PT1372710E - Vam modificado que expressa os genes gag e pol do envelope de vih - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

VAM MODIFICADO QUE EXPRESSA OS GENES GAG E POL DO

ENVELOPE DE VIH

Domínio da invenção A presente invenção tem por objecto o vírus Ankara vacínia modificado (VAM)y uma estirpe de replicação imperfeita do vírus vacínia que expressa os genes gag e pol do envelope· do vírus da imunodeficiência humana (VIH)

Antecedentes da invenção . A imunidade celular desempenha um papel importante no controlo de infecções causadas pelo vírus da imunodeficiência (P..J.. Goulder.. et al.. 1999 AIDS 13: S121) . Recentemente, uma vacina de ADN concebida para aumentar a imunidade celular por meio do aumento da citocina continha, com sucesso, um reforço altamente virulento do vírus da imunodeficiência (D.H., Barouch et al. 2000 Science 290: 4 8 6} . Outra abordagem promissora relativa a uma maior, imunidade celular é uma inoculação do ADN seguida de reforços recombinantes de vírus da varíola (H.L. Robinson et al. 2000 AIDS Rev2: 105) . Este regime de inoculação heteróloga/reforço induz uma frequência de células T 10 a 100 vezes superiores à inoculação e reforço apenas com ADN ou apenas com vacinas recombinantes de varíola. Previamente, investigadores demonstraram que o estímulo de uma resposta iniciada com ADN com um vírus da varíola foi superior ao estímulo com ADN ou proteína para o controlo de um vírus não patogénico da imunodeficiência (H.L. Robinson et al. 1999 Nat Med 5: 526). Moss et al descrevem composições de vacinas que compreendem um VAM recombinante 1 contendo os genes gag-pol do vírus da iraunodeficiência de símios (VIS) e genes truncados do envelope de VIH para a indução de uma resposta imunitária protectora em macacos (Moss et al: Retroviruses of human AIDS and related animal-diseases, Colloque des Cent Gardes, 12°, 25 de Outubro de 1999 - 27 Outubro de 1999, Paris, França, páginas 105-107). Há uma necessidade de um controlo de um vírus patogénico da imunodeficiência.

Sumário da invenção

Relata-se aqui que a inoculação de ADN seguida de um reforço com Ankara de vacínia modificada recombinante (VMAr) tinha controlado a inoculação do vírus da imunodeficiência, altamente patogénico num modelo de macaco rhesus. Tanto as componentes do ADN como do VAMr da vacina expressaram múltiplas proteínas , do vírus da imuno-deficiência. Duas inoculações de ADN na semana 0 e na semana 8 e um único reforço com VAMr na 24a semana controlaram eficazmente uma inoculação intrarectal administrada sete meses após o reforço. Estas verificações são encaradas como uma indicação que uma vacina de ADN/VAM, de proteínas múltiplas relativamente simples, pode ajudar a controlar a síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA) epidémica. Os requerentes também relatam que as inoculações de VAMr induzem boas respostas imunitárias mesmo sem a activação do ADN.

Breve descrição dos desenhos

Figura I. Relações filogenéticas de VIH-1 e VIH-2 com base na identidade de sequências do gene pol. Os VIScpZ e VISsram . são lentivírus de primatas sub-humanos 2 recuperados de um chimpanzé e · de um macaco Sooty. Mangabey, respectivamente.

Figura II. Relações filogenéticas dos grupos M, Ne O de VIH-1 com quatro VIScpz diferentes, isolados com base nas sequências de comprimento completo do gene pol. A barra indica uma distância genética de 0,1 (divergência de nucleótidos de 10 %) e as posições· do grupo com asterisco isolados de VIH-1 do grupo N com base nas sequências do env.

Figura III. Propriedades trópicas e biológicas dos isolados de VIH-1.

Figura IV. Proteínas codificadas de VIH. Indica-se a localização dos genes de VIH, as dimensões dos produtos de tradução primária (nalguns casos poliproteínas) e as proteínas virais maduras tratadas.

Figura V. Representação esquemática de um virião maduro de VIH-1.

Figura VI. Representação linear da glicoproteína do Env de VIH-1. A seta indica o sítio de clivagem da gp 160 à gp 120 e da gp 41. Na gp 120, as áreas com uma rede tracejada representam domínios variáveis (Vi a V5) e as caixas abertas descrevem sequências conservadas (Ci a C5) . No ectodomínio da gp41, indicam-se vários domínios: o péptido de fusão do terminal N e as duas hélices do ectodomínio (hélice N e Ç) . 0 domínio que abarca a membrana é representado por uma caixa preta. No domínio citoplásmico da gp41, mostra-se o elemento da endocitose Tir-X-X-Leu (YXXL) (SEQ ID NO: 9) e dois domínios helicoidais previstos (hélice 1 e 2). Indicam-se os números dos aminoácidos.

Figura 1. Frequências temporais. de células T específicas de Gag. (A) Respostas de células T de CD8 específicas de Gag estimuladas pela activação do ADN e imunizações de reforço com VAMr. O esquema apresenta os 3 dados médios do tetrâmero de Gag-CM9 gerados em animais imunizados i.d. com uma dose elevada de ADN. (B) ELISPOTs de IFN-γ específicos de Gag em macacos A*01 (barras em branco) e sem ser A*01 (barras a cheio), em vários momentos, antes da inoculação e duas semanas após a' inoculação. . Utilizaram-se para as análises conjuntos de 10 a 13 péptidos Gag (22 mers sobrepostos por 12) . Os números por cima das barras dos dados representam a média aritmética ± DP para os ELISPOTs dentro de cada grupo. Os números no topo dòs gráficos designam individualmente os animais. *, dados não disponíveis; . #, <20 ELISPOTs por lxlO6 células mononucleares do sangue periférico (MCSP). Os dados temporais para as células T especificas dos tetrâmeros Gag-CM9-Mamu-A*01 podem ser encontrados na figura 6. Figura 2. Cargas virais temporais, contagens de CD4 e sobrevivência após a inoculação dos animais vacinados e dos de controlo. (A) Média geométrica das cargas virais e (B) média geométricas das contagens de CD4. (C) Curva de sobrevivência para animais vacinados e de controlo. A linha a tracejado representa os 24 animais vacinados. (D) Cargas virais e (E) contagens de CD4 para animais individualmente nos grupos vacinados e nos de controlo'.. A chave - dos números referentes aos animais está ilustrada em (E) . Os ensaios para as primeiras 12 semanas após a inoculação tinham um nível de detecção de 1000 cópias de ARN por mililitro de plasma. Os animais com cargas inferiores a 1000 foram pontuados com uma carga de 500. Para as semanas 16 e 20, o nível de detecção foi de 300.cópias de ARN.por mililitro. Os animais com níveis de vírus abaixo de 300 foram pontuados com 300.

Figura 3. Respostas das células T após a inoculação em grupos com vacina e grupos de controlo. (A) Células de 4 tetrâmero* temporal (linha a tracejado) e cargas virais (linha a cheio). (B) Ensaios da citocina intracelular para avaliar a produção de IFN-γ em resposta à estimulação com o.péptido Gag-CM9, duas semanas após a inoculação. Este ensaio, ex vivo permite a avaliação do estádio' funcional das células do tetrâmero+ no pico após a inoculação na figura IA.. (C) Ensaio de proliferação às 12 semanas após a inoculação. Utilizaram-se para a estimulação Gag-Pol-Env (barras a branco) e Gag-Pol (barras a tracejado) produzidos por transfecções transientes. Os sobrenadantes das culturas transfectadas de forma simulada serviram como antigénio de controlo. Os índices de estimulação são o crescimento das culturas na presença de antigénios virais dividido pelo crescimento de culturas na presença do antigénio simulado.

Figura 4. Histomorfologia dos nódulos linfáticos 12 semanas após a inoculação. (A) Nódulos linfáticos típicos de um macaco vacinado mostrando a evidência da hiperplasia folicular caracterizada pela presença de numerosos folículos secundários com centros germinais expandidos e zonas discretas negras e iluminadas. (B) Nódulos linfáticos típicos de um animal de controlo infectado mostrando uma diminuição folicular e uma atrofia linfócelular paracortical. (C) Nódulo linfático representativo de um macaco não infectado, da mesma idade, exibindo centros germinais não reactivos. (D) A percentagem de área total dos nódulos linfáticos ocupada por centros germinais foi medida para dar um indicador não específico de hiperplasia folicular. 0.s dados dos controlos não infectados são para quatro macacos rhesus da mesma idade.

Figura 5. As respostas temporais do anticorpo. Microgramas do anticorpo total de Gag (A) ou de Env --(B) 5 -foram determinados por meio' de ELISAs. Os títul-os do anticorpo de neutralização para VIHS-89.6 (C) e VIHS-

89.6P (.D) foram determinados com células assassinas MT-'2 e. corante vermelho neutro (D.C. Montefiori et al. 1988 J Clin Microbiol 26: . 231) . Os títulos, são o recíproco da diluição de soro que dá uma neutralização de 50 % do crescimento de vírus, indicado em CMSP humanas. Os símbolos para os animais são os mesmos que na figura 2.

Figura 6. As células T específicas do tetrâmero de Gag-CM9-Mamu-A*01 em macacos vacinados com Mamu—A*01 e macacos de controlo, em vários momentos antes da inoculação e duas semanas após a inoculação. O número no canto superior direito de cada gráfico representa a frequência das células T de CD8 específicas do tetrâmero como uma % do,total das células T de CD8. Os números por cima de cada coluna dos dados de SCAF (saída de células activada por fluorescência) designam os animais individualmente.

Figura A. Mapa e sequência do vector de transferência do plasmido pLW-48.

Figura B. Sequências do vector . de transferência do pla-smido pLW-48, do promotor de Psi II (que controla a expressão do envelope de ADA), envelope de ADA truncado, promotor de PmH5 (que controla a expressão de gag pol de HXB2) e gag pol de HXB2(com mutações de segurança, Δ integrase). .

Figura C. Vector de transferência do plasmido pLW-48, e produção do vírus recombinante de VAM VAM/VIH 48.

Figura D. gag pol do ciado B.

Figura Ξ. Sequência do novo promotor de Psin II. 6

Descrição detalhada de enquadramentos preferidos Virus VAM recombinante 0 virus vacínia, um membro da espécie Orthopoxvirus na família dos Poxviridae, foi utilizado como uma vacina viva para imunizar contra a doença varíola humana. A vacinação mundial com vírus vacínia, que teve sucesso, culminou na erradicação do vírus da varíola, o agente causador da varíola (The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication. History of Public Health, No. 4, Geneva: World Health Organization, 1980). De acordo com a declaração da OMS (Organização Mundial de Saúde), a vacinação foi universalmente descontinuada excepto para pessoas com risco elevado de sofrerem infecções pelo vírus da varíola (por exemplo, trabalhadores de laboratório).

Mais recentemente, os vírus vacínia também têm sido utilizados para fazer engenharia dos vectores virais para a expressão recombinante de genes e para a utilização potencial como vacinas vivas recombinantes (Mackett, M. et al.. 1982 PNAS USA 79: 7415-7419; Smith, G.L. et al. 1984

Biotech Genet Engin Rev 2: 383-407). Isto transmite sequências de ADN (genes). que codificam para antigénios exógenos a ser introduzidos, com a ajuda de técnicas de recombinação do ADN, no genoma dos vírus vacínia. Se o gene é integrado no sítio do ADN virai, que não é essencial para o ciclo de vida do vírus, é possível que os vírus vacínia recombinantes produzidos recentemente sejam infecciosos, isto é, sejam capazes de infectar células exógenas e assim expressem a sequência integrada de ADN (pedidos de patentes EP No. 83.286 e No. 110.385). Os vírus recombinantes de vacínia preparados desta forma podem ser utilizados-, por um 7 lado, como vacinas vivas para a profilaxia - de doenças infecciosas, por outro lado, para. a preparação de proteínas heterólogas em células eucarióticas-

Para as aplicações dos vectores deve-se atenuar os riscos para a saúde por meio da utilização de uma estirpe do vírus vacínia muitíssimo atenuada. Várias dessas estirpes do vírus vacínia foram especialmente desenvolvidas para evitar efeitos colaterais indesejáveis da vacinação da varíola. Assim, o Ankara de vacínia modificado (VAM) tem sido gerado por passagens em série de longa duração da estirpe Ankara do vírus vacínia (CVA) em fibroblastos de embriões de galinhas (para revisão ver Mayr, A. et· al. 1975 Infection 3: 6-14; patente suíça No. 568.392). 0 vírus VAM está publicamente' disponível na American Type Culture Collection como ATCC No. VR-1508. 0 VAM distingue-se pela sua grande atenuação, quer dizer, por meio . de uma virulência diminuída e uma capacidade para replicar em células de primatas, ao mesmo tempo que mantém uma boa imunogeneicidade. 0 vírus VAM tem sido analisado para determinar alterações no genoma relativamente à estirpe parental de. CVA. .Identificaram-se seis eliminações principais do ADN geriómico (eliminação I, II, III,·· IV, V e VI) que totalizam 31.000 pares de bases (Meyer, H. et al. 1991 J Gen Virol 72: 1031-1038). 0 vírus VAM resultante torna-se severamente uma célula hospedeira restrita a células de aves.

Além disso, o VAM é caracterizado pela sua extrema atenuação. Quando ensaiado numa variedade de modelos de animais, o VAN tem provado ser avirulento mesmo em animais imuno-suprimidos. Ainda mais importante, as excelentes propriedades da estirpe .VAM, têm sido ' demonstradas em ensaios-clínicos abrangentes (Mayr A. et al. 1978 Zentralbl 8

Bakteriol [BJ 167: 375-390; Stickl et al. 1974 Dtsch Med Wschr 99: 2386-2392). Durante estes estudos em mais de 120.000 seres humanos, incluindo pacientes de alto risco, não foram associados efeitos secundários à utilização da vacina do VAM.

Verificou-se que a replicação de VMA em células humanas era bloqueada numa fase tardia da infecção prevenindo a associação a viriões infecciosos maduros. Apesar de tudo, o VAM era capaz de expressar, em níveis elevados, genes virais e recombinantes, mesmo em células não permissivas e propôs-se que servisse como um vector de expressão de genes eficaz e excepcionalmente seguro (Sutter, G. e Moss, B. 1992 PNAS USA 89: 10847-10851). Além disso, as novas vacinas- de vector de vacínia · foram estabelecidas com base no VAM comportando sequências exógenas de ADN inseridas no sítio da eliminação III dentro do genoma de VAM (Sutter, G. et al. 1994 Vaccine 12: 1032-1040)

Os vírus de vacínia VAM recombinantes podem ser preparados tal como se estabelece aqui a seguir. Introduz-se uma estrutura de ADN que contém uma sequência de ADN que codifica para um polipéptido exógeno flanqueado pelas sequências de ADN de VAM adjacentes a uma eliminação de ocorrência natural, por exemplo, a eliminação III ou outros sítios não essenciais, dentro do genoma de VAM, em células infectadas com VAM, para permitir a recombinação homóloga. Uma vez introduzida a estrutura de ADN nas células eucarióticas e depois de o ADN exógeno se recombinar com o ADN virai, é possível isolar o vírus vacínia recombinante desejado, de uma maneira conhecida per se, preferencialmente com a ajuda de um marcador. A estrutura de ADN a ser inserida pode ser linear ou circular. --Prefere-se um 9 t-'"' plasmido ou um produto de uma reacção em cadeia de polimerase. A estrutura de ADN contém sequências que flanqueiam o lado esquerdo e o lado direito de uma eliminação de ocorrência natural, por exemplo, a eliminação III, dentro do genoma de VAM. A sequência de ADN exógeno é inserida entre as sequências que flanqueiam a eliminação de ocorrência natural. Para a- expressão de uma sequência de ADN ou de um gene, é necessário que as sequências reguladoras, que são necessárias para a transcrição do gene, estejam presentes no ADN. Essas sequências reguladoras (chamadas promotores) são conhecidas pelos .especialistas na técnica e incluem, por exemplo, as do gene de vacinia de 11 kDa tal como descrito na patente EP-A-198.328 e as do gene de 7,5 kDa (EP-A-110.385)A estrutura de ADN pode ser introduzida nas células infectadas com VAM por transfecção, por exemplo, por meio de precipitação em fosfato de cálcio (Graham et al. 1973 Virol 52: 456-467; Wigler et al. 1979 Cell 16: 777-785), por meio de electroporação (Neumann et al, 1982 EMBO J 1: 841-845), por microinjecção {Graessmann et al. 1983 Meth Enzymol 1Õ1: 482-492) , por meio de liposomas (Straubinger et al. 1983 Meth Enzymol 101: 512-527)·, por meio de esferoplastos (Schaffner 1980 PNAS· USA 77.: 2163-2167) ou por outxos processos conhecidos pelos especialistas na técnica. VIHs e a sua replicaçâo O agente etiológico. da síndrome de imuno-deficiência adquirida (SIDA) é reconhecido como sendo um retrovírus exibindo características típicas da espécie lentivírus, referido como o vírus da imunodeficiência humana (VIH). As relações filogenéticas dos lentivírus humanos estão ilustradas na figura I. O VIH-2 está mais relacionado de forma mais próxima com o VISsmm, um vírus isolado-a partir 10 de macacos Sooty Mangabey na selva, do . que com VIH-1. Acredita-se, hoje em dia, que o VIH-2 representa uma transmissão zoonótica do VISsmn para o homem. Uma série de isolados de lentivírus isolados de chimpanzés em cativeiro, designados, por VISCpZ, são parentes genéticos próximos do VIH-1.

As análises filogenéticas precoces dos isolados de VIH-1 focaram-se em amostras da Europa/América do Norte e África; identificaram-se agrupamentos discretos de virus a partir destas duas áreas do mundo. Em seguida definiram-se sub-tipos genéticos distintos ou ciados de VIH-1 e classificaram-se em . três grupos: M (principal) ; 0 (exógeno); e N (diferente de M ou de 0) (Fig. II). 0 grupo M de VIH-1, que inclui máis de 95 % do total dos isolados do virus global, consiste em pelo menos 8 ciados discretos (A, B, C, D, F, G, H e J) , com base na sequência dos genomas virais completos. Os membros do grupo 0 do VIH-1 têm sido recuperados de indivíduos que vivem nos Camarões, Gabão e Guiné Equatorial; os seus genomas partilham menos de 50 % de identidade, na sequência de nucleótidos, com os vírus do grupo M. 0 grupo mais recentemente descoberto, as estirpes VIH-1 do grupo N, têm sido identificadas em camaroneses infectados, não reagem serologicamente em vírus padrão completo no ensaio de imunoabsorçâo ligado a enzimas (ELISA), embora sejam prontamente detectáveis por meio da análise convencional de "Western blot". A maior parte do conhecimento actual acerca . da variação genética do VIH-1 resulta de estudos de vírus do grupo M com origem geográfica diversa. Os dados recolhidos durante a última década indicam que a população de VIH-1 presente em indivíduos infectados pode variar de 6 % a 10% nas sequências de nucleótidos. 0 VIH-1 isolado dentro de um 11 ciado pode exibir distâncias de nucleótidos de 15 % nas sequências de codificação em gag e até 30 % em gpl20. A variação genética inter-clados pode variar entre 30 % e 40 % consoante o gene analisado.

Em África podem encontrar-se todos os subtipos. do grupo M de VIH-1. Os vírus do ciado A são geneticamente os mais divergentes e foram os sub-tipos de VIH-1 mais comuns em África no inicio da epidemia. Com a rápida propagação do VIH-1 na África austral durante a última metade dos anos 90, os virus do ciado C têm-se tornado o subtipo dominante e são agora responsáveis por 48 % das infecções mundiais causadas por VIH-1. Os virus do ciado B, o subtipo de VIH-1 mais intensamente estudado, continuam a ser, dos virus isolados, o mais prevalente na Europa e na América do Norte.

Taxas elevadas de recombinação genética são a imagem de marca dos retrovirus. Acreditava-se inicialmente que não seria provável estabelecer infecções simultâneas causadas por diversas estirpes de virus geneticamente diferentes, em indivíduos em risco em relação ao VIH-1. Contudo, em 1995, tornou-se evidente que uma fracção significativa da diversidade global do grupo M de VIH-1 incluía produtos recombinantes virais inter-clados. Agora verificou-se que se encontram recombinantes de VIH-1 em áreas geográficas tais como África, América do Sul e Sudoeste asiático, em que coexistem múltiplos subtipos de VIH-1 e podem ser responsáveis por mais do que 10 % das estirpes de VIH-1 que circulam. Do ponto de vista molecular, os genomas destes vírus recombinantes parecem mosaicos de patchwork, com segmentos justapostos de diversos subtipos de VIH-1, reflectindo múltiplos eventos cruzados que contribuem para a sua geração. A maior parte dos recombinante-s- de VIH-1 - 12 apareceram em África e a maioria deles contêm segmentos originalmente derivados dos vírus do ciado A. Na Tailândia, por exemplo, a composição das estirpes predominantes que circulam consiste em segmentos dos genes gag mais pol do ciado A e ura gene .env do ciado E. Como o gene env do ciado E em estirpes tailandeses do VIH-1 está . altamente relacionado com o gene env do ciado E presente em isolados de vírus da República Centro Africana, crê-se que a ocorrência original de recombinação ocorreu em África, com a subsequente introdução de um vírus descendente na Tailândia. É interessante que, até à data, não foi referenciado nenhum produto isolado do subtipo E de VIH-1 de comprimento completo (isto é, com os genes gag, pol e env do subtipo E) . A descoberta de que os receptores de quimiocina α e β funcionam como co-receptores para a fusão do vírus e entram em células sensíveis a CD4+, levou à revisão do esquema de classificação do VIH-1 (Fig. III). Os isolados podem agora ser ' agrupados com base na utilização de receptores de quimiocina em ensaios de fusão em que as proteínas co-receptoras de gpl20 e CD4+ de VIH-1 são expressas em células separadas. Como. se indica na figura III, os-isolados de VIH-1 que utilizam o receptor de CXCR4 (agora designado por vírus X4) são normalmente estirpes que induzem sincício (IS) trópico nas linhas de células T (LCT), enquanto as que utilizam exclusivamente o receptor de CCR5 (vírus R5) são perdominantemente macrófagos (M) trópicos e não induzem sincício (NIS). As estirpes R5/X4 duplamente trópicas, que podem conter a maior parte dos isolados de pacientes e que exibem uma sequência contínua de fenotipos trópicos, são frequentemente IS. 13

Tal como no câso de todos os retrovlrus concorrentes da replicação, os três produtos primários da tradução de VIH-1, todas as proteínas estruturais que os codificam,· são inicialmente sintetizadas como precursores de poliproteínas, . que são em seguidas tratadas por meio . de vírus ou proteases celulares em proteínas associadas a partículas maduras (Fig. IV) . 0 precursor Gag de 55-kd, o Pr55Gag, é clivado na matriz (MA), na cápside (CA), na nucleocápside (NC), e nas proteínas p6. A autocatálise . da poliproteína Gag-Pol de 160 kd, a PrlôO233-1’03· dá origem às proteínas de protease (PR), de transcriptase inversa (TI) heterodimérica e de integrase (IN), em que a digestão proteolítica por enzimas celulares converte os produtos de clivagem da superfície (SU) do precursor de Env glicosado, de 160-kd, gplôO em produtos de clivagem da superfície (SU) de gpl20 e em produtos de clivagem da transmembrana (TM) de gp41. As restantes seis proteínas codificadas de VIH-1 (V.if, Vpr, Tat, Rev, Vpu e Nef) são os produtos primários de tradução dos ARNms combinados.

As. proteínas .Gag de VIH, como as de outros retrovlrus, são necessárias e suficientes para a formação de partículas não infecciosas semelhantes ' aos vírus. As proteínas retrovirais Gag são geralmente sintetizadas como precursores de poliproteínas; o precursor de Gag de VIH-1 tem sido designada, com base na sua massa molecular aparente, por Pr55Gag. Como se fez notar antes, o ARNm para Pr55Gag é o transcrito não combinado de 9,2-kb (Fig. IV) que requer Rev para a sua expressão no citoplasma. Quando o QLA de pol está presente, a protease (PR) virai cliva Pr55Gag durante ou imediatamente depois da geração, a partir da célula, para gerar as proteínas de Gag maduras pl7 -(MA) , 14 ρ24 (CA) f ρ7 (NC) e p6 (ver Fig. IV) . . No virião,·· MA está localizada imediatamente dentro da camada dupla de lipido do envelope virai, CA forma a porção externa da estrutura nuclear em forma de cone no centro da partícula e NC está presente no núcleo num complexo de ribonucleoproteína com· o genoma do ARN virai (Fig. V). 0 precursor Pr55Gag de VIH-1 oligomeriza no seguimento da sua tradução e é dirigido à membrana do plasma, onde as partículas com dimensão e densidade suficientes se juntam para serem visíveis por EM. A formação de partículas semelhantes a vírus por meio de Pr55Gag é um processo de auto-aglomeração, com interacções críticas Gag-Gag que têm lugar entre múltiplos domínios ao longo do precursor de Gag. A junção de partículas semelhantes a vírus não. requer a participação do ARN genómico (embora a presença de ácidos nucleicos pareça ser essencial), enzimas codificadas por pol ou glicoproteínas de Env, mas a produção de viriões infecciosos requer a encapsidação do genoma do ARN virai e a incorporação das glicoproteínas de Env e do precursor da poliproteína Gag-Pol, o Prl60Gag"Po1.

Pol..... A jusante de gag está a região mais altamente conservada do genoma de VIH, o gene pol, que codifica três enzimas: PR, RT e IN (ver Fig. IV) . RT e IN são necessárias, respectivamente, para a transcrição inversa do genoma do ARN virai para uma cópia do ADN de hélice dupla e para a integração do ADN virai no cromossoma da célula hospedeira. PR desempenha um papel crítico na parte final do ciclo de vida, mediando a produção de viriões infecciosos, maduros. Os produtos do gene pol são derivados, por clivagem enzimática, de uma proteína de 15 fusão Gag-Pol de 160-kd, referidas como Prl60Gag_Po1. Esta proteína de .fusão é produzida por desvio do quadro ribossómico durante a tradução de Pr55Gag (ver Fig.. IV) . Este mecanismo de desvio do quadro para a expressão de Gag-Pol, também utilizado por muitos outros retrovírus, assegura que as· proteínas derivas de pol são expressas num baixo nível, aproximadamente 5 % a 10 % em relação a Gag.· Tal como Pr55Gag, a terminação N -de Prl60Gag~po1 é miristilada e dirigida à membrana do plasma.

Protease

Estudos de "pulse-chase" precoces, realizados com retrovírus de aves, claramente indicaram que as proteínas retrovirâis Gag são inicialmente sintetizadas como precursores de poliproteínas que são clivados para gerar produtos mais pequenos. Estudos subsequentes demonstraram que a função de tratamento é dada mais pela parte virai do que pela enzima celular e que a digestão proteolítica dos precursores de Gag e de Gag-Pol é essencial para a infectividade do vírus. A análise da sequência das PRs retrovirâis indicou que estão relacionadas com as proteases celulares "aspárticas" tais como pepsina e renina. Tal como estas enzimas celulares, as PRs retrovirâis utilizam dois resíduos de Asp apostos no sítio activo para coordenar uma molécula de água que catalisa a hidrólise de uma ligação de péptido na proteína-alvo. Ao contrário das proteases celulares aspárticas, que funcionam como pseudodímeros (utilizando duas vezes dentro da mesma molécula para gerar o sítio activo) as PRs retrovirâis funcionam como verdadeiros dímeros. Os dados cristalográficos obtidos por raios X a partir da PR de VIH-1 indicam que os dois monómeros são mantidos juntos em parte por meio de uma folha β anti-paralela · de quarto - hélices derivada das 16 extremidades dos terminais N e C de cada monómero. 0 sitio de ligação do substrato está localizado dentro de uma fenda formada entre os dois monómeros. Tal como os seus homólogos celulares, o dimero da PR do VIH contém "abas" que estão suspensas no sitio de ligação e podem estabilizar o substrato dentro da fenda; os resíduos de Asp do sítio actívo residem no centro do dimero. É interessante notar que, apesar de se observar uma homologia de aminoácidos de alguma forma limitada à volta dos resíduos do sítio activo, as sequências primárias das PRs retrovirais são altamente divergentes, embora as suas estruturas sejam notavelmente similares.

Transcriptase inversa

Por definição, os retrovírus possuem a capacidade para converter os seus genomas de ARN de hélice simples em ADN de hélice dupla durante os estádios precoces do processo de infecção. A enzima que catalisa esta reacção é a RT, em conjunto com a actividade associada da sua RNaseH. As RTs retrovirais têm três actividades enzimáticas: (a.) a polimerização de ADN dirigida a ARN (para a síntese de ADN sem hélice), (b) a actividade de RNaseH {para a degradação do iniciador de ARNt e o ARN genómico presente nos intermédios híbridos de ADN-ARN) e (c) a polimerização de ADN dirigida a ADN (para a síntese de ADN com uma segunda ou mais hélices). A holoenzima RT madura, de VIH-1 é um heterodímero de subunidades de 66 e 51 kd. A subunidade de 51-kd Íp51) deriva da subunidade de 66-kd (p66.) por eliminação proteolítica do domínio RNaseH de 15 kd do terminal C de p66 por meio de PR (ver Fig. IV). A estrutura cristalina de RT de VIH-1 revela uma dobragem altamente assimétrica em 17 que a orientação das subunidades p66 e p51 diferem substancialmente. A subunidade p66 pode ser visualizada como uma mão direita, com o sitio activo da polimerase dentro da palma da mão e uma fenda profunda de ligação da matriz formada, pela palma da mão, os dedos e os subdominio do polegar. 0 domínio da polimerase está ligado a RNaseH por meio· do subdominio de ligação. 0- sitio activo, localizado na palma, contém três resíduos críticos de Asp (110, 185 e 186) em grande proximidade e dois iões de Mg2+ coordenados. A mutação destes resíduos de Asp vai abolir a polimerização de RT. A orientação dos três resíduos de Asp do sítio activo é similar à observada noutras polimerases de ADN (por exemplo, no fragmento. Kl.enow do ADN de poli de E. colí) . A subunidade p51 parece ser rígida e não forma uma abertura de polimerização; Asp 110,. 185 e 186 desta subunidade estão . enterradas , dentro da molécula. Aproximadamente 18 pares de bases do duplex de iniciador-matriz estão na abertura de ligação dos ácidos nucleicos, estendendo-se do sítio activo da polimerase até ao domínio de RNaseH.

Na estrutura de RT-iniciador-matriz-dNTP, a presença de um didesoxinucleótido na extremidade 3' do iniciador permite a visualização do complexo catalítico fixado imediatamente antes do ataque no dNTP de entrada. A comparação com as estruturas previamente obtidas sugere um modelo em que os dedos se fecham para fixar a matriz e o dNTP antes do ataque nucleofílico de 3’-OH do iniciador no dNTP de entrada. Depois da adição do dNTP de entrada à cadeia de crescimento, tem sido proposto que os dedos adoptem uma configuração mais aberta, libertando assim o pirofosfato e permitindo que RT se ligue ao dNTP seguinte. A estrutura de RNaseH de VIH-^1 também tem sido determinada 18 por cristalografia feita com raios X;· este dominio exibe uma dobragem global similar à de RNaseH de E. coli.

Integrados . Uma caracteristica distintiva da replicação do retrovírus é a inserção de uma cópia de um ADN do genoma virai no hospedeiro,, no cromossoma das células, no seguimento da transcrição inversa. 0 ADN virai integrado (o pro-virus) serve como matriz para a síntese dos ARNs virais e mantém-se como parte do genoma da célula hospedeira, durante o período de vida das células infectada. Os mutantes retrovirais, deficientes na sua capacidade para integrar,' geralmente falham no estabelecimento de uma infecção produtiva. A integração do ADN virai é catalisada pela integrase, uma proteína de 32-kd gerada por clivagem mediada por PR da porção do terminal C da poliproteína Gag-Pol de VIH-1 (ver Fig. IV).

As proteínas IN retrovirais são compostas por .três domínios estruturalmente e funcionalmente distintos: um terminal N, um domínio contendo um dedo de zinco, um. domínio nuclear e um domínio relativamente não conservado do terminal C. Por causa da sua baixa solubilidade, ainda não foi possível cristalizar toda a proteína IN do VIH-1 de 288 aminoácidos. Contudo, a estrutura dos três domínios tem sido resolvida independentemente por cristalografia de raios X ou processos de RMN. A estrutura de cristal do domínio nuclear do vírus do sarcoma de aves IN também foi determinada. 0 domínio do terminal N (resíduos 1 a 55) , cuja estrutura foi resolvida por espectroscopia de RMN é composto por quatro- hélices com um zinco coordenado pelos 19 V"1'' aminoácidos His-12, His-16, Cis-40 e Cis-43. A estrutura do domínio do terminal N é reminiscente das proteínas de ligação do ADN helicoidal que contêm o elemento designado por hélice-volta-hélice, contudo, na estrutura de VIH-1, este elemento contribui para a formação do- dímero. Inicialmente, a fraca solubilidade atrasou os esforços, para resolver a estrutura do domínio nuclear. ' Contudo, as tentativas para obter a cristalografia tiveram sucesso quando se observou que uma alteração de Fen- para -Lis no resíduo 185 de IN aumentou muitíssimo a solubilidade sem perturbar a actividade catalítica in vitro. Cada monómero do domínio nuclear de IN de VIH-.1 (resíduos de IN 50 a 212) é composto por uma folha β de cinco hélices flanqueada pelás hélices; esta estrutura apresenta uma semelhança impressionante com outras transferases de polinucleotidilos incluindo RNaseH e a transposase bacteriófaga MuA. Encontram-se três . resíduos altamente conservados em posições análogas noutras transferases de polinucleotidilos; nas IN de VIH-1 trata-se de Asp-64, Asp-116 e Glu-152, o chamado elemento D,D-35-E. As mutações nestas posições bloqueiam a função de IN do VIH tanto in vivo como in vitro. A grande proximidade destes três aminoácidos na estrutura de cristal tanto do vírus do sarcoma de aves como nos domínios do núcleo de VIH-1 suporta a hipótese de que estes resíduos desempenham um papel central na catálise da reacção de transferência de polinucleotidilo que está no centro do processo de integração. 0 domínio do terminal C, cuja estrutura tenha sido resolvida por processos de RMN, adopta uma topologia de dobragem β em . forma de barril reminiscente de um domínio com homologia com Scr 3 (SH3), de 5 hélices. Recentemente, as estruturas de raios X dos fragmentos de IN do vírus VIS e do vírus do sarcoma de Rous englobando tanto o domínio do núcleo como o domínio do terminal C foram resolvidas. 20

Env

As glicoproteinas do Env de' VIH desempenham um papel relevante no ciclo de vida do vírus. Contêm os determinantes que interagem com o receptor e o co-receptor de CD4 e catalisam a reacção de fusão entre a camada dupla de lipidos do- envelope virai e a membrana do plasma da célula hospedeira. Além disso, as glicoproteinas do Env de VIH contêm epítopes que provocam respostas imunitárias que são importantes tanto de uma perspectiva de diagnóstico como do desenvolvimento de vacinas. A glicoproteina doEnv de VIH sintetiza-se a partir de ARNm bicistrónico de Vpu/Env, de 4,3 kb, simplesmente combinados (ver Fig. IV) ; a tradução ocorre nos ribossomas associados com o retículo endopáslmico (RE) inacabado. 0. precursor da poliproteína de 160-kd (gpl60) é uma proteína de membrana integral que está ancorada às membranas das células por meio de um sinal de transferência da paragem hidrofóbíca no domínio destinado a ser a glicoproteina madura do Env de TM , gp41 (Fig. VI). A gpl60 é glicosada co-translacionalmente, forma ligações de bi-sulfureto e sofre oligomerização em ER. A forma oligomérica predominante parece ser um trímero, embora também se tenham observado dímeros e tetrâmeros. A gpl60 é transportada para o Golgi, onde, tal como outras proteínas precursoras do envelope retroviral, é clivada proteoliticamente por enzimas celulares na glicoproteina de SU madura gp 120 e na glicoproteina da TM gp41 (ver Fig. VI) . A enzima celular responsável pela clivagem dos precursores do Env retroviral no seguimento de um elemento de Lis/Arg-X-Lis/Arg-Arg altamente conservado é a furina ou uma protease semelhante a furina, embora outras enzimas possam também catalisar o tratamento de gpl60. A clivagem de gpl60 é necessária para 21 a actividade de fusão induzida por Env e a infectividade do virus. Subsequentemente à clivagem de gp 160, a gpl20 e a gp41 formam uma associação não covalente que é critica para o transporte do complexo do Env desde Golgi até à superfície das células. A interacção de gpl20-gp41 é bastante fraca e liberta-se uma quantidade substancial de gpl20 da superfície das células que expressam Env. 0 complexo de glicoproteína do Env de VIH, em particular o domínio da SU (gpl20), está muito fortemente glicosilado; aproximadamente metade da massa molecular de gpl60 é composta por cadeias laterais de oligossacáridos. Durante o transporte de Env a partir do seu sítio de síntese em ER para a membrana do plasma, muitas das suas cadeias laterais são modificadas pela adição de açúcares complexos. As numerosas cadeias laterais de oligossacáridos formam o que se poderia imaginar como sendo uma nuvem de açúcar que obscurece grande parte de gp 12 0 a partir do reconhecimento da imunidade do hospedeiro. Como se mostra na figure VI, a gp!20 contém domínios inter-dispersos conservados · (Ci a C5) e domínios variáveis (Vi a V5) . Ós resíduos de Cis presentes nas gpl20 de diferentes isolados estão altamente conservados e formam ligações de di-sulfureto que ligam as primeiras quatro regiões variáveis em grandes ansas.

Uma função primária das glicoproteínas virais de Env consiste em promover uma reacção de fusão da membrana entre as camadas duplas de lípidos do envelope virai e as membranas das células hospedeiras. Esta ocorrência da fusão da membrana permite que o núcleo virai ganhe entrada no citoplasma da célula hospedeira. Um certo número de regiões tanto na gpl20 como na gp41 esteve implicado, directa ou. •indirectamente, na· fusão- da membrana mediada por Env. Os 22 estudos da proteína de hemaglutinina HA2 dos ortomixovlrus e da proteína F dos paramixovírus indicaram que um domínio altamente hidrofóbico na terminação N destas proteínas, referido como o péptido de fusão, desempenha um papel crítico na fusão da membrana. As análises mutacionais demonstraram que um domínio análogo estava localizado na terminação N das glicoproteínas TMN de VIH-1, VIH-2 e VIS {ver Fig. VI) . As substituições não hidrofóbicas dentro desta região de gp41 reduziram enormemente ou bloquearam a formação de sincínio o que resultou na produção de viriões de progenia não infecciosos.

Os terminais C do péptido de fusão de gp41 são dois domínios helicoidais anfipáticos (ver .Fig. VI) que desempenham um papel central na fusão da membrana. As mutações na hélice do terminal N (referida como a hélice N), que contem um elemento repetido heptavalente semelhante a um fecho de correr de Leu, prejudica a infectividade e a actividade de fusão da membrana e os péptidos derivados destas sequências exibem uma potente actividade aiitiviral em cultura. A estrutura do ectodomínio da gp41 de VIH-1 e de VIS, em particular os dois elementos helicoidais, têm sido o foco das análises estruturais nos últimos anos. As estruturas foram determinadas por cristalografia por raios X ou espectroscopia de RMN quer para as proteínas de fusão contendo os domínios helicoidais, uma mistura de péptidos derivados das hélices N e C ou, no caso da estrutura de SIV, a sequência intacta do ectodomínio de gp41 desde o resíduo 27 a 149. Estes estudos obtiveram fundamentalmente estruturas triméricas semelhantes, em que os dois domínios helicoidais se sobrepusessem de uma maneira anti-paralela para gerar um feixe de seis hélices. As hélices N formam um enrolamento helicoidal no centro do feixe, com as hélices C encaixando-se em canais hidrofóbicos na parte exterior. 23

Nas etapas que levam à fusão'da membrana, a ligação de CD4 induz alterações na conformação em Env o que facilita a ligação do co-receptor. No seguimento da formação de um complexo ternário de gpl20/CD4/co-receptor, a gp41 adopta uma conformação hipotética que permite que o péptido de fusão seja inserido na camada dupla de lípidos que é· o alvo- A formação do feixe de seis hélices da gp41 (que envolve interacções ahti-paralelas· entre as· hélices N e C de gp41)’ coloca as 'membranas virais e celulares juntas e tem lugar a fusão da membrana-. · . .

Utilização ’do virus recombinante VAM para reforçar a resposta imunitária das células CD+8 A presente invenção tem por objecto a geração de uma resposta imunitária das células T de CD8+ contra um antigénio e também provo.car uma resposta de um anticorpo. Mais particularmente, a presente invenção tem por objecto regimes de imunização com "iniciadores e reforços" em que a resposta imunitária induzida pela administração, de uma composição de iniciação 'é' reforçada pela administração de .uma composição de reforço. A presente invenção baseia-se na demonstração experimental dos requerentes de que o reforço efectivo pode ser conseguido utilizando vectores de vacínia Ankara modificada (VAM), no seguimento da iniciação com qualquer variedade dos diferentes tipos de. composições de iniciação incluindo o próprio VAM recombinante.

Um dos componentes protectores principais da resposta imunitária contra um certo número de elementos patogénicos é mediado pelos linfócitos T do tipo CD8+, também conhecidos por linfócitos T citotóxicos (LTC). Uma importante função das células CD8+ é a secreção do interferão gama (IFNy) e esta função dá uma medida da 24 r· -' resposta imunitária das células T de CD8+. Um segundo componente da resposta imunitária é o anticorpo dirigido às proteínas do agente patogénico. A presente invenção utiliza VAM que, tal como mostram as experiências descritas a seguir, tem mostrado ser um meio eficaz para providenciar um reforço à resposta imunitária das células T de CD8+ iniciada com o antigénio utilizando qualquer uma das variedades de diferentes composições de iniciação e também provoca uma resposta de anticorpo. É de notar que o trabalho experimental descrito a seguir demonstra que a utilização de enquadramentos da presente invenção permite ao vírus VAM recombinante a expressão de um antigénio de VIH para reforçar a resposta imunitária das células T de CD8+ iniciada com uma vacina de ADN e também provocando uma resposta de anticorpo. Verificou-se que o VAM induz uma resposta das células T de CD8+ depois da uma imunização. intradérmica, intramuscular ou na mucosa. 0 VAM recombinante tem também mostrado que inicia uma resposta imunitária que é reforçada por uma ou mais inoculações de VAM recombinante.

Os primatas não humanos imunizados com ADN do plasmido e reforçados com o VAM ficaram efectivamente protegidos contra a inoculação intramucosa com vírus vivo. Com vantagem, os requerentes verificaram que se pode utilizar um regime de vacinação utilizado numa . imunização intradérmica, intramuscular ou através da mucosa tanto para a inoculação inicial como para o reforço, constituindo um regime de imunização geral apropriado., para a indução de células T de CD8+ e também provocando uma resposta de anticorpo, por exemplo, em seres humanos.. 25 A presente invenção-, era vários aspectos e enquadramentos, utiliza um vector de VAM que codifica um. antigénio de VIH tal como definido nas reivindicações em anexo para o reforço de uma resposta imunitária de células T de CD8+ ao anti.génio iniciado pela administração prévia de ácidos nucleicos que codificam o antigénio e também provocando uma resposta de anticorpo.

Um aspecto geral da presente invenção tem por objecto a utilização de um vector de VAM tal' como definido nas reivindicações em anexo para o reforço de uma resposta imunitária de células T de CD8+ a um antigénio de VIH e também provocando uma resposta de anticorpo.

Um dos objectivos da presente invenção' consiste na utilização de um vector de VAM incluindo o ácido nucleico que codifica o antigénio, tal como definido nas reivindicações em anexo, ligado operacionalmente a sequências reguladoras para a produção de antigénios no indivíduo por meio da expressão do ácido nucleico, em que a resposta imunitária da célula T de CD8+ ao antigénio previamente: inoculado no . indivíduo é reforçada para a preparação de uma vacina para o reforço da resposta imunitária da célula T de 008^ a um antigénio de VIH num indivíduo e provocando também uma resposta do anticorpo.

Uma resposta imunitária a um antigénio de VIH pode ser iniciada por imunização com ADN de plasmido ou por infecção com um'agente infeccioso. ..

Um outro objectivo da presente invenção consiste na utilização de uma composição de iniciação que compreende um ácido nucleico que codifica o antigénio e uma composição de reforço que compreende um vector de VAM' incluindo o-ácido- 26 nucleico que codifica o antigénio ligado operacionalmente às sequências reguladoras para a preparação de um antigénio num indivíduo por meio da expressão de um ácido nucleico, para a preparação de uma vacina para a indução de uma resposta imunitária das.células T de CD8+ a um antigénio de VIH num indivíduo e também provocando uma resposta do anticorpo em que a composição de iniciação é para ser administrada antes da composição de reforço.

Um outro aspecto tem por objecto a utilização de um vector de VAM tal como descrito, no fabrico de um medicamento para administração a um mamífero para reforçar uma resposta imunitária de células T de CD8+ a um antigénio de VIH e também provocando uma resposta do anticorpo. Tal medicamento é geralmente para administração no seguimento da administração anterior de uma composição de iniciação que compreende um ácido nucleico que codifica o antigénio. A composição de iniciação . pode compreender qualquer vector virai, tal como um vector de vírus vacínia tal como uma estirpe de deficiente replicação tal como Ankara de vacínia modificada (VAM) ou NYVAC (Tartaglia et al. 1992 Virology 118: 217-232) , um vector de avipox tal como da varíola das aves domésticas ou da varíola de canários, por exemplo/ a estirpe conhecida como ALVAC (Paoletti et al. 1994 Dev Biol Stand 82: 65-69) ou um vector de adenovírus ou um vector de vírus de estomatite vesicular ou um vector do vírus alfa. A composição de iniciação pode compreender o ADN que codifica o antigénio, estando esse ADN, preferencialmente, sob a forma de um plasmido circular, isto é, que não é capaz de se replicar em células de mamíferos. Qualquer marcador seleccionável não deve ser resistente a um 27 antibiótico utilizado clinicamente, por isso, por exemplo, a resistência à canamicina é preferível à resistência, à ampicilina. A expressão do antigénio deve ser conduzida por um promotor que esteja activo em células de mamífero, por exemplo, o promotor precoce imediato do citomegalovírus .(PI CMVj .

Em enquadramentos particulares de vários aspectos da presente invenção, a administração de uma composição de iniciação é seguida de um reforço com uma composição de reforço ou uma primeira e uma segunda composições de reforço, sendo a primeira e a segunda composições de reforço iguais ou diferentes uma da outra. Ainda se podem utilizar outras composições de reforço sem sair da presente invenção. Num enquadramento um regime de imunização tripla utiliza ADN, depois adenovírus como uma primeira composição de reforço, depois VAM como uma segunda composição de reforço, eventualmente seguida de mais uma (terceira) composição de reforço ou a subsequente administração de rim reforço de um ou de ambos os vectores iguais ou diferentes. Outra opção é ADN depois VAM e depois adenovírus, eventualmente seguido da subsequente administração de reforço de um ou outro ou de ambos os vectores iguais ou diferentes. 0 antigénio a ser codificado, no que respeita às composições de iniciação e de reforço (utilizam-sé contudo muitas .composições de reforço), não necessita de ser idêntico, mas deve partilhar pelo menos um epítope de células T de CD8+. O antigénio pode corresponder a um antigénio completo ou a um seu fragmento. Os epítopes de péptidos ou as sequências artificiais de epítopes podem ser utilizados mais eficientemente cortando a sequência desnecessária da proteína no antigénio e a sequência de 28 codificação no vector ou vectores. Pode-se inclui-r um ou mais epitopes adicionais, por exemplo, epitopes que são reconhecidos pelas células T auxiliares, especialmente epitopes reconhecidos em indivíduos em diferentes tipos de HLA.

Ura antigénio de VIH a ser codificado por um vírus de VAM recombinante, tal como definido nas reivindicações em anexo, ' inclui polipéptidos com actividade imunogéncia provocada por uma sequência de aminoácidos de um Env, Gag, Pol, Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu ou Nef de VIH como pelo menos um epítope de célula T de CD8+. Esta sequência de aminoácidos corresponde praticamente a pelo menos um fragmento de 10-900 aminoácidos e/ou uma sequência .de consenso de um Env ou Pol conhecido de VIH; ou pelo menos um .fragmento de 10-450 aminoácidos e/ou uma sequência de consenso de um Gag conhecido de VIH; ou pelo menos um fragmento de 10-100 aminoácidos e/ou uma sequência de consenso de um Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu ou Nef conhecido de VIH. , .

Embora se apresente uma sequência de comprimento completo do precursor de Env para ser utilizada na presente invenção, Env eventualmente será eliminado das subsequências. Por exemplo, podem eliminar-se as regiões da superfície de gpl20 e os produtos. de clivagem da transmembrana de gp41.

Embora se apresente uma sequência de comprimento completo do precursor de Gag para ser utilizada na presente invenção, Gag eventualmente será eliminado das subsequências. Por exemplo, podem eliminar-se as regiões da proteina matriz (pl7), as regiões da proteína da cápside (p24) , regiões da - proteína da nucleocápside (p7) e as- 29 fj .. t, ís regiões de p6 (o- péptido do terminal C da poliproteina

Gag} . .Embora se apresente uma sequência de comprimento completo do precursor de Pol para ser utilizada na presente invenção, Pol eventualmente será eliminado das subsequências. Por exemplo, podem eliminar-se as regiões da proteína da protease (plO), regiões da proteína da transcriptase inversa (p66/p51) e as regiões da proteína, integrase (p32).

Esses Env, Gag ou Pol de VIH podem ter uma identidade global de pelo menos 50 % em relação a uma sequência de aminoácidos da proteína conhecida de Env, Gag ou Pol, tal como uma identidade de 50-99 % ou qualquer intervalo ou valor, ao mesmo tempo que provoca uma resposta imunogénica contra pelo menos uma estirpe de VIH. A percentagem de identidade pode ser determinada, por exemplo, comparando a informação sobre a sequência utilizando o programa de computador GAP, na versão 6.0, disponível no University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)- O programa GAP utiliza o processo de alinhamento de Needleman e Wunsch (J Mol Biol 1970 48: 443), depois revisto por Smith e Waterman (Adv Appl Math 1981 2: 482). Em resumo, o programa GAP define a identidade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleótidos ou aminoácidos) que são idênticos, dividido pelo número total de símbolos na mais pequena das duas sequências. Os parâmetros por defeito preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação unitária . (contendo um valor de 1 para as identidades e 0 para as não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gríbskov e Burgess (Nucl Acids Res 1986 14: 67 4-5), tal como descrito por 30

Schwartz e Dayhoff (eds.,. Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. 1979, pp. 353-358); (2) uma penalização de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo; e (3) sem penalização para os intervalos das extremidades.

Num enquadramento preferido, um Env da presente invenção é uma forma variante de pelo menos uma proteína do envelope do VIH. Preferencialmente, o Env é composto por gpl20 e transpõe a membrana e o ectodomínio de gp41. mas falta-lhe todo ou parte do domínio citoplásmico de gp41. qAs sequências de VIH conhecidas estão facilmente disponíveis comercialmente e em bases de dados institucionais conhecidas de sequências de VIH, tal como o GENBANK ou como compilações publicadas, tal como na Myers et al. eds., Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Vol. I e II, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, N. Mex. (1993), ou http://hiv-web.lanl.gov/.

As substituições ou inserções de um Env, Gag ou Pol de VIH para se obter mais .Env, Gag ou Pol de VIH, codificados por um ácido nucleico para ser utilizado num vírus VAM recombinante da presente invenção, podem incluir substituições ou inserções de pelo menos um resíduo de aminoácido (por exemplo, aminoácidos 1-25). Alternativamente, pode-se·eliminar pelo menos um aminoácido (por exemplo, aminoácidos .1-25) de uma sequência de Env, Gag ou Pol de VIH. Preferencialmente, essas substituições, inserções ou eliminações são identificadas com base em características de segurança, níveis de expressão, 31 imunogeneicidade e compatibilidade com elevadas taxas de replicação de VAM.

As variações das sequências de aminoácidos de Env, Gag ou Pol de VIH da presente invenção podem ser preparadas,, por exemplo, por mutações no ADN. Esses Env, Gag ou Pol de VIH incluem, por exemplo, eliminações, inserções ou substituições de nucleótidos que codificam para diferentes residuos de aminoácidos dentro da sequência de aminoácidos. Obviamente, as mutações que serão feitas no ácido nucleico que codifica Env, Gag ou Pol de VIH não deverão colocar a sequência fora do quadro de leitura e, .preferencialmente, não irão criar domínios complementares que possam produzir estruturas, secundárias de ARNm. 0 ácido nucleico que codifica Env, Gag ou Pol de VIH da presente invenção pode também ser preparado por amplificação ou mutagénese dirigida ao sítio de nucleótidos em ADN ou ARN que codificam um Env, Gag ou Pol de VIH e sintetizando depois ou fazendo a transcrição inversa do ADN de codificação para produzir ADN ou ARN que codifica um Env, Gag ou Pol de VIH, com base nos ensinamentos e orientações aqui apresentados.

Os vírus de VAM recombinantes que expressam Env, Gag ou Pol de VIH da presente invenção, incluem um conjunto finito de sequências que codificam Env, Gag ou Pol de VIH como nucleótidos de substituição que podem ser obtidos por rotina por um especialista nesta técnica, sem experimentação desnecessária, com base nos ensinamentos e orientações aqui apresentados. Para uma descrição detalhada da química e da estrutura das proteínas, ver Schulz, G.E. et al., 1978 Principies of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, N.Y., e Creighton, T.E., 1983 Proteins: 32

Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA. Para uma apresentação de substituições de sequências de nucleótidos, tal como preferências de codões, ver Ausubel et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe., New York, N.Y. 1994 em §§ A.l.l-A.1.24 e Sambrook, J. et al. (19.89) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) nos apêndices C e D.

Assim, um especialista na matéria, considerando os ensinamentos e as orientações aqui apresentados, saberá como substituir outros resíduos de aminoácidos noutras posições de um ADN ou ARN de Env, Gag ou Pol de VIH para obter Env, Gag ou Pol alternativos de VIH, incluindo variantes de substituição, de eliminação ou de inserção.

Dentro do vector de VAM, as sequências reguladoras para a expressão do antigénio codificado incluirão um promotor do vírus da varíola natural, modificado ou sintético. Por "promotor" entende-se uma sequência de nucleótidos a partir da qual se pode iniciar a transcrição do ADN operacionalmente ligado a jusante (isto é, na direcção de 3' no sentido da hélice do ADN de hélice dupla). "Operacionalmente ligado" significa ligado como parte da mesma molécula de ácido nucleico, posicionado apropriadamente e orientado para a transcrição para ser iniciado a partir do promotor. 0 ADN operacionalmente ligado a um promotor está "sob o controlo da iniciação transcricional" do promotor. Se for apropriado, podem estar incluídas outras sequências reguladoras incluindo fragmentos de terminador, sequências de poliadenilação, genes marcadores e outras sequências, de acordo com o conhecimento e a prática de um especialista na matéria: 33 ver, por exemplo, Moss, B. (2001).. Poxviridae: the viruses and their replication. em Fields Virology, eds. D.M. Knipe, e P.M. Howley. (Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins), pp. 2849-2883. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a .manipulação de ácidos nucleicos, por exemplo, na preparação de estruturas, mutagéneses, sequenciação e introdução de ADN de ácidos nucleicos em células e a expressão de genes e a análise de proteínas estão descritas em detalhe em Current Protocols in Molecular Biology, 1998 Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons.

Os promotores a serem utilizados nos vários aspectos e enquadramentos da presente invenção devem ser compatíveis com os sistemas de expressão do vírus da varíola e incluem sequências naturais, modificadas e sintéticas.

Uma qualquer ou ambas as composições de iniciação e de reforço podem incluir um adjuvante, tal como um factor de estimulação de colónias de granulócitos e macrófagos (FEC-GM) ou os seus ácidos nucleicos de codificação. A administração da composição de reforço é geralmente feita cerca de 1 a 6 meses depois da administração da composição de iniciação, preferencialmente cerca de 1 â 3 meses.

Preferencialmente, a administração da composição de iniciação, da composição de reforço ou de ambas as composições de iniciação e de reforço, é uma imunização intradérmica, intramuscular ou através da mucosa. A administração das vacinas de VAM pode ser conseguida utilizando uma agulha para injectar uma suspensão do virus. 34

Uma alternativa é a utilização de um dispositivo para injecção sem agulha para administrar uma suspensão do virus (utilizando, por exemplo, um injector sem agulha Biojector™) ou um pó liofilizado novamente suspenso contendo a vacina, providenciando o fabrico de doses preparadas individualmente que não necessitam de armazenagem no frio. Isto constitui uma grande vantagem para uma vacina' que seja necessária em áreas rurais da África. VAM é um vírus com um registo de segurança excelente nas imunizações de seres humanos. A geração de vírus recombinantes pode ser conseguida simplesmente e podem ser fabricados de forma reprodutível em grandes quantidades. A administração do vírus VAM recombinante, intradérmica, intramuscular ou através da mucosa é por isso altamente apropriada para a vacinação profilática ou terapêutica de seres, humanos contra a SIDA que pode ser controlada por uma resposta de células T de CD8+. 0 indivíduo pode ter SIDA e então a administração do antigénio e a geração de uma resposta imunitária das células T de CD8+ ao antigénio é benéfica ou tem um efeito terapêutico benéfico. 0 mais provável é que a administração terá um objectivo profilático para gerar uma resposta imunitária contra o VIH ou a SIDA antes da infecção ou do desenvolvimento de sintomas.

Os componentes a ser administrados, de acordo com a presente invenção, podem ser formulados em composições farmacêuticas. Estas composições podem compreender um excipiente, veículo, tampão, estabilizante ou - outros 35 materiais bem. conhecidos dos especialistas na matéria e aceitáveis sob o' ponto de vista farmacêutico. Esses materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente activo. A natureza precisa do veículo ou de outro material pode depender da . via de administração, por exemplo, as vias intravenosa, cutânea ou subcutânea, nasal, intramuscular, intraperitoneal ou através da mucosa.

Como já se fez notar, a administração é preferencialmente intradérmica, intramuscular ou através da mucosa.

Pode-se incluir uma solução salina fisiológica, dextrose ou outras soluções de sacáridos ou glicóis tal como etileno-glicol, propileno^glicol ou . polietileno-glicol.

Para injecção intravenosa, cutânea, subcutânea, intramuscular ou através da mucosa ou injecção no sítio do sofrimento, o ingrediente activo estará sob a forma de uma solução aquosa aceitável sob o ponto de vista parentérico que está isenta de pirogénio e tem'um pH, isotonicidade e estabilidade apropriados. Os que têm conhecimentos relevantes nesta técnica são bem capazes de preparar soluções apropriadas utilizando, por exemplo., veiculos isotónicos tal como injecções de cloreto de sódio, injecção de Ringer, injecção de Ringer lactada. Quando necessário, podem-se incluir conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos.

Pode-se utilizar uma formulação de libertação lenta. 36

No. seguimento da produção das partículas de VAM e a formulação opcional dessas partículas em composições, as partículas podem ser administradas a um indivíduo, particularmente a um ser humano ou outros primatas. A administração pode ser feita a outros mamíferos, por exemplo, roedores, tal como murganhos, ratos ou hamsters, cobaias, coelhos, ovelhás, cabras, porcos, cavalos, vacas, burros, cães ou gatos. A administração é feita, preferencialmente, numa "quantidade efectiva sob o ponto de vista profilático" ou numa "quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico" (conforme o caso, embora a profilaxia possa ser considerada como. uma terapia), sendo isto suficiente para demonstrar o benefício para o indivíduo. A quantidade actual administrada e a taxa de tempo de duração da administração, dependerá da natureza e da severidade do que está a ser tratado.' A prescrição do tratamento, por exemplo, as decisões sobre a dose, etc., está dentro da responsabilidade dos. clínicos gerais e de outros médicos ou num contexto veterinário e normalmente tem em conta o distúrbio a ser tratado, o estado clínico individual do paciente, o sítio de libertação, o processo de administração e outros factores conhecidos pelos médicos. Exemplos das técnicas e protocolos mencionados antes podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, 1980, Osol, A. (ed.).

Num regime preferido, administra-se o ADN numa dose de 250 pg até 2,5 mg/injecção, seguido de VAM numa dose de 106 a 109 partículas infecciosas de vírus/injecção.

Uma composição pode ser administrada isoladamente ou em combinação com outros tratamentos, quer simultaneamente 37 ou sequencialmente consoante o estado clinico a ser tratado. A administração a um mamífero não humano não precisa de ter fins terapêuticos, mas pode . ser para uso num contexto experimental, por exemplo, em investigação de mecanismos de respostas imunitárias a um antigénio com interesse, por exemplo protecção contra o VIH ou a SIDA.,

Outros aspectos e enquadramentos da presente invenção serão evidentes para os especialistas nesta técnica, tendo em vista a descrição anterior e os exemplos experimentais que se seguem, incluídos a título de ilustração e não de limitação e com referência às figuras em anexo. EXEMPLO 1

Controlo de uma inoculação através da mucosa e prevenção da SIDA por meio de uma vacina de ADN/VAM de múltiplas proteínas

Aqui fez-s'e o ensaio de iniciação com ADN e um reforço de vírus da varíola quanto à capacidade para proteger contra uma inoculação altamente patogénica na mucosa. Os vírus quiméricos 89.6 de símios e da imunodeficiência humana (VIHS-89.6) foram utilizados para a preparação de imunogénios e os seus . derivados altamente patogénicos, VIHS-89.6P, para inoculação (G.B. Karlsson et al. 1997 J Virol 71: 4218). Os VIHS-89.6 e VIHS-89.6P não geram anticorpos de neutralização cruzada (D.C. Montefiori et al. 1998 J Virol 72: 3427} e permitiram pesquisar a capacidade das células T que originaram vacinas e os anticorpos não neutralizantes para controlar uma inoculação do virus da imunodeficiência; A vacínia Ankara modificada (VAM) - fo'i 38 utilizada para a preparação do vírus recombinante da varíola. 0 VAM tem sido altamente eficaz no reforço. As células T de CD8 que iniciaram o ADN e que gozam de características de segurança não replicam de forma eficaz em células de seres humanos e de macacos (H.L. Robinson et al. 2000 AIDS Reviews 2: 105).

Para assegura uma ampla resposta imunitária tanto os componentes do ADN como do VAM recombinante (VAMr). da vacina expressam múltiplas proteínas do vírus da imunodeficiência. O iniciador de ADN (ADN/89.6) expressou Gag, Pol, Vif, Vpx e Vpr do vírus da imunodef iciência de símios (VIS.) e Env, Tat e Rev do vírus da imunodeficiência humana 1 (VIH-1) de um único transcrito (R.J. Gorelick et al. 1999 Virology 253: 259; M.M. Sauter et al. 1996 J Cell Biol 132: 795).

As sequências de VIHS-89.6 clonadas molecularmente foram clonadas no vector pGA2 utilizando os sítios Ciai e Rsrll. Esta clonagem eliminou tanto as repetições de terminal longo (RTLs) como nef. As sequências de VIHS-89.6 também foram mutadas internamente para uma região com 12 pares de bases que codificam os primeiros quatro aminoácidos do segundo dedo de zinco na nucleocápside. Esta mutação torna os vírus de VIHS não infecciosos (R.J. Gorelick et al. 1999 Science 253: 259). Uma mutação em gp41 converteu a tirosina' na posição 710 em cisteína para se' conseguir uma melhor expressão de Env na membrana do plasma das células.que expressam ADN (M.M.. Sauter et al. 1996 J Cell Biol 132: 795). pGA2 utiliza o promotor imediato precoce de CMV sem o . intrão A e a sequência de poliadenilação da hormona, de crescimento de bovino para expressar as inserções da vacina. 0 ADN da vacina foi produzido por Althea (San- Diego,. CA) . Nas transfecções 39 s- \ Lr' transientes de 293 células T, o ADN/89.6 produziu cerca de 300 ng de Gag e 85. ng de Env por lxlO6 células. O reforço de VAMr (VAM/89.6, MVA/89.6 em inglês) expressou Gag, Pol de VIS e Env de VIH-1 sob o controlo dos promotores precoces e tardios do virus vacínia. O virus recombinante duplo de VAM expressou tanto o 89.6 Env de VIH como 239 . Gag-Pol de VIS, que foram inseridos numa eliminação II e numa eliminação III de VAM, respectivamente. A proteína 89.6 Env foi truncada para os 115 aminoácidos do terminal COOH de gp41. O promotor H5 modificado controlou a expressão de ambos os genes exógenos. A vacinação foi feita iniciando com ADN às 0 e 8 semanas e o reforço com VAMr às,24 semanas (Fig. IA). . As imunizações com ADN i.d. e i.m. foram dadas em solução tamponada com fosfato (STF) com um injector de jacto sem agulha (Bioject, Portland, OR) para administrar i.d. cinco injecções de 100-ul na parte exterior da coxa para a- dose de 2,5 mg de ADN ou uma injecção i.d. de 100 μΐ na parte externa da coxa direita para uma dose de 250 pg de plasmido. As administrações i.m. de ADN foram feitas com uma injecção de 0,5 ml de ASN em STF à parte externa de cada coxa para a dose de 2,5 mg e uma injecção de 100 μΐ na parte externa da coxa direita para uma dose de 250 pg. Adminístrou-se 1x10® pfu de VAM/89.6 tanto i.d. como i.m. com uma agulha. Administraram-se doses de 100 μΐ na parte exterior de cada coxa para a dose i.d. e uma dose de 500 μΐ na parte externa da coxa para a dose i.m. Os animais de controlo receberam 2,5 mg do vector pGA2 sem inserção de vacina com o dispositivo Bioject para adminis-trar cinco 40 doses de 100 μΐ i.d. na parte exterior de cada coxa.-A imunização de controlo com reforço de VAM consistiu em 2xl08 pfu de VAM' sem a inserção, . administrada i.d. e i.m., tal como descrito para VAM/89.6.

Inocularam-se quatro grupos, de seis macacos rhesus cada um, quer com 2,5 mg (dose elevada) ou 250 pg (dose baixa) de ADN pelas vias intradérmica (i.d.) ou intramuscular (i.m.) utilizando um dispositivo de jacto sem agulha (Bioject, Portland, OR) (T.M. Allen et al. 2000 J Immunol 164: 4968).

Cuidaram-se macacos rhesus jovens, de uma colónia que se reproduziu em Yerkes, de acordo com as orientações estabelecidas pelo Animal Welfare Act e o "Guide for .the Care and Use of Laboratory Animais" do NIH, com protocolos aprovados pelo the Emory University Institutional Animal Care and Use Committee. Os macacos foram tipificados em relação ao alelo Mamu A*01 com análises por reacção em cadeia de polimerase (RCP) (M.A. Egan et al. 2000 J Virol 74: 7485; I. Ourmanov et al. 2000 J Virol 74: 2740). Dois ou mais animais que comportavam pelo menos um alelo. de Mamu-A*01 foram atribuídos a cada grupo. Os números dos animais são os seguintes: 1, RBr-5*; 2, RIm-5*; 3, RQf-5*; 4, RZe-5; 5, ROm-5; 6, RDm-5; 7, RAj-5*; 8, RJi-5*; 9, RAI-5*; 10, RDe-5*; 11, RAi-5; 12, RPr-5; 13, RKw-4*; 14, RWz-5*; 15, RGo-5; 16, RLp-4; 17, RWd-6; 18, RAt-5; .19, RPb-5*; 20, Rli-5*; 21, Rlq-5; 22, RSp-4; 23, RSn-5; 24, RGd-6; 25, RMb-5*; 26, RGy-5*; 27, RUs-4; e 28, RPm-5. Os animais com o alelo A*01 estão indicados com asteriscos. A administração do ADN por meio de genes não foi feita porque tinham respostas imunitárias iniciadas não protectoras num ensaio de 1996 - 98 (H.L. Robinson et al.· 41 1999 Nat Med 5: 526). A imunização com reforço de VAM/89.6 (2xl08 unidades de formação de placas, pfu) foi injectada com uma agulha tanto i.d. como i.m. Um grupo de controlo incluiu dois animais falsamente imunizados e dois animais que não passaram pela experiência. A inoculação foi dada 7 meses depois do reforço de VAMr para avaliar a geração de imunidade a longo prazo. Como a maior parte das infecções por VIH-1 são transmitidas através das superfícies da mucosa, fez-se uma inoculação intrarectal. A iniciação com ADN seguida do reforço com VAMr gerou frequências elevadas de células T específicas dos vírus que tiveram um pico na semana que se seguiu ao reforço com MVAr (Fig. IA). As frequências das células T reconheceram que os epítopes de Gag-CM9 foram avaliadas por meio dos tetrâmeros de Mamu-A*01 e as frequências de células T que reconhecem os epítopes ao longo de Gag foram avaliados com conjuntos de péptidos de sobreposição e um ensaio de "immunospot" ligado à enzima (ELISPOT) (C.A. Power et al. 1999 J Immunol Methods 227: 99).

Para a análise dos tetrâmeros, fez-se a coloração da superfície de cerca de lxlO6 de células mononucleares de sangue periférico (CMSP) com anticorpos contra CD3 conjugados com isotiocianato de fluoresceína (ITCF) (FN-18; Biosource International, Camarillo, CA), CD8 conjugados com a proteína de peridinin-clorofila (PerCP) (SKI; Becton Dickinson, San Jose, CA) e o tetrâmero Gag-CM9 {CTPYDIN-QM) -Mamu-A*01 (SEQ ID NO: 6) conjugado com aloficocianina (AFPC) , num volume de 100 μΐ a 8o até 10°C durante 30 min. Lavaram-se as células duas vezes com STF fria contendo 2% de soro de bovino fetal (SBF), fixaram-se com para-formaldeído a 1 % em SBF e analisou-se no prazo de 24 hrs num calibrador de SCAF (Becton Dickinson, San Jose., CAj . As 42 células foram inicialmente fixadas em populações de linfócitos com dispersão para a frente e lateral e depois em células CD3. Analisaram-se então as células CD3 quanto a CD8 e células de ligação do tetrâmero. Adquiriram-se cerca de 150.000 linfócitos para cada amostra. Os dados foram analisados utilizando o programa informático FloJo (Tree Star, San Carlos, CA).

Para o interferão-γ (IFN-γ) cobriram-se as placas de filtração de 96 poços de ELISPOTs, MULTISCREEN (Millipore Inc. Bedford, MA) , durante a noite, com um anticorpo do. IFN-γ humano (Clone B27, Pharmíngen, San Diego, CA) numa concentração de 2 pg/ml em tampão de bicarbonato de sódio (pH 9,6) a 8o até 10°C. Lavaram-se.as placas duas vezes com meio RPMI e, depois bloquearam-se durante 1 hora com meio completo (RPMI contendo SBF a 10%) a 37 °C. As placas foram lavadas mais cinco vezes com meio RPMI completo e semearam-se as células em duplicado em 100 pl de meio completo num valor variando de 2xl04 a 5xl06 células por poço. Adicionaram-se conjuntos de péptidos a cada poço até a uma concentração final de 2pg/ml de cada péptido num volume de 100 μΐ em meio completo. Fez-se uma cultura de células a 37 °C durante cerca de 36 hrs em atmosfera de CO2 a - 5 %. Lavaram-se as placas seis vezes com tampão de lavagem (SBF com Tween-20 a 0,05 %) e depois incubou-se com 1 pg de anticorpo biotinilado de IFN-γ humano por mililitro (clone 7-86-1; Diapharma Group, West Chester, OH) diluído em tampão de lavagem contendo SBF a 2 %. Incubaram-se as placas durante 2 hrs a 37 °C e lavou-se seis vezes com tampão de lavagem. Adicionou-se avidina-peroxidase de rábano (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a cada poço e incubou-se durante 30 a 60 min a 37°C. Lavaram-se as placas seis vezes com tampão de lavagem e desenvolveram-se as manchas (spots) utilizando como substrato DAB estável- 43 (Research Genetics, Huntsville, AL). Contaram-se as manchas com um microscópio de dissecção estéreo. Incluiu-se como controlo um péptido de albumina do ovo (SIINFEKL) SEQ ID NO: 7) em cada análise. As manchas iniciais para o péptido de albumina do ovo foram geralmente <5 para 5xl05 CMSPs. Este valor de base, quando normalizado para 1x10® de CMSP foi <10. Apenas as contagens por ELISPOT que eram duas vezes o valor de base (> 20) foram considerados significativas. As frequências de ELISPOTs são aproximadas porque diferentes diluições das células têm eficiências diferentes de formação de manchas na ausência das células a liment adoras (C.A. Power et al. 1999 J Immunol Methods 227: 99). Utilizou-se a mesma diluição das células utilizada para todos os animais num dado momento, mas utilizaram-se diferentes diluições para detectar memória e respostas agudas.

As análises do tetrâmero de Gag-CM9 foram restritas aos macacos que expressaram o tipo de histocompatibilidade de Mamu A*01, em que as respostas de ELISPOT não dependem ' de um tipo especifico de histocompatibilidade. Conforme esperado, a imunização com ADN elevou os niveis baixos de células de memória que se expandem para frequências elevadas no prazo de uma semana após a administração do reforço com VAMr (Fig. 1 e 6) . Nos macacos com Mamu A*01, as células CD8 especificas para o epítope de Gag-CM9 expandiram-se para frequências tão altas quanto 19 % do total das células T de. CD8 (Fig. 6). Este pico de células especificas sofreu uma contracção de 10 a 100 vezes no conjunto de memórias de ADN/VAM (Fig. IA e 6) . Os ELISPOTs para três conjuntos de péptidos Gag também sofreram uma expansão grande (frequências até 4000 manchas para IxlO6 de CMSP) antes de se contraírem 5 a 20 vezes na resposta de ~ memórias de ADN/VAM (Fig. 1B). As frequências dos ELISPOTs 44 foram as mesmas nos macacos com e sem o tipo de histocompatibilidade do tipo A*01 (P > 0,2).

Utilizou-se a regressão linear simples para estimar as correlações entre, as respostas de ELISPOT após o reforço e após a inoculação, as respostas de ELISPOT entre a memória e após a inoculação e entre as cargas virais transformadas logaritmicamente e as frequências de ELISPOT. As comparações entre os grupos da vacina e o grupo de controlo e os macacos com' A*01 e sem A*01 foram realizadas por meio de testes t em duas amostras com a carga virai transformada logaritmicamente e as respostas de ELISPOT. Utilizaram-se duas formas de análises' de variância para examinar os efeitos da dose e a via de administração no pico dos ELISPOTs de ADN/VAM, nos ELISPOTs de ADN/VAM das memórias e os dados do anticorpo de Gag transformados logaritmicamente.

Tanto nas fases de pico como na de memória da resposta à vacina, a ordem da posição para a altura dos ELISPOTs nos grupos de vacina foi de 2,5 mg i.d. > 2,5 mg i.m. > 250 pg i.d. > 250 pg i.m. (Fig. 1B). Os ELISPOT de IFN-γ incluíram tanto as células de CD4 como as de CD8. As células de CD8 específicas de Gag-CM9 têm boa actividade lítica após a re-estimulação com péptido. A inoculação com VIHS-89.6P, altamente patogénica, foi administrada inter-rectalmente 7 meses após o reforço com VAMr, quando as células T, que aumentaram com a vacina, ficaram na memória (Fig. 1) . 0 concentrado de inoculação (5,7 x 109 cópias de ARN virai por mililitro) foi produzido por uma passagem intravenosa seguida-de uma passagem intrarectal em macacos 45 rhesus do concentrado original de VIHS-8.9.6P (G. B. Karlsson et al. 1997 J Virol 71: 4218) . Colheram-se as células linfóides a partir do animal infectado intrarectalmente, num pico de virémia, CD8 empobrecidas e mitogenes estimulados para a produção dé concentrado. Antes da inoculação intrarectal, anestesiaram-se animais em jejum (cetamina, 10 mg/kg) e colocaram-se sobre o seu estômago com a região pélvica ligeiramente elevada. Inseriu-se um tubo de alimentação (8Fr (2.7 mm) x.16 polegadas (41 cm); Sherwood Medicai, St. Louis, MO) no recto até a uma distância de 15 a 20 cm. No seguimento da inserção do tubo de alimentação, ligou-se ao tubo uma seringa contendo 20 doses infecciosas intrarectais em 2 ml de RPMI-1640 mais SBF a 10 % e injectou-se lentamente o inoculo no recto. Depois da administração do inoculo, lavou-se o tubo de alimentação com 3,0 ml de RPMI sem SBF e depois retirou-se lentamente. Deixaram-se os animais no lugar, com as regiões pélvicas ligeiramente elevadas, durante um período de dez minutos após a inoculação. A inoculação infectou todos os animais vacinadose os de controlo (Fig. 2). Contudo, 2 semanas após a inoculação, os títulos do ARN virai do plasma foram pelo menos 10 vezes menores nos grupos vacinados (médias geométricas de lxlO7 a 5xl07) do que nos animais de controlo (média geométrica de 4xl08) (Fig. 2A) (S. Staprans et al. em: Virai Genome Methods K. Adolph, ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1996 pp. 167-184; R. Hofmann-Lehmann et al. 2000. AIDS Res Hum Retroviruses 16: 1247).

Para a determinação do número de cópias de VIHS, extraiu-se directamente o ARN de 150 μΐ de plasma anticoagulado de ACD com o kit de ARN virai QIAamp (Qiagen), eluíu-se em 60 μΐ de tampão de AVE e congelou-se 46 a -80 °C até se realizar a quantificação do ARN do VIHS. Fez-se a transcriptase inversa de cinco microlitros de ARN de , plasma purificado, num volume final de 20 μΐ, contendo KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mH (pH 8,3), MgCl2 4 mM, 1 mM de cada trifosfato de desoxinucleótido (dNTP), 2,5 μΜ de hexameros aleatórios, 20 unidades de TI da MultiScribe e 8 unidades de inibidor . de ribonuclease. As misturas reaccionais foram incubadas a 25 °C durante 10 min, seguido de incubação a 42 °C durante 20 . min e inactivação de transcriptase inversa a 99 °C durante 5 min. Ajustou-se a mistura reaccional até a um volume final de 50 μΐ contendo KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl2 4 mM, 0,4 mM de cada trifosfato de desoxinucleótido (dNTP), 0,2 μΜ de iniciador directo, 0,2 μΜ de iniciador inverso, 0,1 μΜ de sonda e 5 unidades de polimerase de ADN da AmpliTaq Gold (todos os reagentes da Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) . As sequências de iniciador dentro de uma porção conservada do gene gag de VIS são as mesmas que as descritos previamente (S. Staprans et al. in: Virai Genome Methods K. Adolph, ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1996 pp. 167-184). Utilizou-se um sistema de detecção de sequências 7700 da Perkin Elmer Applied Biosystems com o perfil da RCP: 95° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 93 °C durante 30 s e 59,5 °C durante 1 min. A acumulação do produto de RCP foi monitorizada com o detector de sequências 7700 e uma sonda para uma sequência interna do gene gag conservado: 6FAM-CTGTCTGCGTCATTTGGTGC-Tamra (SEQ ID NO: 8), em que FAM e Tamra indicam o corante repórter e o extintor. Determinou-se o número de cópias do ARN de VIHS por comparação com uma curva padrão externa que consiste no ARN de VISmac239, derivado de um virião, quantificado pelo processo do ADNb de VIS (Bayer Diagnostics, Emeryville, CA) . Todas as amostras foram extraídas e amplificadas em duplicado, relatando-se o resultado médio. Com uma-entrada 47 ο de plasma de 0,15 ml, o ensaio tem uma sensibilidade de 10 cópias de ARN por mililitro de plasma e um intervalo de dinâmica linear de 103 a 108 cópias de ARN (R2 = 0,995). O coeficiente de variação intra-ensaio foi < 20% para amostras contendo > 104 cópias de ARN de VIHS por mililitro e < 25 % para amostras contendo 103 a 104 cópias de ARN de VIHS por mililitro. Para quantificar de forma mais rigorosa o baixo número de cópias de ARN de VIHS nos animais vacinados nas 16a e 20 a semanas, os requerentes fizeram as modificações que se seguem para aumentar a sensibilidade do ensaio de ARN de VIHS: (i) Concentraram-se viriões de < 1 ml de plasma por centrifugação a 23.000g a 10 °C. durante 150 min antes da extracção do ARN virai e (ii) utilizou-se um processo de RCP de transcripta.se inversa, numa só etapa (R. Hofmann-Lehmann et al. 2000 AIDS Res Hum Retroviruses 16: 1247). Estas alterações providenciaram um limite de quantificação fiável de 300 cópias, de ARN de. VIHS por mililitro e deu valores de ARN de VIHS que estão altamente correlacionados com os obtidos pelo primeiro processo utilizado (r = 0,91, P < 0,0001).

Cerca de 8 semanas após a inoculação, tanto os grupos iniciados com uma dose· elevada de ADN como o grupo iniciado com o ADN i.d. em dose baixa tinham reduzido as médias geométricas das cargas até cerca de 1000 cópias de ARN virai por mililitro. Nesse momento, o grupo iniciado com uma dose baixa de ADN i.d. tinha uma média geométrica de 6xl03 cópias de ARN virai e os controlos de não vacinados tinham uma média geométrica de 2 x 106. Cerca de 20 semanas depois da inoculação, mesmo o grupo de dose baixa i.m. tinha reduzido as suas médias geométricas de cópias de ARN virai para 1000. Entre os 24 animais vacinados, apenas um animal, com o número de animal 22 no grupo de dose baixa 48 i.iru, tinha cargas virais intermitentes acima de lxlO4 cópias por mililitro (Fig 2D) .·

Cerca de 5 semanas após a inoculação, todos os controlos não . vacinados tinham sofrido um profundo empobrecimento das células CD4 (Fig 2B) . Todos os animais vacinados mantiveram as suas células CD4, com excepção do animal 22 no grupo de dose baixa i.m. (ver antes), que sofreu um lento declínio de CD4 (Fig. 2E) . Próximo das 23 semanas após a inoculação, três dos quatro animais de controlo tinham sucumbido à SIDA (Fig. 2C) . Estes animais tinham graus variáveis de enterocolite com diarreia, criptoesporidiose, colecistite, infecção entérica por campylobacter, esplenomegália, linfadenopatia e pneumonia das -células gigantes associada ao VIS. Pelo contrário, os 24 animais vacinados mantiveram a sua saúde. 0 confinamento da inoculação virai foi associado ao surgimento de células T antivirais (Fig. 1 e 3A)·. Uma semana depois da inoculação, a frequência das células do tetrâmero+ no sangue periférico tinha diminuído,' reflectindo potencialmente o recrutamento de células T específicas para o sítio da infecção (Fig. 3A) . Contudo, cerca de duas semanas depois da inoculação, as células de tetrâmero+ no sangue periférico tinham-se expandido para frequências tão altas quanto ou mais altas do que as frequências depois do reforço com VAMr (Fig. 1 e 3A) . A maioria das células do tetrâmero+ produziram IFN-γ em resposta a uma estimulação do péptido de 6 horas (Fig. 3B) (S.L. Waldrop et al. 1997 J Clin Invest 99: 1739) e não tiveram o "atordoamento" do fenótipo negativo de IFN-γ algumas vezes observado em infecções·. virais (F. Lechner et al. 2000 J Exp Med 191: 1499). 49

Fara os ensaios da citocina intracelular, estimulou-se cerca de lxlO6 de CMSP durante 1 hora a 37 °C em tubos de polipropileno de 5 ml com 100 pg de péptido Gag-CM9 (CTPYDINQM) (SEQ ID NO: 6) por mililitro num volume de 100 μ! de RPMI contendo albumina de soro bovino (ASB) a 0,1 % e 1 pg de anticorpo contra CD28 humana e 1 pg de anticorpo contra CD49d humana (Pharmingen, San Diego, CA) por mililitro. Depois, adicionou-se 900 pl de RPMI contendo SBF a 10 % e monensina (10 pg/ml) e fez-se a cultura de células durante mais 5 hrs a 37 °C num ângulo de 5o em atmosfera de CO2 a 5 %. Corou-se a superfície das células com anticorpos a CD8 conjugados com PerCP (clone SKI, Becton Dickinson) a 8 0 até 10 °C durante 30 min, lavou-se duas vezes com STF contendo SBF a 2 % e fixou-se e permeabilizou-se com uma solução de Cytofix/Cytoperm (Pharmingen). As células foram então incubadas com anticorpos a CD3 humano (clone FN-18; Biosource International, Camarillo, CA) and IFN-γ (Clone B27; Pharmingen) conjugado com ITCF ed ficoeritrina, respectivamente, em solução de lavagem Perm (Pharmingen) durante 30 min a 4°C. Lavaram-se as células duas vezes com solução de lavagem de· Perm, uma vez só com SBF total e voltou a fazer-se uma suspensão em paraformaldeído a 1 % em SBF. Adquiriram-se 150.000 linfócitos no calibrador de SCAF e analisou-se com o programa informático FioJo. A explosão das células T após a inoculação reduziu-se concomitante com o· declínio da carga virai.. Cerca de 12 semanas após a inoculação, as células T específicas do vírus estavam presentes em cerca de um décimo da sua altura de pico . (Figs. IA e 3A) . Ao contrário da resposta secundária vigoroa nos animais vacinados, os animais que não passaram por esta experiência tiveram uma resposta primária modesta (Fig. 1B e 3A) . As células do tetrâmero* tiveram um pico inferior a 1 % do total de células CD8 50 A 3 ' (Fig. 3A) e o IFN-γ que produziu ELISPOTs estava presente numa frequência média de cerca de 300 em oposição às frequências muito mais altas de 1000 a 6000 nos grupos das vacinas (Fig. 1B) (P < 0,05).

As células de tetrâmero* no grupo de controlo, como as do grupo da vacina, produziram IFN-γ após a estimulação do péptido (Fig. 3B). Por volta da 12a semana após a inoculação, três . dos quatro controlos tinham níveis indetectáveis de IFN-γ produzindo ELISPOTs. Esta rápida perdâ das células T antivirais na presença de elevadas cargas virais pode reflectir a perda de CD4 auxiliar.

As respostas proliferativas das células T demonstraram que as células CD4 específicas do vírus tinham sobrevivido à inoculação e estavam disponíveis para suportar a resposta imunitária antiviral (Fig. 3C).

Estimulou-se cerca de 0,2 milhões de CMSP em triplicado durante 5 dias, com o antigénio indicado, em 200 μΐ de RPMI a 37 °C numa atmosfera de C02 a 5 %. Os sobrenadantes das células 293 T transfectadas com ADN que expressa quer Gag e Pol de VIRS-89.6 ou Gag, Pol e Env de de VIHS-89.6 foram utilizados directamente como antigénios (concentração final de ~0,5 pg de p27 Gag por mililitro). Os sobrenadante das células transfectadas do ADN simulado (apenas o vector) serviram como controlos negativos. Ao sexto dia, as células foram submetidas a pulsação com 1 pCi de timidina tritiada, . por poço, durante 16 a 20 horas. Colheram-se as células com um dispositivo de colheita automática de células (TOMTEC, Harvester 96, Modelo 1010, Hamden, CT) e contaram-se com um contador de cintilação Wallac 14 50 MICROBETA (Gaithersburg, MD) . Os índices de estimulação são as contagens da timidina tritiada 51 incorporada nas CMSP estimuladas com os antigérvios 89.6 divididas pelas contagens da timidina tritiada incorporada nas mesmas GMSP estimuladas com os antigénios simulados. 12 Semanas após a inoculação, os índices médios de estimulação para Gag-Pol-Env ou Gag-Pol,- variavam de 35 a 14 proteínas nos grupos da vacina mas eram indetectáveis no grupo de ' controlo. Consistente com os ensaios de proliferação, os ensaios de citocina intracelular demonstraram a presença das células CD4 específicas do vírus nos animais vacinados mas não nos de controlo. A ordem da posição global dos grupos vacinados para a amplitude da resposta proliferativa foi de 2,5 mg i.d. > 2,5 mg. i.m. > 250 pg i.d. > 250 pg i.m. 12 Semanas após a inoculação, os nódulos linfáticos dos animais vacinados estavam intactos sob o ponto de vista morfológico e responderam à infecção, enquanto os dos controlos infectados tinham sido funcionalmente destruídos (Fig. 4). Os nódulos dos animais vacinados continham grandes quantidades de.folículos secundários reactivos com centros de expansão germinais e zonas discretas escuras e claras (Fig. 4A}. Pelo contrário, os nódulos linfáticos dos animais de controlo não vacinados mostraram uma diminuição folicular. e paracortical (Fig. 4B) , enquanto os dos animais não vacinados e não inoculados exibiram números normais de centros germinais minimamente reactivos (Fig. 4C). Os centros germinais ocuparam < 0,05 % da área total dos nódulos linfáticos nos controlos infectados, 2 % da área dos nódulos linfáticos nos controlos não infectados e até 18 % da área dos nódulos nos grupos vacinados (Fig. 4D). A reactividade imunitária mais vigorosa nos animais iniciados com uma dose baixa de ADN foi sugerida pelos centros germinais mais extensos no grupo da dose baixa (Fig. 4D) . 52

Passadas 12 semanas após a inoculação, a hibridaçã in situ para o ARN virai revelou células com uma rara expressão de virus nos nódulos linfáticos de 3 dos 24 macacos vacinados, enquanto as células que expressam o virus foram prontamente deteCtáveis nos nódulos linfáticos dos animais de controlo infectados. Nos controlos, que tinham sofrido um profundo empobrecimento nas células T de CD4, a citomorfologia das células dos nódulos linfáticos infectados foi consistente com um fenótipo de macrófago. A estratégia de inoculação/reforço deu origem a níveis baixos de anticorpo de Gag e níveis indetectáveis de anticorpo de Env (Fig. 5}. Após a inoculação, os anticorpos tanto de Env como de Gag sofreram respostas anamnésicas com o anticorpo total de Gag atingindo picos que se aproximaram de 1 mg/ml e o anticorpo total de Env atingindo picos até 100 pg/ml.

Os ensaios de imuno-absorção ligados a enzimas (ELISAs) para o anticorpo de Gag utilizados sob o ponto de vista bacteriano produziram gag p27 de VIS oara revestir os poços (2 pg por mililitro em tampão de bicarbonato) . Os ensaio ELISAs para o anticorpo do anticorpo de Env utilizou Env 89.6 produzido nas células T 293 transfectadas temporariamente e foi capturado com anticorpo de ovelhas contra Env (número de catálogo 6205; International Enzymes, Fairbrook CA). As curvas padrão para os ensaios ELISAs para Gag e Env foram produzidas com soro de um macaco infectado com VIS-89.6 com quantidades conhecidas de imunoglobulina G (IgG) específica para Gag ou Env. Detectou-se o anticorpo ligado com anticorpo de cabra conjugado com peroxidase para IgG de macaco (catálogo # YNGMOIGGFCP; Accurate Chemical, Westbury, NY) e substrato de TMB (catálogo # T3405; Sigma, St. Louis, MO). Fizeram-se os ensaios dos soros com 53 diluições de três vezes era poços duplicados. Realizaram-se as diluições dos soros dos ensaios em tampão de soro de leite (soro de leite a 4 % e Tween 20 a 0,1 % em IX SBF). 0 tampão de bloqueio consistiu num tampão de soro de leite ruais leite, em pó desnatado a 0,5 %.

Pararam-se as reacç.ões com H2SO4 2M e leu-se a densiodade óptica a 450 nm. Ajustaram-se as curvas padrão e interpolaram-se as concentrações da amostra como pg de anticorpo por ml de soro utilizando o programa informático SOFTmax 2.3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Cerca· de 2 semanas depois da inoculação, os anticorpos de neutralização para o' imunogénio 8 9.6, m, as não a inoculação com 89.6P de VIHS, estavam presente' nos grupos iniciados com ADN em dose elevada (títulos com média geométrica de 352 nos grupos i.d. e 303 nos grupos de-i.m.) (Fig. 5C) (D.C. Montefiori et al. 1988 J Clin Microbiol 26: 231) . Cerca de 5 semanas após a inoculação, tinha sido gerado o anticorpo de neutralização, o 89.6P (títulos com média geométrica de 200 no grupo de i.d. com dose elevada e de 126 no grupo de i.m. de dose elevada) (Fig. 5D) e o anticorpo de neutralização para 89.6 tinha começado a declinar. Cerca de 16 a 20 semanas depois da inoculação, os anticorpos para Gag e Env tinham caído na maior parte dos animais.

Os resultados dos requerentes demonstram que uma vacina de AND/VAM de proteínas múltiplas pode provocar uma resposta imunitária da memória capaz de controlar uma inoculação do vírus da imunodeficiência da mucosa, altamente virulento. Os níveis de controlo virai foram mais favoráveis do que os que se tinham atingido utilizando apenas ADN (M.A. Egan et al. 2000 J Virol 74: 74 85) ou 54 vacinas de VAMr (1. Ourmanov et al. 2000 J Virol 74: 2740) e eram comparáveis aos obtidos para imunizações com ADN completadas com interleucina-2 (D.H. Barouch et al. 2000

Science 290: '486). Todos estes estudos prévios tinham utilizado mais de três inoculações de vacina, nenhum utilizou inoculações na mucosa e a maior parte tiveram inoculação no pico das respostas efectoras e não permitiram um período prolongado após a vacinação para ensaiar quanto à "eficácia a longo prazo". A dose de ADN tem efeitos significativos sob o ponto de vista estatístico tanto nas respostas celulares como humorais (P < 0,05), enquanto a via de administração do ADN afectou apenas as respostas humorais. A libertação do ADN intradérmico foi cerca de 10 vezes mais eficaz do que as inoculações í.m. para gerar anticorpos a Gag (P = 0,02). Nem a via nem a dose de ADN pareceu ter um efeito significativo na protecção. Às 20 semanas depois da inoculação, os animais inoculados com ADN numa dose elevada tinham níveis de ARN virai (7xl02 e 5xl02) com uma média geométrica inferior à dos valores dos animais inoculados com ADN em dose baixa (9xl02 e IxlO3) . A vacina de ADN/VAM controlou a infecção, reduziu rapidamente as cargas virais para um número de cópias de ARN virai próximo ou abaixo de 1000 por mililitro de sangue. O confinamento, mais do que a prevenção da infecção, deu a possibilidade de estabelecer uma infecção crónica (H.L. Robinson et al. 1999 Nat Med 5: 526). Reduzindo rapidamente as cargas virais, uma vacina de uma proteína múltipla de ADN/VAM irá prolongar a previsível não progressão a longo prazo e no limite a transmissão do VIH. (J.W. Mellors et al. 1996 Science 272: 1167; T.C. Quinn et al. 2000 N Engl J Med 342: 921). 55 Λ* ' EXEMPLO 2

VAM Expressando genes modificados de Env, Gag e Pol de VIH

Esta memória descritiva descreve a produção de um vírus recombinante de vacínia Ankara modificado (VAM), vírus recombinante do ciado B de VAM/VIH que expressa as estirpes do env de ADA e HXB2 gag pol de VIH (VAM/env de ADA + HXB2 gag pol de VIH) . Para a amplificação, irá utilizar-se o nome laboratorial de VAM/VIH 48, que indica o plasmido do qual deriva a estrutura.

Os genes gag-pol de VIH derivaram do vírus infeccioso HXB2 do ciado B. 0 gene gag—pol foi truncado de tal modo que a maior parte das sequências de codificação de integrase foram eliminadas e os aminoácidos 185, 266 e 478 foram mutados para inactivar a transcriptase inversa, inibir a actividade de transferência da hélice e inibir a actividade de RNaseH, respectivamente. 0 gene do envelope trópico de CCR5 do ciado B derivou do isolado primário de ADA; as sequências de TTTTTNT foram mutadas sem alterar a capacidade de codificação para prevenir a terminação prematura da transcrição e a cauda citoplásmica foi truncada de modo a melhorar a expressão na superfície, a imunogenicidade e a estabilidade do vector de VAM. Os genes de VIH foram inseridos num vector de transferência de plasmido de modo que o gene gag-pol foi regulado pelo promotor do vírus vacínia precoce/tardio H5 modificado e o gene env foi regulado pelo recentemente designado promotor precoce/tardio Psyn II que providencia elevados níveis similares de expressão. Um gene repórter de GUS de auto-eliminação foi incluído para permitir a detecção e o isolamento do vírus: recombinante. Os genes de VIH foram flanqueados pelas sequências de VAM para permitir a recombinação homólogano sítio de eliminação 3 de modo que o VAM recombinante permanecesse positivo em relação a TK quanto à estabilidade e à elevada expressão nas células remanescentes. Isolou-se o VAM recombinante que mostrou expressar abundantes quantidades de gag-pol-env e processar gag. 56 A produção de partículas semelhantes a VIH foi demonstrada por configuração e por microscopia electrónica. A presença de env em partículas semelhantes a VIH foi demonstrada por microscopia imuno-electrónica.

Quadro de sequências

Descrição SEQ ID NO FIG. NO pLW-48 1 A pLW-48 1 B Promotores Psyn II 2 B Envelope de ADA truncado 3 B Promotor PinH5 4 B gag pol de HXB2 5 B

Vector de transferência de plasmidos 0 vector de transferência de plasmidos utilizado para a produção do vírus VAM recombinante, pLW-48, (figura C) por recombinação homóloga foi preparado como se segue: 1. A partir do plasmido pGem-4Z obtido comercialmente (Promega),. as áreas de flanqueio em cada um dos lados da eliminação III, designadas por flanco 1 e flanco 2, contendo 926 e 520 pares de bases respectivamente, foram amplificadas por RCP a partir das estirpes de VAM do vírus vacínia. Dentro destes flancos, adícionou-se um promotor, o mH5, que tinha sido modificado a partir da sequência publicada originalmente por alteração de duas bases que tinham-se tornado conhecidas por meio de um trabalho publicado previamente, para aumentar a expressão do gene clonado. 2. 0 gag pol do ciado B (figura D) foi truncado de modo a que a integrase fosse eliminada e clonou~se no plasmido de modo a que fosse controlado por meio do promotor mH5. Este gene continha a sequência completa de HXB2 do gag. 0 gene pol tinha mutações de segurança de transcriptase inversa no aminoácido 185 dentro do sítio activo de TI, no aminoãcido 266 que- inibe a actividade de transferência da cadeia e no 57 aiainoácido 478 que inibe a actividade de RNaseH. Além disso, o gene de integrase foi eliminado depois do sítio EcoRI. 3. Adicionou-se uma repetição directa de 280 pares de bases, correspondendo aos últimos 280 pares de bases do flanco 1 de VAM, depois do flanco. '4 . 'Adicionou-se o promotor pll e o gene repórter GUS entre duas repetições directas do flanco 1 de modo que este marcador de rastreio pudesse ser utilizado inicialmente para a obtenção do vírus recombinante, depois eliminado no vírus recombinante final (Scheiflinger, F. et al. 1998 Arch Virol 143: 467-474; Carroll, M.W. e B. Moss 1995 BioTechniques 19: 352-355). 5. Um novo promotor, o Psyn II, foi concebido para permitir o aumento da expressão do env de ADA. A sequência deste novo promotor precoce/tardio está ilustrada na figura E.

6. Obteve-se por RCP uma versão truncada do envelope de ADA com uma mutação silenciosa de 5TNT e inseriu-se no plasmido sob o controlo do promotor Psyn II. 0 envelope foi truncado na cauda citoplásmica do gene gp41, eliminando 115 aminoácidos da cauda citoplásmica. Esta truncagem mostrou que aumentava a quantidade da proteína do envelope na superfície das células infectadas e aumentava a imunogeneicidade da proteína do envelope em ratos e a estabilidade do vírus recombinante na cultura de tecido.

Preparação de VAU recombinante 1. O vírus VAM, que se pode obter da ATCC no número VR-1508, foi purificado em placa três vezes por diluições do terminal em fibroblastos de embrião de galinha (FEG), que foram preparados a partir de ovos de galinhas férteis SPF Premium SPAFAS com nove dias de idade, distribuídos por ovos B e E, Stevens, PA. 2. Infectaram-se células secundárias de FEG a um MOI de 0,05 de VAM e transfectaram-se com 2 pg de pLW-48, o plasmido descrito antes. Passados dois dias de incubação a 37 °C, 58 colheu-se o vírus, congelou-se e descongelou-se 3x e colocou-se em placas de FEG. 3. Passados 4 dias, seleccionaram-se os focos de . infecção que adquiriam a coloração azul após a adição do substrato X-gluc, indicando que tinha ocorrido a recombinação entre o plasmido e o vírus da infecção, seleccionaram-se e inoculou-se em placas de FEG. Seleccionaram-se novamente esses .focos que tinham a coloração azul. 4. Estes focos contendo GUS foram colocados em placa em triplicado e foram analisados quanto à coloração de GUS (que se pretendia agora eliminar) e à expressão do envelope de ADA. Seleccionaram-se os focos individuais a partir das 3as placas replicadas dessas amostras que tinham um número aproximadamente igual de populações mistas de focos corados e não corados de GUS assim como a maior parte dos focos corados do envelope. 5. Estes focos foram novamente colocados em placa em triplicado e analisados da mesma forma. Após 5 passagens, derivou-se um vírus que expressou a proteína do envelope mas que tinha eliminado o gene GUS por causa, da dupla repetição. Por imuno-coloração este vírus também expressou a proteína de gag pol.

Caracterização do vírus recombinante VAM, VAM/HIV 48 1. Analisaram-se alíquotas dos produtos da lise de células infectadas com VAM/HIV 48 por radio-imuno-precipitação e imuno-coloração com anticorpos monoclonais para a expressão tanto da proteína do envelope como a de gag pol. Em ambos os ensaios detectaram-se ambas as proteínas. 2. 0 vírus recombinante mostrou produzir partículas de gag no sobrenadante de células infectadas quando se peletizaram partículas marcadas com 35S numa almofada de sacarose a 20 o. Ό > 3. As partículas de Gag foram também visualizadas tanto na parte externa como no interior das células assim como dentro dos vacúolos das células, por meio de secções finas postas 59 no microscópio electrónico. Estas partículas de gag tinham partidas do envelope na sua superfície. A menos que seja .indicado de outra forma, todas as sequências de nucleótidos determinadas por sequnciação de uma molécula de " ADN' foram determinadas aqui utilizando um sequenciador automático de ADN e todas as sequências de aminoácidos dos polipéptidos codificados pelas moléculas de ADN determinadas aqui foram previstas por tradução de uma sequência de ADN determinada como antes. Por isso, tal como é sabido na técnica para qualquer sequência de ADN determinada por esta abordagem automática, qualquer sequência de nculeótidos determinada aqui pode conter alguns erros. As sequências de nucleótidos determinadas por automação são normalmente pelo menos cerca de 90 % idênticas, mais tipicamente pelo menos cerca de 95 % até pelo menos cerca de 99,9 % idêntica à sequência de nucleótidos actual da molécula de ADN sequenciada. A sequência actual pode ser determinada de forma mais precisa por meio de outras abordagens incluindo processos de sequenciação manual de ADN bem conhecidos na técnica. Tal como também é bem conhecido' na técnica, uma inserção ou uma eliminação única numa. determinada sequência de nucleótidos, comparada com a sequência actual, vai causar um deslocamento de um quadro na tradução das sequências de nucleótidos de tal modo que a sequência de aminoácidos prevista, codificada por uma determinada sequência de nculeótidos, será completamente diferente da sequência de aminoácidos actualmente codificada pela molécula de ADN sequenciada, começando no ponto dessa inserção ou eliminação.

Sumário

Em resumo, os requerentes produziram vírus VAM, VAM/VIH 48, que tem' uma elevada expressão do envelope truncado de ADA e de gag pol de HXB2. O vírus recombinante VAM é preparado utilizando um marcador de GUS expresso temporariamente que é eliminado no vírus final. A elevada expressão do envelope de ADA é possível por causa de um novo híbrido do promotor precoce/tardio Psyn II. 60

Além disso, o envelope tem sido truncado porque se mostrou que a truncagem do envelope aumenta a quantidade de proteína da superfície das células infectadas e ainda aumenta a imunogeneicidade; a estabilidade do recombinante fica também aumentada. 0 recombinante de VAM vai produzir partículas de gag o que tem sido demonstrado por peletização das partículas através da sacarose e faz-se a análise por EGPA. As partículas de Gag com a proteína do envelope na superfície também já foram analisadas no microscópio electrónico. EXEMPLO 3

Promotores adicionais modificados ou sintéticos concebidos para a expressão de genes em VAM ou noutros virus da varíola

Conceberam-se outros promotores modificados ou sintéticos para a expressão de genes em VAM ou outros vírus da varíola. Os promotores foram modificados para permitir a expressão em estádios precoces ou tardios depois da infecção e para reduzir a possibilidade da recombinação homóloga entre sequências idênticas quando se utilizam promotores múltiplos no mesmo vector de VAM. Os promotores são colocados a montante da sequência de codificação da proteína.

Promotor m7.5 (SEQ ID NO: 10):

C GCTTT TTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAA.TTTCT C GTAAAAATTGAAAAACTATTCTAATTTATTGCACGGT

Promotor Psyn II (SEQ ID NO: 2):

TAAAAAATGAAAAAATATTCTAATTTATAGGACGGTTTTGATTTTCTTTTTTTCT AT GCTATAAATAATAAATA

Promotor Psyn III (SEQ ID NO: 11):

TAAAAATTGAAAAAATATTCTAATTTATAGGACGGTTTTGATTTTCTTTTTTTCT

ATACTATAAATAATAAATA 61

Promotor Psyn IV (SEQ ID NO: 12):

TAAAAATTGAAAAACTATTCTAATTTATAGGACGGTTTTGATTTTCTTTTTTTCT

ATACTATAAATAATAAATA

Promotor PsynV (SEQ ID NO: 13):

AAAAAATGATAAAGTAGGTTCAGTT TTATTGCT GGTTTAAAAT CACGC TTTCGA GTAAAAACTACGAATATAAAT EXEMPLO 4

Quadros A-F

Quadro A: Imunização de cobaias com VAM/48.

Imunizaram-se grupos de cobaias nos dias 0 e 30 com lxlO8 unidades infecciosas de VAM/48 quer por via intramuscular (IM) ou intradérmica (ID). Como controlo, imunizou-se outro grupo IM com a mesma dose de VAM não recombinante. Analisaram-se.os soros recolhidos antes assim como depois de cada imunização para avaliar a actividade de neutralização contra VIH-l-MN. Os títulos são a diluição recíproca do soro para a qual 50 % das células MT-2 foram protegidas da morte induzida pelo vírus. Observou-se actividade de neutralização significativa em todos os animais depois da segunda imunização com VAM/48 (dia 49).

Quadro B: Frequências das células T específicas de gag de VIH-1 no seguimento da imunização de ratos com VAM/48.

Imunizaram-se os grupos de ratos BalbC, nos dias 0 e 21, com 1 x 1Q7 de unidades infecciosas de VAM/48 por uma de três vias: intraperitoneal (IP), intradérmica (ID) ou intramuscular (IM). Imunízou-se um grupo de controlo com VAM não recombinante. 5 Semanas após a última imunização, preparara-se esplenócitos e estimularam-se in vitro com um péptido imunodominante de p24 de VIH-1 durante 7 dias. As células foram então misturadas quer com células P815 pulsadas de péptidos ou com péptidos solúveis. As células que produzem interferão gama foram numeradas num ensaio 62 por ELISPOT, Atribuiu-se um valor > 500 aos poços que continham demasiadas manchas para contar. Relataram-se fortes respostas das células T em ratos imunizados IP com outros vírus. Nesta experiência, a imunização IP de ratos com VAM/48 provocaram respostas muito fortes das células T específicas de gag de VIH-í. ·.-.

Quadro C: Inoculação com ADN e reforço com VAM/48 - total de ELISPOTS por animal.

Inocularam-se dez macacos rhesus (semanas 0 e 8) com uma vacina de ADN que expressa antigénios de VIH-1 incluindo o envelope de Ada e gag-pol de HXB2. Na 24a semana deu-se um reforço aos animais intramuscularmente com 1 xlO8 unidades-infeccíosas de VAM/48. Analisaram-se as células mononucleares de sangue periférico (CMSP) para a produção de interferão gama num ensaio por ELISPOT como se segue: Fez-se a incubação das CMSP durante 30-36 horas na presença de conjuntos de péptidos sobrepostos correspondendo aos antigénios individuais de VIH-1 nas vacinas. O número total de células que produzem interferão gama de cada animal está ilustrado no quadro. As respostas das células T à vacinação com ADN foram limitadas (semanas 2-20). Contudo, o reforço com VAM/38 resultou em respostas muito fortes das células T específicas de VIH-1 em todos os animais (semana 25) .

Quadro D: Resposta do anticorpo no seguimento da imunização de macacos com VAM/VIHS KB9.

Imunizaram-se grupos de macacos rhesus com 2xl08 unidades infeccíosas de VAM/VIHS-KB9- nas semanas 0 e 4 por meio de uma de várias vias: tonsilar, intradérmica (ID) ou intramuscular (IM). Outro grupo foi imunizado com VAM não recombinante utilizando as mesmas vias. Analisaram-se amostras de soro 2 semanas após a segunda imunização quanto à ligação da proteína do envelope de KB9 por ELISA e à neutralização de VIHSV-89.6P e VIHS-89.6. No ensaio de ELISA, a proteína solúvel do envelope de KB9 foi 63 capturada em placas de 96 poços utilizando um anticorpo à cfgpl20 do terminal C. Analisaram-se as diluições em série dos soros e utilizaram-se para determinar os títulos no ponto final. A neutralização de VIHS-89.6P e de VIHS-89.6 foi determinada num ensaio das células MT-2. Os titulos são a diluição reciproca do soro para a qual 50 %' das células foram protegidas da morte induzida pelo vírus. Nos ensaios de neutralização in vitro, VIHS-89.6P e VIHS-89.6 são heterólogos, i.e. os soros de animais infectados com um dos vírus não neutralizaram os outros vírus. Assim, duas imunizações com VAM/VIHS-KB9 provocaram bons anticorpos de ligação verificados por ELISA em todos os animais e anticorpos de neutralização ao vírus homólogo (VIHS-89.6P) nalguns animais. Além disso, os anticorpos heterólogos de neutralização foram observados num subconjunto de animais.

Quadro E: As frequências das células T de CD3/CD8 específicas de gag CM-9, no seguimento da imunização de macacos com VAM/VIHS-KB9.

Imunizaram-se grupos de macacos rhesus positivos a MamuA*01 com 2xl08 unidades infecciosas de VAM/VIHS-KB9 nas semanas 0 e 4 por meio de uma de várias vias: tonsilar, intradérmica (ID) ou intramuscular (IM) . Imunizou-se um outro grupo com VAM não recombinante. As frequências das células T de CD3+/CD8+ que se ligam ao complexo tetrâmico contendo o péptido CM9 específico de gag de VIS, foram determinadas por citometria de fluxo em vários momentos após cada imunização. Os intervalos de tempo foram os seguintes: la, lb e ld foram uma, duas e quatro semanas depois da primeira imunização, respectivamente; 2a, 2b, 2c e 2d foram uma, duas três e doze semanas depois da segunda imunização, respectivamente. Os valores acima do valor inicial estão indicados a negrito. Observaram-se fortes respostas específicas de gag do VIS depois de uma única imunização com VAM/VIHS-KB9 em todos os animais imunizados. Observou-se um reforço na maior parte dos animais no seguimento da segunda imunização. Além disso, a ligação mensurável do tetrâmero foi ainda encontrada doze semanas depois da segunda imunização. 64

Quadro F: Frequências de células T especificas no seguimento da imunização de macacos com VAM/VIHS-KB9.

Os grupos de macacos foram imunizados com VAM/VIHS-KB9 como descrito antes. VAM/VIHS-KB9 expressam 5 genes do virus quimérico, VIHS-89.6P: envelope, gag, polimerase, tat e nef. Assim, analisaram-se as frequências de células T especificas para cada um dos 5 antigénios utilizando conjuntos de péptidos correspondendo a cada proteína individual. As CMSP frescas foram estimuladas com conjuntos de péptidos durante 30-36 horas In vitro. As células que produzem interferão gama foram numeradas num ensaio por ELISPOT. 0 número total de células específicas para cada antigénio é dado como o "total # manchas (spots)". Além disso, mostra-se o número de animais que responderam e a média de # manchas (spots) por grupo. Analisaram-se as CMSP uma semana depois da primeira imunização (la) e uma semana depois da segunda imunização (2a). Imunizou-se um outro grupo de 7 animais com VAM não recombinante. Nestes animais, não se detectaram manchas acima nos níveis iniciais. Assim, uma única imunização com VAM/VIHS-KB9 provocou fortes respostas das. células T específicas de VIHS em todos os animais. As respostas a gag e ao envelope foram as mais fortes; a maior parte dos animais tiveram respostas a' gag, todos os animais tiveram respostas ao envelope. As. respostas de Elispot foram também observadas depois da segunda imunização com VAM/VIHS-KB9, mas com níveis mais baixos. Nas duas ocasiões, a ordem da classificação das respostas foi: tonsilar > ID > IM, Os requerentes obtiveram boas respostas imunitárias a nef e algumas respostas imunitárias a tat.

QUADRO

Imunização de cobaias com VAM/48 Anticorpo .de neutralização de VIH-MN- titulo recíproco Animal # Grupo Via dia 0 Dia 4 VAM #1 dia 30 dia 33 VAM#2 dia 49 885 VAM I.M. <20 I.M. 31 I.M. 24 891 H TT <20 rt 85 11 <20 882 VAM/48 I.M. <20 I.M. <20 I.M. 5.524 883 CT Tt <20 Π 63 TI 691 886 Π TI <20 TT <20 11 4.249 65 8 90 TT n <20 IP 180 Π 89. 879 VAM/48 I. D. <20 I.D. <20 I.D. 817 881 Π ir <20 11 <20 11 234 888 Π M <20 ir 24 11 112 889 Γ1 M <20 ir 22 Π 376

Quadro B:

Frequências das células T especificas de gag de VIH-1 no seguimento da imunização de ratos com VAM/48 Grupo £él'S PÊ15 4* péptidc qblq Péptido cracr Sem estimulação VAM controlo VAM/48 (IP) VAM/48(ID) VAM/48 (IM) 0 2 >500 >500 12 5 22 18 0 4 >500 >500 49 33 66 49 1 2 8 8 4 2 12 8

QUADRO C

Inoculação com ADN e reforço de VAM/48 Total de ELISPOTS por animal Animal # -2 SEMANAS 2 6 102 142 2 O2 252 RLw 4 731* < 47 43 50 3905 RVI 5 997* < < < 8 205 Roa < 1 < 1 < < < 245 RHc < < < < < < 535 Ryl < < < < < < 4130 RQk < 46 < < < < 630 RDr < < < 14 < < 1965 RZc < 5 < 58 < < 925 RSf < 118 < < < 20 5570 Ras < 69 < < < < 1435 Total 9 1966 1 119 43 78 19545 Média Geo 4,5 105,3 1,0 33,7 43,0 20,0 1147,7 Inoculação de ADN nas semanas 0 e 8 e reforço de MVA/48 na semana 24 :< = Valor base (2x o número de ELISPOTs no controlo não estimulado +10) 2 Anticorpos de co-estimulação adicionados às incubações de ELISPOT *Animais desta data de hemorragia exibiram elispots mais elevados do que o habitual.

QUADRO D 66

Resposta do anticorpo no seguimento da imunização VftM/VIHS KB9 de macacos com animal# Via Env KB9 KB9 env elisa VIHS-89.6 VIHS- VIHS-89.6 VIHS- 89.6P 89.6P Titulo de média dev. pad. Titulo Hab . Titulo # pos # pos ELisa Nab animais animais 598 Tons . 25.600 31.086 20.383 <20 <20 3 2 601 F1 51.200 <20 <20 606 H 25.600 <20' <20 642 Π 51.200 75 31 646 F1 .51.200 61 48 653 FF 6.400 <20 <20 654 n 6; 400 22 <20 602 i - d. 25.600 18.800 15.341 38 <20 2 4 604 II 12.800 <20 2 62 608 11 3.200 20 66 637 FF 12.800 <20 35 638 FF 51.200 <20 <20 645 FF 25.600 <20 <2 0 647 IF 12.800 32 162 650 FF 6.400 <20 <20 599 i 6.400 17.000 16.516 <2 0 <20 0 3 600 ir 6.400 <20 29 609 Fl 6.400 <20 <20 539 M 51.200 <20 85 640 FF 12.800 <20 <20 641 FF 25.600 <20 41 649 FF 1.600 <20 <20 651 11 25.600 20 <20 603 Controlo <100 <100 <20 <20 0 0 605 IF <100 <20 <20 607 FF <100 <20 <20 643 FF <100 <20 <20 644 FF <100 <20 <20 648 ir <100 <20 <20 652 ir <100 <20 <20

QUADRO E

Frequência de células T de CD3/CD8 especificas de CM9 gag no seguimento imunização de macacos com VAM/VIHS KB9 da Animal # Via Vinis · pré- hemorragia la lb ld 2a 2b 2c 2d 598 Tonsil. ’ VAM/K 0,018 0,41 0,79 0,25 2, 64 1,13 0,51 0,21 B9 601 n Π 0,071 0,34 0,38 0,27 0, 83 0,7 0,36 0,039 646 11 Π 0,022 0, 68 0,76 0,43 1,12 0,91 0,53 0,1,5 653 Π n 0,041 0, 69 0,85 0,53 0, 68 0,49 0,47 0, 3 648 TT VAM 0, 033 0,039 0,022 0,058 0, 033 0, 0.13 . 602 i, d. VAM/K 0,019 0,17 0,92 0, 5 0, 95 0,59 0,5 0,2 B9 604 n TI 0,013 0,11 0,38 0,32 0,44 0, 38 0, 19 0,25 650 ir M 0,095 0,17 0, 6 0,23 2,87 1,12 0,9 0,16 647 11 fl 0, 032 0,22 0,38 0,14 0,84 0, 91 0, 34 0,17 652 rr VAM 0, 041 0,038 0, 059 0,025 0,022 0, 026 0,055 599 i.m. VAM/K 0,081 0,31 0, 082 0,12 0, 054 0,11 B9 600 rr 11 0, 034 0,15 0,41 0,17 0,29 0,27 0, 16 0,049 649 tr fl 0,00486 0,35 1,34 0,56 2,42 0,77 0, 69 0,22 651 H M 0, 049 0,12 0, 69 0,25 1,01 0,32 0, 24 0,22 ir VAM 0,024 0,087 0, 073 0,082 0,027 0,17 σ\ κο ί—1rd -Ρ Ο Εη 40 40 , γ-· Γ'- Γ"· Γ- X. \ •χ \ X. Ν 40 40 Γ~ Γ~ ΐ- ΚΩ > ÍH Η Φ Ίβ Ου Η 4-1 Ή Uα> α Í0 ω 00 40 40 "Τ’ L0 "Τ’ Ο τ—1 00 C0 U0 Γ- σ’) Γ* Η 00 Ο U0 Ο ο ο lO 40 CO CM σ ¢0 o γ- "Τ 00 0- "Τ’ CM C0 "Τ' γ- CM uO CM 40 40 r- β- r- r- Ν Ν x S s \ 40 40 r~- Γ- r- 40 σο § > S co Ο Μ Τιϋ 3 Οΐ ϋ «ο ο rd : U ! rd 0 Φο »tti Ο td Ν Η Π Ηrd Ό Ο -Μ tí ω 0 Ή β cn ω η ο β η rd υ Η 4-ι Ή Φ φ α CQ Φ XI! ο φ Τί rd ••Ηυ β <Φ β ϋ1 φ μ Ευ 4-1 Φ & Φ V Ο ϋ -Η 4-1 νΗ U Φ Ο, W Μ 4-» rd Εη 0) Χ5 Ο Ο Ή Ή Ήυ φ Λ V) Μ t7> rd ο φ d οο Ή 4μ χΗϋ φ ftto Μ 0 Φ τ* tí ο α (0 φ LO ο LD 55 Ο C0 40 «—1 C0 ο t—1 U0 CM Η 40 40 r- Γ- ΐ- r- N "X V N \ \ 00 rH CM ΐ—1 00 σ 40 Ν Ο r- r- r- ο- *·χ -χ -χ Ο Ο Γ-l ο τ—1 "Τ’ «—ι C0 CM CM Γθ σο ο 00 CM CM Η Η ΐ—1 40 00 ιη uO U0 CM Ο 00 Γ0 00 Η Η ι—1 40 40 Γ- X χ. χ "Τ’ LO [X Γ— Γ— Γ—

LD L0 σ L0 ÍM L0 β* οο CM

1—I «Η I—I -γΗ la 2a la rd CM <Λ rd ΰ) rd t * β Ο «Η α 0 CM -ΰ V è é JJ •μ -Η •Η Η ‘H

Embora a presente invenção tenha sido descrita com algum detalhe para fins de clarificação e compreensão, um especialista-na matéria entenderá que se podem fazer várias alterações nã forma e no detalhe sem sair do verdadeiro âmbito da invenção.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> 0 GOVERNO DOS ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA, REPRESENTADO PELO

SECRETÁRIO DO DEPARTAMENTO DE SAÚDE E RECURSOS HUMANOS

Moss, Bemard

Wyatt, Linda

Earl, Patrícia

<120> GENES GAG E POL E DO ENVELOPE DE VIH QUE EXPRESSAM VAM

<130> NIH211.001PCT <150> US 60/274.434 <151> 2001-03-08 <160> 13 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 12225 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Plasmido pLW-48 <400> 1 gaattcgttg gtggtcgcca tggatggtgt tattgtatac tgtctaaacg cgttagtaaa 60 acatggcgag gaaataaatc atataaaaaa tgatttcatg attaaaccat gttgtgaaaa 120 agtcaagaac gttcacattg gcggacaatc taaaaacaat acagtgattg cagatttgcc 180 atatatggat aatgcggtat ccgatgtatg caattcactg tataaaaaga atgtatcaag 240 70 aatatccaga tttgctaatt tgataaagat agatgacgat gacaagactc ctactggtgt 300 atataattat tttaaaccta aagatgccat tcctgttatt atatccatag gaaaggatag 360 agatgtttgt gaactattaa. tctcatctga taaagcctgt gcgtgtatag agttaaattc 420 atataaagta gccattcttc ccatggatgt tccctttttt accaaaggaa atgçatcatt 480 gattattctc ctgtttgatt tctctatcga tgcggcacct ctcttaagaa gtgtaaccga 540 taataatgtt attatatcta gacaccagcg tctacatgac-gagcttccga gttccaattg 600 gttcaagttt tacataagta taaagtccga ctattgttct atattatata tggttgttga 660 tggatctgtg atgcatgcaa tagctgataa tagaacttac gcaaatatta gcaaaaatat 720 attagacaat actacaatta acgatgagtg tagatgctgt tattttgaac cacagattag 780 gattcttgat agagatgaga tgctcaatgg atcatcgtgt gatatgaaca gacattgtat 840 tatgatgaat ttacctgatg taggcgaatt tggatctagt atgttgggga aatatgaacc 900 tgacatgatt aagattgctc tttcggtggc tgggtaccag gcgcgccttt cattttgttt 960 ttttctatgc tataaatggt acgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc 1020 gacggcctgt gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg 1080 gaaagcgcgt tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc 1140 gccgatgccg atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata 1200 ccgaaaggtt gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc 1260 aaagtgtggg tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggacaaac gccatttgaa 1320 gccgatgtca cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtatcaccgt ttgtgtgaac 1380 aacgaactga actggcagac tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga aaacggcaag 1440 aaaaagcagt cttacttcca tgatttcttt aactatgccg gaatccatcg cagcgtaatg 1500 ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa 1560 gactgtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtgctggcca atggtgatgt cagcgttgaa 1620 ctgcgtgatg cggatcaaca ggtggttgca actggacaag gcactagcgg gactttgcaa 1680 71 gtggbgaate cgcacctcfcg gcaaccgrggb gaaggtfcatc tctabgaaeb gtgegteaea 1740 gçcaaaegcc agacagagtg tgatafcctac çcgcttegeg toggeatccg gtcagtggsa 1800 gtgasgggcs aacagttccfc gabfcaaccac aaaòcgCtct actbtacfcgg cttfcggtcgt 1860 catgaagatg cggacttgcg tggsaaagga ttegataacg tgctgatggt gcacgaeeac 1920 geattaatgg aecggattgg ggceaaeteo fcaccgtaect ogcattaccc ttacgctgaa 1980 gagacgcteg actgggcaga tgaacatggc atcgtggfcga ttgatgaaac tgCtgcfcgbe 2040 ggcbttaacc tctcfcttagg cattggtttc gaagegggca acaagccgaa agaacfcgfcae 2100 agcgaagagg cagccaacgg ggaaactcag caagcgcact taceggcgat' taaagagetg 2100 atagcgcgcg acaaaaacca cccaagogfcg gtgatgtgga gtattgccaa cgaaocggafc 2220 aeccgtccgc aaggcgeacg ggaacatttc gcgccactgg cggasgcaac gcgtaaaeco 2280 gacccgacgc gtocgsafccac atgogtcaat gtaafcgtCct gogaegctca caccgatacc 2340 atcagfegatc fcctttgatgt. gcfcgtgcctg saccgtfcabt acggatggta tgtccaaagc 2400 ggcgatfetog aaacggcaga gaaggfcacfeg gaaaaagaac 1;bcbggccfcg geaggagaaa 2460 ctgcatcagc cgatbatcab caccgaatac ggcgfcggata cgttagccgg gccgcactca 2S20 atgfcacaccg acatgfcggag fcgaagaatat çagtgtgcat ggctggatat gtatcaccgc 2SB0 gcctetgatc gcgtcagcgc egtcgttsggb gaacaggtafc gpgaattfccgc cgattttgcg 2640 accfccgcaag geafcafcfcgeg cgfcfcçscggfc aacaagaaag ggaecfctcae tcgegaccgc 2700 aaaccrgaagc. eggaggcttt fcctgctgcaa aaacgctgga cbggcatgaa cbfceggbgsa 2760 aaaccgcagc agggag^eaa. açaatgagag cbeggttgfct gatggafecSg tgatgcafegç 2820 aatagcfcgafc aatagaacbfc acgcaaatat tagcaaaaat atatfcagaca atacfcacaat 2880 taacgafcgag tgfcagatgcfc gfctabtitga aCcacagatt aggafctetfcg afcagagabga 2940 gatgctcaat ggafccafccgfc gtgafcafcgaa cagacattgt attacgatga &fcfcfcaectga 3000 tgtaggsgaa ttbggafccta gtabgfctggg gaaabatgaa cctgacatga ttaagatfcgc 30S0 tctfctcggtg gctggsggcc cgctcgagfea aaaaatgaaa aaatattcfca afctbatagga 3120 cggttttgat tfctctttctc fcctatgctat asataataaa tagcggccgc acoatgaaag 2180 tgaaggggafc caggaagfaat fcateagcaet tgtggaaatg gggcateafeg ctccttggrga 3240 tgfctgatgafc ctgfcagtgct gtagaaaatfc tgtgggtcac agfctfcattat ggggtaectg 3300 tgtggaaaga ageaaccace actetatttfc gtgcatcaga fcgctaaagca tatgabacag 3360 aggfcacataa bgtttgggcc acacasgcct gfcgtacecac agaceccaac ccacaagraag 3420 tagfcattgga aaatgtgaca gaaaatfcfcta acatgtggaa aaataacabg gtagaacaga 3430 tgcatgagga bafcaafccagfc ttatgggatc aaagccbaaa gccotgtgta aaabkaaccc 3540 cacfcotgtgfc fcaccttaaat tgcactgatt bgaggaatgt tactaatatc aataatagta 3600 gtgagggaat gagaggagaa ataaaaaacfc gctçttttíaa tabcaccaca agçataagag 3660 abaaggtgaa gaaagaotafc gcacttttct atagacttga_ tgtagtaeca abe^taatg 3720 ataatactag cfcataggttg afcftaabbgfaa abaccbcaac eat:taeacag gcc&gtccaa 3730 aggtsawcfcfc tgagccaabt cecátacatt afctgtaeccc ggctggtctt gcgabtctaa 3840 agtgttaaaga caagaagicc aatggaacag ggce&bgtaa aaatgtcago acagtacaab 3900 gfcacaeatgg aattaggcca gfcagtgtcaa cbcaactgfct gttaaabgge agtotagcag 3.560 aagaagaggt. agfcaattaga ceba.gtaatt tQacagacaa tgoaaaaaac ataatagtae 4020 agttgaaaga atctftagsa atbaafctgta caagacoaaa caaca&baca aggaaaagta 4030 tacatatagg accaggaaga gcattctata caacaggaga aataatagga gatataagac 414o aagcacatca oaaçattagt agaacaaaat ggaataacrac. tttaaatcaa atagctacaa 420o ôatbaaaaga acaacttggg aataataaáa caaragtcbt taatcaatac tcaggagggg 426o acecagaaae bgfcaatgcac agfctfetaatt gfcggagggga atbctfccfcae fcgtaabtcaa 4320 cacaaatgtt taatagtace bggaatttta atggtaettg gaatttaaca aaatcgaatg 4130 cbactgaagg aaatgacact atcacactcc catgfcaçaat aaaâeáaaifcfc ataaatatgrft 4440 ogcagg&agt"" aggaaaagca atgtatgcec ctcccatcag aggacaaatt «gatgcboat 4500 caaafcattac agggobftafea ttaaeaagág atggtggaac bascagtâgt gggbccgaga 4560 tctbcsgacc tsggggaggá gatafcgaggg acaafctggag aagbgaattft tátaaacaca 4620 aagbagtaaa aattgaacca ttaggagfcag cacccaccaa ggeaaaaaga agagtggtgc 4660 agagagaaaa aagagcagbg ggaacgatsg gagotatgtfc ccfetgggtcc ttgggagcag 4740 caggaagcac tatgggcgca gcgtcaabaa cgcfcgacggt ácaggçcsga cbattattgt 4300 cfcggbatagb gcaacagcag aíicaabfcbgc bgagggctat tgagacgcaa eageratísftgb 4060 eccaactcac agtctggggc atcaageegc tccaggcaag agtcttggcc gtggaaagat 452 c aeçfcaaggga ccaacagctc ctagggattt ggggttgcto tggaaaactc afectgcasca 4980 otgcftgtgec ctggaatgct agtcggagta^ ataaaaatct gg&ratgatt tgcgataaaa So*o bgacctsgab ggagrgggaa agagaaatçg aaaatbacac agocttaaba tacaocfctaa 3100 . tbgaggaate gcagaaccaa caagaaaaga atgaaeaaga ctbabbagca ttagafcaagt 5160 gggrcaegttfc gtggaattgg ttbgacatab. caaabtggct gbgçtafcgta aaaato&toa S220 taafcgatagfc aggaggcttg ataggtrtas gaatagtfctt fcactgtactt tctatagtaa 5230 atagagttag gcagggatac tcaaçattgt catttcagac ceacctecca gecccgaggg £34 C .gaccngacag gccegaagga ategaagaag aaggtggaga cagagactaa tttatargcg 540C gccgctggta cccaacctaa aaattgaaaa taaataCàaa ggfcfcefefesaa ggfctgtgtta 5460 aattgaaagp gagaaacaat cataaaeaag cecggggafcc cfcetagagte gaeaecatgg 5520 gtgcgagagc gtcagtatta a.gegggggag aattagateg atg^aaaaa attcggfctaa. 5580 Sgccaggggg aaagaaaaaa t&taaattsa aacataeagt atgggcaage agggagetag 5640 aacgattcçre agttaatcct ggcetgttag aaacatoaga aggctgtaga caaafcaetgg S200 gacagctaea aesateecfefc côgaeaggar, eagaagaatít tagatfcca.fcta bataatacag 5250 tagcaaccet etattgtgtg. cafccaaagga tagagafcaaa agacascaag gaagefcttag 5820 acaagataga ggaagsgcaa 'aaaaaaagta agaaaaaaga acageaagea geagcfcgaoa 5880 caggaoacag caateaggee agacaaaatfc aeccfcat&gfc gcagaacatc caggggcaaa 5940 fcggfc*oatca ggccafcafcca aetagaactt taaatgcatg ggfeaaaagfea gtagaagaga 6000 aggctttcag ceeagaagfcg atacecafcgfc tttcagcatfc ateagaaggs gccacccaac enizn aagatttaaa ca&catgcta aacacegtgg ggggacefcca agcagccatg aaaatgfctaa 63,20 aagagaceat eaatgagg&a gctgcagaaK gggatagagt geafcceagtg catgeagggc 6180 ccattgcaec aggccagatg agagaaccaa ggggaagtga catagcagga actacfcagca 6240 cccttcagga acaaatagga fcggatgacaa ataetceacc tatucoagta ggagaaatct 6300 ataaaagatg gataatcctg ggafctaaata aaatagtàag aafeçtafcagc ©cfc&ecagca 63S0 ctetggacat aagacaagga ccaaaagaae eetttagaga etatgtagae cggttetasa 6420 aaactctaag agccgagcaa gctccaeagg aggtaaaaaa ttggatgaca gaaaeattgt 6480 tggtccaaaa tgcgaaccea gafcfcgtaags cfcattttaaa. agcattggga ecagfc^gcfca 6540 eaofcagaaga aatgafcgaca gcatgtcagg gagtaggagg aceoggecat aaggeaagag 6600 fctttggctga agcaatgagc eaagtaacaa attcagctac cataatgatg cagagaggea ssso attfctaggaa ccassgaaag attgttaagi: gfefcfceaafcfcg fcggcaaagaa gggeacacag- 6720 ocagaaattg cagggccace aggaaaaagg getgttggaa atgfcgg&aag gaaggacacç 6780 aaatgaaaga fcbgfcactgag agacaggcfca afcfetfettagg gaagaSctgg ccttcctaea 6840 a.gggaaggcc agggaacttt cfctcagagca gaccagagae aacagececa ccagaagaga 6000 gcctcaggtc tcgggtagag acaaoaaccc cccctcagaa gsaggagccg atagacaagg 6960 aactgfcatoe bttaac&tec ctcágatcac tc&fcfcggeaa egacsocnfcçg teacaatasa 702 o gafeagggssg câactaaagg aegatctatfc agatacagga gcsgatgafca cagtafctaga 70-80 ggaagtgagfc otgccaggaa gatggaaacc saaaatgafca gggggaattg gaggttttat. 7140' es&agtaaga esagtafega.fc-e agat&etcat agaaatcCgfc ggâcataaag ctataggtae 7200 agtattagta gaaeotacac etgteaacafc asttggaaga aafecSgttga cteagatfcgg 7260 crgcacctfca aactttcçca ttagccctac tgagactgCa ceagftaaaat taaageeagg 7320 aacggacggc ccaaaagcta aacaatggcc aktgacagaa gaaaaaataa aagcattagt. 73SO agaaattttgt acagaaafcgg aaaaggaagg gaaaattt.ca aaaatfcgggç ctgagaafecc 7440 atacaataot ccagtattts coataaogaa aaaagacagfe actaaatgga ggaoattãgt 7500 agatttcaga gaacttaata agagaactca agacttctgg gaagttcaat taggaataeo 7560 aeatccegca gggttaaaaa agaaaaaatc agfcaacagta ctggatgtgg gtgatgcata 7620 tttttaagtt occttagatg aagacttcag gaagtataçfc gcafcKtacca taoctagtat 7600 aaacaa“gag acaccaggga ttagatatca gtacaacgtg cttccacagg gatggaaagg 774o aKcaccagea afcatfcccaaa gfcagcatgac aaaaatctta gagc&tttta aaaaacãaaã 7800 tccagacaté. gttatetate a&tacatgaa cgatittgtat gtaggatccg acttagaaat- 7S60 agggcagcafc agaacaaaaa tagaggagco gagacaacac ctgttgaggt ggggacttac 7920 cacaoeagaâ aaaaaacatc agaaagaasc tccattcett tggatgggtt acgaaet:eea. 7980 tcefcgatBaa t^acagtac agcctatagt gctgccagaa aaagacaget; ^ãctgtcaa 8040 tgacatacag aagttagtgg ggaaattgaa taccgcaagt cagatttacc cagggattaa &100 agtaaggaaa ttatgtaaac toctfcágagg aaecaaagaa otaaoagaag taataccacO eiso aacagaagaa gcagagctag aactggcaga aaacagagag attctaaaag aaccagtaea 8220 tggagtgtat”tatgacccat cáaa^actt aôtagcagaa atacagaagc aggggcaagg 8280 ocaa-cggao^ tatcasattet atcaagagcc afcttaaaaat atgaaaacag gaaaatatgc B340 aagaatgagg ggngnccaca ctaacgatgt aaaacaatta acagaggeag tgcaaaaaat 8400 aaccacagaa. agcafcagtaa tatggggasa gactcctaaa tttaaacfcec ceatacaasa 8460 ggaaacatgg gaaacâtggt. ggaaagagta ttggcaagcs acctggattc ctgagCggga 8525 çrtttgfetaaS acccctcctt tagtgaaatc atggtaccag ttagagaaaç aacccatagfe 8580 aggagcagae accttctatg tagatgggge agetaacagg gagactaaat fcaggaaaagc 8540 aggatatgcç. aetaacaaag gaagacaaaa ggttgtçccc etaactaaca caacaaafeca 8700 ©aaaactGag ttacasgcaa tttatetagc tttgcaggat tcaggattag aagtaaacat £760 73 agtaacagac tcacaatatg cattaggaat cactcaagea caaccagata aaagfcgaatc 8820 agagttagtc aatcaaataa fcagageagfct a&taaasaag gaaaaggfcct atctggcafcg 8880 ggtaccagca cacaaaggaa tfcggaggaaa tgaacaagta gataâatfcag tcagtgctgg 8840 aatcaggaaa atacfcatfcfct tagatggaat agataaggcc eaagatgaac afctagttttt 8000 atgtcgaccfc gcagggaaag bttfcataggt agttgataga acaaaafcaca taafcetfcgfca 8060 aaaataaate acttttttata ctaatatgac âegattacca atacttttgt tacfcaafcatc 8120 accagfcatac gctacacett ttfccctcagac atctaaaaaa afcaggtgatg atgcaacttt 9180 atcacgtaat cgaaataata caaatgacfcá cgfctgttafcg agtgcttggt afcaaggagec. 8240 caattccatt attcttttag ctgçtaaaag cgasgtcCtg tattttgata attataecaa 8300 ggataaaata tettacgact ccccatacga tgafcctagtt aeaactafcca caafctaaats; 9360 attgaatgot agagatgecg gtacfctatgfc atgtgcafcte trtfcafcgacafc cgccfcaeaaa 9420 tgacactgat aaagtagatt afcgaagaata ctccacagag tcgactgtaa atacagacag 9480 tgaatcgact atagaeataa taofcatctgg atctacaeafc fccaccagaaa ctagttaagc 9540 ttgtctccct atagtgagtc gtattagagc fctggcgtaat catggfccafca gcfcgfctfccefe 9600 gcgfcgaaatt gfcratccgct caeaatfccea cacaacatac gagccggaag cataaagfcgt 9560 aaagcstggg gtgoctaatg agtegagctaa ctcacattaa ttgcgttgeg cfccactgccc 9720 gctttogagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcea acgcgcgggg 9780 agaggoggtefc tgogtattfcgg gcgctcfctcc gcfctectcgc fceaefcgacfce g-tgegctcg 9840 gtcgtccggc tgcggcgagc ggtafccaget eacteaaagg cggtaafcacg gttatceaca 9900 gaatcagggg at&acgcagg aaagaacatg fcgagcaaaag gccagoaaaa çgccaggaac 9960 cgtaaaaagg ccgcgttgcfc ggcgtttfctc gataggctcc gcccccctga cgagcatcac 10020 aaaaatcgac gotcaagtca gaggtggoga âaccegacag gactataaag ataacaggeg 100B0 tctcccccfcg gaagctccct cgtgcgctort cctgttccga occtgccgct taccggafcac 10140 ctgtccgcct ttcfccccttc gggaagcgtg sçgetbtctc atagctcaeg cfcgtaggtat 10200 cbcagttegg fcgtaagtegc fcogcfcceaag cfcgggcfcgfcg fcgcacgaaec ccccgttcag 10260 cscgaccgcfc gcgccttafcc cggfcaactafc cgfcettgagt ccaacceggfc aagacacgac 10320 fccatcgccae fcggcsgcagc cactggfcaae âggafctagca gagcgaggta tgtaggcggt 10380 gctacagagt tcttgaagtg gtggcçtaac tacggetaca cfcagaaggae agtattfcggt*10440 atctgcgctc hgetgaagcc agcfcsccttc ggsaaaagsg tfeggtagetc ttgatcoggc 10500 aaacaaacca ccgctggtag csgt-ggfcttt tfctgtttgea agcagcagac tacgcgcaga 10560 aaaaaaggat. ctcaagsaga fcsctctgatc ttttetacgg ggtcfcgacgc tcagfcggaac 10S20 gaaaactcas gfctaagggat tttggtcafcg agattatcaa aaaggatctt oacefcagatc 10680 ctttfcaaatfc aaaaatgaag fctttaaatca afcefcaaagfca fcstafcgagfca aacfcfcggfccfc 10740 gacagtíacc aatgctfcaat cagtgaggca ccfcatcfesag coafcctgtcfc afctÊçgttea 10800 tccatagttg cstgactcce cgtcgtgtag ataactacga tuacgggaggg cttaccatct 10860 ggccccagtg ctgcaatgafc accgcgagac ccaegctcae eggefcccaga tfctafccagea 10920 ataaaecagc cagaoggaag ggccgagcgc agaagtggfcc ctgcaactbt atecgcctcc 10980 atcoagteta -ttaafefcgtfcg ccgggaaget agagtaagta gttcgccagt taafcagtttg 11040 cgcaacgttg ttggoattgc tacaggcafcc gtggtgtcac gctcgtcgct tggtatggct moo tcatteagct ccggttocca acgatcaagg cgagtfcacat gabcccccat gtbgbgcaaa 11160 aaagcggtfea galocttegg ccctccgafcc gttgtcagaa gfcaagtfeggc ogcagtgcta 11220 fccaetcatgg ttabggcaçc actgsataafc tcfccttactg tcatgccatc cgtaagatgc 11280 fctbtctgtga ctggtgagta ctcaaccaag bcattoegag aatagtgtat gcggcgaccíg 11340 agttgctcbt gcccggcgtc aatacgggat aafcaccgcgc cacatagcag aactttaaaa 11400 gtgcteataa ttggaaaaeg. ttcttogggg- cgsaaactct eaaggatctt acegetgttg .11460 agatncagfct ngatgtaacc cactcgtgca cccaacfcgat cfctcagcatc ttttactttc 11520 aceagcçttt ctgggfcgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 21580 gcgacãcgga aatgttgaat actcatactc tfcc»ettttc aatattabtg aagcaCttat 21640 caggotcatC gtobcabgag cggatacaba ttbgaabgta tbtagaaaaa baaacaaaba 11700 ggggttcegc goacattbcc ccgaaa^tg ceacctgacg tctaagaaac cattattàtc 11760 atgacattaa cctataaaaa fcaggcgtatc aegaggccct ttcgtctcgc gcgttteggt 1182© gatgacggfcg aaaacctctg acacafcgcag ctcccggaga cggtoacagc tcgtctgfcaa' ílstíO acggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggogcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg U940 ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagbgcaeea tatgcggtgt 12000 gaaataecgo acagatgcgfe aaggsgaaaa taccgcatca ggagccattc gccafctcagg 12060 CtgcgCaaCt gttgggaagg gcgatcggtg Cgggcctctt cgctattacg Geagctggeg 12120 aaagggggat gtgctgcaag gcgactaagrt tc^gcascge cagggttttc ccagfccacga 12280 cgttgtaaaa cgãcggeeag fcgaattggafc ttag^tgaea ctata 12225 74

<210 2 <211> 74 <212> ADN <213> Sequência artificiai <220 <223> promotor Psyn II <400> 2 taaaaaatga aaaaatattc taatttatag gacggttttg attttctttt tttctatgct 60 ataaataata aata 74

<210> 3 <211> 2214 <212> ADN <213> Sequência artificial. <220 <223> gene do env do VIH <400 3 atgaaagtga aggggatcag gaagaattat cagcacttgt ggaaatgggg catcatgctc 60 cttgggatgt tgatgatctg tagtgctgta'gaaaatttgt gggtcacagt ttattatggg 120 gtacctgtgt ggaaagaagc aaccaccact ctattttgtg catcagatgc taaagcatat 180 gatacagagg tacataatgt ttgggccaca catgcctgtg tacccacaga ccccaaccca 240 caagaagtag tattggaaaa tgtgacagaa aattttaaca tgtggaaaaa taacatggta 300 gaacagatgc atgaggatat aatcagttta tgggatcaaa gcctaaagcc atgtgtaaaa 360 ttaaccccac tctgtgttac tttaaattgc actgatttga ggaatgttac taatatcaat 420 aatagtagtg agggaatgag aggagaaata aaaaactgct ctttcaatat caccacaagc 480 ataagagata aggtgaagaa agactatgca cttttctata gacttgatgt agtaccaata 540 gataatgata atactagcta taggttgata aattgtaata cctcaaccat tacacaggcc 600 tgtccaaagg tatcctttga gccaattccc atacattatt gtaccccggc tggttttgcg 660 attctaaagt gtaaagacaa gaagttcaat ggaacagggc catgtaaaaa tgtcagcaca 720 gtacaatgta cacatggaat taggccagta gtgtcaactc aactgctgtt aaatggcagt 780 ctagcagaag aagaggtagt aattagatct agtaatttca cagacaatgc aaaaaacata 840 atagtacagt tgaaagaatc tgtagaaatt aattgtacaa gacccaacaa caatacaagg 900 aaaagtatac atataggacc aggaagagca ttttatacaa caggagaaat aataggagat 960 75 ataagacaag cacattgcaa cattagtaga acaaaatgga ataacacttt aaatcaaata 1020 gctacaaaat taaaagaaca atttgggaat aataaaacaa tagtctttaa tcaatcctca 1080 ggaggggacc cagaaattgt aatgcacagt tttaattgtg gaggggaatt cttctactgt 1140 aattcaacac aactgtttaa tagtacttgg aattttaatg gtacttggaa tttaacacaa 1200 tcgaatggta ctgaaggaaa tgacactatc acactcccat gtagaataaa acaaattata 1260 aatatgtggc aggaagtagg aaaagcgatg tatgcccctc ccatcagagg acaaattaga 1320 tgctcatcaa atattacagg gctaatatta acaagagatg gtggaactaa cagtagtggg 1380 tccgagatct tcagacctgg gggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat 1440 aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaaaagaaga 1500 gtggtgcaga gagaaaâaag agcagtggga acgataggag ctatgttcct tgggttcttg 1560 ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaataacgc tgacggtaca ggccagacta 1620 ttattgtctg gtatagtgca acagcagaac aatttgctga gggctattga ggcgcaacag 1680 catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc aggcaagagt cctggctgtg 1740 gaaagatacc taagggatca acagctccta gggatttggg gttgctctgg aaaaotcatc 1800 tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata aaactctgga tatgatttgg 1860 gataacatga cctggatgga gtgggaaaga gaaatcgaaa attacacagg cttaatatac 1920 accttaattg aggaatcgca gaaccaacaa gaaaagaatg aacaagactt attagcatta 1980 gataagtggg caattttgtg gaattggttt gacatatcaa attggctgtg gtatgtaaaa 2040 atcttcataa tgatagtagg aggcttgata ggtttaagaa tagtttttac tgtactttct 2100 atagtaaata gagttâggca.gggatactca ccattgtcat ttcagaccca cctcccagcc 2160 ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaatc gaagaagaag gtggagacag agac 2214

<210> 4 <211> 70 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Promotor PmH5 <400> -4 aaaaattgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt taaattgaaa gcgagaaata 60 atcataaata .70

<210> 5 <211> 3479 <212> ADN <213> Sequência artificial 76 <220> <223> genes de VIH <400> 5 atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga < aaaaattcgg 60 ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120 ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180 ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240 acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300 ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360 gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420 caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtaggagaa 480 gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540 ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600 ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660 gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720 agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acaaataatc cacctatccc agtaggagaa 780 atttataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840 agcattctgg acataagaca aggaccaaaa gaacccttta gagactatgt agaccggttc 900 tataaaactc taagagccga gcaagcttca caggaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960 ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagcg 1020 gctacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtag gaggacccgg ccataaggca 1080 agagfctttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaattcag ctaccataat gatgcagaga 1140 ggcaatttta ggaaccaaag aaagattgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200 acagccagaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260 caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320 tacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380 gagagcttca ggtctggggt agagacaaca actccccctc agaagcagga gccgatagac 1440 aaggaactgt atcctttaac ttccctcaga tcactctttg gcaacgaccc ctcgtcacaa 1500 taaagatagg ggggcaacta aaggaagctc tattagatac õggagcagat gatacagtat 1560 tagaagaaat gagtttgcca ggaagatgga aaccaaaaat gataggggga attggaggtt 1620 ttatcaaagt aagacagtat gatcagatac tcatagaaat > ctgtggacat aaagctatag 1680 gtacagtatt agtaggacct acacctgtca acataattgg aagaaatctg ttgactcaga 1740 ttggttgcac tttaaatttt cccattagcc ctattgagac tgtaccagta aaattaaagc 1800 caggaatgga tggcccaaaa gttaaacaat ggccattgac agaagaaaaa ataaaagcat 1860 tagtagaaat ttgtacagaa atggaaaagg aagggaaaat ttcaaaaatt gggcctgaga 1920 atccatacaa tactccagta tgtgccataa agaaaaaaga > cagtactaaa tggaggaaat 1980 tagtagattt cagagaactt aataagagaa ctcaagactt cagggaagtt caattaggaa 2040 tacaacatcc cgcagggtta aaaaagaaaa aatcagtaac agtactggat gtgggtgatg 2100 catatttttc agttccctta gatgaagact tcaggaagta tactgcattt accataccta 2160 77 gtataaacaa tgagacacca gggattagat atcagtacaa tgtgcttcca cagggatgga 2220 aaggatcacc agcaatattc caaagtagca tgacaaaaat cttagagcct tttaaaaaac 2280 aaaatccaga catagttatc Uatcaataca tgaacgattt gtatgtagga tctgacttag 2340 aaatagggca gcatagaaca aaaatagagg agctgagaca acatctgttg aggtggggac 2400 ttaccacacc agacaaaaaa catcagaaag aacctccatt cctttggatg ggttatgaac 2460 tccatcctga taaatggaca gtacagccta tagtgctgcc agaaaaagac agctggactg 2520 tcaatgacat acagaagtta gtggggaaat tgaataccgc aagtcagatt tacccaggga 2580 ttaaagtaag gcaattatgt aaactcctta gaggaaccaa agcactaaca gaagtaatac 2640 cactaacaga agaagcagag ctagaactgg cagaaaacag agagattcta aaagaaccag 2700 tacatggagt gtattatgac ccatcaaaag ac.ttaatagç agaaatacag aagcaggggc 2760 aaggccaatg gacatatcaa atttatcaag agccatttaa aaatctgaaa acaggaaaat 2820 atgcaagaat gaggggtgcc cacactaatg atgtaaaaca_attaacagag gcagtgcaaa 2880 aaataaccac agaaagcata gtaatatggg gaaagactcc taaatttaaa ctacccatac 2940 aaaaggaaac atgggaaaca tggtggacag agtattggca agccacctgg attcctgagt 3000 gggagtttgt taatacccctcctttagtga aattatggtá ccagttagag aaagaaccca 3060 tagtaggagc agaaaccttc tatgtagatg gggcagctaa cagggagact aaattaggaa 3120 aagcaggata tgttactaac aaaggaagac aaaaggttgt ccccctaact aacacaacaa 3.180 atcagaaaac tcagttacaa gcaatttatc tagctttgca ggattcagga ttagaagtaa 3240 acatagtaac agactcacaa tatgcattag gaatcattca agcacaacca gataaaagtg 3300 .aatcagagtt agtcaatcaa ataatagagc agttaataaa aaaggaaaag gtctatctgg 3360 catgggtaoc agcacacaaa ggaattggag gaaatgaaca agtagataaa ttagtcagtg 3420 ctggaatcag gaaaatacta tttttagatg gaatagataa ggcccaagat gaacattag 3479

<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Vírus de imunodeficiência de símio <400> 6

Cis Tre Pro Tir Asp Ile Asn Gin Met 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Galinha <400> 7 78

Ser Ile Ile Asn Fen Glu Lis Leu 1 .5

<210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> sonda <400> 8 ctgtctgcgt catttggtgc 20

<210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana <22 0> <221> VARIANTE <222> (1)...(4) <223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 9

Tir Xaa Xaa Leu 1

<210> 10 <211> 93 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> promotor m7.5 <4 Ο Ο> 10 cgctttttat agtaagtttt tcacccataa ataataaata caataattaa tttctcgtaa 60 aaattgaaaa actattctaa tttattgcac ggt 93 <210> 11 <211> 74 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Promotor Psyn III <400> 11 taaaaattga aaaaatattc taatttatag gacggttttg attttctttt tttctatact 60 ataaataata aata 74. <210> 12 <211> 74 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Promotor Psyn IV <400> 12 taaaaattga aaaactattc taatttatag gacggttttg attttctttt tttctatact 60 ataaataata aata 74

<210> 13 <211> 75 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Promotor Psyn V 80 <400> 13 aaaaaatgat aaagtaggtt .cagttttatt gctggtttaa aatcacgctt tcgagtaaaa. 60 actacgaata taaat 75 81

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender um . virus recombinante VAM codificando HXB2 Gag/Pol de VAM 48 (SEQ ID NO: 5) e o envelope truncado de ADA de VAM 48 (SEQ ID NO: 3) .
2. 2. Utilização de uma composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de um medicamento para o reforço de uma resposta imunitária de células T de CD8+ a um antigénio de Env, Gag ou Pol de VIH num primata, em que a resposta imunitária das células T de' CD8+, ao antigénio previamente inoculado no primata, é reforçada.
3. 3. Utilização de uma composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de se destinar â preparação de um medicamento para a indução de uma resposta imunitária de células T de CD8+ a um antigénio de Env, Gag ou Pol de VIH num primata, em que se induz a resposta imunitária das células T de CD8+ ao antigénio num primata.
4. 4. Utilização de uma composição de inoculação, caracterizada pelo facto de compreender ácido nucleico que codifica um antigénio de Env, Gag . ou Pol de VIH e uma composição de reforço que compreende uma composição de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um medicamento para a indução de uma resposta imunitária de células T de CD8+ a um antigénio de Env, Gag ou Pol de VIH num primata, em que se induz a resposta imunitária de células Τ' de CD8+ ao antigénio. 1
5. 5. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 4,.caracterizada pelo facto de o primata ser um ser humano.
6. 6. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a. 4, caracterizada pelo facto de o virus recombinante VAM ser administrado por uma injecção sem agulha.
7. 7.· Utilização, de acordo com' a reivindicação 4, caracterizada pelo facto de a composição de inoculação compreender o ADN do plasmido que codifica o referido antigénio.
8. 8. Processo para a preparação de uma composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de compreender: a preparação de um vector de' transferência de plasmido que codifica HXB2 Gag/Pol de VAM 48 {SEQ ID NO: 5) e o envelope truncado de ADA de VAM 48 (SEQ ID NO: 3); e - a recombihação do referido vector de transferência de plasmido com um virus VAM para.produzir uma composição de acordo com a reivindicação 1. 2