MX2008000890A

MX2008000890A - Vacunas de influenza (flu) recombinantes.

Info

Publication number: MX2008000890A
Application number: MX2008000890A
Authority: MX
Inventors: Lada Rasochova; Jason M Radam; Jamie P Phelps; Nghiep Dang
Original assignee: Dow Global Technologies Inc
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2008-03-18
Also published as: CN101227920A; WO2007011904A2; BRPI0613625A2; JP2009502789A; AU2006270065A1; WO2007011904A3; EP1909829A4; EP1909829A2; CA2615658A1; US20090117144A1; KR20080028941A

Abstract

La presente invencion proporciona composiciones para el uso como vacunas contra el virus de la influenza, y metodos rapidos para producir tales composiciones. La composicion incluye i) por lo menos un peptido derivado de un virus de la influenza, en donde el peptido se fusiona a una proteina de capsida derivada de un virus de planta que forma un peptido de fusion de capsida recombinante e ii) por lo menos una proteina antigenicas aislada o fragmento de proteina derivado de un virus de la influenza humana o aviar. La proteina antigenica aislada o fragmento de proteina derivado del virus de la influenza humana o aviar se puede conjugar con la superficie del peptido de fusion de capsida recombinante.

Description

VACUNAS DE INFLUENZA (FLU) RECOMBINANTES Campo de la Invención La presente invención se dirige a la producción e integración de las vacunas multivalentes del virus de la influenza utilizando las proteínas de la influenza antigénicas aisladas o fragmentos de proteína derivados de los virus de la influenza humana y/o aviar combinados con un adyuvante que comprende un portador de partícula similar al virus quimérico, que contiene una proteína cápsida viral derivada de una célula eucariótica o procariótica fusionada de manera genética a los péptidos antigénicos del virus de la influenza humana y/o aviar. La presente invención también se dirige a los péptidos antigénicos de novedad, y a composiciones que contienen tales péptidos, derivados de las proteínas de la influenza. Antecedentes de la Invención El desarrollo de las vacunas es una de las maneras más efectivas y eficientes para proteger a animales y humanos contra infecciones por agentes patógenos. En general, las vacunas son diseñadas para proporcionar inmunidad protectora contra un agente patógeno produciendo una inmunorespuesta del hospedador a las proteínas antigénicas, péptidos u otras estructuras inmunogenéticas contenidas en la vacuna, así se reduce el potencial de una infección eficaz durante la exposición del hospedador al agente patógeno.

El virus de la influenza, es un miembro de la familia Orthomyxoviridae, e incluye tres subtipos clasificados por sus proteínas base, designadas como influenza A, influenza B, e Influenza C. Los virus de la influenza A infectan una gama de especies mamíferas y aviares, mientras que los tipos B y C esencialmente se limitan a la infección humana. Los virus de la influenza A son generalmente responsables de epidemias anuales y pandemias ocasionales, mientras que los virus de la influenza B causan brotes cada 2-4 años, pero no se asocian generalmente a las pandemias. Las cepas de virus se clasifican de acuerdo al origine de la especie hospedadora, sitio geográfico, año de aislamiento, número de serie, y, para la influenza A, por propiedades serológicas de los subtipos de hemaglutinina y neuraminidasa. El virus de la influenza es un virus de ARN dividido en sentido negativo segmentado esencialmente integrado por nueve proteínas: matriz (M1); canal de protón-ión (M2); hemaglutinina (HA, por sus siglas en ingles), neuraminidasa (NA, por sus siglas en inglés); nucleoproteína (NP, por sus siglas en inglés); proteína básica de polimerasa 1 (PB1, por sus singlas en inglés); proteína básica de polimerasa 2 (PB2, por sus siglas en inglés); proteína acida de polimerasa (PA, por sus siglas en inglés); y la proteína no estructural 2 (NP2, por sus siglas en inglés). La proteínas HA, NA, M 1 , y M2 son proteínas asociadas a la membrana, las proteínas HA y NA son las glicoproteínas responsables de la unión y el ingreso viral a la célula hospedadora, respectivamente. Quince clases de antígenos de hemaglutinina, clasificados como H1-H15, y 9 clases de antígenos de neuraminidasa, clasificados como N1-N9, se han identificado en el virus de la influenza A. La proteína HA inicializa la unión viral a la célula uniéndose a un receptor superficial de la célula hospedadora que contiene ácido siálico. La hemaglutinina de los virus de influenza humanos se une con preferencia a los receptores de ácido siálico que contienen los enlaces a2,6-galactosa, mientras que los virus de influenza aviar se unen con preferencia a las células que contienen los enlaces a2,3-galactosa. Estas preferencias de unión se correlacionan al predominio de los enlaces de ácido siálico de a2,6-galactosa en las células epiteliales humanas, y los enlaces de a2,3-galactosa en las células epiteliales intestinales aviares. Ver, por ejemplo, Rogers GN, Paulson JC, Daniels RS, Skehel JJ, Wilson IA, Wiley DC (1983) "Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity," Nature 304: 76-78; Connor RJ, Kawaoka Y, Webster RG, Paulson JC (1994) "Receptor specificity in human, avian and equine H2 and H3 influenza virus isolates," Virology 205: 17-23; Ito T, Suzuki Y, Mitnaul L, Vines A, Kida H, Kawaoka Y (1997) "Receptor specificity of influenza A viruses correlate with agglutination of erythrocytes from different animal species," Virology 227:492-99. Aunque los mecanismos moleculares responsables de la especificidad de unión al receptor se definen deficientemente, se cree que la hemaglutinina de la influenza de origen aviar debe adquirir la especificidad de unión al receptor humano para generar las cepas de la influenza capaces de la transmisión prolongada de humano a humano. Ver, por ejemplo, Stephenson I, KG Nicholson, JM Wood, MC Zambón, y JM Katz (2004) "Confronting the avian influenza threat: vaccine development for a potential pandemic," The Lancet Infectious Diseases 4:499-509. Los estudios de la mutagénesis dirigida al sito han mostrado que solamente una o dos mutaciones de aminoácido son requeridas para este cambio. Ver Matrosovich M, Tuzikov A, Bovin N, y col. (2000) "Early alterations of the receptor binding properties of the H1, H2 and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals," J Virol 74: 8502-12. Una vez que ocurra la unión, la proteína NA inicia la endocitosis mediada por el receptor, y la fusión de la célula hospedadora/membrana viral. La proteína HA entonces experimenta un cambio de adaptación en el ambiente ácido del endosoma, y, junto con la proteína M2, media la liberación de las proteínas M1 de las ribonucleoproteínas asociadas a la nucleocápsida (RNPs, por sus siglas en inglés), que entonces se dirigen al núcleo celular para la síntesis viral de ARN. La proteína M2 es una proteína de transmembrana no glicosilada del aminoácido 97. Lamb RA, Lai C-J, Choppin PW (1981) "Sequences of mARNs derived from genome ARN segment 7 of influenza virus: collinear and interrupted mARNs code for overlapping proteínas," PNAS 78:4170-4; Lamb RA, Zebedee SL, Richardson CD (1985) "Influenza virus M2 proteína is an integral membrane proteína expressed on the infected-cell surface," Cell 40:627-33. Ésta forma homotetrámeros en la membrana viral de la partícula de virus, pero a cantidades comparativamente bajas cuando se compara a HA y NA. Sin embargo, están presentes a alta densidad en la membrana de plasma de la célula infectada. Zebedee SL, Lamb RA (1988) "Influenza A virus M2 proteína: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions," J Virol 62:2762-72. Se cree que la proteína M2 facilita la liberación de los complejos de RNP desde la membrana viral después de la fusión. Exhibe la actividad de transporte de protón que reduce el pH dentro de vesículas de transporte durante la salida de las proteínas de la transmembrana viral desde ER a la membrana de plasma, previniendo un cambio prematuro de adaptación inducido por el ácido en HA. Ver M Mozdzanowska K y col. (2003) "Induction of influenza type A virus specific resistance by immunization of mice with a synthetic múltiple antigenic peptide vaccine that contains ectodomains of matrix proteína 2," Vaccine 21:2616-2626; Steinhauer DA, Wharton SA, Skehel JJ, Wiley DC, Hay AJ (1991) "Amantadine selection of a mutant influenza virus containing an acid-stable hemagglutinin glycoprotein: evidence for virus-specific regulation of the pH of glycoprotein transport vesicles," Proc Nati Acad Sci 88:11525-9; Pinto LH, Holsinger LJ, Lamb RA (1992) "Influenza virus M2 proteína has ion channel activity," Cell 69:517-28; Zhirnov OP (1990) "Solubilization of matrix proteína Ml/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses," Virology 176:274-9 La proteína M2 contiene un ectodominio largo de 23 aminoácidos (M2e) que se conserva altamente entre los virus tipo A de la influenza capaces de infectar a los humanos. De hecho, los 9 aminoácidos de la terminal N se conservan completamente a través de las cepas humanas infecciosas del virus, y solamente un grado menor de diversidad estructural se muestra en los primeros 15 aminoácidos de la terminal N. Zebedee SL, Lamb RA (1988) "Influenza A virus M2 proteína: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions," J Virol 62:2762-72; Ito T, Gorman OT, Kawaoka Y, Bean WJ, Webster RG (1991) "Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the Ml and M2 proteínas," J. Virol. 65:5481-8. Generalmente, los virus de influenza aviar son incapaces de multiplicarse de manera eficiente en los humanos. Beare AS, Webster RG (1991) "Replication of avian influenza viruses in humans," Arch Virol 119:31-42. Sin embargo, se conoce que algunos subtipos de virus de la influenza aviar pueden multiplicarse dentro del tracto respiratorio humano. Ha habido un número de casos confirmados de la transmisión del virus de la influenza aviar a humanos. Ver Stephenson I, KG Nicholson, JM Wood, MC Zambón, y JM Katz (2004) "Confronting the avian influenza threat: vaccine development for a potential pandemic," The Lancet Infectious Diseases 4:499-509; WHO disease alert (2004) "Confirmed human cases of avian influenza H5N1," http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/en/; Hien TT, Liem NT, Dung NT, y col. (2004) "Avian influenza (H5N1) in 10 patients in Vietnam," N Engl J Med 350: 1179-88. La capacidad de ciertos tipos de virus de la influenza aviar de infectar a humanos aumenta el grupo de especies que pueden proporcionar un ambiente para la aparición del virus reasortante aviar/humano. En general, existen dos tipos de vacunas de la influenza, la vacuna viral de la influenza completamente inactivada y la vacuna viral de subvirión inactivada. La vacuna viral completa contiene viriones inactivados intactos, mientras que la vacuna de subvirión contiene la mayoría de las proteínas estructurales virales y algunas de las proteínas de cubierta viral. Estas vacunas virales se componen anualmente por una mezcla trivalente de las cepas de la influenza tipo A y de la influenza tipo B ya mencionadas que se encuentran en circulación entre la población humana durante una temporada de influenza dada. WHO revisa la composición de vacuna cada dos años y actualiza el contenido antigénico dependiendo de los subtipos circulantes frecuentes para proporcionar las vacunas igualadas correctamente de manera antigénica. Por ejemplo, para la temporada de la influenza de 2004-2005, la composición trivalente comprendió A/New Caledonia/20/99 (HIN1); A/Wyoming/03/2003 (H3N2), que es un virus similar a A/Fujian/411/2002; y el virus similar a B/Shanghai/361/2002 (es decir B/Jiangsu/10/2003 o B/Jilin/20/2003). Los ejemplos de tales vacunas incluyen Fluzone (Connaught), Fluvirin (Chiron), y Flu-Shield (Wyeth-Lederle).

Recientemente, Medlmmune ha desarrollado una vacuna de la influenza atenuada viva para el suministro intra-nasal, FluMist, que ha recibido la aprobación de la FDA para el uso comercial en los Estados Unidos de Norteamérica. Estas vacunas generalmente producen una respuesta humoral a una cepa específica, han reducido la eficacia contra los virus derivados de manera antigénica, y son inefectivas contra las cepas sin relación. Ver Stephenson I, Nicholson KG, Wood JM, Zambón MC, y Katz JM (2004) "Confronting the avian influenza threat: vaccine development for a potential pandemic," The Lancet: Infectious Diseases 4:499-509. Los virus inactivados y atenuados utilizados en las vacunas descritas anteriormente se producen en la cavidad alantoica de los huevos de los embriones de pollo. Este método de producción es lento, puesto que la producción toma hasta 6 meses y puede ser altamente vulnerable a la contaminación. En 2004, la contaminación en la producción del virus de la influenza de Chiron dio lugar a una escasez altamente publicitada y polémica de la vacuna de la influenza. La contaminación fue descubierta en agosto del 2004, demasiado tarde para que los fabricantes generaran los nuevos lotes de la vacuna para esa temporada. Además, los métodos de producción actuales requieren anticipar que cepa o cepas particulares son más probable que se presenten durante la temporada de la influenza. Tal requisito, en combinación con los métodos de producción actuales, limita la capacidad de modificar la producción de una vacuna de la influenza para dirigirla una cepa viral inesperada. Así, hay una necesidad de vacunas mejoradas que puedan producirse rápidamente y que puedan modificarse fácilmente para permitir la vacunación contra los virus que se presentan recientemente. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona las composiciones para el uso como vacunas contra un virus, particularmente un virus de la influenza, que comprende i) por lo menos un péptido derivado de un virus de la influenza fusiona a por lo menos una proteína de cápsida derivada de un virus de planta que forma un péptido recombinante de fusión de cápsida, en donde el péptido recombinante de fusión de cápsida es capaz de unirse para formar un virus o partícula similar al virus, e ii) por lo menos una proteína antigénica aislada o fragmento de la proteína derivado de un virus de la influenza humana o aviar. Tal estrategia utiliza el aspecto inmunogenético de un virus o partícula similar al virus en combinación con las proteínas antigénicas o fragmentos de proteína para producir una vacuna que pueda proporcionar una inmunidad protectora más amplia contra los virus de la influenza humana y/o aviar. En un aspecto de la presente invención, el péptido derivado de un virus de la influenza fusionado a la proteína de cápsida de la planta es un epítope viral de la influenza conservado. En una modalidad, el epítope conservado es un epítope del virus de la influenza humana conservado. Utilizando un epítope de la influenza conservado como un inserto antigénico para el virus o partícula similar al virus, el componente base de la composición no necesita ser re-diseñado en una base anual. En cambio, solamente la proteína antigénica aislada o el fragmento de proteína necesitan el cambio de acuerdo a las nuevas cepas emergentes del virus de la influenza. Debido a que las proteínas antigénicas o fragmentos de proteína pueden producirse de manera recombinante, la composición se puede producir rápidamente para el uso como una vacuna que produce una inmunorespuesta en un humano o animal contra las cepas de la influenza aparecidas recientemente. En una modalidad específica, el péptido de la influenza conservado se deriva de la proteína M2. En una modalidad, el péptido derivado de M2 se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-5, y 22-24. Las modalidades de la presente invención proporcionan las secuencias del péptido de la influenza derivado de la proteína M2, seleccionadas del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 3, 22, 23, y 24. Además, se proporcionan los fragmentos, derivados y homólogos de las SEC ID NOS: 3, 22, 23, ó 24. En otras modalidades, el epítope conservado se deriva de la proteína NP. En una modalidad, el péptido de NP se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NO: 8-10. En otra modalidad, el epítope conservado se deriva de la proteína HA. En una modalidad, el péptido de HA se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 6 y 7. En otras modalidades, cualquier combinación de los péptidos de la influenza conservados derivados de un virus de la influenza seleccionado del grupo que consiste de M2, NP, o HA se puede fusionar a una proteína de cápsida. En una modalidad, el péptido de fusión de cápsida contiene un péptido de M2, NP, y HA. En otra modalidad, el péptido de fusión de cápsida contiene un péptido de M2 y NP conservado. En aún otra modalidad, el péptido de fusión de cápsida contiene un péptido de M2 y HA. En otra modalidad, el péptido de fusión de cápsida contiene un péptido conservado de HA y NP. La presente invención utiliza las proteínas de cápsida derivadas de los virus de planta para construir los péptidos de fusión de cápsida. Las proteínas de cápsida con el péptido de la influenza fusionado pueden auto-integrarse in vivo o in vitro para formar un virus o partícula similar al virus. En una modalidad, el virus o partícula similar al virus no incluye las proteínas de la membrana de plasma de la célula hospedadora o las proteínas de la pared de la célula hospedadora. En una modalidad, el virus de la planta serán seleccionado de los virus que son icosaédricos (incluyendo icosaédricos apropiado, isométricos, cuasi-isométricos, y geminados o "gemelos"), polihedricos (incluyendo, esféricos, elipsoides, y con forma de limón), bacilliformes (incluyendo en forma de barra o bala, y fusiformes o con forma de cigarro), y helicoidales (incluyendo en forma de barra, cilindricos, y filamentosos). En algunas modalidades el virus de la planta puede ser una especie del virus icosaédrico de la planta. En una modalidad, la cápsida viral se puede derivar de un Cowpea Chlorotic Mottle Virus (CCMV) o de un Cowpea Mosaic Virus (CPMV). En las modalidades adicionales el virus de la planta se selecciona de un virus CCMV o CPMV, y la cápsida incluye por lo menos un inserto seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 3, 22, 23, y 24. En un aspecto de la presente invención, la proteína antigénica aislada o fragmento de proteína en combinación con el virus o partícula similar al virus, es una proteína de la influenza de una cepa viral de la influenza que apareció recientemente, incluyendo un el virus de la influenza humana o aviar. En una modalidad, la proteína o fragmento de proteína se deriva de un virus de la influenza aviar. En una modalidad de la presente invención, la proteína antigénica o fragmento de proteína se deriva de una proteína viral de la influenza seleccionada del grupo que consiste de matriz (M1), canal del protón-ión (M2), hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), nucleoproteína (NP), proteína de polimerasa básica 1 (PB1). En una modalidad de la presente invención, la proteína o fragmento de proteína se deriva de HA o NA de la influenza aviar. En ciertas modalidades, el virus o partícula similar al virus se combina con más de una proteína antigénica aislada o fragmento de proteína. En ciertas modalidades, este péptido antigénico aislado o fragmentos de péptido se derivan de la misma especie. En otras las modalidades, este péptido antigénico aislado o fragmentos de péptido se deriva de diferentes especies. En ciertas modalidades, el virus o partícula similar al virus se combina con por lo menos un proteína NA o fragmento de proteína y por lo menos una proteína HA o fragmento de proteína. En ciertas modalidades, los fragmentos de NA y/o HA, se derivan de un virus de la influenza aviar. En ciertas otras modalidades, los fragmentos de NA y/o HA se derivan de un virus de la influenza humana. En una modalidad adicional, la partícula similar al virus se combina con por lo menos un proteína NA o fragmento de proteína, por lo menos una proteína HA o fragmento de proteína, y cualquier combinación de las proteínas virales de la influenza aviar o fragmentos de proteína seleccionadas del grupo que consiste de M1, M2, NP, PB1, PB2, PA, y NP2. En ciertas modalidades la proteína NA o fragmento de proteína se deriva del grupo de proteínas NA de la influenza seleccionadas del grupo que consiste de N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, y N9. En las modalidades adicionales la proteína HA o fragmento de proteína se deriva de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, y H15 de la influenza. En ciertas modalidades, el péptido antigénico aislado está en una mezcla con el virus o partícula similar al virus pero no se une de manera covalente al virus o partícula similar al virus. La mezcla puede incluir los excipientes adicionales. En una modalidad, por lo menos un fragmento antigénico de proteína es menor que la proteína integral. En ciertas modalidades, el fragmento antigénico de proteína se deriva de un virus de la influenza aviar o humana. En ciertas modalidades, el fragmento de proteína comprende por lo menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200 ó más aminoácidos. En una modalidad, los péptidos derivados de un virus de la influenza, las proteínas de cápsida derivadas de un virus de la planta, y las proteínas antigénicas o fragmentos de proteína se derivan de un virus de la influenza, se pueden alterar para proporcionar las características deseables aumentadas. Tales características incluyen la antigenicidad aumentada, la expresión recombinante aumentada en una célula hospedadora, una integración más eficiente, o propiedades de unión covalentes mejoradas. En una modalidad, el péptido de la influenza insertado en la proteína de cápsida es modificado cambiando su secuencia de aminoácidos, en donde la alteración no reduce la naturaleza antigénica del péptido. En otra modalidad, el péptido de la influenza insertado en la proteína de cápsida es modificado mediante las modificaciones post-translación, tal como glicosilación, fosforilación o modificación de lípidos. En otra modalidad, la proteína antigénica aislada o fragmento de proteína derivada se puede modificar cambiando su secuencia de aminoácidos, en donde la alteración no reduce la naturaleza antigénica del péptido. En otra modalidad, la proteína antigénica aislada o fragmento de proteína derivada es modificada mediante la modificación post-translación. En otras modalidades de la presente invención, por lo menos una proteína aislada o fragmento de proteína se puede unir de manera covalente a la superficie del virus que contiene el péptido o partícula similar al. En otra modalidad, por lo menos un fragmento de proteína viral de la influenza aviar o humana que consiste de menos que la secuencia completa de aminoácidos de la proteína, se une de manera covalente a la superficie del péptido que contiene el virus o partícula similar al virus. En una modalidad, el fragmento de proteína antigénico unido de manera covalente incluye por lo menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200 ó más aminoácidos. En otra modalidad de la presente invención, por lo menos un péptido de M2, NP, o HA derivado de un virus de la influenza se fusiona a una proteína de cápsida derivada de un virus de la planta que forma un primer péptido de fusión de cápsida recombinante y el péptido de fusión de cápsida recombinante se combina con por lo menos un péptido derivado de un virus de la influenza aviar y/o humana fusionado a una proteína de cápsida derivada de un virus de la planta que forma un segundo péptido de fusión de cápsida recombinante. En esta modalidad, el primer péptido de fusión de cápsida recombinante y el segundo péptido de fusión de cápsida recombinante son capaces de integrarse, in vivo o in vitro, para formar un virus o partícula similar al virus. La partícula similar al virus resultante puede entonces combinarse con una proteína antigénica aislada derivada de un virus de la influenza. En una modalidad, el péptido contenido en el segundo péptido de fusión de cápsida recombinante se deriva de una proteína del virus de la influenza humana o aviar seleccionada del grupo que consiste de M1, M2, HA, NA, NP, PB1, PB2, PA, y NP2. En una modalidad de la presente invención, el péptido contenido en el segundo péptido de fusión de cápsida recombinante se deriva de las proteínas HA o NP del virus de la influenza. En algunas modalidades el péptido contenido en el segundo péptido de fusión de cápsida recombinante es NP. En otras modalidades el péptido contenido en el segundo péptido de fusión de cápsida recombinante es HA. En algunas modalidades el péptido de HA se deriva de H 1 , H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, o H15. En aún otra modalidad de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un virus o partícula similar al virus, en donde el virus o partícula similar al virus comprende una proteína de cápsida derivada de un virus de planta fusionado a i) por lo menos un péptido conservado de un virus de la influenza, a ii) por lo menos un péptido viral de la influenza aislado adicional, en donde los péptidos de fusión de cápsida son capaces de integrarse, in vivo o in vitro, a virus o partícula similar al viruss, y a iii) un péptido antigénico aislado derivó de un virus de la influenza. En aún otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una mezcla de virus o partícula similar al virus, en donde la mezcla comprende i) un primer virus o partícula similar al virus que contiene por lo menos un péptido de un virus de la influenza, e ii) por lo menos un segundo virus o partícula similar al virus que contiene por lo menos un péptido viral de la influenza diferente al contenido en el primer virus o partícula similar al virus, e ¡ii) un péptido antigénico aislado derivado de un virus de la influenza. En una modalidad, los péptidos de la influenza están fusionados a una proteína de cápsida derivada de un virus de planta. En algunos aspectos de la presente invención, las composiciones se pueden utilizar en una estrategia de vacunación para inducir una inmunorespuesta en un humano o animal. Las composiciones se pueden combinar con un adyuvante y administrarse en una cantidad efecitva a un humano o un animal para producir una inmunorespuesta. En otras modalidades, las composiciones se administran sin un adyuvante a un humano o animal. En algunas modalidades la composición incluye los ácidos nucleicos immuno-estimulantes, tal como las secuencias de CpG. En cierta modalidad los ácidos nucleicos immuno-estimulantes se pueden encapsular en la partícula similar al virus. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde las composiciones se pueden administrar a un humano o animal en una forma sustancialmente purificada, por ejemplo, sustancialmente libre de las proteínas de la célula hospedadora. En otra modalidad, las composiciones se pueden administrar a un humano o animal en una forma parcialmente purificada, por ejemplo, en una forma que incluya las proteínas de la célula hospedadora, que pueden ser proteínas de célula de planta. En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una composición para el uso en una vacuna de la influenza en un humano o animal, que comprende: i) proporcionar un primer ácido nucleico que codifica una secuencia de la proteína de cápsida del virus de planta unida de manera operable a una secuencia del péptido viral de la influenza, y que expresa el primer ácido nucleico en una célula hospedadora para producir un péptido de fusión de cápsida; ii) integrar el péptido de fusión de cápsida para formar un virus o partícula similar al virus; iii) proporcionar por lo menos un segundo ácido nucleico que codifica por lo menos una proteína antigénica o fragmento de proteína derivada de una variedad de virus de la influenza, y que expresa el segundo ácido nucleico en una célula hospedadora para producir la proteína o fragmento antigénica de proteína; iv) aislar y purificar la proteína antigénica o fragmento de proteína; y v) combinar el virus o partícula similar al virus y la proteína antigénica aislada o fragmento de proteína para formar una composición capaz de administrarse a un humano o animal. En algunas modalidades el virus o partícula similar al virus se produce en una célula hospedadora de planta, por ejemplo, en todas las plantas o cultivos celulares de planta. En otras modalidades, el virus o partícula similar al virus se produce en una célula hospedadora de Pseudomonas fluorescens. En otras modalidades, el péptido de fusión de cápsida se expresa en una célula hospedadora tal como una célula de planta o Pseudomonas fluorescens y el virus o partícula similar al virus se integra in vitro. En una modalidad, la proteína antigénica o fragmento de proteína se puede producir en una célula eucariótica, tal como en todas las plantas o cultivos celulares de planta. En las modalidades adicionales la proteína antigénica o fragmento de proteína se puede producir en cualquier célula procariótica, tal como, en E. coli o Pseudomonas fluorescens. En algunas modalidades el péptido de fusión de cápsida y la proteína antigénica o fragmento de proteína se co-expresan en la misma célula eucariótica, y el péptido de fusión de cápsida se integra in vivo para formar un virus o partícula similar al virus. En otras modalidades el péptido de fusión de cápsida y la proteína antigénica o fragmento de proteína se co-expresan en la misma célula procariótica, tal como una célula de Pseudomonas fluorescens, y el péptido de fusión de cápsida se integra in vivo para formar una partícula similar al virus. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra el dibujo esquemático de la vacuna de la influenza que comprende el virus de la influenza o partícula similar al virus que exhibe los epítopes del virus de la influenza y los antígenos de la proteína del virus de la influenza o fragmento de proteína unidos de manera covalente a VLP. También se muestra la encapsidación de las secuencias de ácido nucleico immuno-estimulantes (CpGs) en la partícula. La figura 2 muestra el dibujo esquemático de la unión covalente de los antígenos de la proteína del virus de la influenza o del fragmento de proteína al virus o partícula similar al virus. La figura 3 muestra el dibujo esquemático de la encapsidación de las secuencias de ácido nucleico immuno-estimulantes (CpGs) en VLP durante la integración de VLP. La figura 4 muestra la expresión de CCMV129 CP fusionado con el péptido del virus de la influenza M2e-1 en Pseudomonas fluorescens según lo detectado por SDS-PAGE manchado por el Simply Blue Safe Stain (Invitrogen). La figura 5 muestra la expresión de CCMV129 CP fusionado con el péptido del virus de la influenza M2e-2 en Pseudomonas fluorescens según lo detectado por SDS-PAGE manchado por el Simply Blue Safe Stain (Invitrogen). La figura 6 muestra la expresión de CCMV129 CP fusionado con el péptido del virus de la influenza NP55-69 en Pseudomonas fluorescens según lo detectado por SDS-PAGE manchado por el Simply Blue Safe Stain (Invitrogen). La figura 7 muestra la expresión de CCMV129 CP fusionado con el péptido del virus de la influenza NP147-158 en Pseudomonas fluorescens según lo detectado por SDS-PAGE manchado por el Simply Blue Safe Stain (Invitrogen). La figura 8 muestra la expresión de CCMV129 CP fusionado con el péptido del virus de la influenza HA91-108 en Pseudomonas fluorescens según lo detectado por SDS-PAGE manchado por el Simply Blue Safe Stain (Invitrogen). La figura 9 muestra la expresión y purificación de CCMV129 CP fusionado con el péptido del virus de la influenza M2e-1 en Pseudomonas fluorescens según lo detectado por SDS-PAGE manchado por el Simply Blue Safe Stain (Invitrogen). La figura 10 muestra la expresión de CCMV129 CP fusionado con el péptido del virus de la influenza M2e-1 en Pseudomonas fluorescens según lo detectado por Western Blot con los anticuerpos anti-CCMV y anti-M2. El péptido M2e es reconocido por los anticuerpos anti-M2. La figura 11 muestra la expresión de CPMV fusionado con el péptido del virus de la influenza M2e-1 en plantas según lo detectado por SDS-PAGE y Western Blot con los anticuerpos 14B anti-CPMV y anti-M2. El péptido M2e es reconocido por los anticuerpos anti-M2. La figura 12 muestra la secuencia de una proteína HA de un aislado de H5N1 que comprende el péptido señal, HA1 y HA2, el dominio trans-membrana, y la cola citoplásmica indicada. La figura 13 muestra la estructura de un monómero de H5N1 HA. La figura 14 muestra el dibujo esquemático de los vectores virales basados en PVX para la expresión de las proteínas de la influenza o fragmentos de proteína en las plantas. La figura 15 muestra el dibujo esquemático del sistema basado en el vector del virus de la planta para la producción de las proteínas del virus de la influenza en las plantas. El vector del virus de la planta diseñado para expresar las proteínas del virus de la influenza o fragmentos de proteína se puede suministrar a las plantas por inoculación mecánica como ADN de plásmido, ARN viral, o por suministro mediado por grobacterium. Descripción Detallada de la Invención /. Péptidos de Fusión de Cápsida La presente invención utiliza por lo menos un péptido derivado de un virus de la influenza fusionado a una proteína de cápsida derivada de un virus de la planta que forma un péptido de fusión de cápsida recombinante. El péptido de fusión de cápsida recombinante es capaz integrarse para formar un virus o partícula similar al virus que no contiene las membranas del plasma de la célula hospedadora. El péptido de fusión de cápsida recombinante puede contener los péptidos derivados de manera viral de la influenza. En modalidades de la presente invención, el péptido de fusión de cápsida recombinante contiene un péptido derivado de una proteína viral de la influenza. En las modalidades adicionales, el péptido se deriva de un péptido conservado, un péptido derivado u homólogo del mismo. El péptido conservado se puede derivar de una proteína M2, HA, o NP. En algunas modalidades, uno, más de uno, o combinaciones de los péptidos conservados, o derivados u homólogos de los mismos, derivados de M2, HA, o NP se pueden fusionar a la proteína de cápsida. Un derivado u homólogo es considerado generalmente que es una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% idénticas a una secuencia de referencia. a. Péptidos Derivados de la Influenza Humana y/o Aviar En una modalidad de la presente invención, un péptido derivado de un virus de la influenza humana y/o aviar se fusiona de manera genética a una proteína de cápsida derivada de un virus de planta. Las secuencias de la proteína viral de la influenza humana y aviar son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, el National Center for Biotechnology Infomations mantiene una Influenza Resourse Databse que contiene las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas, y las secuencias de aminoácidos, cepas aisladas del virus de la influenza humana y aviar. La base de datos está disponible en http://www.ncbi.nhn.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html. El péptido seleccionado para la inserción en la proteína viral de cápsída de la planta se puede derivar de la secuencia de aminoácidos de las proteínas integrales del virus de la influenza. En otras modalidades, el péptido seleccionado para la inserción comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ó más aminoácidos de longitud. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogos a un péptido antigénico que comprende por lo menos 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ó más aminoácidos dentro de la proteína de la influenza de la cual se deriva. Preferiblemente, el péptido de la influenza seleccionado para la inserción comprende un epítope capaz de producir una inmunorespuesta en un humano o animal. La determinación de los epítopes es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, un péptido seleccionado para la inserción en la proteína de cápsida viral de la planta se puede probar para determinarse si es capaz de producir una inmunorespuesta administrando el péptido seleccionado a un animal tal como un ratón, conejo, cabra, o mono, y posteriormente probar el suero del animal para determinar la presencia de anticuerpos al péptido. En otras modalidades, el péptido antigénico derivado de la influenza se puede alterar para mejorar las características del inserto, por ejemplo, pero sin limitarse a, la expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, y propiedades de unión covalente mejoradas. b. Péptido de M2 de la Influenza La proteína M2 de la influenza es una proteína de la membrana del aminoácido 97. La proteína tiene 24 aminoácidos que se exponen de manera extracelular en la terminal N, 19 aminoácidos que atraviesan la bicapa de lípidos, y 54 residuos que estén localizados en el lado citoplásmico de la membrana. En una modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención se deriva de la secuencia del aminoácido 97 de un virus de la influenza capaz de infectar un humano o ave. El péptido derivado puede comprender la secuencia completa del aminoácido 97, o ser un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ó 97 aminoácidos elegidos dentro de la secuencia del aminoácido 97. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido antigénico de M2 que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ó 97 aminoácidos. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen el péptido de M2 utilizado en la presente invención que se deriva del dominio extracelular del aminoácido. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido de M2 utilizado en la presente invención es la secuencia del dominio extracelular del aminoácido 23 M2e-1 (SEC ID NO: 1, tabla 1) derivada de la secuencia de M2 universal conservada. En otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención está compuesto por un subconjunto de aminoácidos del péptido M2e-1 que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ó 23 aminoácidos elegidos dentro del péptido M2e-1. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido M2e-1 que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ó 23 aminoácidos de la SEC ID NO: 1. En otras modalidades, el péptido de M2 utilizado en la presente invención se deriva de la secuencia del dominio extracelular del aminoácido 23 M2e-2 (SEC ID NO: 2, tabla 1). En otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención está compuesto por un subconjunto de aminoácidos del péptido M2e-2 que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ó 23 aminoácidos elegidos dentro del péptido M2e-2. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido M2e-2 que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ó 23 aminoácidos de la SEC ID NO: 2. 5 En otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención se deriva de la secuencia del dominio extracelular del aminoácido 22 M2e-3 (SEC ID NO: 3, tabla 1). En otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención está compuesto por un subconjunto de aminoácidos del péptido ío M2e-3 que comprende por lo menos 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos elegidos del péptido M2e-3. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido M2e-3 que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, I5 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos de la SEC ID NO: 3. En aún otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención se deriva de la secuencia del dominio extracelular del aminoácido 23 de la cepa de la influenza o A/PR/8/34 (HIN1) (SEC ID NO: 4, tabla 1). En otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención está compuesto por un subconjunto de aminoácidos del péptido de M2 de la cepa de la influenza A/PR/8/34 (HIN1) que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ó 5 23 aminoácidos elegidos del péptido de M2 de la cepa de la influenza A/PR/8/34 (HIN1). El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo al péptido de M2 de la cepa de la influenza A/PR/8/34 (HIN1) que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 aminoácidos de la SEC ID NO: 4. En aún otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención se deriva de la secuencia extracelular del aminoácido 23 de la cepa de la influenza A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1) (SEC ID NO: 5, tabla 1). En otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención está comprendido por un subconjunto de aminoácidos del péptido de M2 de la cepa de la influenza A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1) que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ó 23 aminoácidos elegidos del péptido de M2 de la cepa de la influenza A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1). El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo al péptido de M2 de la cepa de la influenza A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1) que comprende por lo menos 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ó 23 aminoácidos de la SEC ID NO: 5. En otras modalidades, el péptido de M2 utilizado en la presente invención se deriva de la secuencia del aminoácido 22 M2e-2(W-) (SEC ID NO: 22, tabla 1). En otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención estpá comprendido por un subconjunto de aminoácidos del péptido M2e-2(W-) que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos elegidos dentro del péptido M2e-2(W-). El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido M2e-2(W-) que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos de la SEC ID NO: 22. En aún otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención se deriva de la secuencia del aminoácido 22 de la cepa de A/PR/8/34 (HIN1)(W-) (SEC ID NO: 23, tabla 1). En otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención está compuesto por un subconjunto de aminoácidos de M2-A/PR/8/34 (HIN1)(W-) que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos elegidos de A/PR/8/34 (HIN1)(W-). El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo (HIN1)(W-) al péptido A/PR/8/34 que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 aminoácidos de la SEC ID NO: 23. En aún otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención se deriva de la secuencia del aminoácido 22 de A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1)(W-) (SEC ID NO: 24, tabla 1). En otra modalidad, el péptido de M2 utilizado en la presente invención está compuesto por un subconjunto de aminoácidos de M2-A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1)(W-) que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos elegidos de M2-A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1)(W-). El péptído seleccionado pueden ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo al péptido M2-A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1)(W-) que comprende por lo menos 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos de la SEC ID NO: 24. En las modalidades adicionales, el péptido de M2 insertado en la proteína de cápsida del virus de la planta puede ser la secuencia completa de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-5 y 22-24, o un subconjunto de la misma que tiene por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó más aminoácidos de longitud. El péptido seleccionado para la inserción puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a un péptido de por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ó más aminoácidos de longitud dentro de las secuencias de péptido seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 1-5 y 22-24. En otras modalidades, cualquier combinación de los péptidos de M2 seleccionados del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-5 y 22-24, o un subconjunto de las mismas que tiene por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más aminoácidos de longitud, se puede insertar en la proteína de cápsida del virus de la planta. Las combinaciones del péptido seleccionado pueden ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homologas a por lo menos a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-5 y 22-24. En las modalidades adicionales, péptido de M2 antigénico derivado de la influenza se puede alterar para mejorar las características del inserto, por ejemplo, pero sin limitarse a, la expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, y propiedades de unión covalente mejoradas. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el triptofan de aminoácido en la SEC ID NO: 1, 2, 4, ó 5 se elimina o remplaza por cualquier aminoácido que no sea triptofan. Tabla 1 : Secuencias del Péptido de M2 La presente invención también proporciona los péptidos derivados de M2 de novedad. En una modalidad, se proporciona el péptido M2e-3 de M2 de novedad que comprende la SEC ID NO: 3. En una modalidad, se proporcionas secuencias de aminoácidos que son por lo menos 70, 75, 80, 90, 95, 98 ó 99% homologa a SEC ID NO: 3. En otra modalidad, se proporciona un péptido que comprende por lo menos, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos derivados de la SEC ID NO: 3. El péptido M2e-3 se deriva del péptido M2e-1, en donde se ha eliminado el triptofan de aminoácido. La eliminación del triptofan proporciona la integración aumentada de ciertos péptidos de fusión de cápsida, mientras que no afecta de manera perjudicial la inmunogenicidad del péptido. En una modalidad, el péptido M2e-3 se inserta en una proteína de cápsida viral de planta. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido M2e-3 se inserta en una proteína de cápsida derivada a de CCMV o CPMV. En una modalidad, se proporciona el péptido M2e-2(W-) de M2 de novedad que comprende la SEC ID NO: 22. En una modalidad, se proporcionan las secuencias de aminoácidos que son por lo menos 70, 75, 80, 90, 95, 98 ó 99% homologas a la SEC ID NO: 22. En otra modalidad, se proporciona un péptido que comprende por lo menos, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos derivados de la SEC ID NO: 22. El péptido M2e-2(W-) se deriva del péptido M2e-2, en donde se ha eliminado el triptofan del aminoácido. En una modalidad, el péptido M2e-2(W-) se inserta en una proteína de cápsida derivada de un virus de planta. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido M2e-2(W-) se inserta en una proteína de cápsida derivada de CCMV o CPMV. En una modalidad, se proporciona el péptido M2e-A/PR/8/34 (HIN1)(W-) de M2 de novedad que comprende la SEC ID NO: 23. En una modalidad, se proporcionan las secuencias de aminoácidos que son por lo menos 70, 75, 80, 90, 95, 98 ó 99% homologas a la SEC ID NO: 23. En otra modalidad, se proporciona un péptido que comprende por lo menos, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos derivados de la SEC ID NO: 23. El péptido M2e-A/PR/8/34 (HIN1)(W-) se deriva del péptido M2e-A/PR/8/34 (HIN1), en donde se ha eliminado el triptofan de aminoácido. En una modalidad, el péptido M2e-A/PR/8/34 (HIN1)(W-) se inserta en una proteína de cápsida derivada de un virus de planta. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido M2e-A/PR/8/34 (HIN1)(W-) se inserta en una proteína de cápsida derivada de CCMV o CPMV. En una modalidad, se proporciona el péptido M2e-A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1)(W-) de M2 de novedad que comprende la SEC ID NO: 24. En una modalidad, se proporciona las secuencias de aminoácidos que son por lo menos 70, 75, 80, 90, 95, 98 ó 99% homologas a la SEC ID NO: 24. En otra modalidad, se proporciona un péptido que comprende por lo menos, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ó 22 aminoácidos derivados de la SEC ID NO: 24. El péptido se deriva del péptido M2e-A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1), en donde se ha eliminado el triptofan del aminoácido. En una modalidad, el péptido M2e-A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1)(W-) se inserta en una proteína de cápsida derivada de un virus de planta. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido M2e-A/Fort Monmouth/1/47 (HIN1)(W-) se inserta en una proteína de cápsida derivada de CCMV o CPMV. También se proporcionan las composiciones de novedad que comprenden un péptido de fusión de cápsida que comprende una proteína de cápsida derivada de un virus, incluyendo un virus de planta, fusionado a un péptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 3, 22, 23, y 24. b. Proteína HA La hemaglutinina (HA) del virus de la influenza es una glicoproteína de transmembrana tipo I que aparece en las partículas del virus de la influenza como homotrímeros con dominios plegados múltiples. El monómero tiene seis enlaces disulfuro de intra-cadena y siete glicanos enlazados a N en el ectodominio de la terminal N, un dominio de transmembrana y una cola citosólica. Wilson y col. (1981) "Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A° resolution," Nature 289:366-373; Wiley D.C. y JJ. Skehel (1987) "The structure and function of hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus," Annu. Rev. Biochem. 56:365-394. La estructura cristalina del ectodominio de los trímeros activados de manera proteolítico revela una proteína estructural trimérica larga punto de 135 Á en la cual cada subunidad tiene dos dominios importantes: un dominio superior terminal de NH2 globular y un dominio terminal de COOH que forma el vastago de la proteína aumentada. La región de vastago contiene los péptidos de fusión conocidos por estar implicados en la actividad de fusión de membrana de la proteína. Wilson y col. (1981) "Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A° resolution," Nature 289:366-373; Wiley D.C. and JJ. Skehel (1987) "The structure and function of hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus," Annu. Rev. Biochem. 56:365-394. En una modalidad, el péptido de HA utilizado en la presente invención se deriva de una proteína HA contenida en un virus de la influenza seleccionado del grupo de quince clases de antígenos de hemaglutínina H1-H15. El péptido derivado puede comprender la secuencia completa de aminoácidos de HA, o ser un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 331, 332, 333 o más aminoácidos elegidos dentro de la secuencia de aminoácidos de HA. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia de péptido antigénico de HA de la proteína de la influenza que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 331, 332, 333 o más aminoácidos elegidos dentro de la secuencia de aminoácidos de HA de la que se derivan. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen el péptido de HA utilizado en la presente invención que se deriva de un virus de la influenza capaz de infectar un humano o ave. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido de HA insertado en la proteína de cápsida del virus de la planta utilizado en la presente invención se deriva de un subtipo H3. En las modalidades adicionales el péptido de HA se puede derivar de la proteína HA del aminoácido 333 de la cepa de la influenza A/Texas/1/77 (H3N2) (SEC ID NO: 6, tabla 2). CB Smith y col. CB Smith et al. (2002) "Molecular epidemiology of influenza A(H3N2) virus re-infections," J. Infect. Dis. 185 (7):980-985. En otra modalidad, el péptido de HA utilizado para el inserto en la proteína de cápsida de la planta puede comprender la secuencia completa de aminoácido de HA de la SEC ID NO: 6, o ser un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 331, 332, 333 o más aminoácidos elegidos dentro de la secuencia de aminoácidos de HA de la SEC ID NO: 6. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia antigénica del péptido de HA que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 331, 332, 333 o más aminoácidos de la SEC ID NO: 6. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen el péptido de HA utilizado en la presente invención que se deriva de la secuencia del aminoácido 18 de HA91-108-A/Texas/1/77 (H3N2) (SEC ID NO: 7, la tabla 2) o un subconjunto de la misma que tenía por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18 aminoácidos de longitud derivados de los aminoácidos 91-108 de HA de la cepa de la influenza A/Texas/1/77 (H3N2). El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido antigénico de HA que comprende la secuencia del aminoácido 18 de HA91 -108-A/Texas/1/77 (H3N2) (SEC ID NO: 7, tabla 2) o un subconjunto de la misma que tiene por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ó 18 aminoácidos de longitud derivados de los aminoácidos 91-108 de HA de la cepa de la influenza A/Texas/1/77 (H3N2). En las modalidades adicionales, el péptido de HA insertado en la proteína de cápsida del virus de la planta puede ser la secuencia completa de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 6 y 7, o un subconjunto de la mima que tiene por lo menos por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 331, 332, 333 o más aminoácidos de longitud. En otras modalidades, cualquier combinación de los péptidos de HA seleccionados del grupo que consiste de las SEC ID NO: 6 y 7, o un subconjunto de los mismos que tiene por lo menos 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 331, 332, 333 o más aminoácidos de longitud. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido antigénico de HA del péptido seleccionado derivado del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 6-7. En las modalidades adicionales, el péptido antigénico de HA derivado de la influenza se puede alterar para mejorar las características del inserto, tal como, pero sin limitarse a, la expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, y propiedades de unión covalente mejoradas. Tabla 2: Secuencias del Péptido de HA c. Proteína NP La nucleoproteína del virus de la influenza (NP) es una nucleoproteína helicoidal asociada estrechamente al genoma del ARN filamentoso sencillo viral. La proteína NP de la influenza es rica en residuos de arginina, glicina y serina y tiene una carga positiva neta a pH neutral. La proteína NP de la influenza tipo A se compone generalmente por un polipéptido de 498 aminoácidos de longitud, mientras que en los virus de la influenza B y C, la longitud del polipéptido de NP homólogo es generalmente de 560 y 565 residuos, respectivamente. Ver Londo y col. (1983) "Complete nucleotide sequence of the nucleoprotein gene of influenza B virus," Journal of Virology 47:642-648; S. Nakada y col. (1984) "Complete nucleotide sequence of the influenza C/California/78 virus nucleoprotein gene," Virus Research 1: 433-441. La alineación de las secuencias previstas de aminoácidos de los genes de NP de los tres tipos del virus de la influenza, revela la similitud significativa entre las tres proteínas, las NPs tipo A y B muestran el grado más alto de conservación. Ver Pórtela y Digard (2002) "The influenza virus nucleoprotein: a multifunctional RNA-binding protein pivotal to virus replication 2002," JGV 83:723-734. El análisis filogenético de las cepas de de virus aisladas de diferentes hospedadores, revelo que el gene de NP está relativamente bien conservado, con una diferencia máxima de aminoácido de menos de 11%. Ver Shu y col. (1993) "Analysis of the evolution and variation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1933 to 1990," Journal of Virology 67:2723-2729. En una modalidad, el péptido de NP utilizado en la presente invención se deriva de una proteína NP contenida en un virus de la influenza tipo A, B, o C. El péptido derivado puede comprender la secuencia completa de aminoácidos de NP, o ser un subconjunto de los mismas que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 450, 460, 470, 480, 490, 495, 498 o más aminoácidos elegidos dentro de la secuencia de aminoácidos de NP. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido antigénico de NP de la proteína de la influenza que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 320, 325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 450, 460, 470, 480, 490, 495, 498 o más aminoácidos elegidos dentro de la secuencia de aminoácidos de NP. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen el péptido de NP utilizado en la presente invención que se deriva de un virus de la influenza capaz de infectar un humano o ave. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido de NP insertado en la proteína de cápsida del virus de la planta utilizada en la presente invención, se deriva de la proteína de NP derivada de un virus de la influenza tipo A. La proteína NP se deriva de la proteína NP del aminoácido 498 de la cepa de la influenza A/Texas/1/77 (H3N2) (SEC ID NO: 8, tabla 3) o ser un subconjunto del mismo que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 450, 460, 470, 480, 490, 495, 498 o más aminoácidos elegidos dentro de la secuencia de aminoácidos de NP de la SEC ID NO: 8. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido antigénico de NP de la proteína de la influenza que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 320, 325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 446, ó más aminoácidos elegidos dentro de la secuencia de aminoácidos de NP de la SEC ID NO: 8. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen el péptido de NP utilizado en la presente invención que se deriva de 15NP55-69-A/Texas/1/77 (H3N2) de la secuencia del aminoácido (SEC ID NO: 9, tabla 3) o un subconjunto de la misma que tiene por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ó 15 aminoácidos de longitud derivados de los aminoácidos 55-69 de NP de la cepa de la influenza A/Texas/1/77 (H3N2). El péptido seleccionado puede ser por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido antigénico de NP o un subconjunto de la misma que tiene por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 aminoácidos de longitud derivados de los aminoácidos 55-69 de NP de la cepa de la influenza A/Texas/1/77 (H3N2). En otras modalidades, el péptido de NP utilizado en la presente invención se deriva de la secuencia del aminoácido 12 NP147-158-A/Texas/1/77 (H3N2) (SEC ID NO: 10, tabla 3) o un subconjunto de la misma que tiene por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ó 12 aminoácidos de longitud derivados de los aminoácidos 147-158 de NP de la cepa de la influenza A/Texas/1/77 (H3N2). El péptido seleccionado puede ser por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido antigénico de NP o un subconjunto de la misma que tiene por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ó 12 aminoácidos de longitud derivada de los aminoácidos 147-158 de NP de la cepa de la influenza A/Texas/1/77 (H3N2). En modalidades adicionales, el péptido de NP insertado en la proteína de cápsida del virus de la planta puede ser la secuencia completa de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 8 10, o un subconjunto de la misma que tiene por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 320, 325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 450, 460, 470, 480, 490, 495, 498, o más aminoácidos de longitud. El péptido seleccionado puede ser por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido antigénico de NP de la proteína de la influenza que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 320, 325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 450, 460, 470, 480, 490, 495, 498, o más aminoácidos elegidos dentro de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NOS: 8-10. En otras modalidades, cualquier combinación de los péptidos de NP seleccionados del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 8-10, o un subconjunto de las mismas que es 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% homólogo a la secuencia del péptido antigénico de NP de la proteína de la influenza que comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 320, 325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 450, 460, 470, 480, 490, 495, 498, ó más aminoácidos de longitud derivados del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 8-10, se puede insertar en la proteína de cápsida del virus de la planta. En las modalidades adicionales, el péptido antigénico derivado NP de la influenza se puede alterar para mejorar las características del inserto, por ejemplo, pero sin limitarse a, expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, y propiedades de unión covalente mejoradas. Tabla 3: Secuencias de Aminoácidos de NP d. Proteína de Cápsida La presente invención utiliza las proteínas de cápsida derivadas de virus de la planta para construir los péptidos de fusión de cápsida. Una ventaja potencial del uso de las proteínas de cápsida de un virus de planta es el potencial reducido de reacciones adversas cuando se administra a un humano o animal, mientras que mantiene la forma ventajosa de una partícula viral que presenta el epítope de la influenza. En las modalidades adicionales, la proteína de cápsida será derivada de los virus de planta seleccionados de miembros de cualquier taxón que sea específico para por lo menos un hospedador de planta. Las taxonomías virales reconocen el siguiente taxón de entidades de la partícula sometida a cápsida: Virus del grupo I, es decir los virus de ADNds; Virus del grupo II, es decir los virus de ADNss; Virus del grupo lll, es decir los virus de ARNds; Virus del grupo IV, es decir virus filamentosos de ARNss ( + ) sin etapa de ADN; virus de grupo V, es decir virus filamentosos de ARNss (-); Virus del grupo VI, es decir virus retroides de ARN, que son virus de transcripción inversa de ARNss; Virus del grupo Vil, es decir virus retroides de ADN, que son virus de transcripción inversa de ADNds; Deltavirusus; Viroides; y bacteriófagos los satélite y virus satélite, excluyendo los ácidos nucleicos y priones satélite. Los miembros de este taxón son bien conocidos por un experto en la técnica y se revisan en: H. V. Van Regenmortel y col. (edsJ, Virus Taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2000) (Academic Press/Elsevier, Burlington Mass., E.E.U.U.); the Virus Taxonomy web-page of the University of Leicester (UK) Microbiology & Immunology Department en at http://wwwmicro.msb.le.ac.uk/3035/ Virusgroups.html; y en las secciones en línea "Virus" y "Viroid" del Taxonomy Browser of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) of the National Library of Medicine of the National Institutes of Health of the US Department of Health & Human Services (Washington, D.C, E.E.U.U.) en http://www.ncbi.nhn.nih.gov/Taxonomy/ tax. html. La secuencia de aminoácidos de la cápsida se puede seleccionar de las cápsidas de cualquier miembro de cualquiera de estos taxones que son infecciosos para las plantas. Las secuencias de aminoácidos para las cápsidas de los miembros de estos taxones se pueden obtener de las fuentes, incluyendo, pero son limitarse a, por ejemplo: las secciones "Nucleotide" (Genbank), "Protein", y "Structure" en línea del centro de búsqueda PubMed ofrecido por NCBI en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi. Los virus se pueden clasificar en aquellos con simetría helicoidal o simetría icosaédrica. Las morfologías de cápsida generalmente reconocidas incluyen: icosaédrica (incluyendo icosaédricas apropiada, isométrico, cuasi-isométrico, y dobles o "duplicadas"), poliédricas (incluyendo esféricas, ovoides, y en forma de limón), baciliformes (¡ncluyendo en forma de barra o bala, y fusiforme o en forma de cigarro), y helicoidales (incluyendo en forma de barra, cilindricas, y filamentosas); cualquiera de las cuales se puede poner en serie y/o puede contener las proyecciones superficiales, tal como púas y bolas. En una modalidad de la invención, la secuencia de aminoácidos de cápsida se selecciona de las cápsidas de los virus clasificados que tienen cualquier morfología. En una modalidad, la cápsida se deriva de un virus en forma de barra de la planta. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen que la cápsida es una cápsida viral en forma de barra derivada del grupo seleccionado del Virus Mosaico del Tabaco (TMV) y Virus de la Papa X (PVX). TMV consiste de un solo ARN genómico en sentido positivo (6.5 KB) sometido a cápsida con una proteína de revestimiento única capa (kDa 17.5) que da lugar a las partículas en forma de barra (300 nm). Una amplía gama de hospedadores del virus mosaico del tabaco permite que se utilice una variedad de especies de plantas como sistemas de producción y suministro. Se ha mostrado previamente que los genes extranjeros insertados en este vector pueden producir altos niveles de proteína. Yusibov y col. (1995) "High-affinity RNA-binding domains of alfalfa mosaic virus coat protein are not required for coat protein-mediated resistance," Proc. Nati. Acad. Sci. E.E.U.U. 92:8980-8984. Los virus de papa X son filamentosos, no cubiertos; comúnmente virus flexibles con una longitud modal clara de 515 nm y 13 nm de ancho. La estructura de cápsida forma una hélice básica con una inclinación de 3.4 nm. Varma A, Gibbs AJ, Woods RD, Finch JT (1968) "Some observations on the structure of the filamentous particles of several plant viruses," J Gen Virol. 2(1): 107-14. En otras modalidades, la proteína de cápsida se deriva de un virus de planta que no es TMV. En una modalidad, la cápsida tiene una morfología icosaédrica. Generalmente, las cápsidas virales de virus icosaédricos se componen de numerosas sub-unidades de proteína ubicadas en simetría (cúbica) icosaédrica. Las cápsidas icosaédricas nativas pueden estar compuestas, por ejemplo, por 3 subunidades que forman cada cara triangular de una cápsida, dando por resultado 60 subunidades que forman una cápsida completa. Es representativo de esta estructura viral pequeña por ejemplo el bacteriófago 0X174. Muchas cápsidas del virus icosaédrico contienen más de 60 subunidades. Muchas cápsidas de virus icosaédricos contienen un motivo de plegado de barril con ocho filamentos anti-paralelo. El motivo tiene un bloque en forma cuña con cuatro filamentos beta (designados como BIDG) en un lado y cuatro (designados como CHEF) en el otro. Hay también dos hélices alfa conservadas (designadas como A y B), una está entre betaC y betaD, la otra entre betaE y betaF. En una modalidad la especie icosaédrica del virus de planta será una especie de virus infeccioso a la planta que es un miembro de cualquier taxón de Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Luteoviridae, Nanoviridae, Partitiviridae, Sequiviridae, Tymoviridae, Ourmiavirus, Virus Satélite de Necrosis del Tabaco, Caulimoviridae, Geminiviridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, o Bromoviridae. En una modalidad, la especie icosaédrica del virus de planta es una especie infecciosa para la planta que es un miembro de cualquier taxón de Luteoviridae, Nanoviridae, Partitiviridae, Sequiviridae, Tymoviridae, Ourmiavirus, Virus Satélite de Necrosis del Tabaco, Caulimoviridae, Geminiviridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, o Bromoviridae. En las modalidades específicas, la especie icosaédrica del virus de planta es una especie de virus infeccioso para la planta que es un miembro de cualquiera de Caulimoviridae, Geminiviridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, o Bromoviridae. En otras modalidades la especie icosaédrica del virus de planta será una especie virus infeccioso para la planta que es un miembro de cualquiera de Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, o Bromoviridae. En las modalidades adicionales la cápsida se deriva de llarvirus o Alfamovirus. En las modalidades adicionales la cápsida se deriva de un virus de la raya del tabaco, virus mosaico de la alfalfa (AMV), o virus mosaico de bromo (BMV). En otras modalidades la especie del virus icosaédrico de la planta puede ser una especie de virus infeccioso para planta que es un miembro de la familia de Comoviridae o Bromoviridae. Las modalidades de la presente invención ¡ncluyen en donde la cápsida viral se deriva de un virus mosaico de guisante pinto (CPMV) o de un virus del moteado clorótico del guisante pinto (CCMV). Las modalidades de la presente invención incluyen en donde la proteína de cápsida utilizada en la presente invención se deriva de una proteína de cápsida de CCMV. Más específicamente, la proteína de cápsida se deriva de la secuencia de aminoácidos de cápsida de CCMV representada por la SEC ID NO: 11 (tabla 4). En otras modalidades la proteína de cápsída utilizada en la presente invención pueden ser la secuencia completa de aminoácidos de la proteína grande de cápsida de CCMV, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 11. La proteína de cápsida seleccionada puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de la proteína grande de cápsida de CCMV, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 11. En otras modalidades, la proteína de cápsida se puede alterar para mejorar las características del péptido de fusión de cápsida, tal como, pero sin limitarse a, expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, propiedades de unión covalente mejoradas, o plegamiento o re-integración mejorado. En otras modalidades, la proteína de cápsida utilizada en la presente invención se deriva de la proteína de cápsida pequeña de CPMV (Cápsida S de CPMV). Más específicamente, la proteína de cápsida se deriva de la secuencia de aminoácidos de cápsida S de CPMV representada por la SEC ID NO: 12 (tabla 4). En otras modalidades, la proteína de cápsida utilizada en la presente invención puede ser la secuencia completa de aminoácidos de la proteína de cápsida pequeña de CPMV, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 213 o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 12. La proteína de cápsida seleccionada puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ó 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de la proteína de cápsida pequeña de CPMV, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 213 o más aminoácidos seleccionados de SEC ID NO: 12. En otras modalidades, la proteína de cápsida se puede alterar para mejorar las características del péptido de fusión de cápsida, tal como, pero sin limitarse a, expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, propiedades de unión covalente mejoradas, o plegamiento o re-integración mejorados.

En otra modalidad, la proteína de cápsida utilizada en la presente invención se deriva de la proteína de cápsida grande de CPMV (Cápsida L CPMV). Más específicamente, la proteína de cápsida se deriva de secuencia de aminoácidos de cápsida L de CPMV representada por la SEC ID NO: 13 (tabla 4). En otras modalidades, la proteína de cápsida utilizada en la presente invención puede ser la secuencia completa de aminoácidos de la proteína de cápsida grande de CPMV, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 240, 250, 265, 275, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 374 o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 12. La proteína de cápsida seleccionada puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ó 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de la proteína de cápsida grande de CPMV, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 240, 250, 265, 275, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 250, 265, 275, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 374 ó más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 13. En otras modalidades, la proteína de cápsida se puede alterar para mejorar las características del péptido de fusión de cápsida, tal como, pero sin limitarse a, expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, propiedades de unión covalente mejoradas, o plegamiento o reintegración mejorados. Tabla 4: Secuencias de Aminoácidos y Nucleótidos de la Cápsida Viral de Planta. e. Generación del Péptido de Fusión de Cápsida Un ácido nucleico que codifica un péptido derivado de un virus de la influenza se fusiona de manera genética a un ácido nucleico que codifica una proteína viral de cápsida de la planta para producir un constructo capaz de ser expresado como un péptido de fusión recombinante. Los péptidos de cápsida recombinantes para el uso en la presente invención se pueden producir en los sistemas de expresión biológica que utilizan técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los constructos de ácido nucleico que codifican un péptido de fusión de una proteína de cápsida viral de planta unida de manera operable a por lo menos un péptido antigénico de la influenza pueden, se pueden introducir en una célula hospedadora y expresarse. Los elementos reguladores de transcripción y translación, tal como las secuencias mejoradoras de transcripción, secuencias mejoradores de translación, promotores, sitio de ingreso de ribosomas, incluyendo los sitios internos de ingreso de ribosomas, activadores, señales de de inicio y detenimiento de translación, finalizadores de transcripción, reguladores cistrónicos, reguladores policistrónicos, secuencias de etiquetas, tal como etiqueta secuencias que codifican el péptido de las "etiquetas" y "etiqueta" de la secuencia de nucleótidos, que facilita la identificación, separación, purificación, o aislamiento del péptido de fusión de proteína de cápsida recombinante expresado, que incluye la etiqueta His, etiqueta Flag, etiqueta T7, etiqueta S, etiqueta HSV, etiqueta B, etiqueta Strep, poliarginina, policisteína, polifenilalanina, ácido poliaspartico, (Ala-Trp-Trp-Pro)n, tiorredoxina, beta-galactosidasa, acetiltransferasa de cloranfenicol, gluconotransferasa de ciclomaltodextrina, CTP:CMP-3-deoxi-D-mano-octulosonato, trpE o trpLE, avidina, estreptavidina, gen 10 de T7, T4 gp55, proteína A de estafilococo, proteína G de estafilococo, GST, DHFR, CBP, MBP, dominio de unión de galactosa, dominio de unión de calmodulina, KSI, c-myc, ompT, ompA, pelB, NusA, ubiquitina, histamina hex, glutationa-S-transferasa, GFP, YFP, o análogos de tales proteínas fluorescentes, moléculas de anticuerpo, hemosilina A, o un antígeno o ligando conocido para un asociado de unión conocido útil para la purificación, se pueden incluir en la secuencia de ácido nucleico para la expresión en la célula hospedadora. La secuencia de codificación de ácido nucleico para el péptido o péptidos de la influenza se puede insertar en la secuencia de codificación del ácido nucleico para la proteína de cápsida viral en un sitio predeterminado. En una modalidad, el péptido de la influenza se inserta en la secuencia de codificación de cápsida para expresarse como un bucle durante la formación de un virus o partícula similar al virus. Los péptidos de la influenza se pueden insertar en más de un sitio de inserción en la cápsida de la planta. Así, los péptidos de la influenza se pueden insertar en más de un motivo del bucle superficial de una cápsida cuando los péptidos de fusión de cápsida se re-integran para formar un virus o partícula similar al virus. Alternativamente, los péptidos de la influenza también se pueden insertar en los sitios múltiples dentro de un motivo de bucle dado cuando los péptidos de fusión de cápsida se integran para formar un virus o partícula similar al virus. Además, los péptidos de la influenza se pueden insertar dentro de los bucles opuestos externo y/o dentro de bucles opuestos internos, es decir dentro de los bucles de la cápsida que son opuestos respectivamente hacia afuera o hacia el centro de la cápsida. Cualquier enlace aminoácido o péptido en un bucle superficial de una cápsida, puede servir como un sitio de inserción para el péptido de la influenza. Comúnmente, el sitio de inserción se puede seleccionar alrededor del centro del bucle, es decir alrededor de la posición localizada más lejos del centro de la estructura terciaria del péptido de cápsida plegado. La secuencia de codificación del péptido de la influenza se puede insertar de manera operable dentro de la posición de la secuencia de codificación de cápsida que corresponde a este centro aproximado de los bucles seleccionados cuando los péptidos de fusión de cápsida se integran para formar un virus o partícula similar al virus. Esto incluye la retención de la estructura de lectura para la porción de la secuencia de péptido de la cápsida que se sintetiza de manera descendente desde el sitio de inserción de péptido.

En otra modalidad, el péptido de la influenza se puede insertar en la terminal amino de la cápsida. El péptido de la influenza se puede ligar al cápsida a través de una o más secuencias del enlace. En aún otra modalidad, el péptido de la influenza se puede insertar en la terminal carboxi de la cápsida. El péptido de la influenza también se puede ligar a la terminal carboxi a través de uno o más enlaces, que se pueden dividir por hidrólisis química o enzimática. En una modalidad, las secuencias del péptido de la influenza se ligan en la terminal amino y carboxi, o en una terminal y en por lo menos una localización interna, tal como una localización que se exprese en la superficie de la cápsida en su ajuste tridimensional. En una modalidad, por lo menos un péptido antigénico de la influenza se expresa dentro de por lo menos un bucle interno, o en por lo menos un bucle superficial externo, cuando los péptidos de fusión de cápsida se integran para formar una partícula similar al virus.

Más de un bucle de la cápsida viral se puede modificar. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido antigénico de la influenza se' expone a por lo menos dos bucles superficiales cuando se integran como un virus o partícula similar al virus. En otra modalidad, por lo menos dos péptidos antigénicos de la influenza se insertan en una proteína de cápsida y se exponen en por lo menos dos bucles superficiales de cápsida viral, jaula, virus, o partícula similar al virus. En otra modalidad, por lo menos tres péptidos antigénicos de la influenza se insertan en la proteína de cápsida y se exponen en por lo menos tres bucles superficiales del virus o partícula similar al virus. Los péptidos de la influenza en los bucles superficiales pueden tener la misma secuencia de aminoácidos. En las modalidades separadas, puede ser diferente la secuencia de aminoácidos de los péptidos de la influenza en los bucles superficiales. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de cápsida viral también se puede modificar para alterar la formación de un virus o partícula similar al virus (ver por ejemplo Brumfleld, y col. (2004) J. Gen. Virol. 85: 1049-1053). Por ejemplo, tres clases generales de modificaciones son lo más comúnmente generadas para modificar la integración del virus o partícula similar al virus. Estas modificaciones se diseñan para alterar el interior, exterior o la interfaz entre las subunidades adyacentes en la jaula de proteína integrada. Para lograr esto, los cebadores mutagénicos se pueden utilizar para: (i) altera la carga superficial interior de la región de unión del ácido nucleico viral sustituyendo los residuos básicos (por ejemplo K, R) en el terminal N con los ácidos glutámicos ácidos (Douglas y col., 2002b); (ii) eliminar los residuos interiores de la terminal N (por ejemplo, en CCMV, generalmente los residuos 4-37); (iii) insertar un ADNc que codifique una secuencia de etiquetado celular del péptido de aminoácido 11 (Graf y col., 1987) en un bucle superficial expuesto; y (iv) modificar las interacciones entre las subunidades virales alterando los sitios de unión de metal (por ejemplo, en CCMV, residuos 81/148 mutantes). En una modalidad, el péptido antigénico de la influenza se puede insertar en la cápsida de un virus moteado clorótico del guisante pinto (CCMV). Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido de la influenza se puede insertar en el aminoácido 129 de la proteína de cápsida de CCMV en la SEC ID NO 11. En otra modalidad, la secuencia del péptido de la influenza se puede insertar en los aminoácidos 60, 61, 62 ó 63 de la proteína de cápsida de CCMV en SEC ID NO: 11. En aún otra modalidad, el péptido de la influenza se puede insertar el aminoácido 129 y aminoácidos 60-63 de de la proteína de cápsida CCMV en la SEC ID NO: 11. En una modalidad, un péptido de M2 seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID NO: 3, 22, 23, y 24, o derivado u homologo de la misma se inserta en la proteína de cápsida de CCMV. En una modalidad, el péptido antigénico de la influenza se puede insertar en la cápsida pequeña de un virus mosaico del guisante pinto (CPMV). Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido de la influenza se puede insertar entre el aminoácido 22 y 23 de la proteína de cápsida pequeña de CPMV (Cápsida S de CPMV) en la SEC ID NO: 12. En una modalidad, un péptido de M2 seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 3, 22, 23, y 24, o derivado u homólogo del mismo se inserta en la proteína de cápsida pequeña de CPMV. En una modalidad, el péptido antigénico de la influenza se puede insertar en la cápsida grande de un virus mosaico del guisante pinto (CPMV). Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido de la influenza se puede insertar en la proteína de cápsida grande de CPMV (L CPMV) en SEC ID NO: 13. En una modalidad, un péptido de M2 seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 3, 22, 23, y 24 o derivado u homólogo del mismo se inserta en la proteína de cápsida grande de CPMV. En una modalidad, también se puede incluir una secuencia de etiquetado adyacente al péptido antigénico de la influenza de interés, o ligada a una porción de la proteína de cápsida viral. En una modalidad, esta secuencia de etiquetado permite la purificación del péptido de fusión de cápsida recombinante. La secuencia de etiquetado puede ser una etiqueta de afinidad, tal como una etiqueta de afinidad de hexa-histidina. En otra modalidad, la etiqueta de afinidad puede ser una molécula de glutationa-S-transferasa. La etiqueta también puede ser una molécula fluorescente, tal como YFP o GFP, o análogos de tales proteínas fluorescentes. La etiqueta también puede ser una porción de una molécula de anticuerpo, o un antígeno o ligando conocido para un asociado de unión conocido útil para la purificación. La presente invención contempla el uso de un sistema de expresión biológica sintético o de cualquier tipo para producir los péptidos de cápsida recombinantes que contienen el péptido de influenza. Los métodos actuales de expresión de la proteína de cápsida incluyen los sistemas de expresión celular de insecto, sistemas bacterianos de expresión celular tal como E. coli, B. subtilus, y P. fluorescens, plantas y sistemas de expresión celualr de planta, sistemas de expresión de levadura tal como S. cervisiae y P. Pastoris, y sistemas mamíferos de expresión. En una modalidad, un constructo de ácido nucleico que codifica un péptido de fusión de cápsida se expresa en una célula hospedadora seleccionada de una célula de planta, incluyendo la planta completa y cultivos celulares de planta, o una célula de Pseudomonas fluorescens. En una modalidad, una constructo de ácido nucleico que codifica el péptido de fusión de cápsida se expresa en un planta hospedadora completa. En otras modalidades, un constructo de ácido nucleico que codifica el péptido de fusión de cápsida se expresa en un cultivo celular de planta. En aún otra modalidad, un constructo de ácido nucleico que codifica el péptido de fusión de cápsida se expresa en Pseudomonas fluorescens. Las técnicas para expresar los péptidos de fusión de cápsida en las células hospedadoras anteriores se describen en, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,874,087, Patente Norteamericana No. 5,958,422, Patente Norteamericana No. 6,110,466. Solicitud Norteamericana 11/001,626, y Solicitud Norteamericana 11/069,601 así como en los ejemplos posteriores. d. Integración de Virus o Partículas Similares al Virus Los péptidos de fusión de cápsída de la presente invención se pueden purificar a partir de una célula hospedadora e integrarse in vitro para formar las partículas similares al virus o estructuras de jaula, en donde la partícula similar al virus no contiene la membrana de plasma de la célula hospedadora. Una vez que el péptido de fusión de cápsida recombinante se exprese en una célula hospedadora, se puede aislar y purificarse a una pureza sustancial mediante las técnicas estándares bien conocidas en la técnica. La integración y las técnicas de purificación pueden depender de la célula hospedadora utilizada para producir los péptidos de fusión de cápsida. Tales técnicas pueden incluir, pero sin limitarse, PEG, precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de níquel, cromatografía de hidroxilapatito, cromatografía de fase inversa, cromatografía de lectina, electroforesis preparatoria, solubilidad de detergente, precipitación selectiva con sustancias tal como cromatografía en columna, métodos de inmunopurificación, cromatografía de exclusión de tamaño, métodos de inmunopurificación, centrifugación, ultracentrifugación, centrifugación de gradiente de densidad (por ejemplo, en un gradiente de sucrosa o cloruro de cesio (CsC1)), ultrafiltración a través de un filtro de exclusión del tamaño, y cualquier otro método de aislamiento de proteína conocido en la técnica. Por ejemplo, el péptido de fusión de proteína de cápsida que tiene las propiedades de adhesión molecular establecidas se puede fusionar de manera inversa a un ligando. Con el ligando apropiado, el péptido de fusión de proteína de cápsida se puede absorber selectivamente a una columna de purificación y después liberase de la columna en una forma relativamente pura. La proteína de cápsida entonces es eliminada mediante actividad enzimática. Además, el péptido de fusión de proteína de cápsida se puede purificar usando las columnas de inmunoafinidad o columnas de Ni-NTA. Las técnicas generales se describen adicionalmente en, por ejemplo, R. Scopes, Peptide Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag: N.Y. (1982); Deutscher, Guide to Peptide Purification, Academic Press (1990); Patente Norteamericana No. 4,511,503; S. Roe, Peptide Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, y col., Peptide Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra y col., Peptide Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000); y R. Mukhija, y col., Gene 165(2): p. 303-6 (1995). Ver también por ejemplo, Ausubel, y col. (1987 y complementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Peptide Purification," Methods in Enzymology vol. 182, y otros volúmenes en estas 30 series; Coligan, y col. (1996 y complementos periódicos) Current Protocols in Peptide Science Wiley/Greene, NY; y literatura del fabricante con respecto al uso de los productos de purificación del péptido, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, NJ., o Bio-Rad, Richmond, Calif. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a los segmentos apropiados, por ejemplo, a la secuencia FLAG o a un equivalente que se pueda fusionar vía una secuencia de proteasa eliminable. Ver también, por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Peptides with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principie and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; y Crowe, y col. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Peptide Purification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif. En otras modalidades, los péptidos de fusión de cápsida expresados en las células hospedadoras, especialmente células hospedadoras bacterianas, pueden formar los agregados insolubles ("cuerpos de inclusión"). Varios protocolos son convenientes para la purificación de péptidos de cuerpos de inclusión. Por ejemplo, la purificación de los cuerpos de inclusión comúnmente implica la extracción, separación y/o purificación de los cuerpos de inclusión por alteración de las células hospedadoras, por ejemplo, por incubación en un amortiguador de 50 mM TRIS/HCL pH 7.5, 50 mM NaCI, 5 mM MgCI2, 1 mM DTT, 0.1 mM ATP, y 1 mM PMSF. La suspensión celular comúnmente se sometió a lisinas usando 2-3 pasos a través de una Frech Press. La suspensión celular también se puede homogeneizar usando un Polytron (Brinknan Instruments) o un tratamiento de sonido en el hielo. Los métodos alternos de las bacterias de sometimiento a lisinas son evidentes a los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra; Ausubel y col., supra).

En caso de ser necesario, los cuerpos de inclusión pueden ser solubilizados, y la suspensión celular sometida a lisinas comúnmente se puede centrifugar para eliminar la materia insoluble indeseada. Los péptidos de fusión de cápsida que formaron los cuerpos de inclusión, se pueden re-naturalizar mediante dilución o diálisis con un amortiguador compatible. Los solventes convenientes incluyen, pero no se limitan a, urea (de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M), formamida (por lo menos aproximadamente 80%, volumen/base de volumen), y clorhidrato de guanidina (aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M). Aunque el clorhidrato de guanidina y agentes similares son desnaturalizantes, esta desnaturalización no es irreversible y la re-naturalización puede ocurrir durante la eliminación (por diálisis, por ejemplo) o dilución del desnaturalizante. Otros amortiguadores convenientes son conocidos por los expertos en la técnica. Alternativamente, es posible purificar los péptidos de fusión de cápsida recombinantes, la partícula similar al virus, o estructuras de jaula del periplasma del hospedador. Después de lisis de la célula hospedadora, cuando el péptido recombinante se exporta al periplasma de la célula hospedadora, la fracción periplásmica de las bacterias se puede aislar con un choque osmótico frío además de otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Para aislar los péptidos recombinantes del periplasma, por ejemplo, las células bacterianas se pueden centrifugar para formar un granulo. El granulo se puede suspender nuevamente en un amortiguador que contiene 20% sucrosa. Para someter a lisinas las células, las bacterias se pueden centrifugar y el granulo se puede suspender nuevamente en 5 mM de MgSO4 enfriado en hielo y mantenerse en un baño de hielo durante aproximadamente 10 minutos. La suspensión celular se puede centrifugar y el supernadante se decanta flotante y guarda. Los péptidos recombinante presentes en el supernadante se pueden separar de los péptidos del hospedador por técnicas estándares de separación bien conocidas por los expertos en la técnica. Un fraccionamiento de sal inicial puede separar muchos de los péptidos indeseados de la célula hospedadora (o péptidos derivados del medio de cultivo celular) de los péptidos de fusión de proteína de cápsida recombinantes de interés. Un ejemplo tal puede ser sulfato de amonio. El sulfato de amonio precipita los péptidos con eficacia reduciendo la cantidad de agua en la mezcla del péptido. Los péptidos entonces se precipitan en base a su solubilidad. Cuanto más hidrofóbico sea un péptido, más probable es que se precipite a concentraciones más bajas de sulfato de amonio. Un protocolo común incluye la adición de sulfato de amonio saturado a una solución de péptido a modo que la concentración resultante del sulfato de amonio esté entre 20-30%. Esta concentración precipitará al más hidrofóbico de los péptidos. El precipitado entonces se desecha (a menos que el péptido de interés sea hidrofóbico) y el sulfato de amonio se agrega al supernadante a una concentración conocida para precipitar el péptido de fusión de proteína de cápsida de interés. El precipitado entonces se solubiliza en el amortiguador y el exceso de sal se elimina en caso de ser necesario, a través de la diálisis o diafiltración. Otros métodos que se basan en la solubilidad de los péptidos, tal como la precipitación de etanol frió, son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden utilizar para fraccionar las mezclas complejas del péptido de fusión de proteína de cápsida. El peso molecular de un péptido de fusión de la proteína de cápsida recombinante se puede utilizar para aislarlo de los péptidos de mayor y menor tamaño usando la ultrafiltración a través de las membranas de diferente tamaño de poro (por ejemplo, membranas Amicon o Millipore). En primer lugar, la mezcla del péptido de fusión de proteína de cápsida se puede ultrafiltrar a través de una membrana con un tamaño de poro que tiene un corte de peso molecular más bajo que el peso molecular del péptido de fusión de cápsida recombinante de interés. Lo retenido por la ultrafiltración entonces se puede ultrafiltrar contra una membrana con un mayor corte de molecular que el peso molecular del péptido de fusión de la proteína de cápsida de interés. El péptido de fusión de proteína de cápsida recombinante pasará a través de la membrana en el filtrado. El filtrado entonces se puede someter a cromatografía según lo descrito abajo. Los péptidos de fusión de cápsida recombinantes también se pueden separar de otros péptidos en base a su tamaño, carga superficial neta, hidrofobicidad, y afinidad de los ligandos. Además, los anticuerpos producidos contra las proteínas de cápsida se pueden conjugar con las matrices de columna y las proteínas de cápsida inmunopurificadas. Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica. Será evidente a un experto que las técnicas cromatográficas se pueden realizar a cualquier escala y usando el equipo de muchos y diferentes fabricantes (por ejemplo, Pharmacia Biotech). La integración de la partícula similar al virus requiere que las proteínas de cápsida se plieguen correctamente. Sin embargo, los factores adicionales significativos para la formulación de VLP y la estabilidad pueden existir, incluyendo pH, fuerza iónica, enlaces disulfuro, unión catiónica divalente, entre otros. Ver, por ejemplo, Brady y col. (1977) "Dissocíation of polyoma virus by the chelation of calcium ions found associated with purified virions," J. Virol. 23(3):717-724; Gajardo y col., (1997) "Two proline residues are essential in the calcium binding activity of rotavirus VP7 outer capsid protein," J. Virol., 71:2211-2216; Walter y col., (1975) "Intermolecular disulfide bonds: an important structural feature of the polyoma virus capsid," Cold Spring Har. Symp. Quant. Biol., 39:255-257 (1975); Christansen y col., (1977) "Characterization of components released by alkali disruption of simian virus 40," J Virol., 21:1079-1084; Salunke y col., (1986) "Self-assembly of purified polyomavirus capsid protein VPl," Cell 46:895-904; Salunke y col., (1989) "Polymorphism in the assembly of polyomavirus capsid protein VP," Biophys. J., 56:887-900; Garcea y col., (1983) "Host range transforming gene of polyoma virus plays a role in virus assembly," Proc. Nati. Acad. Sci. E.E.U.U., 80:3613-3617; Xi y col., (1991) "Baculovirus expression of the human papillomavirus type 16 capsid proteins: detection of L1-L2 protein complexes," J. Gen. Virol., 72:2981-2988. Las técnicas que se pueden utilizar para la re-integración son bien conocidas en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, las técnicas según lo descrito en el ejemplo 6. Además, los péptidos de fusión de cápsida de la presente invención se pueden expresar en una célula hospedadora, e integrarse in vivo como un virus, partícula similar al virus, o estructuras de jaula, en donde el virus o partícula similar al virus no contiene la membrana de plasma de la célula hospedadora. En una modalidad, un virus, partícula similar al virus (VLP), o estructura de jaula se forma en la célula hospedadora durante o después de la expresión del péptido de fusión de cápsida. En una modalidad, el virus, partícula similar al virus, o jaula expone el péptido de la influenza en la superficie del virus o partícula similar al virus. En una modalidad, el virus, partícula similar al virus, o estructura de jaula está integrada como una integración multimérica de los péptidos de fusión de cápsida recombinantes, incluyendo de tres a aproximadamente 200 péptidos de fusión de cápsida. En una modalidad, el virus, partícula similar al virus, o estructura de jaula incluye por lo menos 30, por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 90 o por lo menos 120 péptidos de fusión de cápsida. En otra modalidad, cada virus, partícula similar al virus, o estructura de jaula incluye por lo menos 150 péptidos de fusión de cápsida, por lo menos 160, por lo menos 170, o por lo menos 180 péptidos de fusión de cápsida. En una modalidad, el virus o partícula similar al virus está integrado como una estructura ¡cosaédrica. En otra modalidad, la partícula similar al virus o virus está integrada en la misma geometría que el virus nativo del cual se deriva la secuencia de cápsida. En una modalidad separada, sin embargo, el virus o partícula similar al virus no tiene la geometría idéntica del virus nativo. En otras modalidades, por ejemplo, la estructura está montada en una partícula formada de péptidos de fusión de cápsida múltiples pero no forma una partícula de virus de tipo nativo. Por ejemplo, se puede formar una estructura de jaula de únicamente 3 cápsidas virales. En las modalidades separadas, se pueden formar las estructuras de jaula de aproximadamente 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, ó 60 cápsidas. La purificación de los virus de planta o partículas de virus de planta integrados in vivo se ha descrito previamente. Por ejemplo, ver Dijkstra, J. y De Jager, C.P., 1998; Matthews, R. E. F., 1991, Plant Virology, Third Edition, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, Publishers, y los ejemplos abajo. La mayoría de los virus pueden aislarse por una combinación de dos o más de los siguientes procedimientos: sedimentación de alta velocidad, fraccionamiento de gradiente de densidad, precipitación usando polietilenglicol, precipitación de sal, filtración por gel, cromatografía, y diálisis. Una vez que el virus o partícula similar al virus que contiene las células sea dividido y el contenido de la célula sea liberado y mezclado, el virus o partículas similares al virus se ponen en un ambiente que es anormal. Por lo tanto, frecuentemente es necesario utilizar un medio artificial diseñado para conservar el virus o partícula similar al virus en un estado intacto y sin agregar durante las varias etapas del aislamiento. Las condiciones que favorecen la estabilidad de las preparaciones purificadas de virus o partículas similares al virus, pueden ser diferentes de las necesitadas en los extractos crudos o preparaciones parcialmente purificadas. Por otra parte, diferentes factores pueden interactuar fuertemente en el grado al cual afectan la estabilidad del virus. Los factores principales que se considerarán que se desarrollan en un medio conveniente son: pH y sistema amortiguador, iones de metal y fuerza iónica, agentes de reducción y sustancias protectoras contra los compuestos fénolicos, aditivos que eliminan las proteínas y ribosomas de planta, enzimas y detergentes. Muchos virus son estables en un intervalo estrecho de pH, y el extracto se debe mantener dentro de este intervalo. La elección del amortiguador puede ser importante. Los amortiguadores de fosfato se han empleado frecuentemente, pero pueden tener efectos nocivos sobre algunos virus o partículas similares a los virus. Algunos virus o partículas similares a los virus requieren la presencia de iones bivalentes metálicos para la conservación de la integridad estructural. La fuerza iónica puede también ser importante. Los agentes de reducción se agregan con frecuencia a los medios de extracción. Estos materiales ayudan a la preservación del virus o partículas similares al virus que pierden fácilmente la capacidad de infección con la oxidación. También pueden reducir la adsorción de los componentes del hospedador al virus. Los materiales fenólicos pueden causar dificultades serias en el aislamiento y preservación del virus o partículas similares al virus. Varios métodos se han utilizado más o menos con éxito en para minimizar el efecto de los fenoles sobre el virus de la planta o partículas similares al virus durante el aislamiento. EDTA como la sal de sodio a 0.01 M en amortiguador de pH 7.4, causa la alteración de la mayoría de los ribosomas, previniendo su co-sedimentación con las partículas del virus. Esta sustancia se puede utilizar para los virus que no requieren los iones de metal divalentes para lograr la estabilidad. Las ribonucleasas, ribosoma, proteína 19 S, y el material en partículas verde de los cloroplastos fragmentados se pueden absorber fácilmente mediante la bentonita bajo cierta concentración de magnesio. El carbón se puede utilizar para absorber y eliminar los materiales del hospedador, particularmente los pigmentos. Las enzimas se pueden agregar al extracto inicial para varios propósitos. Por ejemplo, la pectinasa y la celulasa ayudan a la liberación del virus o partículas similares al virus que permanecerán de otra manera en la fracción de fibra. Las enzimas también digieren los materiales que de otra manera se co-precipitarán con el virus o partículas similares al virus. Tritón X-100 o Tween 80 se puede utilizar ocasionalmente en el medio de extracción inicial para ayudar a la liberación del virus o partículas similares al virus de componentes celulares insolubles. Los detergentes también pueden ayudar a la clarificación inicial del extracto de planta. Los detergentes no iónicos disocian las membranas celulares, los cuales pueden contaminar el virus o partículas similares al virus.

Una variedad de procedimientos se puede utilizar para descomponer u homogeneizar el virus o partículas similares al virus que contienen el tejido de planta. Éstos incluyen (i) una maja y mortero, (ii) varios mezcladores de alimentos de tipo lote y extractores de jugo, y (iii) molinos de rodillo, molinos coloidales, y máquinas para picar carne comerciales, que pueden confrontarse con kilogramos de tejido. Si se utiliza un medio de extracción, es frecuentemente necesario asegurar el contacto inmediato de las células divididas con el medio. El tejido homogeneizado se presiona generalmente a través de estopilla para separar el virus que contiene la savia de planta y el tejido de planta triturado. En el extracto crudo, los virus o partículas similares al virus se mezclan con una variedad de componentes celulares que están en el mismo intervalo amplio de tamaño que el virus o partículas similares al virus y que pueden tener características que son similares en algunos respectos. Estas partículas incluyen los ribosomas, la proteína 19 S de los cloroplastos, que tiene una tendencia a agregar, fitoferritina, fragmentos de la membrana, y fragmentos de cloroplastos divididos. También están presentes las células intactas, todas las proteínas solubles más pequeñas de la célula, y los solutos de bajo peso molecular. La primera etapa del aislamiento del virus se diseña generalmente para eliminar todo el material macromolecular del hospedador que sea posible, dejando el virus o partículas similares al virus en la solución. El medio de extracción se puede diseñar para precipitar los ribosomas y otros materiales de hospedador de altos peso molecular o para desintegrarlos. El extracto puede estar sujeto a un tratamiento tal como calentamiento, solventes orgánicos tal como cloroformo o n-butanol-cloroformo. El extracto tratado entonces se somete a la centrifugación a una velocidad bastante baja. Este tratamiento sedimenta los restos celulares y los materiales coagulados del hospedador. La centrifugación a velocidad alta durante un tiempo suficiente sedimentará el virus o las partículas similares al virus.

Esta es una etapa muy útil, pues sirve para el propósito doble de concentrar las partículas del virus y eliminar los materiales de bajo peso molecular. Ciertos virus de planta se precipitan de manera preferencial en un sistema de polietilenglicol monofásico (PEG), aunque un poco de ADN del hospedador también se puede precipitar. La precipitación con PEG es uno de los procedimientos más comunes usados en el aislamiento del virus o partículas similares al virus. Las condiciones exactas para la precipitación dependen del pH, fuerza iónica, y concentración de macromoléculas. Su aplicación en el aislamiento de cualquier virus particular es empírica. La ventaja principal de la precipitación de PEG es que no son requeridas las ultracentrifugadoras costosas, aunque la centrifugación diferencial se utiliza frecuentemente como una segunda etapa en los procedimientos de purificación. Muchos virus pueden formar granulos que son muy difíciles de suspender nuevamente. La centrifugación de gradiente de densidad ofrece la posibilidad de concentrar tal virus o partículas similares al virus sin la granulación y se utiliza en el procedimiento de aislamiento de muchos virus. Un tubo de centrifugadora se llena parcialmente con una solución que tiene una densidad disminuida de la parte inferior a la parte superior del tubo. Para los virus de planta, la sucrosa se utiliza comúnmente para formar el gradiente, y la solución del virus se cubre sobre la parte superior del gradiente. Con los gradientes formados con las sales de cesio, el virus o partículas similares al virus se pueden distribuir a través de la solución al comienzo de la sedimentación o se pueden cubrir sobre la parte superior del gradiente de densidad. Los gradientes de densidad se pueden utilizar de tres maneras: (i) centrifugación de gradiente isopícnico, (ii) sedimentación zonal de índice, y (iii) sedimentación zonal de equilibrio. Después de la centrifugación, las bandas de virus se pueden visualizar debido a sus características de dispersión de luz. La precipitación de sal también se utiliza comúnmente. El sulfato de amonio a concentraciones de hasta aproximadamente un tercio de la saturación es el utilizado más comúnmente, aunque muchas otras sales precipitarán el virus o partículas similares al virus. Después de reposar durante algunas horas o días, el virus o partículas similares al virus se centrifugan a una velocidad baja y se disuelven nuevamente a un volumen pequeño de un medio conveniente. Muchas proteínas tienen una solubilidad baja a o casi sus puntos isoeléctricos. La precipitación isoeléctrica se puede utilizar para el virus o partículas similares al virus que son estables bajo las condiciones implicadas. El precipitado es recolectado por centrifugación o filtración y es disuelto nuevamente en un medio conveniente. La diálisis a través de las membranas de celulosa se puede utilizar para eliminar los materiales de bajo peso molecular de un extracto inicial y para cambiar el medio. Se emplea más generalmente eliminar la sal después de la precipitación o cristalización de la sal, o después del fraccionamiento del gradiente de densidad en las soluciones de sal o sucrosa. Las preparaciones de virus o partículas similares al virus, se toman a través de una etapa de purificación y concentración, aún contendrán algunos materiales hospedadores de bajo y alto peso molecular. Más de éstos se pueden eliminar por las etapas adicionales de purificación. El procedimiento depende de la estabilidad del virus o virus partícula y de la escala de la preparación. A veces las preparaciones altamente purificadas se pueden obtener por el uso repetido del mismo procedimiento. Por ejemplo, una preparación se puede someter a las precipitaciones repetidas de PEG, o se pueden proporcionar varios ciclos de sedimentación de alta y baja velocidad. El último procedimiento conduce a la eliminación preferencial de las macromoléculas hospedadoras debido a que permanecen insolubles cuando los granulos de una sedimentación de alta velocidad se suspenden nuevamente. En términos generales, durante un aislamiento es útil aplicar por lo menos dos procedimientos que dependen de diferentes propiedades del virus o partículas similares al virus. Esto es probable que sea más efectivo eliminando los constituyentes hospedadores que en la aplicación repetida del mismo procedimiento. Uno de los procedimientos más útiles para la purificación adicional, particularmente del virus menos estable o partículas similares al virus, es la centrifugación de gradiente de densidad. La sucrosa es el material usado más comúnmente posible para elaborar el gradiente. La centrifugación de gradiente de densidad de sucrosa es frecuentemente el método de elección para la purificación adicional. Las soluciones fuertes de sales tal como cloruro de cesio también son materiales de gradiente efectivos para los virus que son suficientemente estables. El fraccionamiento sucesivo en dos diferentes gradientes ocasionalmente puede dar resultados útiles. La filtración a través de gel de agar o Sephadex puede ofrecer una etapa útil para la purificación posterior del virus o partículas similares al virus que son inestables a la granulación implicada en la centrifugación de alta velocidad. Los anticuerpos monoclonal anti-virus se pueden unir a una matriz de soporte tal como agarosa para formar una columna que una específicamente el virus de una solución pasada a través de la columna. El virus se puede eluir disminuyendo el pH. Los procedimientos cromatográficos se pueden utilizar para proporcionar una etapa efectiva de purificación para las preparaciones parcialmente purificadas. Por ejemplo, una columna de gel de fosfato de calcio en amortiguador de fosfato, una columna de celulosa, o la cromatografía líquida rápida de proteína se pueden utilizar para purificar varios virus.

En varias etapas en el aislamiento de un virus, es necesario concentrar el virus y eliminar las sales o sucrosa. La centrifugación de alta velocidad se utiliza comúnmente para la concentración del virus y para la reducción de la cantidad de material de bajo peso molecular. La diálisis se utiliza para eliminar o intercambiar las sales. //. Proteína Completa de la Influenza Antigénica o Fragmentos de Proteína La presente invención utiliza, en combinación con los péptidos de fusión de cápsida descritos anteriormente, los cuales contienen un péptido de la influenza, por lo menos una proteína antigénica aislada o fragmento de proteína, derivado, u homólogo de la misma, derivado de un virus de la influenza, incluyendo un virus de la influenza humana y/o aviar. En una modalidad, la proteína antigénica aislada o fragmento de proteína, derivado, u homólogo de la misma, se deriva de una cepa viral de la influenza aparecida recientemente. La proteína viral de la influenza o fragmento de proteína utilizado en la presente invención puede ser una proteína o fragmento de proteína derivado las proteínas M1, M2, HA, NA, NP, PB1, PB2, PA o NP2, derivado, u homólogo de las mismas, de una cepa viral de la influenza identificada. Se han identificado una gran cantidad de cepas de la influenza, y las secuencias de proteína correspondientes, y las secuencias están disponibles públicamente a través del sitio del National Center for Biotechnology Information (NCBI) Influenza Virus Resource, disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html.

En una modalidad de la presente invención, la proteína o fragmento de proteína derivado de un virus de la influenza se selecciona del grupo que consiste de las proteínas HA y NA o fragmentos de proteína. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen la proteína NA o fragmento de proteína que se deriva del grupo de proteínas NA de la influenza seleccionadas del grupo que consiste de los subtipos N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, y N9. En una modalidad, el péptido viral de la influenza es una proteína o fragmento de proteína derivado de una proteína NA de la influenza humana y/o aviar. En otras modalidades, la proteína antigénica viral de la influenza o fragmento de proteína se deriva de una proteína HA de la influenza. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen la proteína HA o fragmento de proteína derivados del grupo de proteínas HA de la influenza seleccionadas del grupo que consiste de los subtipos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, y H15. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el péptido de HA se deriva del grupo de proteínas HA de la influenza humana y/o aviar. En las modalidades adicionales el péptido de HA se puede derivar de una proteína HA de la influenza aviar. En una modalidad, la proteína HA aviar se selecciona de los subtipos H5, H7, y H9.

En una modalidad de la presente invención, la proteína antigénica aislada o fragmento de proteína se selecciona de una cepa de la influenza aparecida recientemente. La World Health Organization revisa los datos epidemiológicos de la influenza mundial dos veces anualmente, y actualiza periódicamente la identificación de cepas aparecidas recientemente de la influenza. La información genética útil en la derivación de las proteínas antigénicas aisladas o fragmentos de proteína para el uso en la presente invención, está disponible para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el Los Alamos National Laboratory mantiene una Influenza Sequence Datábase disponible en http://www-flu.lanl.gov/ que contiene la información genética relacionada a las cepas de la influenza aparecidas recientemente.

Las modalidades de la presente invención también incluyen en donde la proteína HA o fragmento de proteína en combinación con la partícula similar al virus se deriva de la secuencia del aminoácidos 568 de la cepa A/Thailand/3(SP-83)/2004 (H5N1) en la SEC ID NO: 15 (tabla 5), derivado, u homólogo de la misma, que es codificada por la secuencia de nucleótido SEC ID NO: 16 (tabla 5). En otras modalidades, la proteína del virus de la influenza utilizada en la presente invención puede ser la secuencia completa de aminoácidos de la proteína HA o fragmento de proteína de la cepa A/Thailand/3(SP-83)/2004 (H5N1), o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 565, 568 o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 15. La proteína del virus de la influenza seleccionada puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ó 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de la proteína HA o fragmento de proteína de la cepa A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5N1 ), o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 565, 568 o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 15, o un subconjunto de los mismos que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 15. En otras modalidades, la secuencia de la proteína de la influenza o del ácido nucleico se puede alterar para mejorar las características de la proteína, tal como, pero sin limitarse a, expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, o propiedades de unión covalente mejoradas. Alternativamente, la proteína HA o fragmento de proteína combinado con las partículas similares al virus, se deriva de la SEC ID NO: 17 (tabla 5). En otras modalidades, la proteína del virus de la influenza utilizada en la presente invención puede ser la secuencia completa de aminoácidos de la proteína HA o fragmento de proteína de la SEC ID NO: 17, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 530, 537, o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 17. La proteína del virus de la influenza seleccionada puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ó 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 17, o un subconjunto de los mismos que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 530, 537, o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 17. En otras modalidades, la secuencia de la proteína de la influenza o del ácido nucleico se puede alterar para mejorar las características de la proteína, por ejemplo, pero sin limitarse a, expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, o propiedades de unión covalente mejoradas. En otras modalidades el fragmento de proteína HA será el fragmento 36 kDa HA1 de la cepa A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5N1) (SEC ID NO: 18, tabla 5) codificado por la secuencia de nucleótido SEC ID NO: 19 (tabla 5). En otras modalidades, la proteína del virus de la influenza utilizada en la presente invención puede ser la secuencia completa de aminoácidos de la proteína HA o fragmento de proteína de la SEC ID NO: 18, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 350, 352, o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 18. La proteína del virus de la influenza seleccionada puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ó 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 18, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 350, 352, o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 18. En otras modalidades, la secuencia de la proteína de la influenza o ácido nucleico se puede alterar para mejorar las características de la proteína, por ejemplo, pero sin limitarse a, expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, o propiedades de unión covalente mejoradas. En otra modalidad el fragmento de proteína HA será el fragmento de HA2 de 26 kDa de la cepa A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5N1) (SEC ID NO: 20, tabla 5) codificado por la secuencia de nucleótido SEC ID NO: 21 (tabla 5). En otras modalidades, la proteína del virus de la influenza utilizada en la presente invención puede ser la secuencia completa de aminoácidos de la proteína HA o fragmento de proteína de la SEC ID NO: 20, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 20. La proteína del virus de la influenza seleccionada puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ó 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 20, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 20. En otras modalidades, la secuencia de la proteína de la influenza o de ácido nucleico se puede alterar para mejorar las características de la proteína, por ejemplo, pero sin limitarse a, expresión mejorada en el hospedador, inmunogenicidad mejorada, o propiedades de unión covalente mejoradas. En modalidades de la presente invención, la proteína HA o fragmento de proteína en combinación con la partícula similar al virus se deriva de la secuencia del aminoácidos 565 de la cepa A/Vietnam/CL20/2004(H5N1) en la SEC ID NO: 25 (tabla 5), derivado, u homólogo de la misma, que es codificado por la de secuencia de nucleótido SEC ID NO: 26-28 (tabla 5). En otras modalidades, la proteína del virus de la influenza utilizada en la presente invención pueden ser la secuencia completa de aminoácidos de la proteína HA o fragmento de proteína de la cepa A/V¡etnam/CL20/2004(H5N1 ), o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 565 o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 25. En una modalidad la proteína del virus de la influenza utilizada en la presente invención puede ser el fragmento de proteína HA de la cepa A/Vietnam/CL20/2004(H5N1) en la SEC ID NO: 29 (tabla 5) que carece de la señal de la terminal N nativa y el dominio de transmembrana de la terminal N y la cola citoplásmica. La proteína del virus de la influenza seleccionada puede ser por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ó 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de la proteína HA o fragmento de proteína de la cepa A/Vietnam/CL20/2004(H5N1 ), o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 565 o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 25 y de la SEC ID NO: 29, o un subconjunto de la misma que comprende por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o más aminoácidos seleccionados de la SEC ID NO: 25 y de la SEC ID NO: 29. En otras modalidades, la secuencia de la proteína de la influenza o del áci do nuclei co se puede alterar para mej orar l as características de la proteína, por ejemplo, pero si n li mitarse a, expresión mej orada en el hospedador, i nm unogeni ci dad mej orada , o propiedades de unión coval ente m ejoradas . Tabla 5: Secuencia de la Proteína HA y del Ácido Nucleico Secuencia Nombre SEC ID NO: MEKIVLLFANSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIM EKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRD CSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVN DLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSW SSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNWWLIKKNS TYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTK LYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQS GRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVK HA- SEC ID NO: KGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPF A/Thailand/3(SP- 15 HNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRER 83)/2004(H5N1) RRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHS NEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNT QFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTY NAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLR DNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDY PQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVAS SLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI Secuencia Nombre SEC ID NO: ATGGAGAAGATAGTTCTCTTGTTTGCCATCGTCAGT TTGGTCAAATCAGATCAGATTTGTATAGGATACCAT GCAAACAACAGTACCGAACAAGTTGACACAATCAT GGAGAAGAATGTAACAGTGACTCACGCCCAGGACA TTCTTGAGAAGACCCACAATGGCAAGCTTTGCGAC TTGGATGGTGTTAAGCCACTCATTCTTCGTGATTGT TCTGTGGCAGGTTGGCTTCTCGGAAACCCAATGTG TGACGAGTTCATCAACGTTCCAGAGTGGTCTTACA TCGTCGAGAAGGCAAACCCTGTGAATGATCTTTGC TACCCAGGAGACTTCAACGACTACGAGGAATTGAA ACATCTCTTGTCTAGGATCAACCACTTTGAGAAGAT TCAGATCATTCCTAAGTCCTCTTGGTCTTCACATGA GGCAAGCCTTGGTGTGTCATCCGCCTGCCCTTATC AAGGAAAGTCATCTTTCTTCAGAAATGTTGTGTGGC TTATCAAGAAGAACTCTACATATCCAACCATCAAGA GGAGCTACAACAACACAAACCAGGAAGATCTCTTG GTGCTCTGGGGAATTCATCATCCAAATGACGCAGC Secuencia de ácido AGAGCAAACTAAGCTTTACCAGAACCCTACAACTTA CATCTCCGTGGGCACTTCTACACTCAATCAGAGAC TTGTGCCAAGGATTGCTACTAGGTCAAAGGTTAAC nucleico optimizada GGACAATCAGGTCGTATGGAGTTCTTCTGGACAAT CTTGAAGCCAAACGATGCCATCAACTTCGAGTCAA con codón de SEC ID NO: ATGGAAACTTCATCGCTCCAGAGTACGCTTACAAG ATTGTGAAGAAAGGAGATAGTACCATCATGAAGTC planta HA- 16 TGAACTCGAGTACGGAAACTGCAACACCAAGTGTC AGACTCCAATGGGAGCTATCAATAGCTCTATGCCA A/Thailand/3(SP-rTTCACAACATTCACCCTTTGACAATAGGAGAATGC CCTAAGTACGTGAAGAGCAACAGGCTCGTCCTCGC 83)/2004(H5N1) AACTGGTTTGAGAAACAGTCCACAAAGAGAACGTA GACGTAAGAAGAGAGGATTGTTCGGTGCAATTGCC GGGTTCATCGAAGGAGGCTGGCAGGGTATGGTGG ATGGTTGGTATGGGTATCATCACAGTAATGAGCAA GGATCAGGATATGCTGCAGACAAAGAAAGCACCCA GAAAGCAATAGATGGAGTCACTAACAAAGTCAATT CCATAATCGACAAGATGAACACACAGTTCGAAGCT GTTGGACGTGAGTTCAACAACCTTGAGAGGAGGAT TGAGAATCTTAACAAGAAGATGGAAGATGGGTTCT TGGACGTGTGGACTTACAATGCTGAATTGTTAGTTC TTATGGAGAACGAAAGAACTCTCGACTTCCATGATT CTAACGTGAAGAACTTGTACGACAAGGTGCGTCTT CAACTTCGTGATAACGCTAAAGAGCTCGGGAACGG TTGCTTTGAGTTCTATCACAAGTGTGACAATGAGTG CATGGAATCTGTTAGAAATGGAACTTACGATTACCC TCAGTATTCAGAGGAGGCAAGGCTCAAGAGAGAAG AGATCTCCGGCGTGAAGTTGGAGAGCATTGGTATC TACCAACATCATCACCATCACCACTAA Secuencia Nombre SEC ID NO: ATGGAGAAGATAGTTCTCTTGTTTGCCATCGT CAGTTTGGTCAAATCAGATCAGATTTGTATAG GATACCATGCAAACAACAGTACCGAACAAGTT GACACAATCATGGAGAAGAATGTAACAGTGAC TCACGCCCAGGACATTCTTGAGAAGACCCACA ATGGCAAGCTTTGCGACTTGGATGGTGTTAAG CCACTCATTCTTCGTGATTGTTCTGTGGCAGG TTGGCTTCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAGT TCATCAACGTTCCAGAGTGGTCTTACATCGTC GAGAAGGCAAACCCTGTGAATGATCTTTGCTA CCCAGGAGACTTCAACGACTACGAGGAATTGA AACATCTCTTGTCTAGGATCAACCACTTTGAGA AGATTCAGATCATTCCTAAGTCCTCTTGGTCTT Optimizada con CACATGAGGCAAGCCTTGGTGTGTCATCCGC CTGCCCTTATCAAGGAAAGTCATCTTTCTTCAG codón de planta AAATGTTGTGTGGCTTATCAAGAAGAACTCTA SEC ID NO: HA1- CATATCCAACCATCAAGAGGAGCTACAACAAC 19 ACAAACCAGGAAGATCTCTTGGTGCTCTGGGG A/Thailand/3(SP- AATTCATCATCCAAATGACGCAGCAGAGCAAA 83)/2004(H5N1) CTAAGCTTTACCAGAACCCTACAACTTACATCT CCGTGGGCACTTCTACACTCAATCAGAGACTT GTGCCAAGGATTGCTACTAGGTCAAAGGTTAA CGGACAATCAGGTCGTATGGAGTTCTTCTGGA CAATCTTGAAGCCAAACGATGCCATCAACTTC GAGTCAAATGGAAACTTCATCGCTCCAGAGTA CGCTTACAAGATTGTGAAGAAAGGAGATAGTA CCATCATGAAGTCTGAACTCGAGTACGGAAAC TGCAACACCAAGTGTCAGACTCCAATGGGAGC TATCAATAGCTCTATGCCATTTCACAACATTCA CCCTTTGACAATAGGAGAATGCCCTAAGTACG TGAAGAGCAACAGGCTCGTCCTCGCAACTGG TTTGAGAAACAGTCCACAAAGAGAACGTAGAC GTAAGAAGAGACATCATCACCATCACCACTAA Secuencia Nombre SEC ID NO: MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTI MEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILR DCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPV NDLCYPGDFDDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSS WSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNWWLIKKN STYPTIKRSYNNTNQEDLLVMWGIHHPNDAAEQ TKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPATRSKVNGQS GRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVK HA-AA/ietnam/ SEC ID NO: KGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPF CL20/2004(H5N1) 25 HNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRER RRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHS NEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNT QFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTY NAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLR DNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDY PQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVAS SLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCR Secuencia Nombre SEC ID NO: GACTAGTAGGAGGTAACTTATGGAGAAAATCGTCCTG TTGTTTGCCATTGTCTCCCTGGTGAAGAGCGACCAGA TTTGCATCGGCTATCACGCGAACAATTCCACCGAACA AGTGGATACGATCATGGAGAAGAATGTGACCGTCACC CACGCTCAGGATATTCTGGAGAAGACGCATAACGGG AAACTCTGTGACTTGGATGGGGTTAAGCCGCTGATTC TGCGCGATTGTTCGGTGGCCGGCTGGCTGCTGGGCA ACCCAATGTGCGATGAATTTATCAACGTGCCCGAGTG GAGCTACATTGTCGAGAAGGCCAATCCCGTTAACGAC TTGTGCTACCCTGGTGATTTCGACGACTACGAAGAAC TGAAGCACCTGTTGTCCCGCATTAATCACTTCGAGAA AATCCAGATCATCCCGAAATCGAGCTGGAGCAGCCAT Optimizada con GAAGCCTCGCTCGGTGTGAGTTCCGCCTGTCCGTAC CAGGGCAAGTCGTCCTTCTTCCGTAACGTGGTGTGG CTGATTAAGAAGAACTCCACTTACCCGACCATTAAGC codón HA- GGAGCTACAACAACACCAACCAAGAAGACTTGTTGGT GATGTGGGGTATCCATCACCCCAACGACGCCGCCGA A? ietnam/CL20/ GCAAACCAAACTGTACCAGAATCCTACGACTTACATC TCGGTCGGCACCAGCACCCTGAACCAACGCTTGGTT 2004 (H5N1) que CCGCGCATCGCGACTCGCAGCAAAGTCAACGGCCAG AGTGGGCGTATGGAATTCTTTTGGACCATCCTGAAGC CAAACGATGCGATCAACTTCGAATCGAATGGCAACTT contiene los sitios CATTGCCCCGGAATACGCCTACAAGATCGTGAAGAAA SEC ID NO: GGGGACTCGACCATCATGAAGTCGGAGCTGGAATAC de restricción Spel GGCAACTGCAACACGAAATGCCAGACGCCGATGGGC 26 GCCATCAACTCCAGCATGCCGTTTCATAACATTCACC y Xho\ y el sitio de CATTGACTATCGGCGAATGCCCGAAATACGTCAAGTC CAATCGTCTGGTCCTGGCGACCGGTCTGCGCAACAG CCCGCAGCGCGAACGTCGCCGTAAGAAACGGGGCCT unión de ribosoma GTTCGGTGCCATCGCTGGCTTCATCGAGGGCGGCTG GCAGGGCATGGTCGACGGCTGGTATGGCTACCATCA para la expresión CAGCAACGAGCAGGGCAGTGGTTACGCCGCTGACAA GGAAAGCACCCAAAAGGCCATCGACGGCGTGACGAA en P. fluorescens CAAGGTGAACTCCATTATCGACAAGATGAACACGCAG TTCGAAGCCGTCGGCCGTGAGTTCAACAACCTGGAA CGCCGCATCGAAAACTTGAACAAGAAGATGGAAGAC GGTTTCTTGGACGTCTGGACCTATAATGCGGAATTGC TGGTTCTGATGGAAAACGAACGCACCCTGGACTTTCA TGACTCGAACGTGAAGAACCTGTATGATAAAGTCCGT CTGCAGCTGCGCGACAACGCCAAGGAACTGGGTAAC GGCTGCTTTGAATTTTACCATAAATGTGACAATGAGTG CATGGAAAGTGTGCGCAACGGCACCTATGATTATCCG CAGTACAGTGAAGAGGCACGTCTGAAGCGTGAGGAA ATTAGCGGCGTTAAATTGGAGAGCATCGGGATCTATC AGATCCTCAGCATCTACAGCACCGTGGCCAGCAGCTT GGCCCTGGCCATCATGGTCGCTGGCCTCTCGCTGTG GATGTGCAGCAACGGTTCCCTGCAGTGCCGCTGATA ATAGCTCGAGTT Secuencia Nombre SEC ID NO: GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGGAAAAGATTGTG CTGTTGTTCGCCATCGTGAGTCTGGTGAAATCGGA CCAAATCTGCATCGGCTACCACGCTAATAACAGCA CCGAACAAGTCGACACCATCATGGAGAAGAACGTC ACTGTGACGCATGCCCAAGATATCTTGGAAAAGAC CCATAACGGCAAGCTGTGCGACCTGGACGGTGTG AAGCCGTTGATCCTGCGCGACTGCTCCGTCGCGG GTTGGCTGTTGGGCAACCCGATGTGCGATGAGTTC ATTAACGTCCCGGAATGGAGCTATATCGTCGAGAA GGCGAATCCCGTCAACGACCTGTGTTACCCTGGC GATTTCGATGATTACGAAGAGCTGAAACATCTGCT GAGCCGCATCAACCACTTCGAGAAGATCCAAATCA TCCCGAAGAGCAGTTGGAGCAGCCACGAAGCCTC CCTGGGCGTTTCGTCGGCCTGCCCCTATCAGGGG AAGTCGTCCTTTTTCCGCAACGTGGTCTGGCTGAT Optimizada con CAAAAAGAACAGTACCTATCCTACTATCAAGCGCA GTTACAACAACACTAACCAAGAAGACCTGTTGGTC codón HA- ATGTGGGGCATTCATCATCCCAACGACGCGGCCG AGCAGACCAAGTTGTACCAGAACCCGACCACGTAT A? ietnam/CL20/ ATCAGCGTGGGGACGTCCACCCTCAATCAGCGTCT GGTGCCGCGCATCGCGACCCGTAGCAAGGTGAAC GGGCAGTCGGGCCGGATGGAGTTCTTTTGGACTAT 2004 (H5N1) que CCTGAAGCCGAACGACGCAATCAACTTCGAGTCGA ATGGTAACTTCATTGCCCCAGAGTATGCTTACAAGA contiene los sitios SEC ID NO: TCGTGAAAAAGGGCGACTCGACTATCATGAAGAGC GAACTGGAGTACGGGAACTGTAACACCAAATGTCA de restricción Spel 27 AACCCCGATGGGCGCAATCAACAGCTCGATGCCCT TCCATAATATCCATCCGCTGACCATTGGTGAGTGC y Xho\ y el sitio de CCGAAGTACGTCAAATCGAACCGGTTGGTGCTGGC CACTGGCCTCCGTAACTCGCCGCAGCGGGAACGT unión de ribosoma CGCCGTAAGAAACGCGGTTTGTTCGGCGCCATTGC AGGGTTCATCGAGGGCGGCTGGCAGGGCATGGTC GATGGTTGGTACGGGTACCACCACTCCAACGAACA para la expresión AGGCAGCGGCTACGCGGCGGATAAAGAAAGTACC CAGAAGGCTATCGACGGCGTCACCAACAAAGTGAA en P. fluorescens CAGCATCATCGATAAGATGAACACGCAGTTCGAAG CCGTGGGCCGTGAGTTCAACAACCTCGAACGGCG CATCGAGAACCTGAACAAAAAGATGGAAGATGGCT TCCTGGATGTCTGGACCTATAATGCCGAGCTGCTG GTGCTGATGGAAAACGAGCGTACCCTGGACTTTCA CGATTCGAATGTGAAGAATCTGTACGACAAAGTCC GGTTGCAGCTGCGCGACAACGCGAAAGAGCTGGG CAACGGCTGTTTCGAGTTCTACCATAAGTGCGACA ACGAGTGTATGGAGTCCGTGCGCAACGGCACGTA TGATTATCCTCAGTATTCCGAAGAGGCCCGCTTGA AACGTGAAGAAATCAGCGGCGTGAAGCTGGAGAG CATCGGCATCTATCAAATCTTGAGCATCTATAGCAC CGTGGCGTCGTCGCTGGCCCTCGCGATCATGGTT GCCGGCCTGAGCCTGTGGATGTGCAGCAACGGCT CGCTGCAATGCCGCTGATAATAGCTCGAGTT Secuencia Nombre SEC ID NO: GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGGAGAAAATCGTC CTGTTGTTTGCCATTGTCTCCCTGGTGAAGAGCGA CCAGATTTGCATCGGCTATCACGCGAACAATTCCA CCGAACAAGTGGATACGATCATGGAGAAGAATGTG ACCGTCACCCACGCTCAGGATATTCTGGAGAAGAC GCATAACGGGAAACTCTGTGACTTGGATGGGGTTA AGCCGCTGATTCTGCGCGATTGTTCGGTGGCCGG CTGGCTGCTGGGCAACCCAATGTGCGATGAATTTA TCAACGTGCCCGAGTGGAGCTACATTGTCGAGAAG GCCAATCCCGTTAACGACTTGTGCTACCCTGGTGA TTTCGACGACTACGAAGAACTGAAGCACCTGTTGT CCCGCATTAATCACTTCGAGAAAATCCAGATCATCC CGAAATCGAGCTGGAGCAGCCATGAAGCCTCGCT CGGTGTGAGTTCCGCCTGTCCGTACCAGGGCAAG TCGTCCTTCTTCCGTAACGTGGTGTGGCTGATTAA Optimizada con GAAGAACTCCACTTACCCGACCATTAAGCGGAGCT ACAACAACACCAACCAAGAAGACTTGTTGGTGATG codón HA- TGGGGTATCCATCACCCCAACGACGCCGCCGAGC AAACCAAACTGTACCAGAATCCTACGACTTACATCT CGGTCGGCACCAGCACCCTGAACCAACGCTTGGT AA ietnam/CL20/ TCCGCGCATCGCGACTCGCAGCAAAGTCAACGGC CAGAGTGGGCGTATGGAATTCTTTTGGACCATCCT 2004 (H5N1) que GAAGCCAAACGATGCGATCAACTTCGAATCGAATG GCAACTTCATTGCCCCGGAATACGCCTACAAGATC contiene los sitios SEC ID NO: GTGAAGAAAGGGGACTCGACCATCATGAAGTCGG AGCTGGAATACGGCAACTGCAACACGAAATGCCAG de restricción Spel 28 ACGCCGATGGGCGCCATCAACTCCAGCATGCCGT TTCATAACATTCACCCATTGACTATCGGCGAATGCC y Xho\ y el sitio de CGAAATACGTCAAGTCCAATCGTCTGGTCCTGGCG ACCGGTCTGCGCAACAGCCCGCAGCGCGAACGTC GCCGTAAGAAACGGGGCCTGTTCGGTGCCATCGC unión de ribosoma TGGCTTCATCGAGGGCGGCTGGCAGGGCATGGTC GACGGCTGGTATGGCTACCATCACAGCAACGAGC para la expresión AGGGCAGTGGTTACGCCGCTGACAAGGAAAGCAC CCAAAAGGCCATCGACGGCGTGACGAACAAGGTG en P. fluorescens AACTCCATTATCGACAAGATGAACACGCAGTTCGA AGCCGTCGGCCGTGAGTTCAACAACCTGGAACGC CGCATCGAAAACTTGAACAAGAAGATGGAAGACGG TTTCTTGGACGTCTGGACCTATAATGCGGAATTGCT GGTTCTGATGGAAAACGAACGCACCCTGGACTTTC ATGACTCGAACGTGAAGAACCTGTATGATAAAGTC CGTCTGCAGCTGCGCGACAACGCCAAGGAACTGG GTAACGGCTGCTTTGAATTTTACCATAAATGTGACA ATGAGTGCATGGAAAGTGTGCGCAACGGCACCTAT GATTATCCGCAGTACAGTGAAGAGGCACGTCTGAA GCGTGAGGAAATTAGCGGCGTTAAATTGGAGAGCA TCGGGATCTATCAGATCCTCAGCATCTACAGCACC GTGGCCAGCAGCTTGGCCCTGGCCATCATGGTCG CTGGCCTCTCGCTGTGGATGTGCAGCAACGGTTCC CTGCAGTGCCGCTGATAATAGCTCGAGTT En una modalidad, la partícula similar al virus que contiene el péptido de la influenza se combina por lo menos una proteína NA o fragmento de proteína derivado de un virus de la influenza, incluyendo un virus de la influenza humana o aviar, y por lo menos una proteína HA o fragmento de proteína derivado de un virus de la influenza, incluyendo un virus de la influenza humana o aviar. En una modalidad adicional, la partícula similares al virus que contiene el péptido de la influenza se combina con por lo menos una proteína NA o fragmento de proteína derivado de un virus de la influenza, por lo menos una proteína HA o fragmento de proteína derivado de un virus de la influenza, y cualquier combinación de las proteínas virales de la influenza o fragmentos de proteína, incluyendo las proteínas de la influenza humana y/o aviar o fragmentos de proteína, seleccionadas del grupo que consiste de M1, M2, NP, PB1, PB2, PA, y NP2, derivado u homólogo de las mismas. a. Producción de Proteínas Antigénicas o fragmentos de Proteína La presente invención contempla el uso de un sistema de expresión biológica sintético o de cualquiera tipo para producir las proteínas antigénicas de la influenza o fragmentos de proteína. Los métodos actuales de expresión de proteína incluyen los sistemas de expresión celular de insecto, sistemas bacterianos de expresión celular tal como E. coli, B. subtilus, y P. fluorescens, planta y sistemas de expresión de cultivo celular de planta, sistemas de expresión de la levadura tal como S. cervisiae y P. pastoris, y sistemas mamíferos de expresión. En una modalidad, la proteína o fragmento de proteína se expresa en una célula hospedadora seleccionada de una célula de planta, incluyendo plantas completas y cultivos celulares de planta, o una célula de Pseudomonas fluorescens. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen la proteína o fragmento de proteína expresado en una planta hospedadora completa. En modalidades adicionales la proteína o fragmento de proteína se expresa en un cultivo celular de la planta. Las técnicas para expresar la proteína recombinante o fragmentos de proteína en las células hospedadoras anteriores, son bien conocidas en la técnica. En una modalidad, los vectores virales de la planta se utilizan para expresar las proteínas de la influenza o fragmentos de proteína en las plantas completas o células de planta. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde el vector PVX se utiliza para expresar las proteínas HA o fragmentos de proteína en plantas Nicotiatta benthamiana. En otra modalidad el vector PVX se utiliza para expresar las proteínas HA o fragmentos de proteína en las células de planta NT1 del tabaco. Las técnicas para utilizar los vectores virales se describen en, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,885,248, Patente Norteamericana No. 5,173,410, Patente Norteamericana No. 5,500,360, Patente Norteamericana No. 5,602,242, Patente Norteamericana No. 5,804,439, Patente Norteamericana No. 5,627,060, Patente Norteamericana No. 5,466,788, Patente Norteamericana No. 5,670,353, Patente Norteamericana No. 5,633,447, y Patente Norteamericana No. 5,846,795, así como en los ejemplos 14 y 15 posteriores. En otras modalidades, las plantas transgénicas o cultivos celulares de planta se utilizan para expresar las proteínas HA o fragmentos de proteína. Los métodos utilizados para la expresión de proteínas o fragmentos de proteína en plantas transgénicas o células de planta, son bien conocidos en la técnica. En otras modalidades y en el ejemplo 18 y ejemplo 19, las proteínas HA o fragmentos de proteína se expresan en el citoplasma o periplasma de Pseudomonas fluorescens. Los métodos que se pueden utilizar para el aislamiento y purificación de la proteína de la influenza o fragmento de proteína expresada en una célula hospedadora son similares a, o iguales que, los descritos previamente en los ejemplos para el aislamiento del péptido de fusión de cápsida y para la purificación. ///. Combinación del Péptido de la Influenza que Contiene VLPs y Proteínas Antigénicas de la Influenza La presente invención proporciona las composiciones para el uso como vacunas contra el virus de la influenza, que comprenden i) por lo menos un péptido derivado de un virus de la influenza, en donde el péptido se fusiona a una proteína de cápsida derivada de un virus de planta que forma un péptido de fusión de cápsida recombinante, y en donde el péptido de fusión de cápsida recombinante es capaz de integrarse para formar un virus o partícula similar al virus, e ii) por lo menos una proteína antigénica o fragmento de proteína derivada de un virus de la influenza. En una modalidad de la presente invención, la proteína antigénica o fragmentos de proteína no están unidos o ligados de manera química a las partículas similares al virus. En otras modalidades, las proteínas antigénicas de la influenza o fragmentos de proteína se conjugan de manera química al virus o partícula similar al virus. Ver, por ejemplo, figuras 1 y 2. Las proteínas antigénicas de la influenza o fragmentos de proteína y las partículas similares al virus de la presente invención se pueden conjugar usando cualquier método de conjugación en la técnica. Ver por ejemplo Gillitzer E, Willits D, Young M, Douglas T. (2002) "Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation," Chem Commun (Camb) 20:2390-1; Wang Q, Kaltgrad E, Lin T, Johnson JE, Finn MG (2002) "Natural supramolecular building blocks. Wild-type cowpea mosaic virus," Chem Biol. 9(7):805-11; Wang Q, Lin T, Tang L, Johnson JE, Finn MG. (2002) "Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks," Angew Chem Int Ed Engl. 41 (3):459-62; Raja y col. (2003) "Hybrid virus-polymer materials. 1. Synthesis and properties of Peg-decorated cowpea mosaic virus," Biomacromolecules 4:472-476; Wang Q, Lin T, Johnson JE, Finn MG. (2002) "Natural supramolecular building blocks. Cysteine-added mutants of cowpea mosaic virus," Chem Biol. 9(7):813-9. Otros métodos para la conjugación pueden incluir, por ejemplo, usando 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sSMCC), éster de N-[e-maleimidocaproiloxij-sulfosuccinimida (sEMCS), éster de N-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), glutaraldehído, 1-etil-3-(3-dimethilaminopropil)carbodiimida (EDCl), Bis-diazobenzidina (BDB), o N-acetil homocisteína tiolactona (NAHT). En el método de activación de maleimida del portador, se logra la conjugación usando 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 -carboxilato de sulfosuccinimidilo (sSMCC), o éster de N-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) El método usando sSMCC se utiliza amplia y altamente específico (ver, por ejemplo, Meyer y col. 2002, J. de Virol. 76, 2150-2158). sSMCC retícula el grupo SH de un residuo de cisteína al grupo amino de un residuo de lisina en la proteína similar al virus. En la reacción de conjugación usando sSMCC, la partícula similar al virus primero se activa uniendo el reactivo de sSMCC a los residuos de amina (por ejemplo: lisina) del virus o partícula similar al virus. Después de la separación del virus activado o partícula similar al virus del reactivo y subproducto en exceso, se agrega el péptido que contiene cisteína y la unión ocurre por la adición del grupo SH a la función de maleimida el virus activado o partícula similar al virus. El método usando MBS, conjuga el péptido y el virus o partícula similar al virus a través de un mecanismo similar. La conjugación usando sSMCC puede ser altamente específica para los grupos SH. Así, los residuos de cisteína en la proteína antigénica de la influenza o fragmento de proteína son esenciales para la conjugación fácil. Si una proteína antigénica o fragmento de proteína no tiene un residuo de cisteína, un residuo de cisteína se puede agregar al péptido, preferiblemente en la terminal N o C. Si el epítope deseado en la proteína o fragmento de proteína contiene una cisteína, la conjugación se debe lograr con un método que no usa un virus activado por sSMCC o partícula similar al virus. Si la proteína o fragmento de proteína contiene más de un residuo de cisteína, la proteína o fragmento de proteína no se debe conjugar con el virus o partícula similar al virus usando sSMCC a menos que exceso de residuo de cisteína se pueda remplazar o modificar. El enlace no debe interferir con el epítope deseado en la proteína o fragmento de proteína. La cisteína se separa preferiblemente de la secuencia del epítope deseada con una distancia de por lo menos un aminoácido como separador. Otra conjugación útil en la presente invención se logra usando N-acetil homocisteína tiolactona (NAHT). Por ejemplo, las tiolactonas se pueden utilizar para introducir una funcionalidad de tiol al virus o partícula similar al virus para permitir la conjugación con péptidos sometidos a maleimidato o acetilados con bromo (Tolman y col. Int. J. Pepetide Protein Res. 41, 1993, 455-466; Conley y col. Vaccine 1994, 12, 445-451). En las modalidades adicionales de la invención, las reacciones de conjugación para acoplar la proteína o fragmento de proteína al virus o partícula similar al virus, implican introducir y/o usar los grupos nucleofílicos intrínsecos en un reactivo e introducir y/o usar grupos electrofílicos intrínsecos en el otro reactivo. Un esquema de activación sería introducir un grupo tiol nucleofílico al virus o partícula similar al virus y agregar los grupos electrofílicos (preferiblemente haluros de alquilo o maleimida) a la proteína de la influenza o fragmento de proteína.

La conjugación resultante tendrá enlaces de tiol éter que ligan la proteína o fragmento de proteína y el virus o partícula similar al virus. La reacción directa del grupo electrofílico de la proteína de la influenza o fragmento de proteína (haluro de alquilo o maleimida) y los grupos nucleofílicos intrínsecos (preferiblemente aminas primarias o tioles) del virus o partícula similar al virus, conducen a los enlaces de amina secundaria o enlaces tiol éter. Los esquemas alternativos implican agregar un grupo maleimida o haluro de alquilo al virus o partícula similar al virus e introducir una cisteína terminal a la proteína de la influenza o fragmento de proteína y/o usar los tíoles intrínsecos de proteína de la influenza nuevamente lo cual da lugar a los enlaces tiol éter. Un azufre que contiene el aminoácido contiene un grupo reactivo azufre. Los ejemplos de azufre que contienen los aminoácidos incluyen cisteína y aminoácidos sin proteínas tal como homocisteína. Adicionalmente, el azufre reactivo puede existir en una forma de disulfuro antes la activación y reacción con el virus o partícula similar al virus. Por ejemplo, las cisteínas presentes en las proteínas de la influenza o fragmentos de proteína se pueden utilizar en las reacciones de acoplamiento a un virus o partícula similar al virus activada con los grupos electrofílicos tal como maleimida o haluros de alquilo. Es común la introducción de los grupos maleimida usando los reticuladores que contienen la maleimida reactiva y esteres activados. Un enlace covalente que une una proteína de la influenza a una partícula similar al virus puede ser estable bajo condiciones fisiológicas. Los ejemplos de tales enlaces son agentes de reticulación no específicos, separadores monogenéticos y separadores bigenéricos. Los agentes de reticulación no específicos y su uso son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de tales reactivos y su uso incluyen la reacción con glutaraldehído; la reacción de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, con o sin la mezcla de un virus o partículas similares al virus sometida a succinas; oxidación de periodato de los sustituyentes glicosilados seguido por el acoplamiento a los grupos libres de amino de un virus o partícula similar al virus en la presencia de borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio; oxidación de periodato de serina terminal no acilada y residuos de treonina puede crear los aldehidos terminales que entonces se pueden hacer reaccionar con las aminas o hidrazidas que crean la base de Schiff o hidrazonas que se pueden reducir con cianoborohidruro a las aminas secundarias; sometimiento con diazo de grupos amino aromáticos seguido por el acoplamiento en los residuos de cadena lateral de tirosina de la proteína; reacción con isocianatos; o reacción de anhídridos mezclados. Ver, generalmente, Briand, y col., 1985 J. Imm. Meth. 78:59. Los separadores monogenéricos y su uso son bien conocidos en la técnica. Los separadores monogenéricos son bifuncionales y requieren la funcionalización de solamente uno de los asociados del par de reacción antes de que ocurra la conjugación. Los separadores bigenéricos y su uso son bien conocidos en la técnica. Se forman los separadores bigenéricos después de que cada asociado del par de reacción sea funcionalizado. La conjugación ocurre cuando cada asociado funcionalizado se hace reaccionar con su asociado opuesto para formar un enlace o enlaces covalentes estables. (Ver, por ejemplo, Marburg, y col., 1986 J. Am. Chem. Sot. 108:5282-5287, y Marburg, y col., Patente Norteamericana No. 4,695,624). Una ventaja de la presente invención es que se puede lograr varías relaciones molares de la proteína de la influenza el virus o partícula similar al virus en la conjugación. Esta 'carga de acoplamiento de péptido' en el virus o partícula similar al virus puede variarse alterando los aspectos del procedimiento de conjugación de una manera de ensayo y error para lograr un conjugado que tiene las propiedades deseadas. Por ejemplo, si una carga de acoplamiento alta se desea tales que cada sitio reactivo en el virus o partícula similar al virus sea conjugado a una proteína de la influenza o fragmento de proteína, se puede determinar los sitios reactivos en el virus o partícula similar al virus e incluye un exceso molar grande de la proteína de la influenza o fragmento de proteína en la reacción de acoplamiento. Si se desea una carga de acoplamiento de baja densidad, se puede incluir una relaciona molar de menos de 1 mol de la proteína de la influenza por mol de los sitios reactivos en el virus o partícula similar al virus. Las condiciones particulares elegidas serán dirigidas en última instancia por las producciones logradas, propiedades físicas del conjugado, potencia del conjugado resultante, población del paciente y dosificación deseada para administrarse.

Si la proteína total en la vacuna no es una consideración importante, se podría formular las dosis de los conjugados de diferentes cargas de acoplamiento y diferentes inmunogenicidades para suministrar la misma dosis efectiva. Sin embargo, si la proteína total o volumen es una consideración importante, por ejemplo, si el conjugado tiene el propósito de utilizarse en una vacuna de combinación, se puede considerar el volumen o proteína contribuida total por el conjugado a la vacuna de combinación final. Entonces se puede determinar la inmunogenicidad de varias conjugaciones que tienen cargas de acoplamiento diferentes y elegir después utilizar un conjugado con una inmunogenicidad adecuada y un nivel de proteína total o volumen aceptable para agregar a la vacuna de combinación. IV. Vacunas La presente invención proporciona las composiciones para el uso como vacunas contra el virus de la influenza. En una modalidad, las composiciones farmacéuticas que comprenden las composiciones de la presente invención se pueden preparar como sales acidas o básicas. Las sales farmacéuticamente aceptables (en forma de productos solubles o disipables de agua o aceite) incluyen sales no tóxicas convencionales o sales de amonio acostumbradas que se forman, por ejemplo, a partir de los ácidos inorgánicos u orgánicos o bases. Los ejemplos de tales sales incluyen las sales de adición de ácido tal como acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencensulfonato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanpropionato, digluconato, dodeciisulfato, etansulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hernisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, hidroyoduro de hidrobromuro, 2-hidroxiethanesulfonato, maleato de lactato, metansulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, pamoato de oxalato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, tartrato de succinato, tioeyanato, tosilato, y undecanoato; y sales básicas tal como sales de amonio, sales metálicas alcalinas tal como sales de sodio y potasio tal como, sales alcalinotérreas tal como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas tal como sales de dicicloheilamina, N-metM-D-glucamina, y sales con aminoácidos tal como arginina y lisina. En una modalidad de la presente invención, las composiciones de la presente invención se administran a un animal o paciente sin un adyuvante. En otras modalidades, las composiciones se administran con un adyuvante. Los adyuvantes basados en aluminio se utilizan en la técnica e incluyen comúnmente el fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, hidroxi-fosfato de aluminio y hirdoxi-sulfato-fosfato de aluminio. Los nombres comerciales de los adyuvantes en uso común incluyen ADJUPHOS, MERCK ALUM y ALHYDROGEL. La composición se puede unir a o co-precipitarse con el adyuvante según lo deseado y según se apropiado para el adyuvante particular usado. Los adyuvantes sin aluminio también se pueden utilizar. Los adyuvantes sin aluminio incluyen QS21, Lipid-A y derivados o variantes de los mismos, el adyuvante completo o incompleto de Freund, liposomas neutrales, liposomas que contienen la vacuna y citocinas o quimiocinas. Los adyuvantes adicionales incluyen los ácidos nucleicos inmuno-estimulantes, incluyendo las secuencias de CpG. Ver, por ejemplo, la figura 3. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar usando cualquier técnica utilizada actualmente en la técnica, incluyendo, por ejemplo, oral, mucosal, intravenosa, intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal o subcutáneamente. Las modalidades de la presente invención incluyen en donde la composición se suministra de manera mucosal a través de la nariz, boca, o piel. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen la composición suministrada de manera intranasal. En otras modalidades, la composición es administrada de manera oral digiriendo una célula hospedadora de planta de la cual composición fue producida. En otra modalidad, la composición se administra de manera transdérmica vía un parche. Los regímenes de dosificación convenientes se determinan preferiblemente considerando los factores bien conocidos en la técnica ¡ncluyendo la edad, peso, sexo y condición médica del sujeto; ruta de administración; efecto deseado; y la composición particular utilizada (por ejemplo, la proteína de la influenza, carga de proteína en el virus o partícula similar al virus, etc.). La vacuna se puede utilizar en formatos de vacunación multi-dosis. En una modalidad, una dosis consistiría del intervalo de aproximadamente 1 ug a aproximadamente 1.0 mg de proteína total. En otra modalidad de la presente invención el intervalo es de aproximadamente 0.01 mg a 1.0 mg. Sin embargo, se puede preferir ajustar la dosificación basada en la cantidad de péptido suministrada. En cualquier modalidad, estos intervalos son pautas. Las dosificaciones más exactas se pueden determinar determinando la inmunogenicidad del conjugado producido para suministrar una dosis inmunológicamente efectiva. Una dosis inmunológicamente efectiva es una que estimule el sistema inmunológico del paciente para establecer una respuesta inmunológica. Preferiblemente, el nivel del estímulo del sistema inmunológico será suficiente para desarrollar una memoria inmunológica suficiente para proporcionar la protección a largo tiempo contra la enfermedad causada por la infección con un virus de la influenza particular. La duración de las dosis depende de los factores bien conocidos en la técnica. Después de que la administración inicial una o más dosis de refuerzo se pueden administrar posteriormente para mantener los títulos del anticuerpo. Un ejemplo de un régimen de dosificación sería una dosis en 1 día, una segunda dosis en 1 ó 2 meses, una tercera dosis en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ó 12 meses o más de 12 meses, y las dosis de refuerzo adicionales en momentos distantes según sea necesario. La inmunorespuesta generado así, puede ser completa o parcialmente protectora contra la enfermedad y los síntomas debilitantes causados por la infección del virus de la influenza. VI. Métodos para Producir una Combinación de VLPs que Contienen el Péptido de la Influenza y las Proteínas Antigénicas de la Influenza En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una composición para el uso en una vacuna de la influenza en un humano o animal, que comprende: i) proporcionar un primer ácido nucleico que codifica un péptido de fusión de cápsida recombinante, que comprende una proteína de cápsida del virus de planta fusionada de manera genética a un péptido viral de la influenza seleccionado del grupo que consiste de M1, M2, HA, NA, NP, PB1, PB2, PA y NP2, y expresar el primer ácido nucleico en una célula hospedadora, en donde la célula hospedadora se selecciona de una célula de planta o célula de Pseudomonas fluorescens; ii) integrar los péptidos de fusión de cápsida para formar un virus o partícula similar al virus, en donde el virus o partícula similar al virus no contiene las proteínas de la pared de la membrana o la célula del plasma de la célula hospedadora; iii) proporcionar por lo menos un segundo ácido nucleico que codifica por lo menos una proteína antigénica o fragmento de proteína derivado de una variedad de virus de la influenza aparecidos recientemente, y expresar el segundo ácido nucleico en una célula hospedadora, en donde la célula hospedadora es una célula de planta o célula de Pseudomonas fluorescens, y opcionalmente en donde la variedad de virus de la influenza aparecido recientemente es identificada por la World Health Organization; e iv) aislar y purificar la proteína antigénica o fragmento de proteína; y v) combinar el virus o partícula similar al virus y la proteína antigénica o fragmento de proteína para formar una composición capaz de administrarse a un humano o animal. En una modalidad, el virus o partícula similar al virus se produce en un hospedador de planta, por ejemplo, en plantas completas o cultivos celulares de planta. En otras modalidades, la partícula similar al virus se produce en una célula hospedadora de Pseudomonas fluorescens. En una modalidad, la proteína antigénica o fragmento de proteína se produce en un hospedador de planta, por ejemplo, en plantas completas o cultivos celulares de planta. En otras modalidades, la proteína antigénica o fragmento de proteína se produce en una célula hospedadora de Pseudomonas fluorescens. En una modalidad, el virus o partícula de virus y la proteína antigénica o fragmento de proteína se co-producen en la misma célula hospedadora de planta o Pseudomonas fluorescens, y el péptido de fusión de cápsida se integra in vivo para formar el virus o partícula similar al virus.

Alternativamente, la proteína antigénica y las partículas similares al virus se producen en una célula hospedadora de de planta y/o Pseudomonas fluorescens, se aislan, y purifican, en donde el péptido de fusión de cápsida se integra in vivo o se re-integra in vitro para formar un partícula similar al virus y se combina con una proteína antigénica de la influenza o fragmento de proteína para formar una composición capaz de administrarse a un humano o animal. Ejemplos Ejemplo 1. Clonación del Epítope Universal M2-e del Virus de la influenza A en la Proteína Cubierta (CP) con el Virus Moteado Clorótico del Guisante Pinto (CCMV) Dos péptidos 23 AA derivados de una proteína M2 del virus de la influenza A: M2e-1 y M2e-2 fueron clonados independientemente en el gen CP CCMV que se expresará en las partículas similares al virus (VLPs) de CCMV. Secuencia del péptido M2e-1 : SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEC ID NO. 1) Secuencia del Péptido M2e-2: SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD (SEC ID NO. 2) Cada uno de los insertos fue sintetizado traslapando los oligonucleótidos de ADN con el programa de ciclo térmico detallado abajo: * (de Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, E.E.U.U., de aquí en adelante "Invitrogen") Los oligonucleótidos utilizados incluyen: M2e-1F 5'CGG GGATCC TGT CAC TCT TGA CAG AGG TAGAAA CAC CGA TAC GTA ATGAAT GG3' (SEC ID NO.14) M2e-1R 5'CGC AGG ATC CCA TCT GAA GAA TCA TTA CAA CGA CAG CCC CAT TCA TTA CGT ATC3' (SEC ID NO.30) M2e-2F 5'CGG GGA TCC TGT CAC TCT TGA CAG AGG TAG AAA CAC CGA TAC GTA ATG AAT GG3' (SEC ID NO: 31) M2e-2R 5'CGC AGG ATC CCA TCT GAA GAG CCA TTA CAA CGA CAT TCC CAT TCA TTA CG3' (SEC ID NO: 32) Los productos de PCR resultantes fueron digeridos con la enzima de restricción BamH\ y se sub-clonaron en el vector de transporte pESC-CCMV129 con BamH\ y después se defosforilaron. Las secuencias de codificación de los genes quiméricos de CCMV-CP entonces fueron secuenciadas para asegurar la orientación de la secuencia del péptido insertada y la integridad del gen modificado de CP. Los genes quiméricos de la proteína cubierta entonces fueron eliminados de plásmido de transporte en Spel y Xho\ y se sub-clonaron en el plásmido de expresión pDOW1803 de Pseudomonas fluorescens en Spel y Xho\. Los plásmidos resultantes entonces fueron transformados por electroporación en el electro-competentes MB214 P. fluorescens con 15 ug/ml de tetraciclina como el agente de selección. Ejemplo 2. Clonación de los Epitomes del Virus de la Influenza A en la Proteína Cubierta (CP) con el Virus Moteado Clorótico del Guisante Pinto (CCMV) Dos péptidos derivados de una proteína NP del virus de la influenza A: NP55-69 y NP 147-158, se clonaron independientemente en el gen CP CCMV que se expresará en las partículas similares al virus (VLPs) de CCMV. Secuencia del Péptido NP55-69: RLIQNSLTIERMVLS (SEC ID NO. 9) Secuencia del Péptido NP147-158: TYQRTRALVRTG (SEC ID NO: 10) Cada uno de los insertos fue sintetizado traslapando los oligonucleótidos de ADN con el programa de ciclo térmico según lo detallado en el ejemplo 1. Los oligonucleótidos incluyen: NP55-69F 5'GATCCTGCGCCTGATCCAGAACAGCCTGACCATCGAACGC ATGGTGCTGAGCGG3' (SEC ID NO: 33) NP55-69R 5'GATCCCGCTCAGCACCATGCGTTCGATGGTCAGGCTGTTC TGGATCAGGCGCAG3' (SEC ID NO: 34) NP147-158F 5'GATCCTGACCTACCAGCGCACCCGCGCTCTGGTGCGCAC CGGCGG3' (SEC ID NO: 35) NP147-158R 5'GATCCCGCCGGTGCGCACCAGAGCGCGGGTGCGCTGGTA GGTCAG3' (SEC ID NO: 36) Los productos de PCR resultantes fueron digeridos con la enzima de restricción BamH\ y se sub-clonaron en el vector de transporte pESC-CCMV129 con BamH\ y después se defosforilaron. Las secuencias de codificación de los genes quiméricos de CCMV-CP entonces fueron secuenciadas para asegurar la orientación de la secuencia del péptido insertada y la integridad del gen modificado de CP. Los genes quiméricos de la proteína cubierta entonces fueron eliminados de plásmido de transporte en Spel y Xho\ y se sub-clonaron en el plásmido de expresión pDOW1803 de Pseudomonas fluorescens en Spel y Xho\. Los plásmidos resultantes entonces fueron transformados por electroporación en el electro-competentes MB214 P. fluorescens con 15 ug/ml de tetraciclina como el agente de selección. Ejemplo 3. Clonación del Epítope HA del Virus de la influenza A en la Proteína Cubierta (CP) con el Virus Moteado Clorótico del Guisante Pinto (CCMV) Un péptido derivado de una proteína HA del virus de la influenza A, HA 91-108 se clonó independientemente en el el gen de CP CCMV que se expresará en partículas similares al virus (VLPs) de CCMV.

Secuencia del Péptido HA91-108: SKAFSNCIPYDVPDYASL (SEC ID NO: 7) Los insertos fueron sintetizados traslapando los oligonucleótidos de ADN con el programa de ciclo térmico según 5 lo detallado en el ejemplo 1. Los oligonucleótidos incluyen: HA91-108F 5'GATCCTGAGCAAGGCTTTCAGCAACTGCTACCCGTACGAC GTGCCGGACTACGCTAGCCTGGG3' (SEC ID NO: 37) l? HA91-108R 5'GATCCCCAGGCTAGCGTAGTCCGGCACGTCGTACGGGTA GCAGTTGCTGAAAGCCTTGCTCAG3' (SEC ID NO: 38) Los productos de PCR resultantes fueron digeridos con la enzima de restricción BamH\ y se sub-clonaron en el vector de I5 transporte pESC-CCMV129 con BamH\ y después se defosforilaron. Las secuencias de codificación de los genes quiméricos de CCMV-CP entonces fueron secuenciadas para asegurar la orientación de la secuencia del péptido insertada y la integridad del gen modificado de CP. Los genes quiméricos de la 0 proteína cubierta entonces fueron eliminados de plásmido de transporte en Spel y Xho\ y se sub-clonaron en el plásmido de expresión pDOW1803 de Pseudomonas fluorescens en Spel y Xho\. Los plásmidos resultantes entonces fueron transformados por electroporación en el electro-competentes MB214 P. 5 fluorescens con 15 ug/ml de tetraciclina como el agente de selección. Ejemplo 4. Expresión de los Péptidos de Fusión de Cápsida Recombinantes de CCMV Los plásmidos de expresión de péptido de fusión de CCMV129 fueron transformados en células hospedadoras de MB214 de Pseudomonas fluorescens de acuerdo al siguiente protocolo. Las células hospedadoras fueron descongeladas gradualmente en los frascos mantenidos en el hielo. Para cada transformación, 1 µl de ADN de plásmido de expresión purificado fue agregado a las células hospedadoras y la mezcla resultante fue agitada suavemente con una pipeta para mezclar, y después fue incubada en hielo durante 30 minutos. La mezcla fue transferida a los tubos desechables de electroporación (BioRad Gene Pulser Cuvette, orificio de electrodo de 0.2 cm, Cat No. 165-2086). Los tubos fueron colocados en un Biorad Gene Pulser preestablecido a 200 Ohms, 25 µfaradios, 2.25 kV. Las células fueron células pulsadas brevemente (aproximadamente 1-2 seg). El medio LB frió entonces fue agregado inmediatamente y la suspensión resultante fue incubada a 30°C durante 2 horas. Las células entonces fueron colocadas en placas en agar LB tetl 5 (medio de LB complementado con tetraciclina) y se desarrollaron a 30°C durante la noche. Una colonia fue seleccionada de cada placa y la muestra seleccionada fue inoculada en 50 ml de cultivo de sembrado de LB en un matraz de agitación con deflector. Los cultivos de suspensión de líquido fueron desarrollados durante la noche a 30°C con 250 rpm da agitación. 10 ml de cada cultivo de sembrado resultante entonces fue utilizado para inocular 200 ml de medio del matraz de agitación (es decir, extractos de levadura y sal con los elementos de rastreo, citrato de sodio, y glicerol, pH 6.8) en un matraz de agitación con deflector de 1 litro. La tetraciclina fue agregada para la selección. Los cultivos inoculados fueron desarrollados durante la noche a 30CC con 250 rpm de agitación y se indujeron con IPTG para la expresión de las proteínas quiméricas cubiertas del péptido de fusión de CCMV129. 1 ml de alícuotas de cada cultivo del matraz de agitación entonces se centrifugó para granular las células. Los granulos celulares fueron suspendidos nuevamente en 0.75 ml de 50 mM Tris-HCl frió, pH 8.2, que contiene 2 mM EDTA. 0.1% volumen de 10% detergente TritonX-100 entonces fue agregado, seguido por una adición de lisozima a la concentración final de 0.2 mg/ml. Las células entonces fueron incubadas en hielo durante 2 horas, en tal momento debe ser evidente un lisado celular claro y viscoso. A los lisados, 1/200 volumen 1M MgCI2 fue agregado, seguido por una adición de 1/200 volumen 2 mg/ml DNase I, y después la incubación en hielo durante 1 hora, en tal momento en el lisado debe haberse convertido en un líquido mucho menos viscoso. Los lisados tratados entonces se hicieron girar durante 30 minutos a 4°C a una velocidad máxima en una centrifuga de mesa y los supernadante fueron decantados en los tubos limpios. Los supernadante decantados son las fracciones de proteína "solubles". Los granulos restantes entonces fueron suspendidos nuevamente en 0.75 ml de amortiguador de TE (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA). Los granulos suspendidos nuevamente son las fracciones "insolubles". Ejemplo 5. Análisis de los Péptidos de Fusión de Cápsida de CCMV Recombinantes Las fracciones "solubles" e "msolubles" fueron sometidas a electroforesis en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (de Invitrogen, Cat NP0323), que tiene 1.0 mm x 15 pozos, de acuerdo a la especificación del fabricante. 5 µl de cada fracción fue combinado con 5 µl de 2x amortiguador de carga de reducción SDS-PAGE, y estuvieron en ebullición durante 5 minutos antes del funcionamiento en gel. Los geles fueron manchados con la SirnplyBlue Safe Stain, (Invitrogen, Cat LC6060) y desmanchados durante la noche con agua. La figura 4 muestra la expresión de CCMV 129 CP fusionada al péptido del virus de la influenza M2e-1 en Psedomonas fluorescens según lo detectado por el manchado SDS-PAGE por SirnplyBlue Safe Stain (Invitrogen). La figura 5 muestra la expresión CCMV129 CP fusionada con el péptido del virus de la influenza M2e-2 en Psedomonas fluorescens según lo detectado por manchado SDS-PAGE por SirnplyBlue Safe Stain (Invitrogen). La figura 6 muestra la expresión de CCMV129 CP fusionada con el péptido del virus de la influenza NP55-69 en Psedomonas fluorescens según lo detectado por el manchado SDS-PAGE por SirnplyBlue Safe Stain (Invitrogen). La figura 7 muestra la expresión de CCMV129 CP fusionada con el péptido del virus de la influenza NP147-158 en Psedomonas fluorescens según lo detectado por el manchado SDS-PAGE por SirnplyBlue Safe Stain (Invitrogen). La figura 8 muestra la expresión de CCMV129 CP fusionada con el péptido del virus de la influenza HA91-108 en Psedomonas fluorescens según lo detectado por el manchado SDS-PAGE por SimpIyBlue Safe Stain (Invitrogen). Ejemplo 6. Purificación de VLPs recombinantes de CCMV El protocolo usado para purificara VLPs quiméricas de CCMV comprende las siguientes etapas: (1) lisis celular, (2) lavado y separación del cuerpo de inclusión (IB), (3) solubilidad de IB, (4) eliminación del contaminante de la proteína de choque térmico (HSP), (5) eliminación de endotoxina, (6) re-naturalización de la proteína cubierta, (7) clarificación, (8) integración de VLP, (9) intercambio de amortiguador en PBS, pH 7.0. y (10) filtración estéril. Fueron utilizados los siguientes amortiguadores: a. amortiguador de lisis - 100 mM NaCI/5mM EDTA/ 0.1-0.2 mM PMSF/50 mM Tris, pH 7.5 b. Amortiguador AU-fuerza iónica baja-8M urea/1 mM DTT/20 mM Tris, pH 7.5 c. Amortiguador B con/ 8M urea - 1M NaCI/8M urea/1 mM DTT/20 mM Tris, pH 7.5 d. Solución de CIP - 0.5N NaOH/2M NaCI e. Solución de preparación de columna - 100 mM Tris , pH 7.5 f. Solución de almacenamiento - 20% EtOH g. Amortiguador B - 1M NaCI/1 mM DTT/20 mM Tris, pH 7.5 h. Mustang E (Pall, cat. # MSTG25E3)-amortiguador de integración de virus filtrado - 0.1 NaOAc, pH 4.8, 0.1 M NaCI, 0.0002 M PMSF i. Mustang E-PBS filtrado pH 7.0 j. 15-20 g de la pasta celular húmeda de P. fluorescens fue medida en un tubo cónico de 50 ml y el amortiguador de lisis fue agregado a un volumen total de 40 ml. La solución de la pasta celular fue sometida a vórtice y se agitó hasta que sea un poco homogénea. Las células lisadas con dos pasos sobre una Frech Press en 1280 psi usando alta velocidad. El lisado (~33 ml) se hizo girar a 10000xG durante 10 minutos a 4°C. El supernadante fue desechado. El granulo fue presionado y se obtuvo una consistencia polvorienta, de color ligero y distinta de la pasta celular. 4-5 ml del amortiguador de lisis fueron agregados al granulo y la solución fue sometida a vórtice y se agitó con una espátula hasta que el granulo se disolvió. El amortiguador de lisis fue agregado a un volumen total de 40 ml. La muestra fue sometida a vórtice hasta que el granulo se disolvió. La muestra se hizo girar a 10000xG durante 10 minutos a 4°C. El lavado de IB fue repetido por lo menos una más vez con el amortiguador de lisis y una vez al final usando agua DI. IBs fueron disueltos en 4-5 ml de 8M urea/1 mM DTT/20 mM Tris, pH 7.5 por vórtice. El volumen de la solución de IB fue ajustado a 40 ml con 8M urea/1 mM DTT/20 mM Tris, pH 7.5. La solución fue tratada con sonido durante 15 minutos en un sonicador de baño enfriado si es necesario y se agitó durante la noche a 4°C seguido por la clarificación (giradnos durante 10 minutos en 1000OxG a 4°C o por filtración con 0.45 um Whatman GDIX, cat # 6976-2504). La columna Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) fue equilibrada usando 10 volúmenes de columna Amortiguador AU-fuerza iónica baja-8M urea/1 mM DTT/20 mM Tris, pH 7.5 (AU-Low). 8 ml de solución de IB fueron cargados por ml de resina y 2 ml de fracciones de flujo (FT) fueron recolectados. La columna fue lavada con 6 CV usando el amortiguador AU-Low y eluida con 5 CV 5 del amortiguador B con 8M urea. La columna fue limpiada y regenerada usando la solución de 6 CV CIP y se almacenó en 20% ETOH. La proteína cubierta de CCMV con el contaminante de HSP eliminado fue encontrada en las fracciones FT que fueron agrupadas. La membrana de filtro Sartobind Q15X o Q100X (Sartorius) fue equilibrada con 10ml amortiguador AU-Low. La solución de IB fue filtrada a través del filtro y el filtrado fue clarificado. La solución filtrada fue agregada al recipiente con 5x volumen del amortiguador B y se mezcló inmediatamente. La solución diluida fue permitida para mezclar a 4°C durante varios minutos y después se díalizó contra el amortiguador B usando una membrana de 3,500 Da a 4°C durante la noche mientras que se agitó lentamente. El amortiguador fue cambiado por lo menos una vez. Después de la diálisis, la solución fue clarificada en caso de ser necesario. La solución de proteína re-naturalizada fue dializada en el amortiguador de integración de virus durante 12 horas y se clarificó por centrifugación o filtración de 0.2 µm. La solución de VLP re-integrada fue concentrada en amortiguador de integración de virus sobre una membrana 300 kDa y se intercambió en PBS, pH 7.0 usando 3 intercambios del amortiguador. La filtración estéril final fue a través de un filtro de 0.2 µm. Ejemplo 7. Análisis de VLPs purificadas recombinantes de CCMV Las VLPs purificadas fueron sometidas a electroforesis en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen, cat NP0323), que tienen 1.0 mm x 15 pozos, de acuerdo a la especificación del fabricante. 5 µl de muestra fue combinada con 5 µl 2x reduciendo el amortiguador de carga de SDS-PAGE, y se sometió a ebullición durante 5 minutos antes de la ejecución en gel. Los geles fueron manchados con SirnplyBlue Safe Stain, (Invitrogen, cat LC6060) y se desmancho durante la noche con agua. La detección por Western Blot utilizó anti-CCMV IgG (No.de acceso AS0011 de DSMZ, Alemania, la proteína A M2 anti-lnfluenza (lgG1 kappa monoclonal de ratón, cat #: MA1-082) de ABR (Affinity BioReagents) como anticuerpos primarios, y el kit WESTERN BREEZE (Invitrogen, cat WB7105), siguiendo los protocolos del fabricante. La figura 9 muestra la expresión y detección de CCMV 129 CP purificada fusionada con el péptido del virus de la influenza M2e-1 en Psedomonas fluorescens según lo detectado por el manchado SDS-PAGE por SirnplyBlue Safe Stain (Invitrogen). La figura 10 muestra la expresión de CCMV129 CP fusionada con el péptido del virus de la influenza M2e-1 en Psedomonas fluorescens según lo detectado por Western Blott con anticuerpos anti-CCMV y anti-M2. El péptido de M2e es reconocido por anti-M2.

Ejemplo 8. Clonación del Epítope Universal M2-e del Virus de la influenza A en la Proteína Cubierta (CP) con el Virus Moteado Clorótico del Guisante Pinto (CCMV) Un péptido M2e-3 derivado de una proteína M2 del virus de la influenza A fue clonado independientemente en el gene de CP pequeña de CPMV que se expresará en las partículas del virus CPMV.

Secuencia del Péptido M2e-3: SLLTEVETPIRNEGCRCNDSSD (SEC ID NO: 3) El inserto fue sintetizado traslapando los oligonucleótidos de ADN con el programa de ciclo térmico según lo detallado en el ejemplo 1. Los oligonucleótidos fueron: M2e-3F 5'ATG GAT AGC TAG CAC TCC TCC TGC TAG TCT GCT GAC CGA AGT GGA AAC CCC GAT TCG CAA CGA AGG CTG3' (SEC ID NO: 39) M2e-3R 5'TGC CTG TGA CGT CTG AAA ATG GAT CGC TGC TAT CGT TGC AGC GGC AGC CTT CGT TGC GAA TCG G3' (SEC ID NO: 40) Los productos de PCR resultantes fueron digeridos con las enzimas de restricción -A afl I y Nhe\ (NEB) y se sub-clonaron en el vector pDOW2604 cortado con AatW, Nhe\ y se defosforiló. 2 µl de producto de ligadura fue transformado en células de E.coli Top 10 Oneshot (Invitrogen). La mezcla del producto celular/ligadura fue incubada en hielo durante 30 minutos, se sometió a choqyue térmico durante 45 segundos antes de la adición de 0. 5ml de hidrolisado libre de soya animal de LB (Teknova). Los transformantes fueron agitados a 37°C durante 1 hora antes de colocarse en la placa de agar del hidrolisado libre de soya animal de LB con 100 µg/ml ampicilina para la selección.

Las secuencias de codificación de los genes quiméricos de CPMV-CP (pDOW-M2e-3) entonces fueron secuenciadas para asegurar la orientación de la secuencia insertada en el péptido y la integridad del gen modificado de CP. Ejemplo 9. Producción de CPMV recombinante que Contiene el Epítope Universal M2-e del Virus de la influenza A en Plantas del Guisante Pinto Producción de las partículas quiméricas de CPMV en plantas Las semillas Cowpea California #5 de Ferry Morse, parte número 1450, fueron germinadas durante la noche a temperatura ambiente en toallas de papel mojadas. Las semillas germinadas fueron transferidas al suelo. Después de la germinación de siete días, las semillas fueron inoculadas con CPMV ARN1 y CPMV ARN2 quimérico en presencia de abrasivo. Los CPMV ARNs fueron producidos por la transcripción in vitro de los plásmidos pDOW2605 cortados con Mlu\ y pDOW-M2e-3 cortados con EcoRl. El ADN de plásmido lineal fue purificado en columna usando una columna de limpieza Qiagen o un kit de limpieza equivalente. La reacción de transcripción fue realizada usando el kit T7 MEGAscript (Ambion, cat # 1334) que contiene CAP (40 mM) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La calidad de las transcripciones fue analizada activando 1 µl de las transcripciones de ARN en un gel de agarosa. Después de la inoculación, las plantas fueron desarrolladas a 25°C con un período de fotosíntesis de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad durante dos a tres semanas. Las hojas que mostraron los síntomas se cosechan y congelan a -80°C antes de la purificación. Purificación de las Partículas Quiméricas de CPMV 40 g de tejido de la hoja infectado con CPMV fue congelado a -80°C. El tejido de la hoja congelado fue machacado con la mano y vertido en un mezclador de alta velocidad Waring, parte número 8011S. 120 ml de amortiguador de unión frío AIEC con PMSF (30 mM Tris Base pH 7.50, 0.2 mM PMSF) fue vertido sobre las hojas trituradas. Las hojas fueron trituradas 2 veces durante 3 segundos a velocidad alta. La solución fue decantada en una botella de centrifuga de 500 ml. El mezclador fue lavado con 30 ml de amortiguador de unión frío de AIEC y el lavado fue vertido en una botella de centrifugadora de 500 ml. La solución fue centrifugada a 15,000G durante 30 minutos para eliminar los restos celulares de la planta. El supernadante fue decantado en un cilindro graduado. Para precipitar el virus CPMV, la solución fría de PEG 6000 (20% PEG 6000, 1M NaCI) fue agregada al supernadante para alcanzar la concentración final de PEG a 4% PEG 6000 con 0.2M NaCI y la solución fue mezclada suavemente.

La solución se dejo precipitarse durante 1 hora en hielo. La solución del precipitado de virus entonces fue centrifugada a 15.000G durante 30 minutos para recolectar el granulo del virus CPMV. El supernadante fue vertido y el granulo del virus fue suspendido nuevamente de manera inmediata en el amortiguador de unión de intercambio de aniones (30 mM Tris Base pH 7.50). Para purificar adicionalmente las partículas similares al virus, la mezcla de proteína fue fraccionada por cromatografía de intercambio de aniones usando la resina de intercambio de iones fuerte POROS 50 HQ de Applied Biosystems aplicados, parte número 1-2559-11. El gradiente de volumen de la columna 20 fue del amortiguador A, 30 mM Tris Base pH 6.75, al amortiguador B, 30 mM Tris Base pH 6.75 con 1M NaCl. La cromatografía fue ejecutada con un explorador AKTA de Amersham Biosciences, parte número 18-1112-41. El primer pico en el gradiente, que contuvo las partículas similares al virus deseadas, fue el amortiguador intercambiado en PBS usando un concentrador giratorio de Millipore de la membrana cortada de 100 kDa, parte número UFC910096. Las muestras entonces fueron almacenadas a -80°C. Ejemplo 10. Análisis de CPMV Recombinante que Contiene el Epítope universal M2-e del Virus de la Influenza A La estabilidad de las proteínas cubiertas pequeñas y grandes fue probada con SDS-PAGE. La integridad de las partículas del virus CPMV quiméricas integradas fue probada usando la cromatografía de exclusión de tamaño. Las partículas purificadas fueron sometidas a electroforesis en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen, cat NP0323), que tienen 1.0 mm x 15 pozos, de acuerdo a la especificación del fabricante. 5 ul de la muestra fueron combinados con 5 µl de 2X amortiguador reducido de carga de SDS-PAGE, y se sometieron a ebullición durante 5 minutos antes de la activación en gel. Los geles fueron manchados con SirnplyBlue Safe Stain, (Invitrogen, cat LC6060) y se desmancharon durante la noche con agua. La detección con Western Blot utilizó IgG J16 de conejo policlonal anti-CPMV policlonal, la proteína M2de la influenza A (kappa de I gG 1 monoclonal de ratón, cat #: MA1-082) de ABR (Affinity BioReagents) como anticuerpos primarios, y el kit WESTERN BREEZE (de Invitrogen, cat WB7105), siguiendo los protocolos del fabricante. La figura 11 muestra la expresión de CPMV fusionado con el péptido M2e-1 del virus de la influenza en las plantas según lo detectado por SDS-PAGE y el Western Blott con los anticuerpos 14B anti-CPMV y anti-M2. El péptido de M2e es reconocido por los anticuerpos anti-M2. Ejemplo 11. Gen de HA y Fragmentos del Gen Usados para la Expresión en Plantas y Células de Planta Una codificación del gene para la influenza HA, identificada a partir de la cepa del virus de la influenza A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5N1) en las SEC ID NO: 15 fueron pedidos del DNA 2.0 (ADN 2.0, Menlo Park, CA 94025, E.E.U.U.) para la síntesis. El gene de HA sintetizado fue diseñado para favorecer la predisposición del uso del codón de planta y para contener los sitios de restricción fabricados que flanquean el gene en ausencia de los mismos sitios de restricción dentro del gene para los propósitos de clonación. El gene de HA integral sintetizado careció del dominio trans-membrana de la terminal C y de la cola citoplásmica. Ver la figura 12 y la figura 13. La secuencia de nucleótidos optimizada por el codón de ORF del gen de HA integral utilizada para la clonación y expresión en las células de planta se muestra en la tabla 5, secuencia SEC ID NO: 16. La secuencia de aminoácidos de la proteína HA integral traducida de la SEC ID NO: 16, se muestra en la tabla 5, SEC ID NO: 17. Carece del dominio trans-membrana de la terminal C y de la cola citoplásmica y contiene la etiqueta HIS en la terminal C de la proteína. Las secuencias de nucleótidos optimizadas por el codón para los fragmentos de la proteína HA, HA1 y HA2, se muestran en la tabla 5, SEC ID NO: 19 y 21. La secuencia de aminoácidos de HA1 y los fragmentos de la proteína HA2 traducidos de la SEC ID NO: 19 y 21, se muestran en la tabla 5, SEC ID NO: 18 y 20. Ambos fragmentos de HA contienen el péptido señal nativo, tienen el dominio trans-membrana de la terminal C y la cola citoplásmica eliminada, y contiene la etiqueta HIS en el terminal C de los fragmentos de proteína. Ejemplo 12. Clonación de HA, HA1 , y HA2 Integral de la Influenza en el Vector de Expresión Basado en pDOW3451 PVX. El gen HA integral fue aislado usando las enzimas de restricción EcoRV y SspE1 que permiten que fuera eliminado del vector G01129 (ADN 2.0). G01129 digerido fue activado en gel de agarosa para separar la estructura del vector del gen de HA. El gen de HA fue purificado en gel y después sub-clonado en el vector pDOW3451 que también fue cortado con EcoRV + BspE y defosforilado usando fosfatasa alcalina de ternera (CIP). Ver la figura 14. La clonación acertada del nuevo vector pDOW3471 por fue verificada por el mapeo de restricción y el análisis por PCR de la colonia para el gen HA. Los fragmentos del gen HA1 y HA2 fueron aislados usando G01129 como patrón en una reacción PCR. La primera reacción PCR sirvió para amplificar el gene de HA1 que incluyó el sitio de restricción EcoKV, el péptido señal, y el comienzo de ORF. El cebador inverso sirvió para agregar una etiqueta 6xHis en la terminal C y en el sitio de restricción BspE^. Las reacciones PCR fueron realizadas usando la SuperPCR Mix (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los cebadores usados para amplificar el fragmento de HA1 fueron: Thai 1 FHA1 5'GCGCGATATCAACAATGGAGAAGATAGTTC3' (SEC ID NO. 41) Thai 3 HA1 BspE1 5'GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTCTCTTCT TACGTC3' (SEC ID NO: 42) La segunda reacción sirvió para amplificar el fragmento de HA2. Fueron utilizados los siguientes cebadores: Thai FHA2 EcoRV GCGATATCAACAATGGAGAAGATAGTTCTCTTGTTTGCCATC GTCAGTTTGGTCAAATCAGGATTGTTCG3' (SEC ID NO: 43) Thai 7 HA2 BspE1 5'GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTTGGTAGA TACC3' (SEC ID NO: 44) Los ajustes del aparato de ciclo térmico para la reacción PCR incluye: 1. 95° C durante 2 min. 2. 94°C durante 30 seg 3. 56°C durante 30 seg 4. 68°C durante 1:10 min 5. Ir a la etapa 2 34 veces 6. 68°C durante 10 min 7. 40°C Después de PCR, los productos para los fragmentos de HA1 y HA2 fueron digeridos con EcoRY y BspE^, se activaron en un gel de ADN y las bandas fueron eliminadas del uso para clonarse en el vector pDOW3451. La clonación acertada fue verificada por el mapeo de digestión de restricción y el análisis de PCR de la colonia para los fragmentos HA. Ejemplo 13. Preparación de las transcripciones de ARN a partir de pDOW3475 y pDOW3466 pDOW3471 y de pDOW3466 (un plásmido auxiliar que contiene el genoma de PVX con una eliminación en la proteína cubierta) se alinearon usando la enzima de restricción Spel, la columna Quickspin fue limpiada (Qiagen) y eluida con agua libre e nucleasa (Ambion). Las reacciones de transcripción in vitro fueron integradas como sigue usando los componentes del kit encapsulado T7 mMessage Machine T7 (Ambion).

Las reacciones fueron integradas en hielo, después se incubaron a 37°C durante 2 horas. Después de la transcripción del ARN in vitro, una muestra pequeña de cada reacción fue activada para visualizar los productos del ARN. Ejemplo 14. Inoculación las Plantas de Nicotiana benthamiana y Producción de la Proteína HA en Plantas Las plantas Nicotiana benthamiana fueron inoculadas usando el ARN transcrito in vitro de pDOW3475 y pDOW3466. Una sola hoja de la planta con 2-3 semanas de edad fue limpiada con una cantidad pequeña de carborundo. El inoculado de ARN fue aplicado a la hoja joven y sobre el carborundo. Usando guantes limpios, el ARN fue frotado en el tejido de la hoja. Un inoculado (20 µl ARN transcrito in vitro) de pDOW3475 combinado con pDOW3466 fue utilizado por inoculación de planta. Las plantas fueron observadas para determinar la formación del síntoma. Ver la figura 15. Ejemplo 15. Inoculación de las Células del Tabaco NT1 y Producción de la Proteína HA en Células de Planta La transfección de las células de tabaco NT1 fue realizada vía la electroporación de ARN transcrito in vitro en protoplastos NT1. Los protoplastos NT1 fueron preparados para la electroporación mediante la eliminación de la pared celular usando la celulisina y macerasa. Cinco minutos antes de la electroporación del ARN de pDOW3475 en las células, 5 ug del plásmido que contiene el gen HcPro se incubaron con las células. HcPro ha demostrado previamente prevenir que el gene se oculte, por lo tanto aumenta la cantidad de multiplicación y actividad viral. Se concluyo que la complementación no es necesaria para que los cultivos celulares de la planta propaguen el ARN viral que expresa el gen de HA. El ARN derivado de pDOW3466 fue utilizado como inoculado. Inmediatamente antes de la electroporación, 5 µl de ARN transcrito in vitro fue agregado a 1 ml de células de planta procesadas en un tubo hueco de 0.4 cm enfriado con hielo (Biorad), y se mezclaron rápidamente. Las células fueron pulsadas a 500 µf y 250 V a una constante de tiempo de 11-13 segundos. Las células fueron colocadas en placas sobre 5 ml de medio de recubrimiento de NT1 en un plato de petri, se sellaron con película de parafína y después se dejaron desarrollar durante 48 horas a temperatura ambiente. Las células fueron probadas para determinar la transfección acertada y la producción de HA. Los cultivos celulares completos fueron granulados, congelados, triturados con una maja, y lisados para purificar la proteína HA etiquetada con HIS bajo condiciones naturales y de desnaturalización a través de una columna giratoria de Ni-NT (Qiagen). Las muestras entonces fueron detectadas vía un Western Blot que utiliza los anticuerpos primarios anti-His (conjunto de 3 paquetes Qiagen), y AP secundario anti-ratón (Western Breeze, Invitrogen). Ejemplo 16. Expresión de los Fragmentos de HA o HA en Pseudomonas fluorescens Una codificación del gen para la influenza HA, identificada de la cepa del virus de la influenza A/Vietnam/2004(H5N1 ) en la SEC ID NO: 25 fue pedida de ADN 2.0 (ADN 2.0, Menlo Park, CA 94025, E.E.U.U.) para la síntesis. El gene HA sintetizado fue diseñado para favorecer la predisposición del uso del codón de P. fluorescens, y contiene un sitio de unión de ribosoma y los sitios de restricción fabricados que flanquean el gen en ausencia de los mismos sitios de restricción dentro del gen para los propósitos de clonación. La secuencia de nucleótidos optimizada por el codón de ORF del gen HA integral utilizada para la clonación y expresión en células de P. fluorescens, se muestra en la tabla 5, SEC ID NO: 26. El gene de la proteína HA fue eliminado del plásmido en Spel y Xho\ y se sub-clonó en el plásmido pDOW1803 de expresión de Pseudomonas fluorescens en Spel y Xho\ en el lugar del gen buibui. Los plásmidos resultantes fueron transformados por la electroporación en el electro-competente P. fluorescens MB214.

Las células hospedadoras fueron descongeladas gradualmente en los frascos mantenidos en hielo. Para cada transformación, 1 µl de ADN de plásmido de expresión purificado fue agregado a las células hospedadoras y la mezcla resultante fue agitada suavemente con una pipeta para mezclar, y después se incubó en hielo durante 30 minutos. La mezcla fue transferida a los tubos desechables de electroporación (BioRad Pulser Pulser Cuvette, orificio de electrodo de 0.2 cm, cat No. 165-2086). Los tubos fueron colocados en Biorad Pulser Gene preestablecido a 200 Ohms, 25 µfaradios, células 2.25kV. Las células fueron células pulsadas brevemente (aproximadamente 1-2 seg). El medio LC frío entonces fue agregado inmediatamente y la suspensión resultante fue incubada a 30°C durante 2 horas. Las células entonces fueron colocadas en placas agar LB tetl 5 (15 ug/ml medio de LB complementado con tetraciclina) y se desarrollaron a 30°C durante la noche. Una colonia fue seleccionada de cada placa y la muestra seleccionada fue inoculada en 50 ml de cultivo de sembrado de LB en un matraz de agitación con deflector. Los cultivos de suspensión de líquido fueron desarrollados durante la noche a 30°C con 250 rpm da agitación. 10 ml de cada cultivo de sembrado resultante entonces fue utilizado para inocular 200 ml de medio del matraz de agitación (es decir, extractos de levadura y sal con los elementos de rastreo, citrato de sodio, y glicerol, pH 6.8) en un matraz de agitación con deflector de 1 litro. La tetraciclina fue agregada para la selección. Los cultivos inoculados fueron desarrollados durante la noche a 30°C con 250 rpm de agitación y se indujeron con IPTG para la expresión de la proteína HA. Ejemplo 17. Clonación y Expresión de pbp-HA en el Periplasma de P. fluorescens DC454 Clonación: Una señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp) del residuo 24 fue fusionada a la terminal N de la cepa modificada del virus de la influenza A/Vietnam/2004(H5N1 ) en la SEC ID NO: 29 sin señal de secreción nativa y su dominio transmembrana de la terminal C. La señal de pbp fue amplificada de pDOW1113 con el siguiente par de cebadores: pbpF-Spel 5'-GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG- 3' (SEC ID NO: 45) pbp-HA-Rev 5'-GTGATAGCCGATGCAAATCTGGTCGGCCACCGCGTTGGC- 3' (SEC ID NO: 46) La proteína HA modificada fue amplificada del plásmido de transporte que contiene el gen de HA en la SEC ID NO: 26 por PCR con el siguiente par de cebadores: pbp-HA-For 5'-GCCAACGCGGTGGCCGACCAGATTTGCATCGGCTATCAC-3' (SEC ID NO. 47) HA-Xhol-Rev 5'-CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC-3' (SEC ID NO: 48) El gene de fusión pbp-HA entonces fue amplificado usando los siguientes pares de cebadores: pbpF-Spel 5'-GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG-3' (SEC ID NO: 49) HA-Xhol-Rev 5'-CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC-3' (SEC ID NO: 48) Etapa 1 : La señal de pbp que contiene el plásmido fue utilizada como el patrón de PCR. Los cebadores pbpF-Spel y pbp-HA-Rev fueron utilizados en la reacción 1. Los cebadores pbp-HA-For y HA-Xhol-Rev fueron utilizados en la reacción 2. Las PCRs fueron realizadas de acuerdo a los protocolos del ciclo térmico descritos anteriormente. Etapa 2: Los productos 1 y 2 de PCR fueron utilizados como patrones de PCR para esta reacción. Los cebadores pbpF-Spel y HA-Xhol-Rev fueron utilizados para amplificar el producto final de la PCR. El producto final de PCR entonces fue digerido por Spel y Xho\ y sub-clonado en el vector pDow1169 de expresión de P. fluorescens restringido con Spel y Xho\ y defosforilado. El producto de ligadura fue transformado por la electroporación en la cepa P. fluorecens DC454 después de la purificación con las columnas Micro Bio-spin 6 Chromatography (Biorad). Los transformantes fueron colocados plateados en la placa Glucose M9 (Teknova) después de dos horas de agitación en el medio de LB a 30°C. Las placas fueron incubadas a 30°C durante 48 horas. La presencia del inserto fue confirmada por la digestión y secuenciación de restricción. Expresión de Proteína: Solo los transformantes fueron inoculados en 50 ml de medio Glucose M9 y se desarrollaron durante la noche. Los cultivos de P. fluorescens de 3.0-5.0 OD600 fueron utilizados para inocular los cultivos del matraz de agitación. Los matraces de agitación fueron incubados a 30°C con 300 rpm de agitación durante la noche. Durante la noche, los cultivos de 15.0-20.0 OD600 fueron inducidos con 300 µM isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida (IPTG). Los cultivos fueron cosechados 24 horas después de la inducción. Ejemplo 18. Conjugación de los Fragmentos de HA o HA con el virus CCMV o Partículas Similares al Virus In Vitro Las partículas quiméricas VLP de CCMV que contienen el inserto de la influenza se producen según lo descrito en los ejemplos 1-7 y después se procesan adicionalmente para conjugar la proteína HA, o fragmentos de proteína HA, o mutante de la proteína HA, o mutantes de los fragmentos de HA derivados según lo descrito en los ejemplos 11-17 a la proteína cubierta de CCMV. La proteína HA o fragmentos de proteína se une a los residuos superficiales de cisteína expuestos a la partícula de CCMV o sus mutantes. Esto es lograda por el acoplamiento oxidante de los tioles de cisteína en CCMV a los grupos libres de tiol en la proteína en presencia de 1 mM CuSO4 en 50 mM de acetato de sodio pH 4.8, con una relación molar de 93 pM de la proteína cubierta de CCMV a 385 pM de HA. La reacción se incuba durante 1-4 horas. Alternativamente, la proteína HA se une a la superficie de VLP de CCMV vía un método según lo descrito en Gillitzer, y col., Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation, Chem. Commun., 2002, 2390-2391 y Chatterji y col., Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea Mosaic Virus. Bioconjugate Chem., 2004, Vol. 15, 807-813. Las partículas conjugadas se separan de las partículas no conjugadas a través de la cromatografía de exclusión de tamaño usando una columna Superóse 6 de 1 cm x 30 cm de GE Bioscience con una fase móvil de 0.1 M NaPO4 pH 7.00. Alternativamente, las partículas conjugadas se separan de las proteínas libres de HA o fragmentos de proteína a través de la precipitación de 4% PEG 0.2M NaCI seguida por la suspensión repetida en 30 mM Tris pH 7.50. Ejemplo 19. Conjugación de HA o Fragmentos de HA con el Virus CPMV o Partículas Similares al Virus In Vitro Las partículas quiméricas de VLP de CPMV que contienen el inserto de la influenza se producen según lo descrito en los ejemplos 8-10 y además se procesan para conjugar la proteína HA, o fragmentos de la proteína HA, o mutantes de la proteína HA, o mutantes de los fragmentos de HA producidos según lo descrito en los ejemplos 11-17 con la proteína cubierta de CPMV.

La proteína HA se une a los residuos superficiales de císteína expuestos a CPMV o sus mutantes. Esto se logra por el acoplamiento oxidante de los tioles de cisteína en CPMV a los grupos libres de tiol en la proteína en presencia de 1 mM CuSO4 en 50 mM de acetato de sodio pH 4.8, con una relación molar de 93 pM de CPMV a 385 pM de la proteína HA cubierta. La reacción se incuba durante 1-4 horas. Alternativamente, la proteína HA se une a la superficie de VLP de CPMV vía un método según lo descrito en Gillitzer, y col., Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation, Chem. Commun., 2002, 2390-2391 y Chatterji y col., Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea Mosaic Virus. Bioconjugate Chem., 2004, Vol. 15, 807-813. Las partículas conjugadas se separan de las partículas no conjugadas a través de la cromatografía de exclusión de tamaño usando una columna Superóse 6 de 1 cm x 30 cm de GE Bioscience con una fase móvil de 0.1 M NaPO4 pH 7.00.

Alternativamente, las partículas conjugadas se separan de las proteínas libres de HA o fragmentos de proteína a través de la precipitación de 4% PEG 0.2M NaCI seguida por la suspensión repetida en 30 mM Tris pH 7.50. Ejemplo 20. Inmunización de los Ratones con las partículas quiméricas de CCMV y CPMV que contienen el Epítope M2e VLPs de CCMV que contienen un péptido de la influenza insertado y conjugado con la proteína HA, se producen según lo descrito en el ejemplo 18 y se administran a los ratones Balb/c hembra. Los ratones de Balb/c con 7 semanas de edad se inyectan de manera intraperitoneal con 100 µg purificados de VLP de CCMV conjugada con HA una vez cada tres semanas. Para la inmunización intranasal, 100 µg de VLP de CCMV conjugada con HA se administran a los ratones anestesiados. Un volumen total de 100 µl se administra en dos fosas nasales (50 µl por cada fosa nasal). A los ratones de control se les administra una VLP de CCMV con un inserto de péptido sin relación tal como el antígeno protector de ántrax (PA) al mismo horario de dosificación. Opcionalmente, a los ratones de control se les administra PBS, pH 7.0. Las muestras de suero, lavados nasales y pulmonares, se obtienen 1 día antes de la primera administración y 2 semanas después de cada una de las dos administraciones subsecuentes. Los ratones inmunizados entonces se desafían con 4000 PFU/ratón de una cepa de la influenza adaptada al ratón vivo 2-3 semanas después de la última inmunización. Los ratones entonces se observan para determinar la supervivencia. Las muestras entonces son procesadas para que los títulos de Ab determinen la inmunorespuesta a las proteínas de CCMV, HA, y M2e por el análisis de ELISA.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una composición para el uso como vacuna de la influenza en un humano o animal, que comprende: i) proporcionar un primer ácido nucleico que codifica un péptido de fusión de cápsida recombinante, el péptido de fusión de cápsida recombinante comprende una proteína de cápsida de virus de planta fusionada a un péptido viral de la influenza, y expresar el péptido de fusión de cápsida en una célula hospedadora; ii) integrar el péptido de fusión de cápsida para formar un virus o partícula similar al virus; iii) proporcionar por lo menos un segundo ácido nucleico que codifica por lo menos una proteína antigénica o fragmento de proteína derivado de una cepa del virus de la influenza, y expresar la proteína antigénica o fragmento de proteína en la célula hospedadora; iv) aislar y purificar la proteína antigénica o fragmento de proteína; y v) combinar el virus o partícula similar al virus y la proteína antigénica o fragmento de proteína para formar una composición capaz de administrarse a un humano o animal.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína antigénica aislada o fragmento de proteína se conjuga con el virus o partícula similar al virus.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína antigénica aislada o fragmento de proteína se deriva de una cepa de la influenza aparecida recientemente.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el péptido de fusión de cápsida comprende un péptido viral de la influenza derivado de un péptido viral de la influenza conservado.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el péptido viral de la influenza conservado se deriva de un péptido M2 de la influenza.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el péptido M2 se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-5 y 22-24.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el péptido M2 se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 3, 22, 23, y 24.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína de cápsida del virus de la planta se deriva de un virus de planta CCMV o CPMV.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la proteína de cápsida del virus de la planta se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 11-13.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el virus o partícula similar al virus no contiene las proteínas de la membrana del plasma de la célula hospedadora o de la pared celular.

11. Una composición que comprende: i) un péptido de fusión de cápsida recombinante, el péptido de fusión de cápsida comprende una proteína de cápsida del virus de planta fusionada a un péptido viral de la influenza, en donde el péptido de fusión de cápsida se integra para formar un virus o partícula similar al virus, y ¡i) por lo menos una proteína antigénica aislada o fragmento de proteína derivado de un virus de la influenza.

12. La composición de la reivindicación 11, en donde la proteína antigénica aislada o fragmento de proteína se conjuga con el virus o partícula similar al virus.

13. La composición de la reivindicación 11, en donde la proteína antigénica aislada o fragmento de proteína se deriva de una cepa de la influenza aparecida recientemente.

14. La composición de la reivindicación 11, en donde el péptido de fusión de cápsida comprende un péptido viral de la influenza derivado de un péptido viral de la influenza conservado.

15. La composición de la reivindicación 14, en donde el péptido viral de la influenza conservado se deriva de un péptido M2 de la influenza.

16. La composición de la reivindicación 15, en donde el péptido M2 se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-5 y 22-24.

17. La composición de la reivindicación 16, en donde el péptido M2 se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 3, 22, 23, y 24.

18. La composición de la reivindicación 11, en donde la proteína de cápsida del virus de la planta se deriva del virus de planta CCMV o CPMV.

19. La composición de la reivindicación 18, en donde la proteína de cápsida del virus de la planta se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 11-13.

20. La composición de la reivindicación 11, en donde el virus o partícula similar al virus no contiene las proteínas de la membrana del plasma de la célula hospedadora o de la pared celular.

21. La composición de la reivindicación 11, en donde la composición adicionalmente comprende una molécula inmunoestimulante.

22. La composición de la reivindicación 21, en donde la molécula inmunoestimulante comprende una secuencia de CpG.

23. Una secuencia del péptido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 3, 22, 23, y

24.