BR112012005703A2

BR112012005703A2 - particuça do tipo virus, composição imunogênia e medicamento

Info

Publication number: BR112012005703A2
Application number: BR112012005703-0A
Authority: BR
Inventors: Vidadi Yusibov; Christine E. Farrance; Konstantin A. Musiychuk; Vadim Mett; Valentina Mett
Original assignee: Fraunhofer Usa Inc
Priority date: 2009-09-18
Filing date: 2010-09-16
Publication date: 2020-09-15
Also published as: RU2012114483A; US20120219579A1; IN2012DN03209A; EP2477650A1; WO2011035004A9; WO2011035004A1; EP2477650B1; CA2774640C; CN102695524B; CA2774640A1; ES2752323T3; CN102695524A; EP2477650B8; RU2571223C2

Abstract

PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E MEDICAMENTO Partículas do tipo vírus compreendendo uma proteína de fusão e substancialmente livre de ácido nucleico, e proteína de fusão compreende urna proteína de revestimento viral de planta e uma proteína alvo, são fornecidos. Composições imunogênicas compreendendo as partículas do tipo vírus podem ser administradas aos indivíduos para induzir as respostas imunológicas protetoras nos indivíduos. Métodos de produzir as partículas do tipo vírus também são fornecidos.

Description

| PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E | MEDICAMENTO | REFERÊNCIA CRUZADA DE PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido de patente reivindica a prioridade do Pedido Provisório U.S 61/243.774, depositado em 18 de *. Setembro de 2009 e Pedido Provisório U.S 61/348,069, : depositado em 25 de Maio de 2010, todos os conteúdos de ambos estão incorporados aqui como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO Esta invenção se refere geralmente à área de vacinas recombinantes. Mais especificamente, a invenção se refere às partículas do tipo vírus compreendendo proteínas alvo fundidas às proteínas de revestimento viral de planta para uso em vacinas bem como à métodos para produzir partículas do tipo vírus.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO Os vírus de planta podem ser ferramentas eficazes para produção e administração de antígeno. Uma variedade de importantes antígenos de proteína tem sido expressa nas plantas transgênicas, mas o nível de proteína antigênica produzida tem sido relativamente baixo. Em uma tentativa de superar este problema, as proteínas de revestimento viral de planta têm sido projetadas para agir como moléculas 7 transportadoras para peptídeos antigênicos fundidos e usadas em sistemas de expressão transiente. As proteínas de Ú revestimento têm o potencial de se auto agregar e formar partículas de vírus recombinante que exibem os epítopos antigênicos desejáveis ou polipeptídeos externos em Suas superfícies. Devido aos vírus recombinantes serem replicados no citoplasma, os epítopos antigênicos desejáveis ou polipeptídeos externos podem não estar devidamente apresentados por causa da modificação inadequada no nível pós translacional ou dobramento inadequado. os antígenos produzidos nas plantas como um resultado da infecção com vírus mosaico de tabaco (TMVS- tobacco mosaic viruses) recombinante ou vírus mosaico de caupi têm sido mostrados para extrair os anticorpos específicos quando injetados em ratos. No entanto, nestes sistemas, os vírus eram incapazes “ de agregar quando os peptídeos maiores que 25 aminoácidos em . comprimento eram fundidos à suas proteínas de revestimento. i Em um sistema diferente, a fusão dos polipeptídeos acima de 47 aminoácidos em comprimento à proteína de revestimento do vírus mosaico de alfafa (AlIMV- alfalfa mosaic virus) não inibiram a agregação viral e as partículas virais resultantes contendo ácidos nucleicos virais eram imunógenos eficazes. (Yusibov, V., et al., PNAS 94: 5784-5788, 1997). Mais recentemente, um método tem sido desenvolvido para ligar um fragmento funcional de proteína A (133 aa) ao C-terminal da proteína de revestimento TMV usando um ligante de peptídeo 15-aa. As construções virais resultantes eram capazes de se agregar às partículas virais que eram capazes de infectar o tecido da folha e se mover ao longo do tecido. (Werner, S., et al., WPNAS 103: 17678-17683, 2006). No entanto, todos estes sistemas produziram partículas virais infectantes contendo RNA viral. Usar tais partículas para extrair uma resposta imunológica protetora, isto é, como uma vacina, necessitaria ' inocular o indivíduo com o RNA viral bem como o imunógeno pretendido.

o : Ú Adicionalmente permanece uma necessidade de métodos - e materiais para apresentar um epítopo antigênico desejável ou polipeptídeo externo na superfície das partículas do tipo vírus para imunização em que as partículas do tipo vírus são substancialmente livres de ácido nucleico viral.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A matéria revelada da presente invenção fornece partículas do tipo vírus bem como métodos para uso e preparação das partículas do tipo vírus.

De acordo com um aspecto da presente invenção, uma partícula do tipo vírus é fornecida. A partícula do tipo vírus compreende uma proteína de fusão e é substancialmente livre de ácido nucleico, em que a proteína de fusão ” compreende uma proteína de revestimento viral de planta e uma .. proteína alvo. A partícula do tipo vírus pode ser produzida em uma célula hospedeira selecionada a partir do grupo consistindo em células bacteriana, fúngica, de planta, de inseto, de anfíbio e de mamíferos. A proteína alvo pode ser fundida ao N-terminal da proteína de revestimento viral da planta.

A proteína de revestimento viral da planta pode ser derivada de uma proteína de revestimento de um vírus de planta selecionado do grupo consistindo de vírus mosaico de alfafa, vírus mosaico Johnsongrass, e vírus Y de batata.

A proteína alvo pode ser derivada a partir de um peptídeo de um patógeno intracelular. A proteína alvo pode ser derivada a partir de um polipeptídeo de superfície da célula do Plasmodium falciparum,y Ou um polipeptídeo de hemaglutinina de um vírus influenza. O vírus influenza pode ser um vírus influenza A selecionado a partir do grupo consistindo de HIN1I, H3N2, H5Nl e H7N7. O vírus influenza " pode ser também um vírus influenza B. A proteína alvo pode 2 25 compreender uma sequência de aminoácido do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 4-11 e 49, e fragmentos antigênicos destas. ' De acordo com outro aspecto da presente invenção, uma composição imunogênica é fornecida. A composição imunogênica compreende a partícula do tipo vírus. A composição imunogênica pode compreender adicionalmente um adjuvante. O adjuvante pode ser selecionado do grupo consistindo de sais de alumínio, emulsões de água e óleo, e adjuvantes com base em saponina. Em algumas realizações, a

| MD MM Na 4/32 proteína de revestimento viral de planta é derivada de uma proteína de revestimento de um vírus mosaico de alfafa enquanto a proteína alvo compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 4- 11 e49, e fragmentos antigênicos destas. ” Um método para induzir uma resposta imunológica . protetora contra um patógeno intracelular em um indivíduo é fornecido.

O método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz imunologicamente de uma primeira composição compreendendo uma primeira partícula do tipo vírus, em que a primeira partícula do tipo vírus compreende uma primeira proteína de fusão e é substancialmente livre de ácido nucleico, e em que a primeira proteína de fusão compreende uma proteína de revestimento viral de planta e uma primeira proteína alvo derivada do primeiro patógeno intracelular.

Em algumas realizações, a proteína de revestimento viral de planta é derivada de uma proteína de revestimento de um vírus mosaico de alfafa enquanto a primeira proteína alvo compreende uma sequência de amino ácido do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 4-11 e 49, e fragmentos antigênicos destas.

Em algumas outras realizações, a composição compreende adicionalmente um adjuvante. o método pode compreender adicionalmente 1 administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz imunologicamente de uma segunda composição compreendendo uma segunda partícula do tipo vírus antes de administrar à . primeira composição, em que a segunda partícula do tipo vírus compreende uma segunda proteína de fusão e é substancialmente | livre de ácido nucleico, e em que a segunda proteína de fusão compreende a proteína de revestimento viral e uma segunda proteína alvo.

A segunda proteína alvo pode ser derivada de um segundo patógeno intracelular que não é o primeiro patógeno intracelular.

Em algumas realizações, O primeiro patógeno intracelular pode ser um vírus influenza, a proteína ! de revestimento viral de planta é derivada de uma proteína de ; revestimento de um vírus mosaico de alfafa, a primeira proteína alvo compreende uma sequência de aminoácido do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 6-11, e a segunda proteína alvo q” compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de um . grupo consistindo de SEQ ID NOs: 4, 5 e 49. Em particular, a primeira e a segunda proteínas alvo podem compreender sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6 e 4, respectivamente.

Um método de produção de uma partícula do tipo vírus em uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína de fusão também é fornecido em que a partícula do tipo vírus compreende a proteína de fusão e é substancialmente livre de ácido nucleico, e a proteína de fusão compreende uma proteína de revestimento viral de planta e uma proteína alvo.

O método compreende expressar a proteína de fusão na célula hospedeira sob condições que permitam agregação da partícula do tipo vírus na célula hospedeira.

O método pode compreender adicionalmente purificar a partícula do tipo vírus da célula hospedeira.

Em algumas realizações, a célula hospedeira é uma ' célula selecionada do grupo consistindo de células bacterianas, fúngicas, de planta, de inseto, de anfíbio e de | mamífero.

Onde a célula hospedeira é uma célula de planta, o método pode compreender adicionalmente infectar a célula de planta com uma bactéria recombinante capaz de infectar a célula da planta, em que a bactéria recombinante compreende uma sequência de nucleotídeo codificando a proteína de fusão.

Em algumas outras realizações, a proteína alvo é derivada a partir de um patógeno intracelular.

Em adicionalmente algumas outras realizações, a proteína de revestimento viral de planta é derivada de uma proteína de revestimento de um vírus mosaico de alfafa e a | proteína alvo compreende uma sequência de aminoácidos | selecionada de um grupo consistindo de SEQ ID NOs: 4-11 e 49, e fragmentos antigênicos destas. ” BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS . A Figura 1 ilustra diagramaticamente a fusão de uma ] proteína de revestimento viral de planta a uma proteína alvo e auto-agregação da proteína de fusão em uma partícula do tipo vírus.

A Figura 2 mostra (A) uma construção do gene exemplar compreendendo uma proteína de fusão (construção de fusão CP) e uma sequência de sinal (PRIA); (B) clonar a construção de fusão CP no vetor de expressão pGR-D4; e (C) clonar a construção de fusão CP no vetor de expressão pBI121. RB e LB representam as bordas direita e esquerda da área introduzida em uma célula de planta através de uma Agrobactéria recombinante.

A Figura 3 mostra micro gráficos do elétron de | 20 transmissão das partículas do tipo vírus feitas de uma | proteína de fusão de uma proteína de revestimento AIMV para Plasmodium falciparum Pfs25 (painéis de cima), Pfs28 (painéis do meio), ou proteína alvo do vírus influenza HA3A (painéis 1 de baixo). As partículas do tipo vírus foram negativamente tingidas (painéis da esquerda) e marcadas com anticorpos i marcados através de immuno-gold específicos para cada | respectiva proteína alvo (painéis da direita). Bar = 100 nm | ou 200 nm conforme marcado. | As Figuras 4A e 4B mostram immunoblots das proteínas de fusão purificadas da proteína de revestimento AIMV fundida com (A) Pfs25 ou (B) HA3A.

A metade direita de cada marca foi incubada com um anticorpo contra AIMV.

A metade esquerda de cada marca foi incubada com um anticorpo monoclonal com (A) Pfs25 ou (B) HA3A. A Figura 4C é uma immunoblot de um extrato bruto das proteínas de planta contendo a proteína de revestimento AIMV fundida com a proteína alvo de hemaglutinina HAA de comprimento completo . 5 extraída sob diferentes condições para avaliar a solubilidade. A marca foi reagida com um anticorpo monoclonal o anti-HAA. TSP = proteína solúvel total; TSP-T = proteína solúvel extraída de tritão; TP = proteína total.

A Figura 5A mostra respostas anti-A/Anhui/1/05 IgG nas amostras de soros dos ratos 28 ou 56 dias após a imunização com VLPs contendo HA3A-CPF (“CPF” significa “fusão da proteína de revestimento” - “coat protein fusion”) com ou sem um adjuvante, QUIL A" ou ALHYDROGEL", ou HAAl com QUIL A". A Figura 5B mostra as respostas do anticorpo de inibição da hemaglutinação (HI - hemagglutination inhibition) dos soros nas amostras de soros dos mesmos ratos conforme na Figura 5A.

| A Figura 6 mostra concentrações de IgG nos soros coletados dos ratos 56 dias após a imunização com VLPs contendo Pfs25-CPF ou Pfs28-CPF, com ou sem um adjuvante, | QUIL A" ou ALHYDROGEL".

A Figura 7 mostra concentrações do isotipo de anti- A/Indonésia/5/05 nas amostras de soros coletadas dos ratos 35 ' dias após a imunização com HAI3-CPF ou HAIl, com ou sem . 25 ALHYDROGEL", ou somente CP.

A Figura 8 mostra as respostas do anticorpo de inibição da hemaglutinação (HI) do soro nas amostras de soros dos ratos após a imunização com HAI3-CPF VLPs ou HAIl, com ou sem ALHYDROGEL"", ou somente CP.

As Figuras 9A e 9B mostram respostas do anticorpo de inibição da hemaglutinação (HI) do soro contra A/Anhui/1/05 nas amostras de soros de ratos após uma primeira vacinação com Pfs25-CPF ou PBS, com ou sem ALHYDROGEL", e uma segunda vacinação com PBS ou HA3A-CPF VLPs, com ou sem ALHYDROGEL".

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção geralmente se refere às o 5 partículas do tipo vírus (VLPs - virus like particles) compreendendo uma proteína de fusão que é substancialmente . livre de ácido nucleico, e à métodos de uso e preparação das VLPs. O termo “partícula do tipo vírus” ou “VLP” usado aqui se refere a um cartucho viral não replicante derivado de um vírus, por exemplo, um vírus de planta conforme discutido acima. As VLPs são geralmente compostas de pelo menos uma proteína viral (por exemplo, proteína de capsídeo, de revestimento, cartucho, de superfície ou envelope), que pode formar espontaneamente após a expressão da proteína viral em uma variedade de células hospedeiras adequadas, por exemplo, células bacterianas, fúngicas, de planta, de levedura, de inseto, de anfíbio, e de mamíferos. A presença de VLPs pode ser detectada usando técnicas convencionais conhecidas na técnica (por exemplo, microscopia de elétron, dispersão de luz dinâmica, e cromatografia por exclusão de tamanho). As VLPs também podem ser isoladas usando técnicas convencionais na técnica (por “exemplo, centrifugação gradiente de ' densidade, cromatografia por exclusão de tamanho, e R 25 cromatografia de afinidade).

Os termos “proteína” e “polipeptídeo” são usados aqui intercambiavelmente, e se referen a um polímero de resíduos de aminoácidos sem limitação em relação ao comprimento mínimo do polímero. A definição inclui ambas as proteínas de comprimento completo e fragmentos destas, bem como as modificações destas (por exemplo, glicosilação, fosforilação, deleções, adições e substituições).

O termo “derivado de” usado aqui se refere à origem ou fonte, e pode incluir a ocorrência natural de moléculas recombinante, não purificadas ou purificadas.

O termo “fragmento” de uma proteína como usado aqui se refere a um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido . 5 que é a mesma em parte, mas não toda, da sequência de aminoácido da proteína.

.. O termo “variante” de uma proteína como usado aqui se refere a um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido que é a mesma que a sequência de aminoácido da proteína exceto tendo pelo menos um aminoácido modificado, por exemplo, deletado, inserido ou substituído. A variante pode ter uma sequência de aminoácido de pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99%, preferencialmente de pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência de aminoácido da proteína.

O termo “antígeno” como usado aqui se refere a uma molécula contendo um ou mais epítopos (linear e/ou conformacional) que são capazes de estimular o sistema imunológico de um indivíduo para fazer uma resposta específica de antígeno celular e/ou humoral. Uma resposta imunológica humoral se refere a uma resposta imune mediada através de anticorpos produzidos por linfócitos B, ou células B, enquanto uma resposta imunológica celular se refere a uma ' resposta imunológica mediada através de linfócito T, ou . 25 células T; e/ou outras células brancas sanguíneas. Em geral, um epítopo de célula B contém pelo menos cerca de 5 ' aminoácidos, mas pode ser 3-4 aminoácidos enquanto um epítopo de célula T inclui pelo menos cerca de 7-9 aminoácidos e um epítopo de célula T auxiliar inclui pelo menos 12-20 aminoácidos. Um antígeno pode ser derivado de uma proteína (por exemplo, uma proteína de superfície) de um organismo patogênico intracelular ou patógeno.

O termo “composição imunogênica” como usado aqui se refere a uma composição que compreende uma molécula antigênica e é capaz de extrair uma resposta específica de antígeno celular e/ou humoral em um indivíduo após a administração da composição ao indivíduo. | . 5 O termo “indivíduo” como usado aqui se refere a um ' mamífero, preferencialmente um humano. .. O termo “cerca” como usado aqui quando se referindo a um valor mensurável tal como uma quantidade, uma porcentagem, e similares, é pretendido para englobar variações de +20% Ou +10%, mais preferencialmente +5%, mais | preferencialmente +1%, e adicionalmente mais preferencialmente +0,1% do valor especificado, desta formas | as variações são apropriadas para desempenhar os métodos | revelados.

| 15 De acordo com um aspecto da presente invenção, uma partícula do tipo vírus (VLP) é fornecida. A VLP compreende uma proteína de fusão e é substancialmente livre de ácido nucleico, em que a proteína de fusão compreende uma proteína de revestimento viral de planta e uma proteína alvo. A Figura 1 demonstra esquematicamente que a fusão de uma proteína alvo com uma proteína de revestimento viral de planta em agregação de uma VLP apresentando a proteína alvo na superfície da VLP. A proteína de revestimento viral pode ser derivada ' de uma proteína de revestimento de qualquer vírus que é capaz . 25 de se auto-agregar nas partículas substancialmente livres de ácido nucleico. A proteína de revestimento viral da planta | pode ser uma proteína de revestimento de comprimento completo, ou um fragmento funcional ou variante desta. Exemplos de proteínas de revestimento viral da planta adequadas incluem proteínas derivadas de proteínas de revestimento do vírus mosaico de alfafa (AlMV-CP, CP ou CPF), vírus Y de batata (Stram, et al., Pesquisa de Vírus 28: 29- 35, 2002) e vírus mosaico de Johnsongrass (Jagadish, et al.,

J. Gen. Virol. 74: 893-896, 1993). A sequência de aminoácido de uma proteína de revestimento pode ser geneticamente modificada para melhorar a agregação da partícula ou imunogenicidade. Os aminoácidos . 5 da proteína de revestimento podem ser deletados, inseridos, ou substituídos, considerando que a variante resultante da o proteína de revestimento retém a capacidade de agregar em uma partícula na ausência de ácido nucleico quando fundida a uma proteína alvo. Um fragmento ou variante de uma proteína de revestimento em que o fragmento ou variante é capaz de se auto agregar em uma partícula que é substancialmente livre de ácido nucleico. Por exemplo, a proteína representada pela SEQ ID NO:1 não tem a primeira metionina (do códon de iniciação) da sequência AlMV-CP nativa, e a SEQ ID NO:2 é um fragmento truncado da sequência AIMV-CP que não tem os primeiros 25 aminoácidos da sequência de proteína nativa.

As proteínas alvo podem ser derivadas de qualquer . antígeno desejável ou polipeptídeo de qualquer fonte. Elas podem ter pelo menos cerca de 6, 10, 50, 100, 200, 300, ou 500 aminoácidos. As proteínas alvo preferidas são derivadas de proteínas de superfície dos organismos patogênicos intracelulares, por exemplo, organismos bacterianos, virais, fúngicos e parasíticos que são adequados para uso em vacinas. ] Exemplos de organismos virais incluem Plasmodium falciparum e . 25 vírus influenza. Os vírus influenza incluem cepas de vírus influenza A (por exemplo, HINlI, H3N2, H5N1 e H7N7) e vírus influenza B. Uma proteína alvo derivada de uma proteína de superfície pode ser a proteína de superfície de comprimento completo ou um fragmento ou variante desta. Por exemplo, a proteína alvo pode ser derivada de um polipeptídeo de superfície de célula do Plasmodium falciparumy ou um polipeptídeo de hemaglutinina de um vírus influenza. Para uso em uma vacina, os fragmentos ou variantes preferidos são aqueles que são antigênicos, isto é, capazes de induzir uma resposta imunológica protetora em um indivíduo. Os fragmentos ou variantes tem pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 Ou 15 aminoácidos em . 5 comprimento. Qualquer proteína, fragmento de proteína, Ou variante de proteína pode ser usado como uma proteína alvo, "o contanto que as partículas substancialmente livres de ácido nucleico sejam auto agregadas quando fundidas a uma proteína de revestimento viral de planta. Alguns exemplos de proteínas alvo são descritas pelas SEQ ID NOs: 4-19 e 23-49 na Listagem de Sequência. A proteína de fusão alvo pode compreender adicionalmente uma sequência de sinal para direcionar a proteína de fusão para um local particular em uma célula hospedeira (por exemplo, ER, cloroplasto) ou para direcionar a secreção extracelular da proteína de fusão. A ausência de um peptídeo de sinal resulta na translação da proteína no - citoplasma. Qualquer sequência de sinal apropriada para a célula hospedeira pode ser utilizada, ou a sequência de sinal pode ser omitida. As sequências de sinal têm sido encontradas para serem conservadas através de filos e reinos, e, em geral, quase qualquer sequência de sinal pode ser usada. Bennett e Scheller, PNAS 90: 2559-2563, 1993; Luirink e ' Sinning, Biochim. Biophys. Acta 1694: 17-35, 2005; Doudna e . 25 Batey, Ann. Rev. Biochem. 73: 539-557, 2004; Stern, et al., ' ” Tendências na Célula e Mol. Biol.2: 1-17, 2007. Em uma | realização para expressão em um tecido de planta, uma sequência de sinal preferida é a proteína relacionada a patogênese da planta 1 (PR-1) da Nicotiana tabacum (SEQ ID NO: 3).

As proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos padrões de clonagem e biologia molecular, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 1. Uma construção exemplar contendo sequências de codificação para uma proteína de revestimento viral de planta e uma proteína alvo pode ser preparada e sub clonada em um vetor de expressão (Figura 2). A proteína alvo pode ser fundida a uma proteína de . 5 revestimento viral de planta diretamente ou indiretamente (por exemplo, através de um ligante de peptídeo). Por .. exemplo, a proteína alvo pode ser fundida ao N-terminal de uma proteína de revestimento viral de planta colocando a sequência de codificação para a proteína alvo na 5' extremidade da sequência de codificação da proteína viral de planta (Figura 2). A construção da expressão pode opcionalmente incluir uma sequência de sinal para direcionar a localização ou secreção da proteína de fusão.

O vetor de expressão pode ser introduzido em um sistema de expressão adequado para expressão da proteína de fusão em uma célula hospedeira usando técnicas convencionais conhecidas na técnica (por exemplo, transfecção, transdução, infecção e - eletroporação). Qualquer sistema de expressão apropriado para uma célula hospedeira selecionada pode ser usado, incluindo plasmídeo e vetores virais.

As células hospedeiras adequadas podem incluir células bacterianas, mamíferas, de planta, fúngicas, de anfíbios e de insetos.

O uso de plasmídeo e vetores virais para expressão das proteínas de fusão nas células de planta é descrito nos Exemplos 1-3. Os organismos - 25 transgênicos também podem ser criados para produzir as proteínas de fusão.

Os vetores de expressão apropriados e métodos de produção de proteínas recombinantes nestes sistemas hospedeiros e para isolar e purificar as proteínas recombinantes são conhecidos na técnica e são descrito, por exemplo, na série “Abordagem Prática” publicada pela Oxford University Press, que inclui Expressão de Proteína, uma Abordagem Prática, S.J.

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Bowler, Eds., 2002; Técnicas de Purificação de Proteína, Uma Abordagem Prática, S. Roe, Ed., 2001; e a série “Métodos na Medicina/Biologia Molecular” publicada pela Humana Press, que incluir Plantas Transgênicas: Métodos e Protocolos, Leandro . 5 Pefiay Ed., 2004; Protocolos de Expressão da Célula de Inseto e Baculovirus, D.W. Murhammer, Ed., 2007; e Adenovírus

7. Métodos e Protocolos, Vols. 1 e 2, W.S.M. Wold e A.E.

Tollefson, Eds., 2007. A invenção também engloba um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de revestimento viral de planta e uma proteína alvo. Os polinucleotídeos podem ser obtidos através de quaisquer meios apropriados conhecidos na técnica. Por exemplo, a sequência de nucleotídeo de uma proteína alvo ou um fragmento Ou variante desta, ou sequência de nucleotídeo de uma proteína de revestimento ou um fragmento ou variante desta pode já ser conhecido ou pode ser determinado pesquisando uma - biblioteca e sequenciando uma proteína de revestimento ou | alvo potencial. Alternativamente, a sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão particular pode ser traduzida em reverso para obter sequências de nucleotídeos apropriadas e nucleotídeos correspondentes podem ser preparados sinteticamente.

i As VLPs da presente invenção são especialmente - 25 vantajosas para apresentação de antígenos. As VLPs são ' “— altamente imunogênicas. Adicionalmente, as VLPs são substancialmente livres de ácido nucleico. Por exemplo, as partículas podem parecer vazias conforme sendo visualizadas através de, por exemplo, TEM ou tingimento negativo. As partículas podem conter menos de cerca de 10%, 5%, 1% ou 0,1% preferencialmente menos de cerca de 5%, mais preferencialmente menos de 1% de ácido nucleico em peso. | Desta forma, elas fornecem vacinas seguras e eficazes contra patógenos virais, bacterianas e eucarióticos.

Uma composição imunogênica compreendendo as VLPs é fornecida. A composição imunogênica é capaz de induzir uma resposta imunológica (isto é, uma resposta celular e/ou , 5 imunológica) contra a proteína alvo em um indivíduo após a i administração da composição ao indivíduo. Em algumas .. realizações, a proteína alvo é derivada de um patógeno intracelular, e a composição imunogênica é capaz de extrair uma resposta imunológica protetora ao patógeno em um indivíduo após a administração da composição ao indivíduo.

A composição imunogênica pode ser formulada como composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de VLPs, um transportador aceitável farmaceuticamente, diluente, e/ou excipiente. Uma “quantidade eficaz” se refere a uma quantidade de VLPs necessárias para exibir um efeito imunopotenciador detectável. A quantidade eficaz dependerá da i rotina de administração, a natureza da formulação, e a - condição do indivíduo. Um faixa adequada da “quantidade eficaz" pode ser de cerca de 0,001 a cerca de 100 ug de ' 20 partículas do tipo vírus (ou partículas de proteína de fusão) por kg do peso do corpo do indivíduo. Transportadores adequados, diluentes, e excipientes são conhecidos na técnica e incluem, entre outros, salina, salina tamponada, manitol Ú L-histidina, polissorbato 80, dextrose, água, glicerol, . 25 etanol, e combinações destes. A composição pode conter ' opcionalmente um adjuvante. Os adjuvantes apropriados incluem sais de alumínio (por exemplo, Alhydrogel"), emulsões de água e óleo, e adjuvantes com base em saponina (Quil A"). A composição imunogênica pode ser formulada para administração oral, anal, transdérmica, nasal, de mucosa ou parenteral. A administração parenteral inclui injeção subcutânea, intramuscular, intraperitoneal e intravenosa. Um método para induzir uma resposta imunológica protetora contra um primeiro patógeno intracelular em um indivíduo também é fornecido. O método compreende administrar ao indivíduo uma primeira composição imunogênica compreendendo uma primeira partícula do tipo vírus, em que a . 5 primeira partícula do tipo vírus compreende uma primeira | proteína de fusão e é substancialmente livre de ácido "a. nucleico, e em que a primeira proteína de fusão compreende uma proteína de revestimento viral de planta e uma primeira proteína alvo derivado do primeiro patógeno intracelular. A composição pode compreender adicionalmente um adjuvante.

O método pode compreender adicionalmente, antes da administração da primeira composição imunogênica, administrar ao indivíduo uma segunda composição imunogênica compreendendo uma segunda partícula do tipo vírus, em que a segunda partícula do tipo vírus compreende uma segunda proteína de fusão e é substancialmente livre de ácido nucleico, e em que a segunda proteína de fusão compreende a proteína de 7 revestimento viral de planta e uma segunda proteína alvo. A segunda proteína alvo pode ser derivada de um segundo patógeno intracelular que não é o primeiro patógeno intracelular. Em algumas realizações, o patógeno intracelular alvo é uma cepa de um vírus influenza enquanto a segunda proteína alvo é derivada de um patógeno intracelular diferente (por exemplo, um parasita de malária, Plasmodium .- 25 falciparumo ou uma cepa diferente do vírus influenza. Por exemplo, o patógeno alvo é um vírus influenza, a proteína de revestimento viral de planta é derivada de uma proteína de revestimento de um vírus mosaico de alfafa, a primeira proteína alvo compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ . 30 ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 Ou 11, e a segunda proteína alvo compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, 5 ou

49. Um método de produzir VLP em uma célula hospedeira é adicionalmente fornecido.

O método compreende expressar uma proteína de fusão, que compreende uma proteína de revestimento viral de planta e uma proteína alvo, em uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de nucleotídeo . 5 codificando a proteína de fusão sob condições que permitam a agregação da partícula do tipo vírus (VLP) na célula . hospedeira.

Por exemplo, a VLP pode ser agregada em um tecido de planta cerca de 3-7 dias após a planta ser infiltrada com um vetor de expressão contendo a construção de fusão correspondente.

A VLP compreende a proteína de fusão e é substancialmente livre de ácido nucleico.

O método pode compreender "adicionalmente purificar a VLP da célula hospedeira.

Células hospedeiras adequadas incluem células bacterianas, fúngicas, de plantas, de anfíbios e de mamíferos.

A sequência de nucleotídeo codificando a proteína de fusão pode ou não pode ser integrada no genoma da célula i hospedeira.

Onde a célula hospedeira é uma célula de planta, - o método pode compreender adicionalmente infetar a célula de planta com uma bactéria recombinante capaz de infectar a célula de planta (por exemplo, cepa de tumefaciens GV3101 e : outras cepas de A. tumefaciens, e cepas de A. rhizogens), em que a bactéria recombinante compreende uma sequência de nucleotídeo codificando a proteína de fusão.

A preparação e teste das proteínas de fusão - 25 exemplares compreendendo proteínas alvo derivadas de um parasita de malária, Plasmodium falciparum, e vírus influenza A/Anhui/1/2005(H5N1), e um vírus influenza A/Indonésia/5/2005(H5N1) são descritos nos exemplos abaixo.

Quando estas proteínas alvo foram fundidas com a proteína de revestimento AIMV, as proteínas de fusão resultantes se agregaram nas VLPs aparentemente vazias.

Estas partículas ligaram anticorpos específicos ao AIMV e específicos às proteínas alvo.

Os soros de ratos imunizados com as VLPs contendo as proteínas alvo de malária produziram altas concentrações de anticorpos ligantes de parasitas e eram capazes de prevenir a transmissão do parasita em mosquitos (Tabelas 2 e 3). Os ratos imunizados com VLPs contendo as . 5 proteínas de influenza produzidas níveis preventivos de concentrações de anticorpos conforme descrito nos Exemplos 4 .-. e 8, e mostrados nas Figuras 5, 7 e 8. A imunidade preexistente contra uma proteína de revestimento viral de planta não interfere com os níveis preventivos das concentrações de anticorpos nos ratos imunizados com VLPs contendo a mesma proteína de revestimento viral conforme descrito no Exemplo 9 e mostrado na Figura 9. Exemplo 1. Construção de um vetor heterólogo para a expressão das proteínas de fusão AlMV-CP

Os genes alvo incluídos nas proteínas de superfície da célula específicas para diferentes estágios sexuais do parasita da malária, P. falciparum, (Pfs25 (SEQ ID NO:4), . Pfs28 (SEQ ID NO:5) e Pfs230 (SEQ ID NO: 49)), o domínio globular da hemaglutinina (HA) da cepa Anhui do vírus influenza (HA3A (SEQ ID NO:6)), o domínio globular da HA das cepas Califórnia do vírus influenza (HA3CO4 (SEQ ID NO0:7) e HA3CO6 (SEQ ID NO:8)), o domínio globular da HA das cepas Indonésia do vírus influenza (HA3I (SEQ ID NO:11)), HA de ] comprimento completo da cepa Anhui (HAA ou HAAl (SEQ ID . 25 NO:9)), e HA de comprimento completo da cepa Indonésia (HAI ou HAI1 (SEQ ID NO:10)). Cada gene alvo foi clonado, usando métodos padrões da biologia molecular, como uma fusão N- terminal para a proteína de revestimento AIlMV (AlMV-CP, CO ou CPF) ou a proteína de revestimento AIMV otimizada (CPO), que é codificada através de uma sequência de codificação otimizada para expressar nas plantas, em um vetor de transporte com enzimas de restrição BsmBI e PacI.

A Figura 2 mostra uma estrutura exemplar das construções de proteína de fusão. As sequências foram verificadas através de sequenciamento automatizado. Cada sequência CP alvo foi então clonada em um vetor de expressão, que codifica opcionalmente o peptídeo . 5 sinal da proteína relacionada à patogênese da planta 1 (PR-1) (SEQ ID NO:3). Especificamente a sequência foi sub clonada -. nos locais BamHI-SacI de pBI121 (Clontech), ou nos locais PacI-XhoI de pGRD4 (descritos em Shoji, et al., Vacina 27: 108701092, 2009). A estratégia de clonagem é mostrada na Figura 2.

Exemplo 2. Infiltração de plantas com vetores de expressão contendo construções de fusão Os vetores de expressão produzidos no Exemplo 1 foram então introduzidos na cepa da Agrobacterium tumefaciens GV3101 e as bactérias resultantes foram cultivadas durante a noite no meio mínimo. A densidade óptica das culturas era determinada e a cepa de expressão da proteína foi misturada com uma de cepa de Agrobactéria expressando a supressão de silenciamento da proteína, pl9, em uma proporção 4:1 para uma O.D. final de 0,5. A solução de Agrobactéria foi introduzida através de infiltração manual nas partes aéreas de 6 semanas, plantas Nicotiana benthamiana , cultivadas em solo conforme descrito previamente (Green, et al., Biotechnol. J. 4: 1-8, ' 2009).

. 25 As amostras de tecidos de plantas foram retiradas em 3-7 dias após a infiltração para determinação dos níveis de expressão e solubilidade da proteína de fusão. As amostras foram pesadas e extraídas em três volumes do tamponamento de extração (100mMM Na2HPO4, pH 7,1; 2,5mM EDTA, pH 8,0) para proteína solúvel total, tamponamento de extração mais 0,5% Triton-X 100 para a proteína Triton solúvel total, ou tamponamento de carregamento de gel para proteína total. As proteínas foram resolvidas em 10% de géis SDS-PAGE e transferidas para membranas PVDF.

Os níveis da proteína de fusão foram avaliados através da análise de immunoblots com anticorpo policlonal de coelho anti-AlIMV comparado com um padrão AIlMV ou com um anticorpo específico alvo e padrão apropriado.

Uma immunoblot representativa é mostrada na Figura 4C.

Os dias de pico dos perfis de solubilidade e .. expressão foram determinados.

As construções de interesse foram infiltradas à vácuo em uma maior escala na N. betamiana cultivada hidroponicamente para expressão das proteínas de fusão.

Exemplo 3. Isolamento e purificação das partículas do tipo vírus No dia da expressão máxima, as folhas foram colhidas e homogeneizadas em um liquidificador em três volumes de tamponamento da extração com base em fosfato com 0,5% de Triton X-100. O homogenato foi agitado por 30 minutos em 4ºC, então centrifugado por 30 minutos em 5.000 x g.

O + sobrenadante foi filtrado através de miracloth e centrifugado em 15.000 x g por 1 a 1,5 horas.

O sobrenadante foi precipitado com PEG e então centrifugado novamente por 30 minutos em 15.000 x g.

O aglomerado foi resuspenso em um tamponamento com base em fosfato e congelado em -20ºC.

Após O descongelamento, a suspensão foi centrifugada por 30 minutos em 30.000 x g.

As alíquotas do sobrenadante foram analisadas . 25 através de SDS-PAGE para estimar a concentração de proteína.

O sobrenadante foi centrifugado por 2h em 60.000 x g em um rotor Ti70. O aglomerado foi resuspenso no tamponamento com base em fosfato.

O sobrenadante resultante foi analisado através de SDS-PAGE e tingimento azul Coomassie.

A concentração de proteína foi determinada colorimetricamente através da comparação com os padrões BSA.

As partículas purificadas foram visualizadas através de TEM e tingimento negativo (Figura 3). As partículas parecem estar vazias e substancialmente livres de ácido nucleico. A marcação imuno-gold com os anticorpos específicos alvo confirmaram a presença da proteína alvo na superfície das partículas. As partículas purificadas foram armazenadas em uma solução tamponada de 10mM Na2HPO4, pH 7,1; I1mMM EDTA, pH 8,0, em -80"ºC.

-. As proteínas purificadas foram submetidas à immunoblot conforme descrito no Exemplo 3. Nas immunoblots tendo partículas purificadas, a proteína de fusão foi reconhecida através de ambos o anticorpo específico alvo e através do anticorpo específico AlMV, que liga a proteína de revestimento. (Figura 4A e 4B).

Os resultados das proteínas de fusão produzidas nas folhas estão sumarizados na Tabela 1. As quantidades de purificação e expressão foram suficientemente altas para permitir testar a imunogenicidade nos ratos.

Tabela 1. Expressão de proteína a partir das - construções de fusão infiltradas nas folhas de plantas Tamanho | Expres- Alvo da são da Construção SEQ Proteína alvo proteína Prote- de Fusão ID alvo nos ína No. amino- Total ácidos | (mg/kg) . PpGR-D4-PR- Proteína do estágio sexual P. falciparum, 171 130 Pfs25-CPF | Pfs25 | z : . pBI-PR- Proteína do estágio sexual P. falciparum, 171 174 Pfs25-CPF Pfs25 Proteína do estágio DOR-DE 5 sexual P. falciparum, 175 101 Pfs28-CPF Pfs28 | Proteína do estágio PGR-D4-PR 5 sexual P. falciparum, 175 79 Pfs28-CPF Pfs28 pBI-PR- Proteína do estágio 5 sexual P. falciparum, 175 100 Pfs28-CPF Pfs28 pBI-PR- Domínio globular da HA3A-CPF hemaglutinina 233 75 A/Anhui/1/2005 (H5N1) PGR-D4-PR- Domínio globular da HA3A-CPF hemaglutinina 233 A/Anhui/1/2005 (H5N1) . PGR-D4-PR- Domínio globular da HA3C04-CPF 7 hemaglutinina 234 14 A/Califórnia/04/2009 (HI1N1) .. PGR-D4-PR- Domínio globular da HA3CO6-CPF hemaglutinina 234 17 A/Califórnia/06/2009 (HI1N1) pGR-D4-PR- Hemaglutinina 515 HAA-CPF A/Anhui/1/2005 (HSN1) PGR-D4-PR- Domínio globular da HA3T-CPF 11 hemaglutinina 233 A/Indonésia/5/2005 (H5N1) PpGR-D4-PR- 11 Hemaglutinina, 233 24 HA3I-CPO A/Indonésia/5/05(HSN1) Proteína do estágio PrraN C66 sexual P. falciparum, 23 Pfs230 Exemplo 4. Imunização dos ratos com partículas do ' tipo vírus : Grupos de seis ratos Balb/c com 6-8 semanas foram imunizados subcultaneamente nos dias de estudo 0 e 28 com l0pugde partículas do tipo vírus contendo Pfs25-CPF ou Pfs28- | CPF ou lug de partículas do tipo vírus contendo HA3A-CPF.

A vacina foi preparada exatamente antes do uso.

As alíquotas de partículas do tipo vírus purificadas (ou partículas de ' proteína de fusão) foram descongeladas no tamponamento e . 10 injetadas com ou sem um adjuvante.

A vacina foi injetada no PBS sozinho ou na presença ou de QUIL A" (adjuvante com base em saponina, Brenntag Biosector, Frederikssund Denmark) ou ALHYDROGEL" (adjuvante com base em hidróxido de alumínio, Brenntag Biosector, Frederikssund Denmark) como um adjuvante. | 15 O HA solúvel de comprimento completo da cepa Anhui do vírus influenza (HAAl) também foi injetado com QUIL A" como um controle positivo.

As amostras de soro foram coletadas no dia de estudo 56 e analisadas para respostas IgG específico antigênicos através de ELISA. No teste, as placas foram revestidas com 1 ug/ml das seguintes proteínas Pfs25 ou Pfs28 recombinante produzidas em Pichia pastoris, ou revestidas com A/Anhui/1/2005 vírus recombinante obtidos de CDC em uma diluição 1:128. As amostras de soro foram banhadas em ” diluições 4-fold na placa. As concentrações do ponto final de . IgG foram determinadas como a diluição na qual os valores OD correspondentes são quatro vezes maiores que oO valor em branco. Os resultados demonstraram que as altas concentrações de anticorpo (>10.000) foram extraídas pelo Pfs25-CPF e Pfs28-CPF no Dia 56 com ou sem um adjuvante (Figura 6). O HA3A-CPF também extraiu concentrações de anticorpo específico de antígeno na presença ou ausência de um adjuvante (Figura 5A). Para testar a funcionalidade dos anticorpos extraídos pela vacina HA3A-CPF, os testes de inibição da ' hemaglutinina (HI) foram desempenhados conforme descrito por . Yoko et al. (Vacina 27: 3467-3470, 2009). Os resultados mostraram que todos os ratos imunizados com HA3A-CPF em PBS ou QUIL A" tiveram uma concentração de HI > 1:40, um nível considerado preventivo em humanos (Figura 5B). Quatro de cinco animais imunizados com vacina HA3A-CPF adsorvidos com ALHYDROGEL" tiveram uma concentração de HI > 1:40. Com base É nestes resultados, o HA3A-CPF parece ser um candidato viável .- 25 para uma vacina influenza pandêmica que pode ser administrada na ausência de um adjuvante.

A eficácia dos anticorpos extraídos pelas vacinas de Pfs25-CPF e Pfs28-CPF foram avaliados usando um grupo diferente de testes. As concentrações de IgG conforme determinadas pelo ELISA no soro coletado no dia 56 são mostradas na Figura 6. Adicionalmente, estas amostras de soro foram enviadas para a Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda, para avaliar a presença de anticorpos ligando gametócitos.

O teste inicial do soro foi feito usando um teste de imunofluorescência (IFA- immunofluorescence assay) nos gametócitos fixos em que uma concentração de parasita ligando os anticorpos em cada amostra de soro foi determinado (Tabela 2);. Os soros positivos do teste IFA foram então testados em um teste IFA de suspensão (SIFA- suspension IFA .. assay) usando os gametócitos vivos em uma diluição de soros de 1:50 e 1:250. Os resultados do SIFA são mostrados na Tabela 2. Tabela 2. Eficácia das Vacinas de Fusão CP de Malária : IFA SIFA Vacina Adjuvante Dose (Concentração (Concentração did: Candidata (pg) Ab) Ab) Muito Pfs25-CPF Quil A 10 Positivo (6400) Positivo . (250) Muito s Pfs25-CPF | Alhydrogel | 10 Positivo (6400) Positivo (250) Muito Pfs25-CPF 10 Positivo (800) Positivo (250) Os soros foram então testados para a presença de anticorpos de bloqueio de transmissão em um teste de . alimentação da membrana padrão (SMFA- standard membrane feeding assay). O teste SMFA é o padrão de ouro para medição " da atividade de bloqueio de transmissão na área teste.

O bioteste simula a situação de infecção natural, e é, portanto considerado a ser um teste valioso para medir a transmissão entre homem e mosquito.

Este teste permite o desenvolvimento da vacina de bloqueio de transmissão (TBV) proceder com uma certeza que não está disponível para a maioria das outras vacinas de malária.

Resumidamente, os mosquitos Anopheles stephensi criados em laboratório são permitidos a ter uma refeição de sangue dos dispositivos cobertos por membranas que contém soro dos ratos imunizados acima combinado suspensões de célula vermelha sanguínea e complemento infectadas com gametócitos P. falciparum. Após uma semana, O número de mosquitos infectados (%InfMosq), bem como o número de oocistos desenvolvidos por mosquito é determinado. A .. atividade de redução de transmissão é determinada comparando os números de oocisto nos mosquitos que são alimentados com soro (pré-imune) de teste versus controle. Estes resultados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3. Teste de Alimentação da Membrana Padrão

Exemplo 5. Preparação das construções da proteína de fusão de adenovírus para transfecção de células de mamíferos.

Para expressão das partículas livres de vírus (ou partículas de proteína de fusão) compostas de proteínas de fusão AIMV-CP em um sistema de mamífero, as técnicas PCR foram usadas para fundir o peptídeo de sinal luciferase - Gaussia à HA3A-CPF e HA3CO4-CPF (domínio globular (3) de A do Anhui (SEQ ID NO:6) e Califórnia 04 (SEQ ID NO:7), respectivamente). As substâncias de encaminhamento (SEQ ID NO:20 e 21) contém a sequência de integração TOPO (CACC) e à sequência de ácido nucleico codificando o peptídeo de sinal de luciferase e o início da proteína alvo. A substância reversa foi específica ao terminal AlIMV-CP 3' (SEQ ID NO: . 25 22). Os amplicons resultantes foram clonados em um vetor pENTR-D-TOPO de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen Corporation). As sequências foram confirmadas através de sequenciamento automático. Após a verificação de sequência, os genes alvo foram recombinados no vetor pAd/CMV/V5-DEST usando a tecnologia Gateway da Invitrogen Corporation de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 6. Preparação do adenovírus contendo um gene da proteína de fusão

O plasmídeo purificado pAd-HA3A-CPF ou pAd-HA3C04- CPF foi digerido com Pacl para expor as repetições terminais invertidas virais (ITRsS). A pAd-HA3A-CPF ou pAd-HA3C04-CPF digerida foi transfectada na linha da célula 293, que contém . 5 uma cópia integrada do El do adenovírus, usando um reagente de transfecção com base lipídica catiônica. Quando os efeitos .. citopáticos do vírus foram observados nas células ' transfectadas (10-14 dias após a transfecção), as células e | meio contendo adenovírus foram colhidos. As células colhidas e o meio de cultura contendo adenovírus foram submetidos a duas rodadas de congelamento e descongelamento (em -80ºC por 30 minutos e então em 37ºC por 15 minutos) para lisar as células e permitir a liberação das partículas virais intracelulares. Após o segundo ciclo de congelamento/descongelamento, o lisado celular foi centrifugado e o sobrenadante contendo partículas virais foi colhido e armazenado em -80ºC. . Exemplo 7. Método para transdução da construção de adenovírus com sequências HA3A-CPF ou HA3CO04-CPF e produção das partículas livres de vírus Isto é um exemplo profético. O adenovírus colhido do Exemplo 6 contendo o gene HA3A-CPF ou HA3CO04-CPF será amplificado infectando 293 células, então novamente colhido e ' armazenado conforme descrito acima para fazer um estoque . 25 adenoviral. O estoque adenoviral será concentrado usando um teste de placa.

Considerando que as construções adenovirais paAd- HA3A-CPF e pAd-HA3CO04-CPF são replicações incompetentes e não integram no genoma hospedeiro, nenhum vírus progênie será produzido após sua transdução nas células de mamíferos. As células hospedeiras serão células de rim canino Madin-Darby (MDCK). As células MDCK serão adaptadas para cultivo em meio livre de soro para evita a possibilidade da contaminação do produto do animal na preparação final. As células MDCK serão transduzidas com adenovírus contendo sequências HA3A-CPF ou HA3CO4-CPF para determinar uma multiplicidade adequada de infecção. Dois ou três dias após a transdução, a expressão de . 5 HA3A-CPF ou HA3CO4-CPF será analisada através de microscopia de fluorescência usando anticorpo anti-HA e anti-AlMV .. seguidor por IgG anti-rato conjugados por FITC. Alternativamente, o sobrenadante da cultura celular será coletado e concentrado para immunoblot e detecção das proteínas de fusão.

Para obter uma plataforma de produção de célula de mamífero escalável para células HA3A-CPF ou HA3CO4-CPF, MDCK serão cultivadas em suspensão usando um sistema micro transportador com base no dextran ligado por cruzamento, por exemplo, CYTODEX" 1 da GE Healthcare. Após a transdução da construção de adenovírus, as células MDCK serão incubadas com micro-transportadores e cultivadas em frascos giratórios.

“ Após dois a três dias, amostras dos sobrenadantes de células serão coletadas em uma base diária e os níveis de expressão serão analisados através de immunoblot usando um anticorpo monoclonal anti-HA específico alvo.

Quando a presença das proteínas de fusão é confirmada, o meio de cultivo da MDCK será coletado e centrifugado. As proteínas de fusão serão purificadas a . 25 partir de sobrenadante usando os procedimentos escritos no Exemplo 3, começando com a precipitação PEG.

Exemplo 8. Imunização dos ratos com partículas do tipo vírus contendo domínio globular da fusão H5 HA ! (A/Indonésia/5/2005) AMV CP Grupos de seis ratos Balb/c com 6-8 semanas foram imunizados subcultaneamente nos dias de estudo O e 21 com 5 ug das partículas do tipo vírus (VLPs) contendo domínio globular de fusão H5 HA (A/Indonésia/5/2005)

A/Indonésia/5/2005 (HA3I-CPF). O HA solúvel de comprimento completo da cepa Indonésia do vírus influenza (HAIl) também foi injetado com ou sem ALHYDROGEL" como comparadores.

Somente CP foi incluído como um controle negativo.

A vacina . 5 só foi preparada antes do uso.

As alíquotas das partículas do ] tipo vírus purificadas (ou partículas de proteína de fusão) .. foram descongeladas em tamponamento e injetadas com ou sem um adjuvante, ALHYDROGEL". As amostras de soro foram coletadas no dia de estudo 35 e analisadas por respostas do isótopo IgG específico por antígeno.

No teste, as placas foram revestidas com vírus recombinantes A/Indonésia/5/2005 desativado obtido do CDC em uma diluição 1:128. As amostras de soro foram banhadas com diluições seriais 4-fold na placa.

As concentrações do ponto final de IgG1, IgG2a e IgG2b foram determinadas como a diluição na qual os valores OD correspondentes são três vezes maiores que oO valor de controle negativo.

Os resultados demonstraram que partículas . do tipo vírus contendo resposta IgG2a mais forte induzida HA3I-CPF na presença ou ausência de ALHYDROGEL" que a subunidade solúvel sozinha (HAI1l) na presença ou ausência de ALHYDROGEL" (Figura 7) sugerindo o desvio Thl da resposta imunológica às VLPs.

Como os ratos infectados com influenza tem mostrado gerar respostas imunológicas Thl, VLPs com base ' em domínio globular AMV do influenza HA produzido de plantas

. 25 são melhores candidatos à vacina que a subunidade solúvel. o Para testar a funcionalidade dos anticorpos extraídos pela vacina HA3I-CPF, os testes de inibição de | hemaglutinina (HI) foram desempenhados conforme descrito em Yoko et al. (Vacina 27: 3467-3470, 2009). Os resultados | 30 mostraram que 80% dos ratos 35 após serem imunizados com HA3I-CPF na ausência de ALHYDROGEL" tiveram uma concentração | HI > 1:40, que é significativamente mais alta que os ratos imunizados com HAIl (p = 0,003) (Figura 8), indicando que

HA3I-CPF é uma melhor candidata a vacina influenza que a subunidade solúvel para administração sem um adjuvante.

Exemplo 9. Efeitos da imunidade preexistente contra CP nas respostas do anticorpo do soro em ratos Grupos de seis ratos Balb/c com 6-8 semanas foram 7 imunizados subcultaneamente (SC) ou intramuscularmente (IM) . com PBS ou 10 ug das partículas do tipo vírus (VLPs) contendo Pfs25-CPF nos dias de estudo 0 e 28 com ou sem um adjuvante, ALHYDROGEL" (alum), e subsequentemente com PBS ou 1 ug de VLPs contendo domínio globular de fusão H5 HA (A/Anhui/1/2005) AMV CP (HA3I-CF) através da mesma rotina de administração nos dias de estudo 140 e 168 com ou sem ALHYDROGEL" (Alum). A vacina foi preparada somente antes do uso.

As alíquotas das partículas do tipo vírus purificadas (ou partículas de proteína de fusão) foram descongeladas e ] injetadas com ou sem um adjuvante, ALHYDROGEL". As amostras . de soro foram coletadas antes do estudo (pré-coleta) e nos dias de estudos 28, 56, 112, 140, 168 e 216, e analisadas para respostas IgG específicas de antígeno através do ELISA.

No teste, as placas foram revestidas com 2 pg/ml AIMV, e 1 ug/ml de Pfs25 recombinante produzido em Pichia pastoris, ou vírus recombinante A/Anhui/1/2005 obtido a partir de CDC em ' uma diluição de 1:128. As amostras de soro foram banhadas nas . 25 diluições 4-fold nas placas.

As concentrações de ponto final foram determinadas como a diluição na qual os valores OD correspondentes quatro vezes maiores que O valor em branco.

Duas imunizações com Pfs25-CPF, ou com ou sem um adjuvante, extraído com altas concentrações de anticorpo IgG (>10.000) contra AIMV (CP) e estas concentrações foram mantidas ao longo do curso do estudo.

Após as imunizações com HA3A-CPF, Ou com ou sem um adjuvante, as concentrações de IgG contra AIMV (CP) no grupo pré-imunizado com Pfs25-CPF aumentaram levemente enquanto as concentrações de IgG nos grupos — pré-imunizados com PBS alcançaram OS níveis equivalentes àqueles nos grupos pré-imunizados com Pfs25-CPF. Duas imunizações com Pfs25-CPF, ou com ou sem um . 5 adjuvante, extraiu altas concentrações de anticorpos IgG i anti-Pfs25 (>10.000), que foram mantidas e não mudaram .. significativamente após as imunizações com Pfs25-CPF. Duas imunizações com Pfs25-CPF, através ou da rotina SC ou IM, extraiu respostas anti-A/Anhui/1/2005 IgG significantes no soro de todos os grupos exceto os grupos pré-imunizados com PBS nos quais as concentrações foram um ou dois cortes mais baixos que aqueles nos outros grupos (>10.000).

Para testar a funcionalidade dos anticorpos extraídos pela vacina HA3A-CPF, os testes de inibição da hemaglutinação (HI) foram desempenhados conforme descrito em Í Yoko et al. (Vacina 27: 3467-3470, 2009). Os resultados . mostraram que duas imunizações com respostas do anticorpo HI do soro induzido HA3A-CPF em todos os grupos exceto para grupo de controle negativo (PBS/PBS) (Figuras 9A e 9B). Sem um adjuvante, diferenças significantes nas concentrações de HI entre os grupos pré-imunizados com Pfs25-CPF e PBS, ou através de rotinas SC (p = 0,01) ou IM (p = 0,08), foram : observadas. Com um adjuvante, não houveram diferenças . 25 significantes observadas entre os grupos pré-imunizados com PfsS25-CPF e PBS via SC (p = 0,5) ou IM (p = 0,6). Com base nestes resultados, sem ALHYDROGEL"" como um adjuvante, a pré- imunização com VLPs contendo uma proteína de fusão de uma proteína de revestimento viral de planta e uma primeira proteína alvo não interferem com as respostas do anticorpo HI do soro para uma segunda proteína alvo nos ratos imunizados com VLPs contendo uma proteína de fusão da mesma proteína de revestimento viral de planta e a segunda proteína alvo,

através das rotinas SC ou IM.

Apesar de a invenção ser ilustrada e descrita aqui com referência às realizações específicas, a invenção não é pretendida a ser limitada aos detalhes mostrados.

Ao invés disso, diversas modificações podem ser feitas nos detalhes 7 dentro do escopo e faixa de equivalentes das reivindicações e

.. sem se afastar da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, caracterizada por compreender uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende uma proteína de revestimento viral da planta e uma ' 5 proteína alvo, e em que a proteína de revestimento viral da planta é derivada de uma proteína de revestimento de um vírus ". de planta selecionado do grupo que consiste em vírus mosaico de alfafa, vírus mosaico Johnsongrass, e vírus Y de batata.

2. PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada em que a proteína alvo é derivada de um polipeptídeo de superfície de célula de um patógeno intracelular.

3. PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada em que a proteína alvo é derivada de um polipeptídeo de superfície de célula do Plasmodium falciparum. :

4. PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, de acordo com - qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada em que a proteína alvo é derivada de um polipeptídeo de hemaglutinina de um vírus influenza.

5. PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada em que O vírus influenza é um vírus influenza A selecionado de um grupo que consiste em ' HIN1l, H3N2, HSN1 e H7N7.

. 25 6. PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada em que o vírus influenza é um vírus influenza B.

Ts PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada em que a proteína alvo compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4-11 e 49, e fragmentos antigênicos desta.

8. PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada em que a proteína alvo é fundida ao N-terminal da proteína de revestimento viral de planta.

9. PARTÍCULA DO TIPO VÍRUS, de acordo com | . 5 qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada em que a | ' partícula do tipo vírus é produzida em uma célula hospedeira ! e. do grupo que consiste em células bacterianas, fúngicas, de planta, de inseto, de anfíbio e de mamífero. |

10. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada por | 10 compreender uma partícula do tipo vírus, em que a partícula | do tipo vírus compreende uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende uma proteína de revestimento viral de planta e uma proteína alvo, e em que a proteína de revestimento viral de planta é derivada de uma proteína de revestimento selecionada do grupo que consiste em vírus mosaico de alfafa, vírus mosaico Johnsongrass, e vírus Y de batata. .

11. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender adicionalmente um adjuvante.

12. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada em que o adjuvante selecionado de um grupo que consiste em sais de alumínio, emulsões de água e óleo, e adjuvantes com base em saponina. . 25

13. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, de acordo com a - reivindicação 10, caracterizada em que a proteína de revestimento viral de planta é derivada de uma proteína de revestimento de um vírus mosaico de alfafa e a proteína alvo compreende uma sequência de aminoácido selecionada de um grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4-11 e 49, e fragmentos antigênicos desta.

14. MEDICAMENTO, caracterizado por compreender uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição compreendendo uma partícula do tipo vírus útil para a indução de uma resposta imunológica protetora contra um patógeno intracelular em um indivíduo, em que a partícula do tipo vírus compreende uma proteína de fusão em que a proteína de fusão compreende uma proteína de revestimento viral de planta 7 e uma proteína alvo derivada do patógeno intracelular, e em e que a proteína de revestimento viral de planta é derivada de uma proteína de revestimento de um vírus de planta selecionado de um grupo que consiste em vírus mosaico alfafa, vírus mosaico de Johnsongrass, e vírus Y da batata.

15. MEDICAMENTO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado em que a proteína de revestimento viral de | planta é derivada de uma proteína de revestimento de um vírus mosaico de alfafa e a proteína alvo compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 4-11 e 49, e fragmentos antigênicos destas.