CN111919836A - 一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂及冻存方法和应用 - Google Patents

一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂及冻存方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物冻存技术领域，提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂及冻存方法和应用，该无血清冻存保护剂包括以下组分：Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物、二甲基亚砜、青链霉素。本发明通过以不含血清的Knockout DMEM培养基作为基质，联合使用KSR血清替代物、二甲基亚砜和青链霉素作为低温保护剂，不仅可以降低冻存保护剂的成本和避免了外源性病原体及病毒污染的风险，而且还能长期低温保存牛睾丸组织，减少细胞凋亡，维持组织形态，较好的保护了生精细胞和睾丸体细胞，使得冻存复苏后的睾丸组织结构完整、各类睾丸细胞的活性高，可正常增殖、发育。

Description

一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂及冻存方法和应用
技术领域
本发明属于生物冻存技术领域，尤其涉及一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂及冻存方法和应用。
背景技术
动物种质资源保存一般有活体保种、精液冻存和胚胎保存等方式。活体保种场大都以封闭繁育为主，全群留种，易受制于群体规模、市场开发等因素；另外进口或本土优良种畜存在基础保种畜群数量少、血统更新和扩充困难等问题，因此活体保种工作依然存在很多困难。冷冻精液技术虽已应用于生产实践，但不适于一些需要保种的新生或幼龄动物、突然死亡或不便采精的动物。胚胎保存则程序繁杂，需要较高技术要求。鉴于此，性腺组织的冻存为解决这一问题提供了新途径。其中，哺乳动物睾丸组织的低温保存是生命科学、农业科学和再生医学领域的研究热点。
睾丸组织结构复杂且包含多种睾丸细胞，因此，睾丸组织的冷冻保存需要兼顾各类睾丸细胞对低温的耐受能力，使用有效降低低温损伤的冻存保护剂是维持睾丸组织结构完整和生理活性的关键。细胞或组织冻存液多以渗透性的二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、甘油或非渗透性的蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白等作为冷冻保护剂，有效避免了细胞在冷冻和复苏过程中受到的损伤。
其中，传统睾丸组织结构的冻存液配伍多采用二甲基亚砜联合胎牛血清（大部分为10%二甲基亚砜与90%胎牛血清配伍），但因胎牛血清中蛋白成分复杂，含有内毒素、血色素等有害物质，不利于下游产物的纯化，生产批次间的品质难以保持一致，存在外源性病原体及病毒污染的危险。此外，胎牛血清取自未接触外界的胎牛，其收集过程一直受到伦理学的质疑。因此，研发一种新的无血清睾丸组织冻存保护液十分必要。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其包括以下按照体积百分数计的组分：Knockout DMEM培养基62%~88%、KSR血清替代物5%~15%、二甲基亚砜5%~15%、青链霉素2%~8%，各组分的体积百分数之和为100%。
作为本发明实施例的一种优选方案，其特征在于，所述无血清冻存保护剂包括以下按照体积百分数计的组分：Knockout DMEM培养基70%~80%、KSR血清替代物8%~12%、二甲基亚砜8%~12%、青链霉素4%~6%，各组分的体积百分数之和为100%。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述无血清冻存保护剂包括以下按照体积百分数计的组分：Knockout DMEM培养基72.5%~77.5%、KSR血清替代物9%~11%、二甲基亚砜9%~11%、青链霉素4.5%~5.5%，各组分的体积百分数之和为100%。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的无血清冻存保护剂在冻存牛睾丸组织中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种牛睾丸组织的冻存方法，其包括以下步骤：
将牛睾丸组织置于如权利要求1~3中任一项所述的无血清冻存保护剂中进行平衡处理后，再置于含有异丙醇的环境中进行冻存处理，然后转移至液氮中进行保存。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，平衡处理时的温度为3~5℃。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，含有异丙醇的环境的温度为-82~-78℃。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，在平衡处理之前，还包括：
用酒精清洗牛睾丸组织的表面后，再用含有青链霉素的磷酸缓冲盐溶液冲洗牛睾丸组织的表面。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述酒精中乙醇的体积浓度为70%~80%。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述含有青链霉素的磷酸缓冲盐溶液中青链霉素的质量浓度为3%~7%。
在本发明中，二甲基亚砜能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。KSR（Knockout™ SerumReplacement）作为一种血清替代物，具有较好的批间稳定性，成分明确。
本发明实施例提供的一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，具有切实的应用意义，其以不含血清的Knockout DMEM培养基作为基质，联合使用KSR血清替代物、二甲基亚砜和青链霉素作为低温保护剂，不仅可以降低冻存保护剂的成本和避免了外源性病原体及病毒污染的风险，而且还能长期低温保存牛睾丸组织，减少细胞凋亡，维持组织形态，较好的保护了生精细胞和睾丸体细胞，使得冻存复苏后的睾丸组织结构完整、各类睾丸细胞的活性高，可正常增殖、发育。
附图说明
图1为采用实施例11的方法冻存6个月的成年黄牛睾丸组织复苏后的HE切片染色图（200X）。
图2为采用实施例11的方法冻存3个月的西门塔尔犊牛睾丸组织复苏后的HE切片染色（400X）。
图3为采用实施例11的方法冻存6个月的成年黄牛睾丸组织复苏后再制备成生精上皮细胞悬液的观察图（200X）。
图4为采用实施例11的方法冻存3个月的西门塔尔犊牛睾丸组织复苏后再分离、培养原代细胞的观察图（200X）。
图5为采用实施例11的方法冻存3个月的西门塔尔犊牛睾丸组织复苏后的TUNEL染色图（200X）。
图6为未进行冻存的西门塔尔犊牛睾丸组织的TUNEL染色图（200X）。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其是由75mL的Knockout DMEM培养基、10mL的KSR血清替代物、10mL的二甲基亚砜、5mL的青链霉素混合而得的，并置于4℃存放。其中，Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物和青链霉素均可以采用美国GIBCO公司的市售产品，二甲基亚砜可以采用美国Sigma公司的市售产品。另外，青链霉素中，青霉素的浓度为10000 Units/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
实施例2
该实施例提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其是由62mL的Knockout DMEM培养基、15mL的KSR血清替代物、15mL的二甲基亚砜、8mL的青链霉素混合而得的，并置于4℃存放。其中，Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物和青链霉素均可以采用美国GIBCO公司的市售产品，二甲基亚砜可以采用美国Sigma公司的市售产品。另外，青链霉素中，青霉素的浓度为10000 Units/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
实施例3
该实施例提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其是由88mL的Knockout DMEM培养基、5mL的KSR血清替代物、5mL的二甲基亚砜、2mL的青链霉素混合而得的，并置于4℃存放。其中，Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物和青链霉素均可以采用美国GIBCO公司的市售产品，二甲基亚砜可以采用美国Sigma公司的市售产品。另外，青链霉素中，青霉素的浓度为10000 Units/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
实施例4
该实施例提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其是由80mL的Knockout DMEM培养基、7mL的KSR血清替代物、7mL的二甲基亚砜、6mL的青链霉素混合而得的，并置于4℃存放。其中，Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物和青链霉素均可以采用美国GIBCO公司的市售产品，二甲基亚砜可以采用美国Sigma公司的市售产品。另外，青链霉素中，青霉素的浓度为10000 Units/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
实施例5
该实施例提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其是由70mL的Knockout DMEM培养基、13mL的KSR血清替代物、13mL的二甲基亚砜、4mL的青链霉素混合而得的，并置于4℃存放。其中，Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物和青链霉素均可以采用美国GIBCO公司的市售产品，二甲基亚砜可以采用美国Sigma公司的市售产品。另外，青链霉素中，青霉素的浓度为10000 Units/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
实施例6
该实施例提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其是由80mL的Knockout DMEM培养基、8mL的KSR血清替代物、8mL的二甲基亚砜、4mL的青链霉素混合而得的，并置于4℃存放。其中，Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物和青链霉素均可以采用美国GIBCO公司的市售产品，二甲基亚砜可以采用美国Sigma公司的市售产品。另外，青链霉素中，青霉素的浓度为10000 Units/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
实施例7
该实施例提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其是由70mL的Knockout DMEM培养基、12mL的KSR血清替代物、12mL的二甲基亚砜、6mL的青链霉素混合而得的，并置于4℃存放。其中，Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物和青链霉素均可以采用美国GIBCO公司的市售产品，二甲基亚砜可以采用美国Sigma公司的市售产品。另外，青链霉素中，青霉素的浓度为10000 Units/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
实施例8
该实施例提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其是由77.5mL的KnockoutDMEM培养基、9mL的KSR血清替代物、9mL的二甲基亚砜、4.5mL的青链霉素混合而得的，并置于4℃存放。其中，Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物和青链霉素均可以采用美国GIBCO公司的市售产品，二甲基亚砜可以采用美国Sigma公司的市售产品。另外，青链霉素中，青霉素的浓度为10000 Units/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
实施例9
该实施例提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其是由72.5mL的KnockoutDMEM培养基、11mL的KSR血清替代物、11mL的二甲基亚砜、5.5mL的青链霉素混合而得的，并置于4℃存放。其中，Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物和青链霉素均可以采用美国GIBCO公司的市售产品，二甲基亚砜可以采用美国Sigma公司的市售产品。另外，青链霉素中，青霉素的浓度为10000 Units/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
实施例10
该实施例提供了一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其是由75mL的Knockout DMEM培养基、12mL的KSR血清替代物、8mL的二甲基亚砜、5mL的青链霉素混合而得的，并置于4℃存放。其中，Knockout DMEM培养基、KSR血清替代物和青链霉素均可以采用美国GIBCO公司的市售产品，二甲基亚砜可以采用美国Sigma公司的市售产品。另外，青链霉素中，青霉素的浓度为10000 Units/mL，链霉素的浓度为10000μg/mL。
实施例11
该实施例的提供了一种牛睾丸组织的冻存方法，其包括以下步骤：
S1、用体积浓度为75%的酒精清洗除去牛睾丸组织的表面的污物后，再用含有质量浓度为5%的青链霉素的磷酸缓冲盐溶液冲洗牛睾丸组织的表面；然后转移到无菌操作台中，用手术刀片将附睾部分去掉，并顺势剥离白膜；随后将睾丸组织用剪刀剪成体积约为0.6cm3的小块。
S2、将上述小块的牛睾丸组织放入加有1mL上述实施例1提供的无血清冻存保护剂的可立式冻存管（2.0mL规格）中，并置于4℃的温度下进行平衡处理10min后，再置于-20℃的温度下存放2h，接着转移到含有异丙醇的-80℃环境中的冻存盒中进行冻存处理24h，然后转移至液氮中进行保存。
实施例12
该实施例的提供了一种牛睾丸组织的冻存方法，其包括以下步骤：
S1、用体积浓度为70%的酒精清洗除去牛睾丸组织的表面的污物后，再用含有质量浓度为3%的青链霉素的磷酸缓冲盐溶液冲洗牛睾丸组织的表面；然后转移到无菌操作台中，用手术刀片将附睾部分去掉，并顺势剥离白膜；随后将睾丸组织用剪刀剪成体积约为0.5cm3的小块。
S2、将上述小块的牛睾丸组织放入加有1mL上述实施例9提供的无血清冻存保护剂的可立式冻存管（2.0mL规格）中，并置于3℃的温度下进行平衡处理10min后，再置于-20℃的温度下存放2h，接着转移到含有异丙醇的-82℃环境中的冻存盒中进行冻存处理24h，然后转移至液氮中进行保存。
实施例13
该实施例的提供了一种牛睾丸组织的冻存方法，其包括以下步骤：
S1、用体积浓度为80%的酒精清洗除去牛睾丸组织的表面的污物后，再用含有质量浓度为7%的青链霉素的磷酸缓冲盐溶液冲洗牛睾丸组织的表面；然后转移到无菌操作台中，用手术刀片将附睾部分去掉，并顺势剥离白膜；随后将睾丸组织用剪刀剪成体积约为0.7cm3的小块。
S2、将上述小块的牛睾丸组织放入加有1mL上述实施例10提供的无血清冻存保护剂的可立式冻存管（2.0mL规格）中，并置于5℃的温度下进行平衡处理10min后，再置于-20℃的温度下存放2h，接着转移到含有异丙醇的-78℃环境中的冻存盒中进行冻存处理24h，然后转移至液氮中进行保存。
试验例：
取成年黄牛（2.5岁，体重1000kg）的牛睾丸组织，并按照上述实施例11提供的冻存方法进行冻存6个月。取西门塔尔犊牛（1日龄，体重约50kg）的牛睾丸组织，并按照上述实施例11提供的冻存方法进行冻存3个月。
其中，冻存6个月的成年黄牛睾丸组织复苏后的HE切片染色图（200X）以及冻存3个月的西门塔尔犊牛睾丸组织复苏后的HE切片染色（400X）分别如附图1和2所示。冻存6个月的成年黄牛睾丸组织复苏后再制备成生精上皮细胞悬液的观察图（200X）以及冻存3个月的西门塔尔犊牛睾丸组织复苏后再分离、培养原代细胞的观察图（200X）分别如附图3和4所示。
另外，冻存3个月的西门塔尔犊牛睾丸组织复苏后的TUNEL染色图（用于检测细胞凋亡情况）如附图5所示，刚从西门塔尔犊牛身上取得的未进行冻存的西门塔尔犊牛睾丸组织的TUNEL染色图（作为阳性对照）如附图6所示。
从上述各图中可以看出，本发明实施例提供的无血清冻存保护剂和冻存方法可用于长期保存牛睾丸组织，且能够减少细胞凋亡，维持组织形态，从而可以较好地保护生精细胞和睾丸体细胞。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其特征在于，包括以下按照体积百分数计的组分：Knockout DMEM培养基62%~88%、KSR血清替代物5%~15%、二甲基亚砜5%~15%、青链霉素2%~8%，各组分的体积百分数之和为100%。
2.根据权利要求1所述的一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其特征在于，所述无血清冻存保护剂包括以下按照体积百分数计的组分：Knockout DMEM培养基70%~80%、KSR血清替代物8%~12%、二甲基亚砜8%~12%、青链霉素4%~6%，各组分的体积百分数之和为100%。
3.根据权利要求1所述的一种牛睾丸组织的无血清冻存保护剂，其特征在于，所述无血清冻存保护剂包括以下按照体积百分数计的组分：Knockout DMEM培养基72.5%~77.5%、KSR血清替代物9%~11%、二甲基亚砜9%~11%、青链霉素4.5%~5.5%，各组分的体积百分数之和为100%。
4.一种如权利要求1~3中任一项所述的无血清冻存保护剂在冻存牛睾丸组织中的应用。
5.一种牛睾丸组织的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
将牛睾丸组织置于如权利要求1~3中任一项所述的无血清冻存保护剂中进行平衡处理后，再置于含有异丙醇的环境中进行冻存处理，然后转移至液氮中进行保存。
6.根据权利要求5所述的一种牛睾丸组织的冻存方法，其特征在于，所述步骤中，平衡处理时的温度为3~5℃。
7.根据权利要求5所述的一种牛睾丸组织的冻存方法，其特征在于，所述步骤中，含有异丙醇的环境的温度为-82~-78℃。
8.根据权利要求5所述的一种牛睾丸组织的冻存方法，其特征在于，所述步骤中，在平衡处理之前，还包括：
用酒精清洗牛睾丸组织的表面后，再用含有青链霉素的磷酸缓冲盐溶液冲洗牛睾丸组织的表面。
9.根据权利要求8所述的一种牛睾丸组织的冻存方法，其特征在于，所述酒精中乙醇的体积浓度为70%~80%。
10.根据权利要求8所述的一种牛睾丸组织的冻存方法，其特征在于，所述含有青链霉素的磷酸缓冲盐溶液中青链霉素的质量浓度为3%~7%。
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