CN104711219A - 一种牙髓干细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牙髓干细胞培养基，基础培养基为IMDM，1L培养基中含有SITE100*，抗坏血酸200-400mM，SITE为细胞生长必需的组份，抗坏血酸和纤连蛋白有助于牙髓干细胞形成细胞外基质，利于牙髓干细胞生长。含有PDGF1-10ug，氢化可的松1-10ug，EGF1-5ng，b-FGF1-5ng，PTH50-200ng，地塞米松1-20mM，这些生长因子的组合可以有效的增强牙髓干细胞的增殖能力，且保持细胞的未分化状态。本发明提供的培养基能够快速扩增牙髓干细胞同时保持牙髓干细胞的多向分化能力，扩增速度较常规培养基调高2-3倍，具有很高的科研和临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，特别是涉及一种牙髓干细胞培养基。
背景技术
干细胞(Stem Cells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括骨髓、脐带、脐带血、牙齿与脂肪。
2000年首次发现了牙髓干细胞，Gronthos等发现在离体的乳牙和智齿中都存在牙髓干细胞。这是一类具有高增殖能力、高度自我更新能力、多项分化能力的细胞。已有研究利用该细胞成功地构建牙髓、牙本质以及牙齿组织。牙髓干细胞(dental pulp stem cell，DPSC)与其他组织来源的干细胞在生物学特性上有很多相似之处。Gronthos等对牙髓干细胞的克隆形成率进行了研究，与骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell，BMSC)比较后发现：牙齿来源的DPSC的克隆形成率明显高于骨髓来源的BMSC，这就表明DPSC具有较BMSC更高的增生能力和自我更新能力。且牙髓干细胞在成脂、成软骨和成神经诱导方面均有研究证实牙髓干细胞具有多向分化的潜能，为其在体内植入牙髓干细胞使受损或衰退的组织、器官改善或恢复功能提供了理论依据。
临床使用牙髓干细胞的前提是对牙髓干细胞进行大量的扩增，现有的扩增方法最常规的是使用添加10％胎牛血清的培养基。临床使用含动物源的培养基不仅会引起免疫排斥反应，异源病毒感染，而且采用这种培养基培养的牙髓干细胞，生长比较缓慢，在传代超过5次之后其分化功能细胞的潜能会大大降低。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种牙髓干细胞培养基，这种培养基可以解决牙髓干细胞培养方法落后造成的牙髓干细胞培养困难，分化潜能降低，及含异源动物蛋白的问题。
本发明所采用的技术方案是：一种牙髓干细胞培养基，基础培养基为IMDM，1L培养基中含有SITE100*(sigma)10-10ml，抗坏血酸200-400mM，SITE为细胞生长必需的组份，抗坏血酸和纤连蛋白有助于牙髓干细胞形成细胞外基质，利于牙髓干细胞生长。含有PDGF1-10ug，氢化可的松1-10ug，EGF 1-5ng，b-FGF 1-5ng，PTH 50-200ng，地塞米松1-20mM，这些生长因子的组合可以有效的增强牙髓干细胞的增殖能力，且保持细胞的未分化状态。
所述的牙髓干细胞培养基，1L培养基中含有人血白蛋白1-10g，人血白蛋白可以显著增强细胞利用脂质，利用微量元素的能力，促进牙髓干细胞生长。
与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明提供了一种牙髓干细胞培养基及其用途，该培养基能够快速扩增牙髓干细胞同时不影响牙髓干细胞的多向分化能力，牙髓干细胞的扩增速度较常规培养基提高2-3倍，所培养的牙髓干细胞在10代内依然具有多向分化能力，同时培养基内不含有动物源物质，细胞用于临床时不会产生免疫排斥及病毒感染的风险，具有很高的科研和医学应用价值。
具体实施方式
实施例1：
对牙髓干细胞增殖的加速作用的实验
1.受试培养基：常规培养基组份：DMEM基本培养基，10％胎牛血清(FBS)；本发明的培养基，包括：SITE100*(sigma)10ml、抗坏血酸300mM、PDGF5ug、氢化可的松5ug、EGF 3ng、b-FGF、3ng、PTH 100ng、地塞米松10mM、IMDM余量。
2.培养干细胞来源：来源于牙髓的牙髓干细胞
3.体外细胞培养实验：细胞接种密度为4000个/ml，接种于12孔板中放入培养箱培养(37度，5％CO2)。每隔24小时里利用血球计数板测一次细胞数量，结果发现，经本发明的培养基培养的牙髓干细胞比经常规培养基培养的细胞便显出更快的扩增速度(数据为三次独立实验的平均值)。
实施例2：
对增殖后的牙髓干细胞体外分化为成骨细胞，成软骨细胞，成脂肪细胞的潜能分析影响实验
1.受试培养基：本发明的培养基。
2.培养细胞来源：牙髓来源的牙髓干细胞
3.体外细胞分化实验：将细胞传代扩增至P10代，按说明书，使用LONZA的成脂，成骨，成软骨检测试剂盒对P10代牙髓干细胞进行分化检测，检测结果表明经本发明描述的培养基培养过的牙髓干细胞分化成脂肪细胞，成软骨细胞，成骨细胞的比率在80％以上(数据为三次独立实验的平均值)。因此本发明所描述的培养基可以有效的保持牙髓干细胞的多向分化能力。
Claims (2)
1.一种牙髓干细胞培养基，其特征在于，每1L牙髓干细胞培养基中有以下重量配比成分组成：
。
2.根据权利要求1所述的牙髓干细胞培养基，其特征在于，所述牙髓干细胞培养基中还可以在每1L培养基加入人血白蛋白1-10g。
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