MX2011003380A - Genotecas de anticuerpo mejoradas. - Google Patents
Genotecas de anticuerpo mejoradas.Info
- Publication number
- MX2011003380A MX2011003380A MX2011003380A MX2011003380A MX2011003380A MX 2011003380 A MX2011003380 A MX 2011003380A MX 2011003380 A MX2011003380 A MX 2011003380A MX 2011003380 A MX2011003380 A MX 2011003380A MX 2011003380 A MX2011003380 A MX 2011003380A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- seq
- library
- nucleic acid
- scfv
- pcr
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 97
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 80
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 70
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 59
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 23
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 19
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 17
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 17
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 16
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 11
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 10
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 claims description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N triethylene glycol Chemical group OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 107
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 107
- 239000000047 product Substances 0.000 description 107
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 79
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 66
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 63
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 42
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 41
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 40
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 38
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 35
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 31
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 30
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 30
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 29
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 28
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 28
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 27
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 25
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 24
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 23
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 19
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 19
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 18
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 17
- 238000002824 mRNA display Methods 0.000 description 16
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 15
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 15
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 9
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 8
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 5
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 3
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 235000019606 astringent taste Nutrition 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 101000651036 Arabidopsis thaliana Galactolipid galactosyltransferase SFR2, chloroplastic Proteins 0.000 description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical group [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 2
- 235000021395 porridge Nutrition 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000011172 small scale experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101710179738 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710179734 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100039819 Actin, alpha cardiac muscle 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101100248198 Arabidopsis thaliana RGGA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- RNPABQVCNAUEIY-GUQYYFCISA-N Germine Chemical compound O1[C@@]([C@H](CC[C@]23C)O)(O)[C@H]3C[C@@H](O)[C@@H]([C@]3(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]4[C@]5(C)O)[C@@]12C[C@H]3[C@@H]4CN1[C@H]5CC[C@H](C)C1 RNPABQVCNAUEIY-GUQYYFCISA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101000959247 Homo sapiens Actin, alpha cardiac muscle 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004782 Lambda Substances 0.000 description 1
- 101710186608 Lipoyl synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710137584 Lipoyl synthase 1, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101710090391 Lipoyl synthase 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101710186609 Lipoyl synthase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710122908 Lipoyl synthase 2, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101710101072 Lipoyl synthase 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- GEYBMYRBIABFTA-VIFPVBQESA-N O-methyl-L-tyrosine Chemical compound COC1=CC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C=C1 GEYBMYRBIABFTA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 108090000279 Peptidyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 238000013381 RNA quantification Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241001468001 Salmonella virus SP6 Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001235254 Thermococcus kodakarensis Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000000367 ab initio method Methods 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- RNPABQVCNAUEIY-UHFFFAOYSA-N germine Natural products O1C(C(CCC23C)O)(O)C3CC(O)C(C3(O)C(O)C(O)C4C5(C)O)C12CC3C4CN1C5CCC(C)C1 RNPABQVCNAUEIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010033706 glycylserine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000012750 in vivo screening Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
- C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/185—Nucleic acid dedicated to use as a hidden marker/bar code, e.g. inclusion of nucleic acids to mark art objects or animals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La presente invención presenta genotecas de despliegue de ARN in vitro mejoradas para permitir la expresión y selección confiables de moléculas de anticuerpo de scFv a partir de las genotecas de expresión. Las genotecas de anticuerpo de scFv de la invención contienen un enlazador inter-dominio acortado, optimizado que mejora la expresión de la expresión de anticuerpo de scFv. Las genotecas de anticuerpo de scFv también incluyen códigos de barras de ácido nucleico cortos que permiten la identificación de clones de genoteca individuales, genotecas o subconjuntos de las mismas. También se proveen iniciadores para generar, amplificar y tipificar por espectros las genotecas de anticuerpo de scFv de la invención.
Description
GENOTECAS DE ANTICU ERPO M EJORADAS
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reclama prioridad para la Solicitud Provisional E. U .A. No. 61 /1 01 ,483 presentada el 30 de septiembre de 2008 , cuyos conten idos se incorporan en la presente solicitud para referencia .
CAM PO DE LA INVENCION
La invención se refiere a genotecas de anticuerpo mejoradas y a métodos y materiales para elaborarlas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Los anticuerpos que se unen con alta especificidad y afinidad a casi cualquier epítope estructural se utilizan en forma rutinaria como herramientas de investigación y como agentes terapéuticos aprobados por la FDA. Como resultado, los anticuerpos monoclonales terapéuticos y para diagnóstico constituyen u n mercado multimillonario en dólares en todo el mundo.
Los métodos clásicos de inmunización de animales para obtener anticuerpos son lentos y problemáticos . Como consecuencia , se han desarrollado varios métodos para selección ex vivo de un anticuerpo contra u na molécula objetivo deseada utilizando
genotecas de anticuerpo sintético. En alg unos métodos , las genotecas de anticuerpos , o fragmentos de los mismos , se despliegan sobre la superficie de u n organismo (por ejemplo, una célula de levad ura , célula bacteriana o célula de mam ífero) o u n agente sub-microscópico (por ejemplo, un bacteriófago o virus) , y el organismo o agente sub-microscópico se selecciona para expresión del anticuerpo deseado . En otros métodos, las genotecas de anticuerpo se expresan y seleccionan en un sistema in vitro libre de células. Los sistemas de expresión in vitro actuales , aunque buenos para expresar dominios variables de anticuerpo ind ividual , son ineficientes para expresar anticuerpos de dominios múltiples tales como las moléculas de anticuerpo de cadena ind ividual (scFv) . Esto se debe tanto a la estructura de las genotecas de anticuerpo de scFv actuales como a las condiciones de reacción de los sistemas de expresión in vitro actuales.
Por lo tanto, existe en la técn ica la necesidad de genotecas de anticuerpo mejoradas para selección de anticuerpos de scFv contra u n objetivo deseado.
BREVE DESCRI PCION DE LA INVENCION
La invención resuelve los problemas anteriores al proveer genotecas de ARN de despliegue in vitro mejoradas para permitir la expresión y selección confiables de moléculas de anticuerpo de scFv.
La invención tiene varias ventajas , las cuales incluyen pero no se limitan a, las siguientes:
• proveer una genoteca de anticuerpo de scFv de despliegue in vitro mejorada que contiene un enlazador ¡nter-dominios optimizado para expresión mejorada;
• proveer una genoteca de anticuerpo de scFv de despliegue in vitro mejorada que contiene códigos de barra de ácido nucleico cortos;
• proveer iniciadores para generar las genotecas de anticuerpo de scFv de despliegue in vitro mejoradas;
• proveer iniciadores para tipificar por espectros las regiones de CDR3 de las regiones variables de la cadena pesada de las moléculas de anticuerpo de scFv en las genotecas de la invención; y
• métodos para elaborar las genotecas de despliegue in vitro mejoradas.
En un aspecto, la invención provee un oligonucleotido que consiste de una secuencia de ácido nucleico como la indicada en cualquiera de SEQ ID NOs: 1-14, 19-42, y 58-210. En otro aspecto, la invención provee un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico como la indicada en cualquiera de SEQ ID NOs: 1-14, 19-42, y 58-210.
En otro aspecto, la invención provee un oligonucleótido que consiste de una secuencia de ácido nucleico como la que se indica en cualquiera de SEQ ID NOs: 14-16, y 43-57. En otro aspecto, la invención provee un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico como la indicada en cualquiera de SEQ ID NOs: 14-16, y 43-57.
Incluso en otro aspecto, la invención provee un oligonucleótido que consiste de una secuencia de ácido nucleico como la indicada en SEQ ID NOs: 17 o 18. En otro aspecto, la invención provee un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico como la indicada en SEQ ID NOs: 17 o 18.
En una modalidad, la invención provee el uso de cualquiera de las secuencias indicadas en SEQ. ID NOs: 1-210 para amplificación de genoteca, transcripción inversa de genoteca, y/o tipificación por espectros de la genoteca.
En otro aspecto, la invención provee una genoteca de ácido nucleico para expresión de anticuerpos de cadena individual (scFv), la genoteca comprende un repertorio de secuencias que codifican para los dominios variables de la cadena pesada y los dominios variables de la cadena ligera, en el cual cada miembro de dicha genoteca contiene un marco de lectura abierto que comprende un dominio variable de la cadena pesada, un dominio variable de la cadena ligera, y una región enlazadora, y en el cual dicha genoteca se genera utilizando uno o más de los oligonucleotidos indicados en SEQ ID NOs: 1-210.
En una modalidad, la genoteca también comprende una región enlazadora que codifica para menos de 20 aminoácidos. En otra modalidad, la genoteca también comprende una región
enlazadora que codifica para 15 aminoácidos.
En una modalidad, cada miembro de la genoteca también comprende un promotor ligado en forma operable al marco de lectura abierto. En otra modalidad, el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste de T7, SP6, y T3. Incluso en otra modalidad, el promotor es un promotor T7.
En una modalidad, cada miembro de la genoteca también comprende una región 5' no traducida (5'UTR) que puede incrementar la transcripción de un gen al cual ésta está ligada en forma operable. En otra modalidad, la 5'UTR es una 5'UTR del Virus del Mosaico del Tabaco o un fragmento activo de la misma. En otra modalidad, cada miembro de la genoteca también comprende una secuencia de poliadenina.
Incluso en otra modalidad, la genoteca también comprende un código de barras de ácido nucleico. En otra modalidad, el código de barras de ácido nucleico comprende 8 nucleótidos.
En otra modalidad, cada miembro de la genoteca también comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una marca de epítope. Incluso en otra modalidad, la marca de epítope es una marca FLAG. Incluso en otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es parte de la región enlazadora del scFv. En otra modalidad, la genoteca también comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región constante de anticuerpo, o fragmento de la misma.
En una modalidad, la genoteca también comprende una
secuencia de pausa de ribosoma.
En una modalidad, la genoteca también comprende un aceptor de péptido. En otra modalidad, el aceptor de péptido está ligado covalentemente a través de un enlazador que comprende una molécula de Psoraleno C6. Incluso en otra modalidad, el enlazador es 5'(Psoraleno C6)2'Ome(U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (Puromicina), en el cual X es un enlazador de trietilenglicol o PGE-150 y CC es una estructura base de ADN.
En otro aspecto, la invención provee un método para producir una genoteca de ácido nucleico para expresión de anticuerpos de cadena individual (scFv) que comprende (a) proveer una composición de ácido nucleico, en la cual por lo menos una porción de los ácidos nucleicos en la composición comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para un dominio variable de anticuerpo y (b) amplificar una pluralidad de dominios variables de anticuerpo utilizando uno o más oligonucleótidos indicados en SEQ ID NOs: 1-210.
En otro aspecto, la invención provee un método para tipificación por espectros de un ácido nucleico que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para un dominio variable de anticuerpo que comprende (a) proveer una composición de ácido nucleico, en la cual por lo menos una porción de los ácidos nucleicos en dicha composición comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para un dominio variable de anticuerpo y (b) amplificar las regiones de CD3 de dichos dominios variables utilizando uno o más oligonucleótidos indicados en SEQ ID NOs 1-210.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra un esquema general para la tecnología de despliegue de ARNm-scFv en algunas modalidades de la invención.
La Figura 2 muestra un esquema general para la tecnología de despliegue de ARNm-scFv en algunas modalidades de la invención.
La Figura 3 muestra una representación general de una construcción de ADN de la genoteca.
La Figura 4 muestra el scFv funcional generado como moléculas de ARNm-scFv.
La Figura 5 muestra los resultados que muestran que un scFv unido en un formato de molécula de ARNm-scFv es funcionalmente equivalente a una molécula de scFv libre.
La Figura 6 muestra cuatro marcas de 8 pares de bases que se insertan entre la TMV-UTR y la secuencia de consenso de Kozak de la construcción de ARNm-scFv de 17/9.
La Figura 7 muestra las construcciones de ejemplo y secuencias de control.
La Figura 8 muestra las secuencias de marca aleatoria identificadas en tres rondas de selección.
La Figura 9 muestra los resultados de la cuantificación de scFv de 17/9 antes y después de una ronda de selección de ARNm-scFv.
La Figura 10 muestra las quimeras entre D2E7 y 2SD4. La Figura 11 muestra las curvas de KD para diferentes ligadores de TNFa.
La Figura 12 muestra la termoestabilidad de las moléculas de ARNm-scFv.
La Figura 13 muestra los resultados que muestran que el ARN se recupera después del tratamiento a temperatura elevada de moléculas de ARNm-scFv.
La Figura 14 muestra la distribución por edades, grupo étnico y género de los donadores de PBMC en una genoteca PROfusion de scFv kappa de PBMC de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 15 muestra los fragmentos de PCR específicos de familia de VH en la genoteca PROfusion construida de scFv kappa de PBMC de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 16 muestra los fragmentos de PCR específicos de familia VK en la genoteca PROfusion de scFv kappa de PBMC de humano no afectado por tratamiento construida.
La Figura 17 muestra los productos de PCR de scFv de VH-VK en la genoteca PROfusion construida de scFv kappa de PBMC de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 18 muestra la distribución de las familia VH y VK en la genoteca PROfusion construida de scFv kappa de PBMC de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 19 muestra el análisis de tipificación por espectros de los tamaños de CDR3 de anticuerpo contra PBMC de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 20 muestra el control de calidad de la genoteca VH/V mediante análisis de tipificación por espectros.
La Figura 21 representa los fragmentos de PCR específicos de familia ?? en una genoteca PROfusion de scFv lambda de PBMC de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 22 muestra los productos de PCR de scFv de VH-?? en la genoteca PROfusion construida de scFv lambda de PBMC de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 23 muestra la distribución de las familia VH y \? en la genoteca PROfusion construida de scFv lambda de PBMC de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 24 muestra el esquema de construcciones de genoteca PROfusion en genotecas PROfusion de scFv kappa y lambda de nodo linfático de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 25 muestra los fragmentos de PCR específicos de familia VH en las genotecas PROfusion construidas de scFv kappa y lambda de nodo linfático de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 26 muestra los fragmentos de PCR específicos de familia VK en las genotecas PROfusion construidas de scFv kappa y lambda de nodo linfático de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 27 muestra los fragmentos de PCR específicos de familia ?? en las genotecas PROfusion construidas de scFv kappa y lambda de nodo linfático de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 28 muestra los productos de PCR de scFv de VH-VK y VH-? ? en las genotecas PROfusion construidas de scFv kappa y lambda de nodo linfático de humano no afectado por tratamiento.
La Figura 29 muestra las distribuciones de las familias de VH y VK en una genoteca de scFv de VH-VK construida.
La Figura 30 muestra las distribuciones de las familias de VH y ?? en la genoteca de scFv de VH-V construida.
La Figura 31 muestra el control de calidad de las genotecas de VH-VK y VH-?? mediante análisis de tipificación por espectros en la genoteca de scFv de VH-?? construida.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Con el fin que la presente invención se pueda entender más fácilmente, se definen primero algunos términos.
I. Definiciones
El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos humanizados, anticuerpos de humano, anticuerpos de múrido y fragmentos de los mismos, por ejemplo, una cadena ligera (VL) de anticuerpo, una cadena pesada (VH) de anticuerpo, un anticuerpo de cadena individual (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, y un fragmento de anticuerpo de dominio individual (DAb).
El término "genoteca de anticuerpo" se refiere a una pluralidad de moléculas de ADN o ARN que contienen un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para un anticuerpo o fragmento del mismo. Este también incluye una pluralidad de proteínas de anticuerpo y moléculas de fusión de ácido nucleico/anticuerpo expresadas a partir de dichas moléculas de ADN o ARN.
El término "dominio variable de la cadena pesada" se refiere al ácido nucleico que codifica para una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y al producto de proteína de dicho ácido nucleico.
El término "dominio variable de la cadena ligera" se refiere al ácido nucleico que codifica para una región variable de la cadena ligera del anticuerpo y al producto de proteína de dicho ácido nucleico.
El término "tipificación por espectros" se refiere a un método basado en PCR que separa secuencias genéticas que codifican para anticuerpos tomando como base la longitud de CDR3. Los cambios en la distribución de longitud de CDR3 se correlacionan con cambios en el repertorio del anticuerpo (Janeway et al.
"Immunobiology", 5a ed. Garland Publishing, Nueva York y Londres, (2001)).
El término "marca de epítope" se refiere a una secuencia de aminoácido corta que es reconocida específicamente por un anticuerpo que está unido químicamente o genéticamente a una molécula para permitir su detección por parte de dicho anticuerpo, por ejemplo, una marca FLAG, una marca HA, una marca MYC o una marca T7.
El término "código de barras de ácido nucleico" se refiere a un ácido nucleico corto incluido en la región no traducida de las genotecas de la invención. El código de barras es una secuencia aleatoria o predeterminada que sirve para proveer un identificador único para un clon individual o una pluralidad de miembros de la genoteca.
El término "secuencias de tipo no anticuerpo" se refiere a cualesquiera secuencias de ácido nucleico o aminoácido que aparecen en las genotecas de anticuerpo de la invención que no son parte de la secuencia de anticuerpo original. Dichas secuencias incluyen, por ejemplo, marcas de epítope, o códigos de barras de ácido nucleico.
El término "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ácido nucleico o elementos genéticos necesarios para la expresión de una secuencia codificadora ligada en forma operable en un organismo hospedero particular, agente sub-microscópico o sistema de expresión in vitro. Dichas secuencias son bien conocidas en la técnica. Las secuencias de control que son apropiadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, e incrementadores. Un ácido nucleico está "ligado en forma operable" cuando éste está colocado dentro de una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o incrementador está ligado en forma operable a una secuencia codificadora si éste afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está ligado en forma operable a una secuencia codificadora si éste está posicionado de modo tal que facilite la traducción. En términos generales, "ligado en forma operable" significa que las secuencias de ácido nucleico que están ligadas son contiguas. Sin embargo, los incrementadores no tienen que ser contiguos. El enlazamiento se logra, por ejemplo, mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se utilizan adaptadores o enlazadores de oligonucleótido sintéticos de conformidad con la práctica convencional.
El término "unión específica" o "se une específicamente a" se refiere a la capacidad de una molécula de unión de unirse a un objetivo con una afinidad de por lo menos aproximadamente 1 x 10"6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x10"9 M, 1 x 1010 M, 1 x 10"11 M, 1 x 10'12 M o más, y/o de unirse a un objetivo con una afinidad que es por lo menos dos veces más grande que su afinidad para un antígeno no específico.
El término "objetivo" se refiere a un antígeno o epítope reconocido por un anticuerpo. Los objetivos incluyen, por ejemplo, cualquier péptido, proteínas, sacáridos, ácidos nucleicos, lípidos, y moléculas pequeñas para las cuales se genera un anticuerpo específico. En una modalidad, los anticuerpos son contra una proteína de humano, por ejemplo, TNFa, IL-12 o IL-1a.
Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la cual un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica.
El término "despliegue de ARN" o "despliegue de ARNm" se refiere a una técnica in vitro en la cual, las proteínas o péptidos expresados están ligados covalentemente o mediante interacción no covalente fuerte a su ARNm codificador para formar moléculas de "fusión de ARN/proteína". El componente de proteína o péptido de una fusión de ARN/proteína se selecciona para unión a un objetivo deseado y la identidad de la proteína o péptido se determina mediante secuenciación del componente de ARNm codificador unido. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes E.U.A. Nos. 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197, 7,022,479, 6,518,018; 7,125,669; 6,846,655; 6,281,344; 6,207,446; 6,214,553; 6,258,558; 6,261,804; 6,429,300; 6,489,116; 6,436,665, 6,537,749; 6,602,685; 6,623,926; 6,416,950; 6,660,473; 6,312,927; 5,922,545; y 6,348,315.
El término "anticuerpo de Fv de cadena individual" o "scFv" se refiere a una porción de unión a antígeno de una región variable de la cadena ligera y a una porción de unión a antígeno de una región variable de la cadena pesada, unidas, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite que éstas se puedan elaborar como una cadena de proteína individual en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena individual (scFv); véase por ejemplo Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 85:5879-5883).
El término "porción funcional" se refiere a cualquier entidad biológica o química que imparte funcionalidad adicional a una molécula a la cual ésta está unida.
El término "seleccionar" se refiere a sustancialmente separar una molécula de otras moléculas en una población. Tal como se utiliza en la presente solicitud, un paso de "selección" provee un enriquecimiento de por lo menos 2 veces, de preferencia, de 30 veces, más preferible, de 100 veces, y de manera más preferida de 1000 veces de una molécula deseada con relación a moléculas no deseadas en una población después del paso de selección. Tal como se indica en la presente solicitud, un paso de selección se puede repetir cualquier cantidad de veces, y se pueden combinar tipos diferentes de pasos de selección en un método determinado.
El término "secuencia de pausa" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que ocasiona que un ribosoma
desacelere o detenga su velocidad de traducción .
El término "soporte sólido" se refiere a , sin limitación , cualquier columna (o material de columna) g lóbulo, tubo de ensayo, placa de microtitulación , partícula sólida (por ejemplo, agarosa o sefarosa) , microchip por ejemplo, ch ip de silicio, de silicio-vidrio, o de oro) , o membrana (por ejemplo, la membrana de u n líposoma o vesícula) al cual se puede unir un complejo de afinidad , ya sea directamente o indirectamente (por ejemplo, a través de otros intermediarios de compañero de unión tal como otros anticuerpos o proteína A) , o en el cual puede estar incrustado u n complejo de afinidad (por ejemplo, a través de un receptor o canal) .
El término "reg ión enlazadora" se refiere a u na región de ácido nucleico q ue conecta las secuencias de ácido n ucleico que codifican para los dominios de VH y VL del anticuerpo en un gen de anticuerpo de scFv. U na región enlazadora está en marco con las secuencias de ácido nucleico que codifican para la VH y VL del anticuerpo de modo tal que se forma un marco de lectura abierto contin uo que contiene las regiones de VH , VL y en lazadoras. El término también se refiere a la región que conecta la VH y VL en una proteína de scFv.
El término "aceptor de péptido" se refiere a cualquier molécula q ue puede ser ag regada al extremo C-termi nal de una cadena de proteína naciente mediante la actividad catal ítica de u na peptidil transferasa ribosómica. Típicamente, dichas moléculas contienen (i) un n ucleótido o porción tipo n ucleótido (por ejemplo, puromicina y análogos de la misma)), (ii) un aminoácido o porción tipo aminoácido (por ejemplo cualquiera de los 20 D-aminoácidos o L-aminoácidos o cualquier análogo de aminoácido de los mismos (por ejemplo, O-metil-tirosina o cualquiera de los análogos descritos por Ellman et al. (1991) Meth, Enzymol. 202:301), y (iii) un enlazamiento entre los dos (por ejemplo, un enlazamiento tipo éster, amida, o cetona en la posición 3' o, menos preferida, la posición 2'); de preferencia, este enlazamiento no altera significativamente la estructura de anillo desde la conformación de ribonucleótido natural. Además, este término abarca, sin limitación, una molécula aceptora de péptido que esté unida covalentemente (ya sea directamente o indirectamente a través de una secuencia de ácido nucleico intercalada) a la secuencia codificadora de proteína, así como una que esté unida a la secuencia codificadora de proteína mediante algunos medios no covalentes, por ejemplo, a través de hibridación utilizando una segunda secuencia de ácido nucleico que se una en o cerca del extremo 3' de la secuencia codificadora de proteína y que por sí misma esté unida a una molécula aceptora de péptido.
II. Generalidades
La presente invención presenta genotecas de despliegue de ARN in vitro mejoradas para permitir la expresión y selección confiables de moléculas de anticuerpo de scFv a partir de genotecas de expresión. Los métodos de despliegue de ARN generalmente implican expresión de una genoteca de proteínas o péptidos, en la cual las proteínas o péptidos expresados están ligados covalentemente o mediante interacción no covalente fuerte a su ARNm codificador para formar moléculas de fusión de ARN/proteína . El componente de proteína o péptido de u na fusión de ARN/proteína se selecciona para unión a un objetivo deseado y la identidad de la proteína o péptido se determina med iante secuenciación del componente de ARNm codificador unido.
Las genotecas de anticuerpo de scFv de la invención contienen un enlazador inter-dominio, acortado, optimizado que mejora la expresión de anticuerpo de scFv. Las genotecas de anticuerpo de scFv también incluyen cód igos de barras de ácido nucleicos cortos que permiten la identificación de clones individuales de la genoteca, genotecas o subconjuntos de las mismas.
La presente invención también provee iniciadores novedosos para generar, amplificar y tipificar espectralmente las genotecas de anticuerpo de scFv de la invención .
I I I . Construcción de la genoteca
Como un desarrollo de la tecnología de anticuerpo para generar candidatos de fármaco tipo anticuerpo monoclonal , esta invención describe el desarrollo de dos métodos para generación de anticuerpo recombinante, PROfusion (despliegue de ARNm) y despliegue en superficie de levadura . La tecnolog ía de despliegue de ARN m PROfusion es un método ab initio para someter a tamizaje genotecas de anticuerpo de humano. La tecnolog ía de despliegue en superficie de levadura es un método celular para someter a tamizaje anticuerpos monoclonales específicamente desplegados sobre la superficie de la levadura.
En un aspecto, la invención presenta genotecas de anticuerpo novedosas que pueden expresar moléculas de anticuerpo. Las genotecas de la invención se generan a partir de cualquier fragmento de anticuerpo que se pueda unir a un objetivo. En una modalidad, se generan genotecas de dominio variables de anticuerpo. En una modalidad, estos son los dominios de VH y/o VL. En otra modalidad, se generan genotecas de scFv.
Las genotecas de la invención también pueden incluir regiones codificadoras de las secuencias de ácido nucleico de anticuerpo fuera de las regiones variables, por ejemplo, una región constante o fragmentos de la misma, o una región de gozne.
Las genotecas de ácido nucleico de la invención pueden comprender elementos de ARN, ADN, o tanto ARN como ADN.
1 ) Generación de la diversidad de aportación de ácido nucleico
Las secuencias de ácido nucleico utilizadas para generar las genotecas de anticuerpo de la invención se pueden obtener a partir de cualquier fuente. En una modalidad, las genotecas de la invención se pueden obtener a partir del repertorio de anticuerpo de un animal, incluyendo, pero sin limitarse a, roedores, primates, camélidos, tiburones, o cualquier animal transgénico que contenga un repertorio de genes de inmunoglobulina de humano. Las técnicas para el aislamiento y clonación de ácidos nucleicos que codifican para las regiones variables del complemento de anticuerpo de un organismo son bien conocidas en la técnica. En efecto, muchas genotecas de ADNc que contienen ácidos nucleicos que codifican para las regiones variables de anticuerpos se pueden conseguir comercialmente, por ejemplo, genotecas de regiones variables de anticuerpo de humano generadas a partir de varias células inmunes, por ejemplo, células mononucleadas de sangre periférica (PBMC), de bazo o de nodo linfático. En otra modalidad, las genotecas de la invención se pueden obtener mediante síntesis ab initio de ácidos nucleicos que codifican para uno o más anticuerpos.
Las genotecas de la invención pueden requerir la introducción de diversidad adicional mediante introducción de substituciones y/o deleciones nucleicas que den como resultado una o más sustituciones y/o deleciones de aminoácido en las moléculas de anticuerpos expresadas. Se contemplan cualesquiera métodos de mutagénesis reconocidos en la técnica, por ejemplo, mutagénesis aleatoria de "recorrido a través de mutagénesis" y de "observación a través de mutagénesis". Dichas mutagénesis de un anticuerpo se pueden lograr utilizando por ejemplo, PCR propensa a error, cepas de "mutador" de levadura o bacteria, o la incorporación de cambios aleatorios o definidos de ácido nucleico durante la síntesis ab initio de todo o una parte de un anticuerpo. En una modalidad, se puede crear una genoteca de moléculas de anticuerpo en la cual uno o más aminoácidos están mutados en forma aleatoria. En otra modalidad, se puede crear un genoteca de moléculas de anticuerpo en la cual uno o más aminoácidos están mutados a uno o más aminoácidos predeterminados.
2) Secuencias de Control
Las genotecas de ácido nucleico de la invención pueden contener secuencias de control adicionales para facilitar la expresión y tamizaje de los anticuerpos codificados in vitro.
Una de dichas secuencias de control puede ser un promotor que se va a utilizar en conjunción con una ARN polimerasa deseada para síntesis de ARNm. Como se describe en la presente solicitud, se puede utilizar cualquier promotor que pueda dirigir la síntesis a partir de un ADN de doble cadena lineal, por ejemplo, los promotores T7, SP6 o T3 de fago.
Una segunda secuencia de control puede ser denominada la región 5' no traducida (o 5'UTR) y corresponde al ARN hacia el extremo 3' del sitio de inicio de traducción. Se puede utilizar cualquier otra 5'UTR apropiada (véase por ejemplo, Kozak (1983) Microbiol. Rev. 47:1). En una modalidad, la 5'UTR (denominada "TE") puede ser un mutante de deleción de la región 5' no traducida del Virus del Mosaico del Tabaco y, en particular, corresponde a las bases directamente en el extremo 5' del inicio de traducción de TMV; la secuencia de esta UTR es la siguiente: rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA (en la que los 3 primeros nucleótidos G se insertan para aumentar la transcripción).
Un tercer elemento puede ser un sitio de inicio de traducción. En general, éste es un codón AUG. Sin embargo, existen ejemplos en los cuales se utilizan codones diferentes de AUG en secuencias codificadoras normalmente presentes en la Naturaleza, y estos codones también se pueden utilizar en el esquema de selección de la invención. Este sitio de inicio de traducción de preferencia está en un contexto de secuencia apropiado denominado una secuencia de "Kozak" (véase, por ejemplo, Kozak (1983) Microbio, Rev. 47:1).
Un cuarto elemento puede ser una secuencia de poliadenilación (poli A) que contiene un codón de detención 5'. La secuencia poli A puede ser colocada después de la secuencia codificadora del anticuerpo dentro de la construcción de genoteca de ácido nucleico. Dichas secuencias son bien conocidas en la técnica y se contempla cualquiera de dichas secuencias.
3) Elementos de secuencia de ácido nucleico adicionales Las genotecas de ácido nucleico de la invención también pueden incluir elementos de secuencia adicionales que se incorporan en transcritos de ARNm, que codifican para los anticuerpos. Estos pueden incluir secuencias de tipo no anticuerpo.
En una modalidad, se puede incorporar una secuencia de ácido nucleico corta, o "código de barras de ácido nucleico", en la porción no traducida de un transcrito de ARNm del anticuerpo. Estas secuencias de código de barras pueden servir como identificadores únicos para distinguir miembros individuales de una genoteca de ácido nucleico o para distinguir entre genotecas diferentes. Las secuencias de ácido nucleico cortas de preferencia contienen menos de 50 bases, menos de 20 bases o menos de 10 bases. En una modalidad, las secuencias de ácido nucleico cortas comprenden 8 bases.
En otras modalidades, se pueden incorporar elementos de secuencia de ácido nucleico que codifiquen para una secuencia de aminoácido de tipo no anticuerpo específica en el marco de lectura abierto (ORF) de las genotecas de ácido nucleico de la invención de modo tal que la secuencia de aminoácido codificada se incorpore en el anticuerpo expresado. En una modalidad, se puede incorporar un elemento de secuencia de ácido nucleico de tipo no anticuerpo en el ORF de un scFv entre las regiones VH y VL para que sirva como una región enlazadora. Se puede contemplar cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique para una secuencia de aminoácido continua que carezca de un codón de detención para la región enlazadora. La longitud de la región enlazadora es menor de 50 aminoácidos, o menor de 20 aminoácidos, o menor de 16 aminoácidos.
En otra modalidad, los elementos de secuencia de ácido nucleico que codifican para una o más marcas de epítope (por ejemplo, una marca FLAG) se pueden incorporar en la secuencia codificadora de anticuerpo. Estas secuencias pueden dar como resultado la producción de un anticuerpo con una marca de epítope presente en cualq uier posición , por ejemplo, en el extremo N-terminal , en el extremo C-terminal , o en la región enlazadora entre los dominios de VH y VL de una molécu la de anticuerpo de scFv. En u na modalidad , se pueden incluir secuencias que codifiq uen para una región constante de anticuerpo o fragmento de la misma en la porción 3' del ORF de las genotecas de ácido n ucleico de la invención . Esta región constante de anticuerpo o fragmento de la misma es idéntica en todos los miembros de una genoteca particular.
En otras modalidades, los elementos de secuencia de ácido nucleico q ue codifican para una secuencia de am inoácido de tipo no anticuerpo específica se pueden incorporar en los vectores , los cuales se utilizan para expresar específicamente la genoteca de ácido nucleico en esta invención sobre la su perficie de células de levad ura . Estos elementos pueden incluir, pero no se limitan a , dominios transmembrana conocidos en la técnica . En una modalidad , estos elementos se pueden incorporar en el O RF de las genotecas de ácido nucleico de la invención de modo tal q ue la secuencia de aminoácido codificada quede incorporada en el anticuerpo expresado. En otra modalidad , estos elementos se pueden incorporar en la secuencia de vector pero no en el ORF de las genotecas de ácido nucleico de la invención . Estos elementos pueden ayudar a la expresión , estabilidad , plegamiento y presentación de epítope, u otras características de la genoteca de ácido n ucleico en esta invención y mencionadas anteriormente.
4) Iniciadores de oliqonucleótido
En un aspecto, la invención presenta iniciadores de oligonucleótido nucleicos adecuados para la síntesis y/o amplificación de las genotecas de anticuerpo de la invención. Los ejemplos de iniciadores incluyen SEQ ID NOs: 1-13 (Tabla 6).
En otro aspecto, la invención presenta iniciadores de oligonucleótido nucleicos adecuados para transcripción inversa del ARNm producido a partir de las genotecas de la invención (Tabla 3). Los ejemplos de iniciadores incluyen SEQ ID NOs: 14-16 (Tabla 3).
En otro aspecto, la invención presenta iniciadores de oligonucleótido adecuados para análisis de PCR para tipificación por espectros de las distribuciones de tamaño de CDR3 de VH en la genoteca o sus producciones (outputs) de selección (Tabla 4). La tipificación por espectros puede ser una herramienta útil para evaluar la diversidad de la genoteca de anticuerpo y el avance de las selecciones. Los ejemplos de iniciadores de PCR para tipificación por espectros incluyen SEQ ID NOs: 17-18.
5) Enlazamiento del ácido nucleico a los aceptores de péptido
En una modalidad, las genotecas de ácido nucleico de anticuerpo de la invención se pueden modificar para que contengan una porción aceptora de péptido. Esto facilita la unión covalente del miembro individual de las genotecas de expresión de ácido nucleico a sus productos de proteína cognada. Se contemplan cualesquiera
medios de unión de un aceptor de péptido a un ácido nucleico reconocidos en la técnica.
En un aspecto, la invención presenta métodos y composiciones novedosos para la unión de un aceptor de péptido a genotecas de ácido nucleico. En una modalidad, se puede sintetizar una molécula enlazadora que comprenda una molécula de Psoraleno C6 y una molécula aceptora de péptido, en la cual la molécula de Psoraleno C6 y una molécula aceptora de péptido se pueden fusionar a una secuencia de ácido nucleico, en la cual la secuencia de ácido nucleico puede ser complementaria a secuencias en el extremo 3' de la genoteca de ácido nucleico. Dichas moléculas enlazadoras se pueden unir, mediante apareamiento de bases complementarias, al extremo 3' de los clones de la genoteca de ácido nucleico. El Psoraleno C6 es sensible a la luz ultravioleta (UV) y puede entrelazar el enlazador a los clones de la genoteca de ácido nucleico, ligando covalentemente, por lo tanto, el aceptor de péptido a los clones de la genoteca de ácido nucleico. En otra modalidad, la porción de ácido nucleico de la molécula enlazadora puede contener nucleótidos modificados, por ejemplo, ribonucleótidos 2 prima metoxi (2'OMe). En otra modalidad, la molécula enlazadora también puede comprender un enlazador de Trietilenglicol o PEG-150 que separa la región de ácido nucleico que contiene la molécula de Psoraleno C6 y una molécula aceptora de péptido. En una modalidad, el enlazador puede ser: 5'(Psoraleno C6)2'OMe(U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (Puromicina)3\ (en la cual X es un Trietilenglicol o PEG-150 y CC es una estructura base de ADN estándar). En una modalidad, dichos enlazadores son sintetizados sobre pedido, por ejemplo, por TriLink BioTechnologies, Inc. (San Diego, CA).
IV. Métodos de tipificación por espectros
El análisis de tipificación por espectros es un método utilizado en escenarios clínicos e inmunológicos básicos en los cuales se evalúa la diversidad de la longitud del receptor de antígeno como un sucedáneo para diversidad funcional (véase, por ejemplo, Cochet, M., et al. (1992) Eur.J. Immunol., 22:2639-2647; Pannetier, C, et al. (1993) Proc. Nati Acad. Sci. USA, 90:4319-4323; Pannetier, C, et al. (1997) en Austin, O.J.R. (Ed). The Antigen T Cell Receptor: Selected Protocols and Applications, TX Landes, pp. 287-325). Las pruebas de tipificación con espectro pueden utilizar, por ejemplo, células T CD4 o CD8 aisladas a partir de una muestra de sangre periférica del individuo, mientras que en otros casos se utilizan CD3 total o células PBMC.
En esta invención, se puede utilizar PCR para replicar específicamente la región de longitud variable (CDR3) para análisis de secuencias genéticas que codifican para anticuerpos con base en la longitud de CDR3. Los cambios en la distribución de longitud de CDR3 están correlacionados con cambios en el repertorio de anticuerpo. En algunas modalidades, se pueden utilizar iniciadores específicos para genotecas individuales construidas en la práctica de la invención para proveer tipos espectrales independientes para cada genoteca. En una modalidad preferida, se pueden utilizar un iniciador sentido 5' marcado con colorante fluorescente (6-FAM-PanVHFR3-Fwd, 5'-GACACGGCCGTGTATTACTGT-3\ SEQ ID NO: 17) y un iniciador anti-sentido (PanJH-Rev, 5'-GCTGAGGAGACGGTGACC-3', SEQ ID NO: 18) que se fijan respectivamente a la región 3 de la estructura base de las VH y a la región J para amplificar a través de las regiones de CDR3 de los dominios de la VH mediante PCR. En otras modalidades, se pueden utilizar otros iniciadores conocidos en la técnica, con fijación específicamente a la misma región u otras regiones en las secuencias de polinucléotido que codifican para la genoteca de anticuerpos. En una modalidad preferida, la mezcla resultante de replicones de CDR3 se puede separar por tamaños mediante electroforesis, y cuantificar mediante densitometria. En otras modalidades, se pueden utilizar otros métodos conocidos en la técnica para caracterizar los replicones de CDR3 resultantes.
En una modalidad preferida, el análisis de tipificación por espectros de la distribución de tamaño de CDR3 entre familias diferentes de VH se puede efectuar en fragmentos de ADNc de VH. En una modalidad, los ejemplos de familias de VH se pueden obtener a partir de una línea germinal individual o a partir de familias de VH diferentes, tales como VH1-46, VH2, VH5, y VH6. En una modalidad preferida, las plantillas para tipificación por espectros se pueden seleccionar, por ejemplo, a partir de genotecas de nodo linfático de humano, genotecas de bazo en levadura, genotecas lambda de humano no afectado por tratamiento, genotecas kappa de PBMC de
humano, genoteca de scFv de VH-??, genoteca de scFv de VH-VK. En otras modalidades, las plantillas para tipificación por espectros se pueden seleccionar a partir de otras genotecas.
V. Métodos de tamizaie generales
En un aspecto, la invención presenta métodos para el tamizaje de genotecas de expresión de la invención para identificar anticuerpos que pueden unirse a un objetivo deseado. Se contempla cualquier método de tamizaje in vitro o in vivo que permita la selección de un anticuerpo a partir de una genoteca de expresión, tomando como base la unión del anticuerpo a una molécula objetivo.
En una modalidad, las genotecas de expresión de la invención se pueden tamizar utilizando un despliegue ligado a fenotipo-genotipo libre de células in vitro reconocido en la técnica. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes E.U.A. Nos. 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 6,518,018; 7,125,669; 6,846,655; 6,281,344; 6,207,446; 6,214,553; 6,258,558; 6,261,804; 6,429,300; 6,489,116; 6,436,665; 6,537,749, 6,602,685; 6,623,926; 6,416,950; 6,660,473; 6,312,927; 5,922,545; y 6,348,315. Estos métodos implican la transcripción de proteína in vitro a partir de un ácido nucleico de modo tal que la proteína esté físicamente asociada o unida al ácido nucleico a partir del cual ésta se origina. Mediante selección respecto a una proteína expresada con una molécula objetivo, también se puede seleccionar el acido nucleico que codifica para la proteína.
Para mejorar la expresión de proteínas de scFv, las pruebas de tamizaje in vitro antes referidas podrían requerir la adición o remoción de ciertos reactivos. En una modalidad, se pueden agregar enzimas de proteína disulforoisomerasa al sistema de expresión in vitro para mejorar la producción de moléculas de scFv funcionales. En otra modalidad, se puede agregar un agente oxidante suave (por ejemplo, GSSG (glutatión oxidado)/GSH (glutatión reducido), por ejemplo GSSG 100mM/GSH 10mM) a una mezcla de reacción de traducción in vitro de las proteínas de scFv para permitir la formación de puentes disulfuro intra-cadena en las regiones de VH y VL de la molécula de scFv. En otra modalidad, se pueden eliminar los agentes reductores (por ejemplo, ditiotreitol (DTT)) de la mezcla de reacción de traducción in vitro del scFv.
En otra modalidad, se pueden agregar uno o más aminoácidos marcados, o derivados de los mismos, al sistema de traducción in vitro de modo tal que el o los aminoácidos marcados queden incorporados en el anticuerpo resultante. Se contempla cualquier aminoácido marcado reconocido en la técnica, por ejemplo, un aminoácido radiomarcado, por ejemplo, metionina o cisteína marcadas con 35S.
En una modalidad, las pruebas de tamizaje in vitro de la invención requieren que después de la selección in vitro de un anticuerpo o pluralidad de anticuerpos, el ARNm que está físicamente asociado con el anticuerpo o pluralidad de anticuerpos se pueda transcribir en forma inversa para generar el ADNc que codifica para dicho anticuerpo o pluralidad de anticuerpos. Se contempla cualquier método apropiado para transcripción inversa, por ejemplo, mediado por enzima, por ejemplo, transcriptasa inversa de virus de leucemia de múrido de Moloney.
Los métodos de tamizaje empleados en la invención podrían requerir amplificación del ácido nucleico que codifica para anticuerpos que se unen específicamente a un objetivo deseado. En una modalidad, se puede amplificar el ARNm que está físicamente asociado con un anticuerpo o pluralidad de anticuerpos para producir más ARNm. Se contempla cualquier método reconocido en la técnica de replicación de ARN, por ejemplo, utilizando una enzima ARN replicasa. En otra modalidad, el ARNm que está físicamente asociado con un anticuerpo o pluralidad de anticuerpos primero se transcribe en forma inversa como un ADNc antes que se amplifique mediante PCR. En una modalidad, la amplificación con PCR se logra utilizando una polimerasa de verificación de lectura de alta fidelidad, por ejemplo, la ADN polimerasa termoestable KOD1 proveniente de Thermococcus kodakaraensis o la ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA). En otra modalidad, la amplificación con PCR se puede efectuar bajo condiciones que den como resultado la introducción de mutaciones en el ADN amplificado, es decir, PCR propensa a error.
Los métodos de tamizaje utilizados en la invención también pueden requerir que se incremente la astringencia de la prueba de tamizaje de unión a objetivo para seleccionar respecto a anticuerpos con afinidad mejorada para el objetivo. Se contemplan cualesquiera métodos reconocidos en la técnica para incrementar la astringencia de una prueba de interacción anticuerpo-objetivo. En una modalidad, se pueden variar una o más de las condiciones de prueba (por ejemplo, la concentración de sal de la solución amortiguadora para prueba) para reducir la afinidad de las moléculas de anticuerpo para el objetivo deseado. En otra modalidad, se puede reducir la longitud de tiempo permitido para que los anticuerpos se unan al objetivo deseado. En otra modalidad, se puede agregar un paso de unión competitiva a la prueba de interacción anticuerpo-objetivo. Por ejemplo, se puede permitir que primero los anticuerpos se unan a un objetivo inmovilizado deseado. Después se puede agregar una concentración especifica de objetivo no inmovilizado, el cual sirve para competir por la unión con el objetivo inmovilizado de modo tal que los anticuerpos con la afinidad más baja para el antígeno se eluyen del objetivo inmovilizado, lo que da como resultado un enriquecimiento respecto a anticuerpos con afinidad de unión a antígeno mejorada. En una modalidad, la astringencia de las condiciones de la prueba también se puede incrementar incrementando la concentración de objetivo no inmovilizado que se agrega a la prueba.
Los métodos de tamizaje de la invención también pueden requerir rondas múltiples de selección para enriquecer respecto a uno o más anticuerpos con unión a objetivo mejorada. En una modalidad, en cada ronda de selección se pueden introducir mutaciones de aminoácido adicionales en los anticuerpos utilizando métodos reconocidos en la técnica. En otra modalidad , en cada ronda de selección se puede incrementar la astringencia de unión al objetivo deseado para seleccionar respecto a anticuerpos con afin idad incrementada para un objetivo deseado.
Los métodos de tamizaje de la invención pod rían requerir purificación de las proteínas de fusión de ARN-anticuerpo a partir de los componentes de un sistema de traducción in vitro. Esto se puede log rar utilizando cualquier método de separación reconocido en la técnica . En una modalidad , las proteínas de fusión de ARN-anticuerpo se pueden separar mediante cromatog rafía util izando una resina de polidesoxitimidina (poli-dT) . En otra modalidad , las proteínas de fusión de ARN-anticuerpo se pueden separar mediante cromatog rafía utilizando un anticuerpo específico para un epítope presente en el componente de anticuerpo de la proteína de fusión de ARN-anticuerpo. En u na modalidad , el epítope puede ser una marca de secuencia de aminoácido, por ejemplo, las marcas FLAG o HA, incorporadas en la secuencia de aminoácido del componente de anticuerpo de la proteína de fusión de ARN-anticuerpo, por ejemplo , en el extremo N-terminal , extremo C-terminal o en el en lazador de región inter-variable.
La selección de anticuerpos a partir de las genotecas de la invención podría req uerir el uso de moléculas objetivo inmovilizadas. En una modalidad , la molécula objetivo puede estar ligada directamente a un substrato sólido por ejemplo , g lóbulos de agarosa. En otra modalidad, la molécula objetivo se puede modificar primero, por ejemplo, biotinilar y la molécula objetivo modificada se puede unir mediante la modificación a un soporte sólido, por ejemplo, estreptavidina-M280, neutravidina-M280, SA-M270, NA-M270, SA-MyOne, NA-MyOne, SA-agarosa, y NA-agarosa.
Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben ser considerados como limitativos.
EJEMPLOS
A través de todos los ejemplos, se utilizan los siguientes materiales y métodos a menos que se indique de otra manera.
Materiales y Métodos
En general, la práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de inmunoglobulina), y cría de animales. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds.
Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).
EJEMPLO 1
Protocolo de despliegue de ARNm para moléculas de scFv
El despliegue de ARNm se puede efectuar de conformidad con el método mostrado en la Figura 2. Las modalidades particulares de este método se describen con mayor detalle más adelante. Estas modalidades pretenden ilustrar lo métodos de la invención, y no deben ser consideradas como limitativas.
1. Diseño de plantillas de genoteca de anticuerpo Las construcciones de ADN de la genoteca se diseñan de conformidad con el diagrama representado en la Figura 3. Las construcciones de ADN de doble cadena por lo general contienen los siguientes elementos funcionales, desde el extremo 5' hacia el extremo 3'. Un promotor T7 puede ser útil para la transcripción de ARN in vitro. Una TMV-UTR (región no traducida de virus del mosaico del tabaco) puede ser útil para traducción de proteína in vitro. Una marca opcional contiene una secuencia de 8 pares de bases única para cada genoteca, la cual puede ser útil para identificar las construcciones que pertenecen a una genoteca dada. Una secuencia de consenso de Kozak facilita el inicio de la traducción de la proteína. La genoteca de anticuerpo de interés puede contener secuencias que codifican para una scFv, VH, o VL. En una modalidad preferida, la genoteca de anticuerpo codifica para scFv. En una modalidad, también se incluye una secuencia de región constante de anticuerpo parcial que es invariable en el extremo 3' de todas las genotecas de anticuerpo. En algunas modalidades, las construcciones incluyen adicionalmente una marca FLAG útil para purificación por afinidad. En otras modalidades, las construcciones contienen una secuencia de fijación al enlazador constituida por un sitio de fijación, en el cual un enlazador de oligonucleótido de ADN modificado con psoraleno y puromicina puede ser entrelazado a la construcción en pasos subsiguientes del protocolo. En una modalidad, una secuencia de poliadenilación con un codón de detención 5' puede ser útil para estabilidad y purificación de ADNRm a través de purificación intermitente con oligo-dT celulosa.
2. Preparación del antígeno objetivo
En términos generales, la genoteca de anticuerpo de despliegue de ARNm se puede seleccionar contra antígenos modificados con biotina. Aunque el mejor antígeno para cada objetivo debe ser determinado en una base caso por caso, se pueden utilizar las siguientes consideraciones como un lineamiento general. Un antígeno objetivo típicamente está bien caracterizado, y es el isotipo genético relevante o dominante, según se determina mediante análisis de polimorfismo (SNP y haplotipo) y/o farmacogenético. Un antígeno objetivo adicionalmente puede tener bioactividad razonable (comparable con la del antígeno original), buena solubilidad y buenas propiedades químicas y físicas y se puede preparar en cantidades suficientes para selecciones o tamizajes de genoteca y ensayos biológicos corriente abajo. Las cantidades de ejemplo de antígeno objetivo útiles para la selección de genotecas se indican en la siguiente Tabla 1.
TABLA 1
Cantidad de antígeno obietivo requerida para selección de genoteca
3. Preparación del ADN de la genoteca
El ADN de la genoteca y sus producciones de selección se pueden amplificar mediante PCR. Los ejemplos de iniciadores para plificación de la genoteca se muestran en la Tabla 2
TABLA 2
iniciadores para amplificación de la qenoteca
La amplificación mediante PCR se puede efectuar utilizando métodos conocidos en la técnica. Las reacciones de PCR típicamente contienen la plantilla de ADN, una solución amortiguadora para reacción, dNTP, los iniciadores utilizados para amplificación, ADN polimerasa, y agua. Se montan tubos de reacción múltiples simultáneamente a partir de una mezcla maestra para rendimiento incrementado del ADN amplificado. 25 ciclos de PCR típicamente producen amplificación suficiente, pero se pueden utilizar tantos como 35 ciclos para ganar más productos.
4. Purificación del ADN de la genoteca
Si los productos provenientes de la PCR anterior son del tamaño correcto (-850 pb para scFv, ~500 pb para la genoteca de VH o VL) y contienen productos no específicos mínimos, éstos se pueden utilizar directamente en la reacción de transcripción. De manera alternativa, los productos se pueden purificar en gel. Si se efectúa la purificación en gel para productos de PCR, los productos se pueden separar en un gel preparativo de agarosa y se pueden cortar las bandas específicas que contienen los productos de PCR. El ADN después se puede purificar a partir de la banda mediante extracción en gel, utilizando métodos estándar conocidos en la técnica, y su concentración se mide en un espectrofotómetro.
5. Transcripción de ARN
La transcripción de ARN a partir del ADN de la genoteca se puede efectuar utilizando métodos estándar conocidos en la
técnica. Se puede utilizar un volumen grande de reacción para transcribir suficientes plantillas de ADN para muestrear la diversidad de la genoteca completa. En una modalidad de ejemplo, se pueden utilizar 1 x 1013 copias de plantillas de la genoteca en la reacción de transcripción de ARN. Una reacción de transcripción de ARN típicamente contiene 5-10 g de producto de PCR, una solución amortiguadora para reacción, más ATP, CTP, GTP, UTP y ARN polimerasa T7. La reacción de transcripción de ARN se puede correr a 37°C por un período entre 2 horas y toda la noche. Se pueden utilizar tiempos más cortos después de las rondas iniciales de selección. Después de la transcripción del ARN, se pueden retirar las plantillas de ADN de la mezcla de reacción utilizando ADNasa I.
6. Purificación de ARN mediante cromatografía en columna con NAP
Después de la transcripción del ARN, el ARN se puede fraccionar utilizando una columna NAP-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se puede cargar hasta 1 mi de reacción de transcripción en una columna NAP-10 para purificación de ARN. La columna se puede equilibrar utilizando dH20 tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) antes de fraccionar. El volumen total de elución debe ser menor de 150% del volumen de reacción de transcripción. El ARN se puede fraccionar adicionalmente o de manera alternativa utilizando una columna NAP-25 (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
7. Control de calidad y cuantificación del ARN
El tamaño y rendimiento de las muestras de ARN se puede monitorear utilizando electroforesis en gel. El rendimiento de ARN típicamente alcanza un máximo de 20 nmoles/ml de reacción de transcripción.
8. Ligación del ARN al enlazador
Se puede ligar covalentemente un enlazador de ADN que contiene una molécula aceptora de péptido por su extremo 3' a los extremos 3' de cada molécula de ARN. El aceptor de péptido, el cual puede entrar al sitio ribosómico A y acoplarse covalente al extremo carboxilo terminal de la cadena de polipéptido naciente, finalmente puede permitir la asociación covalente del ARNm (genotipo) a la proteína codificada por este ARNm (fenotipo). Un ejemplo de enlazador de PEG6/10 puede tener la siguiente fórmula:
5'(Psoraleno C6)2'OMe(U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (Purom¡c¡na)3\
La modificación en el extremo 5' con psoraleno C6 es sensible a la luz y funciona para crear un enlace covalente entre el enlazador y el ARNm mediante entrelazamiento con UV. Una región de estructura base de 2'OMe (U AGC GGA UGC) se fija al sitio de fijación al enlazador 3' para la secuencia FLAG en el ARNm (véase Figura 1). En la secuencia anterior, X representa "Espaciador 9", conocido alternativamente como trietilenglicol o PEG-150. Este espaciador se ha optimizado para proveer flexibilidad para inserción de puromicina en el sitio de ribosoma A eucariota. CC comprende una estructura base de ADN estándar. Se inserta una modificación 3' de puromicina en el sitio de ribosoma A para crear un enlace estable entre el enlazador y el péptido naciente. El coeficiente de extinción para el enlazador descrito en la presente solicitud es 147.7 D026o/umol. Debido a que este enlazador es sensible a la luz, las soluciones que contienen a este enlazador se deben proteger contra la luz.
Para las rondas iniciales de selecciones de genoteca, se recomienda una reacción de ligación a gran escala (3.1 x 1015 moléculas de ARN transcritas) para muestrear una diversidad completa de una genoteca. Se puede fijar esta cantidad de ARN para asegurar que se pongan suficientes plantillas en las reacciones de traducción y produzcan aproximadamente ~10 pmol de moléculas de despliegue de ARNm funcionales. En las rondas posteriores, la aportación de ARN se puede reducir a 0.5 nmol por selección. En una modalidad de ejemplo, una reacción de ligación de ARN puede contener los siguientes componentes: el ARN, agua, una solución amortiguadora para ligación química, y el enlazador PEG6/puromicina (1mM). En una modalidad de ejemplo, el volumen total de reacción es 100 µ?. En una modalidad preferida, la relación molar de enlazador/ARN puede ser mayor de 1.5. En una modalidad, la concentración final del enlazador en la reacción puede ser de aproximadamente 15 µ?, y la concentración de ARN en la reacción puede variar desde aproximadamente 3-10 µ? (=0.3-1 nmol de
aportación de ARN). Como referencia, un ARN de scFv de 850 nucléotidos a 1 mg/ml = 3.56 µ?, y la concentración máxima obtenible de ligación es 3.16 µ? (=0.32 nmol).
La reacción de fijación (la cual fija el enlazador al ARN transcrito) se puede efectuar en un ciclador térmico. En una modalidad preferida, la reacción de fijación se puede efectuar mediante incubación de las muestras aproximadamente a 85°C durante 30 segundos, después aproximadamente a 4°C, utilizando una velocidad de incremento de aproximadamente 0.3°C por segundo. Las reacciones después se pueden mantener a 4°C.
La ligación del enlazador/ARN fijos se puede lograr mediante entrelazamiento con UV. Esto se puede efectuar utilizando cualquier método conocido por el experto en la técnica. En una modalidad, los tubos de reacción se pueden colocar a través del centro de una lámpara de UV portátil (longitud de onda larga, aproximadamente 365 nm) y entrelazar durante aproximadamente 15 minutos. Se puede colocar un paquete de refrigerante encima de la lámpara para ayudar a disipar el calor generado durante la irradiación de UV. La eficiencia de ligación típica es de aproximadamente 50 -90%, y la purificación normalmente no es requerida. Los productos de ligación se pueden almacenar a -80°C.
9. Reacción de traducción
En una modalidad de ejemplo, se pueden elaborar aproximadamente 0.1% del ARN aportado como moléculas de
despliegue de ARNm después de todas las reacciones y purificaciones. La traducción in vitro se puede efectuar utilizando métodos y reactivos conocidos por el experto en la técnica. En una modalidad, la reacción de traducción utilizando la genoteca de scFv puede utilizar aproximadamente 5 nmol de plantilla de ARN con aproximadamente 10 mi de lisado de reticulocito en un volumen de reacción de aproximadamente 15 mi.
Como preparación para la reacción de traducción, las soluciones de GSSG/GSH (glutatión oxidado/glutatión reducido) se pueden preparar a una concentración final de aproximadamente GSSG 100 mM/GSH 10 mM. La PDI (Proteína disulfuro isomerasa) se puede preparar disolviendo PDI en polvo en dH20 para alcanzar una concentración de aproximadamente 1 Unidad/µ?. La solución de PDI se puede almacenar a -20°C.
Una reacción de traducción de ejemplo se puede establecer de la siguiente manera:
ARN (100 pmol) X X µ? dH20 para 73.7 para 370 µ?
Mezcla maestra de aminoácido (Met) 15 75 µ?
GSSG 100 mM/GSH 10 mM 3.3 16.5 µ?
PDI (1 U/µ?) 6 30 µ?
[35S]Metionina 2 10 µ?
Lisado de Reticulocito 200 1000 µ?
Volumen total 300 1500
Las reacciones de traducción se incuban en un baño de agua a 30°C durante 1-2 horas. Se observa un decremento significativo en el rendimiento de la fusión de ARN/proteína cuando el volumen de traducción es mayor de 1.5 mi. Por lo tanto, se puede preparar una mezcla maestra de la reacción de traducción si el volumen de reacción es más grande de 1.5 mi antes de dividirlo en alícuotas más pequeñas.
10. Formación de la fusión de ARN/proteína
Después de la reacción de traducción, se pueden agregar aproximadamente 100 µ? de KCI 2M y aproximadamente 20 µ? de MgCI2 1 M por cada 300 µ? de mezcla de reacción de traducción, e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Esto estabiliza los ribosomas pausados al final de las plantillas de ARNm y permite que la puromicina en el extremo del enlazador de ADN entre a los sitios A de los ribosomas pausados, lo cual liga permanentemente las proteínas de scFv traducidas a sus plantillas de ARNm. La incubación a temperatura ambiente se puede acortar si la reacción se almacena a -20°C durante la noche. La reacción se puede finalizar agregando 50 µ? de EDTA 0.5 M para romper los ribosomas. Las reacciones se pueden almacenar a -20°C. Se puede retirar una alícuota de 5 µ? para conteo por centelleo posterior.
11. Purificación de la fusión de ARN/proteína mediante oliqo-dT celulosa
Este paso purifica las moléculas de despliegue de ARNm y las plantillas de ARN remanentes de la reacción de traducción/fusión. Para unión a oligo-dT se puede calcular la cantidad de oligo-dT celulosa pre-levada necesaria para capturar todas las plantillas de ARN. Se puede agregar un volumen suficiente de solución amortiguadora para unión de oligo-dT a la reacción de fusión para alcanzar una concentración final de aproximadamente 1X. Después se puede agregar la oligo-dT celulosa pre-lavada, y las reacciones se llevan a cabo durante 1 hora a 4°C. Las reacciones se pueden centrifugar opcionalmente aproximadamente a 1500 rpm durante 5 minutos a 4°C, y se desecha el sobrenadante. Los glóbulos de oligo-dT celulosa se pueden transferir y lavar aproximadamente 6 veces con solución amortiguadora para unión de oligo-dT 1X utilizando columnas para centrifugación, y la solución amortiguadora típicamente se puede eliminar utilizando columnas de centrifugación aproximadamente a 1000 rpm durante 10 segundos. El flujo pasante se puede eliminar, pero el último lavado se puede conservar para conteo por centelleo. Las moléculas de despliegue de ARNm (y las plantillas de ARN libres) se pueden eluir agregando dH20 a los glóbulos e incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente. El eluato se puede recolectar centrifugando aproximadamente a 4000 rpm durante 20 segundos. La elución típicamente se puede repetir una vez, y los eluatos se combinan. Se pueden retirar 5 µ? del eluato para conteo por centelleo. La eficiencia de la pu rificación con oligo-dT también se puede evaluar mediante DO a 260 nm (D02eo) en un aparato para espectrofotometría NanoDrop (NanoDrop Technolog ies , Wilmington , DE) . Teóricamente, todas las plantillas de ARN remanentes y las moléculas de desplieg ue de ARN m son recuperadas por los glóbulos de oligo-dT. Se puede agregar solución amortig uadora para unión FLAG 5X a los eluatos para alcanzar u na concentración final de aproximadamente 1 X. Las muestras se pueden guardar a -80°C si no se procede al siguiente paso de pu rificación con FLAG.
La recuperación de oligo-dT se puede calcular de la sigu iente manera . Se someten a conteo aproximadamente 5 µ? de aportación (proveniente de la reacción de fusión), 1 00 µ ? del último lavado, y 5 µ? de la producción (eluato proveniente de la pu rificación de oligo-dT) . El ultimo lavado se utiliza para evaluar el grado de lavado, y los otros dos conteos se utilizan para calcular la recuperación de la fusión ARN/proteína a partir de la aportación de plantilla de ARN original . Rendimiento de la fusión de ARN/proteína (pmol) = (CP M prod ucCión Vol u me np rod u Cc¡ón x 5µ ? x Volumei¡sado)/[C P M aportac¡ón x Volumena p0rtación x (# de metionina en el producto)]. Esta fórmula considera una concentración de metionina de 5 µ? en el lisado de reticulocito, y todos los volúmenes utilizados en el cálculo se expresan como µ?. Para rondas iniciales de selección el rendimiento de las moléculas de despliegue de ARNm típicamente es de 0.5-2% , pero se puede incrementar hasta 1 0% en rondas posteriores.
12. Purificación de la fusión de ARN/proteína mediante aqarosa anti-FLAG M2
Este paso purifica las moléculas de despliegue de ARNm a partir de las plantillas de ARN remanentes. Se puede calcular la cantidad de glóbulos de agarosa anti-FLAG M2 pre-lavados necesarios para capturar todas las moléculas de despliegue de ARNm. En una modalidad, la capacidad de unión de los glóbulos es de aproximadamente 6 nmoles de proteína de fusión por cada mililitro de papilla al 50%. Para tener un volumen suficiente de glóbulos para manipulación durante la unión y lavado, no se recomienda utilizar menos de 200 µ? de glóbulos pre-lavados. El ejemplo que se brinda a continuación es para una reacción de traducción de 300 µ? iniciales.
Para la purificación de FLAG, se puede utilizar una punta de pipeta de agujero amplio para transferir 300 µ? de agarosa anti-FLAG M2 pre-lavada a la producción purificada de oligo-dT. La mezcla se puede mezclar e incubar mediante rotación durante 1 hora a 4°C. La incubación con agarosa anti-FLAG M2 puede continuar durante la noche. La agarosa anti-FLAG M2 se puede centrifugar opcionalmente aproximadamente a 1500 rpm en una centrifuga durante 1 minuto a 4°C, y el sobrenadante se puede desechar. Los glóbulos anti-FLAG se pueden lavar aproximadamente 5 veces con solución amortiguadora para unión de FLAG 1X, utilizando columnas de centrifugación y centrifugación aproximadamente a 1000 rpm durante 10 segundos para cada lavado. El flujo pasante se puede desechar. Los glóbulos se pueden lavar adicionalmente dos veces con 700 µ? de solución amortiguadora para selección (véase más adelante) mediante centrifugación aproximadamente a 1000 rpm durante 10 segundos. El último lavado se puede conservar para conteo por centelleo. Las moléculas de despliegue de ARNm se pueden eluir agregando aproximadamente 400 µ? de péptido FLAG a una concentración de 100 g/ml (en solución amortiguadora para selección) e incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente. El eluato se puede recolectar mediante centrifugación aproximadamente a 3000 rpm durante 20 segundos y eluir una o más veces mediante adición de aproximadamente 400 µ? de péptido FLAG a una concentración de 100 pg/ml. Ambos eluatos se pueden combinar, y se pueden retirar 5 µ? de los eluatos combinados para conteo por centelleo. Este volumen de péptido FLAG típicamente es suficiente para elución a partir de hasta aproximadamente 1 mi de papilla al 50%, y se puede cortar a la mitad (200 µ?) si se utiliza menos papilla y/o se desean concentraciones más altas de la fusión de ARN/proteína. Para evitar la degradación del ARN durante el almacenamiento y selección del antígeno, se puede agregar una cantidad apropiada de inhibidor de ARNasa conocida en la técnica (es decir, 1-2U/pl de RNaseOUT y 0.02 µg/ml de ARNt de levadura) a la genoteca de despliegue de ARNm purificada. Las muestras se almacenan a -80°C si no se procede al siguiente paso de selección de antígeno.
Para cuantificar la recuperación de FLAG, se pueden someter a conteo aproximadamente 5 µ? de la producción de elución y aproximadamente 100 µ! del último lavado en un contador beta. Se
podría esperar una recuperación de 10-30% o más alta, y se puede calcular de conformidad con la siguiente fórmula:
% de recuperación de molécula PROfusion = (CPMproduccion x VolumenproduCc¡ón)/(CPM aportación X VOlumenaportación)-
13. Selección de qenoteca utilizando antígenos biotinilados La selección está diseñada para enriquecer moléculas que específicamente se unen a un objetivo de interés. Podría ser necesaria una selección negativa (pre-depuración) para eliminar los ligadores de matriz y no específicos. Dependiendo del formato del objetivo, varía el protocolo de selección. Lo siguiente es un protocolo de selección de ejemplo para uso con objetivos biotinilados. Este protocolo se puede modificar para ajustarse a antígenos objetivo en otros formatos, y se puede escalar hacia arriba o hacia abajo o dependiendo de la producción deseada.
A. Preparaciones antes de la selección
Se pueden utilizar glóbulos magnéticos de estreptavidina (SA) para captura, y estos típicamente se pre-bloquean antes del uso. Los glóbulos de SA se pueden transferir desde la botella original a tubos de 1.5 o 2 mi, y lavar dos veces con 2 mi de solución amortiguadora para unión de FLAG 1X. Los glóbulos después se pueden bloquear con 2 mi de la solución amortiguadora para selección durante 2 horas hasta durante la noche a 4°C con rotación. Se deben preparar suficientes glóbulos tanto para pre-depuración como para captura de selección. Los glóbulos pre-bloqueados se almacenan a 4°C. Típicamente se utilizan aproximadamente 100 µ? de glóbulos por cada 100 pmoles de antígeno biotinilado.
Se pre-bloquean tubos para microcentrífuga de 1.5 mi o 2 mi con solución amortiguadora para unión de FLAG 1X durante aproximadamente 1 hora hasta durante la noche. Los tubos pre-bloqueados se pueden utilizar para todos los pasos de pre-depuración y selección. Típicamente se necesitan 4 tubos por cada muestra: dos para pre-depuración, uno para los glóbulos, y 1 para selección.
Se pueden obtener resultados óptimos mediante pre-depuración de la genoteca. La genoteca de despliegue de ARNm purificada con FLAG se puede agregar a los glóbulos de SA (separados de la solución amortiguadora). El volumen de glóbulo de SA puede ser igual a la mitad del volumen de captura. La mezcla total se puede incubar con rotación a 30°C durante 30 minutos antes de la separación de la genoteca de despliegue de ARNm pre-depurada de los glóbulos de SA utilizando un imán. Este paso de pre-depuración se repite una vez más y los segundos glóbulos de SA pre-depurados se pueden lavar y contar como se describió anteriormente para determinar si el fondo es alto. Esto también puede servir como un control negativo "sin antígeno".
B. Selección de la genoteca: Unión
Para las primeras rondas de selección, se puede agregar objetivo biotilinado (100 nM) a la genoteca pre-depurada completa e incubar con rotación a 30°C durante 1 hora. Para las últimas rondas de selección cuando se espera que la recuperación de moléculas de unión a antígeno supere el 1%, la genoteca pre-depurada se puede dividir en dos alícuotas iguales. El antígeno biotilinado se puede agregar a una alícuota, y la otra sirve como el control negativo "sin antígeno". De manera alternativa, los segundos glóbulos pre-depurados lavados también pueden ser considerados como un control "sin antígeno", como se indicó anteriormente, aunque estos glóbulos tendrán un procedimiento de "pre-depuración" menos. La concentración de antígeno en las últimas rondas puede caer cuando la recuperación de las moléculas de unión a antígeno supera el 5%.
C. Selección de la genoteca: Captura
Los glóbulos de SA pre-bloqueados (separados de la solución amortiguadora) se pueden agregar a la reacción de unión e incubar con rotación a 30°C durante 5 a 10 minutos. La cantidad de glóbulos de SA para captura se debe calcular tomando como base la capacidad y la concentración del objetivo utilizada en la selección (véase lo indicado anteriormente). Se debe reducir la cantidad de glóbulos de SA cuando se reduce la concentración del objetivo para evitar los ligadores de glóbulo de SA, pero típicamente se utiliza no menos de 50 µ? de glóbulos.
D. Selección de la genoteca: Lavado
Los glóbulos de SA se pueden recolectar utilizando un imán y se pueden lavar con 1 mi de solución amortiguadora para selección durante 1 minuto. Los glóbulos se recolectan de nuevo utilizando un imán y se lavan durante aproximadamente 5 veces más (aproximadamente 6 veces en total). El tiempo de lavado se puede incrementar en las rondas finales para incorporar la estrategia de selección de velocidad de disociación a algunos objetivos. Los glóbulos se pueden lavar una última vez con 1 mi de solución amortiguadora 1X apropiada para transcripción inversa. Los glóbulos se recolectan con un imán y se vuelven a suspender en agua (un cuarto del volumen de glóbulo de captura calculado anteriormente).
E. Selección de la genoteca: Conteo v cálculo de recuperación Partiendo de la ronda 3, se cuentan aproximadamente 10-20% del último lavado y los glóbulos. Típicamente sólo menos de 100 µ? de glóbulos se somete a conteo, debido a que más glóbulos pueden extinguir los conteos. La recuperación de la selección de la genoteca se calcula de conformidad con la siguiente fórmula:
% de la Recuperación de la Selección = 100 x CPMg|ó U|0S totales/CPMaportación total-
14. Reamplificación del ADN de la genoteca mediante RT- PCR
La transcripción inversa se puede efectuar utilizando el material capturado a partir de la genoteca. Los reactivos y protocolos conocidos en la técnica son apropiados para realizar la reacción de transcripción inversa. El volumen de la reacción se puede escalar hacia arriba o hacia abajo de conformidad con el volumen del glóbulo después de la selección.
Los iniciadores de ejemplo útiles para transcripción inversa se muestran en la Tabla 3, aunque se puede diseñar iniciadores adicionales utilizando métodos conocidos en la técnica. El iniciador anti-sentido CK se utiliza para genotecas kappa, el iniciador anti-sentido CJL se utiliza para genotecas lambda, y Lib-GS-Rev se utiliza para la genoteca de VH de PBMC de humano.
TABLA 3
Ejemplos de iniciadores apropiados para transcripción inversa
Una reacción de transcripción inversa de ejemplo puede contener los glóbulos provenientes de la selección de genoteca (en agua), iniciador anti-sentido aproximadamente 10µ?, y dNTP aproximadamente 10 mM. Las reacciones se incuban a 65°C durante
5 minutos y se enfrían sobre hielo. Después, típicamente se agregan a la reacción la solución amortiguadora para síntesis de la primera cadena, DTT 0.1M, e inhibidor de ARNasa. Las reacciones de transcripción inversa se incuban a 42°C durante 2 minutos antes de agregar la enzima transcriptasa inversa. Las reacciones se incuban después a 42°C durante 50 minutos con agitación ocasional y se incuban adicionalmente a 95°C durante 5 minutos. Los glóbulos se recolectan después mediante imán, y el sobrenadante se transfiere a tubos nuevos, los cuales se pueden combinar si estos provienen de la misma producción de selección. Los glóbulos se vuelven a suspender en agua (la mitad del volumen de RT), y se incuban en tubos a 95°C durante 5 minutos. Los glóbulos se recolectan de nuevo utilizando un imán, y el sobrenadante se mezcla con el sobrenadante previamente transferido. Esto contiene la plantilla de ADNc para amplificación de PCR de la producción de selección.
La PCR para tipificación por espectros se puede utilizar para analizar las distribuciones de tamaño de CDR3 de la VH en la genoteca o sus producciones de selección. Esta es una herramienta útil para evaluar la diversidad de la genoteca y el avance de las selecciones. Las primeras rondas iniciales de las producciones de selección de la genoteca y la genoteca antes de la selección deben ser muy diversas y la distribución de tamaño de CDR3 se aproxima a una distribución Gaussiana. Los ejemplos de iniciadores para PCR para tipificación por espectros se muestran en la Tabla 4.
TABLA 4
Ejem plos de iniciadores de PCR para ti pificación por espectros
En la siguiente tabla 5 se muestra un ejemplo de reacción de PC R para tipificación por espectros, aunque los componentes de la reacción pueden ser sustituidos con reactivos comparables conocidos en la técnica, y el volumen de reacción se puede ajusta r para acomodar la escala de la reacción de selección .
TABLA 5
Ejem plo de reacción de PCR para ti pificación por espectros
Plantilla de ADNc 2.0 µ? dH2Q 18.1 µ?
Solución amortiguadora para reacción 5X de ADN
polimerasa térmicamente estable
MgCI2 25 m 1 .8 µ? dNTP 10 mM 0.6 µ?
Iniciador sentido 5' (10 µ?) 0.6 µ?
Iniciador antisentido 3' (10 µ?) 0.6 µ?
ADN polimerasa térmicamente estable 0.3 µ?
Volumen total 30.0 µ?
Para esta reacción son apropiadas ADN polimerasas térmicamente estables conocidas en la técnica. En una modalidad de ejemplo, la concentración final de Mg2+ es 1.5 mM. Como un ejemplo de programa de ciclación térmica, la reacción se incuba a 94°C durante 2 minutos y después se somete a 30 ciclos térmicos para alargar el ADN. Para cada ciclo, la reacción se incuba a 94°C durante 20 segundos, a 55°C durante 20 segundos, y después a 72°C durante 30 segundos. Después de 30 ciclos, la reacción se incuba adicionalmente a 72°C durante 5 minutos y después se almacena a 4°C. Después de la PCR, se cargan 10 µ? del producto de PCR en un gel de agarosa al 2% para confirmar que la reacción fue satisfactoria. La reacción y el producto remanente se analizan mediante electroforesis para tipificación por espectros.
El producto de ADN amplificado tiene la siguiente organización:
5'-FR3 (27 pb)-VH CDR3-FR4 (35 pb)-3'
El tamaño de CDR3 de la VH se puede deducir a partir del tamaño del producto de ADN aparente. Esto se puede determinar utilizando el marcador de tamaño de colorante Rox utilizando el siguiente cálculo:
TamañOvH CDR3 = TamañOtamaño de producto de AND aparente -60)/3 en la cual:
60— (6 Estructuras base en ambos extremos " Saliente A 3' + ^subestimación
del marcador de ADN) -
15. PCR para amplificación de plantilla de ADN de la genoteca
Para seleccionar las producciones provenientes de la primera y segunda rondas, el ADNc (sobrenadantes de las reacciones de RT) se puede dializar contra agua utilizando un corte de 8 kDa y la cantidad completa de ADNc se puede utilizar como la plantilla para PCR. Para seleccionar producciones provenientes de las últimas rondas, se utiliza 10% del ADNc como plantilla para PCR, y la diálisis típicamente no es necesaria. Los iniciadores de ejemplo para amplificación se muestran en la Tabla 6.
TABLA 6
Iniciadores para amplificación
Iniciador Secuencia (5' - 3')
Iniciador sentido para todas las genotecas de scFv y VH
T7TMVUTR3 TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTA (SEQ ID NO:1) CA
Iniciador sentido para todas las genotecas de VK y \?
VL- TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTA
T7TMVTag3GS- CAGGCTTTGGACCATGGGGTCTGGCGGCGGAGGTAGCG
Fwd (SEQ ID
NO:2)
TABLA 6 (cont.)
Iniciadores anti-sentido para todas las genotecas ? scFv y VK
Ck1 -FlagA20Rev TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTC (SEQ ID NO:3) GTCGTCCTTGTAGTCGAA GACAGAT
Ck2-FlagA20Rev TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTC (SEQ ID NO:4) GTCGTCCTTGTAGTCGAAGACAGATGGT
Ck3-FlagA20Rev TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTC (SEQ ID NO:5) GTCGTCCTTGTAGTCGAAGACAGATGGTGCA
Ck4-FlagA20Rev TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAG CG G ATGCCTTG TC G TC (SEQ ID NO:6) GTCGTCCTTGTAGTCGAAGACAGATGGTGCAGCC
Ck5-FlagA20Rev TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT A AAT AG C GGATGCCTTGTCGTC b(SEQ ID NO:7) GTCGTCCTTGTAGTCGAAGACAGATGGTGCAGCCACA
Iniciadores anti-sentido para todas las genotecas ? scFv y \/?
CL1 FLAGA20Rev TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAG CG GATG C CTTGTCGTC b(SEQ ID NO:8) GTCGTCCTTGTAGTCAGTGACAGTG
CL2FLAGA20Rev TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAG CG GATG C CTTGTCGTC (SEQ ID NO:9) GTCGTCCTTGTAGTCAGTGACAGTGGGG
CL3FLAGA20Rev TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTC (SEQ ID NO: 10) GTCGTCCTTGTAGTCAGTGACAGTGGGGTTG
CL4FLAGA20Rev TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAATAGCGGATGCCTTGTCGTC (SEQ ID NO: 1 1 ) GTCGTCCTTGTAGTCAGTGACAGTGGGGTTGGCC
CL5FLAGA20Rev TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAATAGCGGATGCCTTGTCGTC (SEQ ID NO: 12) GTCGTCCTTGTAGTCAGTGACAGTGGGGTTGGCCTTG
TABLA 6 (cont.)
Iniciador anti-sentido para todas las genotecas de VH
VH-GSFLAGA20- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCTTTGTCATC Rev (SEQ ID ATCATCTTTATAATCGCTACCTCCGCCGCCAGAC
NO: 13)
a También se puede utilizar el iniciador T7TMVTag (la secuencia de la Marca depende de la genoteca).
b Iniciador preferido
Un ejemplo de reacción de PCR para amplificación de plantilla de ADN de la genoteca se muestra en la sig uiente Tabla 7.
TABLA 7
Reacción de ejem plo de PCR para amplificación de plantilla de
ADN de la genoteca
Plantilla de ADNc X µ? dHzO Agregar hasta 790 µ?
Solución amortiguadora 10X de ADN polimerasa Taq de
Alta Fidelidad
MgS04 (50 mM)
dNTP 10 mM
Iniciador sentido 5' (10 µ?)
Iniciador antisentido 3' (10 µ?)
ADN polimerasa Taq de Alta Fidelidad
Volumen total 1000 µ?
En u na modalidad de ejemplo , se utiliza 1 mi de la reacciones de PCR para las producciones de las rondas 1 y 2 , y se utilizan 0.5 mi de las reacciones para las producciones de las rondas finales . Se deben elaborar alícuotas de 1 00 µ? de las reacciones a partir de una mezcla maestra . El ejemplo de condición de ciclado térmico para la amplificación de plantillas de ADN de la genoteca se muestra en la sig uiente Tabla 8.
TABLA 8
Condiciones de ciclado térmico para am pl ificación de planti lla de
ADN de la genoteca
94°C 2 minutos
i
94°C 20 segundos ")
55°C 20 segundos ¡> 25 ciclos*
68°C 1 minuto J
i
68°C 5 minutos
i
4°C Mantener indefinidamente
* Nota: 25 ciclos típicamente producen suficiente amplificación pero ésta se pod ría incrementar hasta 35 ciclos para obtener más productos. Los productos no específicos de varios tamaños pod rían hacerse más evidentes con ciclos ad icionales de amplificación , y podría ser necesario purificar el producto en gel. Si fuera posible, podría ser útil incrementar la aportación de plantilla de ADN más que el número de ciclos de amplificación.
Después de la PCR, se cargan 5 a 10 µ? de los productos en un gel de agarosa al 1.2% con un marcador de tamaño de ADN apropiado para confirmar el resultado. Si los productos son del tamaño correcto (~ 850 pb para scFv, ~ 500 pb para la genoteca de la VH o la VL) y tienen productos no específicos mínimos, éstos se pueden utilizar directamente en la reacción de transcripción de la siguiente ronda. Podría ser necesario que los productos se purifiquen en gel. Si se va a efectuar la purificación en gel para los productos de PCR, todos los productos remanentes en un gel de agarosa preparativa se separan y se puede cortar la banda específica que contiene los productos para extracción de gel. La cuantificación del ADN purificado en gel podría ser engañosa, ya que los residuos de EtBr en el ADN tienden a interferir con la absorbancia en UV. Un paso de lavado más exhaustivo durante la extracción en gel podría ayudar a aliviar esta interferencia. Si fuera posible, la concentración de ADN se debe medir en un espectrofotómetro, debido a que los trazos del barrido de ultravioleta son completamente diferentes entre una muestra de ADN limpia y una de ADN con EtBr residual. Este protocolo se repite posteriormente para efectuar rondas múltiples de selección.
16. Ejemplos de reactivos v composiciones de sol ución amortig uadora
Solución amortiguadora 10X para
ligación química
Tris, pH 7 250 mM
NaCI 1 M
Solución amortiguadora para unión 1 X 2X 3X de Oligo-dT
Tris, pH 8 100 200 300 mM
NaCI 1 2 3 M
Tritón X-100 0.05 0.1 0.15%
Solución amortiguadora para unión 1 V ,-Y
de FLAG 1 X 5X
Solución amortiguadora basada
en fosfatos
PBS 1 X 5X
Tritón X-100 0.025 0.125%
Solución amortiguadora basada
en HEPES alternativa
HEPES 50 250 mM
NaCI 150 750 mM
Tritón X-100 0.025 0.125%
Solución amortiguadora para
selección
Solución amortiguadora basada
en fosfatos
PBS 1 X
BSA 1 mg/ml
ADN de esperma de salmón 0.1 mg/ml
Tritón X-100 0.025%
ARNt de levadura (opcional,
20 ng/ml agregar antes de usar)
Solución amortiguadora basada en
HEPES alternativa
HEPES 50 mM
NaCI 150 mM
BSA 1 mg/ml
ADN de esperma de salmón 0.1 mg/ml
Tritón X-100 0.025%
ARNt de levadura (opcional, r¡ . , ng/ml agregar antes de usar) a
Solución amortiguadora para la
primera cadena
Tris-HCI, pH 8.3 250 mM
KCI 375 mM
MgCI2 15 mM
Solución de reserva de FLAG 50X
Péptido FLAG 25 mg
Solución amortiguadora c .
. 5 mi para selección
Prepare alícuotas de 1 mi y almacénelas a -20°C
Solución para elución de FLAG
Solución de reserva de FLAG „ .
50X 1 m l
Solución amortiguadora para |
selección
Prepare alícuotas de 1 ml y almacénelas a -20°C Preparación de oligo-dT celulosa
Se pueden transferir 2.5 g de oligo-dT celulosa a un tubo de 50 mi y mezclar con 25 mi de NaOH 0.1 N. La mezcla se puede centrifugar a 1500 rpm durante 3 minutos y se desecha el sobrenadante. La oligo-dT celulosa se lava después con 25 mi de solución amortiguadora 1X de oligo-dT y se centrifuga a 1500 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante se puede desechar. El paso de lavado se puede repetir 3 veces más y se mide el pH del sobrenadante. El pH debe ser el mismo que el de la solución amortiguadora de lavado (~pH 8.5). La oligo-dT celulosa se puede volver a suspender hasta un volumen final de 25 mi mediante adición de solución amortiguadora 1X de oligo-dT para hacer una papilla de aproximadamente 50% y se almacena a 4°C. La concentración final = 100 mg/ml = 1 nmol de capacidad de ARN.
Preparación de Agarosa anti-FLAG M2
Se pueden transferir 25 mi de glóbulos de agarosa M2 a un tubo de 50 mi y se centrifuga durante 5 minutos a 1000 rpm en una centrífuga Beckman (Beckman Coulter, Fullerton, CA). El sobrenadante se puede retirar mediante aspiración. Los glóbulos resultantes se pueden volver a suspender, se lavan en un volumen igual de glicina 10 mM (pH 3.5) y se centrifugan durante 5 minutos a 1000 rpm. El sobrenadante de nuevo se retira mediante aspiración. Los glóbulos se vuelven a suspender con un volumen de columna de solución amortiguadora para unión de FLAG 1X y se centrifugan durante 5 minutos a 1000 rpm. El sobrenadante se elimina mediante aspiración. Este paso de lavado se puede repetir 3 veces y los glóbulos se vuelven a suspender con un volumen de columna de solución amortiguadora para unión 1X (que contiene 1 mg/ml de BSA y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón). La mezcla se puede hacer girar durante 1 hora o durante toda la noche a 4°C y se separa en alícuotas en fracciones de 2 mi, si se desea, y se mantiene a 4°C.
EJEMPLO 2
Demostración de moléculas de ARNm-scFv funcionales
Se utilizan cuatro anticuerpos para demostrar que las moléculas de ARNm-scFv funcionales pueden ser desplegadas y unirse a su antígeno respectivo: D2E7 (anti-hTNF de humano), Y61 (anti-hlL-12 de humano), 17/9 (anti-HA de ratón), y MAK 195 (anti-hTNF de ratón). El scFv de MAK195 se genera mediante PCR utilizando los siguientes iniciadores en la Tabla 9.
TABLA 9
Iniciadores de oligonucleótido utilizados para la construcción de construcciones mARN-scFv de MAK195
Iniciadores Secuencias
T7-MAK195VH-Fwd TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTT
ACAATTACACCATGGAGGTGCAGCTGAAGGAG
(SEQ ID NO: 19)
TCAGG
TABLA 9 (con
Iniciadores Secuencias
MAK195VHGS-Rev CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGA (SEQ ID NO: 20) ACCGCCTCCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT
CC
MAK195VLGS-Fwd GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGG (SEQ ID NO: 21 ) CGGTGGCGGATCGGACATTGTGATGACCCAGTC
TC
MAK195VL-Rev GATGGTGCAGCCACCGTACGTTTTATTTCCAAC (SEQ ID NO: 22) TTTGTCCCCGAG
Se genera u n scFv de 1 7/9 anti-HA (véase Schulze-Gahmen et al. ( 1 993) J . Mol. Biol . 234(4): 1098-1 1 8) mediante PCR utilizando los siguientes iniciadores basados en las secuencias de proteína A31 790 y B31 790 descargadas de la base de datos del NC BI (véase siguiente Tabla 1 0) .
TABLA 1 0
Iniciadores de oligon ucleótido utilizados para la construcción de construcciones de mARN-scFv de 1 7/9
Iniciadores Secuencias
T7TMVUTR-17/9 VH-1 GGACAATTACTATTTACAATTACACCATGGAAG
Fwd TGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGATCTGGTG
(SEQ ID NO: 23) AAACC
TABLA 1 0 (cont.)
Iniciadores Secuencias
17/9 VH-2 Rev GCTGCTAAAGCTAAAGCCGCTCGCCGCGCAGCT (SEQ ID NO: 24) CAGTTTCAGGCTGCCGCCCGGTTTCACCAGATC
GCCG
17/9 VH-3 Fwd GGCTTTAGCTTTAGCAGCTATGGCATGAGCTGG (SEQ ID NO: 25) GTGCGCCAGACCCCGGATAAACGCCTGGAATG
GGTGG
17/9 VH-4 Rev GCCTTTCACGCTATCCGGATAATAGGTATAGCC (SEQ ID NO: 26) GCCGCCGTTGCTAATGGTCGCCACCCATTCCAG
GCGT
17/9 VH-5 Fwd CCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGC (SEQ ID NO: 27) CGCGATAACGCGAAAAACACCCTGTATCTGCAG
ATG
17/9 VH-6 Rev GTTCGCGGCGCGCGCAATAATACATCGCGCTAT (SEQ ID NO: 28) CTTCGCTTTTCAGGCTGCTCATCTGCAG ATACA
GGGT
17/9 VH-7 Fwd ATTGCGCGCGCCGCGAACGCTATGATGAAAAC (SEQ ID NO: 29) GGCTTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTG
ACCGT
17/9 VH-8 GS Rev CGATCCGCCACCGCCGCTGCCACCTCCGCCTGA (SEQ ID NO: 30) ACCGCCTCCACCCGCGCTCACGGTCACCAGGGT
GCCC
TABLA 1 0 (cont.)
Iniciadores Secuencias
GS-17/9 VL-1 Fwd AGCGGCGGTGGCGGATCGGATATTGTGATGACC (SEQ ID NO: 31 ) CAGAGCCCGAGCAGCCTGACCGTGACCGCGGG
CGAAA
17/9 VL-2 Rev (SEQ TGTTTGCCGCTGTTAAACAGGCTCTGGCTGCTG ID NO: 32) GTGCAGCTCATGGTCACTTTTTCGCCCGCGGTC
ACGG
17/9 VL-3 Fwd (SEQ GTTTAACAGCGGCAAACAGAAAAACTATCTGA ID NO: 33) CCTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGCCGCCG
AAAGTG
17/9 VL-4 Rev CGGTAAAGCGATCCGGCACGCCGCTTTCGCGGG (SEQ ID NO: 34) TGCTCGCCCAATAAATCAGCACTTTCGGCGGCT
GGCC
7/9 VL-5 Fwd (SEQ TGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGCA ID NO: 35) CCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCGTGCAGG
CGGA
17/9 VL-6 Rev AAAGGTCAGCGGGTTGCTATAATCGTTCTGGCA (SEQ ID NO: 36) ATAATACACCGCCAGATCTTCCGCCTGCACGCT
GCTA
17/9 VL-7 Fwd AGCAACCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAA (SEQ ID NO: 37) CTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCT
GTCT
17/9 VL-8 Flag Rev TTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTT (SEQ ID NO: 38) GTAGTCGATGAAGACAGATGGTGCAGCCACC
La secuencia del anticuerpo 17/9 se recupera de la base de datos del NCBI utilizando los números de acceso A31790 y B31790.
Las construcciones de ADN para estos scFv se transcriben in vitro y después se traducen en el Usado de reticulocito de conejo ya sea como un ARNm-scFv (la proteína está unida al ARNm a través de un enlazador con modificación de puromicina) o como un scFv libre (la proteína no está unida al ARNm). Ambos tipos de moléculas se purifican y se someten a pruebas de atrapamiento (pull-down ) utilizando los antígenos biotinilados correspondientes (véase Figura 4).
Los datos en la Figura 4 muestran que las moléculas ARNm-scFv funcionales (unidas al antígeno biotilinado) son atrapadas por glóbulos magnéticos con estreptavidina, aunque a un porcentaje de recuperación más bajo que el de las moléculas de scFv libres. Experimentos adicionales muestran que esta diferencia se debe simplemente a la molécula de ARN grande unida al scFv. La degradación con ARNasa de la porción de ARN de las moléculas de ARNm-scFv restaura la recuperación de scFv mediante antígenos hasta el mismo nivel que el de las moléculas de scFv libres (véase Figura 5).
EJEMPLO 3
Construcción de la genoteca de ARNm-scFv
Se obtienen células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) de humano a partir de 18 donadores a partir de SeraCare. La siguiente Tabla 11 muestra el análisis de PBMC mediante el Método de Clasificación de Célula Activado por Fluorescencia (FACS por sus siglas en inglés). Después se extrae el ARN poli A para la construcción de la genoteca.
TABLA 11
Análisis de PBMC mediante FACS
Lote Número total Células CD20+ CD27+/CD20+ de células total por frasco, CD27- CD27 + Total
x106
#012505 22 2.8% 5.6% 8.4% 67%
#020805 21 12.1% 2.4% 14.5% 17%
#022205A 23 4.9% 3.7% 8.5% 43%
#030305A 14 7.6% 3.5% 11.1% 32%
#032905A 11 3.8% 2.8% 6.7% 42%
#041205A 23 4.9% 4.8% 9.7% 49%
#041405A 23 5.9% 3.2% 9.1% 35%
#041905A 18 5.1% 2.2% 7.3% 30%
#042604B 26 9.3% 2.5% 11.9% 21%
#042805B 24 11.4% 1.9% 13.3% 14%
TABLA 11 (cont.)
EJEMPLO 4
Selección de la marca para la qenoteca
Se seleccionan cuatro marcas de 8 pares de bases (SEQ ID NOs: 39-42) y se insertan entre las secuencias de TMV-UTR y de consenso de Kozak de la construcción ARNm-scFv de 17/9 (véase Figura 6). Las secuencias de marca están diseñadas para que no incluyan adenosinas y se identifican después de 3 rondas de selección. Como se observa en la Figura 6, la primera posición prefiere G, y la segunda posición prefiere T. Las marcas de secuencia aleatorias se generan diseñando iniciadores 5' con 8 inserciones de nucleotido aleatorias (B = G, C, T) entre las secuencias de TMV y de consenso de Kozak de la 5'UTR (véase Figura 7). El scFv de 17/9 se amplifica después y se selecciona a través de 2-3 rondas de selección, en donde las rondas subsiguientes se vuelven a amplificar con iniciadores 5'. Las producciones de la secuencia después se procesan para identificar las marcas que pasan a través del proceso de selección. Las diferentes marcas de producción de cada ronda se muestran en la Figura 8. Se observan algunas secuencias repetidas dentro de cada ronda, sin embargo, no se observa secuencia de marca en rondas múltiples. Se debe indicar que hay una posible mutación en la marca en la ronda 2, debido a que una secuencia ATG no sería posible en una secuencia de marca.
EJEMPLO 5
Selección de genoteca para scFv de 17/9
Para demostrar que una molécula de ARNm-scFv se puede enriquecer mediante varias rondas de selección utilizando los métodos de despliegue de ARNm descritos en la presente solicitud, se construye una genoteca de scFv con una diversidad de 25 utilizando el método de PCR de traslape. Para crear la genoteca de scFv, se utilizan los fragmentos de la VH y VL de 17/9, D2E7, 2SD4, Y61 y MAK195 como se describió anteriormente. Después se selecciona el scFv de 17/9 a partir de esta genoteca utilizando una marca HA biotinilada. Después de la selección, se examina el enriquecimiento de 17/9 mediante clonación y reacciones de PCR de colonia. Los resultados que cuantifican a scFv de 1 7/9 antes y después de una ronda de selección de ARNm-scFv se muestran en la Figu ra 9.
EJEMPLO 6
Uso de la tecnología de despliegue de ARNm para discriminar los ligadores de scFv con afinidad diferente
Para determinar si la tecnología de desplieg ue de ARNm, es decir, como se describió anteriormente, se utiliza para d iscriminar o no los ligadores de scFv con afinidad diferente , se elaboran quimeras entre D2E7 y 2SD4. 2S D4 es el precu rsor del scFv de D2 E7 que presenta baja afinidad (KD ~ 200 nM como proteína libre) para TN Fa . La Figu ra 1 0 muestra las quimeras.
Se efectúa la titulación para proteínas libres. La Fig u ra 1 1 muestra el porcentaje de recuperación después de la un ión a antígeno entre las diferentes quimeras, así como el por ciento normalizado de recuperación después de la selección de antígeno. Los resultados anteriores muestran q ue la tecnolog ía de despliegue de ARNm como se describe en la presente solicitud , se puede utilizar para discriminar ligadores con afinidad diferente.
EJEMPLO 7
Termoestabil idad de las molécu las de ARN m-scFv
Para determinar la termoestabilidad de las moléculas de
ARNm-scFv, se traducen D2E7-scCk y Y61-scCK y se purifican en el formato ARNm-scFv como se describe en la presente solicitud. Las moléculas de ARNm-scFv se incuban después a temperaturas diferentes durante 30 minutos antes de la selección de antígeno. El por ciento normalizado de recuperación después de selección del antígeno se muestra en la Figura 12.
La Figura 13 muestra que el ARN se puede recuperar después del tratamiento a temperatura elevada de moléculas de ARNm-scFv. En este caso, la RT-PCR se efectúa en los glóbulos con moléculas de ARNm-scFv de Y61-scCI recuperadas.
EJEMPLO 8
Construcción de una genoteca PROfusion de scFv kappa no afectada por tratamiento a partir de ARNm de Pbmc de humano
El siguiente ejemplo describe la generación de una genoteca de scFv kappa de humano no afectada por tratamiento apropiada para la selección utilizando la tecnología PROfusion.
Se adquieren células mononucleadas de sangre periférica (PBMCs) de humano a partir de SeraCare (Milford, MA, cat. #72000). Las células provenientes de donadores diferentes se caracterizan mediante tinción con anticuerpos anti-CD20 de humano-FITC (BD Pharmingen, San Diego, CA, cat. #556632) y anti-CD27-PE de humano (BD Pharmingen, cat. #555441). El ARN total se aisla de las PBMCs utilizando el estuche RNeasy Midi (QIAGEN, Valencia, CA, cat. #751444), de conformidad con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células congeladas se descongelan rápidamente a 37°C, se vuelven a suspender en una solución amortiguadora que contenga isotiocianato de guanidina y se homogenizan haciéndolas pasar varias veces a través de una aguja calibre 21. Se agrega etanol y el Usado se aplica a las columnas RNeasy midi (18 columnas en total). Las columnas se lavan, y el ARN total se eluye con agua libre de ARNasa. La concentración de ARN y el rendimiento se determinan midiendo la absorbancia a DO 260 nm. Después se aisla el ARNm de conformidad con el manual del estuche, a partir del ARN total utilizando el estuche para aislamiento de ARNm Fastrack MAG Maxi de Invitrogen (cat. #K1580-02). Se agrega el inhibidor de ARNasa (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. #10777-019) durante el procedimiento para reducir al mínimo la degradación del ARN. El ARN total se trata primero con ADNasa (Invitrogen, cat. #18-68-015) para reducir al mínimo la contaminación por ADN genómico. Brevemente, los glóbulos magnéticos de Oligo-dT se lavan primero y después se agregan al ARN total, se incuban a 65°C durante 10 minutos, y después se deja que se unan a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los glóbulos se lavan varias veces, y el ARNm unido se eluye utilizando agua libre de ARNasa. El ARNm se cuantifica midiendo la absorbancia a OD260 nm.
Transcripción inversa
Después se sintetiza la primera cadena de ADNc a partir de 37pg de ARNm utilizando Transcriptasa Inversa SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. #186064-014) y una mezcla de 15 iniciadores (concentración total 100 nM) (Tabla 12), de conformidad con el protocolo del fabricante. La reacción se efectúa en 2 alícuotas de 0.9 mi cada una. La reacción de RT (volumen total 1.8 mi) se purifica haciéndola pasar a través de 36 columnas MicroSpin S-200 HR (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, cat. #27-5120-01) (50 pl por columna). El eluato de las columnas se incuba con ARNasaH durante 20 minutos a 37°C.
TABLA 12
Iniciadores para transcripción inversa
Nombre Secuencia de oligonucleótido
FcyRevl (SEQ ID NO: 43) AGTTCCACGACACC
FcyRev2 (SEQ ID NO: 44) GAAGGTGTGCACG
FcyRev3 (SEQ ID NO: 45) CCACGCTGCTGAG
FcµRev1 (SEQ ID NO : 46) ACTTTGCACACCAC
FcµRev2 (SEQ ID NO : 47) TTTGTTGCCGTTGG
FcµRev3 (SEQ ID NO : 48) GGGAATTCTCACAGG
Fc6Rev1 (SEQ ID NO: : 49) GCTGCTTGTCATGT
Fc5Rev2 (SEQ ID NO: : 50) TGCCTTTGGAGACT
Fc5Rev3 (SEQ ID NO: : 51) GACCACGCATTTGT
Ci RevI (SEQ ID NO: 52) TCCACCTTCCACTG
CicRev2 (SEQ ID NO: 53) CAGGCACACAACAG
TABLA 12 (cont.)
Nombre Secuencia de oligonucleótido
C Rev3 (SEQ ID NO: 54) GAGTGTCACAGAGC
^Rev1 (SEQ ID NO: 55) GGGAACAGAGTGAC
C Rev2 (SEQ ID NO: 56) GTGTGGCCTTGTTG
^Rev3 (SEQ ID NO: 57) CCATCTGCCTTCCA
Amplificación del ADNc de la VH
Un tercio de la reacción del RT anterior se somete a amplificación limitada utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, cat. #11304-102) en reacciones que contienen una mezcla de iniciadores sentido específicos de secuencia líder (LS) de la VH (concentración total 200 nM y una mezcla de iniciadores anti-sentido específicos de JH (concentración total 200nM) (Tabla 13). Las condiciones de PCR son las siguientes: desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 10 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Los productos de PCR después se purifican utilizando el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN, Valencia, CA, cat. #28106), de conformidad con el protocolo del fabricante. Un experimento a escala piloto pequeño confirma una amplificación de por lo menos 100 veces del ADNc.
TABLA 13
Iniciadores utilizados para amplificación de fragmentos de la VH
Nombre Secuencia de oligonucleótido
VH1/7LS (SEQ ID NO: 58) ATCCTCTTYTTGGTGGSAGC
VH1-46LS (SEQ ID NO: 59) GGTCTTCTGCTTGCTGGCTG
VH2LS (SEQ ID NO: 60) CCTGCTGCTGACCAYCCCTTC
VH3LS (SEQ ID NO: 61) GCTATTTTWVRAGGTGTCCARTGT VH4LS (SEQ ID NO: 62) GCRGCTCCCAGATGGGTCCTG
VH5LS (SEQ ID NO: 63) ATGGGGTCAACCGCCATCCT
VH6LS (SEQ ID NO: 64) TGGGCCTCCCATGGGGTGTC
JH1/2sRev (SEQ ID NO: 65) CTGAGGAGACRGTGACCAGGGTGC JH4/5sRev (SEQ ID NO: 66) CTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC JH6sRev (SEQ ID NO: 67) CTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC JH3sRev (SEQ ID NO: 68) CTGAAGAGACGGTGACCATTGTCC
Una centésima parte (1/100) del producto de PCR purificado se utiliza como una plantilla para amplificación de cada ADNc específico de familia de VH. La amplificación se efectúa mediante PCR con ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción que contiene el iniciador sentido específico de LS de VH individual (200 nM) y una mezcla de iniciadores anti-sentido específicos de JH (concentración total 200 nM) (Tabla 13). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Los productos de PCR anteriores se purifican utilizando el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN, Valencia, CA) de conformidad con el protocolo del fabricante. Cada producto de PCR se amplifica posteriormente utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción de PCR que contiene el iniciador sentido anidado específico de VH correspondiente (200 nM)y una mezcla de iniciadores anti-sentido específicos de JH (concentración total 200 nM) (Tabla 14). Los iniciadores sentido en cada reacción portan una "marca" de 8 nucleótidos (subrayada), la cual se introduce para incrementar la especificidad durante amplificaciones subsiguientes de la genoteca. Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
TABLA 14
Iniciadores utilizados para PCR específica de VH anidada
Nombre Secuencia de oligonucleótido
VH1Tag2Forward TTTACAATTACAGTGTTGCGACCATGGAGGTGCAGCTGGT (SEQ ID NO: 69) GCAGTCTGGRSCT
VH2Tag2Forward TTTACAATTACAGTGTTGCGACCATGGAGRTCACCTTGAR (SEQ ID NO: 70) GGAGTCTGGT
TABLA 14 fcont. )
Nombre Secuencia de oligonucleótido
VH3Tag2Forward TTTACAATTACAGTGTTGCGACCATGGAGGTGCAGCTGKT
(SEQ ID NO: 71) GGAGTCTSGRGGA
VH4Tag2Forward TTTACAATTACAGTGTTGCGACCATGGAGGTGCAGCTGCA
(SEQ ID NO: 72) GSAGTSSGGC
VH5Tag2Forward TTTACAATTACAGTGTTGCGACCATGGAGGTGCAGCTGGT
(SEQ ID NO: 73) GCAGTCTGGAGCA
VH6Tag2Forward I I I ACAATTACAGTGTTGCGACCATGGAGGTACAGCTGCA
(SEQ ID NO: 74) GCAGTCAG
VH7Tag2Forward I I I ACAATTACAGTGTTGCGACCATGGAGGTGCAGCTGGT
(SEQ ID NO: 75) GCAATCTGGGT
JH Reverse 1/2 CGCTACCTCCGCCGCCAGACCCGCCTCCACCTGAGGAGAC
(SEQ ID NO: 76) RGTGACCAGGGTGC
JHReverse4/5 CGCTACCTCCGCCGCCAGACCCGCCTCCACCTGAGGAGAC
(SEQ ID NO: 77) GGTGACCAGGGTTC
JHReverse6 CGCTACCTCCGCCGCCAGACCCGCCTCCACCTGAGGAGAC
(SEQ ID NO: 78) GGTGACCGTGGTCC
JHReverse3 CGCTACCTCCGCCGCCAGACCCGCCTCCACCTGAAGAGAC
(SEQ ID NO: 79) GGTGACCATTGTCC
Los productos de PCR se someten a electroforesis en gel de agarosa al 1 % , y se purifican utilizando el estuche para extracción en gel Q IAqu ick (Q IAGEN , Valencia , CA, cat. #28704) . Las alícuotas de estos productos de PC R se amplifican adicionalmente a gran
escala en una reacción de PCR utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 200 nM de los siguientes iniciadores universales:
T7T VTag2 (SEQ ID NO: 80):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAGTGTTGCGAC
Library-GS-Reverse (SEQ ID NO: 16):
CGCTACCTCCGCCGCCAGAC.
Estos iniciadores agregan un promotor T7 y una secuencia de TMV-UTR al extremo 5' de los productos de PCR, y un enlazador parcial de glicina-serina (G4S) al extremo 3' de los productos de PCR. Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 26 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Los productos de PCR se purifican con el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN, Valencia, CA), se cuantifican mediante absorbancia en UV a 260 nm, y las alícuotas de estos productos se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% para confirmar la pureza. Las alícuotas de fragmentos de ADNc específicos de familia de la VH se clonan utilizando el estuche para clonación TOPO TA (Invitrogen, cat, #45-0641), y los clones individuales se analizan mediante secuenciación.
Amplificación de ADNc de VK
Un tercio del ADNc generado a partir de la reacción de RT antes mencionada se somete a amplificación limitada utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción que contiene una mezcla de iniciadores sentido específicos de secuencia líder (LS) de VK (concentración total 200 nM) e iniciador anti-sentido específico de CK (200 nM) (Tabla 15). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 10 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Un experimento separado a pequeña escala confirma una amplificación de 10 a 100 veces del ADNc mediante dicha PCR.
Los productos de PCR se purifican con el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN, Valencia, CA), de conformidad con el protocolo del fabricante. 1/500 del producto de PCR purificado se utiliza como una plantilla para amplificación de cada ADNc específico de familia de VK. La amplificación se efectúa mediante PCR con ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción que contiene iniciadores sentido específicos de LS de VK individuales (200 nM) e iniciadores anti-sentido específicos de CK (200 nM) (Tabla 16). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C .
TABLA 1 5
Iniciadores utilizados para am plificación de fragmentos de VK
Nombre Secuencia de oligonucleótido
VKI LS (SEQ ID NO: 81) GCTCCTGGGRCTYCTGC
VK2LS (SEQ ID NO: 82) CTYCTGGGGCTGCTAATG
VK3LS (SEQ ID NO: 83) CTCTGGCTCMCAGATACCAC
VK4LS (SEQ ID NO: 84) GGATCTCTGGTGCCTACGG
VK5LS (SEQ ID NO: 85) GGATCTCTGATACCAGGGCA
VK6LS (SEQ ID NO: 86) CTGGGTTCCAGCCTCCAG
??-sReverse (SEQ ID NO: 87) GAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCG
TABLA 16
I niciadores uti lizados para PCR específica de VK anidada
Nombre Secuencia de oligonucleótido
VK1 Forward GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGACA (SEQ ID NO:88) TCCRGWTGACCCAGTCTCCWT
VK2 Forward GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGATA (SEQ ID NO:89) TTGTGATGACYCAGWCTCCAC
VK3 Forward CTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGAAATT (SEQ ID NO:90) GTGWTGACRCAGTCTCCAGSCA
TABLA 16 (cont.)
Nombre Secuencia de oligonucleótido
VK4/6 Forward GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGACA
(SEQ ID NO:91) TCGTGMTGACYCAGTCTCCAGA
VK5 For-Redo CTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGAAACG
(SEQ ID NO:92) ACACTCACGCAGTCTCCAGCAT
VK6 For-NEW CTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGATGTC
(SEQ ID NO: 93) GTGATGACACAGTCTCCAGCTT
CK Reverse GTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGAAGACAGATGGTGCAGC
(SEQ ID NO:14) CACAGTTCG
Los productos de PCR se purifican con el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada producto de PCR se amplifica posteriormente mediante ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción de PCR que contiene los iniciadores sentido anidados específicos de VK correspondientes (200 nM) y los iniciadores anti-sentido específicos de CK (200 nM) (Tabla 13). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (30 segundos, 55°C (30 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Los productos de PCR se someten a electroforesis en gel de agarosa al 1%, y se purifican utilizando el estuche para extracción en gel QIAquick (QIAGEN, Valencia, CA). Las alícuotas de estos productos de PCR también se amplifican a gran escala en una reacción de PCR que contiene ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) y los siguientes iniciadores universales (200 nM):
Library-GS-Forward (SEQ ID NO: 94):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCG
FlagA20Rev (SEQ ID NO: 95):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA A AT AG CGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTC.
Estos iniciadores agregan un enlazador G4S parcial al extremo 5' del producto de PCR y una marca FLAG, sitio de fijación al enlazador y una cola poliA al extremo 3' de los productos de PCR resultantes.
Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 26 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos, y 68°C (30 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Los productos de PCR se purifican con el estuche de purificación para PCR (QIAGEN, Valencia, CA), se cuantifican mediante absorbancia en UV a 260 nm, y las alícuotas de estos productos se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% para
confirmar la pureza. Parte de los fragmentos de ADNc específicos de la familia VK obtenidos se clonan utilizando el estuche para clonación TOPO TA (Invitrogen, cat. #45-0641), y los clones individuales se analizan mediante secuenciación.
Construcción de scFv de VH-VK
Los fragmentos de ADNc de VH y VK se mezclan de conformidad con el número de líneas germinales en cada familia (Tablas 17 y 18).
TABLA 17
Relación de mezclado de los fragmentos de VH
TABLA 18
Relación de mezclado de los fragmentos de VK
Fragmento de
VK1 VK2 VK3 VK4 VK5 VK6 Total VK
# de líneas
21 11 8 1 1 3 45 germinales
% del Total 46.7% 2.4% 17.8% 2.7% 2.7% 8.3% 100%
Se utiliza un total de 10 pg de fragmentos de ADNc de la VH (2 x 1013 moléculas) y un total de 10 pg de fragmentos de ADNc de VK (2 x 1013 moléculas) como plantilla para PCR de traslape. La PCR se efectúa con ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum y los iniciadores T7TMVTag2 (200 n ) y FlagA20Rev (200 nM), en un volumen de 30 mi. Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 17 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Se clona una alícuota del producto de PCR utilizando el estuche para clonación TOPO TA (Invitrogen, cat: #45-0641), y los clones individuales se analizan mediante secuenciación.
Tipificación por espectros
Se utilizan un iniciador sentido 5' marcado con colorante fluorescente (6-FAM-PanVHFR3-Fwd,5'-GACACGGCCGTGTATTACTGT-3', SEQ. ID NO: 17) y un iniciador inverso (PanJH-Rev, 5'-GCTGAGGAGACGGTGACC-3\ SEQ ID NO: 18) que se fijan respectivamente a la región 3 de la estructura base de la VH y a la región J para amplificar a través de las regiones de CDR3 de los dominios de VH mediante PCR. Se utilizan 50 ng de la plantilla de ADN de la genoteca de scFv en un volumen de reacción de 30 µ? que contiene el iniciador 6-FAM-PanVHFR3-Fwd 200 nM, iniciador PanJH-Rev 200 nM, dNTP 200 µ?, solución amortiguadora 1 x GoTaq, y 1.5 unidades de GoTaq (Promega, Madison, Wl). Las
condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 30 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 72°C (30 segundos); seguido por un paso de 5 minutos de 72°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Después de la PCR se cargan 10 µ? de productos en un gel de agarosa al 2% para confirmar las reacciones satisfactorias y los productos remanentes se someten a electroforesis para tipificación por espectros utilizando un aparato para secuenciación ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las longitudes de CDR3 se calculan restando las secuencias de estructura base de flanqueo de 60 pares de bases de las longitudes del producto que se determinan utilizando marcadores de ADN marcados con colorante ROX.
Resultados
Caracterización de PBMC de humano
El pretamizaje de muestras de PBMC provenientes de 20 donadores respecto a células B (CD20+) y B de memoria (CD27+) mediante citometría de flujo da como resultado la selección de 10 donadores (> de 9% de células B en las PMBC y < de 35% de células B de memoria en las células B totales) y permite la optimización de la distribución del donador por edades, género, y grupo étnico hasta el mejor grado de disponibilidad del donador (Figura 14).
Purificación de ARN
Para obtener el repertorio de ADNc de anticuerpo para la construcción de la genoteca, se obtienen 1.9 mg del ARN total, a partir de 2.3 x 109 PBMCs de humano con un estimado de 2.6 x 108 células B. Una purificación posterior de ARNm poli A a partir del ARN total produce 42.2 pg de ARNm.
Amplificación de los fragmentos de ADNc de la VH
Las alícuotas de fragmentos de ADNc específicos de familia de VH de ~500 pares de bases que se amplifican utilizando los iniciadores universales de VH (T7TMVTag2, SEQ ID NO: 80 y library-GS-Rev, SEQ ID NO: 16) se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 15).
El análisis de secuenciación de los clones de VH individuales se presenta en la Tabla 19. La comparación de las secuencias de VH clonadas con secuencias de línea germinal de VH conocidas confirma amplificaciones altamente específicas por parte de los iniciadores específicos de familia de VH.
Amplificación de los fragmentos de VK
Las alícuotas de fragmentos de ADNc específicos de familia de VK, amplificados con los iniciadores universales (Library-GS-Fwd, SEQ ID NO: 94 y FlagA20Rev, SEQ ID NO: 95) se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 16). El análisis de secuenciación de los clones de VK individuales se presenta en la Tabla 20. Los datos confirman la especificidad del iniciador para cada una de las familias de línea germinal de VK.
TABLA 19
Análisis de determinación de secuencia de productos de PCR específicos de familia de VH
Construcción de scFv de VH-VK
Se efectúa PCR de traslape para construir fragmentos de ADNc de scFv de VH-VK. Partes de los productos obtenidos se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 17). El fragmento de scFv de VH-VK generado tiene todos los elementos necesarios para que sea seleccionado mediante la tecnología de despliegue de ARNm PROfusion (Figura 17). La secuenciación de clones individuales de scFv de VH-V confirma la recombinación de VH-VK correcta con un enlazador G4S intercalado funcional en una gran mayoría. La distribución de diversas familias de VH y V en la genoteca de scFv construida es consistente con los reportes previos en la literatura (Figura 18, véase también Tsuiji et al. (2006). Exp. Med.; V.203 (2), pp.393-400 y Arons et al. (2006) British Journal of Haematology V.133, pp. 504-512).
TABLA 20
Análisis de determinación de secuencia de productos de PCR específicos de familia de VK
13 B2
Tipificación por espectros
El análisis de tipificación por espectros de la distribución de tamaño de CDR3 entre diferentes familias de VH se efectúa en fragmentos de ADNc de la VH justo antes de su ensamblado como una genoteca de scFv (Figura 19). Como sería de esperar en una genoteca de ADNc con un alto grado de diversidad, los tamaños de CDR3 observados varían en gran manera en todas las familias analizadas. Las alturas de los picos observados de los diferentes tamaños de CDR3 toman una curva con forma de campana típica de una distribución normal y es una indicación de un tamaño de población muy grande. Esto es especialmente evidente en los resultados obtenidos a partir de una línea germinal individual o a partir de familias de VH muy pequeñas tales como VH1-46, VH2, VH5, y VH6. También es interesante observar la ligera diferencia de los tamaños de CDR3 en familias de VH diferentes. Por ejemplo, VH1 y VH2 tienden a tener más CDR3 de 15-16 residuos, mientras que VH3 tiene más CDR3 de 13 residuos. Tomados juntos, los análisis de tipificación de espectros de las familias de VH individuales confirman una alta diversidad y secuencias de VH muy grandes en la genoteca de ADNc.
Se muestrean aleatoriamente 8 plantillas de genoteca de scFv y se someten a análisis de tipificación por espectros como se describió previamente. Los resultados obtenidos a partir de todas las 8 muestras son indistinguibles, lo que sugiere que las plantillas de genoteca en cada al ícuota son similares desde el punto de vista de reproducibilidad (Figura 20) . Los tamaños de C DR3 de la VH de la genoteca tienen una distribución normal y la mayoría caen entre 6 a 24 resid uos y se centran entre 1 3 a 1 6 residuos. Esta distribución es como se esperaba y es consistente con los resultados de tipificación por espectros de familia de VH individ ual .
Conclusión
La selección de líderes de anticuerpo de alta calidad de humano es un prerreq uisito para el desarrollo de fármaco de anticuerpo terapéutico satisfactorio. Además de u na tecnolog ía de selección robusta , la calidad de la genoteca de anticuerpo (fuente, diversidad y construcción) determina en gran manera su utilidad pa ra producir buenos l íderes. Se pretamizan muchos donadores humanos para una mayor diversidad y los iniciadores de PCR se d iseñan con especificidad extremadamente alta para cubrir todas las secuencias de l ínea germinal de anticuerpo de modo tal que se pueda captu rar toda la diversidad dentro de la colección de donadores. La genoteca de scFv de anticuerpo construida tiene una diversidad teórica mayor de 2 x 1 012 a partir de más de 2 x 1 08 células B, lo cual ha sido sustanciado mediante secuenciación de clones mú ltiples y mediante tipificación por espectros.
EJEMPLO 9
Construcción de una qenoteca de scFv PROfusion lambda no afectada por tratamiento a partir de ARN de PBMC de humano
La purificación de ARN total y ARNm, transcripción inversa de ARNm, y amplificación de ADNc de la VH mediante PCR se describieron en el Ejemplo 1.
Amplificación de ADNc de V
Un tercio del ADNc generado a partir de la reacción de RT antes mencionada se somete a amplificación limitada mediante ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción que contiene una mezcla de iniciadores sentido específicos de secuencia líder (LS) de \ ? (concentración total 200 nM) e iniciador anti-sentido específico de Cx (200 nM) (Tabla 21). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 10 ciclos de 94° (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 5 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Un experimento por separado a escala pequeña confirma una amplificación de 10 a 100 veces del ADNc mediante dicha PCR.
TABLA 21
Iniciadores utilizados para am plificación de los fragmentos de la
Nombre Secuencia de oligonucleótido
VL1 LS1 (SEQ ID NO: 96) TCACTGTGCAGGGTCCTG VL1 LS3 (SEQ ID NO: 97) TCACTGCACAGGGTCCTG VL2LS3 (SEQ ID NO: 98) TCAGGRCACAGGGTCCTG VL2LS4 (SEQ ID NO: 99) TCAGGGCACAGGATCCTG VL3LS2 (SEQ ID NO: 100) TGCATAGGTTCTGTGGTTTCTTCTG VL3LS3 (SEQ ID NO: 101) ACAGGHTCTGWGGCCTCCTATG VL3LS4 (SEQ ID NO: 102) TGCACAGGCTCTGTGACCTCCTATG VL3LS5 (SEQ ID NO: 103) TACACAGGCTCTATTGCCTCCTATG VL4ABLS2 (SEQ ID NO: 104) TCCACTGSACAGGGTCTCTCT VL4CLS2 (SEQ ID NO: 105) CTTCATTTTCTCCACAGGTCTCTGTG VL5LS (SEQ ID NO: 106) CACTGCACAGGTTCCCTC VL6LS (SEQ ID NO: 107) CTGCACAGGTTCTTGGGC VL7LS (SEQ ID NO: 108) CTCACTTGCTGCCCAGGG VL8LS (SEQ ID NO: 109) GCTTATGGATCAGGAGTGGATTC VL9LS (SEQ ID NO: 1 10) CACCCTCCTCAGTCTCCTC VL10LS (SEQ ID NO: 1 1 1 ) CTCTGCAGTGTCAGTGGTC CJLS Reverse (SEQ ID NO: 1 12) GCCTTGGGCTGACCKAGGACGGT
El producto de PCR se purifica utilizando el estuche de purificación para PCR Q IAquick (QIAG EN) de conformidad con el protocolo del fabricante . Se utiliza 1 /250 del prod ucto de PCR purificado como una plantilla para amplificación de cada ADNc específico de familia de VX. La amplificación se efectúa mediante PCR con ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción que contiene el iniciador sentido específico de LS de \ ? (200 nM) y el iniciador anti-sentido específico de CX (200 nM) (Tabla 22). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 35 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 5 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
TABLA 22
Iniciadores utilizados para PCR anidada específica de ??
Nombre Secuencia de oligonucieótido
VL1/10 ForRedo GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGATCGCAGTC (SEQ ID NO: 113) TGKGCTGACKCAGCCRC
VL2 For (SEQ ID GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGCAGT NO: 114) CTGCCCTGACTCAGCCT
VL3 ForNew (SEQ GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGTCCT ID NO: 115) ATGAGCTGACDCAG
VL4ab For (SEQ ID GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGCAGC NO: 116) YTGTG CTG ACTC AATC
VL4c For (SEQ ID 3TCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGCTGC NO: 117) DTGTGCTGACTCAGCCCCCG
TABLA 22 (cont.)
Los productos de PCR se corren en un gel de agarosa al 2%, y se purifican utilizando columnas QuantumPrep FreezeNSqueeze de conformidad con el protocolo del fabricante. Cada producto de PCR se amplifica posteriormente utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción de PCR que contiene el iniciador sentido anidado específico de ?? (200 nM) y los iniciadores anti-sentido específicos de CX (200 nM) (Tabla 13). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 35 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 5 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Los productos de PCR se corren en un gel de agarosa al 2% y, se purifican utilizando columnas QuantumPrep FreezeNSqueeze (Biorad, Hercules, CA). Las alícuotas de estos productos de PCR se amplifican adicionalmente en una escala más grande en una reacción de PCR que contiene ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) y los siguientes iniciadores universales (200 nM):
Library-GS-Forward (SEQ ID NO: 94):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCG
FlagA20Rev (SEQ ID NO: 95):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCG TCCTTGTAGTC.
Estos iniciadores agregan un enlazador G4S parcial al extremo 5' del producto de PCR y una marca FLAG, sitio de fijación al enlazador y una cola poli A al extremo 3' de los productos de PCR resultantes. Las condiciones de PCR son las siguientes: un paso de desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 35 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (30 segundos); seguido por un paso de 5 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Los productos de PCR se purifican utilizando el estuche de purificación de PCR Purelink (Invitrogen, Carlsbad, CA), se cuantifican mediante absorbancia en UV a 260 nm, y las alícuotas de estos productos se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% para confirmar la pureza.
Parte de los fragmentos de ADNc específicos de familia de \/? obtenidos se clonan utilizando el estuche para clonación TOPO TA (Invitrogen, cat. # 45-0641) y los clones individuales se analizan mediante secuenciación.
Construcción de scFv de VH-? ?
Los fragmentos de ADNc de VH y \ ? se mezclan de conformidad con la diversidad de las líneas germinales representadas por cada producto de PCR (Tablas 23 y 24).
TABLA 23
Relación de mezclado de los fragmentos de VH
TABLA 24
Relación de mezclado de los fragmentos de VX
Se utiliza un total de 10 \¿g de fragmentos de ADNc de VH (2 x 1013 moléculas) y 10 pg de fragmentos de ADNc de ?? (2 x 1013 moléculas) como la plantilla para PCR de traslape. La PCR se
efectúa con ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum y los iniciadores T7TMVTag2 (200 nM) y FLAGA20Rev (200 nM), en un volumen de 30 mi. Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 17 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos) y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 5 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Una alícuota del producto de PCR se clona utilizando el estuche para clonación TOPO TA (Invitrogen, cat #45-0641) y los clones individuales se analizan mediante secuenciación.
Resultados
Amplificación de fragmentos de \/?
Las alícuotas de fragmentos de ADN específicos de la familia \/? amplificados con los iniciadores universales (Library-GS-Fwd y FlagA20Rev), se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 21 ).
El análisis de secuenciación de los clones de \ ? individuales se presenta en la Tabla 25. Los datos confirman la especificidad del iniciador para cada una de las familias de línea germinal de ?/?, con un no apareamiento resaltado en negritas (VL1 LS3, Germine V1-3).
TABLA 25
Análisis de secuenciación de productos de PCR específicos de familia ? ?
Construcción de scFv de VH-V
Se efectúa PCR de traslape para construir fragmentos de ADNc de scFv de VH-??. Parte de los prod uctos obtenidos se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa (Figu ra 22) . El fragmento de scFv de VH-V generado tiene todos los elementos necesarios para que sea seleccionado utilizando la tecnolog ía de despliegue de ARNm PROfusion (Figura 23).
El análisis de determinación de secuencia de los clones scFv de VH-?? individuales confirma la recombinación VH-?? correcta con u n enlazador G4S intercalado funcional en u na gran mayoría .
EJ EM PLO 1 0
Construcción de genotecas de scFv PROfusion kappa y lam bda no afectadas por tratam iento provenientes de ARNm de nodo linfático de humano
Este ejemplo describe la generación de genotecas PROfusion de scFv no afectadas por tratamiento de h umano (P BMC kappa y PBMC lambda) a partir de ARNm de nodo linfático.
1 0.1 Transcripción I nversa
La primera cadena de ADNc se sintetiza a partir de 40 g de ARNm utilizando Transcriptasa Inversa SuperScrpt I I (I nvitrogen, cat. #1 8064-014) y una mezcla de 1 5 iniciadores (concentración total 1 00 n M) (Tabla 12) de conformidad con el protocolo del fabricante. La reacción se efectúa en 16 alícuotas de 0.1 mi cada una . Las reacciones de RT se combinan (volumen total 1 .6 mi) , se incuban con 20 µ? de ARNasaH durante 20 minutos a 37°C y después se dializan contra agua.
10. PCR
10.2.1 Amplificación de ADNc de la VH
Un tercio de la reacción de RT anterior se somete a amplificación limitada utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, cat. #11304-102) en reacciones que contienen una mezcla de los iniciadores sentido específicos de secuencia líder (LS) de VH (concentración total 200 nM) y una mezcla de iniciadores anti-sentido específicos de JH (concentración total 200 nM) (Tabla 13). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C, 10 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. El producto de PCR se purifica después utilizando el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN, cat. #28106) de conformidad con el protocolo del fabricante. Un experimento pequeño a escala piloto confirma una amplificación de por lo menos 10 veces del ADNc.
La mitad del producto de PCR purificado se divide en 7 alícuotas iguales, y cada alícuota se utiliza como una plantilla para amplificación de uno de los ADNc específicos de la familia de VH. La amplificación se efectúa mediante PCR con ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción que contiene el iniciador sentido específico de LS de VH individual (200 nM) y una mezcla de iniciadores anti-sentido específicos de JH (concentración total 200 nM) (Tabla 13). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (20 segundos); 55°C (20 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Los productos de PCR anteriores se purifican utilizando el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN) de conformidad con el protocolo del fabricante. Cada producto de PCR se amplifica posteriormente utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción de PCR que contiene el iniciador sentido anidado específico de VH correspondiente (200 nM) y una mezcla de iniciadores anti-sentido específicos de JH (concentración total 200 nM) (Tabla 26). Los iniciadores sentido en cada reacción portan una "marca" de 8 nucleótidos (subrayada), la cual se introduce para incrementar la especificidad de las amplificaciones de genoteca subsiguientes. Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Los productos de PCR se someten a electroforesis en gel de agarosa al 1%, y se purifican utilizando el estuche para extracción en gel QIAquick (QIAGEN), cat. #28704). Las alícuotas de estos productos de PCR se amplifican adicionalmente a gran escala en una reacción de PCR utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 200 nM de los iniciadores universales (T7TMVTag4s y Lib-GSv2-Rev). Estos iniciadores agregan un promotor T7 y una secuencia TMV-UTR al extremo 5' del producto de PCR, y el enlazador de glicina-serina (G4S) parcial al extremo 3' del producto de PCR. Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Los productos de PCR se purifican con el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN), se cuantifican mediante absorbancia en UV a 260 nm, y las alícuotas de estos productos se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% para confirmar la pureza. Las alícuotas de fragmentos de ADNc específicos de la familia de VH se clonan utilizando el estuche para clonación TOPO TA (Invitrogen, cat. #45-0641), y los clones individuales se analizan mediante secuenciación.
TABLA 26
Iniciadores Utilizados Para PCR Específica de VH Anidada
Nombre Secuencia de oligonucleótido
VH1Tag4 Forward TTTACAATTACAGCTTCTTCACCATGGAGGTGCAGCTGG
(SEQ ID NO: 121) TGCAGTCTGGRSCT
VH2Tag4 Forward TTTACAATTACAGCTTCTTCACCATGGAGRTCACCTTGAR
(SEQ ID NO: 122) GGAGTCTGGT
TABLA 26 (cont.)
Nombre Secuencia de oligonucleótido
VH3Tag4 Forward TTTACAATTACAGCTTCTTCACCATGGAGGTGCAGCTGK
(SEQ ID NO: 123) TGGAGTCTSGRGGA
VH4Tag4 Forward I I I ACAATTACAGCTTCTTCACCATGGAGGTGCAGCTGC
(SEQ ID NO: 124) AGSAGTSSGGC
VH5Tag4 Forward TTTACAATTACAGCTTCTTCACCATGGAGGTGCAGCTGG
(SEQ ID NO: 125) TGCAGTCTGGAGCA
VH6Tag4 Forward TTTACAATTACAGCTTCTTCACCATGGAGGTACAGCTGC
(SEQ ID NO: 126) AGCAGTCAG
VH7Tag4 Forward TTTACAATTACAGCTTCTTCACCATGGAGGTGCAGCTGG
(SEQ ID NO: 127) TGCAATCTGGGT
JH1/2 RevV2 (SEQ CAGACCCTCCACCGCCGCTGCCGCCTCCACCTGAGGAGA
ID NO: 128) CRGTGACCAGGGTGC
JH3 RevV2 (SEQ ID CAGACCCTCCACCGCCGCTGCCGCCTC'CACCTGAAGAGA
NO: 129) CGGTGACCATTGTCC
JH4/5 RevV2 (SEQ CAGACCCTCCACCGCCGCTGCCGCCTCCACCTGAGGAGA
ID NO: 130) CGGTGACCAGGGTTC
JH6 RevV2 (SEQ ID CAGACCCTCCACCGCCGCTGCCGCCTCCACCTGAGGAGA
NO: 131) CGGTGACCGTGGTCC
T7TMVTag4s TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTA I I IACAATT
(SEQ ID NO: 132) ACAGCTTCTTC
Lib-GSv2-Rev CAGACCCTCCACCGCCGCTG
(SEQ ID NO: 133)
10.2.2 Amplificación del ADNc de VK
Un tercio del ADNc generado a partir de la reacción de RT antes mencionada se somete a amplificación limitada utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción que contiene una mezcla de los iniciadores sentido específicos de secuencia líder (LS) de VK (concentración total 200 nM) y el iniciador anti-sentido específico de CK (200 nM) (Tabla 15). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 10 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Un experimento separado a escala pequeña confirma una amplificación de hasta 10 veces del ADNc mediante dicha PCR.
El producto de PCR se purifica con el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN) de conformidad con el protocolo del fabricante. La mitad del producto de PCR purificado se divide en 6 alícuotas iguales, y cada alícuota se utiliza como una plantilla para amplificación del ADNc específico de familia de VK individual. La amplificación se efectúa mediante PCR con ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción que contiene el iniciador de sentido específico de LS de VK individual (200 nM) y el iniciador antisentido específico de CK (200 nM) (Tabla 15). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Los productos de PCR se someten a electroforesis en gel de agarosa al 1% y se purifican con el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN) de conformidad con el protocolo del
fabricante. Cada producto de PCR se amplifica posteriormente utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen , Carlsbad, CA) en una reacción de PC R que contiene el iniciador sentido anidado específico de VK correspondiente (200 n M) y los in iciadores antisentido específicos de CK (200 n M) (Tabla 27) . Las cond iciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 mi nutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (20 segundos) , 55°C (20 segu ndos) , y 68°C (40 segundos) ; seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Las al ícuotas de estos productos de PCR se amplifican adicionalmente a g ran escala en una reacción de PC R q ue contiene ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platin um (Invitrogen , Carlsbad , CA) y los iniciadores universales a 200 nM (Lib-GSv2-Fwd y CKReverse) .
El iniciador Lib-GSv2-Fwd ag rega u n enlazador G4S parcial hacia el extremo 5' de VK. Las secuencias de los iniciadores universales que codifican para el enlazador G4S (Lib-GSv2-Fwd y Lib-GSv2-Rev) se modifican a partir de las de los iniciadores utilizados para la construcción de genotecas de PBMC de h umano (Library-GS-Forward y Library-GS-Reverse) . Esta mod ificación se efectúa para evitar el problema de in iciación cruzada del iniciador Library-GS-Reverse que se fija a la estructu ra base 1 de las líneas germinales de la familia de VH3, lo cual crea secuencias de VH tru ncadas.
TABLA 27
Iniciadores utilizados para PCR anidada específica de V
Nombre Secuencia de oligonucleótido
VK1FWOV2 (SEQ CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGACA
ID NO.134) TCCRGWTGACCCAGTCTCCWT
VK2FWCIV2 (SEQ CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGATA
IDNO:135) TTGTGATGACYCAGWCTCCAC
VK3FwdV2 (SEQ CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGAAA
IDNO:136) TTGTGWTGACRCAGTCTCCAGSCA
VK4/6FwdV2 (SEQ CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGACA
ID O:137) TCGTGMTGACYCAGTCTCCAGA
VK5FwdV2 (SEQ CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGAAA
ID NO: 138) CGACACTCACGCAGTCTCCAGCAT
Vi6FwdV2 (SEQ CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGATG
ID NO:139) TCGTGATGACACAGTCTCCAGCTT
CKReverse (SEQ GTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGAAGACAGATGGTGCAGC
IDNO:14) CACAGTTCG
Lib-GSv2-Fwd CAGCGGCGGTGGAGGGTCTG
(SEQIDNO:140)
Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos); y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Los productos de PCR se purifican con estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN), se cuantifican mediante absorbancia en UV a 260 nm, y las alícuotas de estos productos se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% para confirmar la pureza. Las alícuotas de los fragmentos de ADNc específicos de la familia V obtenidos se clonan utilizando el estuche para clonación TOPO TA (Invitrogen, cat. #45-0641), y los clones individuales se analizan mediante secuenciación.
10.2.3 Amplificación de ADNc de \/?
Un tercio del ADNc generado a partir de la reacción de RT antes mencionada se somete a amplificación limitada utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción que contiene una mezcla de iniciadores sentido específicos de secuencia líder (LS) de \ ? (concentración total 200 nM) y el iniciador antisentido específico de CX (200 nM) (Tabla 21). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 10 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Un experimento por separado a pequeña escala confirma una amplificación de hasta 10 veces del ADNc mediante dicha PCR.
El producto de PCR se purifica utilizando el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La mitad del producto de PCR purificado se divide en 16 alícuotas iguales y cada alícuota se utiliza como una plantilla para amplificación de ADNc específico de la familia de \ ? individual. La amplificación se efectúa mediante PCR con ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción que contiene el iniciador sentido específico de LS de \/? individual (200 nM) y el iniciador antisentido específico de C (200 nM) (Tabla 21). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 30 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Los productos de PCR se purifican con el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN) de conformidad con el protocolo del fabricante. Los siguientes fragmentos se combinan antes de amplificación subsiguiente: fragmentos VL-1 LS-1 y VL1 LS-3 se mezclan en una relación 3:2 en los fragmentos de la mezcla VL1 LS; los fragmentos VL-2 LS-3 y VL2 LS-4 se mezclan en una relación 3:2 en los fragmentos de la mezcla de VL3 LS; los fragmentos VL3 LS-2, VL3 LS-3, VL3 LS-4 y VL3 LS-5 se mezclan en una relación 1:6:1:1 en los fragmentos de la mezcla VL3 LS. El producto de PCR correspondiente a las familias individuales se amplifica posteriormente utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) en una reacción de PCR que contiene el iniciador sentido anidado específico de \/? correspondiente (200 nM) y los iniciadores antisentido específicos de C (200 nM) (Tabla 22). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos) y 68°C (40 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Los productos de PCR se someten a electroforesis en gel de agarosa al 1%, y se purifican utilizando el estuche para extracción en gel QIAquick (QIAGEN). Las alícuotas de estos productos de PCR se amplifican adicionalmente en una escala mayor en una reacción de PCR que contiene ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) y los iniciadores universales a 200 nM (Lib-GSv2-Fwd y CJLReverse). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 25 ciclos de 94°C (30 segundos), 55°C (30 segundos), y 68°C (30 segundos), seguido por un paso de 5 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C.
Los productos de la PCR se purifican con el estuche de purificación para PCR QIAquick (QIAGEN), se cuantifican mediante absorbancia en UV a 260 nm, y las alícuotas de estos productos se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% para confirmar la pureza. La especificidad de los iniciadores específicos de la familia de VL se confirmó previamente.
Construcción de scFv de VH-VK
Los fragmentos de ADNc de VH y VK se mezclan de conformidad con el número de líneas germinales en cada familia (tomando como base el NCBI) (Tablas 17 y 18).
Se utiliza un total de 10 pg de los fragmentos de ADNc de VH (2 x 1013 moléculas) y un total de 10 pg de fragmentos de ADNc de VK (2 x 10 moléculas) como plantilla para PCR de traslape. La PCR se efectúa con ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum y los iniciadores T7TMVUTR (200 nM) y CK5-FlagA20 Rev (200 nM), en un volumen de 30 mi, con los siguientes pasos: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 12 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 3 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. La alícuota del producto de PCR se clona utilizando el estuche para clonación TOPO TA (Invitrogen, cat. # 45-0641), y los clones individuales se analizan mediante secuenciación.
T7TMVUTR (SEQ ID NO: 1):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACA
Ck5-FlagA20 Rev (SEQ ID NO: 7):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA A ATAG C G G ATG CCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCGAAGACAGATGGTGCAGCCACA.
El iniciador Ck5-FlagA20 Rev agrega una cola poliA al extremo 3' del producto de PCR. Por lo tanto, la secuencia se utiliza para purificación con oligo-dT de las moléculas PROfusion.
10.2.5 Construcción de scFv de VH-V
Los fragmentos de ADNc de VH y \/? se mezclan de conformidad con la diversidad de las líneas germinales representadas por cada producto de PCR (Tablas 18 y 28). Se utiliza un total de 10 pg de fragmentos de ADNc de VH (2 x 1013 moléculas) y 10 pg de fragmentos de ADNc de \/? (2 x 1013 moléculas) como la plantilla para PCR de traslape. La PCR se efectúa utilizando ADN Polimerasa Taq de Alta Fidelidad Platinum y los iniciadores T7T VUTR (200 nM) y CL5 FlagA20 (200 nM), en un volumen de 30 mi. Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 10 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 68°C (60 segundos); seguido por un paso de 5 minutos de 68°C para extensión y almacenamiento a 4°C. La alícuota del producto de PCR se clona utilizando el estuche para clonación TOPO TA (Invitrogen, cat. # 45-0641), y los clones individuales se analizan mediante secuenciación.
TABLA 28
Relación de mezclado para los fragmentos de
CL5 FlagA20 (SEQ ID NO: 12):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA AATAG CG GATG C CTTGTC GTC GTC GTC CTTGTA GTCAGTGACAGTGGGGTTGGCCTTG
El iniciador CL5-FlagA20 agrega la cola de poliA al
extremo 3' del producto de PCR. Por lo tanto la secuencia se utiliza para purificación con oligo-dT de las moléculas PROfusion.
10.3 Tipificación por espectros
Se utilizan un iniciador sentido 5' marcado con colorante
(6-FA -PanVHFR3-Fwd, 5'-GACACGGCCGTGTATTACTGT-3\ SEQ ID NO: 17) y un iniciador anti-sentido (PanJH- Rev, 5'-GCTGAGGAGACGGTGACC-5', SEQ ID NO: 18) que se fijan respectivamente a la región de la estructura base 3 de la VH y a la región J para amplificar a lo largo de las regiones de CDR3 de los dominios de la VH mediante PCR. Se utilizan cincuenta ng de plantilla de ADN de la genoteca de scFv en un volumen de reacción de 30 µ? que contiene iniciador 6-FAM-PanVHFR3-Fwd 200 nM, iniciador PanJH-Rev 200 nM, dNTP 200 µ?, solución amortiguadora 1 x GoTaq, y 1.5 U de GoTaq (Promega, Madison, Wl). Las condiciones de PCR son las siguientes: una desnaturalización inicial de 2 minutos de 94°C; 30 ciclos de 94°C (20 segundos), 55°C (20 segundos), y 72°C (30 segundos); seguido por un paso de 5 minutos de 72°C para extensión y almacenamiento a 4°C. Después de la PCR, se cargan 10 µ? de los productos en un gel de agarosa al 2% para confirmar reacciones satisfactorias y los productos remanentes se someten a electroforesis para tipificación por espectros utilizando un aparato para secuenciación ABI. Las longitudes de la CDR3 se calculan restando las secuencias de estructura base de flanqueo de 60 pb de las longitudes de producto que se determinan utilizando marcadores de ADN marcados con el colorante ROX.
Resultados
Generalidades de la construcción de la genoteca de scFv PROfusion
En la fig ura 24 se presenta el diagrama de flujo q ue representa los diferentes pasos en la construcción de las genotecas PROfusion .
Amplificación de los fragmentos de ADNc de VH
Las al ícuotas de los fragmentos de ADNc específicos de la familia de VH (~500 pb) amplificados con los iniciadores universales para VH (T7TMVUTR y Lib-GSv2-Rev) se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 25) . La especificidad de los iniciadores específicos de la familia de VH se analizó previamente y se confirma de nuevo para los iniciadores que amplifican familias con n úmero grande de líneas germinales (Tabla 29) .
Amplificación de fragmentos de VK
Las alícuotas de los fragmentos de ADNc específicos de la familia de VK, amplificados con los iniciadores u niversales (Lib-GSv2-Fwd : y CK Reverse) , se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 26). La especificidad de los iniciadores específicos de la familia de VK se analizó anteriormente y se
confirma de nuevo para los iniciadores que amplifican familias con número g rande de l íneas germi nales (Tabla 30) .
TABLA 29
Análisis de secuenciación de productos de PCR específicos de la
famil ia de VH
# de Par de # de Par de
Fragmento línea Familia Fragmento línea Familia clones clones
germinal germinal
VH1/7 8 VH-1-69 VH1 VH3 11 VH3- VH3
30?/?3- 33
3 VH1-8 VH7 1 1 VH3-23 VH3
2 VH1-18 VH1 7 VH3-7 VH3
2 VH1-2 VH1 5 VH3-21 VH3
1 VH1 -24 VH1 4 VH3-15 VH3
VH2 11 VH2-5 VH2 2 VH3-9 VH3
4 VH2-26 VH2 2 VH3-48 VH3
VH4 5 VH4-59 VH4 1 VH3-43 VH3
4 VH4 1 VH3-53 VH3
VH4- 55P
4 VH4-39 VH4
3 VH4-31 VH4
TABLA 30
Análisis de secuenciación de productos de PCR específicos de la
familia de VK
Amplificación de fragmentos de \/?
Las alícuotas de los fragmentos de ADNc específicos de la familia de \ ?, amplificados con los iniciadores universales (Lib-GSv2-Fwd, SEQ ID NO: 140, y CJL Reverse, SEQ ID NO: 15), se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 27). La especificidad de los iniciadores específicos de la familia de \/? se analizó anteriormente.
Construcción de scFv de VH-VK V VH-V
Se efectúan PCRs de traslape para construir los fragmentos de ADNc de scFv de VH-VK y VH-V . Parte de los productos obtenidos se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 27). Los fragmentos de scFv de VH-VK y VH-?? tienen todos los elementos necesarios para que se seleccionen mediante la tecnología de despliegue de ARNm PROfusion (Figura 28).
El análisis de secuenciación de los clones de scFv de VH-VK y VH-?? confirmar la recombinación correcta de VH-VK y VH-?? con un enlazador G4S intercalado funcional en una gran mayoría de los clones. La distribución de las diversas familias de VH y VK y Vi en la genoteca de scFv construida es consistente con los reportes previos en la literatura (Figura 29, Figura 30, véase también Tsuiji et al. (2006). Exp. Med.; V.203 (2), pp. 393-400 y Arons et al. (2006) British Journal of Haematology V.133, pp. 504-512).
Tipificación por espectros
El análisis de tipificación por espectros de la distribución de tamaño de CDR3 de VH se efectúa en el ADNc obtenido a partir de ARN de nodo linfático mediante transcripción inversa con la mezcla de iniciadores anti-sentido (véase 10.1), en la mezcla de fragmentos de ADN de VH justo antes de su ensamblado como genotecas de scFv, y en los fragmentos de scFv finales de VH-VK y VH-V (Figura 31). Como sería de esperar en una genoteca de ADNc
con u n alto grado de diversidad , los tamaños de CDR3 observados tienen una distribución normal y la mayoría caen entre 6 a 22 residuos y se centran entre 1 1 a 14 residuos.
Conclusión
La selección de líderes de anticuerpo de alta calidad de humano es un prerrequ isito para el desarrollo de fármaco tipo anticuerpo terapéutico satisfactorio. Además de u na tecnolog ía de selección robusta, la calidad de la genoteca de anticuerpo (fuente, diversidad, y construcción) determinada en g ran medida su utilidad para producir líderes adecuados. En esta invención , las moléculas de ARN m provenientes de donadores múltiples se utilizan para incrementar la diversidad de la genoteca y se diseñan iniciadores de PCR altamente específicos para cubrir todas las secuencias de línea germinal de anticuerpo de modo tal que se pueda captu rar toda la diversidad dentro de la colección de donadores. Las genotecas de scFv de VH -VK y VH-?? se construyen por separado para incrementar las probabilidades de seleccionar l íderes de anticuerpos múltiples a partir de la misma fuente de ARN . La g ran diversidad de ambas genotecas se confirma mediante tipificación por espectros y mediante secuenciación de clones múltiples. Ambas genotecas se utilizan para selección de despliegue de ARN m PROfusion contra objetivos diferentes.
EJEMPLO 11
iniciadores para secuenciación para construcciones PROfusion
Este ejemplo provee los iniciadores para secuenciación utilizados para construcciones PROfusion.
Iniciador sentido para todas las genotecas de scFv y VH:
T7TMVUTR (SEQ ID NO: 1):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACA
Iniciador sentido para todas las genotecas de VK y \/?:
VL-T7TMVTag3GS-Fwd (SEQ IN NO: 2):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAGGCTTTGGAC CATGGGGTCTGGCGGCGGAGGTAGCG
Iniciadores anti-sentido para todas las genotecas de scFv y VK: CK1FLAGA20 (SEQ ID NO: 3):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCGAAGACAGAT CK2FLAGA20 (SEQ ID NO: 4):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA
GTCGAAGACAGATGGT
CK3FLAGA20 (SEQ ID NO: 5):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCGAAGACAGATGGTGCA
CK4FLAGA20 (SEQ ID NO: 6):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT A AAT AG C G G ATG C CTTG TC G TC G TC G TC C TTG TA GTCGAAGACAGATGGTGCAGCC
C 5FLAGA20 (SEQ ID NO: 7):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCGAAGACAGATGGTGCAGCC ACA
Iniciadores anti-sentido para todas las genotecas de scFv ? y \ ?: CL1 FLAGA20 (SEQ ID NO: 8):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCAGTGACAGTG CL2FLAGA20 (SEQ ID NO: 9):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCAGTGACAGTG GGG CL3FLAGA20 (SEQ ID NO: 10):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCAGTGACAGTG GGGTTG CL4FLAGA20 (SEQ ID NO: 11):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCAGTGACAGTGGGGTTGGCC CL5FLAGA20 (SEQ ID NO: 12):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCAGTGACAGTGGGGTTGGCCTTG
Lib-GS-Rev (SEQ ID NO: 16): CGCTACCTCCGCCGCCAGAC
Iniciador anti-sentido para todas las genotecas de VH:
VH-GSFLAGA20-Rev (SEQ ID NO: 13):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCTTTGTCATCATCATCTTTATA ATCGCTACCTCCGCCGCCAGAC
Iniciadores para la síntesis del ADNc de la primera cadena en transcripción inversa:
Fcg:
FcyRevI (SEQ ID NO: 43): AGTTCCACGACACC
FcYRev2 (SEQ ID NO: 44): GAAGGTGTGCACG
FcyRev3 (SEQ ID NO: 45): CCACGCTGCTGAG
Fcm:
FcpRevI (SEQ ID NO: 46): ACTTTGCACACCAC
FcpRev2 (SEQ ID NO: 47): TTTGTTGCCGTTGG
FcpRev3 (SEQ ID NO: 48): GGGAATTCTCACAGG
Fed:
Fc5Rev1 (SEQ ID NO: 49): GCTGCTTGTCATGT
Fc5Rev2 (SEQ ID NO: 50): TGCCTTTGGAGACT
Fc5Rev3 (SEQ ID NO: 51): GACCACGCATTTGT
Iniciadores para CK-RT:
CKRev (SEQ ID NO: 52): TCCACCTTCCACTG
CKRev2 (SEQ ID NO: 53): CAGGCACACAACAG
CKRev3 (SEQ ID NO: 54): GAGTGTCACAGAGC
Iniciadores para CLRT
C Revl (SEQ ID NO: 55) GGGAACAGAGTGAC
C Revl (SEQ ID NO: 56): GTGTGGCCTTGTTG
C^Rev3. (SEQ ID NO: 57): CCATCTGCCTTCCA
Iniciadores utilizados para amplificación de fragmentos de VH: VH1/7LS (SEQ ID NO: 58): ATCCTCTTYTTGGTGGSAGC
VH1-46LS (SEQ ID NO: 59): GGTCTTCTGCTTGCTGGCTG
VH2LS (SEQ ID NO: 60): CCTGCTGCTGACCAYCCCTTC
VH3LS (SEQ ID NO: 61): GCTATTTTWVRAGGTGTCCARTGT VH4LS (SEQ ID NO: 62): GCRGCTCCCAGATGGGTCCTG
VH5LS (SEQ ID NO: 63): ATGGGGTCAACCGCCATCCT
VH6LS (SEQ ID NO: 64): TGGGCCTCCCATGGGGTGTC
Iniciadores utilizados para PCR anidada específica de VH:
Iniciadores Tag2 de VH:
VHIForward (SEQ ID NO: 69):
tttacaattacaqtqttqcgaccatqgAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGRSCT VH2Forward (SEQ ID NO: 70):
tttacaattacaqtgttgcgaccatqgAGRTCACCTTGARGGAGTCTGGT VH3Forward (SEQ ID NO: 71):
tttacaattacagtgttgcgaccatgGAGGTGCAGCTG TGGAGTCTSGRGGA VH4Forward (SEQ ID NO: 72):
tttacaattacagtqttqcqaccatqqAGGTGCAGCTGCAGSAGTSSGGC VH5Forward (SEQ ID NO: 73):
tttacaattacaqtqttgcgaccatqGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCA VH6Forward (SEQ ID NO: 74):
tttacaattacaqtqttqcqaccatqqAGGTACAGCTGCAGCAGTCAG
VH7Forward (SEQ ID NO: 75):
tttacaattacaqtqttqcqaccatqqAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGT
Iniciadores utilizados para amplificación de fragmentos de VK:
T7TMVTag2 (SEQ ID NO: 80):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAGTGTTGCGAC VKI LS (SEQ ID NO: 81): GCTCCTGGGRCTYCTGC
VK2LS (SEQ ID NO: 82): CTYCTGGGGCTGCTAATG
VK3LS (SEQ ID NO: 83): CTCTGGCTCMCAGATACCAC
VK4LS (SEQ ID NO: 84): GGATCTCTGGTGCCTACGG
V 5LS (SEQ ID NO: 85): GGATCTCTGATACCAGGGCA
VK6LS (SEQ ID NO: 86): CTGGGTTCCAGCCTCCAG
Iniciadores de traslape de Gly-Ser de la genoteca:
Lib-GS-Fwd (SEQ ID NO: 94): GTCTGGCGGCGGAGGTAGCG
FLAG-A20.Rev (SEQ ID NO: 95):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGT CGTCCTTGTAGTC
Iniciadores utilizados para amplificación de fragmentos de \/?:
VL1LS-1 (SEQ ID NO: 96): TCACTGTGCAGGGTCCTG
VL1LS-3 (SEQ ID NO: 97): TCACTGCACAGGGTCCTG
VL2LS-3 (SEQ ID NO: 98): TCAGGRCACAGGGTCCTG
VL2LS-4 (SEQ ID NO: 99): TCAGGGCACAGGATCCTG
VL3LS-2 (SEQ ID NO: 100): TGCATAGGTTCTGTGGTTTCTTCTG VL3LS-3 (SEQ ID NO: 101): ACAGGHTCTGWGGCCTCCTATG VL3LS-4 (SEQ ID NO: 102): TGCACAGGCTCTGTGACCTCCTATG VL3LS-5 (SEQ ID NO: 103): TACACAGGCTCTATTGCCTCCTATG VL4CIS-2 (SEQ ID NO: 104): CTTCATTTTCTCCACAGGTCTCTGTG VL4abLS-2 (SEQ ID NO: 105): TCCACTGSACAGGGTCTCTCT VL5LS (SEQ ID NO: 106): CACTGCACAGGTTCCCTC
VL6LS (SEQ ID NO: 107): CTGCACAGGTTCTTGGGC
VL7LS (SEQ ID NO: 108): CTCACTTGCTGCCCAGGG
VL8LS (SEQ ID NO: 109): GCTTATGGATCAGGAGTGGATTC VL9LS (SEQ ID NO: 110): CACCCTCCTCAGTCTCCTC
VL10LS (SEQ ID NO: 111): CTCTGCAGTGTCAGTGGTC
Iniciadores utilizados para PCR anidada específica de VH:
Iniciadores Tag4 de VH:
VH Forward (SEQ ID NO: 121):
tttacaattacagcttcttcaccatggAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGRSCT VH2Forward (SEQ ID NO: 122):
tttacaattacaqcttcttcaccatggAGRTCACCTTGARGGAGTCTGGT VH3Forward (SEQ ID NO: 123):
ttacaattacagcttcttcaccatqGAGGTGCAGCTGKTGGAGTCTSGRGGA VH4Forward (SEQ ID NO: 124):
tttacaattacaqcttcttcaccatggAGGTGCAGCTGCAGSAGTSSGGC
VH5Forward (SEQ ID NO: 125):
tttacaattacaqcttcttcaccatqGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCA VH6Forward (SEQ ID NO: 126):
tttacaattacaqcttcttcaccatggAGGTACAGCTGCAGCAGTCAG
VH7Forward (SEQ ID NO: 127):
tttacaattacaqcttcttcaccatggAGGTGCAGCTGGTGC AATCTGGGT JHReverse1/2 (SEQ ID NO: 128):
CGCTACCTCCGCCGCCAGACCCGCCTCCACCTGAGGAGACRGT GACCAGGGTGC JHReverse3 (SEQ ID NO: 129):
CGCTACCTCCGCCGCCAGACCCGCCTCCACCTGAAGAGACGGTG ACCATTGTCC
JHReverse4/5 (SEQ ID NO: 130):
CGCTACCTCCGCCGCCAGACCCGCCTCCACCTGAGGAGACGGT GACCAGGGTTC
JHReverse6 (SEQ ID NO: 131):
CGCTACCTCCGCCGCCAGACCCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTG ACCGTGGTCC
Iniciadores utilizados para amplificación de fragmentos de ??:
Iniciadores V2 de VK:
VKlFwdV2 (SEQ ID NO: 134):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGACATCCRGWTGACCC AGTCTCCWT
V 2FwdV2 (incluyendo L10 de VK3) (SEQ ID NO: 135):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGATATTGTGATGACYC AGWCTCCAC
VK3FwdV2 (excepto L10) (SEQ ID NO: 136):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGAAATTGTGWTGACRC AGTCTCCAGSCA
VK4/6FwdV2 (SEQ ID NO: 137):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGACATCGTGMTGACYC AGTCTCCAGA
VK5FwdV2 (SEQ ID NO: 138):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGAAACGACACTCACGC AGTCTCCAGCAT VK6FwdV2 (SEQ ID NO: 139):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTGATGTCGTGATGACAC AGTCTCCAGCTT
T7-TMV-Seq (9970) (SEQ ID NO: 148): CTC ACT ATA GGG ACA ATT AC T7TMVTag3 (SEQ ID NO: 149):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAGGCTTTGGAC
T7TMVTag4 (SEQ ID NO: 150):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAGCTTCTTCAC
T7TMVTag2s (SEQ ID NO: 151):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAG TGTTGCG
T7TMVTag3s (SEQ ID NO: 152):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAGGCTTTGG
T7TMVTag4s (SEQ ID NO: 132):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAGCTTCTTC
T7TMVTag4L (SEQ ID NO: 153):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACA GCTTCTTCACCATGG TMVTag4L (SEQ ID NO: 154):
ACAATTACTATTTACAATTACAGCTTCTTCACCATGG TMVTag4 (SEQ ID NO: 155):
ACAATTACTATTTACAATTACAGCTTCTTCAC TMVTag4s (SEQ ID NO: 156):
ACAATTACTATTTACAATTACAGCTTCTTC
phylflag3's (sin poli A) (SEQ ID NO: 157):
CCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTC
VH-FLAGA20-Rev (FLAG se vuelve a codificar para reducir al mínimo el cebado de X con la secuencia FLAG de VL) (SEQ ID NO: 158):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCTTTGTCATCATCATCTTTATA ATC
Iniciadores para preparar la genoteca de dominio de VH con el espaciador ?µ:
JH1/2Cm-Rev (SEQ ID NO: 159):
GGTTGGGGCGGATGCACTCCCCTGAGGAGACRGTGACCAGGGTGC JH4/5Cm-Rev (SEQ ID NO: 160):
GGTTGGGGCGGATGCACTCCCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC JH6Cm-Rev (SEQ ID NO: 161):
GGTTGGGGCGGATGCACTCCCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG TCC
JH3Cm-Rev (SEQ ID NO: 162):
GGTTGGGGCGGATGCACTCCCCTGAAGAGACGGTGACCATTG TCC JH1/2sRev (SEQ ID NO: 65):
CTGAGGAGACRGTGACCAGGGTGC JH4/5sRev (SEQ ID NO: 66):
CTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC JH6sRev (SEQ ID NO: 67):
CTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC JH3sRev (SEQ ID NO:68):
CTGAAGAGACGGTGACCATTGTCC
Iniciadores para V :
VK1 Forward (SEQ ID NO: 88):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGACATCCRGWTGACCCA GTCTCCWT
VK2 Forward (incluyendo L10 de VK3) (SEQ ID NO: 89):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGATATTGTGATGACYCA
GWCTCCAC
VK3 Forward (excepto L10) (SEQ ID NO: 90):
CTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGAAATTGTGWTGACRCAGT CTCCAGSCA
VK4/6 Forward (SEQ ID NO: 91):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGACATCGTGMTGACYCA GTCTCCAGA VK5 For-NEW (SEQ ID NO:92):
CTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGAAACGACACTCACGCAGT CTCCAGCAT
VK6 For-NEW (SEQ ID NO: 93):
CTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGATGTCGTGATGACACAGT CTCCAGCTT
V 5 Forward (SEQ ID NO: 168):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGAAACGACACTCACGCA GTCTC
V 6 Forward (SEQ ID NO: 169):
CTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGGATGTCGTGATGACACAGT CTCCAGCT
CK Reverse (SEQ ID NO: 14):
GTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCG CK5 FLAGA20 (SEQ ID NO: 7):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCGAAGACAGATGGTGCAGCCACA
Iniciador CK-S Reverse: (SEQ ID NO: 87):
GAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCG
Iniciador Ci-Long-Reverse (SEQ ID NO: 170): iniciador anti-sentido
CK largo para añadir 7 aminoácidos antes de FLAG:
atcatcatcatccttataatcCTCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGC
CACAGTTCG
Iniciadores hCk de FLAG:
Ci L4-FlagA20-Rev (SEQ ID NO: 171):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA
GTCCTCATCAGATGGCGGGAAGAT
CKL3-FlagA20-Rev (SEQ ID NO: 172):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT A A ATAG C G G ATG CCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCCTCATCAGATGGCGGGAA
CKl_2-FlagA20-Rev (SEQ ID NO: 173):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCCTCATCAGATGGCGG C L1-FlagA20-Rev (SEQ ID NO: 174):
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTA GTCCTCATCAGATGG
Iniciadores de VL:
VL1/10 Forward (SEQ ID NO: 175):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGKGCTGACKCA GCCRC
VL2 Forward (SEQ ID NO: 114):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGCCCTGACTCA GCCT VL3 Forward-New (SEQ ID NO: 115):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGTCCTATGAGCTGACDCA G
VL4ab Forward (SEQ ID NO: 116):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGCAGCYTGTGCTGACTCA ATC
VL4c Forward (SEQ ID NO: 117):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGCTGCCTGTGCTGACTCA GCCCCCG
VL5/9 Forward (SEQ ID NO: 118):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGCAGCCTGTGCTGACTCA GCCRBCT
VL6 Forward (SEQ ID NO: 119):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGAATTTTATGCTGACTCA GCCC VL7/8 Forward (SEQ ID NO: 120):
GTCTGGCGGCGGAGGTAGCGGCGGTGGCGGATCGCAGRCTGTGGTGACYCA GGAG
CJL Reverse (SEQ ID NO: 15):
GTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCAGTGACAGTGGGGTTGGCCTTGGGCTGACCK AGGACGGT
CJL-sReverse (SEQ ID NO: 112):
GCCTTGGGCTGACCKAGGACGGT
Iniciadores de VH Tag3:
VH1FwdTag3 (SEQ ID NO: 176):
tttacaattacaGGCTTTGGaccatggAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGRSCT
VH2FwdTag3 (SEQ ID NO: 177):
tttacaattacaGGCTTTGGaccatggAGRTCACCTTGARGGAGTCTGGT
VH3FwdTag3(SEQ ID NO: 178):
tttacaattacaGGCTTTGGaccatgGAGGTGCAGCTGKTGGAGTCTSGR GGA
VH4FwdTag3 (SEQ ID NO: 179):
tttacaattacaGGCTTTGGaccatggAGGTGCAGCTGCAGSAGTSSGGC
VH5FwdTag3 (SEQ ID NO: 180):
tttacaattacaGGCTTTGGaccatgGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGA GCA
VH6FwdTag3 (SEQ ID NO: 181):
tttacaattacaGGCTTTGGaccatggAGGTACAGCTGCAGCAGTCAG
VH7FwdTag3 (SEQ ID NO: 182):
tttacaattacaGGCTTTGGaccatggAGGTGCAGCTGGTGCAATCT GGGT
Iniciadores de VL:
VL1/10FwdV2 (SEQ ID NO: 183):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTCAGTCTGKGCTGACKC AGCCRC
VL2FwdV2 (SEQ ID NO: 184):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTCAGTCTGCCCTGACTCA GCCT
VL3FwdV2 (SEQ ID NO: 185)
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTTCCTATGAGCTGACDCA
G
VL4abFwdV2 (SEQ ID NO: 186):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTCAGCYTGTGCTGACTCA ATC
VL4cFwdV2 (SEQ ID NO: 187):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTCTGCCTGTGCTGACTCA GCCCCCG
VL5/9FwdV2 (SEQ ID NO: 188):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTCAGCCTGTGCTGACTCA GCCRBCT
VL6FwdV2 (SEQ ID NO: 189):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTAATTTTATGCTGACTCA G CCC
VL7/8FwdV2 (SEQ ID NO: 190):
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTGGCGGTGGCGGAAGTCAGRCTGTGGTGACYC AGGAG
Lib-GSv2-Fwd (SEQ ID NO: 140)
CAGCGGCGGTGGAGGGTCTG
Lib-GSv2-Rev (SEQ ID NO: 133):
CAGACCCTCCACCGCCGCTG JH1/2RevV2 (SEQ ID NO: 128):
caqaccctccaccqccqctqccqcctccacCTGAGGAGACRGTGACCAGGGTGC JH4/5RevV2 (SEQ ID NO: 130):
caqaccctccaccqccqctqcc cctccacCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC JH6RevV2 (SEQ ID NO: 131):
caqaccctccaccqcc ctqccqcctccacCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC JH3RevV2 (SEQ ID NO: 129):
caqaccctccaccqccqctqccqcctccacCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCC
Enlazador de GlySer v2 de la genoteca:
Library GS Fwd: C AGC GGC GGT GGA GGG TCT G— >
TCC TCA GGT GGA GGC GGC AGC GGC GGT GGA GGG TCT GGC GGT GGC GGA AGT
AGGAGTCCA CCT CCG CCG TCG CCG CCA CCT CCC AGA CCG CCA CCG CCT TCA
Library GD Rev: <— G TCG CCG CCA CCT CCC AGA C
S S G G G G S G G G G S G G G G S
Traslape durante la PCR
VH3 FR1 : CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG CCT GGG GCG TTC TCC TCA GGT GGA GGC GGC AGC GGC GGT GGA GGG TCT G
G TCG CCG CCA CCT CCC AGA CCG CCA CCG
CCT TCA
(para Vk3, Vk6) <— -CG CCG CCA CCT CCC AGA CCG CCA CCG CCT TCA
Iniciadores con marca New para las genotecas de amígdala de humano
Iniciadores Tag5 para VH:
VH1FwdTag5 (SEQ ID NO: 191):
tttacaattacaGTGTCTGTaccatggAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGR SCT
VH2FwdTag5 (SEQ ID NO: 192):
tttacaattacaGTGTCTGTaccatggAGRTCACCTTGARGGAGTC TGGT VH3FwdTag5 (SEQ ID NO: 193):
tttacaattacaGTGTCTGTaccatgGAGGTGCAGCTGKTGGAGTCTSGR GGA VH4FwdTag5 (SEQ ID NO: 194):
tttacaattacaGTGTCTGTaccatggAGGTGCAGCTGCAGSAGTSSGGC VH5FwdTag5 (SEQ ID NO: 195):
tttacaattacaGTGTCTGTaccatgGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGA GCA VH6FwdTag5 (SEQ ID NO: 196):
tttacaattacaGTGTCTGTaccatggAGGTACAGCTGCAGCAGTCAG
VH7FwdTag5 (SEQ ID NO: 197):
tttacaattacaGTGTCTGTaccatggAGGTGCAGCTGGTGC AATCTGGGT Iniciadores con marca New para genotecas de médula ósea de humano
Iniciadores Tag6 de VH:
VH1FwdTag6 (SEQ ID NO: 198):
tttacaattacaGTTTGGCTaccatggAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGRS CT VH2FwdTag6 (SEQ ID NO: 199):
tttacaattacaGTTTGGCTaccatggAGRTCACCTTGARGGAGTCTGGT
VH3FwdTag6 (SEQ ID NO: 200):
tttacaattacaGTTTGGCTCaccatgGAGGTGCAGCTGKTGGAGTCTSG RGGA VH4FwdTag6 (SEQ ID NO: 201):
tttacaattacaGTTTGGCTaccatggAGGTGCAGCTGCAGSAGTSSGGC VH5FwdTag6 (SEQ ID NO: 202):
tttacaattacaGTTTGGCTaccatgGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGA GCA VH6FwdTag6 (SEQ ID NO: 203):
tttacaattacaGTTTGGCTaccatggAGGTACAGCTGCAGCAGTCAG
VH7FwdTag6 (SEQ ID NO: 204):
tttacaattacaGTTTGGCTaccatggAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGG GT
Reamplificación de los iniciadores sentido Tag5
TMVTag5s (SEQ ID NO: 205):
ACAATTACTATTTACAATTACAGTGTCTGT TMVTag6s (SEQ ID NO: 206):
ACAATTACTATTTACAATTACAGTTTGGCT TMVTag5 (SEQ ID NO: 207):
ACAATTACTATTTACAATTACAGTGTCTGTacc
TMVTagó (SEQ ID NO: 208):
ACAATTACTATTTACAATTACAGTTTGGCTacc
T7TMVTag5s (SEQ ID NO: 209):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTT ACA AT TA CAGTGTCTGT
T7TMVTag6s (SEQ ID NO: 210):
TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAGTTTGGCT
Incorporación para referencia
Los contenidos de todas las referencias citadas
(incluyendo referencias de la literatura, patentes, solicitudes de patente, y sitios en la red) que pudieran ser citados a través de toda esta solicitud quedan expresamente incorporados en la presente para referencia en su totalidad, al igual que las referencias citadas en las mismas. La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique otra manera, técnicas convencionales de inmunología, biología molecular y biología celular, las cuales son bien conocidas en la técnica.
Equivalentes
La invención se puede modalizar en otras formas específicas sin alejarse del alcance o características esenciales de la misma. Las modalidades anteriores por lo tanto, deben ser consideradas en todos los aspectos como ilustrativas más que limitativas de la invención descrita en la presente solicitud. Por lo tanto, el alcance de la invención queda indicado por las reivindicaciones anexas más que por la descripción anterior, y se pretende que todos los cambios que vengan dentro del significado e intervalo de equivalencia de las reivindicaciones, por lo tanto, q uedan abarcados en la presente solicitud .
Claims (25)
1. - Un oligonucleótido que consiste de una secuencia de ácido nucleico como la indicada en cualquiera de SEQ ID NOs: 1-14, 19-42, y 58-210.
2. - Un oligonucleótido que consiste de una secuencia de ácido nucleico como la indicada en cualquiera de SEQ ID NOs: 14-16, y 43-57.
3. - Un oligonucleótido que consiste de una secuencia de ácido nucleico como la indicada en SEQ ID NOs: 17 o 18.
4. - El uso de cualquiera de las secuencias en las reivindicaciones precedentes para amplificación de genoteca, transcripción inversa de genoteca, y/o tipificación por espectros de la genoteca.
5.- una genoteca de ácido nucleico para expresión de anticuerpos de cadena individual (scFv), dicha genoteca comprende un repertorio de secuencias que codifican para los dominios variables de la cadena pesada y los dominios variables de la cadena ligera, en donde cada miembro de dicha genoteca contiene un marco de lectura abierto que comprende un dominio variable de la cadena pesada, un dominio variable de la cadena ligera, y una reglón enlazadora, y en donde dicha genoteca se genera utilizando uno o más oligonucleótidos de conformidad con la reivindicación 1.
6.- La genoteca de conformidad con la reivindicación 5, en donde la región enlazadora codifica para menos de 20 aminoácidos.
7.- La genoteca de conformidad con la reivindicación 5, en donde la región enlazadora codifica para menos de 15 aminoácidos.
8.- La genoteca de conformidad con la reivindicación 5, en donde cada miembro de dicha genoteca también comprende un promotor ligado en forma operable al marco de lectura abierto.
9. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 8, en donde dicho promotor es un promotor que se selecciona a partir del grupo que consiste de T7, SP6, y T3.
10. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicho promotor es un promotor T7.
11. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 5, en donde cada miembro de dicha genoteca también comprende una región 5' no traducida (5'UTR) que pueda incrementar la transcripción de un gen al cual ésta está ligada en forma operable.
12. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 11, en donde dicha 5'UTR es una 5'UTR del Virus del Mosaico del Tabaco o fragmento activo de la misma.
13.- La genoteca de conformidad con la reivindicación 5, en donde cada miembro de dicha genoteca también comprende una secuencia de poliadenina.
14.- La genoteca de conformidad con la reivindicación 5, en donde cada miembro de dicha genoteca también comprende un código de barras de ácido nucleico.
15. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 14, en donde dicho código de barras de ácido nucleico comprende 8 nucleótidos.
16. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 5, en donde cada miembro de dicha genoteca también comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una marca de epítope.
17. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 16, en donde la marca de epítope es una marca FLAG.
18. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 16, en donde dicha secuencia de ácido nucleico es parte de la región enlazadora del scFv.
19. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 5, en donde cada miembro de dicha genoteca también comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región constante de anticuerpo o fragmento del mismo.
20. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 5, en donde cada miembro de dicha genoteca también comprende una secuencia de pausa de ribosoma.
21. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 5, en donde cada miembro de dicha genoteca también comprende un aceptor de péptido.
22. - La genoteca de conformidad con la reivindicación 21, en donde el aceptor de péptido está ligado covalentemente a través de un enlazador que comprende una molécula de Psoraleno C6.
23.- La genoteca de conformidad con la reivindicación 22, en donde el enlazador es 5'(Psoraleno C6)2'Ome (U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (Puromicina), en el cual X es un enlazador de trietilenglicol o PEG-150 y CC es una estructura base de ADN.
24. - Un método para producir una genoteca de ácido nucleico para expresión de anticuerpos de cadena individual (scFv) que comprende: proveer una composición de ácido nucleico, en donde por lo menos una porción de los ácidos nucleicos en dicha composición comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para un dominio variable de anticuerpo; y, amplificar una pluralidad de dominios variables de anticuerpo utilizando uno o más oligonucleotidos de conformidad con la reivindicación 1.
25. - Un método para tipificación por espectros de un ácido nucleico que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para un dominio variable de anticuerpo que comprende: proveer una composición de ácido nucleico, en donde por lo menos una porción de los ácidos nucleicos en dicha composición comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para un dominio variable de anticuerpo; y, amplificar las regiones CDR3 de dichos dominios variables utilizando uno o más oligonucleotidos de conformidad con la reivindicación 2.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10148308P | 2008-09-30 | 2008-09-30 | |
| PCT/US2009/059059 WO2010039852A2 (en) | 2008-09-30 | 2009-09-30 | Improved antibody libraries |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MX2011003380A true MX2011003380A (es) | 2011-04-21 |
Family
ID=42074188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MX2011003380A MX2011003380A (es) | 2008-09-30 | 2009-09-30 | Genotecas de anticuerpo mejoradas. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8404445B2 (es) |
| EP (1) | EP2340256A4 (es) |
| JP (1) | JP2012504416A (es) |
| KR (1) | KR20110061629A (es) |
| CN (1) | CN102227440A (es) |
| AU (1) | AU2009298501A1 (es) |
| CA (1) | CA2736430A1 (es) |
| IL (1) | IL211552A0 (es) |
| MX (1) | MX2011003380A (es) |
| NZ (1) | NZ591543A (es) |
| RU (1) | RU2011117213A (es) |
| TW (1) | TW201028432A (es) |
| WO (1) | WO2010039852A2 (es) |
| ZA (1) | ZA201102119B (es) |
Families Citing this family (70)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1355666B1 (en) | 2000-12-22 | 2012-06-13 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Use of repulsive guidance molecule (RGM) and its modulators |
| CN101277974A (zh) * | 2005-09-30 | 2008-10-01 | 阿伯特有限及两合公司 | 排斥性引导分子(rgm)蛋白质家族的蛋白质的结合结构域及其功能性片段和它们的用途 |
| EP2033971A1 (de) * | 2007-09-06 | 2009-03-11 | Abbott GmbH & Co. KG | Bone Morphogenetic Protein (BMP)-bindende Domänen von Proteinen der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Proteinfamilie und funktionale Fragmente davon sowie deren Verwendung |
| US8962803B2 (en) | 2008-02-29 | 2015-02-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Antibodies against the RGM A protein and uses thereof |
| PE20160653A1 (es) | 2009-03-05 | 2016-07-24 | Abbvie Inc | Proteinas de union a il-17 |
| US9085798B2 (en) | 2009-04-30 | 2015-07-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
| CN105131112A (zh) | 2009-08-29 | 2015-12-09 | Abbvie公司 | 治疗用dll4结合蛋白 |
| PL2510001T3 (pl) * | 2009-12-08 | 2016-06-30 | Abbvie Deutschland | Monoklonalne przeciwciało przeciwko białku RGM A do zastosowania w leczeniu zwyrodnienia warstwy włókien nerwowych siatkówki (RNFL) |
| PE20130580A1 (es) | 2010-03-02 | 2013-06-02 | Abbvie Inc | Proteinas terapeuticas de union a dll4 |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| CN105385756B (zh) | 2010-04-05 | 2020-12-25 | 普罗格诺西斯生物科学公司 | 空间编码的生物学测定 |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| BR112012031071B1 (pt) | 2010-05-14 | 2021-08-10 | Abbvie Inc | Proteínas de ligação à il-1 e composição farmacêutica compreendendo as referidas proteínas de ligação |
| EP2694709B1 (en) | 2011-04-08 | 2016-09-14 | Prognosys Biosciences, Inc. | Peptide constructs and assay systems |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| US20230287392A1 (en) * | 2011-04-28 | 2023-09-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Identification of Polynucleotides Associated with a Sample |
| KR102112205B1 (ko) * | 2011-04-28 | 2020-06-12 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | 샘플과 연관된 폴리뉴클레오티드의 식별 |
| EP2710382B1 (en) | 2011-05-17 | 2017-10-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Improved methods for the selection of binding proteins |
| RU2636045C2 (ru) | 2011-07-12 | 2017-11-17 | ИксБиотеч, Инк. | Выявление аффинно-зрелых человеческих антител |
| EP2751291B1 (en) | 2011-09-01 | 2018-08-15 | University of Southern California | Methods for preparing high throughput peptidomimetics, orally bioavailable drugs and compositions containing same |
| WO2013112922A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-08-01 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Composition and method for diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration |
| TW201402608A (zh) | 2012-07-12 | 2014-01-16 | Abbvie Inc | Ｉｌ－１結合蛋白質 |
| UA118441C2 (uk) | 2012-10-08 | 2019-01-25 | Протена Біосаєнсиз Лімітед | Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн |
| EP2909337B1 (en) | 2012-10-17 | 2019-01-09 | Spatial Transcriptomics AB | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
| EP2972366B1 (en) | 2013-03-15 | 2020-06-17 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods for detecting peptide/mhc/tcr binding |
| US9816088B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-14 | Abvitro Llc | Single cell bar-coding for antibody discovery |
| DK3013984T3 (da) | 2013-06-25 | 2023-06-06 | Prognosys Biosciences Inc | Metode til bestemmelse af spatiale mønstre i biologiske targets i en prøve |
| US9951131B2 (en) | 2013-07-12 | 2018-04-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies that recognize IAPP |
| WO2015004632A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Neotope Biosciences Limited | Antibodies that recognize iapp |
| PL3030682T3 (pl) | 2013-08-05 | 2020-11-16 | Twist Bioscience Corporation | Biblioteki genowe syntezowane de novo |
| US10288608B2 (en) | 2013-11-08 | 2019-05-14 | Prognosys Biosciences, Inc. | Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection |
| JP6704850B2 (ja) * | 2013-12-30 | 2020-06-03 | キュアバック アーゲー | 人工核酸分子 |
| US10562973B2 (en) | 2014-04-08 | 2020-02-18 | Prothena Bioscience Limited | Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein |
| KR102541849B1 (ko) | 2014-09-15 | 2023-06-09 | 에이비비트로, 엘엘씨 | 고-처리량 뉴클레오티드 라이브러리 서열결정 |
| JP6897952B2 (ja) * | 2014-09-16 | 2021-07-07 | 国立大学法人東京海洋大学 | 濃縮された生着能をもつ未分化生殖細胞を用いた生殖細胞系列への分化誘導方法 |
| KR101694832B1 (ko) * | 2014-12-31 | 2017-01-12 | 앱클론(주) | 항체 라이브러리 및 그의 제작방법 |
| WO2016114567A1 (ko) * | 2015-01-13 | 2016-07-21 | 이화여자대학교 산학협력단 | 신규 항체 라이브러리 제조방법 및 이로부터 제조된 라이브러리 |
| US20160222377A1 (en) * | 2015-01-29 | 2016-08-04 | Terry T. Takahashi | Method for generating ultra high affinity peptide ligands |
| WO2016126882A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly |
| JP7508191B2 (ja) * | 2015-03-30 | 2024-07-01 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | コンビナトリアルバーコーディングのための方法および組成物 |
| ES2972835T3 (es) | 2015-04-10 | 2024-06-17 | 10X Genomics Sweden Ab | Análisis multiplex de especímenes biológicos de ácidos nucleicos espacialmente distinguidos |
| WO2016172377A1 (en) | 2015-04-21 | 2016-10-27 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
| US20160312212A1 (en) * | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Cow antibody scaffold polypeptide method and composition |
| KR20180050411A (ko) | 2015-09-18 | 2018-05-14 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성 |
| US11512347B2 (en) | 2015-09-22 | 2022-11-29 | Twist Bioscience Corporation | Flexible substrates for nucleic acid synthesis |
| CN115920796A (zh) | 2015-12-01 | 2023-04-07 | 特韦斯特生物科学公司 | 功能化表面及其制备 |
| KR20230042703A (ko) | 2016-06-07 | 2023-03-29 | 맥스-델브뤼크-센트럼 퓌어 몰레쿨라레 메디친 | Bcma에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 car-t 세포 |
| WO2018005720A1 (en) * | 2016-06-30 | 2018-01-04 | President And Fellows Of Harvard College | Method of determining the molecular binding between libraries of molecules |
| AU2017315294B2 (en) | 2016-08-22 | 2023-12-21 | Twist Bioscience Corporation | De novo synthesized nucleic acid libraries |
| US10858649B2 (en) | 2016-09-15 | 2020-12-08 | Augmenta Bioworks, Inc. | Immune repertoire sequence amplification methods and applications |
| JP6871364B2 (ja) | 2016-09-21 | 2021-05-12 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | 核酸に基づくデータ保存 |
| US10907274B2 (en) | 2016-12-16 | 2021-02-02 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
| JP2020508661A (ja) | 2017-02-22 | 2020-03-26 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | 核酸ベースのデータ保存 |
| WO2018170169A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
| WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| KR102628876B1 (ko) | 2017-06-12 | 2024-01-23 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 심리스 핵산 어셈블리를 위한 방법 |
| KR20200047706A (ko) | 2017-09-11 | 2020-05-07 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | Gpcr 결합 단백질 및 이의 합성 방법 |
| CN111565834B (zh) | 2017-10-20 | 2022-08-26 | 特韦斯特生物科学公司 | 用于多核苷酸合成的加热的纳米孔 |
| AU2018367622B2 (en) * | 2017-11-20 | 2022-12-22 | Nantbio, Inc. | mRNA display antibody library and methods |
| CA3088911A1 (en) | 2018-01-04 | 2019-07-11 | Twist Bioscience Corporation | Dna-based storage device and method for synthesizing polynucleotides using the device |
| US20210139985A1 (en) * | 2018-04-10 | 2021-05-13 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Dna-barcoded antigen multimers and methods of use thereof |
| AU2019270243A1 (en) | 2018-05-18 | 2021-01-07 | Twist Bioscience Corporation | Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization |
| US11662341B2 (en) | 2018-10-10 | 2023-05-30 | Augmenta Bioworks, Inc. | Methods for isolating immune binding proteins |
| CA3131691A1 (en) | 2019-02-26 | 2020-09-03 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for antibody optimization |
| AU2020229349A1 (en) | 2019-02-26 | 2021-10-14 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor |
| WO2020205426A1 (en) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | The Regents Of The University Of California | Comprehensive identification of interacting protein targets using mrna display of uniform libraries |
| AU2020298294A1 (en) | 2019-06-21 | 2022-02-17 | Twist Bioscience Corporation | Barcode-based nucleic acid sequence assembly |
| WO2021061829A1 (en) | 2019-09-23 | 2021-04-01 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for crth2 |
| EP4142784A2 (en) | 2020-04-27 | 2023-03-08 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for coronavirus |
| US11970697B2 (en) | 2020-10-19 | 2024-04-30 | Twist Bioscience Corporation | Methods of synthesizing oligonucleotides using tethered nucleotides |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998031700A1 (en) * | 1997-01-21 | 1998-07-23 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using rna-protein fusions |
| IL138668A0 (en) * | 1998-04-03 | 2001-10-31 | Phylos Inc | Addressable protein arrays |
| EP2727936B1 (en) | 2006-11-22 | 2016-09-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including IGF-IR |
| WO2009114093A2 (en) * | 2008-03-03 | 2009-09-17 | Abbott Laboratories | Methods for transforming yeast |
-
2009
- 2009-09-30 JP JP2011530180A patent/JP2012504416A/ja active Pending
- 2009-09-30 US US12/570,897 patent/US8404445B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-09-30 CA CA2736430A patent/CA2736430A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-30 AU AU2009298501A patent/AU2009298501A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-30 TW TW098133249A patent/TW201028432A/zh unknown
- 2009-09-30 CN CN2009801477246A patent/CN102227440A/zh active Pending
- 2009-09-30 WO PCT/US2009/059059 patent/WO2010039852A2/en active Application Filing
- 2009-09-30 EP EP09818451A patent/EP2340256A4/en not_active Withdrawn
- 2009-09-30 RU RU2011117213/10A patent/RU2011117213A/ru not_active Application Discontinuation
- 2009-09-30 KR KR1020117009192A patent/KR20110061629A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-09-30 MX MX2011003380A patent/MX2011003380A/es active IP Right Grant
- 2009-09-30 NZ NZ591543A patent/NZ591543A/xx not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-03-03 IL IL211552A patent/IL211552A0/en unknown
- 2011-03-22 ZA ZA2011/02119A patent/ZA201102119B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ591543A (en) | 2012-11-30 |
| EP2340256A4 (en) | 2012-03-21 |
| RU2011117213A (ru) | 2012-11-10 |
| ZA201102119B (en) | 2011-12-28 |
| US20100099103A1 (en) | 2010-04-22 |
| CN102227440A (zh) | 2011-10-26 |
| CA2736430A1 (en) | 2010-04-08 |
| WO2010039852A3 (en) | 2010-07-29 |
| US8404445B2 (en) | 2013-03-26 |
| JP2012504416A (ja) | 2012-02-23 |
| EP2340256A2 (en) | 2011-07-06 |
| AU2009298501A1 (en) | 2010-04-08 |
| IL211552A0 (en) | 2011-05-31 |
| KR20110061629A (ko) | 2011-06-09 |
| WO2010039852A2 (en) | 2010-04-08 |
| TW201028432A (en) | 2010-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| MX2011003380A (es) | Genotecas de anticuerpo mejoradas. | |
| US8916504B2 (en) | Methods of RNA display | |
| US11685773B2 (en) | Method for mass humanization of rabbit antibodies | |
| US10329555B2 (en) | High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody | |
| JP4939410B2 (ja) | 強化された特性を持つ変性ポリペプチドを発生させるためのルックスルー変異誘発 | |
| ES2334184T3 (es) | Metodo de identificacion de dominios de sitios de union que conservan la capacidad de unirse a un epitopo. | |
| CN113234142B (zh) | 超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用 | |
| KR101938021B1 (ko) | 집합 및 집합의 이용방법 | |
| KR20180077144A (ko) | 신규 항체 라이브러리 제조방법 및 이로부터 제조된 라이브러리 | |
| JP2010515463A (ja) | 配座的に束縛されたポリペプチド配列のコンビナトリアルライブラリー | |
| JP2020537632A (ja) | ダイナミックヒト重鎖抗体ライブラリー | |
| JP2021506976A (ja) | 根本的に多様なヒト抗体ライブラリー | |
| JP7324744B2 (ja) | ダイナミックヒト抗体軽鎖ライブラリー | |
| KR102194203B1 (ko) | 항체 나이브 라이브러리의 생성 방법, 상기 라이브러리 및 그 적용(들) | |
| WO2021247761A1 (en) | Methods and compositions for in vitro affinity maturation of monoclonal antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Grant or registration | ||
| GB | Transfer or rights |