 표면으로의 흡입 투여에 의해서와 같이, 기도 표면으로의 투여를 포함할 수 있다.
후술한 실시예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터는 비강내 투여시 점막 면역 반응을 효과적으로 도출한다. 따라서, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터 또는 백신이 임의의 전통적인 경로를 통해 투여될 수도 있지만, 바람직하게는 점막으로, 예를 들어 코 또는 경구 (위내) 경로를 통해 점막으로 투여된다. 비강내 투여가 특히 바람직하다.
투여 용법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 매일, 2주 마다, 매달, 2달마다 1회, 3달마다 1회, 6달마다 1회, 9달마다 1회 및 1년에 한번 또는 1회 적용 투여 계획을 포함한다. 환자에게 투여되는 바이러스 벡터의 치료학적 유효량은 적용 방식, 질환의 타입, 환자의 체중, 연령, 성별 및 건강 상태 등에 따라 결정된다. 투여는 필요에 따라 1회 또는 수회일 수 있다. 본 발명의 백신은 다른 병원체로부터 유래된 항원과 다가 백신으로서 공동-투여될 수 있다.
이제, 본 발명은 아래 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다.
실시예
아래 실시예들에서, 본 발명의 복제-불능 센다이 바이러스 벡터 (이하 "rdSeV-FRSV/SeV" 벡터로 지칭됨)의 유전자 안정성, 안전성 및 생산 효율을 평가하였다. 그 결과, rdSeV-FRSV/SeV 벡터는 안전하며 다량으로 효율적으로 생산할 수 있는 것으로 확인된다. 따라서, 본 발명의 rdSeV 벡터는 RSV 감염 또는 RSV 감염과 관련된 질환에 대한 유망한 바이러스 벡터 백신의 후보체이다.
재료 및 방법
아래 재료 및 방법은 실시예 1-5에서 사용되었다.
세포 및 바이러스:
American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)으로부터 입수한 Vero (ATCC CCL-81), HEp-2 (ATCC CCL-23) 및 P815 세포 (ATCC TIB-64)는 5% 열-불활화된 소태아 혈청 (FBS; Invitrogen), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 U/ml 페니실린이 첨가된 RPMI (Invitrogen, Milan, Italy) 또는 이글 최소 기본 배지에서 유지시켰다. 헬퍼 세포주 "P-HC" ("증폭 세포")는 SeV 인단백질 (단백질 P)을 발현하는 Vero 세포로부터 유래되며 (Wiegand et al., J. Virol. 81 :13835-13844, 2007), 헬퍼 세포주 "VPN"은 플라스미드-코딩 SeV 인단백질 (단백질 P) 및 핵단백질 (단백질 N)을 발현하는 Vero 세포로부터 유래된다. BSR-T7 세포 ("구제 세포") (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999)는 Klaus-K. Conzelmann (Munich)으로부터 친절하게 제공받았다. RSV 타입 A (Long 균주, ATCC VR-26)는 HEp-2 세포에서 37℃에서 배양하였다. 센다이 바이러스 균주 D52 (ATCC VR-105)로부터 유래된 재조합 SeV 벡터를 기반으로 한 모든 백신 후보물 (rdSeV-FRSV/SeV, rdSeV-FRSV/Sev-ΔCT, rdSeV-sFRSV)은 33℃에서 배양하였다.
게놈 벡터 설계:
본 발명의 바이러스 벡터를 구축하기 위해, RSV 또는 SeV F 유전자의 cDNA를 각각 함유한 플라스미드를 중첩 PCR 기법에 의해 키메라 RSV/SeV F ORF를 구축하기 위한 주형으로서 사용하였다 (Horton et al., Gene 77:61-68, 1989). 특이적인 프라이머 설계를 통해, 제한 효소 SalI 및 XhoI에 특이적인 서열을 함유한 3'-말단 및 5'-말단에 비-중첩 영역을 도입하였다. 서열-검증된 키메라 ORF를, 야생형 게놈의 P 유전자내 SanDI 제한효소 부위 (게놈 뉴클레오티드 위치 2714)에서부터 L 유전자내 SanDI 제한효소 부위 (게놈 뉴클레오티드 위치 9131)까지의 센다이 바이러스 게놈을 포함하는, 서브게놈 플라스미드 구조체에 삽입하였다. 이 게놈 단편은, F ORF 측면에 SalI 및 XhoI 제한효소 부위를 위치시키는 방식으로 변형시켰다. 키메라 F ORF를 중간 클로닝 벡터에 삽입한 후, 클로닝 벡터의 SnaDI 단편을 앞서 준비한 rdSeV 전장 구조체로 이동시킴으로써, rdSeV-FRSV/SeV의 전장 게놈을 구축하였다. 제조된 재조합 SeV 게놈은 "6의 법칙" (Calain et al., J. Virol. 67:4822-4830, 1993)에 따라 "rdSeV-FRSV/SeV" (replication-deficient SeV encoding chimeric RSV/SeV F 단백질)로 명명하였고, 제한 효소 분석 및 서열분석에 의해 검증하였다.
Voges et al. (Voges et al., Cell. Immunol. 247:85-94, 2007)에 기술된 바와 같이, P 및 M 유전자 사이에 부가적인 트랜스진으로서 RSV F 단백질의 용해성 형태를 코딩하는 재조합 센다이 벡터 유래의 서브게놈 EcoRI 단편을, WO 2006/084746 A1에 기술된 복제-불능 센다이 벡터로 이동시킴으로써, 용해성 RSV F 단백질을 발현하는 rdSeV-sFRSV 벡터를 구축하였다. 제조되는 재조합 SeV 게놈은 "6의 법칙" (Calain et al., J. Virol. 67:4822-4830, 1993)에 따라 "rdSeV-sFRSV" (replication-deficient SeV vector expressing RSV soluble F 단백질)로 명명하였고, 제한 효소 분석 및 서열분석에 의해 검증하였다.
바이러스 구제, 증폭 및 역가 측정 (titration):
재조합 바이러스들을 Wiegand et al., J. Virol. 81 :13835-13844, 2007에 기술된 방법에 약간 변형시켜 형질감염된 BSR-T7 세포로부터 회수하였다. FuGENE6 (Roche)를 2.0 ㎕/㎍ DNA 농도로 형질감염 시약으로서 사용하였다. 복제-불능 SeV 바이러스는 상층액으로부터 회수하여, SeV P 단백질 ("P-HC")을 안정적으로 발현하는 헬퍼 세포주에서 증폭시켰다. 이 P-HC 세포주는, 백신 벡터 rdSev-FRSV/SeV를 센다이 바이러스 P 및 N 단백질을 안정적으로 발현하는 VPN 헬퍼 세포주에서 생산하는 바이러스 생산 효율과 관련한 실험을 제외하고는 (Wiegand et al., J. Virol. 81 :13835-13844, 2007), 모든 실험에 사용하였다 (도 4 참조). 바이러스는 기존의 언급된 방법대로 역가를 측정하였고 (Wiegand et al., J. Virol. 81:13835-13844, 2007), 역가는 밀리리터 당 세포 감염 단위 (ciu/ml) (형광 플라그 형성 단위와 동일함)로 제시하였다. 여러가지 SeV 벡터의 완전성 (integrity)은 RT-PCR 및 서열분석에 의해 검증하였다.
웨스턴 블롯 분석:
모의 감염 또는 PIV3, RSV 또는 rdPIRV로 감염된 Vero 세포의 추출물을 수집하여, SDS-PAGE에 의해 분리시켰다. 니트로셀룰로스 막에 블롯팅한 후, PIV3 HN 및 F 단백질에 대한 마우스 단일클론 항체 (Chemicon, Milan, Italy)와 염소 항-RSV 항체 (Meridian Life Science, Saco, ME)를 사용해 단백질을 검출하였다.
실시예 1
본 발명의 복제-불능 SeV 벡터의 구축
리버스 유전자 기법을 사용해, "rdSeV-FRSV/SeV" (replication-deficient SeV vector expressing chimeric RSV/SeV F 단백질)로 명명된, 인간 RSV에 대한 SeV 백신 벡터를 구축하였다. 세포질 도메인을 제외한, SeV F ORF를 이의 RSV 카운터파트로 치환하여, 키메라 RSV/SeV F 표면 단백질을 수득하였다 (도 1). 아울러, 안전한 백신 벡터를 개발하기 위해, 인단백질 (P) 유전자에서 N-말단 76개의 아미노산 (PΔ2-77)을 결손시킴으로써 SeV 백본을 변형시켰다. 기존에 확인된 바와 같이, 결손된 PΔ2-77 SeV 벡터는 비-헬퍼 세포주에서 새로운 게놈 주형을 합성할 수 없지만 일차 전사와 유전자 발현은 여전히 수행할 수 있다 (Bossow et al., Open Virol. J. 6:73-81, 2012). rdSeV-FRSV/SeV를 cDNA로부터 성공적으로 구제할 수 있었으며, 헬퍼 세포주 "P-HC"를 이용해 증폭시킬 수 있었다.
실시예 2
복제-불능 SeV 벡터의 유전자 안정성
본 실시예에서, 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 유전자 안정성을 "rdPIRV" (replication-deficient PIV3/RSV SeV 벡터)로 지칭되는 특이적인 복제-불능 SeV 구조체를 이용해 평가하였다. 이 구조체는 첨부된 청구항의 범위에 포함되는 것은 아니지만, 안정성과 관련하여 이 구조체로부터 수득되는 결과는 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터에 유효한 것으로 간주된다.
rdPIRV 벡터는 용해성 RSV F 단백질 뿐만 아니라 키메라 RSV/SeV F 및 HN 표면 단백질을 전술한 기법 및/또는 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용해 발현하도록 유전자 조작한다. 간략하게, RSV F 엑토도메인 코딩 서열을 기존에 성공적으로 적용된 바와 같이 용해성 단백질 (sF)로서 발현되는 부가적인 전사 유닛으로서 삽입하였다 (Voges et al., Cell. Immunol. 247:85-94, 2007). 세포질 도메인과 막관통 도메인을 제외한, SeV F 및 HN ORF들이 이의 PIV3 카운터파트로 치환되었다. 아울러, 안전한 백신 벡터를 개발하기 위해, 인단백질 (P) 유전자에서 N-말단 76개의 아미노산 (PΔ2-77)을 결손시킴으로써 SeV 백본을 변형시켰다.
rdPIRV를 cDNA로부터 성공적으로 구제하여 헬퍼 세포주를 이용해 증폭시킬 수 있었다. 이 벡터는 비-헬퍼 세포주에서 새로운 게놈 주형을 합성할 순 없었지만, PIV3 F 및 HN 단백질과 RSV sF 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된 바와 같이 (데이타는 도시 안함), 여전히 일차 전사 및 유전자 발현을 할 수 있었다. 나아가, 10번의 연속 계대 배양 후 서열 분석에서 돌연변이는 없는 것으로 확인되었다.
이들 결과는 복제-불능 SeV/PΔ2-77 백신 벡터의 구조적 완전성과 서열 안정성을 검증해주며, 따라서 본 발명의 복제-불능 SeV 벡터의 구조적 완전성과 서열 안정성을 검증해준다.
실시예 3
복제-불능 SeV 벡터의 안전성
아울러, 복제-불능 SeV 벡터의, 특히 복제-불능과 생체내 여러 조직으로의 생물분포에 대한 안전성에 대한 실험들을 실시예 2에 기술된 rdPIRV 벡터를 사용해 수행하였다. 즉, 안전성에 대해 rdPIRV 벡터에서 수득되는 결과는 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터에 동일하게 적용되는 것으로 간주된다.
BALB/C 마우스 (n=4) 2 그룹에, 검출을 용이하게 하기 위해, EGFP (강화된 푸른 형광 단백질)를 발현하는, 1 x 105　ciu의 rdPIRV 또는 변형된 복제-가능 SeV (SeV-E wt)를 비강내 (i.n.)로 접종하였다. 3일 후, 마우스를 희생시키고, 폐와 혈액 샘플을 취하였다. 조직 균질물과 혈액에 존재하는 바이러스를, 세포 배양물에서 EGFP-양성 병소 (foci)를 계수함으로써, 정량하였다 (검출 한계: 폐와 비장 당, 혈액 500 ㎕ 당 20 ciu).
조사한 모든 동물 조직들에서는 rdPIRV의 바이러스 입자를 검출할 수 없었다. SeV-E wt를 사용하였을 때에만, 폐에서 바이러스 입자를 검출할 수 있었으며 (최대 3.2 x 104　ciu/폐), 혈액에서는 검출할 수 없었다 (데이타 도시 안함). 아울러, rdPIRV-면역화 마우스로부터 취한 폐 균질물을 Vero 세포 위에 적층하여, 임의의 복제성 재조합 SeV의 부재를 검증하였다. 바이러스는 검출할 수 없었는데, 이는 이 백신 벡터가 생체내에서 복제-불능임을 검증해주었다 (데이타 도시 안함). 동물에서 어떠한 통증 또는 체중 감소 신호도 나타나지 않았다.
요컨대, 이들 데이타는, (i) P 유전자에서 아미노산 2-77개를 결손시키면 벡터는 생체내에서 후대 게놈을 생산할 수 없으며; (ii) 복제 가능 SeV 전파는 호흡기로 한정됨을 보여준다. 또한, 이러한 결과는 본 발명의 복제-불능 SeV 벡터에도 적용되며, 따라서 인간에게 투여하기에 매우 안전한 것으로 간주된다.
실시예 4
생산 효율
시판 백신의 생산 효율은 이러한 제품의 시장 잠재력에 막대한 영향을 미친다. 따라서, 본 발명의 게놈 복제-불능 SeV 벡터 (rdSeV-FRSV/SeV 벡터)의 생산 효율을 분석하고, 세포질 도메인이 결핍된 변이체 rdSeV-FRSV/SeV-ΔCT의 생산 효율과 비교하였다.
1차 실험에서, SeV P 및 N 단백질을 코딩하는 유전자들로 안정적으로 형질감염된 VPN 헬퍼 세포에, 본 발명의 rdSeV-FRSV/SeV 벡터를 감염시켰다. 여러 계대의 벡터 (P1, P2, P3)를 분석하였다. 계대 P1 및 P2의 경우, 2가지의 개별 생산 경로를 수행하였다 (P1-1, P1-2, P2-1, P2-2). 세포 배양 상층액에서 여러 시간대 (예, 8-11일 ("d8-11"), 11-12일 ("d11-12") 등)에 취한 샘플에서 벡터 역가를 분석하였다.
도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 바이러스 역가는 모든 계대 배양 수준과 생산 회차들에서 높으며, 특히 계대 배양 P2에서 매우 높다. 전반적으로, 이들 결과는, 동일 시간대에 2종의 다른 바이러스로부터 유래된 2가지 표면 단백질 (F 및 HN)의 존재로 인해, 예상치못한 높은 생산 효율을 입증해준다. 이런 사실은, 부착 융합 및 출아 공정 중에 강력한 간섭이 예상되므로, 놀라운 일이었다.
2차 실험에서, rdSeV-FRSV/SeV의 생산 효율을 세포질 꼬리가 필수적으로 결핍된 F 단백질을 코딩하는 변이체 ("rdSeV-FRSV/SeV-ΔCT")와 비교하였다 (도 2 참조). 이 변이체는 헬퍼 세포주 "P-HC"에서 rdSeV-FRSV/SeV의 순차적인 계대 배양을 수행하는 동안에 자발적으로 형성되었다. 이후, 제조된 벡터 입자에 대한 서열 분석을 통해, F 유전자의 K553 (Lys-553) 코돈에서의 넌센스 돌연변이가 미성숙 (premature) 정지 코돈을 형성하는 것으로 드러났다. 그 결과, SeV F 세포질 도메인의 처음 2개의 아미노산 (즉, 아미노산 524 및 525)만 이 변이체에서 유지되고, 이의 세포질 꼬리는 (필연적으로) 결핍되어 있다.
세포 배양시 세포질 꼬리가 없는 자발적으로 생성된 변이체를 후속적으로 계대 배양하는 동안에, 결손 변이체/비-돌연변이 바이러스 (rdSeV-FRSV/SeV)의 비율이 증가하는 것으로 관찰되었다. 이런 예상치못한 결과를 토대로, 비-돌연변이 바이러스 (즉, rdSeV-FRSV/SeV)와 돌연변이 변이체 (즉, rdSeV-FRSV/SeV-ΔCT)의 세포 배양물들에서의 비교 생산 라운드를 이용하여, 돌연변이 바이러스를 현저하게 높은 역가로 증폭시킬 수 있다는 것을 검증하였다. 간략하게, 세포를 동일 MOI 0.1로 감염시켜 5일간 배양하였다. 여러 시간대에, 즉, 3일 ("d2-3"), 4일 ("d3-4"), 5일 ("d4-5"), 6일 ("d5-6") 및 7일 ("d6-7")에, 세포 배양 상층액의 벡터 역가를 측정하였다.
도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 초기 3일에, rdSeV-FRSV/SeV-ΔCT의 역가가 rdSeV-FRSV/SeV 보다 5배 높았다. 4일 및 5일에 각각, rdSeV-FRSV/SeV-ΔCT의 역가가 rdSeV-FRSV/SeV 보다 5배 내지 10배 높았고, 6일 및 7일의 역가는 심지어 10배 이상이었다. 이러한 사실은, 선행 기술 분야에서 SeV F 단백질의 세포질 꼬리가 바이러스 조립에 중요한 역할을 한다고 교시되어 있기 때문에, 더불어 예상치못한 일이었다 (Stone, R. and Takimoto, T., PLoS ONE 8(4): e61281. doi:10.1371/ journal.pone.0061281, 2013). 따라서, 당해 기술 분야의 당업자는 오히려 생산 효율이 감소될 것으로 예상하였다. 그러나, 결손 돌연변이 rdSeV-FRSV/SeV-ΔCT는 놀랍게도 우수한 생산 효율을 나타내며, 심지어 전장 키메라 RSV/SeV F 단백질을 발현하는 rdSeV-FRSV/SeV 보다 훨씬 우수한 생산 효율을 나타내는 것으로 확인되었다.
전체적으로, 전술한 결과들은, 본 발명의 rdSeV 벡터가 탁월한 안전성 프로파일을 가지며, 놀랍게 우수한 생산 효율을 달성할 수 있음을 보여준다. 높은 생산 효율은 백신으로서의 이의 시장성과 관련해 바이러스 벡터에서 매우 중요하며, 바람직한 특징이다. 따라서, 본 발명의 rdSeV 벡터는 RSV에 대한 매우 유망한 백신 후보이다.
SEQUENCE LISTING <110> AmVac AG <120> Semi-live respiratory syncytial virus vaccine <130> MUC00008.38 <150> EP13002973.9 <151> 2013-06-10 <160> 3 <170> BiSSAP 1.3.5 <210> 1 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> "Ectodomain of RSV strain ATCC VR-26 F protein" <220> DOMAIN <223> Ectodomain of RSV strain ATCC VR-26 F protein <400> 1 Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Asn 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Thr Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His His Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn 515 520 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> "Transmembrane domain of RSV strain ATVV VR-26 F protein" <220> DOMAIN <223> Transmembrane domain of RSV strain ATVV VR-26 F protein <400> 2 Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys 20 25 <210> 3 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> "Cytoplasmic domain of SeV strain Fushimi (V52) F protein" <220> DOMAIN <223> Cytoplasmic domain of SeV strain Fushimi (V52) F protein <400> 3 Arg Leu Lys Arg Ser Met Leu Met Gly Asn Pro Asp Asp Arg Ile Pro 1 5 10 15 Arg Asp Thr Tyr Thr Leu Glu Pro Lys Ile Arg His Met Tyr Thr Asn 20 25 30 Gly Gly Phe Asp Ala Met Ala Glu Lys Arg 35 40

Claims (15)

  1. 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터로서,
    인단백질 (P) 유전자에서 아미노산 2-77이 결핍된 돌연변이 P 단백질을 코딩하도록 변형된 핵산을 포함하며,
    상기 핵산은 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) F 엑토도메인 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이, RSV F 막관통 도메인 또는 이의 기능성 단편 또는 돌연변이, 및 SeV F 세포질 도메인 또는 이의 임의의 단편 또는 돌연변이를 포함하는 키메라 F 단백질을 추가로 코딩하거나, 또는
    상기 핵산은, RSV F 엑토도메인 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이, 및 RSV F 막관통 도메인 또는 이의 기능성 단편 또는 돌연변이를 포함하는, F 단백질을 추가로 코딩하는, 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 RSV 엑토도메인이 RSV F 단백질의 아미노산 1-524에 해당되거나, 및/또는
    상기 RSV 막관통 도메인이 RSV F 단백질의 아미노산 525-550에 해당되거나, 및/또는
    상기 SeV 세포질 도메인이 SeV F 단백질의 아미노산 524-565에 해당되는, 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 키메라 F 단백질에는 세포질 도메인이 기본적으로 결핍된, 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 핵산이 용해성 RSV F 단백질 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이를 추가로 코딩하는, 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 용해성 RSV F 단백질이 RSV F 단백질의 엑토도메인 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이인, 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 핵산이 용해성 RSV F 단백질 또는 이의 면역원성 단편 또는 돌연변이를 코딩하지 않는, 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터, 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 핵산 또는 이의 상보체, 및/또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 게놈 복제-불능 SeV 벡터의 핵산 또는 이의 상보체를 코딩하는 DNA 분자를 포함하는, 숙주 세포.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터의 생산 방법으로서,
    (i) 제7항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    (ii) 세포 배양물로부터 게놈 복제-불능 SeV 벡터를 수집하는 단계를 포함하는, 생산 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 게놈 복제-불능 센다이 바이러스 (SeV) 벡터, 및 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 백신.
  10. 제9항에 있어서, 보강제 (adjuvant)를 더 포함하는, 백신.
  11. 포유류에서 RSV 감염 또는 RSV 감염과 관련된 질환의 치료에 사용하기 위한,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 게놈 복제-불능 SeV 벡터.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 포유류가 인간 개체인, 게놈 복제-불능 SeV 벡터.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 인간 개체가 조산아 또는 RSV 감염으로 인한 입원 위험성이 있는 인간 유아를 포함하여 인간 유아 또는 어린이, 노인, 면역저하된 인간 개체, 이식받은 개체 또는 만성 질환을 앓고 있는 개체인, 게놈 복제-불능 SeV 벡터.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 백신이 비경구, 국소 또는 점막 투여용인, 게놈 복제-불능 SeV 벡터.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 비경구 투여가 피하, 정맥내, 복막내 또는 근육내 주사에 의한 것인, 게놈 복제-불능 SeV 벡터.
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