WO2006040926A1 - ３倍体レシピエントを用いた生殖細胞移植による魚類の増殖方法 - Google Patents
３倍体レシピエントを用いた生殖細胞移植による魚類の増殖方法 Download PDFInfo
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- A01K2227/40—Fish
Definitions
- the present invention relates to isolated primordial germ cells (2n) derived from donor fish,
- the present invention relates to a method for breeding fish.
- the present inventors have described a method for transplanting genetically modified or isolated cells into a host individual in fish and inducing the differentiation into the germ line (1)
- mice that are known to share the breeding cell line the cell population that maintains the undivided state is considered to be divided into germ cells by stimulation from surrounding cells.
- maternal factors such as RNA and proteins accumulated in the maturing eggs of the parent ovary play an important role in determining the germline.
- a germ cell stem cell that is, a primordial germ cell
- transplanting the primordial germ cell into an early embryo of a fish The cell can be induced to differentiate into the germline.
- a technique for producing triploids for breeding high-quality fish is known.
- the excellent trait is genetically fixed by selecting a perfect homozygote induced by chromosome manipulation, preferably by selecting individuals of the superior trait, preferably using a normal fish as a control group.
- a breeding method for Japanese flounder which is characterized by mating with a completely homozygous or normal fish and producing a breed with excellent traits (see, for example, Patent Document 2 and Patent Document 3). It is also known to produce both eggs by taking the placenta part of triploid crucian carp and transplanting it into a goldfish embryo to make a chimera.
- Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-235558
- Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 10-327706
- Patent Document 3 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-135038
- Patent Document 1 Although the differentiation induction method described in Patent Document 1 is an extremely excellent method, when isolated primordial germ cells derived from donor fish are transplanted into early embryos of different recipient fish, the recipient fish is: Make donor-derived eggs and Z or sperm, and make recipient-derived eggs and Z or sperm. However, it may be necessary to specifically form donor-derived eggs and Z or sperm, such as when donor fish has higher added value than dissimilar recipient fish.
- An object of the present invention is to provide a method for inducing differentiation of an isolated primordial germ cell into a germ cell line by transplanting an isolated primordial propagation cell derived from a donor fish into an early embryo of a different recipient fish.
- Another object of the present invention is to provide a method for efficiently proliferating or breeding fish that specifically forms donor-derived eggs and Z or sperm without forming sperm.
- the present inventor has intensively researched and isolated source from donor fish.
- a triploid fish as a recipient fish different from the donor
- the method for inducing the separation of the isolated primordial germ cell into the germ line of transplanting germ cells into the early embryo of different recipient fish Find out that donor-derived ova and Z or sperm, which are almost never formed from recipient-derived ova and Z or sperm, are found to be specifically formed in females, especially donor-derived ova. It came to.
- the present invention relates to (1) a germ line of an isolated primordial germ cell, characterized in that the isolated primordial germ cell derived from a donor fish is transplanted into an early embryo of a different recipient fish (triploid).
- the method of inducing differentiation into (2), wherein the isolated primordial germ cell is a primordial germ cell isolated from an embryo before and after hatching The differentiation induction method and (3) transplantation of different recipient fish (triploid) to the early embryo is characterized by being transplanted to the backside of the abdominal mesentery of the host in the developmental stage before and after hatching (1) or (2) the method of inducing the separation of the isolated primordial germ cell into the germ line, or (4) the reproduction of the isolated primordial germ cell described in any of (1) to (3) above. It is characterized by the formation of eggs and Z or sperm from donor fish by the differentiation induction method to the cell lineage. It is related with the propagation method of fish.
- FIG. 1 -A diagram showing the results of an anatomical observation 18 months after transplantation of testes of a pea (triploid) recipient transplanted with primordial germ cells (diploid) of zimus .
- FIG. 2 is a diagram showing the results of anatomical observation 18 months after transplantation of ovary of a trout (triploid) recipient (3n recipient) transplanted with primordial germ cells (diploid) of zimus.
- the isolated primordial germ cells derived from a donor fish are transplanted into an early embryo of a different recipient fish (triploid).
- the method of growing the fish of the present invention is not particularly limited as long as it is a method, and is particularly limited as long as it is a method of forming eggs and Z or sperm derived from donor fish by the differentiation induction method of the present invention.
- fish that can be used for fish such as saltwater fish, freshwater fish, etc.
- examples of dissimilar fish include fish of the same genus and different genera. For example, when the donor is zimus, As brown trout The char can be specifically exemplified.
- transplantation of donor isolated primordial germ cells into the recipient's early embryo can be performed by transplanting the host recipient at the early developmental stage into the peritoneal cavity of the peritoneal mesentery.
- Donna When the isolated primordial germ cells are transplanted into the peritoneal cavity of a recipient (triploid) embryo by a method such as the microindication method, the transplanted primordial germ cells spontaneously enter the host gonad. And can induce proliferation and differentiation there.
- the primordial germ cells used for transplantation can use embryonic force separated before and after hatching, and transplantation into the early embryo of the host is a host recipient in the developmental stage before and after hatching. (Triploid) can be used.
- primordial germ cells of the donor are used for transplantation, it is preferable to obtain them by separating and purifying the cells. Since primordial germ cells in fish are a cell population that appears only at a limited stage of early development, for example, at a limited stage of early development before and after hatching, visualization is performed for acquisition, It is preferable to obtain such that separation and purification are possible.
- the method reported by the present inventors can be used for visualization of primordial germ cells. That is, for example, in order to visualize the primordial germ cells of fish, first, a gene specifically expressed in the germ cells of fish is obtained (Mol. Reprod. Develop. 55: 364-371, 2000) and its regulation is performed.
- vasa In fish, the vasa gene can be used. vasa is isolated as a causative gene of the F1 generation infertile in Drosophila (cannot get the F2 generation) and is said to have RNA helicase activity involved in translation of mRNA in germ cells. This gene is expressed specifically in primordial germ cells even in fish such as rainbow trout, and this gene is expressed in primordial germ cells. It can be used for visualization.
- a plasmid in which a marker gene that encodes a protein that can visualize primordial germ cells in vivo is incorporated into the cytoplasm of fertilized eggs of fish can be done by introducing wear.
- a gene encoding the fluorescent protein FP for example, a marker gene such as green fluorescent protein (GFP) or enhanced green fluorescent protein (EGFP) derived from jellyfish jellyfish can be used.
- primordial germ cells In order to separate the visualized primordial germ cells from germ cell tissues, known methods can be used as appropriate. For example, genital ridges containing embryonic embryonic primordial germ cells can be recovered, dissociated with proteolytic enzymes until disintegrated, and further applied to a cell sorter for separation. Primordial germ cells are fluorescently labeled by the expression of the marker gene, and therefore emit fluorescence, and the germ cells and fluorescence are easily separated from other somatic cells by a cell sorter. can do.
- primordial germ cells are transplanted to the back side of the peritoneal mesentery of the recipient (triploid) at an early stage of development by an appropriate method such as microinstruction.
- Primordial germ cells can spontaneously move into the host gonad, induce differentiation into oocytes or spermatogonia, and induce differentiation into eggs or sperm.
- the method of inducing separation of isolated primordial germ cells into the germ line of the present invention can be used for the production of new individuals, and can be used for the method of breeding donor fish.
- the method for producing a triploid recipient fish transplanted with isolated primordial germ cells derived from a donor fish is not particularly limited, as described in the Examples, usually the female affinity of diploid fish After artificial insemination using normal eggs and spermatozoa of normal diploid fish, the development begins under running water at 10 ° C.
- the second polar body release prevention method (method of blocking the second polar body release by pressure or temperature stimulation during the development process to make it a diploid) or the first cleavage prevention method (stage of development) In this method, the second polar body is released and the development begins only in the female pronucleus.
- a physico-stimulative stimulus is applied, and the first cleavage is made a diploid.
- a male sex hormone testosterone
- the triploid recipient is preferably a female in which a donor-derived ovum is specifically formed.
- the method for inducing differentiation is used for the formation of eggs and Z or sperm of different species of fish. This can be used for large-scale growth of fish and the like.
- the propagation method of the present invention since a triploid host is used as a recipient, almost no primordial germ cells are retained. By transplanting donor-derived primordial germ cells here, most of the egg spermatozoa derived from donor primordial germ cells occupy the recipient (triploid) host gonad.
- donor primordial germ cells are derived from very young embryos before and after hatching, their proliferation ability is extremely high, and their proliferation is extremely high even in heterologous triploid host individuals after transplantation. As soon as it is confirmed. Moreover, only sperm can be produced by spermatogonial cell transplantation, but since primordial germ cells are cells before sex separation, both egg and sperm can be formed. By the way, since the cryopreservation technology for eggs has not been completed in fish, the preservation and technology of gene primordials can be achieved by making eggs' sperm by transplantation after cryopreserving primordial germ cells.
- the preparation of the host trout was usually performed by artificial insemination using eggs from the diploid brute female parent and sperm from the diploid spruce male parent in the usual manner. Then, the development started under running water at 10 ° C, and after 15 minutes from fertilization, it was immersed in warm water at 28 ° C, and after that, when it became a normal egg under running water at 10 ° C, Individuals that reached the day were subjected to experiments as host trout (triploid). The triploidization rate of juveniles at the stage of reaching 35 days after fertilization was examined by microphotometry of the amount of DNA, which was 99.8%, and most juveniles became triploid. I'm stuck.
- the GFP gene derived from the jellyfish vasa gene was connected to the expression regulation region of the rainbow trout and visualized.
- the primordial germ cells (diploid) of rainbow trout were visualized in heterogeneous individuals. It was introduced into an early embryo of a host trout (triploid). Since the primordial germ cells into which this GFP gene has been introduced emits green fluorescence specifically, they can be visualized in living pea (triploid) individuals.
- primordial germ cells into the early embryo of a trout is as follows:-Embryos before and after hatching of zimus (when embryos are kept at a water temperature of 10 ° C, 30-30 days after fertilization, hatching after fertilization 32 From the day, about 10 primordial germ cells isolated by the method described above are aspirated with a glass micropipette attached to a microinjector, and the intraperitoneal cavity Transplanted to the back side of the mesentery.
- the host germline was observed with fluorescence over time after transplantation, and the proportion of germ cells derived from donors was investigated. On the 60th day after transplantation, it was observed that the transplanted primordial germ cells migrated to the genital ridge in the gonad, taken up into the genital ridge, and further proliferated.
- transplanted primordial germ cells efficiently proliferated in the host recipient gonad, and induced to differentiate into spermatogonia in the testis and to oocyte oocytes in the ovary. Since these oocytes and spermatogonia are divided into eggs or sperm in a trout (triploid) individual, it is possible to create a new-mass individual by using these germ cells. it can.
- -A corn (triploid) recipient transplanted with primordial germ cells (diploid) of zimus was subjected to anatomical observation of testis and ovary 18 months after transplantation.
- a control Transplanted with transplanted trout (triploid) recipients (triplet) that did not transplant at the same stage as transplant recipients (3n control) and -jimas primordial germ cells (diploid) 1 After 8 months, a bean (diploid) recipient (2n control) was used.
- Fig. 1 (Reference Photo 1) shows the anatomical results in the testis
- Fig. 2 (Reference Photo 2) shows the anatomical results in the ovaries.
- large coronalizations were found in the testicular (triploid) recipient testes.
- donor-derived eggs that have developed to the same extent as the bean (diploid) recipient (2n control) fill the ovary of the bean (triploid) recipient (3n recipient). It was.
- primordial germ cells from donor fish are used and transplanted into early embryos of different recipient fish (triploid), so that almost all recipient-derived eggs and Z or sperm are formed. Since donor-derived ova and Z or sperm, especially eggs, are almost exclusively formed in donors, for example, isolated primordial germ cells can be transformed into different strains or different host individuals. (Triploid) can be used as a borrower for fish and so on.
- primordial germ cells of a huge species such as tuna can be transplanted to small related species, Since fry from different strains and different host individuals are mostly mixed, it is possible to produce tuna-specific fry without the need to separate them.
- primordial germ cells of rare and endangered species are cryopreserved and transplanted to related species that are easy to breed when necessary, so that rare species and extinct species that are not mixed with eggs or sperm from related species It can be used to preserve endemic species-specific genetic resources.
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Abstract
ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を異種のレシピエント魚類の初期胚に移植する分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、レシピエント由来の卵子及び／又は精子を形成させることなく、ドナー由来の卵子及び／又は精子を特異的に形成させる魚類の増殖或いは育種を効率よく行う方法を提供するものである。ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を異種のレシピエント魚類の初期胚に移植する分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、ドナーと異なるレシピエント魚類として３倍体魚類を用いることにより、レシピエント由来の卵子及び／又は精子を殆ど形成させることなく、ドナー由来の卵子及び／又は精子、特に雌においては殆どドナー由来の卵子を特異的に形成させる。
Description
3倍体レシピエントを用いた生殖細胞移植による魚類の増殖方法 技術分野
[0001] 本発明は、ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞（2n)を、異種のレシピエント魚類
(3倍体)の初期胚に移植して、生殖細胞系列への分化誘導方法や、力かる分ィ匕誘 導方法を利用したドナー魚類由来の卵子及び Z又は精子を特異的に形成せしめる ドナー魚類の増殖方法に関する。
背景技術
[0002] 本発明者らは、魚類において、遺伝的に改変した或いは分離した細胞を、宿主個 体に移植し、これを生殖細胞系列へ分ィ匕誘導する方法について、（1) ES細胞が生 殖細胞系列に分ィ匕することが知られているマウスでは、未分ィ匕な状態を維持している 細胞集団力 周辺細胞からの刺激により生殖細胞へと分ィ匕していくと考えられている のに対して、魚類においては、親の卵巣内で成熟途上の卵内に蓄積された RNAや タンパク質等の母性因子が、生殖細胞系列の決定に重要な役割を果たしており、そ して、これらの母性因子が受精卵中に不均一に存在するため、細胞分裂により一部 の割球のみがこの因子を受け取ることとなり、その結果、母性因子を受け取った一部 の細胞のみが、将来生殖細胞系列へと分ィ匕していくと考えられること、（2)このような 生殖細胞系列の決定機構を考慮すると、マウスにおいては生殖細胞系列に分ィ匕可 能な細胞株に求められる条件は"未分ィ匕であるこど'であるが、魚類の場合は"生殖 細胞への分ィ匕を決定する母性因子を含むこど'であること、（3)魚類において、遺伝 的に改変した或いは分離した細胞を、宿主個体に移植し、これを生殖細胞系列へ分 化誘導する際に用いるべき細胞 (すなわち、宿主個体に移植後、卵子又は精子に分 化し、次世代個体に改変可能な細胞）は、未分化な胚細胞ではなぐ将来生殖細胞 に分ィ匕することが決定付けられて 、る生殖細胞の幹細胞、すなわち始原生殖細胞で あること、（4)該始原生殖細胞を、魚類の初期胚に移植することにより、始原生殖細 胞を、生殖細胞系列へ分化誘導することができること、（5)魚類由来の分離始原生殖 細胞を、宿主魚類の初期胚への移植、特には、初期発生段階の宿主の腹腔内腸管
膜裏側への移植により、該始原生殖細胞を生殖細胞系列への分化誘導を行うことが 可能であること、を報告している (例えば、特許文献 1参照)。そして、このような生殖 細胞への分化誘導に関する研究を応用すれば、ヒラメを宿主とし、他のヒラメやカレイ の仲間を借り腹で作ることも可能である。
[0003] 他方、優良品質の魚の育種に 3倍体を作製する技術が知られている。具体的には 、染色体操作によって誘導した完全同型接合体の選抜によって、好ましくは通常魚 をも対照群として該優良形質の個体を選び出すことによって、優良形質を遺伝的に 固定し、これと、他の完全同型接合体もしくは通常魚と交配し、優良形質の品種を作 出することを特徴とするヒラメ類の育種方法が知られている（例えば、特許文献 2及び 特許文献 3参照)。また、三倍体のフナの胎盤部分を取り出し、金魚の胚に移植し、 キメラを作ることにより、両者の卵を生産することも知られている。
[0004] 特許文献 1：特開 2003— 235558号公報
特許文献 2：特開平 10— 327706号公報
特許文献 3：特開 2000— 135038号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 上記特許文献 1記載の分化誘導方法は極めて優れた方法であるが、ドナー魚類由 来の分離始原生殖細胞を、異種のレシピエント魚類の初期胚に移植した場合、レシ ピエント魚類は、ドナー由来の卵子及び Z又は精子を作ると共に、レシピエント由来 の卵子及び Z又は精子を作る。しかし、ドナー魚類の方が異種のレシピエント魚類よ りも付加価値が高い場合など、ドナー由来の卵子及び Z又は精子を特異的に形成さ せることが必要とされる場合がある。本発明の課題は、ドナー魚類由来の分離始原生 殖細胞を異種のレシピエント魚類の初期胚に移植する分離始原生殖細胞の生殖細 胞系列への分化誘導方法において、レシピエント由来の卵子及び Z又は精子を形 成させることなく、ドナー由来の卵子及び Z又は精子を特異的に形成させる魚類の 増殖或いは育種を効率よく行う方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究し、ドナー魚類由来の分離始原
生殖細胞を異種のレシピエント魚類の初期胚に移植する分離始原生殖細胞の生殖 細胞系列への分ィ匕誘導方法にぉ 、て、ドナーと異なるレシピエント魚類として 3倍体 魚類を用いることにより、レシピエント由来の卵子及び Z又は精子が殆ど形成される ことなぐドナー由来の卵子及び Z又は精子、特に雌においては殆どドナー由来の 卵子が特異的に形成されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
[0007] すなわち本発明は、（1)ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を、異種のレシピエン ト魚類 (3倍体)の初期胚に移植することを特徴とする分離始原生殖細胞の生殖細胞 系列への分化誘導方法や、（2)分離始原生殖細胞が、孵化前後の胚から分離した始 原生殖細胞であることを特徴とする請求項 1記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系 列への分化誘導方法や、（3)異種のレシピエント魚類 (3倍体)の初期胚への移植が、 孵化前後の発生段階にある宿主の腹腔内腸管膜裏側への移植であることを特徴と する上記 (1)又は (2)記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分ィ匕誘導方法 や、（4)上記 (1)〜(3)の 、ずれか記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分 化誘導方法により、ドナー魚類由来の卵子及び Z又は精子を形成せしめることを特 徴とする魚類の増殖方法に関する。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]-ジマスの始原生殖細胞（2倍体）を移植したャマメ（3倍体）レシピエント (recipi ent)の精巣の移植 18ヶ月後における解剖観察の結果を示す図である。
[図 2]-ジマスの始原生殖細胞（2倍体)を移植したャマメ（3倍体)レシピエント（3n re cipient)の卵巣の移植 18ヶ月後における解剖観察の結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分ィ匕誘導方法としては、ドナー 魚類由来の分離始原生殖細胞を、異種のレシピエント魚類 (3倍体)の初期胚に移植 する方法であれば特に制限されるものではなぐ本発明の魚類の増殖方法としては、 上記本発明の分化誘導方法により、ドナー魚類由来の卵子及び Z又は精子を形成 せしめる方法であれば特に制限されるものではなぐ魚類としては海水魚、淡水魚等 特に制限されず、異種の魚類としては同属異種や異属の魚類を挙げることができ、 例えば、ドナーが-ジマスの場合、同属異種としてャマメ、異属としてブラウントラウト
、イワナを具体的に例示することができる。
[0010] また、ドナー分離始原生殖細胞のレシピエントの初期胚への移植は、初期発生段 階の宿主レシピエントの腹腔内腸管膜裏側への移植によって行うことができる。ドナ 一分離始原生殖細胞を、レシピエント（3倍体)の孵化胚の腹腔内に、マイクロインジ クシヨン法のような方法で移植すると、移植した始原生殖細胞は、自発的に宿主生 殖腺内へと移動し、そこで増殖、分化を誘導することができる。魚類においては、移 植に用いる始原生殖細胞は、孵化前後の胚力 分離した始原生殖細胞を用いること ができ、又、宿主の初期胚への移植は、孵化前後の発生段階にある宿主レシピエン ト（3倍体)を用いることができる。
[0011] 上記ドナーの始原生殖細胞を移植に用いるに際しては、該細胞の分離、精製を行 い、取得することが好ましい。魚類の始原生殖細胞は、初期発生の限られた段階、例 えば孵化前後の限られた初期発生の段階でのみ出現する細胞集団であることから、 その取得のためには、その可視化を行い、分離、精製を可能として、取得を行うこと が好ましい。始原生殖細胞の可視化には、本発明者らが報告した方法 (Int. J. Dev. Biol.44: 323-326, 2000)を用いることができる。即ち、例えば、魚類の始原生殖細胞 の可視化には、まず、魚類の生殖細胞で特異的に発現している遺伝子を取得し (Mol . Reprod. Develop. 55: 364-371, 2000)、その調節領域を利用する。魚類においては 、 vasa遺伝子を利用することができる。 vasaとは、ショウジヨウバエで F1世代が不妊 になる (F2世代が取れない)突然変異の原因遺伝子として単離され、生殖細胞にお ける mRNAの翻訳に関与する RNAヘリカーゼ活性を有すると ヽわれて ヽる遺伝子 で（蛋白質核酸酵素， 43, 356-363, 1998)、二ジマスのような魚類においても、始原 生殖細胞において特異的に発現しており、この遺伝子の発現を、始原生殖細胞の可 視化に利用することができる。
[0012] 始原生殖細胞の可視化に際して、始原生殖細胞において特異的に発現している 遺伝子の発現を用いて、生体中で始原生殖細胞を標識して分離するためには、 vas a遺伝子のように生殖細胞で特異的に発現して 、る遺伝子の調節領域に、例えば、 生体中で始原生殖細胞を可視化しうるタンパク質等をコードするマーカー遺伝子を 組込んだプラスミドを、魚類の受精卵の細胞質内に導入することによって行うことがで
きる。該マーカー遺伝子としては、蛍光タンパク質 FPをコードする遺伝子、例えばォ ンワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質 GFP (green fluorescent protein)や EGFP (E nhanced Green Fluorecent Protein)のようなマーカー遺伝子を用いることができる。
[0013] 可視化した始原生殖細胞を、生殖細胞組織から分離するには、適宜公知の方法を 用いることができる。例えば、孵化胚力 始原生殖細胞を含む生殖隆起を回収し、こ れをタンパク質分解酵素でバラバラになるまで解離し、更にこれをセルソーターに掛 けて、分取することができる。始原生殖細胞は、マーカー遺伝子の発現により、蛍光 陽性に標識されて 、るから、蛍光を発して 、る生殖細胞と蛍光を発して 、な 、他の 体細胞とを、セルソーターにより、容易に分離することができる。
[0014] 取得した始原生殖細胞は、例えば、マイクロインジヱクシヨン等の適宜の方法により 、初期発生段階のレシピエント (3倍体)の腹腔内腸管膜裏側への移植を行うことによ つて、始原生殖細胞は、自発的に宿主生殖腺内へと移動し、卵母細胞或いは精原 細胞への分化誘導、更には卵子或いは精子への分ィ匕誘導を行うことができる。本発 明の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分ィ匕誘導方法は、これを、新規個体の 作製に用いることができ、ドナー魚類の増殖方法に用いることができる。
[0015] ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を移植する 3倍体のレシピエント魚類の作製 方法としては特に制限されないが、実施例に記載されているように、通常 2倍体魚類 の雌親力 の卵と、通常 2倍体魚類の雄親力 の精子を用いて、通常の方法で人工 授精を施した後、 10°Cの流水下で発生を開始させ、受精後 15分経過した後に 28°C の温水に浸漬し、その後 10°Cの流水で通常卵となると同様に発生させる方法の他、 通常 2倍体魚類の雌親からの卵と、通常 2倍体魚類の雄親力もの精子を用いて、通 常の方法で人工授精を施した後、圧力処理によって第二極体の放出を阻止すること により卵の染色体を三倍体化した受精卵を経て、 3倍体稚魚を作出する方法や、紫 外線や γ線によって不活性ィ匕した精子を卵にかけ、発生させることで雌性発生を行 わせ、第二極体放出阻止法 (発生の過程で、圧力刺激や温度刺激によって第二極 体の放出を阻止して 2倍体にする方法)又は第一卵割阻止法 (発生の段階で第二極 体を放出して雌性前核のみで発生を開始したところに、物理ィ匕学的な刺激を与え、 第 1回の卵割を阻止して 2倍体とする方法）により染色体を倍加する方法や、雌魚を
雄性ホルモン (テストステロン)で処理して、性転換を起こさせ雄化させ、この偽雄と普 通の雌を交配する方法等を挙げることができる。 3倍体のレシピエントとしては、殆どド ナー由来の卵子が特異的に形成される雌が好ましい。
[0016] 本発明の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法の魚類の増殖方 法への利用としては、該分化誘導方法を魚類の異種個体の卵子及び Z又は精子の 形成に用い、これを用いて魚類等の大量の増殖に利用することができる。本発明の 増殖方法の特徴として、レシピエントとして 3倍体宿主を用いるため殆ど始原生殖細 胞を保持していない。ここにドナー由来の始原生殖細胞を移植することで、レシピエ ント（3倍体)宿主生殖腺内で、ドナー始原生殖細胞に由来する卵 '精子、が殆どを占 めることになる。
[0017] また、ドナー始原生殖細胞は孵化前後の極めて若い胚に由来するため、元来その 増殖能力が極めて高ぐ移植後の異種の 3倍体宿主個体内であっても、その増殖が 極めて早 、ことが確認されて 、る。さらに精原細胞の移植では精子しか作れな 、が、 始原生殖細胞は性が分ィ匕する以前の細胞であるため、卵'精子の両者の形成が可 能である。ちなみに魚類では卵の凍結保存技術が完成していないため、本始原生殖 細胞を凍結保存後、移植により卵'精子を作れば遺伝子始原の保存と技術となる。
[0018] (実施例）
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。本発明の実施例として、ニジマスを用いた例 を示し、本発明を説明する。
[0019] (実施例 1)
[ャマメ (3倍体)の調製]
宿主となるャマメ（3倍体)の調製は、通常 2倍体ャマメの雌親からの卵と、通常 2倍 体ャマメの雄親からの精子を用いて、通常の方法で人工授精を施した後、 10°Cの流 水下で発生を開始させ、受精後 15分経過した後に 28°Cの温水に浸漬し、その後 10 °Cの流水で通常卵となると同様に発生させ、受精後 35日に達した個体を宿主ャマメ (3倍体)として実験に供した。なお、受精後 35日に達した段階の幼魚の 3倍体化率 を、 DNA量の顕微測光法で調べたところ、 99. 8%であり、殆どの幼魚が 3倍体とな
つていた。
[0020] (実施例 2)
[分離した始原生殖細胞のャマメ (3倍体)初期胚での分化誘導]
(分離始原生殖細胞のャマメ (3倍体)初期胚への導入）
特開 2003— 235558号公報記載の方法により、 -ジマスの vasa遺伝子の発現調 節領域にォワンクラゲ由来の GFP遺伝子を接続し、可視化した-ジマスの始原生殖 細胞（2倍体)を、異種個体である宿主ャマメ（3倍体)の初期胚に導入した。この GF P遺伝子を導入した始原生殖細胞は特異的に緑色蛍光を発するため、生きたャマメ (3倍体)個体内で可視化することができる。ャマメ（3倍体)の初期胚への始原生殖 細胞の導入は、 -ジマスの孵化前後の胚 (水温 10°Cで飼育した場合、受精後 30— 4 0日の胚、孵化は受精後 32日）から、前記の方法で単離した始原生殖細胞 10個程 度を、マイクロインジェクターに装着したガラス製のマイクロピペットで吸引し、同じ初 期発生段階のャマメ (3倍体)個体の腹腔内腸管膜裏側に移植した。
[0021] (移植した始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導）
初期発生段階のャマメ (3倍体)個体の腹腔内腸管膜裏側に移植した始原生殖細 胞は、自発的に未熟生殖腺に向力つて移動を開始し、そこで生殖腺内に取り込まれ る。導入効率の確認は、移植後に経時的に宿主生殖線を蛍光観察し、ドナー由来の 生殖細胞の割合を調査した。移植後、 60日目において、移植した始原生殖細胞が 生殖腺中の生殖隆起へ移動し、生殖隆起内に取り込まれて、更に増殖しているのが 観察された。その後、移植した始原生殖細胞は、宿主レシピエント生殖腺内で効率よ く増殖し、精巣において精原細胞に、卵巣において卵原細胞'卵母細胞に分化誘導 しているのが観察された。これらの卵母細胞や精原細胞は、ャマメ（3倍体)個体内で 、卵子又は精子に分ィ匕するので、これらの生殖細胞を用いることにより、新しい-ジマ ス個体を作製することができる。
[0022] (実施例 3)
[精子'卵子の形成]
-ジマスの始原生殖細胞（2倍体）を移植したャマメ（3倍体）レシピエント (recipient )を、移植 18ヶ月後に精巣と卵巣の蛍光顕微鏡による解剖観察を行った。対照として
は、移植したャマメ（3倍体）レシピエント（recipient)と同ステージの移植をしなかった 3倍体ャマメ (3n control)、及び-ジマスの始原生殖細胞（2倍体）を移植した移植 1 8ヶ月後ャマメ（2倍体)レシピエント（2n control)を用いた。精巣における解剖結果を 図 1 (参考写真 1)に、卵巣における解剖結果を図 2 (参考写真 2)に示す。図 1からわ かるように、ャマメ（3倍体）レシピエント (recipient)精巣内に大きなコロナィズが認め られた。また、図 2からわかるように、ャマメ（2倍体）レシピエント（2n control)と同程 度に発達したドナー由来の卵がャマメ（3倍体)レシピエント（3n recipient)の卵巣を 満たしていた。
産業上の利用可能性
本発明によると、ドナー魚類由来の始原生殖細胞を用いて、これを異種のレシピエ ント魚類（3倍体)の初期胚に移植することにより、レシピエント由来の卵子及び Z又 は精子が殆ど形成されることなぐドナー由来の卵子及び Z又は精子、特に雌にお いては殆どドナー由来の卵子が特異的に形成されることから、例えば、分離した始原 生殖細胞を、異種系統や異種の宿主個体 (3倍体）に移植して、魚類等の借り腹とし ての利用が可能となり、この方法により、マグロのような巨大な種の始原生殖細胞を 小型の近縁種に移植することで、異種系統や異種の宿主個体由来の稚魚が殆ど混 じって 、な 、のでこれらを分離する手間が省け、マグロ特異的な稚魚生産が可能とな る。また、希少種、絶滅危惧種の始原生殖細胞を凍結保存し、必要な時に飼育が容 易な近縁種に移植することにより、近縁種由来の卵子や精子が混じっていない希少 種、絶滅危惧種特異的な遺伝子資源の保存への利用が可能となる。
Claims
[1] ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を、異種のレシピエント魚類 (3倍体)の初期胚 に移植することを特徴とする分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法
[2] 分離始原生殖細胞が、孵化前後の胚から分離した始原生殖細胞であることを特徴と する請求項 1記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[3] 異種のレシピエント魚類 (3倍体)の初期胚への移植が、孵化前後の発生段階にある 宿主の腹腔内腸管膜裏側への移植であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の分 離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[4] 請求項 1〜3の！、ずれか記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方 法により、ドナー魚類由来の卵子及び Z又は精子を形成せしめることを特徴とする魚 類の増殖方法。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AK | Designated states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW |
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| AL | Designated countries for regional patents |
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| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application | ||
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
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| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 05788170 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |