CN114521550A - 生物保存液及其在卵母细胞和卵巢组织保存中的应用 - Google Patents

生物保存液及其在卵母细胞和卵巢组织保存中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种生物保存液，由平衡液、玻璃化液和N种解冻液组成，N为不小于2的正整数。本发明的所述生物保存液通过控制所述玻璃化液中的非渗透冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的非渗透性冷冻保护剂的含量；所述玻璃化液中的渗透性冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的渗透性冷冻保护剂的含量；不同解冻液中的非渗透性冷冻保护剂的含量不同，随所述N次复苏过程逐步降低。所述生物保存液有利于提供卵母细胞和卵巢组织生存的微环境，提高细胞和组织的冻存复苏后活率，保存生物活性和功能。本发明还提供了所述生物保存液在卵母细胞和卵巢组织冷冻保存和复苏过程中的应用。

Description

生物保存液及其在卵母细胞和卵巢组织保存中的应用
技术领域
本发明涉及生物保存技术领域，尤其涉及生物保存液及其在卵母细胞和卵巢组织冻存和复苏中的应用。
背景技术
卵母细胞和卵巢组织冻存技术是保存女性生育力的最有潜力和最受关注的技术。在冻存和复苏过程中，维持卵母细胞和卵巢组织存活的微环境，保存组织的活性和功能是最难攻克的瓶颈。
理想的用于卵母细胞和卵巢组织保存的冻存复苏溶液要能够保存卵母细胞和卵巢组织活性与功能。目前，虽然开发出了多种冷冻保存和复苏液，但只可应用于卵母细胞的冻存与复苏，或应用于卵巢组织的冻存与复苏。目前，没有同时适用于卵母细胞和卵巢组织的冷冻液和复苏液。
因此，有必要提供一种新型的生物保存液既可用于卵母细胞冻存与复苏又可用于卵巢组织的冻存与复苏，以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物保存液及其在卵母细胞和卵巢组织保存中的应用，以利于延长细胞与组织的保存时间，提高卵母细胞和卵巢组织冻存复苏后的活率，保存细胞和组织的功能。
为实现上述目的，本发明的所述生物保存液，由平衡液、玻璃化液和N种解冻液组成，以应用于对生物样本进行冻存和复苏过程；
所述平衡液、所述玻璃化液和每种解冻液均包含组成和含量相同的基准液；
所述平衡液和所述玻璃化液含有渗透性冷冻保护剂和非渗透冷冻保护剂，所述解冻液含有非渗透性冷冻保护剂；
所述玻璃化液中的非渗透冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的非渗透性冷冻保护剂的含量；
所述玻璃化液中的渗透性冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的渗透性冷冻保护剂的含量；
不同解冻液中的非渗透性冷冻保护剂的含量随所述复苏过程逐步降低。
本发明的所述生物保存液的有益效果在于：通过控制所述玻璃化液中的非渗透冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的非渗透性冷冻保护剂的含量；所述玻璃化液中的渗透性冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的渗透性冷冻保护剂的含量；不同解冻液中的非渗透性冷冻保护剂的含量不同，随复苏过程的逐步降低，有利于提高卵母细胞和卵巢组织冻存和复苏后的生物活性，维持卵母细胞和卵巢组织的功能。
优选的，所述玻璃化液中非渗透冷冻保护剂的含量是所述平衡液中非渗透性冷冻保护剂含量的8-30倍。
进一步优选的，所述平衡液中非渗透冷冻保护剂含有5-40mg/ml的人血白蛋白。
进一步优选的，所述玻璃化液中非渗透冷冻保护剂具有与所述平衡液含量相同的人血白蛋白，还含有0.1-2mol/L的蔗糖和海藻糖的任意一种。
优选的，所述玻璃化液中渗透性冷冻保护剂的含量是所述平衡液中渗透性冷冻保护剂含量的0.8-1.5倍。
进一步优选的，所述平衡液和所述玻璃化液中任意一种的渗透性冷冻保护剂由体积百分比为2-30％的乙二醇和二甲基亚砜组成，所述玻璃化液中乙二醇含量高于所述平衡液中乙二醇含量，所述玻璃化液中二甲基亚砜含量高于所述平衡液中二甲基亚砜含量。
进一步优选的，同一平衡液和同一玻璃化液中任意一种的乙二醇和二甲基亚砜具有相同的含量。
优选的，不同解冻液中的非渗透性冷冻保护剂含量随所述复苏过程降低0.2-1倍。
进一步优选的，以每种解冻液的体积计，不同解冻液的非渗透性冷冻保护剂均含有5-40mg/ml的人血白蛋白，不同解冻液具有相同含量的人血白蛋白。
进一步优选的，以每种解冻液的体积计，不同解冻液的非渗透性冷冻保护剂均含有0.05-3mol/L的蔗糖和海藻糖的任意一种，不同解冻液中蔗糖和海藻糖任意一种的含量随所述N次复苏过程的逐步降低。
优选的，所述基准液包含0.1-10mmol/L的抗氧化剂。
优选的，所述基准液还含有6-19g/L的营养剂、0.5-1g/ml的能量物质、14-21g/L的缓冲剂、15-45mg/L的抗菌剂以及3.36g/L的pH调节剂。
本发明的所述生物保存液应用于卵母细胞保存过程包括控制所述平衡液和所述玻璃化液的温度为10-25摄氏度，控制第一种解冻液的温度为30-40摄氏度，其余复苏液解冻液的温度为10-25摄氏度。其有益效果在于：有利于提供卵母细胞生存的微环境，提高卵母细胞冻存复苏后的活率，维持卵母细胞的生理功能。
优选的，控制使用所述平衡液进行样本平衡的时间不超过10分钟，使用所述玻璃化液进行样本处理的时间不超过3分钟，使用所述第一种解冻液进行复苏的时间不超过3分钟，使用所述其余解冻液分别进行的复苏时间不超过10分钟。
优选的，使用平衡液进行样本处理和使用玻璃化液进行样本处理的次数均至少为2。
本发明所述生物保存液应用于卵巢组织保存过程包括控制所述平衡液和所述玻璃化液的温度为10-25摄氏度，控制第一种解冻液的温度为30-40摄氏度，其余解冻液的温度为10-25摄氏度，使用所述玻璃化液样本处理结束后进行液氮速冻保存。其有益效果在于：有利于提高卵巢组织冻存复苏后的活性，维持卵巢组织的生理功能。
优选的，控制使用所述平衡液样本处理的时间不超过25分钟，使用所述玻璃化液样本处理的时间至少为10分钟直至所述玻璃化液中卵巢组织切片由悬浮状态下沉至容器底部，使用所述第一种解冻液进行复苏的时间不超过5分钟，使用所述其余解冻液分别进行复苏的时间不超过15分钟。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
针对现有技术存在的问题，本发明的实施例提供了一种生物保存液及其在卵母细胞和卵巢组织保存中的应用，以提供适于卵母细胞和卵巢组织存活的微环境，保存组织的活性和功能。
本发明实施例的人血白蛋白为非重组人血白蛋白。具体的，所述非重组人血白蛋白经对健康人血液纯化得到，能够维持与调节溶液的渗透压并对细胞形成保护作用。
本发明实施例的所述生物保存液，由平衡液、玻璃化液和N种解冻液组成，以应用于对生物样本进行的平衡过程和N次复苏过程，N为不小于2的正整数。
本发明一些实施例中，所述平衡液由基准液、渗透性冷冻保护剂、非渗透冷冻保护剂和溶剂组成。
具体的，所述平衡液的非渗透冷冻保护剂为人血白蛋白，所述平衡液的渗透性冷冻保护剂由乙二醇和二甲基亚砜组成。
本发明一些实施例的平衡液中，以占所述平衡液的体积计，人血白蛋白含量为5-40mg/ml，乙二醇和二甲基亚砜的体积百分比均为2-30％。
本发明一些实施例的平衡液中，乙二醇和二甲基亚砜具有相同的含量。
本发明一些实施例中，所述玻璃化液由基准液、渗透性冷冻保护剂、非渗透冷冻保护剂和溶剂组成。
具体的，所述玻璃化液的非渗透冷冻保护剂由人血白蛋白以及蔗糖和海藻糖的任意一种组成。所述玻璃化液的渗透性冷冻保护剂由乙二醇和二甲基亚砜组成。
本发明一些实施例的玻璃化液中，以占所述玻璃化液的体积计，蔗糖和海藻糖任意一种的含量为0.1-2mol/L，人血白蛋白含量为5-40mg/ml，乙二醇和二甲基亚砜的体积百分比均为2-30％。
本发明一些实施例的玻璃化液中，乙二醇和二甲基亚砜具有相同的含量。
本发明一些实施例中，所述玻璃化液中的渗透性冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的渗透性冷冻保护剂的含量。
具体的，所述玻璃化液中的渗透性冷冻保护剂的含量相比所述平衡液中的渗透性冷冻保护剂的含量增加0.8-1.5倍。
本发明一些实施例中，所述玻璃化液中的非渗透冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的非渗透性冷冻保护剂的含量。
具体的，所述玻璃化液中非渗透冷冻保护剂的含量是所述平衡液中非渗透性冷冻保护剂含量的8-30倍。
本发明一些实施例中，所述玻璃化液的非渗透冷冻保护剂具有与所述平衡液中相同含量的人血白蛋白。
本发明一些实施例中，所述玻璃化液中乙二醇含量高于所述平衡液中乙二醇含量，所述玻璃化液中二甲基亚砜含量高于所述平衡液中二甲基亚砜含量。
本发明一些实施例中，每种解冻液由基准液、非渗透性冷冻保护剂和溶剂组成。
具体的，所述解冻液的非渗透性冷冻保护剂由人血白蛋白以及蔗糖和海藻糖中的任意一种组成。
本发明一些实施例的解冻液中，以每种解冻液的体积计，每种解冻液中的人血白蛋白含量均为5-40mg/ml，蔗糖和海藻糖任意一种的含量为0.05-3mol/L。
本发明一些实施例中，不同解冻液中非渗透性冷冻保护剂含量随所述复苏过程逐步降低0.2-1倍。
本发明一些实施例中，不同解冻液具有相同含量人血白蛋白。
本发明一些实施例中，不同解冻液的蔗糖和海藻糖中任意一种的含量随所述N次复苏过程逐步降低。
本发明一些实施例中，所述平衡液、所述玻璃化液和每种解冻液的溶剂均为纯化水。
本发明一些实施例中，所述平衡液、所述玻璃化液和每种解冻液均包含组成和含量相同的基准液。
具体的，所述基准液由抗氧化剂、营养剂、能量物质、缓冲剂、抗菌剂和pH调节剂组成。
本发明一些实施例中，以占所述平衡液、所述玻璃化液和每种解冻液的任意一种的体积计，抗氧化剂、营养剂、能量物质、缓冲剂、抗菌剂和pH调节剂的含量依次为0.1-10mmol/L、6-19g/L、0.5-1g/ml、14-21g/L、15-45mg/L以及3.36g/L。
本发明一些实施例中，所述抗氧化剂为牛磺酸。
本发明一些实施例中，所述营养剂为丙氨酰谷氨酰胺。
本发明一些实施例中，所述能量物质为丙酮酸钠和葡萄糖。
本发明一些实施例中，所述缓冲剂为HEPES。
本发明一些实施例中，所述抗菌剂为硫酸庆大霉素。
本发明一些实施例中，所述pH调节剂为碳酸氢钠。
本发明实施例还提供了所述生物保存液应用于卵母细胞保存过程，包括控制所述平衡液和所述玻璃化液的温度为10-25摄氏度，控制第一种解冻液的温度为30-40摄氏度，其余解冻液的温度为10-25摄氏度。
本发明一些实施例的所述生物保存液应用于卵母细胞保存过程中，控制使用所述平衡液进行样本处理的时间不超过10分钟，使用所述玻璃化液进行样本处理的时间不超过5分钟，使用所述第一种解冻液进行复苏的时间不超过3分钟，使用所述其余解冻液分别进行复苏的时间不超过10分钟。
本发明一些实施例的所述生物保存液应用于卵母细胞保存过程中，使用平衡液进行样本处理和使用玻璃化液进行样本处理的次数均至少为2。
本发明实施例还提供了所述生物保存液应用于卵巢组织保存过程，包括控制所述平衡液和所述玻璃化液的温度为10-25摄氏度，控制第一种解冻液的温度为30-40摄氏度，其余解冻液的温度为10-摄氏度，使用玻璃化液样本处理结束后进行液氮速冻保存。
本发明一些实施例的所述生物保存液应用于卵巢组织保存过程中，控制使用平衡液进行样本处理的时间不超过25分钟，使用玻璃化液进行样本处理的时间至少为10分钟直至所述玻璃化液中卵巢组织切片由悬浮状态下沉至容器底部，使用所述第一种解冻液进行的复苏时间不超过5分钟，使用所述其余解冻液分别进行的复苏时间不超过15分钟。
本发明实施例的统计学方法如下：实验结果数据利用GraphPadPrism8.0软件进行统计学分析；百分率的比较采用R×C表形式的χ2检验和Fisher确切概率法进行分析。
以下以具体的实施例进行详细说明：
实施例1-3提供的平衡液、玻璃化液和三种解冻液的具体组成和含量请分别对应参见表1-3.
表1
Figure BDA0003559543500000081
表2
Figure BDA0003559543500000091
表3
Figure BDA0003559543500000092
Figure BDA0003559543500000101
本发明实施例1-3中，采用6-8周龄的健康SPF级雌性KM小鼠(上海杰思捷实验动物有限责任公司)的卵母细胞进行冻存复苏实验，每只体重为20-25克。
卵母细胞的采集步骤如下：取12只6-8W雌性昆明小鼠，腹腔注射注射孕马血清促性腺激素PMSG(宁波第二激素厂)与人绒毛膜促性腺激素hCG(宁波第二激素厂)各10IU，PMSG和hCG的注射间隔48小时，在注射hCG后的12-15小时内处死小鼠，取小鼠部分子宫和输卵管。在体视镜下用注射器针头刺破输卵管膨大处，使得卵团流出，将获得的卵丘复合体移入到37℃、80IU/mL的透明质酸酶溶液中处理1-3min，去除颗粒细胞，收集形态正常且有第一极体的卵母细胞用于实验。
卵母细胞冻存过程和复苏过程具体为：
实验前平衡液和玻璃化液平衡至室温。
取适量平衡液和玻璃化液，分别制备3个平衡液液滴和2个玻璃化液液滴，每个液滴体积为50μl。
将卵母细胞在不同平衡液液滴中顺次平衡3min、5min和5min。
然后将经所述平衡液处理的卵母细胞转移至不同玻璃化液液滴中均处理30-45S。处理结束后，将卵母细胞迅速转移至冷冻载杆上，然后将冷冻载杆快速转入液氮速冻，并在液氮中盖上载杆套，将冷冻载杆转入液氮罐中冷冻保存。
本发明实施例1-3中，卵母细胞复苏过程具体为：
实验前解冻液1应先预热至37℃，解冻液2和解冻液3平衡至室温，提前准备好37℃操作温台。
将载有卵母细胞的冻存载杆从液氮中取出，载片浸入解冻液1中，将卵母细胞转移至2毫升解冻液1中平衡2min，然后将卵母细胞顺次转移至0.5毫升解冻液2和0.5毫升解冻液3中分别平衡5分钟和5分钟以完成复苏过程，并计算卵母细胞的存活率。另外，以取卵当日获得的新鲜卵母细胞作为对照组计算存活率。
本发明实施例1-3中，在卵母细胞复苏当天，处死6只10-12周龄的SPF级健康雄性KM小鼠(上海杰思捷实验动物有限责任公司)，用无菌方法取其附睾尾，置于37℃的500μlHTF液滴中，刺破附睾尾使精子充分游出并培养获能。卵母细胞复苏后在37℃，5％CO2培养箱中培养2小时，液滴中加入浓度2×106/毫升的精子进行体外受精。
卵母细胞体外受精4-6小时后将受精卵转移至培养液(Sigma)中继续培养，并在倒置显微镜下观察受精情况，计算受精率。将受精卵继续培养至96h观察并计算囊胚形成率。另外，以取卵当日获得的新鲜卵母细胞作为对照组，对照组除不冷冻保存外，其他操作同实验组。
统计上述各实施例的实验组和对照组回收到的卵母细胞个数、卵母细胞存活率、体外受精率和培养96h后囊胚形成率，结果请参见表4。
表4
分组 卵母细胞数/个 存活率 受精率 囊胚形成率
对照组 98 100％ 86.84±1.74％ 87.05±1.68％
实施例1 118 86.36±2.64％ 78.89±3.39％ 86.84±2.24％
实施例2 102 81.21±2.62％ 62.15±6.90％ 86.84±3.92％
实施例3 110 77.25±2.93％ 58.54±1.85％ 86.84±1.08％
实施例1、2和3各组数据与对照组的对应数据相比较P>0.05，均无显著性差异。
其中：
存活率＝存活的卵母细胞个数/回收到的卵母细胞个数；
受精率＝受精卵数/卵子总数；
囊胚形成率＝囊胚数/受精卵子数。
本发明实施例1-3中，取前述6-8周龄的健康SPF级雌性KM小鼠的卵巢组织片进行冻存和复苏。另外，以未经冻存处理的新鲜卵巢组织片为对照组。
卵巢组织片的获取过程为：取12只小鼠并处死，摘取双侧卵巢，将卵巢切割为若干厚度为1mm的卵巢组织片。
卵巢组织片的冻存过程具体为：
使用平衡至室温的平衡液和玻璃化液，以及上述平均厚度为1mm的卵巢组织片为实验材料。
将卵巢组织片浸没于平衡液中平衡处理25min后用无菌纱布吸去卵巢组织片表面的浮液。
然后再浸入玻璃化液中平衡至少15min直至卵巢组织片下沉至容器底部，处理结束后，将卵巢组织片平铺于组织支架上，用无菌纱布吸去浮液后连同组织支架快速浸入液氮中，静置至少5min。然后将组织支架移入已预冷的冻存管内并置于液氮罐中保存。
卵巢组织片的复苏过程具体为：
实验前先将解冻液1预热至37℃，解冻液2和解冻液3平衡至室温。
将载有卵巢组织片的组织支架从液氮中取出并移入解冻液1中，使卵巢组织片从组织支架上脱落并在5毫升的解冻液1中浸泡5min；然后将卵巢组织片转移至5毫升的解冻液2静置5min；最后将卵巢组织片转移至5毫升的解冻液3静置5min。
本发明实施例1-3中，将复苏后的卵巢组织片置于福尔马林中进行固定后脱水至透明，石蜡包埋后行厚度为4μm的连续切片，进行HE染色以对原始卵泡个数和形态进行分析，进行TUNEL染色以分析细胞凋亡情况。结果请参见表5。
表5
分组 原始卵泡数/个 正常原始卵泡率 凋亡细胞率
对照组 116 93.96±0.91％ 2.65±0.52％
实施例1 128 87.75±3.80％ 5.60±2.00％
实施例2 114 90.19±2.66％ 3.5±1.08％
实施例3 122 81.88±4.34％ 8.98±3.70％
实施例1、2和3各组数据与对照组的对应数据相比较P>0.05，均无显著性差异。
其中：
正常原始卵泡率＝正常原始卵泡数目/原始卵泡个数；
凋亡细胞率＝凋亡细胞数目/原始卵泡个数。
本发明实施例用来冻存保存和复苏的卵巢组织不限于片状，还可以是块状或整个卵巢。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims (17)

1.一种生物保存液，由平衡液、玻璃化液和N种解冻液组成，其特征在于，N为不小于2的正整数；
所述平衡液、所述玻璃化液和每种解冻液均包含组成和含量相同的基准液；
所述平衡液和所述玻璃化液还含渗透性冷冻保护剂和非渗透冷冻保护剂，所述解冻液还包含非渗透性冷冻保护剂；
所述玻璃化液中的非渗透冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的非渗透性冷冻保护剂的含量；
所述玻璃化液中的渗透性冷冻保护剂的含量高于所述平衡液中的渗透性冷冻保护剂的含量；
不同解冻液中的非渗透性冷冻保护剂的含量不同，随所述N次复苏过程逐步降低。
2.根据权利要求1所述的生物保存液，其特征在于，所述玻璃化液中的非渗透冷冻保护剂的含量是所述平衡液中的非渗透性冷冻保护剂的含量的8-30倍。
3.根据权利要求2所述的生物保存液，其特征在于，所述平衡液中的非渗透冷冻保护剂含有5-40mg/ml的人血白蛋白。
4.根据权利要求3所述的生物保存液，其特征在于，所述玻璃化液的非渗透冷冻保护剂具有与所述平衡液中相同含量的人血白蛋白，还含有0.1-2mol/L的蔗糖和海藻糖的任意一种。
5.根据权利要求1所述的生物保存液，其特征在于，所述玻璃化液中的渗透性冷冻保护剂的含量是所述平衡液中的渗透性冷冻保护剂的含量的0.8-1.5倍。
6.根据权利要求5所述的生物保存液，其特征在于，所述平衡液和所述玻璃化液中的任意一种的渗透性冷冻保护剂由体积百分比为2-30％的乙二醇和二甲基亚砜组成，所述玻璃化液的乙二醇含量高于所述平衡液的乙二醇含量，所述玻璃化液的二甲基亚砜含量高于所述平衡液的二甲基亚砜含量。
7.根据权利要求6所述的生物保存液，其特征在于，同一平衡液和同一玻璃化液的任意一种的乙二醇和二甲基亚砜具有相同的含量。
8.根据权利要求1所述的生物保存液，其特征在于，不同解冻液中的非渗透性冷冻保护剂含量随所述复苏过程逐步降低0.2-1倍。
9.根据权利要求8所述的生物保存液，其特征在于，以每种解冻液的体积计，不同解冻液的非渗透性冷冻保护剂均具有含量为5-40mg/ml的人血白蛋白，不同解冻液具有相同含量的人血白蛋白。
10.根据权利要求9所述的生物保存液，其特征在于，以每种解冻液的体积计，不同解冻液的非渗透性冷冻保护剂均具有含量为0.05-3mol/L的蔗糖和海藻糖的任意一种，不同解冻液的蔗糖和海藻糖中任意一种的含量随所述N次复苏过程逐步降低。
11.根据权利要求1所述的生物保存液，其特征在于，所述基准液含有0.1-10mmol/L的抗氧化剂。
12.根据权利要求11所述的生物保存液，其特征在于，所述基准液还具有营养剂、能量物质、缓冲剂、抗菌剂以及pH调节剂。
13.如权利要求1-12任一项所述的生物保存液应用于卵母细胞冻存和复苏过程，其特征在于，控制所述平衡液和所述玻璃化液的温度为10-25摄氏度，控制第一种解冻液的温度为30-40摄氏度，其余解冻液的温度为10-25摄氏度。
14.根据权利要求13所述的应用于卵母细胞冻存和复苏过程，其特征在于，控制使用所述平衡液进行样本处理的时间不超过10分钟，使用所述玻璃化液进行样本处理的时间不超过5分钟，使用所述第一种解冻液进行复苏的时间不超过3分钟，使用所述其余解冻液分别进行复苏的时间不超过10分钟。
15.根据权利要求13所述的应用于卵母细胞冻存和复苏过程，其特征在于，使用平衡液和玻璃化液进行样本处理的次数均至少为2。
16.如权利要求1-12任一项所述的生物保存液应用于卵巢组织冻存和复苏过程，其特征在于，控制所述平衡液和所述玻璃化液的温度为10-25摄氏度，控制第一种解冻液的温度为30-40摄氏度，其余解冻液的温度为10-25摄氏度，使用所述玻璃化液进行样本处理结束后进行液氮速冻保存。
17.根据权利要求16所述的生物保存液应用于卵巢组织冻存和复苏过程，其特征在于，控制使用所述平衡液样本处理的时间不超过25分钟，使用所述玻璃化液样本处理的时间至少为10分钟直至卵巢组织切片下沉至容器底部，使用所述第一种解冻液进行复苏的时间不超过10分钟，使用所述其余解冻液分别进行的复苏过程时间不超过15分钟。
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