CN117925374A - 一种细胞高温复苏方法及细胞复苏器 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细胞高温复苏方法及细胞复苏器，所述方法包括以下步骤：启动细胞复苏器，先加热至复苏温度，再将盛有待复苏细胞的冻存管置于细胞复苏器的振荡托盘的孔位中，进行振荡复苏，至水浴状态结束；改变复苏状态，振荡托盘螺旋上升至离开水面，处于出浴状态，取出复苏后的细胞样本。本发明通过对细胞复苏工艺的调控，可实现快速复苏，达到速融效果，提高细胞活率，并通过在配套的细胞复苏器中设置振荡托盘、转轴及固定件，控制振荡托盘在水浴时的回旋振荡及水浴后振荡托盘的螺旋上升，提高细胞复苏的效率，减少污染；所述细胞复苏器对内部空间要求较小，设备成本低，应用范围更广。

Description

一种细胞高温复苏方法及细胞复苏器

技术领域

本发明属于细胞保存及复苏技术领域，涉及一种细胞高温复苏方法及细胞复苏器。

背景技术

在细胞的研究过程中，为保证其能够长期使用，在研究间隙需要对其进行保存，通常采用液氮冻存的方式，研究需要时再取出冻存细胞进行复苏。细胞复苏是指将在液氮中冷冻保存的细胞取出，置于37℃水浴条件下升温，使其快速融化，恢复细胞活力的过程。为避免冷冻细胞复苏时，因细胞重结晶造成的损伤或因冷冻保护剂对细胞的毒害作用，需要在尽可能短的时间内完成复苏操作。

传统的细胞复苏方式是将冻存管置于水浴锅中，依靠人工手持止血钳夹住冻存管进行晃动完成复温过程，但是人工操作无法保证晃动的角度和速度一致，对于不同冻存管样品造成的误差较大，而且容易在管口残留水滴造成污染；此外，传统的细胞复苏方式自动化程度低，无法实现批量操作，因而需要对细胞复苏器进行设计与改进。同时，基于细胞复苏需要快速完成，高温复苏开始受到关注，即通过提高细胞复苏的温度，使得细胞迅速升温，既可减少细胞复苏的时间，也能够减少重结晶造成的细胞损伤。

CN 105199950A公开了一种细胞复苏器，该复苏器包括水浴锅、升降机构、承载装置和控制器，所述承载装置设置在升降机构上，所述控制器与升降机构电连接，用于控制升降机构的运动并将承载装置放入水浴锅中。该复苏器通过承载装置与升降装置可以在水浴锅中实现大批量的细胞复苏，并通过两层隔离套实现干湿分离，避免污染，但该装置的冻存管承载装置无法实现晃动功能，复苏时间长，无法达到快速融化的目的，且容易造成细胞复苏不均匀。同时该专利研究的是两种细胞系SMMC 7721细胞和hybridoma细胞，没有涉及原代细胞，适用的细胞种类有限。

CN 209974800U公开了一种细胞复苏装置，该装置包括壳体、板架摇晃装置、控制装置、接线插座、水阀开关、电磁阀、电热管、水泵、T型三通接头和传感器，所述板架摇晃装置设置于壳体内，所述接线插座设于外壳箱体后侧，水阀开关一端与外部水管连接，另一端通过水管与T型三通接头连接，T型三通接头再与水泵连接，水泵设置于底板上且位于电磁阀一侧，电磁阀与水阀开关电性连接。该装置在能够实现大批量细胞复苏的复苏装置基础上，增加了一个板架摇晃装置，该装置能够带动冻存管盛放板往复摇晃，达到振荡复苏的效果，但是往复摇晃方式需要水浴锅内预留较大空间，且左右往复摇晃可能会造成水面波动剧烈，溅起的水滴会黏附在冻存管外壁，容易造成污染。

综上所述，对于细胞复苏的方法及配套装置的选择，需要能够实现批量操作以及振荡效果，同时缩短细胞复苏时间，减少细胞的损伤，提高细胞的活率。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提出一种细胞高温复苏方法及细胞复苏器，通过对细胞复苏工艺的调控，实现快速复苏，并提高细胞活率，并通过配套的细胞复苏器中转轴和固定件的组合，使得振荡托盘能够上下升降，既可提高细胞复苏的效率，又可避免水溅射可能造成的污染；所述细胞复苏器可实现批量操作，能够保持不同批次的一致性，且对内部空间要求较小，设备成本较低。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种细胞高温复苏方法，所述方法包括以下步骤：

（1）启动细胞复苏器，先加热至复苏温度，再将盛有待复苏细胞的冻存管置于细胞复苏器的振荡托盘的孔位中，进行振荡复苏，至水浴状态结束；

（2）水浴状态结束后，改变复苏状态，振荡托盘螺旋上升至离开水面，处于出浴状态，取出复苏后的细胞样本。

本发明中，根据细胞冻存后的特性，其复苏所需的环境条件为水浴，为便于实现批量化、自动化操作，通常需要对常规的细胞复苏工艺进行改进，通过提高复苏温度，缩短复苏的时间，达到速融效果，并提高细胞活率；所述细胞复苏的自动化操作能够保证不同批次细胞复苏操作的一致性，极大地提高工作效率。

以下作为本发明优选的技术方案，但不作为本发明提供的技术方案的限制，通过以下技术方案，可以更好地达到和实现本发明的技术目的和有益效果。

作为本发明优选的技术方案，步骤（1）所述待复苏细胞包括免疫细胞，优选为PBMC细胞。

优选地，所述细胞是由液氮进行冷冻保存，所述冻存管的规格包括2mL冻存管和5mL冻存管。

优选地，所述冻存管中的细胞与冻存液混合均匀，以细胞悬液的形式存在。

本发明中，对于2mL规格冻存管中，加入1mL细胞悬液进行复苏；对于5mL规格冻存管中，加入4mL细胞悬液进行复苏。

作为本发明优选的技术方案，步骤（1）所述细胞复苏启动时，通电后先设定复苏程序，包括复苏温度、振荡模式以及振荡时长的设定。

优选地，步骤（1）在放入冻存管之前先进行加热，至复苏温度达到60~70℃，例如60℃、62℃、65℃、68℃或70℃等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。

优选地，步骤（1）在放入冻存管之后，自动复苏程序开启，电机带动转轴转动，振荡托盘做平面回旋振荡运动，直至复苏时间结束。

优选地，步骤（1）所述振荡托盘回旋转动的速率为1~30s/cycle，例如1s/cycle、5s/cycle、10s/cycle、15s/cycle、20s/cycle、25s/cycle或30s/cycle等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。

优选地，步骤（1）所述振荡复苏的时间为60~140s，例如60s、65s、70s、80s、90s、100s、110s、120s、130s或140s等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。

本发明中，所述复苏程序启动时设定水浴温度，振荡模式和振荡时间等参数，参数确认后先达到水浴温度条件，再将待复苏细胞从液氮中取出，插入到振荡托盘的对应孔位中，参数和样品均确认后，打开振荡开关，振荡托盘开始水平回旋振荡，数字显示屏实时显示复苏器内水浴温度以及振荡倒计时，时间到振荡即停。

本发明中，所述细胞复苏振荡的时间可在正常复苏时间加减20s的范围内选择，而正常复苏时间则根据冻存管中待复苏的细胞量及复苏条件相关。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）所述复苏状态的改变，使得振荡托盘螺旋上升，离开水面，复苏结束。

优选地，所述振荡托盘的上升速率为1~10cm/s，例如1cm/s、2cm/s、3cm/s、4cm/s、5cm/s、6cm/s、8cm/s或10cm/s等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。

本发明中，所述复苏状态的改变，由卡扣与固定件结合引起，使得电机带动转轴转动时，固定件无法转动，固定件与转轴相对位置改变，转轴沿螺纹段转动而螺旋上升，并带动振荡托盘螺旋上升，离开水面，复苏结束；此时冻存管外壁上黏附的水滴被瞬时离心甩弃，结束水浴，水浴盖打开，立即取出冻存管。

优选地，步骤（2）所述复苏后的细胞样本取出后，开启复位模式，振荡托盘螺旋下降回到初始状态。

优选地，步骤（2）所述复苏后的细胞样本取出后，转移至培养基中，再进行离心分离，弃上清保留细胞沉淀，再加入培养基以重悬细胞，取细胞悬液与染料混合，以检测细胞活率。

另一方面，本发明提供了一种细胞复苏器，上述细胞高温复苏方法采用所述细胞复苏器进行，所述细胞复苏器包括水浴装置，所述水浴装置内设有振荡托盘、转轴、固定件和电机，所述振荡托盘呈圆盘状，沿圆周设有孔位，所述振荡托盘中间位置下方连接转轴，所述转轴呈圆柱状，包括螺纹段和竖纹段，所述螺纹段位于竖纹段上方；

所述固定件的中间位置开贯穿孔，所述贯穿孔的内壁上设有螺纹，所述转轴穿过固定件的贯穿孔，所述转轴上的螺纹段与贯穿孔上的螺纹适配；所述电机与转轴上的竖纹段适配。

本发明中，根据细胞冻存后的特性，其复苏所需的环境条件为水浴，为便于实现批量化、自动化操作，通常需要对常规的水浴器进行结构改进，本发明在水浴装置中设置振荡托盘，以此实现不同规格冻存管中细胞的批量复苏；再通过转轴及固定件的设置，可以控制振荡托盘在水浴时的回旋振荡以及水浴后振荡托盘的螺旋上升，以此保证冻存管内细胞受热均匀，提高细胞复苏的效率，并减少可能造成的水污染；所述细胞复苏器的自动化操作能够保证不同批次细胞复苏操作的一致性，且对内部空间要求较小，占地面积小，设备成本低，可实施性较高，应用范围更广。

作为本发明优选的技术方案，所述振荡托盘上的孔位至少设有一圈，例如一圈、两圈或三圈等，每圈上的孔位均匀分布。

优选地，所述振荡托盘上的孔位包括两圈及以上时，适用于不同规格的冻存管。

本发明中，根据振荡托盘的结构特点，内圈的孔位数一般小于外圈，例如内圈设8个孔位，外圈设10个孔位。

优选地，所述转轴上还包括光滑段，所述光滑段位于上部位置，所述螺纹段位于中部位置，所述竖纹段位于下部位置。

优选地，所述螺纹段和竖纹段的长度独立地为5~25cm，例如5cm、8cm、10cm、12cm、15cm、18cm、20cm或25cm等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。

优选地，所述螺纹段和竖纹段的长度比为(0.5~2):1，例如0.5:1、0.67:1、0.75:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.25:1、1.5:1、1.8:1或2:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。

本发明中，所述转轴可选择长圆柱状的螺杆或螺柱，根据水浴装置内部的大小，不一定需要设置光滑段，可以延长螺纹段和竖纹段，便于更大长度范围内的移动。

作为本发明优选的技术方案，所述固定件包括螺母。

优选地，所述固定件在水浴装置中的纵向位置固定，即相对于水浴装置底部的高度不变。

优选地，所述水浴装置内还设有卡扣，所述卡扣的一端焊接固定于水浴装置内壁上，另一端与固定件可拆卸式结合。

本发明中，所述卡扣可选择金属部件，其与螺母的结合关系是影响水浴装置内部结构相对位置的重要因素，卡扣与螺母由未结合转为结合状态，螺母的运动状态改变，带动转轴、振荡托盘的运动，使得振荡托盘由水平回旋振荡运动转化为螺旋上升或下降运动。

优选地，所述电机通过控制转轴上的竖纹段带动转轴转动。

优选地，所述电机及转轴进行顺时针转动-逆时针转动的水平回旋转动。

优选地，每次回旋转动中顺时针和逆时针转动的角度均为45~450度，例如45度、90度、135度、180度、225度、270度、315度、360度、405度或450度等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。

作为本发明优选的技术方案，所述转轴转动时，根据转轴和固定件之间是否存在相对运动，确定振荡托盘的位置。

优选地，所述卡扣与固定件未结合时，固定件随转轴转动，相对位置保持不变，振荡托盘进行回旋振荡运动。

优选地，所述卡扣与固定件结合时，固定件不随转轴转动，转轴的螺纹段发生螺旋运动，带动振荡托盘进行螺旋上升或下降运动。

本发明中，电机通过控制转轴上的竖纹段使转轴进行转动时，当卡扣与螺母未结合，螺母正常转动，螺母和转轴保持相对位置不变，共同进行顺时针半圈、逆时针半圈的回旋转动，此时振荡托盘也进行水平回旋振荡运动；当卡扣与螺母结合，电机带动转轴转动时，螺母无法转动，转轴通过竖纹段发生螺旋运动，螺母和转轴相对位置改变，此时振荡托盘进行螺旋上升或下降运动。

作为本发明优选的技术方案，所述水浴装置的外表面上设有按键、开关、数字显示屏和电源插孔。

优选地，所述按键包括模式设置键、增减调节键、确认键。

优选地，所述开关包括电源开关和振荡开关。

本发明中，所述模式设置键调节设定水浴温度、振荡模式和振荡时间，所述增减调节键用于增加或减小设定的水浴温度和振荡时间，所述确认键用于确认所设定的温度值和振荡时间；所述振荡开关用于启动或关闭振荡程序。

优选地，所述数字显示屏上显示水浴温度和剩余振荡时间，所述数字显示屏还连接报警装置。

本发明中，所述数字显示屏可以显示实时监测的水浴温度值以及剩余振荡时间；数字显示屏连接报警装置，当实际监测温度超出预设范围，该数字显示屏自动报警，可提醒操作人员及时发现应对。

优选地，所述水浴装置的顶部设有水浴盖，所述水浴装置的底部设有垫脚。

本发明中，所述水浴盖的结构可分为两部分，外边缘可选择金属材质，如304不锈钢，而中间部分选择透明材料，如高硼硅玻璃，便于观测水浴装置内部情况；所述水浴盖能够起到保温作用，同时可保证复苏过程中水分不溅出，保证外部环境的整洁。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明采用高温复苏的方式，可有效缩短细胞复苏时间，达到速融效果，提高细胞活率；

（2）本发明通过在细胞复苏器中设置振荡托盘，以此实现不同规格冻存管中细胞的批量复苏，再通过转轴及固定件的设置，可以控制振荡托盘在水浴时的回旋振荡以及水浴后振荡托盘的螺旋上升，以此保证冻存管内细胞受热均匀，提高细胞复苏的效率，并减少可能造成的水污染；

（3）本发明所述细胞复苏器能够实现恒定温度，进行实时监测，其自动化操作能够保证不同批次细胞复苏操作的一致性；

（4）本发明所述细胞复苏器对内部空间要求较小，占地面积小，设备成本低，可实施性较高，应用范围更广。

附图说明

图1是本发明实施例1-3和对比例1中细胞复苏时间的柱形图；

图2是本发明实施例1-3和对比例1中细胞活率的柱形图；

图3是本发明实施例3-5和对比例1-3细胞复苏过程中温度时间变化曲线；

图4是本发明实施例3-5和对比例1-3细胞活率的柱形图；

图5是本发明实施例6-8和对比例4-6细胞复苏过程中温度时间变化曲线；

图6是本发明实施例6-8和对比例4-6细胞活率的柱形图；

图7是本发明实施例9提供的细胞复苏器的整体结构示意图；

图8是本发明实施例9提供的细胞复苏器中振荡托盘、转轴和固定件的结构示意图；

图9是本发明实施例9提供的细胞复苏器处于工作状态和结束状态时的内部结构示意图；

其中，1-振荡托盘，2-第一孔位，3-第二孔位，4-卡扣，5-模式设置键，6-增减调节键，7-确认键，8-振荡开关，9-数字显示屏，10-垫脚，11-电源插孔，12-电源开关，13-转轴，14-固定件，15-水浴盖，16-螺纹段，17-竖纹段，18-电机。

具体实施方式

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，下面对本发明进一步详细说明。但下述的实施例仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明保护范围以权利要求书为准。

以下为本发明典型但非限制性实施例：

实施例1：

本实施例提供了一种细胞高温复苏的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）通电启动细胞复苏器，先设定复苏程序，包括复苏温度、振荡模式以及振荡时长的设定；待先加热至复苏温度60℃，再将盛有待复苏PBMC细胞的2mL冻存管置于振荡托盘1的第一孔位2中，自动复苏程序开启，电机18带动转轴13转动，振荡托盘1做平面回旋振荡运动，进行振荡复苏，所述振荡托盘1回旋转动的速率为10s/cycle，所述振荡复苏的时间为88s，直至复苏时间倒计时为0，水浴状态结束；

（2）卡扣4与固定件14结合改变复苏状态，使得电机18带动转轴13转动时，固定件14无法转动，固定件14与转轴13相对位置改变，转轴13沿螺纹段16转动而螺旋上升，并带动振荡托盘1螺旋上升，所述振荡托盘的上升速率为5cm/s，离开水面，处于出浴状态，复苏结束，取出复苏后的细胞样本。

实施例2：

本实施例提供了一种细胞高温复苏的方法，所述方法参照实施例1中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏温度为65℃，此时的复苏时间为83s。

实施例3：

本实施例提供了一种细胞高温复苏的方法，所述方法参照实施例1中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏温度为70℃，此时复苏时间为79s。

实施例4：

本实施例提供了一种细胞高温复苏的方法，所述方法参照实施例3中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏时间为69s。

实施例5：

本实施例提供了一种细胞高温复苏的方法，所述方法参照实施例3中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏时间为89s。

对比例1：

本对比例提供了一种细胞复苏的方法，所述方法参照实施例1中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏温度为37℃，此时的复苏时间为125s。

对比例2：

本对比例提供了一种细胞复苏的方法，所述方法参照对比例1中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏时间为135s。

对比例3：

本对比例提供了一种细胞复苏的方法，所述方法参照对比例1中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏时间为115s。

实施例6：

本实施例提供了一种细胞高温复苏的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）通电启动细胞复苏器，先设定复苏程序，包括复苏温度、振荡模式以及振荡时长的设定；待先加热至复苏温度70℃，再将盛有待复苏PBMC细胞的5mL冻存管置于振荡托盘1的第二孔位3中，自动复苏程序开启，电机18带动转轴13转动，振荡托盘1做平面回旋振荡运动，进行振荡复苏，所述振荡托盘1回旋转动的速率为20s/cycle，所述振荡复苏的时间为122s，直至复苏时间倒计时为0，水浴状态结束；

（2）卡扣4与固定件14结合改变复苏状态，使得电机18带动转轴13转动时，固定件14无法转动，固定件14与转轴13相对位置改变，转轴13沿螺纹段16转动而螺旋上升，并带动振荡托盘1螺旋上升，所述振荡托盘的上升速率为2.5cm/s，离开水面，处于出浴状态，复苏结束，取出复苏后的细胞样本。

实施例7：

本实施例提供了一种细胞高温复苏的方法，所述方法参照实施例6中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏时间为112 s。

实施例8：

本实施例提供了一种细胞高温复苏的方法，所述方法参照实施例6中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏时间为132 s。

对比例4：

本对比例提供了一种细胞复苏的方法，所述方法参照实施例6中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏温度为37℃，此时所需的复苏时间为175s。

对比例5：

本对比例提供了一种细胞复苏的方法，所述方法参照对比例4中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏时间为185s。

对比例6：

本对比例提供了一种细胞复苏的方法，所述方法参照对比例4中的方法，区别仅在于：步骤（1）中的复苏时间为165s。

实施例9：

本实施例提供了一种细胞复苏器，上述实施例1-8和对比例1-6中细胞复苏方法均采用所述细胞复苏器进行；

所述细胞复苏器的整体结构示意图如图7所示，包括水浴装置，所述水浴装置内设有振荡托盘1、转轴13、固定件14和电机18，所述振荡托盘、转轴和固定件的结构示意图如图8所示，所述振荡托盘1呈圆盘状，沿圆周设有孔位，所述振荡托盘1中间位置下方连接转轴13，所述转轴13呈圆柱状，包括螺纹段16和竖纹段17，所述螺纹段16位于竖纹段17上方；

所述固定件14的中间位置开贯穿孔，所述贯穿孔的内壁上设有螺纹，所述转轴13穿过固定件14的贯穿孔，所述转轴13上的螺纹段16与贯穿孔上的螺纹适配；所述电机18与转轴13上的竖纹段17适配。

所述振荡托盘1上的孔位设有两圈，每圈上的孔位均匀分布，内圈上的孔位为第一孔位2，其数量为8个，适用于2mL规格的冻存管，外圈上的孔为第二孔位3，其数量为10个，适用于5mL规格的冻存管。

所述转轴13上还包括光滑段，所述光滑段位于上部位置，所述螺纹段16位于中部位置，所述竖纹段17位于下部位置。

所述螺纹段16和竖纹段17的长度比为1:1，均为10cm。

所述固定件14为螺母。

所述固定件14在水浴装置中的纵向位置固定。

所述水浴装置内还设有卡扣4，所述卡扣4的一端焊接固定于水浴装置内壁上，另一端与固定件14可拆卸式结合。

所述电机18通过控制转轴13上的竖纹段17带动转轴13转动。

所述电机18及转轴13进行顺时针转动-逆时针转动的水平回旋转动。

每次回旋转动中顺时针和逆时针转动的角度均为180度。

所述转轴13转动时，根据转轴13和固定件14之间是否存在相对运动，确定振荡托盘1的位置，所述细胞复苏器处于工作状态和结束状态时的内部结构示意图如图9所示。

所述卡扣4与固定件14未结合时，固定件14随转轴13转动，保持相对位置不变，振荡托盘1进行回旋振荡运动。

所述卡扣4与固定件14结合时，固定件14不随转轴13转动，转轴13的螺纹段16发生螺旋运动，带动振荡托盘1进行螺旋上升或下降运动。

所述水浴装置的外表面上设有按键、开关、数字显示屏9和电源插孔11。

所述按键包括模式设置键5、增减调节键6、确认键7。

所述开关包括电源开关12和振荡开关8。

所述数字显示屏9上显示水浴温度和剩余振荡时间，所述数字显示屏9还连接报警装置。

所述水浴装置的顶部设有水浴盖15，所述水浴装置的底部设有垫脚10。

实施例10：

本实施例提供了一种细胞复苏器，所述细胞复苏器的结构参照实施例9中的结构，区别仅在于：所述螺纹段16和竖纹段17的长度比为1.5:1，前者长度为18cm，后者的长度为12cm，每次回旋转动中顺时针和逆时针转动的角度均为360度。

实施例11：

本实施例提供了一种细胞复苏器，所述细胞复苏器的结构参照实施例9中的结构，区别仅在于：所述振荡托盘1上的孔位设有三圈，多出的一圈孔位数量为6个，适用于1 mL规格的冻存管；所述螺纹段16和竖纹段17的长度比为0.75:1，前者长度为9cm，后者的长度为12cm；每次回旋转动中顺时针和逆时针转动的角度均为90度。

将实施例1-8和对比例1-6中得到的复苏后的细胞转移至含有3mL RPMI 1640培养基的15mL离心管中，迅速补加RPMI 1640培养基至14mL。在4℃，400g条件下离心10min，弃上清液；再加入RPMI 1640培养基重悬细胞，细胞密度约为10 million/mL，取10μL细胞悬液与10μL AOPI染料混匀，检测细胞活率。

所述实施例1-3和对比例1中细胞复苏时间的柱形图如图1所示，相应的细胞活率的柱形图如图2所示；实施例3-5和对比例1-3细胞复苏过程中温度时间变化曲线如图3所示，相应的细胞活率的柱形图如图4所示；实施例6-8和对比例4-6细胞复苏过程中温度时间变化曲线如图5所示，相应的细胞活率的柱形图如图6所示；

所述实施例1-8和对比例1-6中复苏后细胞的活率如表1所示。

表1

由表1可知，根据实施例1-3和对比例1中的复苏时间及细胞活率数据可知，复苏时间随温度的升高而缩短，同时实施例1-3中的细胞活率略有增加，这表明采用高温条件可以缩短复苏时间，提升细胞活率；

根据实施例3-5和对比例1-3、实施例6-8和对比例4-6中的复苏过程中的温度时间变化曲线和细胞活率数据可知，70℃与37℃复苏相比，复苏时间随温度升高而缩短；2mL和5mL规格的冻存管、70℃复苏温度条件下，在正常复温时间基础上，增加或减少10s对细胞活率基本无显著影响（p>0.05），为高温复苏操作提供了容错空间。

综合上述实施例和对比例可以看出，本发明采用高温复苏的方式，可有效缩短细胞复苏时间，达到速融效果，提高细胞活率；本发明通过在细胞复苏器中设置振荡托盘，以此实现不同规格冻存管中细胞的批量复苏，再通过转轴及固定件的设置，可以控制振荡托盘在水浴时的回旋振荡以及水浴后振荡托盘的螺旋上升，以此保证冻存管内细胞受热均匀，提高细胞复苏的效率，并减少可能造成的水污染；所述细胞复苏器能够实现恒定温度，进行实时监测，其自动化操作能够保证不同批次细胞复苏操作的一致性；所述细胞复苏器对内部空间要求较小，占地面积小，设备成本低，可实施性较高，应用范围更广。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法与装置，但本发明并不局限于上述详细方法与装置，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法与装置才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明装置的等效替换及辅助装置的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞高温复苏方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）启动细胞复苏器，先加热至复苏温度，再将盛有待复苏细胞的冻存管置于细胞复苏器的振荡托盘的孔位中，进行振荡复苏，至水浴状态结束；

（2）改变复苏状态，振荡托盘螺旋上升至离开水面，处于出浴状态，取出复苏后的细胞样本。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述待复苏细胞包括免疫细胞，所述免疫细胞为PBMC细胞；

所述细胞是由液氮进行冷冻保存，所述冻存管的规格包括2mL冻存管和5mL冻存管；

所述冻存管中的细胞与冻存液混合均匀，以细胞悬液的形式存在。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述细胞复苏器启动时，通电后先设定复苏程序，包括复苏温度、振荡模式以及振荡时长的设定；

步骤（1）在放入冻存管之前先进行加热，至复苏温度达到60~70℃；

步骤（1）在放入冻存管之后，自动复苏程序开启，振荡托盘做平面回旋振荡运动，直至复苏时间结束；

步骤（1）所述振荡托盘回旋转动的速率为1~30s/cycle；

步骤（1）所述振荡复苏的时间为60~140s。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述复苏状态的改变，使得振荡托盘螺旋上升，所述振荡托盘的上升速率为1~10cm/s；

步骤（2）所述复苏后的细胞样本取出后，开启复位模式，振荡托盘螺旋下降回到初始状态；

步骤（2）所述复苏后的细胞样本取出后，转移至培养基中，再进行离心分离，弃上清保留细胞沉淀，再加入培养基以重悬细胞，取细胞悬液与染料混合，以检测细胞活率。

5.一种细胞复苏器，其特征在于，权利要求1-4任一项所述的细胞高温复苏方法采用所述细胞复苏器进行，所述细胞复苏器包括水浴装置，所述水浴装置内设有振荡托盘、转轴、固定件和电机，所述振荡托盘呈圆盘状，沿圆周设有孔位，所述振荡托盘中间位置下方连接转轴，所述转轴呈圆柱状，包括螺纹段和竖纹段，所述螺纹段位于竖纹段上方；

所述固定件的中间位置开贯穿孔，所述贯穿孔的内壁上设有螺纹，所述转轴穿过固定件的贯穿孔，所述转轴上的螺纹段与贯穿孔上的螺纹适配；所述电机与转轴上的竖纹段适配。

6.根据权利要求5所述的细胞复苏器，其特征在于，所述振荡托盘上的孔位至少设有一圈，每圈上的孔位均匀分布；

所述振荡托盘上的孔位包括两圈及以上时，适用于不同规格的冻存管；

所述转轴上还包括光滑段，所述光滑段位于上部位置，所述螺纹段位于中部位置，所述竖纹段位于下部位置；

所述螺纹段和竖纹段的长度独立地为5~25cm；

所述螺纹段和竖纹段的长度比为(0.5~2):1。

7.根据权利要求5所述的细胞复苏器，其特征在于，所述固定件包括螺母；

所述固定件在水浴装置中的纵向位置固定；

所述水浴装置内还设有卡扣，所述卡扣的一端焊接固定于水浴装置内壁上，另一端与固定件可拆卸式结合。

8.根据权利要求5所述的细胞复苏器，其特征在于，所述电机通过控制转轴上的竖纹段带动转轴转动；

所述电机及转轴进行顺时针转动-逆时针转动的水平回旋转动；

每次回旋转动中顺时针和逆时针转动的角度均为45~450度。

9.根据权利要求7所述的细胞复苏器，其特征在于，所述转轴转动时，根据转轴和固定件之间是否存在相对运动，确定振荡托盘的位置；

所述卡扣与固定件未结合时，固定件随转轴转动，相对位置保持不变，振荡托盘进行回旋振荡运动；

所述卡扣与固定件结合时，固定件不随转轴转动，转轴的螺纹段沿固定件发生螺旋运动，带动振荡托盘进行螺旋上升或下降运动。

10.根据权利要求5所述的细胞复苏器，其特征在于，所述水浴装置的外表面上设有按键、开关、数字显示屏和电源插孔；

所述按键包括模式设置键、增减调节键、确认键；

所述开关包括电源开关和振荡开关；

所述数字显示屏上显示水浴温度和剩余振荡时间，所述数字显示屏还连接报警装置；

所述水浴装置的顶部设有水浴盖，所述水浴装置的底部设有垫脚。