CN105709221B - 用于预防和/或治疗人中的hiv疾病的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预防和/或治疗人中的HIV疾病的药物组合物。其包含具有一个或多个来自HIV Gag和/或Pol蛋白的表位的颗粒抗原和非重组的致耐受细菌的混合物。这些组合物对预防和/或治疗人中的HIV疾病是有用的。

Description

用于预防和/或治疗人中的HIV疾病的药物组合物

本申请是申请号为201280026590.4，申请日为2012年4月6日，发明名称为“用于预防和/或治疗人中的HIV疾病的药物组合物”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及含有特异性HIV抗原和非致病细菌的混合物的药物组合物。所述特异性HIV抗原包括一个或多个来自Gag和/或Pol蛋白的表位，且优选其在颗粒(particulate)的形式下。所述细菌优选是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。这些组合物对预防和/或治疗人中的HIV疾病是有用的。

背景技术

在发现人免疫缺陷病毒(HIV)后超过25年，来自世界卫生组织和HIV/AIDS的联合国联合计划的最新预测(projection)表明，如果大流行以目前的速度进展，到2011年将有超过3千万人感染。

但是，尽管为了发现对预防HIV感染有效的治疗作出大量的研究努力，目前两种测试的预防性疫苗或者失败(Mc Elrath等人，2008)或者产生中度效果(Rerks-Ngarm等人，2009)。

Jae-Sung Yu等人(Clinical and Vaccine Immunology,2006十一月,13卷,No.11,1204-1211)描述了重组包皮垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)载体，其构建用于表达作为表面、细胞内或分泌蛋白的M组HIV-1共有env基因CON6。作者能证明在小鼠中，重组包皮垢分枝杆菌(M.smegmatis)对在粘膜表面诱导HIV-1 T细胞反应是免疫原性的。

Ke-Qin Xin等人(Blood,2003六月1,102卷,No.1,223-228)描述了在其细胞表面表达HIV-1 Env V2-V4环的重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)载体。用该载体口服免疫小鼠诱导：

-粘膜和体液免疫反应，如通过检测到高水平的HIV特异性血清IgG和排泄物IgA抗体所表明的；和

-细胞免疫反应，如通过HIV特异性IFNγ分泌细胞的数量增加所表明的。

为了在乳酸乳球菌(L.lactis)细胞表面正确表达，可以使用1kb或小于1kb的基因片段(segment)。

大多数参与HIV发病机理和预防的科学家感觉在测试用于预防或治疗人类HIV感染的HIV预防性疫苗或其它生物组合物之前，在非人的灵长目中测试其对应物将更有建设性意义(Morgan C,等人，2008)。选择的非人灵长目是恒河猴(macaques rhesus)，在猕猴(macaques)中，现在已经确凿地表明感染猴免疫缺陷病毒(SIV)239的中国来源的猕猴是模拟多数人中HIV感染演化的临床、病毒学和免疫方面最好的模型(Marcondes MC等人，2006；Stahl-Hennig C等人，2007；Chen S等人，2008)。

最后，现在科学界认同，一旦在猕猴中发现抗SIV239有效的预防性生物组合物或疫苗，其应当完全可能成功地适用于人来保护其免受AIDS。

尽管科学界持久的研究努力，仍然期待预防性和治疗性有效的策略战胜全世界的AIDS流行。

已经描述了各种细菌具有施用于受试者时的令人感兴趣的佐剂性和免疫调节性的特性。尤其是，报道了乳酸细菌促进对免疫系统的耐受作用。

例如，公布于2006年11月23日，在Stallergenes S.A名下的WO2006/123230，描述了选自双歧杆菌(Bifidobacteria)和乳酸细菌的细菌作为免疫原性组合物中的佐剂的用途，其能够在舌下、经舌、或口服施用于受试者时诱导抗原特异性耐受。建议免疫原性组合物用于治疗过敏、自体免疫性疾病、或用于预防移植排斥。

然而，例如公布于2009年7月30日，在食品和营养高级研究所(Stichting TopInstitute Food and Nutrition)名下的WO2009/093900，描述了含有大量对数中期乳酸细菌的致耐受性组合物。当施用于受试者时，该组合物诱导非抗原特异性免疫耐受。建议该组合物用于预防、延缓和/或治疗与导致组织损伤的炎症反应相关的病症或疾病，例如，过敏、自体免疫性疾病、以及肠的炎症疾病。

发明内容

令人惊奇地，发明人能够表明如以下实施例中描述的原始药物组合物在猕猴中诱导有效的对SIV的抗原特异性免疫保护。而且，当所述SIV特异性免疫保护被诱导时，发明人表明其预防了SIV复制/传播以及随后的体内感染的建立。

实际上，发明人惊奇地表明将文中公开的药物组合物粘膜地或由皮内或上皮内途径施用时，显著地抑制或甚至消除或防止病毒复制。

实际上，发明人第一次观察到在猕猴中非细胞毒CD8+T细胞反应抑制SIV抗原提呈的CD4+T细胞的早期激活。因而，不希望束缚于理论，当粘膜或皮内或上皮内施用于受试者时，根据本发明的药物组合物诱导意想不到的新型病毒特异性免疫耐受。该免疫耐受看起来是HIV Gag和/或Pol抗原特异性抑制性CD8+T细胞诱导的免疫耐受(文中也命名为“T抑制性”免疫耐受的“Ts”免疫耐受)，其是MHC(为“主要组织相容性复合物”)-1b/E限制的和非细胞毒的。

鉴于文中所报道的结果，本发明提供了一种能够实现如上所定义的“Ts”免疫耐受的新型药物组合物，其用于预防和/或治疗人的HIV疾病。

因而，本发明的一个目的是提供含有抗原和非致病活细菌的混合物的药物组合物，其中，优选所述抗原是颗粒的和/或其具有一个或多个来自HIV Gag和/或Pol蛋白的表位，且其中所述细菌优选是植物乳杆菌。

本发明的另一个目的是提供文中所述的药物组合物，用作疫苗。

本发明的另一个目的是提供用于预防和/或治疗有需要的人的HIV疾病的方法，其包括至少粘膜地(优选口服)或皮内地或上皮内地将有效量的上述药物组合物施用于所述人的步骤。

本发明的又一个目的是提供用于保护人免受HIV的方法，其包括至少粘膜地(优选口服)或皮内地或上皮内地将有效量的上述药物组合物施用于所述人的步骤。

本发明的又一个目的是提供用于保护人免受HIV血清转化的方法，其包括至少粘膜地(优选口服)或皮内地或上皮内地将有效量的上述药物组合物施用于所述人的步骤。

本发明的又一个目的是提供用于预防和/或治疗有需要的人的HIV疾病的药物试剂盒，其包含

-在第一容器中的抗原；和

-在第二容器中的非致病细菌，

其中所述抗原和所述细菌在用于粘膜或皮内或上皮内施用的药学上可接受的载体中，其中优选所述抗原是颗粒的和/或其具有一个或多个来自HIV Gag和/或Pol蛋白的表位，且其中所述细菌优选植物乳杆菌。

附图说明

通过以下的附图说明本发明，其可参照以下非限制的实施例。

图1：用阴道内iSIV/BCG预处理的恒河猴的静脉内(i.v.)SIVmac239挑战。

图2：用阴道内iSIV/BCG预处理的恒河猴的直肠内(i.r.)SIVmac239挑战。

图3：用阴道内iSIV/BCG预处理的恒河猴的重复SIVmac239挑战(3次由i.v.和2次由i.r.)。

图4：用阴道内iSIV/BCG加皮内加强预处理的恒河猴的静脉内SIVmac239挑战。

图5：用阴道内iSIV/BCG加皮内加强预处理的恒河猴的直肠内SIVmac239挑战。

图6：用口服iSIV/BCG预处理的恒河猴的直肠内SIVmac239挑战。

图7：从用阴道内iSIV/BCG预处理的恒河猴获得的CD8+T细胞体外抗病毒活性。

图8：从用口服iSIV/BCG预处理的4只恒河猴获得的CD8+T细胞体外抗病毒活性。

图9：通过从用口服iSIV/BCG预处理的4只恒河猴获得的自体同源(autologous)CD8+T细胞的CD4+T细胞激活的SIV特异性抑制。

图10a：取自用iSIV/LP、iSIV或LP预处理的恒河猴的血浆样品中的抗SIV IgG抗体滴度。

图10b：取自用iSIV/LP、iSIV或LP预处理的恒河猴的PBMC样品中的SIV特异性T细胞增殖。

图10c：在存在或不存在CD8或CD25T细胞时在体外刺激下SIV特异性IFNγ分泌T细胞。

图10d：与用口服LP(n＝4)或iSIV(n＝3)预处理的动物相比，通过用口服iSIV/LP预处理的8只恒河猴获得的自体同源CD8+T细胞的CD4+T细胞激活的SIV特异性抑制。

图10e：胃内施用iSIV/LP制剂后60天的SIV特异性CD8+T细胞：在CD8+T细胞或存在人自然杀伤细胞(hNK)(对照)的K562存在时，在具有或不具有SEB和抗CD3/CD28刺激时，AT-2SIV脉冲的CD4+T细胞的细胞毒性。

图11a：与用口服LP(n＝4)或iSIV(n＝3)预处理的动物相比，通过用口服iSIV/LP预处理的8只恒河猴获得的自体同源CD8+T细胞的体外抗病毒活性(在CD4细胞中)。

图11b：从口服iSIV/LP处理后80天的8只恒河猴中的4只获得的异种(heterologous)或同种异体(allogenic)CD8+T细胞的体外抗病毒活性(在CD4细胞中)。

图11c-11g：口服免疫后60天CD8+T细胞的抗SIV活性，在延缓的(图11c)、插入(图11d)、同种异体(图11e)的培养系统中，在抗MHC-la/ABC或抗MHC-lb/E抗体(图11f)存在时、以及在去除TCRγδ⁺或Vβ8⁺亚群的CD8+T细胞中(图11g)。

图12a：与用口服LP或iSIV预处理的动物相比，用口服iSIV/LP预处理的恒河猴中直肠内和静脉内SIVmac239挑战后，血浆的病毒载量水平(每ml血浆的SIV RNA拷贝)。

图12b：与用口服LP或iSIV预处理的动物相比，用口服iSIV/LP预处理的恒河猴中直肠内和静脉内SIVmac239挑战后，细胞的病毒载量水平(每100万PBMC的SIV DNA拷贝)。

图13a-13e：通过输注抗CD8抗体cMT807，去除8只iSIV/LP处理的猕猴的外周血和淋巴结CD8⁺T细胞。图13a，在接受三次cMT807注射之前和之后的外周血CD8⁺T细胞计数；图13b，在接受三次cMT807注射之前和之后的淋巴结CD8⁺T细胞％；图13c，在接受三次cMT807注射之前和之后的血浆病毒载量；图13d，在接受三次cMT807注射之前之后的PMBC DNA SIV载量；图13e，在接受三次cMT807注射之前和之后的淋巴结SIV DNA载量。

图14a-14b：在8只用由iSIV和LP制成的口服制剂免疫的恒河猴和2只另外的未处理

的猴子中用SIVB670直肠内进行第三次直肠内挑战后，血浆(图14a)和PBMC(图14b)的病毒载量。

图15a-15c：用iSIV和LP胃内免疫后(iSIV/LP免疫No.2)，在体外和体内CD8⁺T细胞介导的抗病毒活性。图15a，在将被直肠内挑战的8只恒河猴中，在免疫后的60-420天期间，CD8⁺T细胞的抗SIV活性(病毒抑制的倍数)；图15b和图15c，用口服iSIV/LP免疫的那8只恒河猴和仅用LP(n＝4)或仅用iSIV(n＝4)处理的8只对照猴中，直肠内SIVmac239挑战后，血浆和细胞的病毒载量。

图16a-16e：在8只猕猴(iSIV/LP免疫No.2)中，在SIVmac239直肠内挑战后，直肠粘膜上皮内淋巴细胞(IPL)中(图16a－图16b)，固有层(lamina propria)细胞中(LPC)(图16c－图16d)和盆腔淋巴结中(PLN)(图16e)的SIV DNA和RNA载量。

具体实施方式

发明的详细描述

本发明涉及包含抗原和非致病活细菌的混合物的药物组合物。

抗原

由于HIV基因组中突变、重组、插入和/或缺失所致的高度变异性，HIV被分类为组、亚组、型、亚型和基因型。有两个主要的HIV组(HIV-1和HIV-2)和许多亚组，原因是HIV基因组不断地突变。组和亚组间的主要不同与病毒包膜(envelope)相关。HIV-1被分类为主要的亚组(M)，所述亚组M被分类为命名为A到J的9个亚型(分支(clade)或亚型)(Hu等人,JAMA275:210-216,1996；Korber等人,Science 280:1868-1871,1998)，以及第10个之外的亚组(O)。还存在来自于前一个的体内重组的许多其它亚组(Papathanasopoulos MA等人，VirusGenes 2003,26:151-163)。优选，HIV病毒是HIV-1或HIV-2，包括所有已知的和至今未知的其分支。然而，优选的是HIV-1。

在本发明的上下文中，“抗原”来自HIV来源，这意味着其与特异性HIV组、亚组、型、亚型或一些亚型的组合相关。优选地，所述HIV抗原是HIV-1或HIV-2抗原。

所述抗原是非感染性的。

很长时间科学界怀疑CD4⁺T细胞(既是HIV-1又是SIV的主要靶点)的激活直接导致病毒复制(Andrieu和Lu,1995；Korin和Zack,1999)。但是，仅仅在最近，才澄清了CD4⁺T细胞激活和SIV或HIV感染过程的连续步骤之间的相互作用。在静态的CD4⁺T细胞中，在进入后2小时内，跟随病毒穿透之后的是在质膜上提呈来自进入的病毒粒子的Gag和Pol蛋白表位，而Env和Nef蛋白需要重新合成(Sacha等人，2007)。但是，感染过程随后的阶段，即，病毒整合之后的逆转录，在静态细胞中发展得非常没有效率(Vatakis等人，2009a和2009b)。相反地，当在质膜上提呈Gag和Pol表位之前或之后的48小时之内激活CD4⁺T细胞，HIV/SIV逆转录和DNA整合完全活化，其允许非常有效的病毒复制和释放(Vatakis等人，2009a和2009b)。

因而，发明人假定，在HIV/SIV暴露后，体内特异性阻断早期发生的HIV/SIV Gag或Pol特异性CD4⁺T细胞的激活，将导致防止活化的病毒复制。

考虑到这一点，为了诱导HIV Gag和/或Pol抗原提呈CD4⁺T细胞激活的抑制，继而在病毒暴露的人中防止体内HIV复制和传播，本发明的药物组合物包含HIV抗原，其优选具有一个或多个来自HIV Gag和/或Pol蛋白的表位。这样的抗原有利地或含有或衍生自HIVGag和/或Pol。

因而，术语“含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原”指HIV抗原：

-包含至少一个Gag和/或Pol(作为“含有Gag和/或Pol的抗原”)；或

-包含一个或多个由GAG，例如衣壳蛋白(p24)和基质蛋白(p17)，编码的蛋白，和/或一个或多个由POL，例如整合酶、逆转录酶和蛋白酶，编码的蛋白(作为“衍生自Gag和/或Pol的抗原”)；或

-包含一个或多个来自这些蛋白的表位(也作为“衍生自Gag和/或Pol的抗原”)。

特别地，选自如下的任何其它病毒蛋白或其表位不是包含于文中公开的药物组合物的必要组分：ENV、VIF、VPR、HIV-1的VPU、HIV-2的VPX、REV、NEF、TAT等等。如果存在，这些蛋白的任一个仅仅是用于文中公开的药物组合物中的任选组分。

优选抗原是颗粒抗原。这意味着其优选选自病毒颗粒、重组病毒颗粒、病毒样颗粒、表达Gag和/或Pol的重组细菌或真菌、在其表面提呈一个或多个病毒蛋白或肽或表位(含有或衍生自HIV Gag和/或Pol)的聚合微颗粒。优选地，一个或多个来自Gag和/或Pol的表位由所述抗原产生或表达或包含于所述抗原。当使用重组病毒颗粒或病毒颗粒或表达Gag和/或Pol的重组细菌或真菌时，其优选是失活的微生物。

抗原可以是病毒颗粒、重组病毒颗粒、病毒样颗粒或表达Gag和/或Pol的重组细菌或真菌。其还可以是一个或多个病毒蛋白或肽(含有或衍生自HIV的Gag和/或Pol)、重组的或非重组的、可以是缀合物(conjugate)或多联体(concatemer)的形式。然后，抗原是病毒核酸非依赖的，即，其是非病毒DNA或非病毒RNA依赖的。

抗原可以来自有利地包含于适当的重组微生物中的病毒核酸序列的表达。

如果包含于本发明药物组合物中的抗原是表达Gag和/或Pol的重组细菌，那么所述重组细菌优选不同于也包含在组合物中的非致病活细菌。

当根据本发明的药物组合物中的抗原是一个或多个病毒蛋白或肽(含有或衍生自HIV的Gag和/或Pol)时，其优选是颗粒的形式。实践中，适当的颗粒抗原，可由活的微生物(例如，酵母)，以与重组DNA B型肝炎疫苗相同的方式生产，在重组DNA B型肝炎疫苗的情况中，表达的HBsAg多肽自我组装成免疫原性球形颗粒，其非常类似慢性HBV感染患者血清中发现的天然22-nm颗粒(Plotkin等人，2008)。

或者，当根据本发明的药物组合物中的抗原是一个或多个病毒蛋白或肽(含有或衍生自HIV Gag和/或Pol)时，其是缀合物的形式。在这样的实施方式中，如本领域公知的，感兴趣的蛋白或肽共价缀合于适当的载体。可商业获得的常规载体尤其是蛋白，如KLH(钥孔戚血蓝蛋白)蛋白、BSA(牛血清白蛋白)蛋白、OVA(卵清蛋白)蛋白等(优选其可以安全地口服施用于人类)。生产适当的缀合物的方法对本领域技术人员是熟悉的。

但是，或者，当根据本发明的药物组合物中的抗原是一个或多个病毒蛋白或肽(含有或衍生自HIV Gag和/或Pol)时，其是多联体的形式。如本领域中公知的，多联体由感兴趣蛋白或肽的多个拷贝形成，其在一个大分子中物理连接在一起。在多联体中，感兴趣蛋白或肽的一个拷贝可以直接地或被合成手臂分隔而连接至其它拷贝。因而，多联体包含至少两个拷贝，优选多至10个拷贝或更多，的感兴趣蛋白或肽。生产适当多联体的方法属于本领域技术人员的普通常识。

如文中使用的，“病毒样颗粒”(VLP)指非常类似成熟病毒粒子的颗粒，但是其不含有所述病毒的病毒基因组物质。更准确地，VLP，也称为假病毒粒子，代表由病毒衣壳和/或其它病毒蛋白的多个拷贝组成的亚单元结构。这些病毒蛋白能够在体内自我组装成明确的球形对称的VLP。这些VLP不包含编码病毒蛋白的任何核酸分子，更准确地，其不包含任何核酸分子。因而，VLP在自然中是非复制且非感染的，这使得其安全地以药物组合物的形式施用。用于生产VLP的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Liew等人,2010；Plummer和Manchester,2010)。用于生产VLP的适当方法的非限制的例子在US 5,919,458、EP 386882、WO 91/07425、US 5,861,282和WO 91/05864中描述了，其公开了不包含HIV基因组也不包含任何核酸分子的HIV VLP(假病毒粒子)。

如文中所述的，“重组病毒颗粒”指包含来自不同病毒的蛋白、或在其表面暴露来自不同病毒的蛋白的病毒颗粒。而且，重组病毒颗粒还可以指细菌或其它宿主细胞，其包含、生产或在其表面暴露一个或多个含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位。

事实上，重组病毒颗粒的大多数是其中原始结构蛋白(即，主要包膜蛋白和核心蛋白)的一部分被来自另一病毒的对应(counterpart)蛋白取代的病毒颗粒。作为例子，包膜蛋白可互换。在这样的情况中，重组病毒颗粒包含存在于病毒基因组中的“嵌合”基因组，其具有与编码来自另一病毒的包膜蛋白的序列互换的编码包膜蛋白的序列。大多数重组病毒颗粒是可复制的、且有感染性的。

如文中所使用的，包含来自另一病毒的蛋白的重组病毒指，在内部或呈现在其表面，含有一个或多个含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的重组病毒颗粒。描述了用于生产重组病毒颗粒的方法的非限制例子：

*甲病毒(Alphavirus):WO 02/053757中，公开了表达HIV(ENV蛋白)的重组甲病毒。

*逆转录病毒:EP 1499736中，公开了表达嵌合糖蛋白的慢病毒(lentiviral)载体。

*腺病毒(例如5、7或35型):US 2007/077257、US 2007/054395、JP 2007037402、WO2006/120034、US 2004/253210、US 2004/170647、US 2005/070017、US 2003/228329、US2004/101957、US 2003/219458、US 2004/009936、US 2004/028652、WO 03/050238、WO 03/038057、WO 03/020893、WO 02/31168、WO 02/22080、WO 01/02607和US6716823中，公开了表达HIV蛋白的重组腺病毒。

*痘病毒(金丝雀痘(canarypox)、牛痘、Ankara牛痘和禽痘病毒)：US 5,766,598、EP 0592546、US 2007/048861、US 2006/188961、US 2006/134133、EP 1789438、WO 2005/017208、WO 2004/035006、US 2004/146528、JP 2003321391、EP 1378516、WO 95/07099、JP7170982、DE 4141741、EP 0449116、JP 1148183、JP 1085072、EP 0592546、EP 0243029、US2005/287162、JP 2004105187、JP 2004089185、WO 03/095656、EP 0592546、WO 96/40880、US 6,136,318、US 5,670,367中，其公开了表达包含HIV蛋白的病毒蛋白的重组痘病毒。

*含有、生产或在其表面暴露至少一个来自病毒的蛋白的细菌：US 7,189,402和WO96/11708中，其公开了表达HIV糖蛋白(即，包膜蛋白)的沙门菌属(Salmonella)或大肠杆菌(E.coli)。

优选地，重组病毒颗粒对应于痘病毒，该痘病毒优选选自金丝雀痘(例如，ALVAC病毒载体，如描述于专利US 5,766,598和EP 0592546中的)、牛痘(例如牛痘病毒，如公开于国际专利申请WO 95/07099中的)、Ankara牛痘(如，NYVAC病毒载体，如公开于专利申请EP1789438中的)和禽痘病毒(如，TROVAC病毒载体，如公开于国际专利申请WO 03/095656中的)。

更优选地，所述痘病毒是金丝雀痘病毒。作为对应于金丝雀痘病毒且表达HIV肽/蛋白的重组病毒颗粒的一个例子，可以引用公开于专利US 5,766,598(从第6栏第18行至第82栏第36行在此引入作参考)中的ALVAC病毒载体，其中该ALVAC载体作为例子表达HIV-1gp120、HIV-1 gp160、HIV-1 env非切割的分泌形式、用跨膜序列锚定的HIV-1 gp120、HIV-1gag/pol、HIV-1 gag/pol和env(gp120)、HIV-1 gag/pol和env(gp160)、以及HIV-1 gag/pol和env(带有跨膜锚定的gp120)。优选地，所述ALVAC载体表达HIV-1gag/pol和env(gp120)，最优选地所述ALVAC载体是ALVAC vCP1521。

“病毒颗粒”优选是SIV或HIV颗粒，如含有突变的病毒基因组(例如，通过核酸突变、取代或插入)导致产生非感染的病毒颗粒的SIV或HIV病毒颗粒。

包含突变的病毒基因组的病毒颗粒公开于US 7,229,625、US 6,121,021、US 6,923,970、US 6,544,527、US 6,451,322和US 6,080,408。

有利地，为了使病毒颗粒或重组病毒颗粒安全施用于人，所述病毒颗粒或重组病毒颗粒在施用前是失活的。这样的失活对重组病毒颗粒、甚至对非复制的那些，可能是必要的。

如文中使用的“失活的病毒颗粒”，所述病毒颗粒是重组或非重组的，指不再感染的，优选不再复制的病毒颗粒。

用于失活病毒颗粒或重组病毒颗粒的方法对本领域技术人员是公知的。病毒失活的非限制的例子包括化学失活例如福尔马林、牛磺酸氯胺、甲醛、多聚甲醛、丙内酯、β丙内酯(REMUNE)或aldrithiol-2(无对应中译文)(AT-2,参见US 6,001,155)处理、热失活、物理失活如U.V或γ辐射或微波暴露、及其组合。对于HIV失活的参照，参见RAVIV等人(J.Virol.,vol.79(19),p:12394-12400,2005)。

根据一个实施方式，所述失活是化学失活，其选自福尔马林、牛磺酸氯胺、甲醛、多聚甲醛、丙内酯、β丙内酯(REMUNE)或aldrithiol-2失活。

或者，或额外地，所述失活是热失活。这样的失活是技术人员公知的，作为该方法的例子，可以引用实施例中公开的。实际上，发明人令人惊奇地在猕猴中建立了化学地(即，AT-2)和/或热失活的病毒，当与非致病活性菌联合时，其诱导保护性免疫耐受。

有利地，为了施用于人的目的，病毒颗粒至少失活两次，典型地使用至少以上提及的两种失活方法。

优选地，如以上提及的，用作本发明的药物组合物中的抗原的病毒颗粒(重组或非重组的，VLP或非VLP)是核酸(即，DNA或RNA)非依赖的，这意味着病毒颗粒不含有任何病毒DNA或RNA，或者如果其含有DNA或RNA，其在免疫原性中没有作用。

或者，多种结构的聚合微颗粒(以微胶囊、微球等的形式)且在其表面提呈一个或多个含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位，可用作根据本发明的药物组合物中的抗原。这样的微颗粒可由适当的生物或化学的聚合物形成，例如，甲基丙烯酸葡聚糖、甲基丙烯酸聚乙二醇酯和/或明胶，含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的HIV病毒或病毒蛋白或肽或表位可粘附于其上。聚合微颗粒的例子可见于文献中(例如Wei Li Lee等人，(2010),Sandri等人(2007),Goldberg等人(2003),Delie F.(1998),Ponchel等人(1998),Mathiowitz等人(1997),Fasano等人(1997),Chickering等人(1997))。

在一个优选的实施方式，根据本发明的HIV-1药物组合物中的抗原是能够表达一个或多个含有或衍生自HIV-1 Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的一个或多个病毒颗粒。或者，根据本发明的HIV-1药物组合物中的抗原是在其表面提呈一个或多个含有或衍生自HIV-1 Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的一个或多个聚合微颗粒。

优选地，用于根据本发明的药物组合物中的抗原是至少大约110kDa大小。优选，至少大约120、130、140、150、160、170、180、190、200kDa大小，甚至更大。

使用常规的一般知识，以及在以下公开的实施例的基础上，结合SIV或HIV病毒，技术人员很容易确定用于本发明上下文中的病毒抗原的有效量。

作为实例，当所述抗原是颗粒抗原、且更特别地是病毒颗粒时，病毒颗粒的量是大约10⁶至大约10¹²每mL所述混合物。

非致病细菌

如本发明人用猕猴中的SIV所示的，当通过粘膜或皮内或上皮内的途径与如上所定义的适当的抗原一起施用时，包含在药物组合物中的非致病活细菌能够诱导并优选地维持对上述抗原的免疫耐受的状态。在人中，这使得可能预防和/或治疗HIV疾病。

因而，所述细菌可被认为是特定的佐剂，其在文中可被指定为“致耐受的佐剂”或“致耐受载体(carrier)”或“致耐受载体(vehicle)”或“耐受性载体”或“耐受作用(tolerization)载体”或“用于耐受的载体”，这些术语是同义的。

优选地，所有这些等同的术语指，为了获得对抗原的特异性免疫保护(优选，免疫耐受)，从而预防和/或治疗人中的HIV疾病，与如上定义的HIV抗原组合使用的非致病活细菌。

更优选地，“致耐受载体”是非致病活细菌，其与如上定义的HIV抗原混合施用，以实现下述免疫保护的效果的一个或多个、优选2或多个、更优选3或多个：

1)“致耐受载体”不诱导全身HIV抗原特异性抗体的显著产生：

特别地，没有观察到全身抗HIV IgM和/或IgG抗体的显著产生。例如，没有显著的全身体液反应，就是说通过经典临床实验室方法如ELISA没有检测到特异性可检测的全身抗体反应，或者如果检测到全身抗体，对于抗HIV病毒感染也不是保护性的。

2)“致耐受载体”不诱导显著的HIV抗原特异性CD4+T细胞增殖：

特别地，通过例如所附实施例中描述的标准分析测量的，在体外HIV抗原刺激时，没有观察到显著的HIV抗原特异性CD4细胞增殖。

3)“致耐受载体”在体外HIV抗原刺激时，不诱导显著的由CD8+T细胞产生的γ干扰素：

特别地，在体外HIV抗原刺激时，观察到的由CD8+T细胞分泌的γ干扰素水平在ELIspot分析的阈值水平以下。

4)“致耐受载体”诱导抑制HIV抗原提呈CD4+T细胞激活的显著CD8+T细胞反应：

特别地，如随附实施例所示，可通过测量由CD8+T细胞抑制的病毒复制水平(指示“显著的”CD8+T细胞反应)的体外测试确定该反应。这些CD8+T细胞还称为CD8+“调节”T细胞。但是，特别地，考虑到，例如该反应不诱导γ干扰素的显著产生，该反应是非细胞毒性的。但是，特别地，该反应是MHC-1b/E限制的。但是，特别地，TCRαβ看起来参与抑制病毒复制的CD8+T细胞反应。但是，特别地，与去除CD8+T细胞的相同细胞群相比，该反应抑制HIV抗原提呈CD4+T细胞的激活。优选地，所述反应抑制HIV抗原提呈CD4+T细胞的早期激活，其中所述“早期”激活是通过Ki67+标记物测量的(Scholzen和Gerdes.J.Cell Physiol.182,311-322(2000三月))。

通过以上在1)、2)和3)中使用的术语“不诱导”，意指对于适当的定量检测分析，低于阈值水平的结果，其中所述“阈值水平”是依据阴性对照在分析中确定的值：在该值以下，结果是阴性结果。该值可根据分析不同而不同，以及检测方法不同而不同。

有利地，致耐受载体选自活的：

-非致病细菌，特别是益生菌(probiotics)和共生细菌；

-减毒的致病细菌；和

-失活(可选地，也是上述减毒的)致病细菌。

致耐受载体可以是重组或非重组的。

在本发明的上下文中用作致耐受载体的“非致病细菌”通常在人中不诱导任何病理。这也是其通常被认为安全(GRAS)的原因。当然，这样的细菌应当是可施用于人的。

用作致耐受载体的优选非致病细菌是共生细菌。这样的细菌是技术人员公知的。非限制的例子包括芽孢杆菌属(Bacillus sp)(例如，芽泡杆菌B.coagulans)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等等。

用作本发明上下文中的致耐受载体的“共生细菌”有利地是乳酸菌或双歧杆菌，其更特别地选自以上列表，还包括其组合。一个优选的共生细菌是乳杆菌属(Lactobacillussp.)，以及更优选地是植物乳杆菌。以下报道的实施例第一次表明植物乳杆菌是致耐受载体，当与如上定义的抗原一同施用时，导致病毒免疫耐受。

有利地，非致病细菌的组合，如两种或多种共生细菌，可用作致耐受载体。

如文中使用的，术语“致病细菌”指在人中诱导病理的细菌。这样的细菌对技术人员是公知的，包括尤其是李斯特菌属(Listeria species)(例如单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes))、棒状杆菌属(Corynebacterium species)、分枝杆菌属(Mycobacterium species)、红球菌属(Rhococcus species)、真细菌属(Eubacteriaspecies)、博德特氏菌属(Bortadella species)和诺卡氏菌属(Nocardia species)。优选地，致病细菌选自分枝杆菌属(Mycobacterium species)，更优选为牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)。

如文中使用的，“减毒致病细菌”是由于一个或多个突变或一种或多种减毒处理(例如，化学处理和/或在特定介质上的连续传代)，与其野生型对应物相比毒性(virulent)较低的致病细菌。该减毒致病细菌是本领域技术人员公知的。减毒致病细菌非限制的例子包括减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和优选减毒的分枝杆菌的分枝杆菌。作为减毒分枝杆菌的例子，可以引用“卡介苗(Bacille de Calmette Guerin)”，也被称为“BCG”，而且，更特别地，其中，六个广泛应用的BCG株-进化早期株BCG Japanese、DU2组III中的两个进化晚期株(BCG Danish和Glaxo)，和DU2组IV中的三个进化晚期株(BCGConnaught、Pasteur和Tice)。作为减毒分枝杆菌的其它的例子，还可以引用重组BCG，如公开于HOFT等人(2008)中的株rBCG30，公开于WANG等人(2008)中的重组BCG，以及公开于国际专利申请WO 2005/111205和WO 02/102409以及公开于专利US 7,122,195和US 6,261,568中的重组BCG。

有利地，不是减毒的或减毒的同时，致病细菌可以被失活以用作本发明上下文的致耐受载体，但是，减毒致病细菌在被失活后也可以被使用。

“失活致病细菌”是本领域技术人员公知的。该失活致病细菌的制备方法构成本领域常规普通知识的一部分。作为这种方法的例子，能举出噬菌体介导的裂解、化学失活如福尔马林处理(见US 7,393,541)、热失活、如冷冻干燥(例如，扩展冷冻干燥)或U.V或γ辐射(参见WO 2008/128065)或微波暴露的物理失活，以及它们的组合。

优选地，所述致耐受载体是致病细菌如BCG的减毒衍生物。以下报道的例子第一次表明BCG是致耐受载体，当与如上定义的抗原一同施用时导致病毒的免疫耐受。

当重组时，根据本发明的致耐受载体不表达任何HIV蛋白或肽或表位。

优选地，至少用作致耐受载体的活细菌的显著量在对数中期。更优选地，至少大约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至大约100％的细菌细胞总数在对数中期。

技术人员能够容易地确定致耐受载体的有效量，该有效量的例子在以下公开。

作为例子，本发明药物组合物中所述细菌的量是大约10⁴到大约10¹⁴CFU每ml所述混合物。

药物组合物

所述组合物文中还作为“致耐受组合物”或“耐受-免疫原组合物”，这些术语是等同的。

致耐受载体和含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原是两个分别的、不同的组分，其作为混合物包含在本发明的药物组合物中。这意味着所述致耐受载体和所述抗原作为不同的组分存在于所述组合物中。

有利地，本发明的药物组合物不包含作为佐剂的任何寡核苷酸(例如，CpG或dsRNA)。

由于致耐受载体是细菌，相同属和/或种的细菌可在重组形式下分别用作抗原的来源。例如，重组细菌将含有位于适当的调节序列(包括启动子，可诱导的或组成性的)控制下的编码抗原的核酸，该核酸可以在包含于细胞内的核酸载体上，或者作为整合的核酸序列整合至细菌染色体。从而，重组细菌将能够表达或产生所述抗原。因而，根据特定的实施方式，本发明的药物组合物包含是细菌的致耐受载体，以及是一个或多个含有或衍生自HIVGag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的抗原，且其分开地由与致耐受载体属于相同的属和/或种的重组细菌产生。

在根据本发明的药物组合物中，当所述抗原是颗粒抗原且更特别地是病毒颗粒时，在所述混合物中所述病毒颗粒(表示为每ml所述混合物中的颗粒)对所述细菌(表示为每ml所述混合物中CFU)的比是大约从1：10到大约1：1000，优选从大约1：25到大约1：750，然而优选地从大约1：50到大约1：500，甚至更优选地从大约1：75到大约1：250，然而更优选地为大约1：100。

施用本发明的药物组合物

有可能同时地、或分开地或相继地施用致耐受载体和抗原。

因而，本发明的一个目的是提供用于预防和/或治疗有需要的人中HIV疾病的药物试剂盒，其含有：

-在第一容器中，如上定义的抗原；和

-在第二容器中，如上定义的非致病活细菌，

其中所述抗原和所述细菌在用于粘膜或皮内或上皮内施用的药学上可接受的载体中。

本发明的另一个目的是提供产物，产物含有：

-如上定义的作为致耐受载体的非致病活细菌；和

-如上定义的具有一个或多个来自HIV Gag和/或Pol蛋白的表位的颗粒抗原或抗原，

作为用于同时的、分开的或相继使用的组合药物组合物，用于预防和/或治疗有需要的人中HIV疾病。通过粘膜地或皮内地或上皮内地向所述人施用所述组合的药物组合物实现所述预防和/或治疗。为了该目的，可以同时地、或分开地、或相继地施用致耐受载体和抗原。

作为实例，非致病活细菌可以口服(例如，作为口服药物或食物补充剂)，而抗原是粘膜地、或皮内地或上皮内地施用。

当然，为了保证每次适当的递送至预期位点(例如，粘膜表面)，可以使用适当的药物载体。技术人员将轻易调整施用各致耐受载体和抗原的时间和剂量。

优选地，根据本发明的药物组合物是粘膜或皮内或上皮内的药物组合物。但是优选地，其是口服的药物组合物。

如文中使用的，“粘膜或皮内或上皮内的药物组合物”是用于粘膜或皮内或上皮内施用的药物组合物，这意味着其被配制用于这样的施用。

特别地，药物组合物可进一步包括用于粘膜或皮内或上皮内递送所述抗原和所述细菌的一个或多个适当的药物载体(或支持物)。

优选地，文中的“粘膜递送”选自鼻、口、舌下、气管、咽、支气管、食管、胃、十二指肠、小肠、直肠、包皮和阴道递送。“粘膜递送”是递送到粘膜表面，如鼻、口、舌下、气管、支气管、咽、食管、胃、和十二指肠、小和大肠的粘膜、包括直肠粘膜，以及包皮和阴道粘膜。在本上下文中，粘膜表面还包括眼睛的外表面，即，眼睛及其周围的粘膜。然而，优选地，粘膜表面是指阴道和消化道粘膜，更优选消化道粘膜。然而优选的是，粘膜递送是口服递送。

因而，药物组合物还可以包含一个或多个取决于施用途径的药物载体。药学领域的普通技术人员熟知，或能容易确定用于药物递送至粘膜表面的载体，或用于皮内或上皮内递送的载体。关于这方面，有用的参考是Chien(Novel Drug delivery system,第三章从6至9,Marcel Dekker,1992),Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,第六版(多位编辑,1989-1998,Marcel Dekker)；以及Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(ANSEL等人,1994,WILLIAMS&WILKINS)。

对于本发明中有用的药物递送的示例性方法和途径在以下简述。

至支气管、细支气管、气管、鼻、口、包皮或咽粘膜的施用可通过将药物组合物配制成吸入、喷雾等(例如，喷鼻、气雾喷雾或泵喷雾等)、溶液、凝胶等而获得。适用于将药物组合物递送至鼻粘膜、气管和支气管的喷雾器装置是本领域已知的，因此在这里将不进行详细说明。那么，药物组合物可包括选自溶液、乳液、微乳液、水包油型乳液、无水脂质和水包油型乳液、以及其它类型的乳液的载体。

至阴道粘膜的施用可通过将药物组合物配制成溶液、灌肠剂、泡沫、栓剂、阴道片剂或局部凝胶而获得。优选用于阴道递送的载体包括亲水的和疏水的载体，例如常用在配制乳液或凝胶制剂中的那些(例如，油/水乳液凝胶)。

至消化道粘膜的施用可通过将药物组合物配制成胶囊、微胶囊获得。用于消化道递送的优选载体对应着通常经口给药的胶囊和微胶囊(例如，果胶和/或藻酸盐的胶囊和微胶囊)，如通常用于配制消化道递送制剂的那些(例如，公开于国际专利申请WO 2007/140613中的微胶囊)。或者，可通过消化或施用适当的液体和/或食品，例如饮料、酸奶等获得消化道递送。

皮内或上皮内施用是技术人员公知的。例如可以使用针装置进行皮内施用(例如，注射)，例如专利US 6,933,319和国际专利申请WO 2004/101025中公开的，或者用适当的无针装置进行。

药物组合物可进一步包含至少一个吸收剂。“吸收剂”是本领域技术人员熟知的。例如，可以举例表面活性剂，例如山梨糖醇酐脂肪酸偏酯的聚氧乙烯衍生物(例如，

80、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯-9-月桂基醚和辛苯聚醇)、胆汁盐如甘氨胆酸钠、混合胶束、烯胺、一氧化氮供体(如，S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺、NOR1、NOR4-其优选与NO清除剂如羧基PITO或双氯芬酸钠联合施用)、水杨酸钠、乙酰乙酸的甘油酯(例如，甘油基-1，3-二乙酰乙酸酯或1,2–异亚丙基甘油-3-乙酰乙酸酯)、环糊精或β-环糊精衍生物(例如，2-羟丙基-β-环糊精和七(2,6-二-O-甲基-β-环糊精))、中链脂肪酸，如单-和二甘油酯(例如，椰子油的癸酸钠提取物，Capmul)、或甘油三酸酯(如，淀粉糊精、Estaram 299、Miglyol 810)、聚合物如羧甲基纤维素、卡波姆、聚卡波非、黄蓍胶和藻酸钠、以及其它适合于粘膜或皮内或上皮内的递送的吸收剂。关于已经成功用于粘膜或皮内或上皮内药物递送的吸收剂的一般原则的参考，参见Chien,Novel Drug Delivery SystemsCh.4(Marcel Dekker，1992)。

药物组合物可进一步包含一个或多个添加剂(例如，稀释剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂等)。一般地，参见，Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,第六版(多位编辑,1989-1998,Marcel Dekker)；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(ANSEL等人,1994,WILLIAMS&WILKINS)。

如以下公开的，将被施用于人受试者的根据本发明的药物组合物的适当剂量可以根据所述受试者的一个或多个特征确定，如性别、年龄、体重、健康等。

作为例子，当抗原是颗粒时，更特别地，当其是病毒颗粒时，可以每天向所述人施用大约10⁸至大约10¹⁴个病毒颗粒的剂量。作为另一个例子，可以每天向所述人施用大约10⁶至大约10¹⁶CFU的非致病活细菌的剂量。

本发明药物组合物的应用

本发明的一个目的是提供如上所述的药物组合物，作为药物，优选作为疫苗的用途。

本发明还涉及用于预防和/或治疗有需要的人中HIV疾病的方法，包括至少向所述人粘膜地或皮内地或上皮内地施用有效量的如上定义的药物组合物的步骤。

根据本发明，为了预防的目的，“有需要的人”可以是任何人，优选至少大约2岁的人。为了治疗的目的，“有需要的人”是由于他/她患有HIV疾病将被治疗的人。

“HIV疾病”指任何与HIV相关的免疫疾病，包括AIDS以及疾病进展的早期阶段，包括血清转化(慢性感染的建立)。

本发明进一步涉及保护人免受HIV的方法，包括至少向所述人粘膜地或皮内地或上皮内地施用有效量的如上定义的药物组合物的步骤。

特别地，如果粘膜地暴露于HIV，该方法能够保护人免受HIV感染，和/或如果静脉暴露于HIV，该方法能够保护人免于HIV复制。

本发明还进一步地涉及保护人免受HIV血清转化的方法，包括至少向所述人粘膜地或皮内地或上皮内地施用有效量的如上定义的药物组合物的步骤。从而，所述人将不会变成血清阳性，并不会表现出显著的HIV抗体水平。

术语“接种”指采取的预防和/或治疗人HIV疾病的行动(特别地，施用本发明的药物组合物)。优选地，本发明的药物组合物对于诱导和，优选地，维持人对含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原的免疫耐受是有用的，即，换言之，对接种(或“致耐受”)所述人是有用的。因而，使用本发明的药物接种人被认为是“致耐受接种”(或“耐受作用”或“耐受”)。

如果在粘膜或皮内或上皮内施用本发明的药物组合物后(即，在致耐受接种后)，在人中成功地诱导了免疫耐受，所述人被认为是“被接种的”(或“被耐受的”或“耐受的”)。对体内病毒感染挑战的反应，即，如通过“被接种”人的血浆病毒RNA载量所评估的病毒复制，与对照人(对其单独施用了抗原、或抗原与标准佐剂(如上定义的)、或没有施用药物组合物或安慰剂)血浆病毒RNA载量相比，降低了至少大约50％、更优选至少大约70％、然而更优选至少大约75％、或80％或85％或90％或95％或98％或99％，或甚至更多(99.5％、99.8％、99.9％、100％)。

根据本发明，致耐受接种可以包括一次或多次药物组合物的连续施用。优选地，致耐受接种可以包括至少两次或多次连续施用(即，接种)，更优选地，两次以上连续施用所述组合物。

有利地，连续致耐受接种之间的间隔是1分钟到3个月之间，优选15分钟到2个月之间。

但是，有利地，本发明的致耐受接种还可以包括第一次粘膜或皮内或上皮内的致耐受接种之后一年或多年，再次致耐受接种(例如1到10年)。

第一次粘膜或皮内或上皮内的致耐受接种之后新的致耐受接种可以选自粘膜、皮内和上皮内的致耐受接种。明显的，如果新的致耐受接种是上皮内或皮内注射，那么特异性全身体液和/或细胞毒(产生γ干扰素)反应是可检测的，但是对疾病的预防或治疗没有作用。

根据本发明，药物组合物的有效量施用至有需要的人。术语“有效量”指足以实现所需生物效果的量，此处的生物效果是通过诱导免疫耐受，优选“Ts”免疫耐受的治愈或保护作用(换言之，免疫保护效果)。可理解有效剂量将取决于将被治疗的受试者的年龄、性别、健康和体重、如有的话，同时治疗的种类、治疗的频率和预期效果的性质。以下提供的有效剂量的范围没有意图限制发明，代表优选的剂量范围。但是，如本领域技术人员理解的且能够确定的，可调整优选剂量以适应受试者，这不需要过度(undue)实验。参见，例如，Ebadi,Pharmacology,Little,Brown and Co.,Boston,Mass.(1985)。

例如，关于HIV，对于成年人的典型剂量是每剂量大约10⁶-10¹²HIV病毒颗粒(即，VLP，重组或非重组病毒颗粒)，优选10⁸-10¹⁰。当然，无论使用多少剂量，其应当是被已知的方法确定为安全有效的量，如本文所述。

而且，本领域技术人员还能够根据他/她的一般知识确定为了实现所需的生物效果，将被施用于人的致耐受载体的有效量。

作为例子，所述致病细菌(例如BCG)的减毒衍生物的有效量是每剂量10⁴至10¹²的范围，优选10⁵至10¹⁰CFU(克隆形成单元)，更优选10⁶至10⁸CFU。作为其它的例子，所述致病细菌或失活的致病细菌(例如BCG)的减毒衍生物的有效量是每剂量0.001mg至1g的范围，优选0.01至100mg，更优选0.1至10mg。

作为其它的例子，所述非致病细菌(例如乳杆菌属)的有效量是每剂量大约10⁶-10¹⁴CFU的范围，更优选大约10¹⁰-10¹²CFU。

如上所述，本发明的药物组合物适于预防人将来的HIV疾病，或治疗已患HIV疾病的人。

对于治疗的目的，如上定义的“抗原，含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol”，可以是自体同源的，也就是说，其可以衍生自感染将被治疗的人的HIV病毒。在这种情况中，例如，HIV病毒可以分离自人，然后，可以培养病毒并使其失活(优选至少失活两次)，最后与致耐受载体结合从而获得如上所述的药物组合物。

然而，例如，含有自体同源或非自体同源的含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的抗原的药物组合物可以在常规的抗病毒治疗期间施用给人，其将首先导致检测不到的病毒载量。然后，只要通过自体同源病毒特异性CD8细胞实现了非自体同源急性感染的CD4细胞的适当离体病毒复制抑制，或者只要实现了由CD8 T细胞诱导的CD4 T细胞激活的适当抑制，就在一次或多次使用药物组合物的致耐受接种后，停止常规抗病毒治疗。

特别地，为了治疗目的，药物组合物可以在被治疗人的生命期间仅施用一次。或者，其可以在被治疗人的生命期间施用两次或多次，在同一天或者隔开一定期间的不同天，所述期间的范围例如从大约1天到大约1年，或更长。更特别地，其可以每天或定期地施用，期间的范围例如从大约1天到大约1年，或更长。如果有必要，药物组合物可以在被治疗的人的终生施用。

本发明进一步提供了用于体外确定人是否被保护免受HIV病毒的方法，包括：

a)从所述被接种人的血液样品中分离外周血CD8 T细胞；

b)在适当的条件下培养：

(i)所述分离的CD8 T细胞和同种异体或自体同源的CD4+T细胞，CD4+T细胞在体外急性地被与所述HIV病毒等同的病毒株感染；和

(ii)所述体外急性感染的同种异体或自体同源的CD4+T细胞；

c)回收培养上清；

d)测量所述上清中的病毒载量；和

e)确定所述人是否被保护免受所述HIV病毒。

通过“等同于待测试HIV病毒的病毒株”，其意味着所述病毒株源于野生病毒，并具有与待测试HIV病毒相似的本质特征(例如，可以例举源于个体HIV-1的病毒株HTLVIIIB：HTLVIIIB可被认为是“等同于HIV-1的病毒株”)。优选地，所述病毒株源自是待测试HIV病毒的野生病毒。因而，所述病毒株代表了研究包括HIV病毒，特别是野生HIV病毒的适当模型。当然，病毒株被很好地调整以适应这样的研究，特别是在安全性方面。

以上所有的步骤能够使用本领域技术人员熟知的标准技术进行。特别是，对于步骤b)的适当培养条件是本发明领域中普通知识的一部分(如以下实施例中描述的常规方法)。

通过如以下实施例中描述的那些常规方法能测量步骤d)中的病毒载量。

从根据亚步骤b)(ii)的所述体外急性感染的同种异体或自体同源的CD4+T细胞培养物回收的上清中的病毒载量将被用作步骤e)中的确定的参照。通过例如比较仅含有来自体外急性感染的同种异体或自体同源的CD4+T细胞的一式两份(或一式三份或一式四份或更多)的孔的上清中的病毒浓度的几何平均值，与含有CD8 T细胞和来自体外急性感染的同种异体或自体同源的CD4+T细胞的一式两份(或一式三份或一式四份或更多)的孔的上清中的病毒浓度的几何平均值，将有利地计算“抑制百分比(％)”或“抑制率”或“抗病毒效果”。

那么，步骤e)中的所述确定优选如下进行：

-如果抑制率高于大约100，可以得出结论所述人是被保护的。典型地，这将是如下情况：如果HIV非感染的人被施用了有效的预防性抗病毒治疗，或者如果HIV感染的人被施用了有效的治疗性治疗，所述有效的预防性或治疗性治疗包含优选根据本发明的药物组合物，因而，只要其仍然被保护，则没有必要进一步向人施用任何预防性或治疗性治疗。

-如果抑制率低于大约100，可以得出结论所述人没有被保护免受所述病毒。那么，人，HIV非感染的人或HIV感染的人，将有利地分别被施用包含根据本发明的药物组合物的预防性或治疗性治疗，而且，以适当的时间间隔，将进行一次或多次以上的体外方法，来确保人成为被保护的。

而且，本发明提供了用于体外确定人是否被保护免受HIV病毒的试剂盒，其包含能够被病毒株感染的同种异体或自体同源的CD4+T细胞，所述病毒株如上所定义的，等同于待测试所述HIV病毒。试剂盒还可以含有适当浓度的足够的病毒株，以感染上述同种异体或自体同源的CD4+T细胞，和/或适当的试剂和/或对照和/或介质(如用于细胞悬浮、细胞培养、细胞储存等的介质)。本发明的试剂盒可特异于HIV病毒特定型，或者其可被调整以适用于病毒的多种型，所述病毒的型是接近的(特别是，系统发生上接近的)。

可以容易地调整本发明以适用于预防和/或治疗任何慢性感染疾病。这样的疾病的非限制的例子是：B和C型肝炎、人乳头瘤病毒(HPV)、EBV和其它疱疹病毒、肺结核、麻风、利什曼病等等。

全局地，每一次当与上述感染或疾病相关的一个或几个致病抗原参与CD4+T细胞(所述CD4+T细胞提呈衍生自上述致病蛋白或肽的表位)特异性激活时，非细胞毒性CD8+T细胞(所述CD8+T细胞由粘膜或上皮内或皮内的结合上述抗原和文中所述致耐受载体的药物组合物产生)能够引起对CD4+T细胞激活的特异性抑制/防止。

文中表明使用本发明的药物组合物能够预防和/或治疗哺乳动物/人中的病毒感染和相关疾病。根据这一教导，有可能提供其它的药物组合物，其包含：(i)如文中公开的致耐受载体；和(ii)任何来自病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫来源的抗原。这样的药物组合物被配制用于适当的递送(优选，粘膜或皮内或上皮内)所述致耐受载体和所述抗原。其对于预防和/或治疗由抗原所衍生自的病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫所引起的哺乳动物中的慢性感染是有用的。一个例子是细菌药物组合物，其包含(i)如文中所述的致耐受载体；和(ii)衍生自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的抗原。该细菌药物组合物被配制用于适当的递送(优选，粘膜或皮内或上皮内)所述抗原和所述致耐受载体。特别感兴趣地，用于预防和/或治疗人结核的是这样的细菌药物组合物，其中分枝杆菌抗原衍生自Koch氏杆菌。

通过本发明的药物组合物实现的免疫保护

耐受是免疫系统的一种生理能力，以识别通过粘膜系统进入的抗原，以及产生对再次遭遇相同抗原的无反应性(anergy)(一般地与其它免疫修饰相关)。经常表明耐受诱发粘膜抗原的粘膜sIgA容许的抗体遏制，而不刺激全身免疫区域。TGF-β，一种调节性细胞因子，有时也参与耐受的产生。也经常表明CD25+调节性T细胞的活性抑制作为粘膜耐受的潜在机制(Faria和Weiner,2005；Mestecky等人2007)。但是，在本发明描述的药物组合物诱导的免疫耐受中没有观察到这些免疫修饰，其主要特征在于抑制提呈病毒表位抗原的CD4+T细胞的激活的CD8+T细胞活性，该免疫反应类型迄今没有认识到，更特别地，其是一种全新类型的免疫耐受。

表述“耐受”、“免疫学耐受”、“免疫耐受”、“对病毒的免疫耐受”、“新型病毒特异性耐受”、“对病毒抗原的免疫耐受”、“对病毒免疫原的免疫耐受”和““Ts”免疫耐受”是同义的。发明人已经表明这对应着猕猴中活跃诱导的强的非细胞毒性、MHC-1b/E限制的CD8+T细胞反应，其抑制HIV Gag和/或Pol抗原提呈CD4+T细胞的早期激活，且与CD4+T细胞增殖的缺失相关，以及当失活的SIV抗原刺激时没有CD8+T细胞分泌的γ干扰素，并且没有全身抗SIVIgM和IgG抗体的产生。而且，发明人能表明TCRγδ和Vβ8不参与病毒复制的CD8+T细胞抑制，表明了TCRαβ应当在识别感染的CD4+T细胞上MHC-1b/E肽提呈中起主要作用。

尤其，当用包含含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原的常规预防性疫苗组合物和标准的或常规的佐剂(即，目的是刺激和/或有助于和/或增加与抗原相关的免疫反应的物理、化学或生物佐剂的任何形式，如S.Plotkin等人在"Vaccines"中标题为"Adjuvants"章中描述的)接种时，可观察到“通常的对衍生自病毒的抗原的免疫反应”。该“通常的对衍生自病毒的抗原的免疫反应”包括体液的、细胞的、或体液和细胞的免疫反应，其通常的特征为：

(i)在特异性体外刺激下，病毒特异性CD4细胞增殖；和/或

(ii)通过产生抗病毒抗原蛋白和/或肽的全身抗体诱导特异性全身体液反应；和/或

(iii)诱导与CD8T细胞产生γ干扰素相关的特异性细胞反应，和/或

(iv)没有非细胞毒性的、抑制HIV Gag和/或Pol抗原提呈CD4+T细胞激活的CD8+T细胞反应。

相反，如本发明提供的，包含含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原和致耐受载体的药物组合物产生“对病毒的免疫耐受”，且，更特别地，产生““Ts”免疫耐受”，在以下关于猕猴中SIV的实施例中确定了其特征在于：

(i)在特异性体外刺激下，没有病毒特异性CD4细胞增殖；和

(ii)没有任何显著的全身体液反应，也就是说，通过经典临床实验室方法如ELISA，没有检测到特异性可检测的全身抗体反应，或者如果检测到全身抗体，其对SIV病毒感染也没有保护性；和

(iii)在足够的体外刺激下，没有与产生γ干扰素相关的任何细胞毒性CD8+T细胞反应(例如，由ELIspot可检测的)，或者如果检测到细胞毒性CD8 T细胞反应，其对SIV病毒感染也没有保护性；和

(iv)作为一个重要特征，活跃诱导的强的非细胞毒性、非CD25 MHC-1b/E限制的CD8+T细胞反应，抑制SIV抗原提呈CD4+T细胞的早期激活。

如上所述，本发明的药物组合物包含致耐受载体和抗原，所述抗原含有，或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol。实际上，结合至病毒抗原的致耐受载体诱导人中病毒特异性免疫耐受的状态，而不激发如上定义的通常的免疫反应。因而，通过粘膜或皮内或上皮内途径施用的抗原，单独或与标准佐剂联合，一般能够激发通常的免疫反应，然而，其与如本发明的药物组合物中的致耐受载体联合则不同。在这些特定的情况中，本发明药物组合物中致耐受载体/抗原的联合诱导了如上定义的免疫耐受。这意味着免疫耐受仅能通过施用(通过粘膜或皮内或上皮内途径)适当的致耐受载体和抗原(含有，或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol)的混合物实现。如果向人施用一种而没有另一种，那么人将不被“接种”或“被耐受”。

如以下的实施例所示(使用猕猴模型中的SIV)，通过施用根据本发明的药物组合物诱导的或实现的免疫耐受(也称为“Ts”免疫耐受)特征在于抑制SIV Gag和/或Pol抗原提呈CD4+T细胞激活(特别是早期激活)的CD8+T细胞反应(特别是非细胞毒性的和/或MHC-1b/E限制的)；以及有利地，特征在于一个或多个：1)没有CD4+T细胞的增殖；2)在SIV抗原刺激下没有显著的CD8+T细胞分泌的γ干扰素；和3)没有显著产生全身抗SIV IgM和IgG抗体。

通过术语“在HIV或SIV抗原刺激下没有显著的CD8+T细胞分泌的γ干扰素”，文中这意味着在HIV或SIV抗原刺激下观察到的CD8+T细胞分泌的γ干扰素水平是0或弱的。在HIV或SIV抗原刺激下CD8+T细胞分泌γ干扰素是“弱的”典型地指每2×10⁵个PBMC少于大约80SFC。

通过术语“没有显著产生全身抗HIV或抗SIV IgM和IgG抗体”，文中意味着观察到的全身抗HIV或抗SIV IgM和IgG抗体产生水平是0或弱的。全身抗HIV或抗SIV抗体产生是“弱的”典型地指抗HIV或抗SIV滴度是大约300或更少。

因而，根据本发明的药物组合物诱导，优选地维持人中对HIV的抗原特异性免疫保护，其中所述免疫保护优选特征在于：

-与适当的实验对照相比，所述人中HIV病毒载量降低，优选抑制；和/或

-与适当的实验对照相比，所述人中抑制HIV Gag和/或Pol抗原提呈CD4+T细胞激活的CD8+T细胞。

有利地，通过体外检测来自所述人的CD8+调节性T细胞的存在或活性，确定所述人中的所述免疫保护。可通过标准的体外技术，例如在以下实施例中描述的那些，进行这种检测。

以上引用的所有专利、专利申请和出版物在文中并入作参考。

实施例

部分A-通用的材料和方法

A-I动物。依据国立健康研究所(National Institutes of Health)的“Guide forthe Care and Use of Laboratory Animals”条例饲养群养的中国恒河猴普通猕猴(Macaca mulatta)。所有动物健康良好，2-4岁，体重4-6kg，是SIV、SRV、猴T细胞嗜淋巴细胞病毒1、B型肝炎病毒、和B病毒血清阴性。在进入时对所有动物进行X射线和皮肤试验(PPD)，以排除潜在的结核携带者。

A-II I类MHC分型。如之前所述的(Muhl等人,2002；Loffredo等人,2007)，使用对代表性Mamu-A和Mamu-B序列的序列特异性引物(SSP)PCR分析在外周血单核细胞(PBMC)样品中对恒河猴典型I类MHC等位基因进行基因分型。

A-III抗原病毒的制备。

III-1.在用SIVmac239(P.A.Marx馈赠)接种的CEM174细胞上进行SIV生产。收集培养物上清挑选病毒产生。

III-2. AT-2失活的SIVmac239：SIVmac239由250μM aldrithiol(AT-)(Sigma)失活2小时，通过超离心洗涤3次。AT2失活的病毒以10⁹病毒颗粒的最终剂量用于每次施用(即，接种)。

III-3.热失活的SIVmac239：SIVmac239在56℃下失活30分钟。热失活的病毒以10⁹病毒颗粒的最终剂量用于每次施用。

III-4. AT-2热失活的SIVmac239：SIVmac239由250μM aldrithiol(AT-2)(Sigma)失活2小时，通过超离心洗涤3次。然后，病毒接受56℃温度下30分钟。失活的病毒以10⁹病毒颗粒的最终剂量用于每次施用。

III-5.将失活的病毒制剂接种于CEM174细胞，以证实病毒感染性的100％抑制。

A-IV对SIV的抗体反应的分析。通过免疫荧光抗体(IFA)分析(Mederle等人，2003)滴定血浆中的抗SIV IgG、IgM和IgA抗体。简言之，在37℃下，2倍系列稀释的测试血浆和SIV感染的CEM174细胞粘附的玻片孵育30分钟。用Hanks洗涤后，加入FITC-缀合的山羊抗猕猴IgG(Sigma)、IgM(ADI,San Antonio,Texas)、或IgA(ADI)，再持续30分钟(于37℃)。抗体滴度确定为达到阳性免疫荧光染色的最高稀释的倒数。IFA分析的灵敏度对于IgG是20滴度，对于IgM和IgA是5滴度。当血浆样品的IFA是阴性时(在分析的灵敏度以下)，为了有助于数据分析，值被指定为1。

如之前所述(Tsai等人,1993)，通过用胃滴入导管、用PBS冲洗直肠来收集粘膜分泌物。简言之，向样品中加入胰蛋白酶抑制剂(10μg/ml)和EDTA(5×10-4M)(Sigma)，然后在10000×g下，在4℃离心10分钟。收集上清，并补充苯甲基磺酰氟(10-3M)和叠氮化钠(0.01％)(Sigma)。将样品储存于-80℃，直至使用。通过上述的IFA分析检测直肠中的抗SIVIgA滴度。

A-V流式细胞术。用FACScalibur(BD Biosciences,San Jose,California)，使用抗如下的荧光标记的单克隆抗体进行流式细胞分析：CD3-PE-Cy7(克隆SP34-2)、CD4-PE(克隆MT477)、CD8-PerCP(克隆RPA-T8)和兔抗小鼠-APC二抗(BDBiosciences)。Ki-67-PE(BDBiosciences)和FITC缀合的抗P27单克隆抗体(Fitzgerald,Concord,MA)或偶联有APC-SAv(BD Biosciences)的生物素缀合的抗P27单克隆抗体(Fitzgerald)用于透化后的细胞内染色。

抗TCRγδ(克隆B1)、Vβ8、和CD抗原(CD7、CD16、CD28、CD62L、CD95、CD122、CD137、CD150、CD183、CD184、CD195、CD196、CD197、CD226、CD272和CD305)的PE缀合的单克隆抗体购自BD Biosciences；抗CD抗原(CD11a、CD25、CD27、CD39、CD101、CD129、CD215、CD277和CD357)的PE缀合的单克隆抗体购自BioLegend(San Diego,CA,USA)；和抗CD抗原(CD127、CD247和CD279)的PE缀合的单克隆抗体购自eBioscience(San Diego,CA,USA)。

A-VI细胞增殖。如之前所述(Lu等人2003)获得PBMC。通过羧基荧光素二乙酸酯、琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记分析(Molecular Probes,Eugene,Oregon)，根据厂商的说明书评估SIV特异性CD4+或CD8+T细胞的增殖。用3μM CFSE在37℃下染色PBMC 15分钟。洗涤后，用10μg/ml重组SIV核心蛋白P27(ImmunoDiagnostics,Wobun,MA)、2μg/ml SIV gag 15-mer肽(GLS,中国上海)、10⁹/ml AT-2失活的SIV或单独的介质对CFSE标记的细胞刺激5天。用抗CD3和抗CD4或抗CD8抗体标记后，在1％多聚甲醛中固定PBMC，用于流式细胞术。

A-VII细胞激活。通过磁珠去除(或没有去除)CD8或CD25的新鲜PBMC被AT-2处理的SIVmac239以10¹⁰/ml的病毒浓度单轮感染2小时。用金黄色葡萄球菌肠毒素B(2.5μg/ml)和抗CD3(2.5μg/ml)/抗CD28(2.5μg/ml)抗体过夜刺激感染的细胞。刺激后48小时进行SIVP27和Ki-67的细胞内染色，以确定感染的(P27+)CD4+细胞内激活(Ki-67+)的百分比。

A-VIII ELISPOT分析。使用商售的试剂盒(Cell Sciences,Canton,MA)，在存在或不存在P27或AT-2失活的SIV时，在未培养的PBMC中进行恒河猴IFN-γ和IL-10 ELISPOT分析。TGF-b1 ELISPOT试剂盒购自R&D Systems(Minneapolis,MN)。用自动ELISPOT阅读器(AID,GmbH,Straβberg,Germany)读取数据。通过减去介质单独存在时的非特异性SPC，计算SIV特异性点形成细胞(SFC)的数目。

A-IX抗病毒分析。在存在或不存在磁性纯化的CD8+T细胞时，以1:2的CD4/CD8的比，用SIVmac239(10^-3MOI)急性感染磁阳性标记(MicroBeads,Miltenyi Biotec)纯化的来自每一动物的自体同源CD4+T细胞，然后用SEB(Sigma)刺激16小时。洗涤后，在每孔最终体积200μl的含有100IU人rIL2的RPMI 1640介质(Invitrogen,中国上海)中，在96孔板上在存在5％CO₂时，在37℃下一式四份培养细胞5天。在第3天，用一半的新鲜介质替换细胞培养物一次。在第5天收集的培养物上清用于通过实时RT-PCR测量病毒载量(如以下)。通过比较来自仅含有CD4+感染细胞的一式两份孔的培养物上清中病毒浓度的几何平均值，与来自含有混合的CD8+和CD4+细胞的一式四份孔的上清中病毒浓度的几何平均值，计算抑制百分比(％)。为了确定病毒抑制与HLA限制之间的相关性，CD4+T细胞也与同种异体的CD8+T细胞共培养。

A-X病毒载量的测量。使用对SIVmac239和SIVmac251特异优化的引物(正义，SEQID No.1:5'-GAGGAAAAGAAATTTGGAGCAGAA-3'；反义，SEQ ID No.2:5'-GCTTGATGGTCTCCCACACAA-3')和探针(SEQ ID No.3:5'-FAM-AAAGTTGCACCCCCTATGACATTAATCAGATGTTA-TAMRA-3')，通过实时RT-PCR或PCR定量血浆中SIV RAN或细胞相关的SIV DNA。

A-XI SIV特异抑制的T细胞分析。根据厂商(Miltenyi Biotec)提供的方案，通过磁珠缀合的抗CD8或抗CD25抗体去除(或没有去除)CD8或CD25的新鲜PBMC，被SIVmac239在0.5感染复数(MOI)下感染2小时。用金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)(2.5μg/ml)(Sigma)和抗CD3(2.5μg/ml)/抗CD28(2.5μg/ml)抗体(BD Biosciences)过夜处理感染的细胞。在体外刺激后48小时进行SIV P27和Ki-67的同时细胞内染色，以确定感染的(P27+)细胞群内T细胞激活(Ki-67+)的百分比(％)。

A-XII病毒挑战。

XII-1.在用SIVmac239(P.A.Marx馈赠)接种的猕猴PBMC上进行SIV生产。收集培养物上清挑选病毒产生。

XII-2.直肠内挑战(IRC)：在接种后，动物直肠内接种(重复)5000MID 100，即，5×10⁵TCID50的致病SIVmac239。这种感染的剂量通常导致中国恒河猴100％的全身感染，在第10至14天之间具有血浆病毒载量峰值(10⁶-10⁷拷贝/ml)。一个月每两周、之后每一个月临床和生物学地评估所有SIV挑战的动物。

XII-3.静脉内挑战(IVC)：在接种后，动物静脉内接种(重复)5MID 100，即，500TCID50(在CEM174细胞系中滴定)的致病SIVmac239(来自Aaron Diamond AIDSResearch Center,New York,USA的P.A.Marx博士的馈赠)。感染的剂量通常导致中国恒河猴100％的全身感染，在第10至14天之间具有血浆病毒载量峰值(10⁶-10⁷拷贝/ml)。一个月每两周、之后每一个月临床和生物学地评估所有SIV挑战的动物。

A-XIII统计学分析。在免疫之前和之后，分别通过Mann-Whitney或Wilcoxon检验比较不同组动物间不成对的数据或成对的数据。

部分B-特异性材料和方法

B-I-BCG用作致耐受载体

B-I-I BCG的制备

I-1.活BCG：在哥本哈根的Statens Serum Institut制备的活BCG(SSI 1331株)购自Laboratories Sanofi-Pasteur Merck,Sharp and Dome(无对应中译文)(SPMSD)，并以最终浓度5×10⁶cfu用于肠内或阴道内施用，或以最终浓度5×10⁵cfu用于每次皮内加强施用。

I-2.扩展冷冻干燥(EFD)失活的BCG：在小于20μm Hg的真空下通过5天的扩展冷冻干燥(EFD)杀死活的SSI 133BCG株，以对应着每次肠内或阴道内施用5×10⁶cfu或每次皮内施用5×10⁵cfu的最终剂量使用。

I-3.热失活BCG：在115℃下，在硼酸盐缓冲液中高压灭菌活的SSI 133BCG株15分钟，以对应着每次肠内或阴道内施用5×10⁶cfu或每次皮内施用5×10⁵的最终剂量使用。

B-I-II药物组合物

使用含有SIV抗原和致耐受载体之一的RPMI 1640(Invitrogen中国上海)新鲜制备组合物。

B-I-III动物免疫

在免疫时，用盐酸替来他明和唑拉西泮(0.7mg/kg)肌肉内注射麻醉动物。

III-1.阴道内免疫(IVI)：在麻醉下通过阴道内注射1毫升药物组合物或作为对照的以上公开的一种致耐受载体，免疫雌性动物4小时。在第8周在相同的位点以相同的剂量给予药物组合物或致耐受载体的加强免疫。在第一次免疫后每两周临床和生物学地评估所有动物。

III-2.口服(胃内)免疫(IGI)：在摄入药物组合物或一种如上公开的作为对照的致耐受载体之前，在麻醉下向雄性或雌性动物胃内施用15分钟15ml 0.1M碳酸氢钠。在施用后立即给予另外15ml碳酸氢钠溶液。以一个月的间隔向每只动物重复两次与初次相同的致耐受接种。第一次免疫后每两周临床和生物学地评估所有动物。

III-3.皮内加强免疫(IDI)：第一次免疫后的第90天，在麻醉下给予雌性阴道内免疫的动物(参见上述IVI部分)0.1ml药物组合物的皮内加强，所述药物组合物含有10⁹拷贝的AT-2失活SIV和5×10⁵cfu的活BCG。在第一次免疫后每两周临床和生物学地评估所有动物。

B-I-IV抗病毒分析.对应着直肠内挑战后无菌免疫的阈值是至少20。

B-II-植物乳杆菌用作致耐受载体

B-II-I细菌制备(致耐受载体的制备)。在37℃下、在MRS介质上以200rpm的转速培养植物乳杆菌(LP)(ATCC8014)。为获得细菌培养对数(对数中间)期的LP，培养细菌直至600nm下的光密度达到1.0，最终LP浓度大约10¹⁰cfu/ml(在大约3.5小时获得)。

B-II-II由口服(胃内)递送的动物免疫。动物过夜禁食(没有早餐)。在口服施用时，用盐酸替来他明和唑拉西泮(0.7mg/kg)肌肉内注射麻醉动物。

免疫No.1：8只动物胃内施用30ml病毒-细菌制成的制剂，其含有4×10⁷拷贝/mlDI-SIV和麦芽糊精(20％)溶液中的3×10⁹cfu/ml活的LP。在该第一次免疫后，猴子每30分钟接受胃内25ml相同的病毒-细菌制剂(即，药物组合物)，持续3小时。该口服递送方案在5个连续的工作日进行5次。作为对照，4只动物被施用单独的活LP，其它3只平行地仅接受两次失活SIV。

免疫No.2:12只动物(iSIV/LP#9-20)胃内施用30ml 4×10⁷拷贝/ml iSIV(AT-2/热失活SIVmac239)制剂和麦芽糊精(20％)溶液中的3×10⁹cfu/ml活的LP。然后，在5个连续的工作日，动物每30分钟接受25ml相同的制剂，持续3小时(6次)。六只动物(LP#5-10)胃内施用30ml麦芽糊精(20％)溶液中的3×10⁹cfu/ml活的LP。然后，在5个连续的工作日，动物每30分钟接受25ml相同的制剂，持续3小时(6次)。最后，另外6只动物(iSIV#5-10)胃内施用30ml 4×10⁷拷贝/ml的单独的iSIV制剂。然后，在5个连续的工作日，动物每30分钟接受25ml相同的制剂，持续3小时(6次)。

B-II-III去除体内CD8⁺T细胞。首先麻醉猕猴，然后，如之前所述(Schmitz等人，1999)，在第0、4、7天给予静脉内注射5mg/kg的嵌合抗CD8单克隆抗体(cMT-807,CentocorResearch&Development,Inc.,Malvern,Pennsylvania,USA)。在第0天以及抗体注射后的各时间点从每个动物采取外周血样品(5ml)。

B-II-IV抗病毒分析。对应于直肠内挑战后的无菌免疫的阈值是至少100。

B-II-V CD8+细胞SIV抑制分析。存在或不存在磁纯化的CD8⁺T细胞时，以1:3的CD4/CD8的比，用SIVmac239(10^-3感染复数)急性感染磁阳性标记(MicroBeads,MiltenyiBiotec)纯化的来自每一动物的自体同源CD4⁺T细胞，然后用SEB和抗CD3/抗CD28抗体刺激16小时。洗涤后，在96孔板上一式四份培养细胞。在每孔最终体积200μl的含有100IU人rIL2(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)的RPMI 1640介质中，培养物维持5天。在第5天收集的培养物上清用于通过实时RT-PCR测量病毒载量(见以下)。如以下计算抑制倍数：来自仅感染CD4+靶细胞的培养物上清中病毒浓度的几何平均值/来自混合的CD8+和CD4+T细胞上清中病毒浓度的几何平均值)。

在一些实验中，通过使用Multiwell Insert System(BD Biosciences)没有细胞-细胞接触地培养CD8+和CD4+T细胞(CD8在插入孔，而CD4在底部的孔)；CD4+T细胞与同种异体的CD8+T细胞共培养，以便确定病毒抑制和MHC限制之间的相关性；CD8+和CD4+T细胞也在抗MHC-ABC(BioLegend)或抗MHC-E(Cell Science)抗体存在时共培养，以定义MHC限制的模式。为了定义与抗病毒活性相关的CD8+T细胞亚群(subset)，使用通过LD柱(MiltenyiBiotec)的抗PE微珠，用PE缀合抗TCRγδ、抗Vβ8或其它抗CD抗原抗体进行去除后，立即从PBMC纯化CD8+T细胞。

B-II-VI SIV特异性CD8+T细胞的细胞毒性分析。纯化的CD8+T细胞(效应细胞)和用10²AT-2处理的SIVmac239脉冲的纯化的CD4+T细胞(靶细胞)在37℃下用40nM 3,3'二己氧基羰花青(DiOC₆)(Marchetti等人，1996)(Molecular Probes)标记10分钟。靶细胞在冰上用PerCP-Cy5缀合的抗CD4(BD Bioscience)标记20分钟。洗涤3次后，在U底96孔板中以不同的E/T比(3:1,1:1,0.3:1)一式三份地混合效应细胞和靶细胞。来自4个健康供体的具有APC缀合的抗CD32(BD Bioscience)和纯化的CD56⁺(NK)细胞(效应物)被纳入用作分析的对照。在SEB和抗CD3/抗CD28存在时，在37℃下孵育4小时后，收获细胞，并由流式细胞术分析。如下计算细胞毒性百分比：100×(％总凋亡靶细胞-％自发凋亡的靶细胞)/(100-％自发凋亡的靶细胞)。

B-II-VII病毒的挑战。

首次研究：在第一批实验中(免疫No.1)，口服施用疫苗或对照后4个月，8只免疫动物和其7只对照直肠内接种2500MID₁₀₀(100.000TCID₅₀)的致病SIVmac239。两个月之后，4只接种的和已经被保护的猴子通过直肠内途径再次挑战(100.000TCID₅₀)，而另外4只被保护的猴子用5MID₁₀₀(200TCID₅₀)SIVmac239静脉内再次挑战。作为对照，2只猴子接受直肠内挑战，另外2只接受静脉内挑战。这些感染的剂量通常在第10至14天之间导致100％中国恒河猴的全身感染，血浆病毒载量达到峰值(10⁷-10⁹vp/ml)。

第二次研究(免疫No.2)：在第二组研究中在免疫后第420天，16只动物(用iSIV和LP免疫的8只猴子)和8只对照(4只iSIV和4只LP)用100,000TCID₅₀的SIVmac239直肠内挑战。

部分C-结果

C-I BCG是致耐受载体

C-I-I阴道内施用后对静脉内SIVmac239挑战的保护：

六只动物(组合物_1、2、3、4、5和6)阴道内施用1毫升含有作为抗原的AT2失活的病毒和活BCG的致耐受组合物。在第8周在相同位点用相同的致耐受组合物给予加强施用。

同时地，5只其它的动物(对照_1、2、3、4和5)阴道内给予1毫升仅含活BCG的组合物。也在第8周在相同的位点用相同的组合物给予加强施用。

初次施用后4个月，所有11只动物(组合物_1-6和对照_1-5)被静脉内病毒接种挑战。

常规地在处理动物的血浆中测量病毒载量。

图1表明在接受组合物(组合物_1-6)的动物中和在对照动物(对照_1-5)中，在单次静脉内病毒挑战后，病毒载量(血浆SIV RNA拷贝/ml)作为时间(天)的函数。

结果表明，在静脉内病毒挑战后，5只对照动物(对照_1-5)表现典型的原发感染，如预期地，在挑战后10-14天之间具有血浆病毒载量峰值(10⁶-10⁷拷贝/ml)。该对照动物组的血浆病毒载量经过病毒挑战后60天以及其后仍持续高(>10⁵vp/ml)。

相反地，阴道内接受由AT-2失活的SIVmac239和BCG制成的致耐受组合物的4/6的动物表现非常低的血浆病毒载量峰值(在10-14天之间，<1000vp/ml)，其很快变得不可检测(<10vp/ml)(病毒挑战后1个月)。在第60天，具有高血浆病毒载量峰值(>10⁶拷贝/ml)的2只动物比对照组(>10⁵拷贝/ml)具有较低的定点(set-point)病毒载量水平(<1000拷贝/ml)。

C-I-II-阴道内施用组合物后对直肠内SIVmac239挑战的保护：

七只动物(组合物_7、8、9、10、11、12和13)阴道内施用1毫升含有作为抗原的AT2失活的病毒和作为致耐受载体的活BCG的组合物。在第8周在相同的位点用相同的组合物给予加强施用。

同时地，5只其它的动物(对照_6、7、8、9和10)阴道内给予1毫升仅含活BCG的组合物。也在第8周相同的位点用相同的组合物给予加强施用。

初次施用后4个月，所有12只动物(组合物_7-13和对照_6-10)通过直肠内病毒接种被SIVmac239挑战。

在处理的和对照动物的血浆中常规地测量病毒载量。

图2表明在直肠内病毒挑战后，在接受组合物(组合物_7-13)的动物中和在对照动物(对照_6-10)中，病毒载量(血浆SIV RNA拷贝/ml)作为时间(天)的函数。

结果表明，在直肠内病毒挑战后，接受单独的活BCG阴道内施用的5只动物(对照_6-10)表现典型的原发感染，如预期地，在挑战后10-14天之间具有血浆病毒载量峰值(10⁶-10⁷vp/ml)。该对照动物组的血浆定点病毒载量经过病毒挑战后60天仍持续高(>10⁵拷贝/ml)。

相反地，阴道内接受AT-2失活的SIVmac239和活BCG的4/7的动物在挑战后的60天期间令人惊奇地表现出检测不到病毒载量水平(＜10拷贝/ml)。3只其它的动物表现出典型的原发感染，在挑战后10-14天之间具有血浆病毒载量峰值。但是，其定点病毒载量(10³-10⁵拷贝/ml)显著低于对照动物的水平(>10⁵)。

C-I-III-阴道内施用药物组合物后对重复静脉内或直肠内SIVmac239挑战的保 护：

两及八个月后，静脉内挑战后具有不能检测到的病毒载量的3只动物(组合物_1、_2、和_3)接受相同剂量病毒接种物的第二和第三次静脉内挑战。

该组猴子的第二和第三次静脉内病毒挑战后，在第10天观察到相似的低的血浆病毒载量峰值。但是，到病毒挑战后30天，病毒载量再次变成不可检测(图3)。

组合物初始施用后的16和23个月，一共已经有3次静脉内挑战的3只动物(组合物_1、_2、和_3)再一次被直肠内接种挑战。

如预期地，在2次连续的直肠内病毒挑战后，这3只动物(其初始接受阴道内AT-2-失活SIVmac239加BCG)再次表现出检测不到的(<10拷贝/ml)血浆病毒载量(图3)。

这些结果确立，抑制病毒复制的效率是稳定的，理由是该抑制在初始组合物施用后20个月以上仍然可以观察到。

C-I-IV-阴道内施用药物组合物以及皮内加强后，对静脉内或直肠内SIVmac239挑 战的保护：

如预期的，跟随静脉内(对照17和18，图4)或直肠内(对照19和20，图5)病毒挑战后，4只接受单独活BCG阴道内施用的动物表现出典型的原发感染，如预期地，在挑战后10-14天之间具有血浆病毒载量峰值(10⁶-10⁷vp/ml)。该对照动物组的血浆定点病毒载量到病毒挑战后60天仍然高(>10⁵拷贝/ml)。

相反地，阴道内接受由AT-2失活的SIVmac239和活BCG制成的组合物以及用相同组合物皮内加强的3/4(75％)的动物(组合物14、15和17)，在静脉内挑战后60天期间，表现检测不到的血浆病毒载量(<10拷贝/ml)(参见图4)。剩余的1只动物(组合物16)表现原发感染，在挑战后10-14天之间具有血浆病毒载量峰值(>10⁵拷贝/ml)(参见图4)。但是，其定点病毒载量在第60天达到相对低的水平(10⁴拷贝/ml)。

而且，接受阴道内由AT-2失活的SIVmac239和活BCG制成的组合物以及用相同组合物皮内加强的4/4(100％)的动物(组合物18-21)，在直肠内挑战后60天期间，表现检测不到的血浆病毒载量(<10拷贝/ml)(参见图5)。

C-I-V-口服施用药物组合物后对直肠内SIVmac239挑战的保护：

4只动物(组合物_22、_23、_24和_25)胃内施用1毫升含有AT2失活的病毒和活BCG的组合物。

同时地，4只其它的动物(对照21-24)胃内给予1毫升单独的活BCG。

初次给予每个动物的相同的施用，在第一次施用步骤后第15天、30天和60天，再重复3次。

结果表明，在直肠内病毒挑战(在第90天进行)后，4只接受单独的活BCG的动物(对照21-24)表现典型的原发感染，在挑战后10-14天之间具有血浆病毒载量峰值(10⁶-10⁷拷贝/ml)，而4只接受AT-2失活的SIV和活BCG的组合物的动物(组合物_22-25)令人惊奇地表现出检测不到的血浆病毒载量(<10拷贝/ml；在第10-14天之间)(图6)。

C-I-VI-施用由AT2失活的病毒和活BCG制成的组合物后免疫相关和对SIVmac239 挑战的保护：

在处理动物的血液中没有检测到针对SIV的全身抗体。但是，当使用皮内加强组合物施用时，检测到一些特异性全身体液反应。因而，观察到的对处理动物的抗SIV感染的保护并不是来自全身的体液反应。

而且，通过ELIspot没有检测到常规的产生SIV特异性γ干扰素的细胞毒性T淋巴细胞(数据未显示)。为了评估SIV特异性非常规细胞反应是否存在的目的，对每个处理或对照动物提取血液样品，根据常规方法从每个样品纯化CD4+和CD8+细胞。培养事先获得的CD4+细胞，然后根据常规方法用SIV mac239感染。然后，在存在或不存在事先获得的自体同源CD8+细胞时培养SIV感染的CD4+细胞5天。通过定量实时PCR分析上清SIV浓度。

图7表明在存在或不存在图2表示的实验的过程中获得的自体同源CD8+细胞时，获得的SIV感染的CD4+中病毒复制的抑制倍数。测试的CD8获自通过阴道内途径接受AT2失活的病毒和BCG组合物(组合物_7-13)的动物或来自对照动物(对照6-10)。

结果表明来自被保护免受病毒感染的动物(组合物_7、组合物_8、组合物_10和组合物_11)的CD8 T细胞在SIV感染的CD4细胞中提供了大于20倍的病毒抑制水平，而来自没有被保护免受病毒感染的动物(组合物_9、组合物_12、和组合物_13)的CD8T细胞提供了小于或等于10倍的病毒抑制水平(图7)。而且，也在图1所示的被保护免受静脉内病毒挑战的4只动物中观察到大于20倍的病毒抑制(数据未显示)。

图8表明在存在或不存在图6表示的实验的过程中获得的自体同源CD8+细胞时，获得的SIV感染的CD4+中病毒抑制水平。测试的CD8获得自通过口服施用AT2失活的病毒和BCG接受组合物(组合物_22-25)的4只动物或来自4只对照动物(对照21-24)。

图9表明在存在或不存在图6表示的实验的过程中获得的自体同源CD8+细胞时获得的SIV(P27+)感染的CD4细胞群中T细胞激活(Ki-67+)水平。测试的CD8获得自通过口服施用AT2失活的病毒和BCG接受组合物(组合物_22-25)的4只动物或来自4只对照动物(对照21-24)。在4只接受组合物的动物中观察到由自体同源CD8+T细胞的CD4+T细胞激活的SIV特异性抑制。

这些结果确认了，由阴道内或口服施用AT2失活的和BCG获得的全身或粘膜SIV感染的预防，诱导了一种免疫耐受状态，该免疫耐受状态的特征在于与SIV感染的CD4细胞无反应性相关的非细胞毒性的CD8+T细胞反应。结合这些结果，因而，BCG被鉴定为致耐受佐剂。

总之，这些发现第一次证实了通过阴道内或口服(或胃内)施用由失活的SIV病毒和活BCG制成的组合物实现对SIV抗原免疫耐受的稳定状态。同时，其还第一次表明阴道内或口服施用根据本发明的含有AT2失活的SIV病毒和活BCG的药物组合物有效地(>50％)预防直肠内或静脉内挑战后的慢性病毒感染。

C-II植物乳杆菌用作致耐受载体

C-II-I-由口服联合施用双失活的SIV和植物乳杆菌(iSIV/VP)诱导的SIV特异性 免疫耐受

在一方面，在用口服iSIV/LP处理的动物中没有检测到SIV特异性抗体(IgG、IgM和IgA)(图10a)。在另一方面，在iSIV/LP处理的动物中没有观察到显著的SIV P27-特异性外周血CD4+T细胞增殖，而iSIV处理的动物表现出显著的P27特异性外周血CD4+T细胞增殖。

C-II-II-非细胞毒性CD8+细胞的抗激活和抗病毒活性

在iSIV/LP处理的和iSIV处理的动物中均观察到SIV P27-特异性外周血CD8+T细胞增殖(图10b)。但是，在iSIV/LP处理的动物中没有检测到γ干扰素分泌T细胞(在细胞外刺激时)，去除CD8+或CD25+细胞并不能改变P27-特异性效应T细胞的无反应性(图10c)。而且，在来自iSIV/LP处理动物的急性体外感染的PBMC中还观察到由非细胞毒性CD8+T细胞强烈地抑制感染的(P27+)CD4+T细胞激活(Ki-67+)，去除CD25+细胞并不改变CD25-CD8+T细胞产生的对感染的CD4+T细胞激活的强烈抑制(图10d)。

注意这样一个事实：在存在或不存在SEB和抗CD3/抗CD28抗体时，在共同孵育CD8+T细胞和用非复制的SIVmac239脉冲的CD4+T细胞后，通过高灵敏度的细胞毒性分析(Marchetti等人,1996)没有检测到细胞裂解(图10e)。

最后，来自iSIV/LP处理≥2个月的动物的外周血CD8+T细胞表现出强的对抗急性体外感染的自体同源CD4+T细胞中病毒复制的抑制活性(图11a)。而且，在急性体外感染的异源CD4+T细胞中也观察到这种CD8+T细胞强的抗病毒活性(图11b)，表明非经典的HLA1限制机制参与CD8+T细胞的抑制性/抑制活性。

取自用LP/iSIV≥2个月免疫早期的猕猴的纯化外周血CD8+T细胞，对自体同源急性SIVmac239感染的CD4+T细胞(用SEB和抗CD3/抗CD28抗体过夜刺激，并共同培养5天)具有强的抗病毒活性。一旦SIV特异性CD4+T细胞激活建立(刺激后48小时)，添加CD8+T细胞不再能抑制病毒复制(图11c)。该观察辩解了如之前的在人1型自体免疫型糖尿病的研究中表明的(Jiang等人，2010)，在延长的培养中CD8+T细胞对靶(有效(productively)感染的)CD4+T细胞潜在的裂解。该CD8+T细胞介导的抗病毒活性需要细胞-细胞间的接触(图11d)，而且也是经典MHC1a非限制的，如通过来自其它免疫动物或来自对照动物的急性感染的CD4+T细胞上由CD8+T细胞产生的强的病毒复制的抑制所示的(图11e)。最后，CD8介导的抗病毒活性被抗MHC-1b/E抗体阻断，而不被抗MHC-1a/ABC抗体阻断，表明非经典的MHC-1b/E限制的CD8+T细胞活性(图11f)。

确立了CD8+T细胞TCR表达对识别由靶CD4+T细胞携带的MHC-1b/E肽复合物是必要的(Sarantopoulos等人,2004；Van Kaer,2010)。使用通过缀合抗体的磁微珠体外去除，表明TCRγδ和Vβ8不参与病毒复制的CD8+T细胞抑制(图11g)。因而，TCRαβ看起来在识别感染的CD4+T细胞上提呈的MHC-1b/E肽中起重要作用。而且，通过用与非人灵长类膜CD(参见“分化群(Cluster Differentiation)”)(CD7、CD11a、CD16、CD25(IL-2RA)、CD27、CD28、CD39、CD62L、CD95、CD101、CD122(IL-2RB)、CD127(IL-7R)、CD 129(IL-9R)、CD 137、CD 150、CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD 195(CCR5)、CD196(CCR6)、CD197(CCR7)、CD215(IL-15Ra)、CD218(IL-18Ra)、CD223(LAG3)、CD226、CD247、CD272、CD277、CD279(PD-1)、CD305(LAIR1)和CD357)抗原交叉反应的可获的抗人抗体去除CD8+T细胞，没有鉴定到与MHC-1b/E限制的CD8+T细胞活性相关的CD抗原(表1)。以下的表1表明首次免疫研究(免疫No.1)中、在CD抗原限定的亚群去除之前和之后*，取自8只iSIV/LP免疫动物的CD8+T细胞的抗病毒活性(抑制倍数，几何平均值±SE)。

表1

*在实验的每个批次，进行来自8只iSIV/LP免疫动物的、用2个抗CD抗原的抗体去除(或不去除)的CD8+T细胞的抗病毒活性(抑制倍数，几何平均值±SE。

C-II-III通过口服免疫耐受保护动物免于直肠内挑战

施用口服iSIV/LP或对照制剂后3个月，用单次高剂量(100,000TCID₅₀)SIVmac239直肠内挑战8只iSIV/LP免疫的和7只对照动物。8只iSIV/LP处理动物中8只被保护免于致病SIVmac239的直肠内挑战，而4只iSIV处理的和4只LP处理的动物被相同的直肠内病毒挑战感染(图12a和b，图的左部分)。

C-II-IV通过口服免疫耐受保护动物免于静脉内挑战

第一次挑战后两个月，8只猴子中的4只通过静脉内途径接受第二次挑战(200TCID₅₀)。在挑战后第10天，其所有均显示轻度的复制峰值(≤200SIV DNA拷贝/百万PBMC以及200SIV RNA拷贝/ml血浆)；但是，到第30天，PBMC SIV DNA降低至≤10拷贝/百万细胞，以及血浆SIV RNA不可检测(≤10拷贝/ml)，表明没有体内病毒的活性复制(图12a和b，图的右部分)。相反地，接受相同静脉内SIVmac239挑战(200TCID₅₀)的2只未处理动物被成功地感染。4只剩余的猴子被直肠内再次挑战(100.000TCID₅₀)，其全部被完全保护(图12a和b，图的右部分)。

C-II-V确认体内CD8+T细胞的作用

该第二次挑战后5个月，为了确认CD8+T细胞的体内作用，在一周的期间(免疫后第300、304和307天)向8只已经被挑战的猴子给予3次小鼠-人嵌合单克隆抗CD8抗体(cMT-807,Centocor)静脉内注射，以暂时地从其外周血和淋巴样器官中去除其CD8+T细胞(图13a&b)。在4只由直肠内途径再挑战的猕猴中没有检测到病毒RNA或DNA的出现，再一次证明其完全的无菌保护；相反地，如其血浆病毒载量峰值为10⁶RNA拷贝/ml、以及其PBMC和淋巴结原病毒载量到第15天达到10⁴DNA拷贝/10⁶个细胞(CD8+T细胞去除的最低点)所示的，从4只静脉内挑战的动物淋巴样器官去除CD8+T细胞伴随强的病毒复制；到第60-90天，当4只猴子恢复基线CD8+T细胞浓度时，血浆SIV RNA和PBMC和淋巴结SIV DNA也恢复至基线水平(图13c、d&e)。这确认了iSIV/LP诱导的CD8+T细胞在控制静脉内SIV挑战动物体内病毒复制中的独特作用，其中推测有复制能力的病毒潜伏在静止的记忆CD4+T细胞中。

第二次挑战后8个月，4只直肠内再挑战的猴子以及4只静脉内再挑战的猴子接受第三次挑战，此次用SIVB670(100,000TCID₅₀)一种不同的感染性SIV株，经直肠途径。如其检测不到的SIVB670DNA和RNA水平，而2只未处理动物被相同的SIVB670挑战成功地感染所示，在随后的12个月8只动物保留了完全的保护，这表明LP/iSIVmac239产生的MHC-1b/E限制的CD8+T细胞，通过防止被其它SIV株感染的CD4+T细胞激活，是交叉保护的(图14a&b)。

为了确定iSIV/LP处理的动物中预防SIV疾病的有效期间，在8只新的中国来源的猕猴中进行了用iSIV/LP的第二次免疫，没有SIV挑战检测了随时间的其CD8+T细胞的体外抗病毒活性。与用LP(n＝4)或单独的iSIV(n＝4)处理的对照动物比较，检测了来自免疫后60天的该体外抗病毒活性。

8只猴子中的7只直至第420天保持了离体抗SIV活性水平，而1只猴子的抗病毒活性从第360天渐进地下降，到第420天达到对照猴子的基线水平(图15a)。在免疫后第420天，用100,000TCID₅₀SIVmac239直肠内挑战16只动物。8只iSIV/LP免疫动物中的7只获得了无菌免疫，在血浆和PBMC中(图15b&c)、以及在直肠粘膜的淋巴细胞中(其从挑战后第1天测量)和盆腔淋巴结中(图16a至16e)没有任何SIV RNA和DNA出现，而1只免疫的猴子完全感染。重要地，8只接种猴子的离体抗病毒活性的进化允许根据7只被保护的猴子和1只未被保护的猴子免疫后360天进行预测(即，其挑战前60天)(图15a至c)。

C-II-VI结论

文中公开了，在猕猴模型中，失活的SIVmac239(iSIV)和共生植物乳杆菌(LP)(称为致耐受佐剂)的施用产生了MHC-1b/E限制的CD8+T细胞，其诱导SIV抗原提呈CD4+T细胞激活的抑制，从而抑制SIV复制，并保护猕猴免受SIV挑战。

由失活的iSIV和LP制成的混合物胃内施用至一共16只动物和15只对照。4至14个月后，用致病SIVmac239直肠内挑战所有动物。

16只iSIV/LP施用的动物中15只中观察到完全的抗SIV感染保护；相反地，在所有对照动物和1只接种猴子中确立了感染。在直肠内挑战前60天可通过离体抗病毒分析预测未被保护的猴子。在4只猴子中静脉内给予第二次SIVmac239挑战和另外4只猴子中直肠内给予第二次SIVmac239挑战后，8只被保护的动物保留了被保护性。

8只iSIV/LP递送的猴子完全没有SIV特异性外周血CD4+T细胞增殖，并且没有产生任何全身的SIV特异性抗体(IgG、IgM或IgA)。

而且，其SIV特异性外周血CD8+T细胞具有一些特点：

1)在体外刺激时其很好地增殖但是没有γ干扰素分泌；

2)其强烈地抑制急性感染的自体同源CD4+T细胞的激活；

3)去除CD25+细胞后两种功能均保持不变；

4)其还抑制急性感染的同种异体CD4+T细胞中SIV复制；和

5)其抑制性/抑制作用是MHC-1b/E限制的。

这些结果表明胃内联合施用iSIV和LP允许猕猴产生病毒特异性非细胞毒性MHC-1b/E限制的CD8+调节性T细胞，其产生SIV特异性免疫耐受，而且非常令人惊奇地，该病毒特异性免疫耐受与抗SIV感染确立的动物的疫苗保护相关。

以上表明根据本发明的药物组合物预防人/哺乳动物中HIV和SIV的感染。该预防的作用通过诱导致耐受接种的受试者(即，施用了药物组合物的哺乳动物)中“Ts”免疫耐受在猕猴中获得。所述“Ts”免疫耐受文中指包括病毒特异性非细胞毒性MHC-1b/E限制的抑制性CD8调节性T细胞，其存在和活性表明：

-抑制已经施用本发明的药物组合物的猕猴的急性感染的CD4+T细胞中SIV的复制(体外)；和/或

-预防用感染的SIV挑战的致耐受接种的猕猴中SIV复制(体内)。

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Claims (14)

1.一种用于口服或阴道内施用的药物组合物，其包含失活的HIV病毒颗粒和非重组的致耐受细菌的混合物，其中所述致耐受细菌是减毒BCG。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗有需要的人中HIV疾病的方法中。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其用于保护人免受HIV的方法中。

4.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其用于保护人免受HIV血清转化的方法中。

5.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其诱导人中对抗HIV的抗原特异性免疫保护。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其进一步维持人中对抗HIV的抗原特异性免疫保护。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述免疫保护的特征在于降低所述人中的HIV病毒载量。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述免疫保护的特征在于抑制所述人中的HIV病毒载量。

9.一种用于预防和/或治疗有需要的人中HIV疾病的药物试剂盒，其包含：

-在第一容器中的失活的HIV病毒颗粒；和

-在第二容器中的非重组的致耐受细菌，其中所述致耐受细菌是减毒BCG，

所述失活的HIV病毒颗粒和所述细菌在用于口服或阴道内施用的药学上可接受的载体中。

10.根据权利要求9所述的用于预防和/或治疗有需要的人中HIV疾病的药物试剂盒，其中所述施用为口服施用。

11.根据权利要求9所述的用于预防和/或治疗有需要的人中HIV疾病的药物试剂盒，其中所述施用是阴道内施用。

12.如权利要求1中所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗有需要的人中HIV疾病的药物的用途。

13.如权利要求1中所述的药物组合物在制备用于保护人免受HIV感染的药物中的用途。

14.如权利要求1中所述的药物组合物在制备用于保护人免受HIV血清转化的药物中的用途。

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