CN113462518A - 一种用于提取微量新鲜外周血有核细胞蛋白的方法及其专用装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于临床微量新鲜外周血制备PBMC蛋白的方法，该方法操作简单，且在血液起始量低的情况下蛋白回收率能达到后续分析要求。本方法实现了提取20μL～120μL新鲜外周血PBMC蛋白，较大程度上减少了所需临床新鲜外周血样本体积和病患负担。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组领域，具体涉及一种蛋白质组学微量样品制备方法，该方法操作简单快捷，在微量血液样品中外周血单核细胞蛋白组学制备方面有着优越的性能。
背景技术
新鲜外周血由血清、血细胞和血小板等构成，其中血细胞又分为红细胞(RBC)和白细胞(WBC)。新鲜外周血单个核细胞(PBMC)是新鲜外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。红细胞和多核白细胞的比重在1.092左右，单个核细胞的比重为1.075-1.090，血小板为1.030-1.035。因此利用一种介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心液，使不同的细胞按相应密度梯度在不同高度分布，红细胞与白细胞在最底层，密度梯度离心液在第二层，PBMC分布在第三层，血小板与血浆分布最上层。目前还没有提取微升血液中PBMC的方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质组学微量血液样品制备装置，我们将其命名为PBMC-mCap。该装置制作方法简单快速，成本低廉，常规实验室、临床医学检验均可完成操作。本装置可用于微升级血液样本PBMC的提取，先用该装置提取PBMC，再提取蛋白并消化成肽段，最后可进行微克蛋白的蛋白质组学研究。该装置实现了微升级血液PBMC的高效俘获，减少了对临床病患新鲜外周血样本体积的需求。
本发明所提供的蛋白质组学微量血液样品制备装置，是以一封闭底部尖头的200μL的移液枪头(PBMC-mCap)作为提取PBMC的分离容器，根据血中不同细胞密度不同的特点，先加入密度稍大于PBMC但小于WBC的密度梯度离心液(LymphoprepTM淋巴细胞分离液)，离心时实现血液中血细胞的分层，使得PBMC能吸附在PBMC-mCap上，从而满足微量样品制备PBMC的需求。
本发明还提供了上述蛋白质组学微量血液样品制备装置的制备方法。
本发明所提供的蛋白质组学微量血液样品制备装置的制备方法，包括以下步骤：
(a)PBMC-mCap制作：将200μL移液枪头尖头底部封闭，以制备细长的分离反应池PBMC-mCap；
(b)清洗PBMC-mCap：待PBMC-mCap封闭冷却后，使用乙腈清洗PBMC-mCap；
上述方法步骤(a)中，封闭尖头底部的方法可使用酒精灯外焰迅速封闭移液枪枪头底部、或者使用其他能封闭移液枪头底部的方法，如直接生产封闭底部移液枪枪头和附有移液枪头盖等方式。
进一步的，PBMC-mCap离心装置制作：在1.5mL离心管上加入一个适配器，再将PBMC-mCap作为分离容器置于其适配器上方固定于1.5mL体积EP管中，以便于后续离心步骤。
本发明还提供了一种提取微量血液样品中外周血单个核细胞(PBMC)的方法。
本发明所提供的提取微量血液样品PBMC的方法，包括下述步骤：
(1)在PBMC-mCap中加入常温密度梯度离心液，分别将血液样品用PBS缓冲液体积比1：1稀释后小心的平铺于常温密度梯度离心液表面；
(2)离心分离PBMC：加入血样后，用封口膜封闭PBMC-mCap顶部后小心的置于离心机中，离心；
(3)分离PBMC层：先用200μL Pipette Tip移液枪枪头移除上层血浆与血小板，再换个Pipette Tip移液枪枪头取PBMC层置于1.5mL离心管中；
(4)裂红：在含PBMC的离心管中加入1mL红细胞裂解液，摇晃后，冰上静置后离心，裂解PBMC中残留的红细胞；
(5)清洗PBMC：离心后用移液枪小心移除上清液体，再加入1mL PBS缓冲液离心，最后移除上清；
(6)收集PBMC：在清洗后的PBMC中加入少量PBS缓冲液，再离心，移除所有上清，收集PBMC沉淀。
上述方法步骤(1)中，所述密度梯度离心液具体LymphoprepTM淋巴细胞分离液。所述血液样品与所述密度梯度离心液的体积比为1：0.5-2，具体如1:1。加入所述血液样品的体积可在20μL～120μL，加入血液样品和密度梯度离心液总体积小于300μL。
所述血液样品具体可为新鲜外周血，优选为取出体内24h的新鲜外周血。
上述方法步骤(2)中，所述离心的条件为：1180g离心10min。
上述方法步骤(4)中，所述红细胞裂解液为氯化铵红细胞裂解液(STEMCELL)。
上述方法步骤(4)中，加入红细胞裂解液后，不可反复剧烈摇晃PBMC混悬液，轻微摇晃后必须静置10min。所述离心的条件为：300g离心8min。
上述方法步骤(5)中，移液枪移除的表面液体根据离心后PBMC分布的高度决定，第一次移除上清液体不小于800μL，第二次移除上清不小于1ml。
上述方法步骤(5)中，移除所有上清时使用200μL的Pipette Tip移液枪枪头移除；所述200μL的Pipette Tip移液枪枪头不可碰到底部PBMC沉淀。
所述离心的条件为：300g离心8min。
上述方法步骤(6)中，所述PBS缓冲液的用量可为200μL。
所述离心的条件为：1200g离心5min。
本发明中所述PBS缓冲液的pH值均为7.3～7.5。
本方法原创性地封闭200μL移液枪枪头(Tip)尖头部分，先在Tip头中加入一定量的密度梯度离心液，再将微量新鲜外周血与等量PBS缓冲液混合均匀后，小心的平铺在密度梯度离心液表面，离心后PBMC层会大部分紧贴于Tip头壁上，一部分悬浮在贴壁PBMC旁边，形成PBMC层，再用Pipette Tip移液枪枪头取出PBMC层进行裂红、清洗和蛋白提取。基于血液中不同细胞成分的密度差异，可用密度梯度离心法分离，利用与PBMC密度稍大的密度梯度分离液将PBMC层从白细胞中分离纯化。
本方法利用Tip头体积小、形成微量反应池的特点，使微量PBMC能明显分层便于提取，最后加入50％三氟乙醇(TFE)，冰上水浴超声裂解蛋白。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的装置大大降低了血液起始量，满足了临床上血液样本较少样本的蛋白质组学研究需求。
2、在血液样本较少的情况下得到的肽段回收率和蛋白鉴定量满足后续数据分析需求。
3、创造性的提出了提取微升级血液PBMC方法。
4、提取微量新鲜外周血可深入到微量蛋白组学研究，实现微克蛋白和更高灵敏度样品生物分析的制备。
本发明提供的装置制作简单，成本低廉，易于操作。
附图说明
图1为微量新鲜外周血PBMC样品制备装置的简易示意图。
图2为三男三女100μL新鲜外周血PBMC全蛋白银染SDS-PAGE图。
图3为100μL新鲜外周血来源PBMC蛋白质组分析蛋白和肽段鉴定量结果直方图；ATF1-ATF3：三名成年健康女性样本；ATM1-ATM3：三名成年健康男性样本。
图4为100μL新鲜外周血PBMC蛋白质组分析实验肽段漏切率直方图；ATF1-ATF3：三名成年健康女性样本；ATM1-ATM3：三名成年健康男性样本。
图5为三男三女100μL新鲜外周血PBMC蛋白质组分析结果的皮尔森相关性分析。
图6为三男三女100μL新鲜外周血PBMC蛋白质组分析总离子流图。
图7为三男三女100μL新鲜外周血PBMC全蛋白蛋白质组分析差异分析热图LogFC＝1，P.valμe＝0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1：微量新鲜外周血制备PBMC装置的制作及操作流程
(1)PBMC-mCap的制作：使用酒精灯外焰迅速封闭200μL移液枪头尖头底部或者使用其他能封闭移液枪头底部的方法。
(2)清洗PBMC-mCap：待PBMC-mCap封闭冷却后，使用乙腈清洗Tip。
(3)加入样本：先将6只PBMC-mCap置于有适配器的1.5mL离心管上，分别再加入100μL常温密度梯度离心液(LymphoprepTM淋巴细胞分离液)，分别将100μL新鲜外周血用PBS(PH为7.3～7.5)按体积比为1：1稀释后平铺于密度梯度离心液表面。
(4)离心分离PBMC：加入血样后，用封口膜封闭PBMC-mCap顶部，小心的置于离心机中1180g常温离心10min。
(5)分离PBMC层：先用200μL Pipette Tip移液枪枪头移除上层血浆与血小板，再换个Pipette Tip移液枪枪头取PBMC层置于1.5mL离心管中；
(6)裂红：在PBMC离心管中加入1mL红细胞裂解液，摇晃后，冰上静置10min后300g离心8min，裂解PBMC中残留的红细胞。
(7)清洗PBMC：离心后用移液枪小心移除上清，再加入1mL PBS 300g离心8min，最后移除上清。
(8)收集PBMC：在清洗后的PBMC中加入少量PBS，再1200g离心5min后，移除所有上清，收集PBMC沉淀。
按照上述实施例1的实验条件制作出蛋白质组学血液微量样品制备装置。如图1所示为本实施例的微量血液样品制备装置的简易图。由图可知该装置由200μL体积的PBMC-mCap组成，PBMC-mCap中加入的密度梯度离心液可用于不同血细胞的分层。PBMC-mCap被封住底部，起到了反应池的作用，与常规离心管相比，其提取微量血液PBMC层分层更明显，且在小容器环境下最大程度的降低了样品的损失，同时PBMC分层后可用Pipette Tip移液枪枪头提取PBMC，并转移至1.5mL离心管中。
实施例2：男女健康人PBMC全蛋白提取实验
(1)用50μL以50mM的碳酸氢铵(ABC)为溶剂的50％三氟乙醇(TFE)裂解液加入按照实施例1方法获得的男女健康人PBMC细胞沉淀中，冰上水浴超声30min，得到全蛋白悬液。
(2)上述全蛋白悬液取5μL采用SDS-PAGE凝胶电泳并银染定量，定量表示100μL新鲜外周血获得约20～25μg PBMC全蛋白。
如图2所示为实施例2的微量新鲜外周血PBMC以50％TFE溶液裂解，上样2μg对蛋白进行15％浓度的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，根据分子量的不同蛋白质在电泳中分离，形成不同的条带。
实施例3：男女健康人PBMC全蛋白消化实验
(1)取约20μg蛋白置低吸附离心管中，加入二硫苏糖醇(DTT)，终浓度为2mM，放入57℃恒温箱还原反应1h；再加入碘乙酰氨(IAA)，终浓度为8mM，常温避光烷基化反应30min；再次加入二硫苏糖醇(DTT)，终浓度为2mM常温反应30min。DTT和IAA均用纯水溶解。
(2)将上述还原烷基化后样本45℃真空浓缩至5～10μL，加入40μL新配制的消化液(10％TFE(50mM ABC)+1:50(w/w)的酶/蛋白质比例胰蛋白酶+以1:50(w/w)的酶/蛋白质比例加入胞内蛋白酶(Lys-C)。
(3)加入终浓度为1mM的氯化钙溶液，氯化钙溶液以10％TFE(50mM ABC)溶剂稀释，在37℃下孵育过夜酶解消化PBMC全蛋白。
(4)反应过夜后，在酶切液加入终浓度为1％的三氟乙酸(TFA)，样本45℃真空浓缩至5～10μL。
(5)在浓缩后样本中加入100μL的0.2％TFA+2％ACN溶液。
(6)制备C18-Tip脱盐柱：C18-Tip中加上5层筛板。
(7)上述C18-Tip活化：在C18-Tip中加入200μL纯乙腈(ACN)，用1mL注射器推除液体，重复一次；其次，在C18-Tip中加入200μL 50％ACN+0.1％TFA溶液，用1mL注射器推除液体；最后，在C18-Tip中加入200μL 0.1％TFA溶液，注射器推除液体。
(8)C18-Tip脱盐：将步骤7样本加入C18-Tip中，在C18-Tip中加入100μL0.1％TFA溶液，并重复一次，最后用50μL 50％ACN+0.1％TFA洗脱肽段，重复两次，收集洗脱液置于45℃真空热干机中热干，-20℃储存备用。
(9)0.1％FA溶液复溶肽段，采用Nanodrop测肽段浓度，取2μg用液质联用质谱仪分析。
按照上述实施例3的实验条件对PBMC全蛋白进行消化，并使用LC-MS进行质谱分析。如图3所示为本实施例健康三男三女的100μL新鲜外周血提取PBMC的约20μg全蛋白蛋白质组分析实验蛋白和肽段鉴定量结果直方图。由图可知实验肽段鉴定量在50000左右，蛋白鉴定量在5900左右。此样品采用QE-HF质谱仪分析，并由Spectronaμt软件对质谱仪产出结果搜库。
如图4所示为本实施例健康三男三女的100μL新鲜外周血提取PBMC的约20μg全蛋白蛋白质组分析实验肽段漏切率直方图。由图可知三男三女6个样本的实验肽段漏切均在19％左右，此结果完全可以满足肽段定量分析的要求。
上述结果表明，该制备方法在微量新鲜外周血样品的蛋白质组分析中具有实用性。
如图5所示为本实施例健康三男三女的100μL新鲜外周血提取的PBMC全蛋白蛋白质组分析的皮尔森相关性分析。由图可知多个样本的皮尔森相关性分析R2>0.92，说明多个实验样本间有很好的相关性。
按照上述实施例3的实验条件对三男三女的100μL新鲜外周血提取的PBMC全蛋白进行酶切制备，并使用QE-HF对其进行质谱分析。
上述结果表明，该技术在微量复杂新鲜外周血生物样品的蛋白组学分析中具有实用性。
如图6所示为三男三女的100μL新鲜外周血采用PBMC-mCap获得的蛋白进行TFE溶液酶切后的LC-MS/MS的总离子流图。由图可知，基于LC-MS/MS此技术可以观察到该方法制备的样本差异极小。并且在六个样本中均鉴定到相近相同数目的蛋白。
如图7所示为健康三男三女的100μL新鲜外周血采用PBMC-mCap全蛋白蛋白质组分析后使用R语言对健康三男三女的差异基因进行分析。在P.valμe＝0.05,LogFC＝1条件下，鉴定到共63个差异基因，其中女/男上调35个基因，下调为27个基因。
上述结果表明，该技术在多个微量血液样品的蛋白组学分析中具有较好的相关性以及可满足用于后续生信分析需要。
Claims (10)
1.一种蛋白质组学微量血液样品制备装置，其特征在于：是以一封闭底部尖头的200μL的移液枪头作为提取PBMC的分离容器。
2.权利要求1所述蛋白质组学微量血液样品制备装置的制备方法，包括以下步骤：
(a)将200μL移液枪头尖头底部封闭，以制备细长的分离反应池PBMC-mCap；
(b)清洗PBMC-mCap：待PBMC-mCap封闭冷却后，使用乙腈清洗PBMC-mCap，即得所述蛋白质组学微量血液样品制备装置。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(a)中，封闭尖头底部的方法包括使用酒精灯外焰迅速封闭移液枪枪头底部、或者使用其他能封闭移液枪头底部的方法，包括直接生产封闭底部移液枪枪头和附有移液枪头盖的方式。
4.一种提取微量血液样品中外周血单个核细胞的方法，包括下述步骤：
(1)在权利要求1所述的蛋白质组学微量血液样品制备装置中加入常温密度梯度离心液，分别将血液样品用PBS缓冲液体积比1：1稀释后平铺于所述常温密度梯度离心液表面；
(2)离心分离PBMC：用封口膜封闭所述蛋白质组学微量血液样品制备装置的顶部，并置于离心机中，离心；
(3)分离PBMC层：先用200μL Pipette Tip移液枪枪头移除上层血浆与血小板，再用新的Pipette Tip移液枪枪头取PBMC层置于1.5mL离心管中；
(4)裂红：在含PBMC的离心管中加入1mL红细胞裂解液，摇晃后，冰上静置后离心，裂解PBMC中残留的红细胞；
(5)清洗PBMC：离心后用移液枪小心移除上清液体，再加入1mL PBS缓冲液离心，最后移除上清；
(6)收集PBMC：在清洗后的PBMC中加入PBS缓冲液，再离心，移除所有上清，收集沉淀，即得。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述密度梯度离心液为氯化铵红细胞裂解液(STEMCELL)；所述血液样品与所述密度梯度离心液的体积比为1：0.5-2；加入所述血液样品的体积可在20μL～120μL，加入血液样品和密度梯度离心液总体积小于300μL；
所述血液样品为新鲜外周血，优选为取出体内24h的新鲜外周血。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述离心的条件为：1180g离心10min。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述红细胞裂解液为氯化铵红细胞裂解液；
所述步骤(4)中，加入红细胞裂解液后，不可反复剧烈摇晃PBMC混悬液，轻微摇晃后必须静置10min；所述离心的条件为：300g离心8min。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，移液枪移除的表面液体根据离心后PBMC分布的高度决定，第一次移除上清液体不小于800μL，第二次移除上清不小于1ml。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，移除所有上清时使用200μL的Pipette Tip移液枪枪头移除；所述200μL的Pipette Tip移液枪枪头不可碰到底部PBMC沉淀；所述离心的条件为：300g离心8min。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，所述PBS缓冲液的用量为200μL；所述离心的条件为：1200g离心5min；
所述步骤(1)、(5)、(6)中所述PBS缓冲液的PH为7.3～7.5。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101013069A (zh) * | 2007-02-09 | 2007-08-08 | 中国农业大学 | 一种少量游离细胞或微小样品收集器 |
| US20080132874A1 (en) * | 2005-08-10 | 2008-06-05 | The Regents Of The University Of California | Collection tubes appratus, systems, and methods |
| US20120309636A1 (en) * | 2011-01-21 | 2012-12-06 | Ian Gibbons | Systems and methods for sample use maximization |
| CN105238756A (zh) * | 2015-10-27 | 2016-01-13 | 上海百众源生物科技有限公司 | 一种脐带血单核细胞的制备方法 |
| CN106244553A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-12-21 | 厦门人瑞生物医药科技有限公司 | 循环肿瘤细胞的分离和检测方法 |
| WO2020107495A1 (zh) * | 2018-12-01 | 2020-06-04 | 铭道创新（北京）医疗技术有限公司 | 一种用于流式细胞仪分析的淋巴细胞样品的制备方法 |
| CN111521473A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-08-11 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种用于蛋白质组学微量样本制备的装置 |
| CN112458051A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-03-09 | 海南优尼科尔生物科技有限公司 | 一种外周血单个核细胞的提取收集方法 |
| KR20210049569A (ko) * | 2019-10-25 | 2021-05-06 | 주식회사 싸이토딕스 | 역류 원심분리를 이용한 ctc 분리방법 |
-
2021
- 2021-07-06 CN CN202110764088.4A patent/CN113462518A/zh active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080132874A1 (en) * | 2005-08-10 | 2008-06-05 | The Regents Of The University Of California | Collection tubes appratus, systems, and methods |
| CN101013069A (zh) * | 2007-02-09 | 2007-08-08 | 中国农业大学 | 一种少量游离细胞或微小样品收集器 |
| US20120309636A1 (en) * | 2011-01-21 | 2012-12-06 | Ian Gibbons | Systems and methods for sample use maximization |
| CN106244553A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-12-21 | 厦门人瑞生物医药科技有限公司 | 循环肿瘤细胞的分离和检测方法 |
| CN105238756A (zh) * | 2015-10-27 | 2016-01-13 | 上海百众源生物科技有限公司 | 一种脐带血单核细胞的制备方法 |
| WO2020107495A1 (zh) * | 2018-12-01 | 2020-06-04 | 铭道创新（北京）医疗技术有限公司 | 一种用于流式细胞仪分析的淋巴细胞样品的制备方法 |
| CN111527406A (zh) * | 2018-12-01 | 2020-08-11 | 铭道创新（北京）医疗技术有限公司 | 一种用于流式细胞仪分析的淋巴细胞样品的制备方法 |
| US20220018745A1 (en) * | 2018-12-01 | 2022-01-20 | Mingdao Innovation (Beijing) Medical-Tech Co., Ltd. | A method for preparing lymphocyte sample for flow cytometry analysis |
| KR20210049569A (ko) * | 2019-10-25 | 2021-05-06 | 주식회사 싸이토딕스 | 역류 원심분리를 이용한 ctc 분리방법 |
| CN111521473A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-08-11 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种用于蛋白质组学微量样本制备的装置 |
| CN112458051A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-03-09 | 海南优尼科尔生物科技有限公司 | 一种外周血单个核细胞的提取收集方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YANG, L ET AL.: "Strategy for Microscale Extraction and Proteome Profiling of Peripheral Blood Mononuclear Cells", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 94, no. 25, pages 8827 - 8832 * |
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