CN1638795A - 表达修饰的hiv包膜、gag和pol基因的mva - Google Patents

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Abstract

本发明提供了修饰的安卡拉牛痘病毒疫苗(MVA)，是一种复制缺陷的牛痘病毒疫苗，表达人类免疫缺陷病毒(HIV)的env，gag和pol基因。

Description

表达修饰的HIV包膜、GAG和POL基因的MVA
技术领域
本发明提供一种修饰的安卡拉牛痘病毒疫苗(modified vacciniaAnkara)(MVA)，这种存在复制缺陷的牛痘病毒疫苗可表达人类免疫缺陷病毒(HIV)的env，gag和pol基因。
背景技术
细胞免疫在控制免疫缺陷病毒感染的过程中发挥着重要作用(P.J.Goulder等人.1999 AIDS 13：S121)。最近，一种通过增加细胞因子分泌而加强细胞免疫的DNA疫苗成功地控制了一种高毒力的免疫缺陷病毒的攻击(D.H.Barouch等人.2000 Science 290：486)。提高细胞免疫的另一种有发展前景的方法是在DNA激发后应用重组痘病毒加强剂(H.L.Robinson等人.2000 AIDS Rev 2：105)。这种异源的激发/加强机制诱导产生的T细胞频率是单独使用DNA或重组痘病毒疫苗进行激发和加强的10到100倍。在此之前，研究者已发现对于控制非致病性免疫缺陷病毒，用痘病毒加强DNA激发的反应要优于用DNA或蛋白的加强作用(H.L.Robinson等人.1999 Nat Med 5：526)。目前需要对控制致病性免疫缺陷病毒进行研究。
发明概述
我们在此报道，在猕猴模型中，用DNA激发加重组修饰的安卡拉牛痘病毒(rMVA)加强剂可控制一种高度致病性免疫缺陷病毒的攻击。疫苗的DNA和rMVA成分均表达多种免疫缺陷病毒的蛋白。于第0周和8周两次接种DNA，第24周接种一次rMVA加强剂，结果有效控制了在应用加强剂7个月后经直肠进行的病毒攻击。上述发现提示，一种相对简单的多蛋白DNA/MVA疫苗有助于控制获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的传播。我们还报道甚至在没有DNA激发的情况下，接种rMVA也可诱导较好的免疫反应。
附图简述
图I.HIV-1和HIV-2基于pol基因序列相似性的种系关系。SIVcpz和SIVsmm属亚人类灵长目慢病毒，分别来自黑猩猩和黑白睑猴。
图II.HIV病毒的M、N和O群与四个不同SIVcpz隔离群基于pol基因的全长序列的种系关系。横杠表示0.1遗传距离(10％的核苷酸趋异)，星号位置表示基于env序列的HIV-1N隔离群。
图III.HIV-1隔离群的向性特性与生物学特性。
图IV.HIV编码的蛋白。显示了HIV基因的定位、原始翻译产物(有时呈多蛋白形式)的大小以及加工后的成熟病毒蛋白。
图V.一个成熟HIV-1病毒颗粒的图示。
图VI.HIV-1 Env糖蛋白的线性图解。箭头所示为gp160裂解为gp120和gp41的位点。在gp120中，斜线框代表可变区(V1到V5)，空白框为保守区(C1到C5)。在gp41胞外区域，显示了几个功能区：N-末端的融合肽和两个胞外区域螺旋(N-螺旋和C-螺旋)。跨膜区以涂黑框表示。在gp41胞浆区，显示了Tyr-X-X-Leu(YXXL)胞饮作用基序(SEQ ID NO：9)和两个预测的螺旋区(螺旋-1和-2)。还显示了氨基酸数目。
图1.Gag特异性T细胞的时间频率。(A)通过DNA激发和rMVA加强剂免疫后的Gag特异性CD8 T细胞反应。图示显示的是高剂量DNA经皮内免疫动物所产生的Gag-CM9-四聚体的平均数据。(B)病毒攻击前和攻击后两周不同的时间点，在A*01(空白框)和非A*01(实框)猕猴模型中，Gag特异性IFN-γ的ELISPOTs结果。三个含10-13个Gag肽的肽库(均为22肽，相互重叠12个氨基酸)用于该分析。数据框上方的数字表示每组内ELISPOTs的算术平均值±SD。图表上方的数字为动物序号。*，无可用资料；#，＜20 ELISPOTs/1×106外周血单核细胞(PBMC)。Gag-CM9-Mamu-A*01四聚体特异性T细胞的时间资料见图6。
图2.攻击后疫苗免疫动物和对照组动物的病毒量、CD4计数和生存率的时间变化。(A)病毒量的几何均数，(B)CD4计数的几何均数。(C)疫苗免疫动物和对照组动物的生存曲线。虚线代表所有24只疫苗免疫的动物。疫苗免疫组和对照组中每只动物的病毒量(D)和CD4计数(E)。动物序号的图标见(E)。攻击后的前12周，RNA检测水平为每ml血浆中1000个RNA拷贝。动物体内病毒水平低于1000者计为负荷量500。在第16和20周检测水平为每ml血浆中300个RNA拷贝。动物体内病毒水平低于300者计为300。
图3.疫苗免疫组和对照组动物攻击后的T细胞反应。(A)四聚体+细胞(虚线)和病毒量(实线)。(B)攻击后两周，用细胞内细胞因子方法检测Gag-CM9肽刺激产生的IFN-γ。这种离体检测能够评价图1A中所示攻击后处于峰值的四聚体+细胞的功能状态。(C)攻击后12周的增殖实验。瞬时转染后产生的Gag-Pol-Env(空白柱)和Gag-Pol(斜线柱)用作刺激抗原。以假转染的培养物上清作为对照抗原。刺激指数是用病毒抗原存在条件下培养物的生长除以假抗原存在条件下培养物的生长。
图4.攻击后12周淋巴结的组织形态学。(A)疫苗免疫的猕猴的典型淋巴结显示滤泡增生，表现为存在大量具有扩张的生发中心的二级滤泡及明暗相间区域。(B)感染的对照组动物的典型淋巴结显示滤泡缺失和副皮质区淋巴细胞萎缩。(C)一只年龄匹配的、未感染猕猴的典型淋巴结，显示无反应性的生发中心。(D)测定生发中心占总淋巴结区域的百分比作为评价滤泡增生的一个非特异性指标。未感染的对照组的数据来源于四只年龄匹配的猕猴。
图5.  抗体反应的时间变化。用ELISAs方法检测总的Gag(A)或Env(B)抗体的μg数。SHIV-89.6(C)和SHIV-89.6P(D)中和抗体的滴度用MT-2细胞毒方法检测，用中性红染色(D.C.Montefiori，等人.1988 JClin Microbiol 26：231)。滴度是指能使PBMC中生长的特定病毒被中和50％的血清稀释度的倒数。动物序号的标志同图2。
图6.在病毒攻击前和攻击两周后的不同时间点，Mamu-A*01免疫组和对照组猕猴模型中的Gag-CM9-Mamu-A*01四聚体特异性T细胞的情况。每个点右上角的数字表示四聚体特异性CD8 T细胞的频率，以总CD8 T细胞的％表示。FACS数据栏上的数字为每个动物的序号。
图A.质粒转移载体pLW-48的质粒图和序列。
图B.质粒转移载体pLW-48、Psy II启动子(控制ADA包膜表达)、截短的ADA包膜、PmH5启动子(控制HXB2 gag pol的表达)和HXB2gag-pol(含安全性突变，Δ整合酶)的序列。
图C.质粒转移载体pLW-48和制备MVA重组病毒MVA/HIV48。
图D.一个分化株B gag和pol。
图E.新的Psyn II启动子的序列。
优选实施方案详述
重组MVA病毒
这里应用的牛痘病毒是痘病毒科中的正痘病毒属的成员，是一种用于预防人类天花的活疫苗。全球范围内成功的预防接种牛痘病毒疫苗最终根除了天花的致病因子一天花病毒(天花在全球的根除，确认根除痘病毒全球委员会的最后报告，History of Public Health，第4号，日内瓦：世界卫生组织，1980年)。自此，世界卫生组织宣布除了痘病毒感染的高危人群外(如实验室工作者)不再继续广泛开展痘病毒预防接种。
最近，牛痘病毒还被用作重组基因表达的基因工程病毒载体和作为潜在的重组活疫苗(Mackett，M.等人.1982 PNAS USA 79：7415-7419；Smith，G.L.等人.1984 Biotech Genet Engin Rev 2：383-407)。在DNA重组技术的帮助下，这种表达异源抗原的DNA序列(基因)已被整合到牛痘病毒的基因组中。如果该基因整合入病毒DNA的部位是在病毒生命周期中不起关键作用部位，那么新产生的重组牛痘病毒可能是感染性的，也就是说它能够感染异种细胞并表达整合的DNA序列(EP专利申请号83,286和110,385)。用这种方法制备的重组牛痘病毒一方面可用作预防感染性疾病的活疫苗，另一方面也可用于在真核细胞中制备异种蛋白。
通过应用高度减毒的疫苗病毒株作为载体可以减少对健康危胁。为了避免出现不愿见到的接种痘病毒的副作用，现已制备了几个这样的高度减毒牛痘病毒株。因此，通过在鸡胚成纤维细胞中长期系列筛选牛痘病毒(CVA)的Ankara株已获得了修饰的Ankara病毒(MVA)(综述见：Mayr，A.等人.1975 Infection 3：6-14；瑞士专利号568,392)。MVA病毒可在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中获取，编号为ATCC No.VR-1508。MVA表现为显著的减毒性，也就是说，其在灵长类细胞内其毒性和复制能力下降，但可保持良好的免疫原性。已对MVA病毒进行分析以确定其基因组相对于母系CVA株的变化情况。现已明确有六个主要的基因组DNA的缺失区(I、II、III、IV、V和VI缺失区)共31,000个碱基对缺失(Meyer，H.等人.1991 J Gen Virol 72：1031-1038)。这样产生的MVA病毒仅能以鸟类细胞为宿主细胞。
另外，MVA以其显著的减毒性为特点。通过在一系列动物模型中的检测，证实MVA即使在免疫抑制的动物中也不表现出致病性。更重要的是，MVA株的优良特性在广泛的临床试验中得到证实(Mayer A，等人.1978 Zentralbl Bakteriol[B]167：375-390；Stickl等人.1974 DtschMed Wschr 99：2386-2392)。上述研究观察了超过了120,000名人类患者，其中包括高危患者，结果未出现与MVA疫苗有关的副作用。
研究发现，在人细胞中MVA的复制在感染后期被阻断，从而使之不能装配为成熟的有感染性的病毒体。然而，MVA即使在非允许细胞中也可以高水平表达病毒和重组的基因，从而被看作一种有效的、特别安全的基因表达载体(Sutter，G..和Moss，B.1992 PNAS USA 89：10847-10851)。此外，在MVA基础上建立了新的牛痘病毒载体疫苗，它是在MVA基因组的第III缺失位点插入外源DNA序列(Sutter，G.等人.1994 Vaccine 12：1032-1040)。
重组MVA牛痘病毒可用下述方法进行制备。在含有能编码外源多肽的DNA序列的侧翼整合入MVA基因组中临近自然缺失位点(如第III缺失位点，或其他非必须位点)的DNA序列，将这种DNA构建物转入MVA感染的细胞中，使其发生同源重组。一旦这种DNA构建物转入真核细胞中并且外源DNA与病毒DNA发生重组，那么就有可能用一种本身已知的方法，优选有标记物的帮助，分离得到需要的重组牛痘病毒。这种被插入的DNA构建物可以是线性的，也可以是环形的。优选是质粒或多聚酶链反应的产物。这种DNA构建物包含位于MVA基因组中的自然发生的缺失位点(如第III缺失位点)左侧和右侧的侧翼序列。外源DNA序列就插入在自然发生的缺失位点的侧翼序列间。为了表达某一DNA序列或基因，在DNA序列中应包含用于调节基因转录的序列。这些调节序列(称为启动子)是本领域所熟知的，例如包括EP-A-198,328中所描述的牛痘病毒11kDa基因的调节序列和7.5kDa基因(EP-A-110,385)的调节序列。这种DNA构建物可通过转染引入MVA感染的细胞，如通过磷酸钙沉淀(Graham等人.1973 Virol 52：456-467；Wigler等人.1979 Cell16：777-785)、电穿孔(Neumann等人.1982 EMBO J1：841-845)、微注射(Graessmann等人.1983 Meth Enzymol101：482-492)、脂质体(Straubinger等人.1 983 Meth Enzymol 101：512-527)、原生质球(Schaffner 1980 PNAS USA 77：2163-2167)或其它本领域所熟知的方法。
HIVs及其复制
获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的致病源已被公认为是一种具典型慢病毒属特征的逆转录病毒，称为人类免疫缺陷病毒(HIV)。人类慢病毒的种系发生关系见图1。同HIV-1相比，HIV-2同SIVsmm关系更密切，后者是一种从野生黑白睑猴中分离得到的病毒。目前认为HIV-2是SIVsmm从动物向人的传播的代表。而从被捕获的黑猩猩分离得到的一系列慢病毒，命各为SIVcpz，则与HIV-1在基因上更接近。
最早关于HIV-1种系发生分析的研究集中于来自欧洲/北美和非洲的样本，从这两个地区得到的离散的病毒群已被鉴定。接下来明确了HIV-1不同的基因亚群或分化株，将其分为三群，即M(主要类群)、O(异常类群)和N(非M或非O)(图II)。以完整的病毒基因组序列为基础进行分析，HIV-1的M群包括了从全球分离的95％以上的病毒，至少含有8个离散的分化株(A、B、C、D、、F、G、H和J)。HIV-1O群的成员分离自喀麦隆、加篷和赤道新几内亚，其基因组序列在核苷酸序列上仅有不到50％和M群相同。最近以从喀麦隆患者中分离得到了HIV-1N群，这种病毒不能用标准的全病毒酶联免疫吸附检测(ELISA)进行血清学检测，但可通过传统的Western印迹分析进行检测。
目前关于HIV-1基因变异的大部分知识来自对不同地区M群病毒的研究结果。过去10年的资料显示，从一位感染者体内分离得到的HIV-1种群在核苷酸序列上可有6-10％的变异。一个分化株中HIV-1隔离群的核苷酸距离在gag可达15％，而在gp120的编码序列中可达30％。依所分析基因的不同，分化株间的基因变异可达30-40％。
在非洲可以找到所有的HIV-1M亚群。其中A分化株是基因变异最大的一群，也是疾病流行早期非洲最常见的HIV-1亚群。在20世纪90年代中后期，随着HIV-1在南部非洲的迅速漫延，C分化株病毒成为最常见的亚群，是目前占全世界48％的HIV-1感染病例的原因。B分化群是HIV亚群中研究最多的亚群，现在仍是欧洲和北美最常见的亚群。
基因重组的高发生率是逆转录病毒的一个特征。人们起初认为，HIV-1的危险人群不会同时感染几种存在基因差异的病毒株。但到了1995年，人们发现有相当一部分HIV-1M群在全球范围内存在分化株之间的病毒重组体。目前认为，HIV-1重组病毒将在非洲、南美和南亚出现，这些地区同时存在多个HIV-1亚群，占流传的HIV-1病毒株的10％以上。从分子角度看，这些重组病毒的基因组就象用多种平行的HIV-1亚群的片段拼凑马赛克一样，反映出许多交叉事件从而导致了重组病毒的产生。大多数HIV重组病毒源于非洲，其中大部分含有来源于A分化株病毒的片段。例如在泰国，流传的最主要的病毒株由A分化株的gag加pol基因片段以及E分化株的env基因组成。由于泰国HIV-1病毒株中的E分化株env基因与从中非共和国分离得到的病毒E分化株env关系密切，人们相信最初的重组事件发生在非洲，接着子代病毒传入泰国。有趣的是，到目前为止，没有关于HIV-1E亚群隔离群的全长基因(即包括E亚群gag、pol和env基因)的报道。
在病毒融合和侵入易感的CD4+细胞时，α和β趋化因子受体起着共同受体的作用，这一发现导致对HIV-1的分类进行了修改(图III)。现在，病毒的隔离群可以根据融合实验中趋化因子受体的利用情况进行分群，其中HIV-1gp120和CD4+共同受体蛋白表达于不同的细胞中。如图III所示，利用CXCR4受体的HIV-1病毒株(现命名为X4病毒)通常是亲T细胞系(TCL)的合胞体诱导株(SI)，而专门利用CCR5受体的病毒株(R5病毒)主要是亲巨噬细胞(M)和非合胞体诱导性的(NSI)。R5/X4双重亲合株通常为合胞体诱导性的SI，它可能包括了从患者中分离得到的大部分病毒株并表现出亲合表型的连续群。
正如所有具复制能力的逆转录病毒，编码结构蛋白的三个初级HIV-1翻译产物最初合成时是多蛋白前体，接着被病毒或细胞蛋白酶加工成为成熟的颗粒相关的蛋白(图IV)。55kd的Gag前体Pr55Gag被裂解为基质(MA)、壳体(CA)、核壳体(NC)和p6蛋白。160kd的Gag-Pol多蛋白，Pr160Gag-Pol，自动催化产生了蛋白酶(PR)、异二聚体逆转录酶(RT)和整合酶(IN)蛋白。而通过一种细胞酶的蛋白水解消化作用可将糖基化160kd Env前体gp160裂解为gp120表面蛋白(SU)和gp41穿膜蛋白(TM)。剩下的6个HIV-1编码蛋白(Vif，Vpr，Tat，Rev，Vpu，Nef)是已剪接的mRNA的初级翻译产物。
Gae
同其他逆转录病毒的Gag蛋白一样，HIV的Gag蛋白是形成非感染性、病毒样颗粒的必要和充分条件。逆转录病毒Gag蛋白通常以多蛋白前体的形式合成；根据其表观分子量，HIV Gag前体被命名为Pr55Gag。如前所述，Pr55Gag的mRNA是一种非剪接的9.2kb转录子(图IV)，在胞浆中的表达需要Rev。在pol ORF存在的情况下，病毒蛋白酶(PR)在其从细胞中产生的过程中或此后不久将Pr55Gag裂解，从而产生成熟的Gag蛋白p17(MA)、p24(CA)、p7(NC)、p6(图IV)。在成熟病毒颗粒中，MA紧邻病毒包膜脂质双层的内侧，CA则形成颗粒中心圆椎形核心结构的外层，NC则和病毒RNA基因组一起位于核心中，是核糖核蛋白复合体。
HIV Pr55Gag前体在翻译后进行寡聚化并锚于质膜上，在此那些大小和密度于电镜下可见的颗粒进行装配。Pr55Gag形成病毒样颗粒是一个自组装过程，沿着Gag前体多个功能区域间发生关键的Gag-Gag相互作用。病毒样颗粒的组装无需基因组RNA的参与(虽然核酸的存在看来是必须的)，也无需pol编码的酶或Env糖蛋白参与，但要产生感染性的病毒颗粒则需要壳体化病毒RNA基因组并掺入Env糖蛋白和Gag-Pol多蛋白前体Pr160Gag-Pol。
Pol
在Gag基因的下游是HIV基因组中最保守的区域，即pol基因，它编码三个酶，PR、RT和IN(参见图IV)。RT和IN分别用于将病毒RNA基因组逆转录为双链DNA拷贝，和将病毒DNA整合至宿主染色体中。PR则在生命周期的后期发挥关键作用，介导产生成熟的、具感染性的病毒颗粒。Pol基因产物通过酶解一种160kd的Gag-Pol融合蛋白，即称为的Pr160Gag-Pol蛋白得到。这种融合蛋白是在翻译Pr55Gag过程中通过核糖体移码产生(图IV)。Gag-Pol表达的移码机制也被许多其它的逆转录病毒利用，从而确保pol来源的蛋白呈低水平表达，约为Gag蛋白的5-10％。与Pr55Gag一样，Pr160Gag-Pol的N-末端发生肉豆蔻基化并锚于质膜上。
蛋白酶
早期针对鸟类逆转录病毒的脉冲追踪(pluse-chase)实验清楚地显示，逆转录病毒的Gag蛋白最初以多蛋白前体的形式合成，被裂解后生成较小的产物。接下来的研究显示这一加工的功能来自一种病毒酶而非细胞酶，Gag和Gag-Pol蛋白前体的蛋白裂解消化过程为产生病毒的感染力所必需。对逆转录病毒蛋白酶PRs的序列分析显示，这些酶类与细胞“天冬氨酸”蛋白酶(如胃蛋白酶和血管紧张肽原酶)关系密切。与细胞酶一样，逆转录病毒蛋白酶PRs在活性中心通过两个邻近的Asp残基与水分子结合，从而催化靶蛋白中的一个肽键的水解。与细胞天冬氨酸蛋白酶不同的是，逆转录病毒蛋白酶PRs形成真正的二聚体，而细胞天冬氨酸蛋白酶形成假二聚体(在同一分子内通过两个折叠形成活性中心)。HIV-1蛋白酶的X线衍射分析显示两个单体通过每个单体N端和C端的四条反向平行的β片层部分地结合在一起。底物结合区则位于两个单体间形成的裂缝中。与它们的细胞同系物一样，HIV蛋白酶二聚体具有弹性的“片”悬挂于结合位点上，可能起到将底物固定于裂缝中的作用；活性位点的Asp残基位于二聚体的中心。有趣的是，虽然在活性位点残基附近发现了一些有限的氨基酸同源性，逆转录病毒蛋白酶的初级序列存在高度差异性，但其结构却惊人地相似。
逆转录酶
根据定义，逆转录病毒在感染过程的早期即具有将其单链RNA基因组转化为双链DNA的能力。催化这一反应的酶是逆转录酶(RT)，辅以与其相关的RNA酶H(RNaseH)活性。逆转录病毒RTs具有三种酶活性：(a)RNA指导的DNA聚合作用(用于负链DNA合成)，(b)RNA酶H活性(用于降解tRNA引物和DNA-RNA杂交中间产物中的基因组RNA)和(c)DNA指导的DNA聚合作用(用于第二链或正链DNA合成)。
成熟的HIV-1RT全酶是由66kd和51kd亚基组成的异二聚体。51kd亚基(p51)源自66kd亚基(p66)，通过PR蛋白酶解去除p66 C-末端的15kd RNA酶H区域而获得(图IV)。HIV-1RT的晶体结构显示有一高度不对称的折叠，其中p66和p51亚基方向差别很大。可将p66亚基看作右手，多聚酶活性中心位于手掌，而手掌、手指和大拇指亚区域形成一个深的模板结合裂缝。多聚酶区域通过连接亚区域与RNA酶H相连。位于手掌中的活性中心含紧密靠近的三个重要Asp残基(110、185和186)及两个配位Mg2+离子。这些Asp残基的突变使RT多聚酶活性丧失。活性中心中的这三个Asp残基的方向与在其他DNA多聚酶中观察到的相似(如大肠杆菌DNA Pol I的克列诺片段(Klenow))。而p51亚基表现刚性，不形成多聚作用裂缝，该亚基的第110、185和186位Asp残基被埋藏在分子内部。引物-模板双链体的大约18对碱基位于核酸结合裂缝内，从多聚酶活性中心向RNA酶H区域伸展。
在RT-引物-模板-dNTP结构中，位于引物3’端的双脱氧核糖核酸使我们观察到正在进入的dNTP受到攻击之前，捕获的催化复合物。与以往获得的结构比较后提示下面的模式，即手指结构聚拢以便在引物的3’-OH对进入的dNTP进行亲核酸攻击正在进入的dNTP之前卡住模板和dNTP。在进入的dNTP加入生长链之后，目前认为手指结构变为更开放的构型，从而释放出焦磷酸盐、使得RT与下一个dNTP结合。HIV-1 RNA酶H的结构也通过X线晶体衍射图谱法已被确定，这一区域有一类似于大肠杆菌RNA酶H的球形折叠。
整合酶
逆转录病毒复制的一个突出特点就是在逆转录以后把病毒基因组的一个DNA拷贝插入宿主细胞的染色体中。被整合的病毒DNA(原病毒)被用作合成病毒RNA的模板，并作为宿主基因组的一部分始终伴存在于感染细胞中。在整合能力上出现缺陷的突变逆转录病毒通常不能构成持续产生的感染。
病毒DNA的整合由整合酶催化，这是一种在PR介导下由HIV-1Gag-Pol多蛋白C-末端部分裂解而产生的32kd蛋白质(见图IV)。
逆转录病毒IN蛋白含三个结构和功能不同的区域：N-末端含锌指的区域、核心区域和相对不保守的C-末端区域。由于其溶解性低，目前还不能得到HIV-1IN蛋白的完整288个氨基酸的晶体结构。然而，已通过X线晶体衍射或核磁共振(NMR)方法获得了上述三个区域的结构。鸟肉瘤病毒IN核心区域的晶体结构也已被确定。N-末端区域(1-55残基)(已通过NMR质谱分析确定了其结构)含四个螺旋，其中锌与His-12、His-16、Cys-40和Cys-43配位。N-末端区域的结构与螺旋DNA结合蛋白类似，后者含有所谓螺旋-转角-螺旋的基序；然而，在HIV-1结构中，这一基序与二聚体的形成有关。起初，由于其溶解度低，妨碍了对核心区域的结构的确定。但是，在发现IN的185位残基由Phe转为Lys后极大增加了溶解度而并不影响其体外的催化活性后，成功地进行了晶体衍射图谱学分析。HIV-1 IN核心区域(IN残基50-212)的每个单体均由与螺旋相连的5股的β片层组成，这一结构与其他多聚核苷转移酶(包括RNA酶H和噬菌体MuA转座酶)存在惊人相似之处。在其他多聚核苷转移酶的类似位点发现了三个高度保守的残基；在HIV-1IN中，它们是Asp-64、Asp-116和Glu-152，被称为所谓的D，D-35-E基序。这些位点的突变妨碍了HIV IN在体内和体外的功能。在鸟肉瘤病毒和HIV-1核心区域的晶体结构中上述三个氨基酸均紧密相邻，从而支持如下假说，即这些残基在多核苷转移反应的催化过程中发挥了中心作用，而这一反应是整合过程的关键所在。C-末端区域(其结构已通过NMR方法确定)有一个5股的β桶状折叠拓朴结构，与Src同源结构3(SH3)区域类似。最近，含核心区域和C-末端区域的SIV和劳斯肉瘤病毒IN蛋白片段的X线衍射结构已被解析。
Env
HIV Env糖蛋白在病毒生命周期中发挥主要作用。它们含有与CD4受体和共同受体相互作用的决定簇，同时催化病毒包膜的脂质双层与宿主细胞的质膜之间的融合反应。此外，HIV Env糖蛋白含诱发免疫反应的抗原决定簇，这种免疫反应从诊断和开发疫苗方面来说均很重要。
HIV Env糖蛋白经由单次剪接的4.3-kb Vpu/Env双顺反子mRNA合成(见图IV)；其翻译发生于与粗面内质网(ER)相连的核糖体上。160-kd的多蛋白前体(gp160)是一种完整的膜蛋白，通过疏水性转移终止信号而锚于细胞膜上，该终止信号位于最终将成为成熟的TM Env糖蛋白gp41的区域内(图VI)。gp160通过共同翻译被糖基化，形成二硫键，并在ER内发生寡聚化。主要的寡聚化形式是三聚体，虽然也可观察到二聚体和四聚体。gp160被转运至高尔基体，在那里，与其他逆转录病毒包膜前体蛋白一样，被细胞酶进行蛋白水解裂解而形成成熟的SU糖蛋白gp120和TM糖蛋白gp41(图VI)。用于裂解位于一个高度保守的Lys/Arg-X-Lys/Arg-Arg基序之后的逆转录病毒Env前体的细胞酶是弗林蛋白酶或类弗林蛋白酶，虽然其他酶可能也催化gp160的加工过程。Env诱导的融合活性和病毒的感染力均需要gp160的裂解。在gp160发生裂解以后，gp120和gp41形成一种非共价联合，该非共价联合对于Env复合物从高尔基体向细胞表面的转运非常重要。gp120-gp41间的相互作用非常弱，大量gp120从表达Env的细胞表面脱落下来。
HIV Env糖蛋白复合物，尤其是SU(gp120)区域中，呈高度糖基化；gp160的分子量大约有一半由寡糖侧链构成。在Env从其在ER上的合成部位向质膜转运的过程中，许多侧链通过加入糖复合物而发生修饰。大量的寡糖侧链形成一种可想象为“糖云”的东西，妨碍了宿主对gp120的免疫识别。如图VI所示，gp120含分散的保守区(C1至C5)和可变(V1到V5)区。不同病毒隔离株的gp120中存在的Cys残基高度保守，形成了连接大环中前四个可变区的二硫键。
病毒Env糖蛋白的的主要功能为促进病毒包膜与宿主细胞膜的脂质双层间的膜融合。这种膜融合使得病毒核心能进入宿主细胞浆中。研究提示，gp120和gp41的许多区域直接或间接参与了Env介导的膜融合。对正粘病毒的HA2血凝素蛋白和副粘病毒的F蛋白的研究显示，上述蛋白N-末端的一个高度疏水区(称为融合肽)在膜融合过程中发挥着关键作用。突变分析显示，在HIV-1、HIV-2、和SIV TM糖蛋白的N-末端有一类似区域(见图VI)。gp41的这一区域发生非疏水替换后，合胞体的形成被减弱或阻断，从而产生非感染性的后代病毒颗粒。
gp41融合肽的C-末端是两个两性螺旋区(见图VI)，在膜融合过程中发挥中心作用。N-末端螺旋(称为N螺旋)含有一个Leu拉链样的七联体重复基序，N螺旋的突变损害病毒的感染力和膜融合活性，而源自上述序列的多肽在培养物中表现出很强的抗病毒活性。HIV-1和SIV gp41的胞外区域的结构，尤其是两个螺旋基序的结构，已成为近年结构分析的焦点。应用X线衍射分析或NMR质谱分析对含螺旋区域的融合蛋白(一种来自N-末螺旋和C-末螺旋的多肽混合物)或SIV的结构，从残基27到149的完整gp41胞外区域进行了测定。这些研究均得到了一个基本相似的三聚体结构，其中两个螺旋区以反向平行的方式积压从而形成一个六螺旋的束。N-末端螺旋在束的中央形成卷曲螺旋，而C-末螺旋则嵌入外侧的疏水沟中。
在膜融合过程中，与CD4结合导致Env的构象改变，从而有利于共同受体的结合。在gp120/CD4/共同受体三分子复合物形成后，gp41发生一种假设的构象改变，使得融合多肽插入到靶向的脂质双层中。gp41六螺旋束的形成(包含了gp41 N-末螺旋和C-末螺旋间反向平行的相互作用)将病毒和细胞膜拉到一起，从而发生了膜融合。
应用重组MVA病毒加强CD8 + 细胞免疫反应
本发明涉及产生针对某个抗原的CD8+T细胞免疫反应，并引发抗体反应。特别是，本发明涉及“激发和加强”免疫的方案，其中使用激发组分处理后诱导的免疫反应可被加强组分加强。本发明基于发明者的实验结果，该结果显示在以一系列不同激发组分中的任何一种(包括重组MVA本身)进行激发后，应用修饰的Ankara牛痘病毒载体可以获得有效的免疫加强。
在针对许多病原体的免疫反应中，有一个主要的保护性作用是通过CD8+T细胞，又称细胞毒性T细胞(CTL)介导的。CD8+T细胞的一项重要功能就是分泌γ干扰素(IFNγ)，后者提供了一种检测CD8+T细胞免疫反应的方式。免疫反应的第二个成分是针对病原蛋白的抗体。
本发明采用了MVA，如以下描述的实验所示，已发现MVA是加强CD8+T细胞免疫反应的有效方法并能诱发抗体反应，该免疫反应通过一系列不同激发组分中的任何一种进行激发。
更引人注目的是，以下描述的实验工作证实，采用本发明的实施方式可使表达HIV抗原的重组MVA病毒加强由DNA疫苗激发的CD8+T细胞免疫反应，同时还可诱发抗体反应。研究发现，MVA经皮内、肌内或粘膜途径进行免疫可诱导CD8+T细胞免疫反应。重组MVA还可激发免疫反应，后者可通过一次或多次接种重组MVA而得到加强。
非人的灵长类在用质粒DNA免疫并以MVA加强后可有效抵御活病毒的粘膜内攻击。方便地是，发明者发现在进行激发和加强免疫时均可采用皮内、肌内或粘膜免疫的方式，从而形成一种适用于诱导产生CD8+T细胞反应以及抗体反应的免疫方式，例如在人类中。
本发明在不同的方面和实施方式中采用编码HIV抗原的MVA载体来加强针对某一抗原的CD8+T细胞免疫反应(该反应是由此前摄入的编码该抗原的核酸激发)，也诱发抗体反应。
总的来说，本发明提供了一种MVA载体，用于加强针对HIV抗原的CD8+T细胞的免疫反应，也诱发抗体反应。本发明的一个方面是提供一种能加强个体内针对HIV抗原的CD8+T细胞免疫反应，也诱发抗体反应的方法。这种方法包括给体内提供一个MVA载体，这种载体内含有能编码某种抗原的核酸(该核酸与调节其在体内表达抗原的调节序列可操作地相连)。由此，体内已被抗原激发的CD8+T细胞免疫反应得到加强。
针对HIV抗原的免疫反应可通过质粒DNA免疫或用一个感染原感染后激发。
本方明的另一方面在于提供了一种在体内诱导产生针对HIV抗原的CD8+T细胞免疫反应、并诱发抗体反应的方法。这种方法包括给个体提供一种激发组分(其中包括编码某种抗原的核酸)；然后再给予一种加强组分，包括一个含有能编码某种抗原的核酸的MVA载体(其中的核酸与调节该核酸在体内表达抗原的调节序列可操作地相连)。
另一方面是为生产可用于哺乳动物的药物提供一种MVA载体，如所公开地那样，用来加强哺乳动物体内针对HIV抗原的CD8+T细胞免疫反应，并诱发抗体反应。这种药物一般是在用激发组分(含编码某种抗原的核酸的组分)进行激发之后再给药。
激发组分可以包括任何病毒载体，如牛痘病毒载体，例如复制缺陷株—修饰的安卡拉牛痘病毒(MVA)或NYVAC(Tartaglia等人，1992Virology 118：217-232)，鸟痘病毒载体中的鸡痘病毒或金丝雀痘病毒，象ALVAC株(Paoletti等人，1994 Dev Biol Stand 82：65-69)，或腺病毒载体、疱疹性口腔炎病毒载体、α病毒载体。
激发组分还可包括编码抗原的DNA，优选地是以环状质粒形式存在的DNA，这种环状质粒在哺乳动物细胞中不能复制。选用的任何标志物均不应对临床上使用的抗生素发生耐药性，因此对卡那霉素耐药性要优于对氨苄青霉素耐药性。抗原的表达应通过在哺乳动物细胞中具有活性的启动子驱动，如巨细胞病毒的立即早期(CMV IE)启动子。
在本发明各个方面的详细实施方案中，给予一次激发组分之后接着以加强组分进行一次加强，或给予第一次和第二次加强组分，第一次和第二次加强组分加强可以一样或者可以不同。可进一步施用加强组分也未偏离本发明。在一种实施方案中，一种三次免疫的方案是先采用DNA，然后是以腺病毒作为第一次加强组分，再以MVA作为第二次加强组分，可选择地进一步施用(第三次)加强组分或者随后使用一种或者另外一种或者两种相同或不同的载体进行加强。另一种方法是先DNA，再MVA，再腺病毒，可选择性地随后使用一种或者另外一种或者两种相同或不同的载体进行加强。
分别用于激发和加强组分的被编码抗原(尽管应用了许多加强组分)无需相同，但至少应共有一个CD 8+T细胞抗原决定簇。这种抗原可以对应于一种完整抗原，也可以是其中的一个片段。可应用多肽抗原决定簇或人工排列抗原决定簇，更有效地切除抗原中的不必要的蛋白序列和单个或多个载体中的不必要的编码序列。可以加入一个或多个额外的抗原决定簇，例如可被T辅助细胞识别的抗原决定簇，特别是被具有不同HLA表达型的个体识别的抗原决定簇。
本发明中由重组MVA病毒编码的HIV抗原含有免疫原活性多肽，这种免疫原活性可被HIV Env、Gag、Pol、Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu或Nef的氨基酸序列所诱导，作为至少一个CD 8+T细胞抗原决定簇。这种氨基酸序列基本上对应于一种已知HIV Env或pol中至少一个10-900个氨基酸的片段和/或共有序列；或一种已知HIV Gag中至少一个10-450个氨基酸的片段和/或共有序列；或一种已知HIV Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu或Ner中至少一个10-100个氨基酸的片段和/或共有序列。
尽管本发明使用了全长的Env前体序列，可以选择性地去除Env的某些子序列。例如，可以去掉gp120的表面区和gp41的跨膜裂解产物区。
尽管本发明使用了全长的Gag前体序列，可以选择性地去除Gag的某些子序列。例如，可去除基质蛋白区(p17)、壳体蛋白区(p24)、核壳体蛋白区(p7)以及p6区(Gag多蛋白的C-末端肽段)。
尽管本发明使用了全长的Pol前体序列，可以选择性地去除Pol的某些子序列。例如，可去除蛋白酶蛋白区(p10)、逆转录酶蛋白区(p66/p51)和整合酶蛋白区(p32)。
上述HIV Env、Gag或Pol与已知的Env、Gag或Pol蛋白的氨基酸序列间的总的同一性至少为50％(如50-99％同一性，或其中的任何范围或数值)，从而诱发了针对至少一株HIV的免疫源性反应。
序列同性百分比可以被测定，例如，通过从威斯康星大学遗传学计算机小组(UWGCG)获得的GAP计算机程序(6.0版)进行序列信息比对。GAP程序采用的是Needleman和Wunsch的比对方法(J Mol Biol1970 48：443)，Smith和Waterman对其进行了改良(Adv Appl Math 19812：482)。简而言之，GAP程序将同性定义为相同的比对符号(如核苷酸或氨基酸)的数目，除以两个序列中较短序列的全部符号的数目。优选的GAP程序缺省参数包括：(1)一元的比较矩阵(数值1代表相同，数值0为不相同)和Gribskov和Burgess加权比较矩阵(Nucl Acid Res 198614：6745)，Schwartz和Dayhoff对此作了描述(主编，《蛋白序列和结构图谱》，国家生物医学研究基金会，华盛顿特区，1977，pp353-358)(Atlasof Protein Sequence and Structure，National B iomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.1979，pp353-358)；(2)每个间隙罚分为3.0，每个间隙中的每个符号再罚分0.10；(3)对末端的间隙不作罚分处理。
在一项优选实施方式中，本发明的Env是至少一种HIV包膜蛋白的变异形式。优选地，Env含有gp120，和gp41的跨膜区和胞外区，但缺乏gp41的部分或全部胞浆区。
已知的HIV序列可从商业或研究所HIV序列数据库中获得，如GENBANK，或出版的汇编物，如由Myers等人主编的《人类逆转录病毒与艾滋病，对核酸和氨基酸序列的编辑与分析》，卷I和卷II，(Human Retrovirus and AIDS，A Compilation and Amino Acid Sequences，Vol.I and II)，《理论生物学和生物物理学》，(Theoretical Biology andBiophysics)，Los Alamos，N.Mex.(1993)，或http://hiv-web.lanl.gov/。
对HIV的Env、Gag或Pol进行替换或插入可获得另外的HIV Env、Gag或Pol，由一个核酸所编码用于本发明中的重组逆转录MVA病毒中，，这种HIV Env、Gag或Pol包含至少一个氨基酸残基的替换或插入(如1-25个氨基酸)。另外，还可从HIV Env、Gag或Pol序列中删除至少一个氨基酸残基(如1-25个氨基酸)。优选地，确定上述替换、插入或删除是根据安全性、表达水平、免疫原性和与MVA高复制率的相容性。
本发明中HIV Env、Gag或Pol氨基酸序列的变异可通过象DNA突变这样的方法进行制备。例如，这样的HIV Env、Gag或Pol可包括对编码氨基酸序列中不同氨基酸残基的核苷酸的删除、插入或替换。显然，在诱发编码HIV Env、Gag或Pol的核酸突变时不能选位于阅读框之外的序列，同时优选地不产生会形成mRNA二级结构的互补区。
本发明中编码HIV Env、Gag或Pol的核酸也可通过对编码HIVEnv、Gag或Pol的DNA或RNA中的核苷酸进行扩增或位点定向突变进行制备，从而根据在此提供的教导或指南，合成或逆转录编码DNA来制备编码HIV Env、Gag或Pol的DNA或RNA。
本发明中表达HIV Env、Gag或Pol的重组MVA病毒含有一套编码HIV Env、Gag或Pol的有限序列作为替换核苷酸，根据在此提供的教导或指南，这种替换核苷酸可通过本领域中普通技术人员用常规方法获得，无需进一步实验。关于蛋白质化学和结构的详细描述见SchulzG..E.等人，1978《蛋白结构原理》(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，New York，N.Y.和Creighton，T.E，1983《蛋白：结构和分子特性》，(Proteins：Structure and Molecular Properties)，W.H.Freeemann & Co.，San Francisco，CA.关于核苷酸序列替换如密码子优先性的陈述，见Ausubel等人主编，《当代分子生物学实验方法》，(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.，NewYork，N.Y.1994，ξξA.1.1-A.1.24和Sambrook，J.等人主编，1989《分子克隆：实验手册》第二版，(Molecular Cloning：A Laboratory Mannual)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.附录C和D。
因此，根据在此提供的教导或指南，本领域的技术人员将会知道如何在HIV env、gag或pol的DNA或RNA中其它位点进行其它氨基酸残基的替换以得到含有替换、删除或插入变异的备选HIV Env、Gag或Pol。
在MVA载体中，用于表达被编码抗原的调节序列包含一个自然的、修饰的或合成的痘病毒启动子。“启动子”指的是一段核苷酸序列，通过它可启动其下游与之可操作地相连的DNA的转录(也就是双链DNA有义链的3’方向)。“可操作地连接”是作为同一个核酸分子的一部分连接在一起，其位置和方向均适于通过启动子启动转录。与启动子可操作地连接的DNA受启动子的“转录起始调控”。根据本领域的技术人员的知识和实践，其他调节序列包括终止子片段、聚腺苷酸化序列、标记基因和其他的序列也应适当包括在内，例如，见Moss，B.(2001)痘病毒：病毒及其复制，(Poxviridae：the viruses and theirreplication.)《病毒学领域》，(In Fields Virology)，D.M.Knipe和P.M.Howley主编的Philadelphia，Lippincott William & Wilkins，pp.2849-2883。许多已知的操作核酸的技术和方法，如制备核酸构建物、诱发突变、测序、将DNA引入细胞、基因表达和蛋白质分析等，详见：《当代分子生物学实验方法》，(Molecular Cloning：A LaboratoryMannual)，1998 Ausubel等人主编，John Wiley & Sons。
本发明中各个部分和实施方案中使用的启动子须与痘病毒表达系统相容，含有自然、修饰和合成的序列。
激发和加强组分的其中之一或二者均可含有佐剂，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或编码它们的核酸。
通常在给予激发组分后约1到6个月给予加强组分，优选是约1到3个月。
给予激发组分、加强组分或两种组分时，最好通过皮内、肌内或粘膜免疫方式。
给予MVA疫苗可用针注射病毒悬液。备选方法是采用无针注射方式给予病毒悬液(使用，如BiojectorTM无针注射器)或经二次悬浮的含疫苗冻干粉剂，前题是制剂剂量个体化、无需冷藏。这对于需要疫苗的非洲乡村地区非常有利。
MVA是一种在人类免疫中有出色安全记录的病毒。制备重组病毒简单易行，还可进行大量重复性生产。因此，皮内、肌内或粘膜给予重组MVA病毒非常适用于作为人类对艾滋病——可通过一种CD8+T细胞反应进行控制的疾病——的预防和治疗用疫苗。
艾滋病患者通过给予抗原并产生针对这种抗原的CD8+T细胞免疫反应将从中获益或得到好的疗效。
更大的可能在于，给药可以在感染或出现症状之前通过产生针对HIV或艾滋病的免疫反应而起到预防作用。
根据本发明的给药组分可以配制在药物组合物中。这些组合物可含有药理学上合适的赋形剂，载体，缓冲剂，稳定剂或其他一些本领域技术人员所熟知的物质。这些物质应无毒且不会影响活性成分的效能。载体或其他物质的确切性质依给药途经而定，如静脉、经皮或皮下、经鼻、肌内或腹腔内等。
如前所述，优选通过皮内、肌内或经粘膜给药。
可以加入生理性盐溶液、葡萄糖、其他糖溶液或醇类如乙二醇、丙二醇及聚乙二醇等。
进行经静脉、经皮、经皮下、肌内或粘膜注射，或病变部位注射时，活性成分应是一种肠外可接受的水溶液，没有致热原、具有合适的pH值、等渗性和稳定性。本领域的相关技术能够用于制备合适的使用溶液，例如等渗溶液，如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液。可以根据需要加入防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
可以采用缓释剂型。
在制作MVA病毒颗粒，并可选择性将这种颗粒以合适形式配制入组合物时，这种颗粒就可以给予某个个体，尤其是人或其他灵长类动物。也可以给予其他哺乳动物，如啮齿动物，象小鼠、大鼠、大颊鼠，又如豚鼠、兔、绵羊、山羊、猪、马、奶牛、驴、狗或猫。
给药优选用一个足以对某一个体呈现疗效的“有效预防剂量”或“有效治疗剂量”(根据具体情况而定，尽管有时候预防也被认为是治疗)。实际给药量、速度和给药时间进程将取决于疾病的性质和严重程度。治疗方案处方，如决定用药剂量等，属全科医师或其他医生的职能范畴，而动物则属兽医范畴，同时应考虑所治疾病、患者的具体情况、给药部位、给药方式和其他医生已知的因素。上述技术和方法的范例见《雷明登药理科学》，(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，16版，1980，Osol，A.(主编)。
在一个优选方案中，DNA用量为每次注射250ug到2.5mg，接着为MVA，用量为每次注射106到109个感染性病毒颗粒。
一个组分可以单独给药，也可与其他治疗方式联合使用，可根据治疗情况同时或序贯给药。
对非人的哺乳动物用药无需出于治疗目的，而可以是用于实验目的，例如，研究针对感兴趣抗原的免疫反应的机制，如针对HIV或艾滋病的保护反应。
参考上面已提及的公开内容和接下来的实验举例，本发明的其他方面和实施方案对于本领域的技术人员来说是非常清楚明的。它们是以例举方式包含于其中，而不是限制本发明。同时参考附图作了相关解释。
                    实施例1
多蛋白DNA/MVA疫苗对粘膜攻击的控制及AIDS的预防作用
在此我们测定DNA激发和痘病毒加强免疫对高致病性粘膜攻击的保护能力。用猿猴和人的免疫缺陷病毒嵌合体89.6(SHIV-89.6)构建免疫原，以其高致病性衍生物SHIV-89.6P进行攻击(G.B Karlsson等人1997 J Virol 71：4218)。SHIV-89.6和SHIV-89.6P不产生交叉中和抗体(D.C...Montefiori等人1998 J Virol 72：3427)并且使我们能描述疫苗诱导T细胞增殖和非中和性抗体产生的能力，以便控制免疫缺陷病毒的攻击。用修饰的安卡拉牛痘病毒(MVA)构建重组痘病毒。MVA能高效促进DNA激活的CD8 T细胞增殖，并且具有不能在人或猴细胞中有效复制的安全特性(H.L.Robinson等人2000 AIDS Reviews 2：105)。
为了确保广泛的免疫反应，疫苗的DNA和重组MVA(rMVA)成分均表达多种免疫缺陷病毒蛋白。DNA主要组分(DNA/89.6)用一个单一的转录子表达猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的Gag，Pol，Vif，Vpx和Vpr以及人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的Env，Tat和Rev(R.J.Gorelick等人1999 Virology 253：259；M.M.Sauter等人1996 J cell Biol 132：795)。
利用ClaI和RsrII位点将分子克隆的SHIV-89.6序列克隆至pGA2载体。这种克隆敲除了长末端重复序列(LTRs)和nef。 SHIV-89.6序列内部还有一个12个碱基对的变异区域，编码了核壳体第二锌指结构的前四个氨基酸。这一变异使SHIV病毒没有感染性(R.J.Gorelick等人1999 Virology 253：259)。gp41内的一个突变使710位的酪氨酸变为半胱氨酸，进而使DNA表达细胞的胞浆膜上可更好地表达Env(M.M.Sauter等人1996 J Cell Biol 132：795)。pGA2用不含内含子A的CMV立即早期启动子和牛生长激素聚腺苷酸化序列来表达疫苗的插入部分。疫苗DNA由Althea生产(San Diego，CA)。在瞬时转染的293T细胞中，DNA/89.6可使1×106细胞产生大约300ng Gag和85ng Env。
在牛痘病毒早期/晚期启动子的控制下，rMVA加强剂(MVA/89.6)表达SIV Gag，Pol，和HIV-1 Env。
MVA双重组病毒表达HIV 89.6Env和SIV 239 Gag-Pol，它们分别插入MVA的第II和第III缺失位点。89.6 Env蛋白被切去了gp41COOH-末端115个氨基酸。修饰的H5启动子控制着这两个外源基因的表达。
疫苗接种方法为在第0和第8周采用DNA激发，第24周以rMVA进行加强(图IA)。
皮内(i..d.)和肌肉内(i.m.)免疫用DNA制剂溶于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中，分五次(每次100μl)将含2.5mg DNA的i.d.注射液用无针注射器(Bioject，Portland，OR)注射于每侧大腿外侧皮内或一次将100μl含250μg质粒的注射液注射于右腿外侧皮内。DNA肌肉注射是在每侧大腿外侧肌肉一次注入2.5mg DNA(DNA溶于0.5ml PBS中)或在右腿外侧肌肉一次注入250μg/100μl。将1×108噬斑形成单位(pfu)的MVA/89.6用针管进行i.d.和i.m.注射。i.d.为每侧大腿外侧每次100μl，i.m.为每侧大腿外侧每次500μl。对照组动物用无针注射器分五次(每次100μl)于每侧大腿外侧皮内注射2.5mg未插入疫苗的pGA2载体。对照的MVA加强免疫制剂为2×108pfu不含插入物的MVA，i.d.和i.m.注射方法与MVA/89.6相同。
四组猕猴(每组六只)分别用无针注射器(Bioject，Portland，OR)经皮内或肌肉内注射2.5mg(高剂量)或250μg(低剂量)DNA(T.M.Allen等人2000 J Immunol 164：4968)。
年轻的成年猕猴选自Yerkes饲养种群，依照“动物福利法案”和美国国立卫生研究院(NIH)的“实验动物管理与使用指南”进行管理。实验方法得到Emory大学动物管理和使用委员会的批准。用多聚酶链式反应(PCR)分析法确定猕猴的Mamu-A*01等位基因(M.A.Egan等人2000 J Virol 74：7485；I.Ourmanov等人2000 J Virol 74：2740)。每组分配有两只或更多的至少含有一个Mamu-A*01等位基因的动物。动物数量如下：1，RBr-5*；2，RIm-5*；3，RQf-5*；4，RZe-5；5，ROm-5；6，RDm-5；7，RAj-5*；8，RJi-5*；9，RA1-5*；10，RDe-5*；11，RAi-5；12，RPr-5；13，RKw-4*；14，RWz-5*；15，RGo-5；16，RLp-4；17，RWd-6；18，RAt-5；19，RPb-5*；20，RIi-5*；21，RIq-5；22，RSp-4；23，RSn-5；24，RGd-6；25，RMb-5*；26，RGy-5*；27，RUs-4；和28，RPm-5。含有A*01等位基因的动物用星号标注。
DNA传送的基因枪未被使用，因为1996-98年的实验中发现它们可激活非保护性的免疫反应(H.L.Robinson等人1999 Nat Med 5：526)。MVA/89.6加强免疫为皮内和肌肉针注2×108噬斑形成单位(pfu)。对照组包括两只假免疫动物和两只未免疫动物。在rMVA加强免疫7个月后对动物进行攻击以检测长期免疫力的产生情况。由于绝大多数HIV-1感染可穿透粘膜表达，实验采用直肠内攻击。
DNA激发加rMVA加强可产生高频率的病毒特异性T细胞，并于rMVA加强后1周达峰值(图1)。用Mamu-A*01四聚体来评价能识别Gag-CM9抗原决定簇的T细胞频率，采用重叠肽库和酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测能识别Gag全部抗原表位的T细胞频率(C.A.Power等人1999 J Immunol Methods 227：99)。
为了分析四聚体，以异硫氰酸荧光素(FITC)(FN-18；BiosourceInternational，Camarillo，CA)标记的CD3，多甲藻素-叶绿素蛋白(peridinin chlorophyl protein)(PerCP)(SK1；Becton Dickinson，San Jose，CA)标记的CD8和别藻蓝蛋白(APC)标记的Gag-CM9(CTPYDINQM)-Mamu-A*01四聚体(SEQ ID NO：6)对大约1×106外周血单个核细胞(PBMC)进行抗体表面染色，体积为100μl于8-10℃染色30分钟。细胞用含2％胎牛血清(FBS)的冷PBS洗涤2次，以1％的多聚甲醛PBS溶液固定，24小时内进行流式细胞分析(FACScaliber)(Becton Dickinson，San Jose，CA)。用前散射光和侧散射光先选定淋巴细胞门，再选定CD3细胞。然后再分析CD3细胞中的CD8和四聚体结合细胞。每一样品约获取150,000个淋巴细胞。数据用FloJo软件(Tree Star，San Carlos，CA)进行分析。
γ-干扰素(IFN-γ)的ELISPOTs分析：用人IFN-γ抗体(克隆B27，Pharmingen，San Diego，CA)包被MULTISCREEN 96孔滤板(MillliporeInc.Bedford，MA)，浓度为2μg/ml(溶于碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)，8-10℃孵育过夜。以RPMI培养基洗板2次，然后用完全培养基(含10％FBS的RPMI)于37℃封闭1小时。再用普通RPMI培养基洗板5次，将细胞(100μl/孔)接种至培养板上，每一浓度均做双份，每孔中细胞数量从2×104至5×105。各孔中加入肽库，每种肽的终浓度为2μg/ml(溶于100μl完全培养基中)。细胞于5％CO2条件下37℃孵育36小时左右。用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20的PBS)洗板6次，加入1μg/ml用2％FBS洗涤缓冲液稀释的生物素化人IFN-γ抗体(克隆7-86-1；Diapharma Group，West Chester，OH)孵育。培养板于37℃孵育2小时，用洗涤缓冲液洗板6次。每孔加入亲和素偶联的辣根过氧化物酶(Vector Laboratories，Burlingame，CA)，37℃孵育30-60分钟。用洗涤缓冲液洗板6次，以稳定DAB作为底物(Research Genetics，Huntsville，AL)使斑点显色。用立体解剖显微镜计数斑点。每次测定均以卵清蛋白肽(SIINFEKL)(SEQ ID NO：7)作为对照组。对应于5×105外周淋巴单核细胞(PBMCs)而言，卵清蛋白肽的背景斑点通常＜5个。对于1×106 PBMCs，这一背景正常值为＜10个。只有当ELISPOTs计数为背景的两倍(≥20)时才认为是显著的。ELISPOTs的计数频率是一个大概数字，因为在没有饲养层细胞的情况下，不同稀释倍数的细胞斑点生成的效率不同。(C.A.Power等人1999 J Immunol Methods 227：99)。同一给定时间点的所有动物的细胞稀释倍数均一致，但是不同的稀释倍数用来检测记忆和急性反应。
Gag-CM9四聚体分析仅限于表达Mamu-A*01组织相容性表型的猕猴，而ELISPOT反应无特异的组织相容性表型。正如所预期的那样，DNA免疫引发低水平的记忆细胞增加，rMVA加强免疫后1周内记忆细胞增殖达到高水平(图1和6)。在Mamu-A*01猕猴体内，Gag-CM9抗原特异性的CD8细胞增殖可达CD8 T细胞总数的19％(图6)。将峰值时期的特异细胞浓缩10-100倍收集在DNA/MVA记忆库(图1A和6)。三个Gag肽库的ELISPOTs也经过大量扩增(对于1×106PBMCs，频率达4000个斑点)，浓缩5-20倍后收入DNA/MVA记忆反应中(图1B)。具有和不具有A*01组织相容性表型的猕猴的ELISPOTs频率计数相同(P＞0.2)。
用简单的线性回归来评价加强免疫后和攻击后、记忆和攻击后ELISPOT反应的相关性，以及对数转化期病毒量与ELISPOT频率计数间的相关性。疫苗组和对照组、具有和不具有A*01的猕猴的对数转化期病毒量及EISPOT反应的比较采用双样本t检验进行。采用双因素方差分析分析免疫剂量和给药途径对峰值期DNA/MVA ELISPOTs、记忆DNA/MVA ELISPOTs和对数转化期Gag抗体产生情况的影响。
在疫苗反应的峰值和记忆时相中，疫苗组ELISPOTs的反应强度排序为：2.5mg i.d.＞2.5mg i.m.＞250μg i.d.＞250μg i.m.(图1B)。IFN-γ的ELISPOTs包括CD4和CD8细胞。Gag-CM9特异性CD8细胞受到肽的再次刺激后具有很好的溶解活性。
rMVA免疫加强后7个月(此时疫苗诱导增殖的T细胞正处于记忆时相中)用高致病性SHIV-89.6P进行直肠内攻击(图1)。
将原始的SHIV-89.6P原种在猕猴体内经一次静脉注射及一次直肠内传代制成攻击原种(每ml含5.7×109病毒RNA拷贝)(G.B.Karlsson等人1997 J Virol 71：4218)。在病毒血症的峰值时期收集直肠内感染动物的淋巴细胞，去除CD8细胞并用有丝分裂原刺激来制备攻击原种。在直肠攻击前，将禁食动物麻醉(氯胺酮(ketamine)，10mg/kg)，使其腹卧位骨盆部位略抬高。在直肠内插入一饲管(8 Fr(2.7mm)×16英寸(41cm)，Sherwood Medical，St.Louis，MO)，深度为15-20cm。插入饲管后，将一只装有20次直肠内感染剂量接种物(溶于2ml含10％FBS的RPMI-1640中)的注射器连接到饲管上，缓缓地将接种物注入直肠。接种物输完后，用3.0ml不含FBS的RPMI冲洗饲管，然后慢慢拔管。攻击后，动物原处放置10分钟，保持骨盆部位略抬高。
这种攻击使疫苗组和对照组动物全部感染(图2)。然而攻击后2周，疫苗组血浆病毒RNA滴度(几何均数为1×107-5×107)比对照组(几何均数为4×108)至少低10倍(图2A)(S.Staprans等人in：Viral GenomeMethods K.Adolph，ed.CRC Press，Boca Raton，FL，1996 pp.167-184；R.Hofmann-Lehmann等人2000 AIDS Res Hum Retroviruses 16：1247)。
为了测定SHIV的拷贝数，直接用QIAamp Viral RNA试剂盒(Qiagen)提取150μl ACD抗凝血浆中的病毒RNA，以60μl AVE缓冲液洗脱，-80℃冻存，待定量测定SHIV RNA。取5μl纯化的血浆RNA在终体积为20μl的反应体系中进行反转录，含有50mM KCl，10mMTris-HCl(pH8.3)，4mM MgCl2，1mM各种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)，2.5μM随机六聚体，20单位的MultiScribe RT(逆转录酶)和8个单位的RNA酶抑制剂。反应物先在25℃下孵育10分钟(min)，然后42℃孵育20min，最后99℃孵育5min灭活反转录酶。调节反应混合物至终体积50μl，含有50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，4mMMgCl2，0.4mM每种dNTP，0.2μM正向引物，0.2μM反向引物，0.1μM探针和5个单位AmpliTaq Gold DNA多聚酶(所有试剂均购自PerkinElmer Applied Biosystems，Foster City，CA)。引物序列位于SIVgag基因的保守部位，与前人描述的一致(S.Staprans等人in：ViralGenome Methods K.Adolph，ed.CRC Press，Boca Raton，FL，1996 pp.167-184)。用PerkinElmer Applied Biosystems 7700序列检测系统进行PCR，条件为：95℃ 10min，进而93℃ 30s和59.5℃ lmin进行40个循环。用7700序列检测器分析PCR产物积累，针对内部保守的gag基因序列的探针为：6FAM-CTGTCTGCGTCATTTGGTGC-Tamra(SEQID NO：8)，其中FAM和Tamra表示报告分子和中止染料。SHIV RNA拷贝数可用一个外推标准曲线的比较进行计算，该曲线用SIV bDNA方法(Bayer Diagnostics，Emeryville，CA)对源自病毒颗粒的SIVmac239RNA进行定量绘制而成。提取所有标本的RNA进行双份扩增，报告其均值结果。采用0.15ml血浆输入时，测定的灵敏度为103RNA拷贝/ml血浆，线性动力学范围为103-108RNA拷贝(R2＝0.995)。当标本中SHIV RNA含量＞104拷贝/ml时，批内变异系数＜20％；每ml中SHIVRNA拷贝数为103-104时，批内变异系数＜25％。为了更精确的定量16和20周时疫苗组动物体内低水平的SHIV RNA拷贝数，我们对SHIVRNA检测方法进行了如下改良以增加其灵敏度：(i)在提取病毒RNA之前，将≤1ml的血浆在23,000g离心力下10℃离心150min进行浓缩，(ii)进行一步法反转录PCR(R.Hofmann-Lehmann等人2000 AIDS ResHum Retroviruses 16：1247)。这些改进可准确定量测定每ml血浆中300个拷贝的SHIV RNA，该方法所测的SHIV RNA值与前述第一方法所测结果高度相关(r＝0.91，P＜0.0001)。
攻击后8周，高剂量DNA激发组和低剂量DNA i.d.激发组动物体内病毒RNA的几何均数均降至1000拷贝/ml。此时，低剂量DNA i.m.激发组病毒RNA的几何均数为6×103拷贝，而未免疫的对照组为2×106拷贝。攻击后20周，即使低剂量DNA i.m.激发组病毒RNA的几何均数也降至1000拷贝。在24只免疫的动物中，仅1只动物(低剂量DNAi.m.激发组的22号)间断的出现病毒量大于1×104拷贝/ml(图2D)。
攻击后5周，所有未免疫的对照组动物出现严重的CD4细胞缺失(图2B)。除低剂量DNA i.m.激发组的22号动物出现缓慢的CD4下降外(见上)，所有疫苗免疫的动物CD4细胞保持不变(图2E)。攻击后23周，四只对照动物中有三只死于AIDS(图2C)。这些动物均有不同程度的肠炎腹泻，隐孢子虫病，大肠杆菌性膀胱炎，小肠弯曲杆菌感染，脾肿大，淋巴结病和SIV相关的巨细胞肺炎。相反，所有24只疫苗免疫的动物均保持健康。
对病毒攻击的遏制与抗病毒T细胞的爆发增殖相关(图1和3A)。在攻击后1周，外周血中四聚体+细胞降低，可能提示特异T细胞向感染部位聚集(图3A)。然而，攻击后2周，外周血中四聚体+细胞扩增达到、甚至超过rMVA加强免疫后的水平(图1和3A)。大多数四聚体+细胞经过6小时的多肽刺激后产生IFN-γ(图3B)(S.L. Waldrop等人1997 J Clin Invest 99：1739)，而并没有出现“休克的”(stunned)IFN-γ阴性表型，后者有时见于病毒感染时(F.Lechner等人2000 J Exp Med191：1499)。
细胞内细胞因子测定：约1×106 PBMC在5ml聚丙烯试管中37℃刺激1小时，内含100ug/ml Gag-CM9多肽(CTPYDINQM)(SEQIDNO：6)[溶于100ul含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的RPMI中]及1ug/ml的人CD28抗体和1ug/ml人CD49d抗体(Pharmingen，San Diego，CA)。然后加入含10％FBS和巴西金叶树苷(monensin)(10μg/ml)的RPMI900ul，细胞在37℃、5％CO2条件下，于5度倾斜角，培养5小时。细胞表面以PerCP偶联的抗CD8抗体(克隆SK1，Becton Dickinson)染色，8-10℃ 30min，以含2％FBS的冷PBS洗两次，再以Cytofix/Cyoperm溶液(Pharmingen)固定和渗透。然后在Perm洗涤溶液中(Pharmingen)分别与FITC偶联的抗人CD3(克隆FN18；Biosource International，Camarillo，CA)和藻红蛋白偶联的抗人IFN-γ抗体(克隆B27；Pharmingen)4℃孵育30min。以Perm洗涤液将细胞洗两次，再以普通PBS冼一次，以含1％多聚甲醛的PBS二次悬浮细胞。对FACScaliber而言，要求分析约150,000个淋巴细胞，以FloJo软件进行分析。
攻击后爆发增殖的T细胞随着病毒量的下降而减少。攻击后12周，病毒特异的T细胞为其峰值的1/10(图1A和3A)。与免疫组动物强有力的二次反应不同，未免疫动物的初次反应较弱(图1B和3A)。四聚体+细胞的峰值少于CD8细胞总数的1％(图3A)，产生IFN-γ的ELISPOTs频率计数均值约为300，而疫苗免疫组为更高的频率1000-6000(图1B)(P＜0.05)。
与疫苗免疫组动物一样，对照组中的四聚体+细胞接受肽刺激后可产生IFN-γ(图3B)。攻击后12周，对照组的四只动物中有三只测不到IFN-γ产生的ELISPOTs。当大量病毒存在时，抗病毒T细胞的快速消失可能反映了CD4辅助细胞的缺失。
T细胞增殖反应证实病毒特异的CD4细胞能受攻击后仍能存活并支持抗病毒的免疫反应(图3C)。
在37℃、5％CO2条件下，约200,000 PBMC在200μl RPMI中接受特定抗原刺激5天可增殖3倍。转染了可表达SHIV-89.6 Gag和Pol或SHIV-89.6Gag、Pol和Env的DNA的293T细胞上清液直接用作抗原(终浓度为～0.5μg p27 Gag/ml)。假DNA(只有载体)转染的细胞的上清作为阴性对照。在第六天，用1μCi氚标记脱氧胸腺嘧啶核苷冲击16-20小时。用自动细胞收集器(TOMTEC，Harvester 96，Model 1010，Hamden，CT)收集细胞，以Wallac 1450 MICROBETA Scintillation计数仪(Gaithersburg，MD)计数。刺激指数是用89.6抗原刺激的PBMC中掺入的氚标记脱氧胸腺嘧啶核苷计数除以假抗原刺激的同种PBMC中掺入的氚标记脱氧胸腺嘧啶核苷计数而计算。
攻击后12周，疫苗免疫组Gag-Pol-Env或Gag-Pol蛋白的刺激指数均值为35至14，而对照组未测得刺激指数。与增殖实验一致，细胞内细胞因子测定证实疫苗免疫组存在病毒特异的CD4细胞而对照组没有。总的来看，疫苗免疫组增殖反应的排序为：2.5mg i.d.＞2.5mg i.m.＞250μg i.d.＞250μg i.m.。
攻击后12周，免疫组动物的淋巴结形态学完整并对感染有反应，而感染的对照组动物淋巴结功能被破坏(图4)。免疫组动物的淋巴结含有大量具有扩张的生发中心的反应性二级滤泡和明暗相间的区域(图4A)。相反，非免疫的对照组动物淋巴结表现为滤泡和副皮质区缺失(图4B)，而未免疫和未攻击的动物均显示正常数量的低反应性生发中心(图4C)。在感染的对照组，生发中心在整个淋巴结区域中所占的比率＜0.05％，未感染的对照组为2％，而在免疫组达淋巴结区域的18％(图4D)。低剂量DNA激发动物的生发中心分布更为广泛，提示低剂量DNA激发动物的免疫反应较高剂量DNA激发的动物更为强烈(图4D)。攻击后12周，病毒RNA的原位杂交结果显示，在疫苗免疫的24只猕猴中仅有3只淋巴结中发现极少的病毒表达细胞，而在每只感染的对照组动物淋巴结中很容易检测到病毒表达细胞。在CD4细胞严重缺失的对照组，感染的淋巴结细胞的细胞形态学与巨噬细胞表型一致。
在激发/加强免疫阶段可产生低水平的Gag抗体和低于检出水平的Env抗体(图5)。攻击后，针对Env和Gag的抗体经过回忆反应使总Gag抗体量接近1mg/ml，总Env抗体量可高达100μg/ml。
检测总Gag抗体的酶联免疫吸附实验(ELISAs)使用用细菌产生的SIV gag p27包被孔(2μg/ml，溶于碳酸氢盐缓冲液)。抗Env抗体的用于ELISAs检测的抗体是用用瞬时转染的293T细胞产生的89.6 Env，以绵羊抗Env抗体作为捕获抗体(批号为6205；International Enzymes，Fairbrook CA)。用含有已知量Gag或Env特异性免疫球蛋白G(IgG)的SHIV-89.6感染的猕猴血清制作Gag和Env的ELISAs标准曲线。用过氧化物酶偶联的山羊抗猕猴IgG抗体(批号#YNGMOIGGFCP；Accurate Chemical，Westbury，NY)和TMB底物(批号#T3405；Sigma，St.Louis，MO)检测结合抗体。将血清进行三倍稀释并作双份检测。待测血清用乳清缓冲液进行稀释(含4％乳清和0.1％吐温20的1×PBS)。封闭液为乳清缓冲液加5％的脱脂奶粉。以2M H2SO4中止反应，在450nm读取光密度。利用SOFTmax 2.3软件拟合标准曲线，在标准曲线上内推标本的浓度，单位为μg抗体/ml血清(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)。
攻击后2周，高剂量DNA激发组出现89.6免疫原的中和抗体(滴度的几何均值为：i.d.组352和i.m.组303)(图5C)(D.C.Montefiori等人1988 J Clin Microbiol 26：231)，而非针对SHIV-89.6P攻击的抗体。攻击后5周，产生89.6P的中和抗体(滴度的几何均值为：高剂量i.d.组200和高剂量i.m.组126)(图5D)，针对89.6的中和抗体开始降低。到攻击后16-20周，大多数动物体内针对Gag和Env的抗体已下降。
我们的实验结果证实，多蛋白DNA/MVA疫苗可加强能控制高毒力粘膜免疫缺陷病毒攻击的记忆免疫反应。与单纯应用DNA(M.A.Egan等人2000 J Virol 74：7485)或rMVA疫苗(I.Ourmanov等人2000J Virol 74：2740)相比，我们的方法能更好的控制病毒水平，其效果与DNA加白细胞介素-2佐剂的免疫效果相当(D.H.Barouch等人2000Science 290：486)。上述所有的前人研究均采用三种以上的疫苗进行接种，没一种使用粘膜攻击，大多数是在效应因子反应的峰值时进行攻击，而没有延长免疫后的时间来测定“长期”反应。
DNA的剂量对细胞免疫和体液免疫反应均有显著的影响(P＜0.05)，而DNA的免疫途径只对体液免疫有影响。DNA皮内接种比肌肉内接种(i.m.)产生Gag抗体的效果强10倍左右(P＝0.02)。DNA接种的途径和剂量对保护效应均无显著影响。攻击后20周，高剂量DNA激发组动物体内病毒RNA水平的几何均值(7×102和5×102)略低于低剂量DNA激发组(9×102和1×103)。
DNA/MVA免疫可控制感染，使病毒量迅速降至接近或低于1000个病毒RNA拷贝/ml血液。遏制(而非预防)感染，使之成为慢性感染(H.L.Robinson等人1999 Nat Med 5：526)。通过迅速降低病毒量，多蛋白DNA/MVA疫苗有望能长期控制病毒的非进行性状态，并限制HIV病毒传播(J.W.Mellors等人1996 Science 272：1167；T.C.Quinn等人2000 N Engl J Med 342：921)。
                        实施例2
        表达修饰的HIV Env，Gag和Pol基因的MVA
在此公开描述了修饰的安卡拉牛痘病毒(MVA)重组病毒的构建，即，表达HIV ADA株env和HXB2 gag pol的MVA/HIV B分化株重组病毒(MVA/HIV ADA env+HXB2 gag pol)的构建。对于扩增，我们使用了实验名称MVA/HIV 48，这一名称表示来源于该构建物的质粒。
HIV gag-pol基因来源于感染性HXB2病毒的B分化株。切去gag-pol基因的顶端从而去除编码整合酶的绝大多数序列，第185，266和478位氨基酸突变使其分别失活逆转录酶，抑制链转移活性，和抑制RNaseH活性。B分化株CCR5向性的包膜基因源自原始的ADA分离株；TTTTTNT序列发生突变但并不改变其防止未成熟转录中止的编码能力，胞浆内的尾巴被截短以便促进MVA载体在细胞表面表达、免疫原性和稳定性。HIV基因插入质粒转移载体使gag-pol基因和env基因分别受修饰的H5早期/晚期牛痘病毒启动子和新设计的早期/晚期Psyn II启动子调节而表现为相似的高水平表达。一种自我缺失的GUS报告子基因也被引入用于检测和分离重组病毒。HIV基因侧翼加入MVA序列使同源重组发生在第3缺失位点从而使重组的MVA可保持TK阳性的稳定性和在静息细胞中的高表达能力。分离重组的MVA，它可表达大量的gag-pol-env并能加工gag。离心和电子显微镜检查证实产生了HIV样颗粒。免疫电镜证实HIV样颗粒中存在env。
        序列列表
 描述 SEQ ID NO 图号
 pLW-48 1  A
 pLW-48 1  B
 Psyn II启动子 2  B
 截短的ADA包膜 3  B
 PmH5启动子 4  B
 HXB2 gag pol 5  B
质粒转移载体
用于MVA重组病毒的质粒转移载体，pLW-48，(图C)的同源重组构建方法如下：
1.商业购买的质粒，pGem-4Z(Promega)，其侧翼区在缺失位点III的两侧，命名为侧翼1和侧翼2(分别包含926和520个碱基对)，用PCR方法使其从牛痘病毒MVA株中扩增而来。在这些侧翼中加入一个启动子(mH5)，它是通过对已发表的原始序列进行修饰而来，改变了两个已证实能增加克隆基因表达的碱基。
2.B分化株gag pol(图D)被切去顶端从而去除整合酶，将其克隆入质粒使其受mH5启动子控制。这一基因包含完整的gag HXB2序列。pol基因在反转录活性位点第185位氨基酸、抑制链转移活性的第266位氨基酸和抑制RNaseH活性的第478位氨基酸发生反转录酶的安全突变。此外，EcoRI位点后的整合酶基因缺失。
3.在侧翼1之后加入一个与MVA侧翼1最后280个碱基对相应的280个碱基对的同向重复。
4.在侧翼1的两个同向重复之间加入p11启动子和GUS报告子基因，使这个筛选标记在初期用来获得重组病毒，而在最终的重组病毒中被删除(Scheiflinger，F.等人1998 Arch Virol 143：467-474；Carroll，M.W.和B.Moss 1995 BioTechniques 19：352-355)。
5.设计了一个新的启动子(Psyn II)使ADA env的表达增加。这种新的早期/晚期启动子的序列见图E。
6.用PCR方法获得具有沉默的5TNT突变的切去顶端的ADA包膜形式，将其插入由Psyn II启动子控制的质粒。包膜被切去的是gp41基因的胞浆内尾巴，去除了胞浆内尾巴115个氨基酸。这种截短方式可增加感染细胞表面包膜蛋白的数量、增强小鼠体内包膜蛋白的免疫原性，以及组织培养物中重组病毒的稳定性。
重组MVA构建
1.MVA病毒(来源于ATCC号VR-1508)用终点稀释法在鸡胚纤维母细胞(CEF)中进行三次噬斑纯化。鸡胚纤维母细胞来自B和E Eggs，Stevens，PA提供的9天的SPF Premium SPAFAS受精卵。
2.用多重性感染(MOI)为0.05的MVA感染次级CEF细胞，并用2μg pLW-48(前述的质粒)转染。37℃孵育2天后收集病毒，冻融3次，铺在CEF平板上。
3.在第4天，感染的部位在加入X-gluc底物后被染成蓝色(提示质粒和感染病毒之间发生了重组)，挑取这些斑点将其接种至CEF平板。再次挑取染成蓝色的斑点。
4.用这些含有GUS的斑点铺板，每份样本铺三只平板，分析GUS染色(现在我们想删掉该基因)和ADA包膜表达的情况。选择GUS染色和未染色斑点数大约相等以及大部分包膜染色的样本，从其第三只重复平板上挑取单个斑点。
5.将这些斑点再次铺板，每份样本三只平板，用同样方法进行分析。经过5次传代之后可获得一种能表达包膜蛋白的病毒，但其GUS基因经二次重复后已被删除。免疫染色证实这种病毒也表达gag pol蛋白。
MVA重组病毒MVA/HIV48的特性
1.用单克隆抗体以放射免疫沉淀和免疫染色方法分析MVA/HIV48感染细胞裂解物中包膜蛋白和gag pol蛋白的表达。用这两种实验方法均可测得上述每一种蛋白。
2.通过在20％蔗糖缓冲液中沉淀35S-标记颗粒，显示重组病毒可在感染细胞的上清中产生gag颗粒。
3.将薄切片在电子显微镜下观察也可以见到存在于细胞外、从细胞出芽以及存在于细胞空泡内的gag颗粒。这些gag颗粒表面具有包膜蛋白。
除非另外说明，在此所有的DNA分子的核苷酸序列均采用自动DNA测序仪进行测定，所有DNA编码的多肽的氨基酸序列则通过对DNA序列的翻译进行预测，参见如上所述。因此，正如本领域所熟知的，用自动DNA测序技术测定任何DNA序列都可能会存在一些错误，这里测定的任何核苷酸序列也可能会存在一些错误。自动测定的核苷酸序列与所测DNA分子的真实核苷酸序列的一致性通常为90％左右，更常见的是95％-99.9％。DNA的实际序列可用其它方法包括本领域所熟知的手工DNA测序法进行更精确的测定。正如本领域所熟知的，在测得的核苷酸序列中一个核苷酸的插入或缺失都会导致核苷酸序列翻译过程中的移码突变，从而导致由测得的核苷酸序列预测出的氨基酸序列完全不同于真实DNA分子序列编码的氨基酸序列，其差异始于核苷酸插入或缺失的位点。
小结
总之，我们制作了一种重组MVA病毒，MVA/HIV48，它能高表达截短的ADA包膜和HXB2 gag pol。这种MVA重组病毒采用一种瞬时表达的GUS标记，后者在最终的病毒中被删除。因采用了一种新的杂交的早期/晚期启动子Psyn II而使得ADA包膜能高水平表达。此外，包膜的顶端被切除是由于我们已证实包膜顶端被切除后能增加感染细胞的表面上的蛋白的数量，进而增强其免疫原性；重组病毒的稳定性也得以增强。MVA病毒可产生gag颗粒，这些颗粒可通过蔗糖沉淀颗粒，并用聚丙烯凝胶电泳(PAGE)分析显示。在表面上具有包膜蛋白的Gag颗粒也能用电子显微镜观察到。
实施例3
为MVA或其它痘病毒的基因表达设计的其它修饰的或合成的启动子
本发明还为MVA或其它痘病毒基因表达设计了其它修饰的或合成的启动子。启动子被修饰是为了使其能在感染后的早期和晚期表达，并且当同一MVA载体内应用多个启动子时可降低相同序列的同源重组的可能性。启动子被放置在蛋白编码序列的上游。
m7.5启动子(SEQ ID NO：10)：
CGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAATTGAAAAACTATTCTAATTTATTGCACGGT
Psyn II启动子(SEQ ID NO：2)：
TAAAAAATGAAAAAATATTCTAATTTATAGGACGGTTTTGATTTTCTTTTTTTCTATGCTATAAATAATAAATA
Psyn III启动子(SEQ ID NO：11)：
TAAAAATTGAAAAAATATTCTAATTTATAGGACGGTTTTGATTTTCTTTTTTTCTATACTATAAATAATAAATA
Psyn IV启动子(SEQ ID NO：12)：
TAAAAATTGAAAAACTATTCTAATTTATAGGACGGTTTTGATTTTCTTTTTTTCTATACTATAAATAATAAATA
Psyn V启动子(SEQ ID NO：13)：
AAAAAATGATAAAGTAGGTTCAGTTTTATTGCTGGTTTAAAATCACGCTTTCGAGTAAAAACTACGAATATAAAT
                    实施例4
表A-F
表A：MVA/48免疫—豚鼠
在第0和30天，用1×108感染单位的MVA/48经肌肉内(IM)或皮内(ID)途径对多组豚鼠进行免疫。另一组对照组豚鼠肌肉内给予同样剂量非重组MVA进行免疫。每次免疫的前后均采集血清标本用来分析其针对HIV-1-MN的中和活性。滴度是指能保护50％MT-2细胞免受病毒诱导的杀细胞作用的血清稀释度的倒数。MVA/48第二次免疫后(49天)在所有动物均观察到显著的中和活性。
表B：MVA/48免疫小鼠后HIV-1gag特异性T细胞的频率
在第0和21天，用1×107感染单位的MVA/48经以下三种途径之一对多组BalbC小鼠进行免疫：腹腔内(IP)，皮内(ID)或肌肉内(IM)。另一组对照组用非重组MVA进行免疫。最后一次免疫后5周，取脾细胞用源于HIV-1 p24的免疫优势肽体外刺激7天。然后将细胞与肽-冲击的(peptide-pulsed)P815细胞或可溶性肽混合。用ELISPOT方法计数产生IFN-γ的细胞。当孔内斑点数＞500时被认为斑点数太多不能计数。曾有报道，用其它病毒在小鼠中进行腹腔内免疫时可出现很强的T细胞反应。在本实验中，用MVA/48对小鼠进行腹腔内免疫出现了非常强的HIV-1 gag特异性T细胞反应。
表C：DNA激发和MVA/48加强—每—动物的ELISPOTS总数
10只猕猴用表达HIV-1抗原(包括Ada包膜和HXB2 gagpol)的DNA疫苗进行激发(第0和8周)。第24周，用1×108感染单位的MVA/48经肌肉内途径对动物进行加强免疫。用ELISPOT方法分析新鲜外周血单核细胞(PBMC)产生的IFN-γ，方法如下：PBMC在相当于疫苗中单个HIV-1抗原的重叠肽库中孵育30-36小时。表中列出了每个动物中产生IFN-γ的细胞总数。T细胞对DNA疫苗接种的反应有限(2-20周)。然而，MVA/48加强免疫可使所有动物出现非常强的HIV-1特异性T细胞反应(25周)。
表D：MVA/SHIV KB9免疫猕猴后的抗体反应
在第0和4周，用2×108感染单位的MVA/SHIV-KB9经以下几种途径之一对多组猕猴进行免疫：经扁桃腺，皮内(ID)或肌肉内(IM)。另一组经同样途径给予用非重组MVA进行免疫。第二次免疫后2周，收集血清标本用ELISA方法分析KB9包膜蛋白的结合并分析SHIV-89.6P和SHIV-89.6的中和作用。ELISA检测是在96孔板中用抗gp120 C-末端的抗体捕获可溶性的KB9包膜蛋白。分析系列稀释的血清并测定其终点滴度。用MT-2细胞测定方法检测SHIV-89.6P和SHIV-89.6的中和作用。滴度是指能保护50％MT-2细胞免受病毒诱导的杀细胞作用的血清稀释度的倒数。在体外中和实验中，SHIV-89.6P和SHIV-89.6属异源性的，即取自其一种病毒感染的动物的血清不能中和另一种病毒。因此，用MVA/SHIV-KB9进行的两次免疫可在所有动物体内激发较好的ELISA结合抗体，并在某些动物体内产生针对同种病毒(SHIV-89.6P)的中和抗体。此外，在动物的一个亚群中发现了异种中和抗体。
表E：MVA/SHIV KB9免疫猕猴后gag CM-9特异性CD3/CD8T细胞频率
在第0和4周，用2×108感染单位的MVA/SHIV-KB9经以下几种途径之一对多组MamuA*01阳性猕猴进行免疫：经扁桃腺，皮内(ID)或肌肉内(IM)。另一组用非重组MVA进行免疫。在每次免疫后的不同时间点，用流式细胞技术检测与四聚体复合物(含有SIV gag特异性肽CM9)结合的CD3+/CD8+T细胞的频率。时间间隔如下：1a，1b和1d分别是第一次免疫后1，2和4周；2a，2b，2c和2d分别是第二次免疫后1，2，3和12周。超过背景的值用黑体字表示。用MVA/SHIV-KB9进行一次免疫后在所有免疫动物体内均可观察到强的SIV gag特异性反应。第二次免疫后大多数动物的免疫得到加强。此外，在第二次免疫后12周仍可检测到四聚体的结合。
表F：MVA/SHIV KB9免疫猕猴后特异性T细胞频率
如上述方法用MVA/SHIV KB9免疫猕猴组。MVA/SHIV KB9表达嵌合病毒SHIV-89.6P的5个基因：包膜，gag，多聚酶，tat和nef。因此，用针对不同蛋白的肽库分析5种抗原中每一种抗原特异性的T细胞的频率。用肽库在体外刺激新鲜PBMC 30-36小时。用ELISPOT方法计数产生IFN-γ的细胞。在“总数#斑点数”一栏中给出每种抗原特异性细胞的总数。此外，还列出了有反应的动物的数量和每组中斑点的平均值#。在第一次免疫后1周(1a)和第二次免疫后1周(2a)分析PBMC。另一组7只动物用非重组MVA进行免疫。在这些动物中未测到超出背景水平的斑点。因此，用MVA/SHIV-KB9进行一次免疫后可在所有动物体内激发强的SHIV特异性T细胞反应。Gag和包膜反应最强；大多数动物对gag有反应，所有动物均对包膜有反应。MVA/SHIV-KB9第二次免疫后还可观察到Elispot反应，尽管水平较低。在两次免疫过程中反应的排序为：经扁桃腺＞ID＞IM。我们的结果显示对nef有较好的免疫反应，对tat有某些免疫反应。
表A
MV A/48免疫-豚鼠
HIV-MN中和抗体-滴度的倒数
动物# 分组 途径 0天 4天MVA#1  30天 33天MVA#2  49天
 885891882883886890879881888889 MVA″MVA/48″″″MVA/48″″″ I.M.″I.M.″″″I.D.″″″ ＜20＜20＜20＜20＜20＜20＜20＜20＜20＜20 I.M.″I.M.″″″I.D.″″″  3185＜2068＜20180＜20＜202422 I.M.″I.M.″″″I.D.″″″  24＜205524691424989817234112376
表B
MVA/48免疫小鼠后HIV-gag特异性T细胞的频率
     分组MVA对照组MVA/48(IP)MVA/48(ID)MVA/48(IM)    P815细胞+gag肽0      2＞500    ＞50012     522     18      gag肽0        4＞500    ＞50049       3366       49     无刺激1    28    84    212   8
表C
DNA激发和MVA/48增强
每一动物的ELISPOTS总数
动物#                          周数-2             2              6              102           142            202             252
 RLw  4  731* ＜ 47 43 50  3905
 RVl  5  997* ＜ ＜ ＜ 8  205
 Roa ＜1 ＜ 1 ＜ ＜ ＜  245
 RHc ＜ ＜ ＜ ＜ ＜ ＜  535
 Ryl ＜ ＜ ＜ ＜ ＜ ＜  4130
 RQk ＜ 46 ＜ ＜ ＜ ＜  630
 RDr ＜ ＜ ＜ 14 ＜ ＜  1965
 RZc ＜ 5 ＜ 58 ＜ ＜  925
 RSf ＜ 118 ＜ ＜ ＜ 20  5570
 Ras ＜ 69 ＜ ＜ ＜ ＜  1435
 总数 9 1966  1  119  43  78  19545
 几何均数 4.5 105.3  1.0  33.7  43.0  20.0  1147.7
在第0和8周进行DNA激发，第24周进行MVA/48增强。
1＜＝背景(2×未刺激的对照组的ELISPOTs数+10)
2ELISPOT孵育时加入共刺激抗体
*这一采血日期动物的ELISPOTs数高于平常
表D
MVA/SHIV KB9免疫猕猴后的抗体反应
动物# 途径 KB9 nevELISA滴度 KB9 nev平均值  elisa标准误差 SHIV-89.6中和抗体滴度 SHIV-89.6P中和抗体滴度 SHIV-89.6#免疫后动物 SHIV-89.6P#免疫后动物
598601606642646653654 扁桃腺″″″″″″ 256005120025600512005120064006400 31086 20383 ＜20＜20＜207561＜2022 ＜20＜20＜203148＜20＜20 3 2
602604608637638645647650 i.d.″″″″″″″ 25600128003200128005120025600128006400 18800 15341 38＜2020＜20＜20＜2032＜20 ＜202626635＜20＜20162＜20 2 4
599600609639640641 i.m.″″″″″ 640064006400512001280025600 17000 16516 ＜20＜20＜20＜20＜20＜20 ＜2029＜2085＜2041 0 2
  649651 ″″   160025600 ＜2020 ＜20＜20
  603605607643644648652 对照组″″″″″″ ＜100＜100＜100＜100＜100＜100＜100 ＜100 ＜20＜20＜20＜20＜20＜20＜20 ＜20＜20＜20＜20＜20＜20＜20 0 0
表E
MVA/SHIV KB9免疫猕猴后gag CM-9特异性CD3/CD8T细胞频率
动物# 途径 病毒 放血前 1a 1b   1d   2a   2b   2c   2d
598601646653 扁桃腺″″″ MVA/KB9″″″ 0.0180.0710.0220.041 0.410.340.680.69 0.790.380.760.85   0.250.270.430.53   2.640.831.120.68   1.130.70.910.49   0.510.360.530.47   0.210.0390.150.3
648 ″ MVA 0.033 0.039   0.022   0.058   0.033   0.013
602604650647652 i.d.″″″″ MVA/KB9″″″MVA 0.0190.0130.0950.032 0.170.110.170.220.041 0.920.380.60.380.038   0.50.320.230.140.059   0.950.442.870.840.025   0.590.381.120.910.022   0.50.190.90.340.026   0.20.250.160.170.055
599600649651603 i.m.″″″″ MVA/KB9″″″MVA 0.0340.004860.049 0.0810.150.350.120.024 0.310.411.340.690.087 0.0820.170.560.250.073 0.292.421.01 0.120.270.770.320.082 0.0540.160.690.240.027 0.110.0490.220.220.17
表F
MVA/SHIV KB9免疫猕猴后特异性T细胞频率
Gag特异性 Tat特异性 Nef特异性 Env特异性 总数
研究分组 #有反应的动物 总数#斑点数 均数#斑点数 #有反应的动物 总数#斑点数 均数#斑点数 #有反应的动物 总数#斑点数 均数#斑点数 #有反应的动物 总数#斑点数 均数#斑点数 #有反应的动物
扁桃腺1a  4/6  1325  221  0/6  0  0  3/6  195  33  6/6  8760  1460  6/6
扁桃腺2a  5/6  1405  234  0/6  0  0  1/6  560  93  6/6  4485  748  6/6
i.d.  7/7  1335  191  0/7  0  0  2/7  215  31  7/7  7320  1046  7/7
1a
i.d.  4/7  755  108  0/7  0  0  1/7  55  8  7/7  2700  386  7/7
2a
 i.m. 7/7  925  132  1/7  60  9  3/7  180  26  7/7  5490  784  7/7
 1a
 i.m. 4/7  250  36  0/7  0  0  0/7  0  0  6/7  2205  315  6/7
 2a
        *****
本发明的细节描述是为了明确和理解本发明，本领域技术熟练的技术人员在不偏离本发明的真实范围的情况下可以在形式和细节上作各种改变。与上述内容相关的所有专利、专利申请和出版物在此均列入参考文献。
                           序列表
<110>美国国有健康与人类服务部
<120>表达修饰的HIV包膜、GAG和POL基因的MVA
<130>NIH211.001PCT
<150>US 60/274,434
<151>2001-03-08
<160>13
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>12225
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pLW-48
<400>1
gaattcgttg gtggtcgcca tggatggtgt tattgtatac tgtctaaacg cgttagtaaa 60
acatggcgag gaaataaatc atataaaaaa tgatttcatg attaaaccat gttgtgaaaa 120
agtcaagaac gttcacattg gcggacaatc taaaaacaat acagtgattg cagatttgcc 180
atatatggat aatgcggtat ccgatgtatg caattcactg tataaaaaga atgtatcaag 240
aatatccaga tttgctaatt tgataaagat agatgacgat gacaagactc ctactggtgt 300
atataattat tttaaaccta aagatgccat tcctgttatt atatccatag gaaaggatag 360
agatgtttgt gaactattaa tctcatctga taaagcgtgt gcgtgtatag agttaaattc 420
atataaagta gccattcttc ccatggatgt ttcctttttt accaaaggaa atgcatcatt 480
gattattctc ctgtttgatt tctctatcga tgcggcacct ctcttaagaa gtgtaaccga 540
taataatgtt attatatcta gacaccagcg tctacatgac gagcttccga gttccaattg 600
gttcaagttt tacataagta taaagtccga ctattgttct atattatata tggttgttga 660
tggatctgtg atgcatgcaa tagctgataa tagaacttac gcaaatatta gcaaaaatat 720
attagacaat actacaatta acgatgagtg tagatgctgt tattttgaac cacagattag 780
gattcttgat agagatgaga tgctcaatgg atcatcgtgt gatatgaaca gacattgtat 840
tatgatgaat ttacctgatg taggcgaatt tggatctagt atgttgggga aatatgaacc 900
tgacatgatt aagattgctc tttcggtggc tgggtaccag gcgcgccttt cattttgttt 960
ttttctatgc tataaatggt acgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc 1020
gacggcctgt gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg 1080
gaaagcgcgt tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc 1140
gccgatgcag atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata 1200
ccgaaaggtt gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc 1260
aaagtgtggg tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa 1320
gccgatgtca cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtatcaccgt ttgtgtgaac 1380
aacgaactga actggcagac tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga aaacggcaag 1440
aaaaagcagt cttacttcca tgatttcttt aactatgccg gaatccatcg cagcgtaatg 1500
ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa 1560
gactgtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa 1620
ctgcgtgatg cggatcaaca ggtggttgca actggacaag gcactagcgg gactttgcaa 1680
gtggtgaatc cgcacctctg gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact gtgcgtcaca 1740
gccaaaagcc agacagagtg tgatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg gtcagtggca 1800
gtgaagggcg aacagttcct gattaaccac aaaccgttct actttactgg ctttggtcgt 1860
catgaagatg cggacttgcg tggcaaagga ttcgataacg tgctgatggt gcacgaccac 1920
gcattaatgg actggattgg ggccaactcc taccgtacct cgcattaccc ttacgctgaa 1980
gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggtga ttgatgaaac tgctgctgtc 2040
ggctttaacc tctctttagg cattggtttc gaagcgggca acaagccgaa agaactgtac 2100
agcgaagagg cagtcaacgg ggaaactcag caagcgcact tacaggcgat taaagagctg 2160
atagcgcgtg acaaaaacca cccaagcgtg gtgatgtgga gtattgccaa cgaaccggat 2220
acccgtccgc aaggtgcacg ggaatatttc gcgccactgg cggaagcaac gcgtaaactc 2280
gacccgacgc gtccgatcac ctgcgtcaat gtaatgttct gcgacgctca caccgatacc 2340
atcagcgatc tctttgatgt gctgtgcctg aaccgttatt acggatggta tgtccaaagc 2400
ggcgatttgg aaacggcaga gaaggtactg gaaaaagaac ttctggcctg gcaggagaaa 2460
ctgcatcagc cgattatcat caccgaatac ggcgtggata cgttagccgg gctgcactca 2520
atgtacaccg acatgtggag tgaagagtat cagtgtgcat ggctggatat gtatcaccgc 2580
gtctttgatc gcgtcagcgc cgtcgtcggt gaacaggtat ggaatttcgc cgattttgcg 2640
acctcgcaag gcatattgcg cgttggcggt aacaagaaag ggatcttcac tcgcgaccgc 2700
aaaccgaagt cggcggcttt tctgctgcaa aaacgctgga ctggcatgaa cttcggtgaa 2760
aaaccgcagc agggaggcaa acaatgagag ctcggttgtt gatggatctg tgatgcatgc 2820
aatagctgat aatagaactt acgcaaatat tagcaaaaat atattagaca atactacaat 2880
taacgatgag tgtagatgct gttattttga accacagatt aggattcttg atagagatga 2940
gatgctcaat ggatcatcgt gtgatatgaa cagacattgt attatgatga atttacctga 3000
tgtaggcgaa tttggatcta gtatgttggg gaaatatgaa cctgacatga ttaagattgc 3060
tctttcggtg gctggcggcc cgctcgagta aaaaatgaaa aaatattcta atttatagga 3120
cggttttgat tttctttttt tctatgctat aaataataaa tagcggccgc accatgaaag 3180
tgaaggggat caggaagaat tatcagcact tgtggaaatg gggcatcatg ctccttggga 3240
tgttgatgat ctgtagtgct gtagaaaatt tgtgggtcac agtttattat ggggtacctg 3300
tgtggaaaga agcaaccacc actctatttt gtgcatcaga tgctaaagca tatgatacag 3360
aggtacataa tgtttgggcc acacatgcct gtgtacccac agaccccaac ccacaagaag 3420
tagtattgga aaatgtgaca gaaaatttta acatgtggaa aaataacatg gtagaacaga 3480
tgcatgagga tataatcagt ttatgggatc aaagcctaaa gccatgtgta aaattaaccc 3540
cactctgtgt tactttaaat tgcactgatt tgaggaatgt tactaatatc aataatagta 3600
gtgagggaat gagaggagaa ataaaaaact gctctttcaa tatcaccaca agcataagag 3660
ataaggtgaa gaaagactat gcacttttct atagacttga tgtagtacca atagataatg 3720
ataatactag ctataggttg ataaattgta atacctcaac cattacacag gcctgtccaa 3780
aggtatcctt tgagccaatt cccatacatt attgtacccc ggctggtttt gcgattctaa 3840
agtgtaaaga caagaagttc aatggaacag ggccatgtaa aaatgtcagc acagtacaat 3900
gtacacatgg aattaggcca gtagtgtcaa ctcaactgct gttaaatggc agtctagcag 3960
aagaagaggt agtaattaga tctagtaatt tcacagacaa tgcaaaaaac ataatagtac 4020
agttgaaaga atctgtagaa attaattgta caagacccaa caacaataca aggaaaagta 4080
tacatatagg accaggaaga gcattttata caacaggaga aataatagga gatataagac 4140
aagcacattg caacattagt agaacaaaat ggaataacac tttaaatcaa atagctacaa 4200
aattaaaaga acaatttggg aataataaaa caatagtctt taatcaatcc tcaggagggg 4260
acccagaaat tgtaatgcac agttttaatt gtggagggga attcttctac tgtaattcaa 4320
cacaactgtt taatagtact tggaatttta atggtacttg gaatttaaca caatcgaatg 4380
gtactgaagg aaatgacact atcacactcc catgtagaat aaaacaaatt ataaatatgt 4440
ggcaggaagt aggaaaagca atgtatgccc ctcccatcag aggacaaatt agatgctcat 4500
caaatattac agggctaata ttaacaagag atggtggaac taacagtagt gggtccgaga 4560
tcttcagacc tgggggagga gatatgaggg acaattggag aagtgaatta tataaatata 4620
aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag cacccaccaa ggcaaaaaga agagtggtgc 4680
agagagaaaa aagagcagtg ggaacgatag gagctatgtt ccttgggttc ttgggagcag 4740
caggaagcac tatgggcgca gcgtcaataa cgctgacggt acaggccaga ctattattgt 4800
ctggtatagt gcaacagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt 4860
tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag agtcctggct gtggaaagat 4920
acctaaggga tcaacagctc ctagggattt ggggttgctc tggaaaactc atctgcacca 4980
ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaaactct ggatatgatt tgggataaca 5040
tgacctggat ggagtgggaa agagaaatcg aaaattacac aggcttaata tacaccttaa 5100
ttgaggaatc gcagaaccaa caagaaaaga atgaacaaga cttattagca ttagataagt 5160
gggcaagttt gtggaattgg tttgacatat caaattggct gtggtatgta aaaatcttca 5220
taatgatagt aggaggcttg ataggtttaa gaatagtttt tactgtactt tctatagtaa 5280
atagagttag gcagggatac tcaccattgt catttcagac ccacctccca gccccgaggg 5340
gacccgacag gcccgaagga atcgaagaag aaggtggaga cagagactaa tttttatgcg 5400
gccgctggta cccaacctaa aaattgaaaa taaatacaaa ggttcttgag ggttgtgtta 5460
aattgaaagc gagaaataat cataaataag cccggggatc ctctagagtc gacaccatgg 5520
gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag aattagatcg atgggaaaaa attcggttaa 5580
ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa aacatatagt atgggcaagc agggagctag 5640
aacgattcgc agttaatcct ggcctgttag aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg 5700
gacagctaca accatccctt cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacag 5760
tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga tagagataaa agacaccaag gaagctttag 5820
acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta agaaaaaagc acagcaagca gcagctgaca 5880
caggacacag caatcaggtc agccaaaatt accctatagt gcagaacatc caggggcaaa 5940
tggtacatca ggccatatca cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtagaagaga 6000
aggctttcag cccagaagtg atacccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac 6060
aagatttaaa caccatgcta aacacagtgg ggggacatca agcagccatg caaatgttaa 6120
aagagaccat caatgaggaa gctgcagaat gggatagagt gcatccagtg catgcagggc 6180
ctattgcacc aggccagatg agagaaccaa ggggaagtga catagcagga actactagta 6240
cccttcagga acaaatagga tggatgacaa ataatccacc tatcccagta ggagaaattt 6300
ataaaagatg gataatcctg ggattaaata aaatagtaag aatgtatagc cctaccagca 6360
ttctggacat aagacaagga ccaaaagaac cctttagaga ctatgtagac cggttctata 6420
aaactctaag agccgagcaa gcttcacagg aggtaaaaaa ttggatgaca gaaaccttgt 6480
tggtccaaaa tgcgaaccca gattgtaaga ctattttaaa agcattggga ccagcggcta 6540
cactagaaga aatgatgaca gcatgtcagg gagtaggagg acccggccat aaggcaagag 6600
ttttggctga agcaatgagc caagtaacaa attcagctac cataatgatg cagagaggca 6660
attttaggaa ccaaagaaag attgttaagt gtttcaattg tggcaaagaa gggcacacag 6720
ccagaaattg cagggcccct aggaaaaagg gctgttggaa atgtggaaag gaaggacacc 6780
aaatgaaaga ttgtactgag agacaggcta attttttagg gaagatctgg ccttcctaca 6840
agggaaggcc agggaatttt cttcagagca gaccagagcc aacagcccca ccagaagaga 6900
gcttcaggtc tggggtagag acaacaactc cccctcagaa gcaggagccg atagacaagg 6960
aactgtatcc tttaacttcc ctcagatcac tctttggcaa cgacccctcg tcacaataaa 7020
gatagggggg caactaaagg aagctctatt agatacagga gcagatgata cagtattaga 7080
agaaatgagt ttgccaggaa gatggaaacc aaaaatgata gg9ggaattg gaggttttat 7140
caaagtaaga cagtatgatc agatactcat agaaatctgt ggacataaag ctataggtac 7200
agtattagta ggacctacac ctgtcaacat aattggaaga aatctgttga ctcagattgg 7260
ttgcacttta aattttccca ttagccctat tgagactgta ccagtaaaat taaagccagg 7320
aatggatggc ccaaaagtta aacaatggcc attgacagaa gaaaaaataa aagcattagt 7380
agaaatttgt acagaaatgg aaaaggaagg gaaaatttca aaaattgggc ctgagaatcc 7440
atacaatact ccagtatttg ccataaagaa aaaagacagt actaaatgga ggaaattagt 7500
agatttcaga gaacttaata agagaactca agacttctgg gaagttcaat taggaatacc 7560
acatcccgca gggttaaaaa agaaaaaatc agtaacagta ctggatgtgg gtgatgcata 7620
tttttcagtt cccttagatg aagacttcag gaagtatact gcatttacca tacctagtat 7680
aaacaatgag acaccaggga ttagatatca gtacaatgtg cttccacagg gatggaaagg 7740
atcaccagca atattccaaa gtagcatgac aaaaatctta gagcctttta aaaaacaaaa 7800
tccagacata gttatctatc aatacatgaa cgatttgtat gtaggatctg acttagaaat 7860
agggcagcat agaacaaaaa tagaggagct gagacaacat ctgttgaggt ggggacttac 7920
cacaccagac aaaaaacatc agaaagaacc tccattcctt tggatgggtt atgaactcca 7980
tcctgataaa tggacagtac agcctatagt gctgccagaa aaagacagct ggactgtcaa 8040
tgacatacag aagttagtgg ggaaattgaa taccgcaagt cagatttacc cagggattaa 8100
agtaaggcaa ttatgtaaac tccttagagg aaccaaagca ctaacagaag taataccact 8160
aacagaagaa gcagagctag aactggcaga aaacagagag attctaaaag aaccagtaca 8220
tggagtgtat tatgacccat caaaagactt aatagcagaa atacagaagc aggggcaagg 8280
ccaatggaca tatcaaattt atcaagagcc atttaaaaat ctgaaaacag gaaaatatgc 8340
aagaatgagg ggtgcccaca ctaatgatgt aaaacaatta acagaggcag tgcaaaaaat 8400
aaccacagaa agcatagtaa tatggggaaa gactcctaaa tttaaactac ccatacaaaa 8460
ggaaacatgg gaaacatggt ggacagagta ttggcaagcc acctggattc ctgagtggga 8520
gtttgttaat acccctcctt tagtgaaatt atggtaccag ttagagaaag aacccatagt 8580
aggagcagaa accttctatg tagatggggc agctaacagg gagactaaat taggaaaagc 8640
aggatatgtt actaacaaag gaagacaaaa ggttgtcccc ctaactaaca caacaaatca 8700
gaaaactcag ttacaagcaa tttatctagc tttgcaggat tcaggattag aagtaaacat 8760
agtaacagac tcacaatatg cattaggaat cattcaagca caaccagata aaagtgaatc 8820
agagttagtc aatcaaataa tagagcagtt aataaaaaag gaaaaggtct atctggcatg 8880
ggtaccagca cacaaaggaa ttggaggaaa tgaacaagta gataaattag tcagtgctgg 8940
aatcaggaaa atactatttt tagatggaat agataaggcc caagatgaac attagttttt 9000
atgtcgacct gcagggaaag ttttataggt agttgataga acaaaataca taattttgta 9060
aaaataaatc actttttata ctaatatgac acgattacca atacttttgt tactaatatc 9120
attagtatac gctacacctt ttcctcagac atctaaaaaa ataggtgatg atgcaacttt 9180
atcatgtaat cgaaataata caaatgacta cgttgttatg agtgcttggt ataaggagcc 9240
caattccatt attcttttag ctgctaaaag cgacgtcttg tattttgata attataccaa 9300
ggataaaata tcttacgact ctccatacga tgatctagtt acaactatca caattaaatc 9360
attgactgct agagatgccg gtacttatgt atgtgcattc tttatgacat cgcctacaaa 9420
tgacactgat aaagtagatt atgaagaata ctccacagag ttgattgtaa atacagatag 9480
tgaatcgact atagacataa tactatctgg atctacacat tcaccagaaa ctagttaagc 9540
ttgtctccct atagtgagtc gtattagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 9600
gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 9660
aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 9720
gctttcgagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 9780
agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 9840
gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 9900
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 9960
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc gataggctcc gcccccctga cgagcatcac 10020
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 10080
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 10140
ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 10200
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 10260
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 10320
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 10380
gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 10440
atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 10500
aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 10560
aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 10620
gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 10680
cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 10740
gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 10800
tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 10860
ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 10920
ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 10980
atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 11040
cgcaacgttg ttggcattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 11100
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 11160
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 11220
tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 11280
ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 11340
agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 11400
gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 11460
agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 11520
accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 11580
gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 11640
cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 11700
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 11760
atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt 11820
gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa 11880
gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg 11940
ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt 12000
gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg 12060
ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg 12120
aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga 12180
cgttgtaaaa cgacggccag tgaattggat ttaggtgaca ctata           12225
<210>2
<211>74
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Psyn II启动子
<400>2
taaaaaatga aaaaatattc taatttatag gacggttttg attttctttt tttctatgct 60
ataaataata aata                                    74
<210>3
<211>2214
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HIV env基因
<400>3
atgaaagtga aggggatcag gaagaattat cagcacttgt ggaaatgggg catcatgctc 60
cttgggatgt tgatgatctg tagtgctgta gaaaatttgt gggtcacagt ttattatggg 120
gtacctgtgt ggaaagaagc aaccaccact ctattttgtg catcagatgc taaagcatat 180
gatacagagg tacataatgt ttgggccaca catgcctgtg tacccacaga ccccaaccca 240
caagaagtag tattggaaaa tgtgacagaa aattttaaca tgtggaaaaa taacatggta 300
gaacagatgc atgaggatat aatcagttta tgggatcaaa gcctaaagcc atgtgtaaaa 360
ttaaccccac tctgtgttac tttaaattgc actgatttga ggaatgttac taatatcaat 420
aatagtagtg agggaatgag aggagaaata aaaaactgct ctttcaatat caccacaagc 480
ataagagata aggtgaagaa agactatgca cttttctata gacttgatgt agtaccaata 540
gataatgata atactagcta taggttgata aattgtaata cctcaaccat tacacaggcc 600
tgtccaaagg tatcctttga gccaattccc atacattatt gtaccccggc tggttttgcg 660
attctaaagt gtaaagacaa gaagttcaat ggaacagggc catgtaaaaa tgtcagcaca 720
gtacaatgta cacatggaat taggccagta gtgtcaactc aactgctgtt aaatggcagt 780
ctagcagaag aagaggtagt aattagatct agtaatttca cagacaatgc aaaaaacata 840
atagtacagt tgaaagaatc tgtagaaatt aattgtacaa gacccaacaa caatacaagg 900
aaaagtatac atataggacc aggaagagca ttttatacaa caggagaaat aataggagat 960
ataagacaag cacattgcaa cattagtaga acaaaatgga ataacacttt aaatcaaata 1020
gctacaaaat taaaagaaca atttgggaat aataaaacaa tagtctttaa tcaatcctca 1080
ggaggggacc cagaaattgt aatgcacagt tttaattgtg gaggggaatt cttctactgt 1140
aattcaacac aactgtttaa tagtacttgg aattttaatg gtacttggaa tttaacacaa 1200
tcgaatggta ctgaaggaaa tgacactatc acactcccat gtagaataaa acaaattata 1260
aatatgtggc aggaagtagg aaaagcaatg tatgcccctc ccatcagagg acaaattaga 1320
tgctcatcaa atattacagg gctaatatta acaagagatg gtggaactaa cagtagtggg 1380
tccgagatct tcagacctgg gggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat 1440
aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaaaagaaga 1500
gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga acgataggag ctatgttcct tgggttcttg 1560
ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaataacgc tgacggtaca ggccagacta 1620
ttattgtctg gtatagtgca acagcagaac aatttgctga gggctattga ggcgcaacag 1680
catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc aggcaagagt cctggctgtg 1740
gaaagatacc taagggatca acagctccta gggatttggg gttgctctgg aaaactcatc 1800
tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata aaactctgga tatgatttgg 1860
gataacatga cctggatgga gtgggaaaga gaaatcgaaa attacacagg cttaatatac 1920
accttaattg aggaatcgca gaaccaacaa gaaaagaatg aacaagactt attagcatta 1980
gataagtggg caagtttgtg gaattggttt gacatatcaa attggctgtg gtatgtaaaa 2040
atcttcataa tgatagtagg aggcttgata ggtttaagaa tagtttttac tgtactttct 2100
atagtaaata gagttaggca gggatactca ccattgtcat ttcagaccca cctcccagcc 2160
ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaatc gaagaagaag gtggagacag agac       2214
<210>4
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PmH5启动子
<400>4
aaaaattgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt taaattgaaa gcgagaaata 60
atcataaata                                    70
<210>5
<211>3479
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HIV基因
<400>5
atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60
ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120
ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180
ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240
acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300
ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360
gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420
caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480
gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540
ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600
ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660
gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720
agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acaaataatc cacctatccc agtaggagaa 780
atttataaaa gatggataat cct9ggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840
agcattctgg acataagaca aggaccaaaa gaacccttta gagactatgt agaccggttc 900
tataaaactc taagagccga gcaagcttca caggaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960
ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagcg 1020
gctacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtag gaggacccgg ccataaggca 1080
agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaattcag ctaccataat gatgcagaga 1140
ggcaatttta ggaaccaaag aaagattgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200
acagccagaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260
caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320
tacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380
gagagcttca ggtctggggt agagacaaca actccccctc agaagcagga gccgatagac 1440
aaggaactgt atcctttaac ttccctcaga tcactctttg gcaacgaccc ctcgtcacaa 1500
taaagatagg ggggcaacta aaggaagctc tattagatac aggagcagat gatacagtat 1560
tagaagaaat gagtttgcca ggaagatgga aaccaaaaat gataggggga attggaggtt 1620
ttatcaaagt aagacagtat gatcagatac tcatagaaat ctgtggacat aaagctatag 1680
gtacagtatt agtaggacct acacctgtca acataattgg aagaaatctg ttgactcaga 1740
ttggttgcac tttaaatttt cccattagcc ctattgagac tgtaccagta aaattaaagc 1800
caggaatgga tggcccaaaa gttaaacaat ggccattgac agaagaaaaa ataaaagcat 1860
tagtagaaat ttgtacagaa atggaaaagg aagggaaaat ttcaaaaatt gggcctgaga 1920
atccatacaa tactccagta tttgccataa agaaaaaaga cagtactaaa tggaggaaat 1980
tagtagattt cagagaactt aataagagaa ctcaagactt ctgggaagtt caattaggaa 2040
taccacatcc cgcagggtta aaaaagaaaa aatcagtaac agtactggat gtgggtgatg 2100
catatttttc agttccctta gatgaagact tcaggaagtatactcgcattt accataccta 2160
gtataaacaa tgagacacca gggattagat atcagtacaa tgtgcttcca cagggatgga 2220
aaggatcacc agcaatattc caaagtagca tgacaaaaat cttagagcct tttaaaaaac 2280
aaaatccaga catagttatc tatcaataca tgaacgattt gtatgtagga tctgacttag 2340
aaatagggca gcatagaaca aaaatagagg agctgagaca acatctgttg aggtggggac 2400
ttaccacacc agacaaaaaa catcagaaag aacctccatt cctttggatg ggttatgaac 2460
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tcaatgacat acagaagtta gtggggaaat tgaataccgc aagtcagatt tacccaggga 2580
ttaaagtaag gcaattatgt aaactcctta gaggaaccaa agcactaaca gaagtaatac 2640
cactaacaga agaagcagag ctagaactgg cagaaaacag agagattcta aaagaaccag 2700
tacatggagt gtattatgac ccatcaaaag acttaatagc agaaatacag aagcaggggc 2760
aaggccaatg gacatatcaa atttatcaag agccatttaa aaatctgaaa acaggaaaat 2820
atgcaagaat gaggggtgcc cacactaatg atgtaaaaca attaacagag gcagtgcaaa 2880
aaataaccac agaaagcata gtaatatggg gaaagactcc taaatttaaa ctacccatac 2940
aaaaggaaac atgggaaaca tggtggacag agtattggca agccacctgg attcctgagt 3000
gggagtttgt taatacccct cctttagtga aattatggta ccagttagag aaagaaccca 3060
tagtaggagc agaaaccttc tatgtagatg gggcagctaa cagggagact aaattaggaa 3120
aagcaggata tgttactaac aaaggaagac aaaaggttgt ccccctaact aacacaacaa 3180
atcagaaaac tcagttacaa gcaatttatc tagctttgca ggattcagga ttagaagtaa 3240
acatagtaac agactcacaa tatgcattag gaatcattca agcacaacca gataaaagtg 3300
aatcagagtt agtcaatcaa ataatagagc agttaataaa aaaggaaaag gtctatctgg 3360
catgggtacc agcacacaaa ggaattggag gaaatgaaca agtagataaa ttagtcagtg 3420
ctggaatcag gaaaatacta tttttagatg gaatagataa ggcccaagat gaacattag 3479
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>猿猴免疫缺陷病毒
<400>6
Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met
1           5
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>鸡
<400>7
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1             5
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>8
ctgtctgcgt catttggtgc                                20
<210>9
<211>4
<212>PRT
<213>人类免疫缺陷病毒
<220>
<221>变异体
<222>(1)...(4)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>9
Tyr Xaa Xaa Leu
1
<210>10
<211>93
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>m7.5启动子
<400>10
cgctttttat agtaagtttt tcacccataa ataataaata caataattaa tttctcgtaa 60
aaattgaaaa actattctaa tttattgcac ggt                    93
<210>11
<211>74
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Psyn III启动子
<400>11
taaaaattga aaaaatattc taatttatag gacggttttg attttctttt tttctatact 60
ataaataata aata                               74
<210>12
<211>74
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Psyn IV启动子
<400>12
taaaaattga aaaactattc taatttatag gacggttttg attttctttt tttctatact 60
ataaataata aata                                   74
<210>13
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Psyn V启动子
<400>13
aaaaaatgat aaagtaggtt cagttttatt gctggtttaa aatcacgctt tcgagtaaaa 60
actacaaata taaat                                  75

Claims (26)

1.一种药物组合物，包括重组MVA病毒和药学上可接受的载体，所述的重组MVA病毒能表达HIV env，gag和pol基因或其修饰基因，通过所述的重组MVA病毒的表达产生HIV Env，Gag，和Pol抗原，其中所述的HIV env基因被修饰用来编码HIV Env蛋白，该蛋白包括gp120和gp41的跨膜区和胞外区，但缺少gp41的部分或全部的胞浆区。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV pol基因或其修饰基因被修饰是用来失活反转录酶和整合酶。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因选自A分化株。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因选自B分化株。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因选自C分化株。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因选自D分化株。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因选自E分化株。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因选自F分化株。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因选自G分化株。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因选自H分化株。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因选自J分化株。
12.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因插入MVA基因组中的缺失位点III。
13.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的HIV env，gag或pol基因或其修饰基因的转录起始受类H5早期/晚期牛痘病毒启动子调节。
14.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的重组MVA病毒额外表达一种附加HIV基因或其修饰基因是用来使所述的重组MVA病毒表达一种HIV抗原，其中所述的附加HIV基因选自vif，vpr，tat，rev，vpu和nef中的一种。
15.MVA/HIV48包括SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
16.pLW-48包括SEQ ID NO：1。
17.一种具有pLW-48(SEQ ID NO：1)的序列但不包括HIV env，gag和pol基因的质粒转移载体。
18.pLW-48(SEQ ID NO：1)，其中HIV env，gag和pol基因具有来自另一分化株的序列。
19.一种痘病毒，包括一个启动子，该启动子选自含有SEQ IDNO：10的m7.5启动子，含有SEQ ID NO：2的Psyn II启动子，含有SEQID NO：11的Psyn III启动子，含有SEQ ID NO：12的Psyn IV启动子和含有SEQ ID NO：13的Psyn V启动子。
20.一种能加强灵长类动物体内针对HIV Env，Gag或Pol抗原的CD8+T细胞免疫反应的方法，该方法包括给灵长类动物提供权利要求1-15中任一项的所述的组合物，由此灵长类动物体内以前激发的针对该抗原的CD8+T细胞免疫反应得到加强。
21.一种能诱导灵长类动物体内针对HIV Env，Gag或Pol抗原的CD8+T细胞免疫反应的方法，该方法包括给灵长类动物提供权利要求1-15中任一项所述的组合物，由此可诱导灵长类动物体内针对该抗原的CD8+T细胞免疫反应。
22.一种能诱导灵长类动物体内针对HIV Env，Gag或Pol抗原的CD8+T细胞免疫反应的方法，该方法包括给灵长类动物提供激发组分，所述的激发组分包括编码所述抗原的核酸，和然后给灵长类动物提供增强组分，所述的增强组分包括权利要求1-15项中的任一项所述的组分，由此诱导针对该抗原的CD8+T细胞免疫反应。
23.权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述的灵长类动物是人。
24.权利要求20-22中任一项所述的方法，其中重组MVA病毒用无针注射法给予。
25.权利要求22中所述的方法，其中激发成分包括编码所述抗原的质粒DNA。
26.一种制备权利要求1-15中任一项所述的组合物的方法，包括制备编码HIV env，gag和pol基因或其修饰基因的质粒转移载体，其中所述的HIV env基因被修饰用来编码一种由gp120和gp41的跨膜和胞外区组成、但缺少gp41的部分或全部的胞浆内功能区的HIV Env蛋白，所述的质粒转移载体与MVA病毒再结合用来生产权利要求1-15中任一项所述的组合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
EP2388015A1 (en) 2000-03-02 2011-11-23 Emory University DNA expression vectors and methods of use
DK1372710T3 (da) 2001-03-08 2010-01-18 Us Gov Health & Human Serv MVA der udtrykker modificeret HIV-kappe-, Gag- og Pol-gener
AU2003220111B2 (en) * 2002-03-08 2008-07-31 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
CN1490056A (zh) * 2002-10-18 2004-04-21 ��¡���ɵ°��̲��о����� 针对hiv-1的免疫方法和组合物
WO2004087201A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-14 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mva virus expressing modified hiv envelope, gag, and pol genes
WO2005034992A2 (en) * 2003-09-15 2005-04-21 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv vaccines based on env of multiple clades of hif
DK1845164T3 (da) * 2003-11-24 2010-09-20 Bavarian Nordic As Promoterer til ekspression i modificeret vacciniavirus ankara
CN1304580C (zh) * 2004-07-09 2007-03-14 楼伟 重组表达人获得性免疫缺陷病毒I型的表面糖蛋白gp160
JP4772045B2 (ja) * 2004-07-16 2011-09-14 アメリカ合衆国 Ｃｍｖ／ｒ核酸コンストラクトを含むａｉｄｓに対するワクチン
WO2006026667A2 (en) * 2004-08-27 2006-03-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant mva viruses expressing glade a/g, clade b, and clade c modified hiv, gag and pol genes
AU2012202786B8 (en) * 2004-08-27 2015-05-21 Emory University Recombinant MVA viruses expressing Clade A/G, Clade B, and Clade C modified HIV ENV, GAG and POL genes
ES2281252B1 (es) 2005-07-27 2009-02-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Vectores recombinantes basados en el virus modificado de ankara (mva) como vacunas preventivas y terapeuticas contra el sida.
FR2893254B1 (fr) * 2005-11-14 2007-12-21 Biomerieux Sa Composition comprenant un vecteur synthetique colloidal bioresorbable et un vecteur viral et son utilisation prophylactique, therapeutique et diagnostique.
CN101020052A (zh) * 2006-02-16 2007-08-22 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心 基于复制型痘苗病毒载体的艾滋病疫苗
WO2007102326A1 (ja) * 2006-03-07 2007-09-13 Yokohama City University アデノウイルス５型／３５型ベクターとワクシニアウイルスｍｖａベクターとの併用による強力な免疫誘導
US20090060947A1 (en) * 2006-05-19 2009-03-05 Sanofi Pasteur, Inc. Immunological compositions
CA2682045A1 (en) * 2007-03-26 2008-10-02 International Aids Vaccine Initiative Method of eliciting immune response with a modified mva viral hiv-1 vector
EP2042604A1 (en) * 2007-09-26 2009-04-01 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) VV promoter driven overexpression of recombinant antigens
US20090263828A1 (en) * 2008-04-16 2009-10-22 Franco Lori Novel assay for precursor T-cells having high proliferative capacity (PHPC-asay)
ES2641915T3 (es) * 2008-09-10 2017-11-14 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Construcción de un gen sintético que codifica el gag del VIH1 y su utilización para la obtención de vacunas contra el VIH-1
AP2012006258A0 (en) * 2009-10-13 2012-06-30 Geovax Inc Eliciting immune responses using recombinant MVA viruses expressing HIV ENV, GAG and POL antigens.
JP5168429B2 (ja) 2010-05-19 2013-03-21 新日鐵住金株式会社 Ｌ字状形状を有する部品のプレス成形方法
DK2694101T3 (en) 2011-04-06 2017-01-09 Biovaxim Ltd Pharmaceutical compositions for the prevention and / or treatment of HIV disease in humans
US20150203540A1 (en) * 2012-07-27 2015-07-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cytoplasmic Tail Modifications to Boost Surface Expression and Immunogenicity of Envelope Glycoproteins
WO2016068919A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Geovax, Inc. Combination therapy for treating viral reservoirs
EP3244919A4 (en) 2015-01-12 2018-06-27 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a hemorrhagic fever virus
AU2017206102C1 (en) 2016-01-08 2022-02-10 Geovax Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen
WO2017136419A1 (en) 2016-02-03 2017-08-10 Geovax Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a flavivirus
US11098086B2 (en) 2016-02-16 2021-08-24 Geovax Inc. Multivalent HIV vaccine boost compositions and methods of use
WO2018195447A1 (en) * 2017-04-20 2018-10-25 Geovax Labs, Inc. Recombinant mva-based hiv immunogens and uses thereof
WO2019018501A1 (en) * 2017-07-18 2019-01-24 Geovax Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENERATING LASV IMMUNE RESPONSE
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL82104A0 (en) * 1986-04-08 1987-10-30 Usa Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus genes and method for producing htlb-iii envelope proteins
US5169763A (en) * 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
US5256767A (en) * 1987-06-10 1993-10-26 The Immune Response Corporation Retroviral antigens
CA1341245C (en) * 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
CA1340729C (en) 1988-03-23 1999-09-07 Mohan Bir Singh Ryegrass pollen allergen
IL89567A0 (en) 1988-03-28 1989-09-10 Univ Leland Stanford Junior Mutated hiv envelope protein
US5614404A (en) * 1988-06-10 1997-03-25 Theriod Biologics, Incorporated Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
US5747324A (en) * 1988-06-10 1998-05-05 Therion Biologics Corporation Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
AU3775789A (en) * 1988-06-10 1990-01-05 Applied Biotechnology, Inc. A method of evaluating recombinant vaccines against immunodeficiency virus
US6306625B1 (en) * 1988-12-30 2001-10-23 Smithkline Beecham Biologicals, Sa Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6214804B1 (en) * 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
GB8923123D0 (en) * 1989-10-13 1989-11-29 Connaught Lab A vaccine for human immunodeficiency virus
JPH05503629A (ja) * 1989-11-20 1993-06-17 オンコーゲン　リミテッド　パートナーシップ 抗ウィルス剤及び免疫原として使用される、非複製組換え製レトロウィルス粒子
IE71643B1 (en) * 1990-11-20 1997-02-26 Virogenetics Corp A recombinant poxviral vaccine for canine distemper
US5863542A (en) * 1991-03-07 1999-01-26 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canaryopox virus containing heterologous HIV or SIV inserts
KR100242671B1 (ko) * 1991-03-07 2000-03-02 고돈 에릭 유전학적으로 처리한 백신 균주
EP0538496B1 (en) * 1991-08-26 2003-10-29 Baxter Healthcare S.A. Recombinant fowlpox virus with intact FPV-tk-gene
US5445953A (en) * 1991-08-26 1995-08-29 Immuno Aktiengesellschaft Direct molecular cloning of a modified poxvirus genome
DE69229390T2 (de) * 1991-08-26 1999-11-11 Immuno Ag, Wien Direkt molekuläre Klonierung eines modifizierten Genoms eines Chordopocken-Virus
US5593972A (en) * 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US6171596B1 (en) * 1993-12-10 2001-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligomeric HIV-1 envelope glycoproteins
US5658785A (en) * 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5955342A (en) * 1994-08-15 1999-09-21 Connaught Laboratories Limited Non-infectious, replication-defective, self-assembling HIV-1 viral particles containing antigenic markers in the gag coding region
US6291157B1 (en) * 1998-02-23 2001-09-18 Connaught Laboratories Limited Antigenically-marked non-infectious retrovirus-like particles
US6080408A (en) * 1994-08-22 2000-06-27 Connaught Laboratories Limited Human immunodeficiency virus type 1 nucleic acids devoid of long terminal repeats capable of encoding for non-infectious, immunogenic, retrovirus-like particles
US5676950A (en) * 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
DE69527089T2 (de) * 1995-04-19 2003-01-02 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh, Wien Monoklonale antikörper gegen hiv-1 und davon hergestellte impfstoffe
US5741492A (en) 1996-01-23 1998-04-21 St. Jude Children's Research Hospital Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
FR2747046B1 (fr) * 1996-04-05 1998-06-19 Univ Paris Curie Nouveaux vaccins issus de plasmovirus
US5846946A (en) * 1996-06-14 1998-12-08 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Compositions and methods for administering Borrelia DNA
US5747338A (en) * 1996-08-15 1998-05-05 Chiron Corporation Method and construct for screening for inhibitors of transcriptional activation
US6201663B1 (en) * 1996-09-05 2001-03-13 Kabushiki Kaisha Ohara Magnetic head having a slider made of a glass-ceramic
US6204250B1 (en) * 1996-11-22 2001-03-20 The Mount Sinai Medical Center Of The City Of New York Immunization of infants
US6077662A (en) * 1996-11-27 2000-06-20 Emory University Virus-like particles, methods and immunogenic compositions
US6099847A (en) * 1997-05-15 2000-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Chimeric Gag pseudovirions
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
US6054312A (en) * 1997-08-29 2000-04-25 Selective Genetics, Inc. Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors
US6121021A (en) * 1997-12-16 2000-09-19 Connaught Laboratories Limited Constitutive expression of non-infectious HIV-like particles
US6156952A (en) * 1998-04-09 2000-12-05 Constituent Institution Of The University Of Maryland System HIV transgenic animals and uses therefor
AUPP349698A0 (en) * 1998-05-13 1998-06-04 Altronic Distributors Pty Ltd Mounting assembly
GB2337755B (en) * 1998-05-29 2003-10-29 Secr Defence Virus vaccine
AU5036899A (en) 1998-06-26 2000-01-17 Aventis Pasteur Use of poxviruses as enhancer of specific immunity
AU5677399A (en) 1998-08-20 2000-03-14 Wistar Institute Of Anatomy And Biology, The Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting
WO2001002607A1 (en) 1999-07-06 2001-01-11 Merck & Co., Inc. Adenovirus carrying gag gene hiv vaccine
US6256183B1 (en) * 1999-09-09 2001-07-03 Ferraz Shawmut Inc. Time delay fuse with mechanical overload device and indicator actuator
MXPA02006379A (es) * 1999-12-23 2004-06-21 Medical Res Council Mejoriasen o relacionadas con la respuesta inmune a vih.
AUPQ520800A0 (en) 2000-01-21 2000-02-17 Alfred Hospital Prime-boost vaccination strategy
EP2388015A1 (en) * 2000-03-02 2011-11-23 Emory University DNA expression vectors and methods of use
ES2282251T3 (es) 2000-04-27 2007-10-16 Sanofi Pasteur Limited Vacunas contra la infeccion por vih.
DK1372710T3 (da) 2001-03-08 2010-01-18 Us Gov Health & Human Serv MVA der udtrykker modificeret HIV-kappe-, Gag- og Pol-gener
EP2292772A1 (en) 2001-07-05 2011-03-09 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. HIV vaccination with a DNA encoding a HIV polypeptide and a HIV polypeptide

Also Published As

Publication number Publication date
ATE445411T1 (de) 2009-10-15
WO2002072754A9 (en) 2003-01-03
CY1109659T1 (el) 2014-08-13
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WO2002072754A3 (en) 2003-05-22
US20150238593A1 (en) 2015-08-27
CN100446812C (zh) 2008-12-31
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AU2002252199B2 (en) 2008-01-03
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US20040146528A1 (en) 2004-07-29
US8916172B2 (en) 2014-12-23
EP1372710A2 (en) 2004-01-02
DK1372710T3 (da) 2010-01-18
CA2454959C (en) 2018-07-10
CA2454959A1 (en) 2002-09-19
US7867982B2 (en) 2011-01-11
JP2010115208A (ja) 2010-05-27
US20090074726A1 (en) 2009-03-19
EP1372710A4 (en) 2005-04-27
ES2334335T3 (es) 2010-03-09
JP4554887B2 (ja) 2010-09-29
EP1372710B1 (en) 2009-10-14
JP2004537974A (ja) 2004-12-24
PT1372710E (pt) 2009-12-21

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Kent et al. Enhanced T-cell immunogenicity and protective efficacy of a human immunodeficiency virus type 1 vaccine regimen consisting of consecutive priming with DNA and boosting with recombinant fowlpox virus
Earl et al. Comparison of vaccine strategies using recombinant env–gag–pol MVA with or without an oligomeric Env protein boost in the SHIV rhesus macaque model
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Agy et al. Viral and cellular gene expression in CD4+ human lymphoid cell lines infected by the simian immunodeficiency virus, SIV/Mne
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Kuroda et al. Role of Genes That Modulate Host Immune
Chandler et al. Stephen J. Kent, Anne Zhao, Susan J. Best, Jenalle D.
Wang et al. Polyvalent DNA prime and envelope protein boost HIV‐1 vaccine elicits humoral and cellular responses and controls...

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