CN105062977A - 永生化人肝细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种永生化人肝细胞的制备方法，包括：获取正常人肝细胞并进行原代培养，收集原代细胞；用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染原代细胞，获得改造细胞；将改造细胞进行3D细胞培养。在上述基础上，本发明还提出由上述方法制备得到的永生化人肝细胞。本发明的方法，采用猴病毒40大T抗原和人端粒酶逆转录酶进行转染，经过转染克隆后的阳性细胞在长期大量培养中能维持其分化水平，保持其细胞形态和结构，且提升其增殖能力；之后再用最接近机体环境的3D培养方式进行大量扩增培养，最后即能大量获得具有肝脏代谢活性的非成瘤细胞的人工肝；得到的是同源性的细胞，不具有免疫排斥和致病性和肿瘤性状，而且能大量培养获得。

Description

永生化人肝细胞及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种永生化人肝细胞及其制备方法。

背景技术

肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。目前肝衰竭治疗手段中，生物人工肝系统是最佳的选择。生物型人工肝是指将同种或异种动物的器官、组织和细胞等与特殊材料、装置结合，构成的人工肝支持系统，暂时替代肝脏功能，从而协助治疗。

生物型人工肝包括以往的离体肝灌流、人-哺乳类动物交叉灌流等等，主要的决定修复体性质的关键是其中采用的人工细胞的材料。但是，目前所构建的各种细胞材料都有其各自的优缺点。比如，动物源性肝细胞来源比较广，可大量获得，但是其带有动物源性疾病，容易产生异种蛋白的免疫排斥和免疫致病。另一种能够大量获得的就是肿瘤来源的肝细胞系，其可大量增殖并规模培养，但具有肿瘤性状，肝细胞的功能不如正常肝细胞，且有致瘤的风险。而相比上两种，胎肝细胞虽较理想，且缺陷比较少，但本身来源受限，且培养和制备的过程中条件非常严格控制，制备难度高且产量也较少，不易大量获得。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有永生化人工肝细胞组织的缺陷，提供一种能利用同源性正常人肝细胞大量培养后进行永生化人肝细胞的制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种永生化人肝细胞的制备方法，包括如下步骤：

获取正常人肝细胞并进行原代培养，收集原代细胞；

用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染所述原代细胞，获得改造细胞；

将所述改造细胞进行3D细胞培养。

本发明的方法，采用猴病毒40大T抗原和人端粒酶逆转录酶进行转染，经过转染克隆后的阳性细胞在长期大量培养中能维持其分化水平，保持其细胞形态和结构，且提升其增殖能力；之后再用最接近机体环境的3D培养方式进行大量扩增培养，最后即能大量获得具有肝脏代谢活性的非成瘤细胞的人工肝；得到的是同源性的细胞，不具有免疫排斥和致病性和肿瘤性状，而且能大量培养获得。

在上述制备过程的基础上，本发明进一步还提出一种采用上述方法步骤直接制备得到的永生化人工肝细胞。本发明的方法制备得到的永生化人工肝细胞，其细胞本身经过改造后在没有肿瘤化的基础上，具有较高的肝细胞的活性和功能；且由于直接取自正常人的肝细胞，不会产生异种蛋白的免疫排斥和免疫致病，且具备了体外大量扩增的能力和条件，能弥补普通的肝细胞体外无法大量培养生长的缺陷，而用于构建人源性生物人工肝。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种永生化人肝细胞的制备方法，包括如下步骤：

S10，获取正常人肝细胞，并进行原代培养；

S20，用SV40Tag(simianvirus40largeTantigen，猴病毒40大T抗原)和人端粒酶逆转录酶转染步骤S10获得的原代人肝细胞，获得永生化人肝细胞系；

S30，将永生化人肝细胞系进行3D培养，而后收获细胞即可用作细胞基材制备人工肝或肝细胞移植。

本发明的上述方法过程，采用的细胞基体为原始正常人肝细胞，是同源性的细胞，相比动物源性的肝细胞，其基本不具有免疫排斥和致病性，且不具有肿瘤性状；同时为了弥补其在体外无法大量维持生长性状的缺陷，首先采用猴病毒40大T抗原和人端粒酶逆转录酶进行转染，经过转染克隆后的阳性细胞在长期大量培养中能维持其分化水平，保持其细胞形态和结构，且提升其增殖能力；之后再用最接近机体环境的3D培养方式进行大量扩增培养，最后即能大量获得具有肝脏代谢活性的非成瘤细胞的人工肝。

其中，本发明的上述方法过程中采用获取的正常人的干细胞进行体外原代培养，将收获的原代培养细胞按照步骤S20细胞进行改造。采用原代培养的肝细胞是因为，原代细胞从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养获得，传代的次数比较低，细胞保持原有细胞的基本性质，能较好地保持细胞自身的分化程度和肝功能代谢水平。同时，原代培养中稍微会发生程度较低的脱分化，而且轻度脱分化后的细胞增殖生长的要求相比从机体获得的原始肝细胞低一些，能利于后续的大量生长。

虽然上述步骤S10获得了肝细胞，但是细胞本身不具有永生的性质，生长条件苛刻、存活时间有限、增殖传代困难，并受到捐献器官短缺的限制。所以在这一情形下，步骤S20对步骤S10的细胞进行改造，改造的方式采用人端粒酶逆转录酶和SV40Tag转染进行；其中，SV40Tag是乳多空病毒科多型瘤病毒属中的一种小DNA肿瘤病毒，具有转化动物细胞和诱发肿瘤的特性。此病毒的早期蛋白T抗原有Rb和p53结合域，使Rb和p53丧失抑瘤蛋白的作用，失去对细胞周期的调控，使细胞分裂加速、无限生长；能用于本发明中细胞的体外的继续增殖传代，但是在不控制其代谢的基础上，具有诱发形成肿瘤的风险。所以，同时以端粒酶逆转录酶进行协调，端粒酶逆转录酶其作用是作用于细胞的端粒，因为在体外具有永生增殖的细胞，只有肿瘤细胞或者是癌细胞，其无线增殖的能力与端粒有关；端粒是真核细胞染色体末端的特有结构，正常情况下随细胞分裂而缩短；端粒酶重新激活使癌变细胞一个带有普遍性意义的生物学标志，是细胞永生化及肿瘤发生的关键步骤。人端粒酶逆转录酶的逆转录催化功能，将端粒重复序列合成到染色体末端，延长或稳定了随着细胞分裂而进行性缩短的端粒，调整其永生分裂的能力。在本发明中基于干细胞体外无法永生的情形，在不产生肿瘤化诱导的情况下，所以采用转染端粒酶逆转录酶控制端粒结构，在保证SV40Tag提升增殖的同时，还能有效控制和保持其产生肿瘤化诱导。

当然，为了进一步降低其肿瘤化的影响，上述的SV40Tag可以采用半灭活减毒处理后的猴病毒40大T抗原先进行，可以进一步降低肝细胞中肿瘤化的发生。并且，在该步骤S20中，由于本身肝细胞在转染之后仍然需要保持或者维持其细胞性状；如果采用转染试剂转染的方式进行，试剂会持续影响肝细胞的细胞膜结构，不利于肝细胞的生长和代谢。所以本发明该步骤S20的转染过程优选采用电转染的方式进行，通过脉冲电压在细胞膜上产生导入孔而进行导入。虽然电转染在瞬间脉冲电击时会伤害细胞，但是由于短暂、持续性比较低，而且控制适当的条件后续细胞膜本身流动性自动修复以后基本上性状和代谢情况影响不大。同时，转染的用量必须要控制，转染的量过少，达不到提升细胞改造的目的；而如果转染的量过大，对细胞本身的代谢和生长性状的影响以及致病性都会加深，所以一般控制SV40Tag和/或人端粒酶逆转录酶转染量：细胞个数的比值1x10^-5～1x10^-4μg/个之间最优。

在步骤S20之后，步骤S30进一步进行大量扩增，而培养的方式采用3D细胞培养进行，即保持其在体外增殖过程中能具有与机体内相仿的3D微环境(即三维微环境)，培养其能表达与肝脏代谢、解毒、合成相关的基因和蛋白，从而最终获得品质和数量更多的肝细胞。

其中在该步骤S30中进行大量扩增的过程中，相比现有的通常培养的方式，本发明中采用的3D细胞培养采用微载体悬浮培养方式进行；其中针对本发明所培养的肝细胞，研究和试验之后微载体优选采用Cytopore，Cytopore是一种纤维素基质微载体，其由交联纤维素构成并带有DEAE基团，可以使微载体的表面具有自身微环境，在各种pH下都能比较稳定保持；使得在培养的过程中，其微环境的电荷密度能稳定地保持对半贴壁肝细胞的吸附性；并且Cytopore其具有的大孔性还能保护细胞不受剪切力的影响。

同时，在步骤S30的培养过程中，随着微载体上肝细胞数量的增殖，随着细胞增殖，微球变得越来越重，且细胞的密度会越来越大，采用搅拌式培养，并且在过程中随着培养时间的增加，相应逐渐提高搅拌速度；通过提高搅拌速度消除高密度下细胞间有限空间和营养物质的竞争性生长抑制的影响。并且步骤S30的悬浮培养过程中，Cytopore微载体在培养基中的浓度控制8～12mg/mL浓度，相比通常微载体悬浮培养的1.03-1.05g/mL浓度大小，本发明的上述浓度较低，经过试验后肝细胞的贴壁能力不是很强，而且在微载体量过大时，微载体之间搅拌的机械碰撞等情况，会造成对细胞的剪切力和机械损伤过大，而且容易造成肝细胞贴壁脱落。所以在经过考量和试验后，本发明中降低了微载体的密度至8～12mg/mL浓度，同时控制搅拌的过程可以采用逐渐加速的方式进行，具体细胞贴壁期可以采用最低的搅拌速度8rpm进行间歇式搅拌，贴壁期过后进行生长后，逐步提升搅拌速度，最好采用阶梯式提升的方式，每隔12小时提升1～2rpm；直至最终达到15rpm后保持恒定直至培养结束。

同时，在步骤S30的3D细胞培养时，接种时采用10⁵个/mL对数生长期的永生化人肝细胞系进行，这一阶段和密度下细胞的接种量，可以提升其增殖的速度，避免扩增时间长导致细胞变异的可能增大。其中，在该步骤S30适于其生长和肝细胞代谢性状的维持，本步骤中采用的培养基为DMEM/F12高糖培养基，因为肝脏本身是糖代谢的重要器官，比如在肝脏糖代谢过程中，葡萄糖激酶GK催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，同时GK也是肝脏铰接和有氧代谢的限速酶，其活性直接反应肝脏的功能。所以在本发明中针对所要保持培养得到的人工肝细胞的功能，所以采用DMEM/F12高糖成分作为底物，在其分裂增殖的同时刺激或者诱导维持细胞保持肝细胞代谢水平，利于后续获得的人工肝细胞的品质；同时，在维持其功能代谢时，还能进一步降低其肿瘤化变异的可能。

在上述制备过程的基础上，本发明进一步还提出一种采用上述方法步骤直接制备得到的永生化人工肝细胞。本发明的方法制备得到的永生化人工肝细胞，其细胞本身经过改造后在没有肿瘤化的基础上，具有较高的肝细胞的活性和功能；且由于直接取自正常人的肝细胞，不会产生异种蛋白的免疫排斥和免疫致病，适于大量的人造肝生产制备和应用。

为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明利用该方法能够进行大量生物人工肝制备的性能和品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。

实施例1

S10，将购买的hhl-5型原正常人肝细胞系(购买自上海细胞库)，进行P0代培养。

S21，将步骤S10培养的P0代的肝细胞用pH7.4的PBS制成细胞悬液(6～8×10⁶个/ml，0.5ml)，并与SV40Tag(50μl质量浓度约为3μg/μl)、人端粒酶逆转录酶(50μl质量浓度约为3μg/μl)混合均匀后，应用BTX2001细胞穿孔仪进行瞬间稳定电转染(800V、脉冲时程200μs、反应温度4℃)，所有操作均在无菌条件下进行；

S22，在步骤S21转染步骤完成之后，该步骤S22中可以采用G418筛选阳性细胞；当然，其实在理解肝细胞体外培养难度的情况下，其实也可以不进行该筛选步骤，因为肝细胞本身在体外的能够生长增殖的能力不高，转染之后直接进行接种培养，培养的过程中转染不成功的阴性细胞的生长能力比较差，比不上转染成功的阳性细胞，所以在培养的过程中慢慢就逐渐消失了。

S31，称取10g微载体Cytopore^TM2，用1000mL无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS(pH7.4的磷酸缓冲液)浸泡水化4h，间或搅拌；再用新鲜PBS洗2次，121℃高压消毒20min后；置于无菌间超净台内，用DMEM/F12达尔伯克氏基本培养基/F12培养液洗2次，用含20％FBS的IHH(永生化人肝细胞)完全培养液浸泡，4℃贮存备用。

S32，将步骤S31预处理的微载体Cytopore^TM2按10mg/mL浓度添加到含有DMEM/F12高糖培养基的Wheaton(惠顿)体悬浮培养瓶中，然后按照10⁵个/mL的比例接种步骤S22中获得的对数生长期的转染后的肝细胞进行培养，在培养的过程中每隔2天，更换新鲜培养液；同时在培养中使用配套的慢速磁力搅拌器进行搅拌。

其中，搅拌实施的过程中，细胞贴壁期搅拌控制速度8rpm，搅拌3min、间歇30min循环；在贴壁期过后的生长阶段中，每隔12h搅拌转速提升1～2rpm直至搅拌速度至15rpm后恒定，持续搅拌至细胞达到衰退期时培养结束。

在本发明的上述方法步骤实施完成之后，收获细胞并验证其细胞的数量和肝功能代谢指标，具体继续进行如下步骤：

S41，待步骤S32培养完成离心去除培养液，收集含有细胞的微载体，取10mL加入等体积肝衰竭患者血浆混匀后，分别按照每个孔1ml的添加量添加至24孔细胞培养板中进行孵育，孵育中每个时间点4个平行样孵育的时间分别为0，1，2，3天；孵育完成后，吸取上清，并于10000rpm离心3min除去上清中的杂质后，取200μL于-20℃贮存待测。

S42，将步骤S41的含有细胞的微载体作为实验组，同时用不含有培养细胞的空微载体作为对照组，取等体积不含细胞的空微载体，同样操作。最后样本收集结束后，应用OLYMPUSAU400型全自动生化分析仪，检测总胆红素、尿素浓度。

步骤S42的检测的结果中，本发明培养后含有肝细胞的微载体作为实验组与重症肝衰竭血浆孵育后，相比空微载体比血浆总胆红素显著下降，尤其是第一天下降幅度较大达36％；随着孵育时间延长，血浆总胆红素仍然下降，但是下降的幅度差别不大；而随着本发明含有肝细胞的微载体与肝衰竭血浆共孵育时间延长，血浆尿素浓度持续增加，第3天比孵育前尿素浓度增加54％。

所以检测中，本发明采用正常人肝细胞改造后为微载体培养后得到的细胞，能在测试的一天具备良好的重症肝衰竭血浆的净化和修复，后续尿素产物浓度逐渐增加，会抑制其功能。

进一步在上述步骤S42的基础上，进一步培养收获得到的细胞其抵抗肝衰竭血浆细胞毒作用进行检测和测试，具体步骤如下：

S50，因为生物人工肝治疗时，肝细胞与肝衰竭病人血浆或全血直接或间接接触，肝衰竭血浆中的多种毒性物质可能对肝细胞有细胞毒作用。为探讨微载体培养的人工肝细胞能否抵抗肝衰竭血浆的细胞毒作用，将微载体培养的人工肝细胞与100％肝衰竭血浆共孵育3天，离心后吸净上清，PBS洗3次，洗去死亡脱落的肝细胞，用Giemsa染色后显微镜下摄影，观察细胞形态和数量变化。并将微载体培养的肝细胞与肝衰竭血浆共孵育0、1、2、3天，每天取上清，离心后检测乳酸脱氢酶(laetatedehydrogenase，LDH)含量，每组三个平行样。

上述步骤S50每组三个平行样检测的乳酸脱氢酶的检测结果：将微载体培养的人工肝细胞与肝衰竭血浆共孵育3天后，Giemsa染色示，微载体上仍有大量的肝细胞贴附，与ALF血浆孵育前微载体培养的肝细胞相比，细胞数目、形态无显著变化。肝细胞损伤死亡后，细胞内的LDH释放，可致培养上清LDH浓度升高，是肝细胞损伤的一个较敏感指标。微载体培养的人工肝细胞与肝衰竭血浆共孵育3天，与未共孵育的肝衰竭血浆相比，血浆中LDH无明显增多，说明肝细胞未大量坏死，即微载体培养的肝细胞可抵抗肝衰竭血浆细胞毒作用。

同时上述两项检测结果的基础上，进一步对微载体培养得到的人工肝细胞的细胞纯度进行测试，用细胞免疫荧光方法检测人肝细胞特异蛋白α1-胰蛋白酶(αl-antitrypsin，αl-AT)在人工肝细胞中的表达情况，结果表明99％以上的人工肝细胞αl-T表达阳性，即肝细胞。

同时短期内将大量培养得到的人工肝细胞扩增冻存，建立种子细胞库，细胞库的规模为450管，每管5x106个细胞，细胞代数为30～40代细胞冻存1个月后随机取样复苏，细胞存活率为94±1.8％,24h贴壁率为87±3.4％。

上述多项检测和测试的结果，说明改造后培养得到的人工肝细胞能相应适当地满足肝脏修复的细胞的要求；并且更主要地是，上述改造的细胞能直接大量培养获得，在上述步骤S31和步骤S32的培养的过程中，用显微镜实时观察时，微载体孔道直径30μm，肝细胞贴附于微载体表面及孔径内生长，呈三维立体形式生长，细胞密度远大于平面培养。人工肝细胞接种于微载体后10～20天内可达70～90％汇合，培养体积可达500～600mL，说明其具备了体外大量扩增的能力和条件，能弥补普通的肝细胞体外无法大量培养生长的缺陷，可用于构建人源性生物人工肝。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种永生化人肝细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取正常人肝细胞并进行原代培养，收集原代细胞；

用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染所述原代细胞，获得改造细胞；

将所述改造细胞进行3D细胞培养。

2.如权利要求1所述的永生化人肝细胞的制备方法，其特征在于，所述用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染所述原代细胞步骤中，

按照所述SV40Tag与原代细胞数比为1x10^-5～1x10^-4μg/个的转染量进行转染；

和/或按照所述人端粒酶逆转录酶与原代细胞数比为1x10^-5～1x10^-4μg/个的转染量进行转染。

3.如权利要求1或2所述的永生化人肝细胞的制备方法，其特征在于，所述用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染所述原代细胞步骤中，所述转染为电转染。

4.如权利要求1或2所述的永生化人肝细胞的制备方法，其特征在于，将所述改造细胞进行3D细胞培养步骤中，所述3D细胞培养为微载体悬浮培养。

5.如权利要求4所述的永生化人肝细胞的制备方法，其特征在于，所述微载体悬浮培养中采用的微载体为Cytopore。

6.如权利要求5所述的永生化人肝细胞的制备方法，其特征在于，所述微载体悬浮培养中，所述微载体在培养基中的浓度控制8～12mg/mL。

7.如权利要求5所述的永生化人肝细胞的制备方法，其特征在于，在所述微载体悬浮培养中，还包括对培养液进行搅拌处理。

8.如权利要求7所述的永生化人肝细胞的制备方法，其特征在于，对培养液进行搅拌处理中，搅拌的速度为8～15rpm。

9.如权利要求4所述的永生化人肝细胞的制备方法，其特征在于，所述微载体悬浮培养中，采用的液体培养基为DMEM/F12高糖培养基。

10.根据权利要求1至9任一项所述的永生化人肝细胞的制备方法制备的永生化人肝细胞。