KR101814857B1 - 인간에서의 hiv 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특이적 HIV 항원과 살아있는 비-병원성 박테리아의 혼합물을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 상기 특이적 HIV 항원은 Gag 및/또는 Pol 단백질로부터의 하나 이상의 에피토프를 포함하고, 바람직하게는 미립자 형태로 존재한다. 상기 박테리아는 바람직하게는 락토바실루스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)이다. 이들 조성물은 인간에서 HIV 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유용하다.

Description

인간에서의 HIV 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR PREVENTING AND/OR TREATING AN HIV DISEASE IN HUMANS}

본 발명은 특이적 HIV 항원과 비-병원성 박테리아의 혼합물을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 상기 특이적 HIV 항원은 Gag 및/또는 Pol 단백질로부터의 하나 이상의 에피토프를 포함하고, 바람직하게는 미립자 형태로 존재한다. 상기 박테리아는 바람직하게는 락토바실루스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)이다. 이들 조성물은 인간에서 HIV 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유용하다.

인간 면역결핍 바이러스 (HIV)가 발견된 지 25년이 넘었지만, 세계 보건 기구 (World Health Organization) 및 HIV/AIDS에 대한 국제 연합 공동 계획 (Joint United Nations Program)의 최근의 추정에 따르면, 이 바이러스가 그의 현재 속도로 진행된다면 2011년까지 3천만 명을 초과하는 감염자가 발생할 것이라고 한다.

그러나, HIV 감염을 예방하기 위한 효과적인 치료제를 발견하기 위한 상당한 연구 노력에도 불구하고, 최근에 시험한 2가지 예방 백신은 실패로 끝났거나 (문헌 [Mc Elrath et al., 2008]), 대단하지 않은 결과를 제시하였다 (문헌 [Rerks-Ngarm et al., 2009]).

문헌 [Jae-Sung Yu et al. (Clinical and Vaccine Immunology, Nov. 2006, vol 13, No. 11, 1204-1211)]에는 HIV-1 그룹 M 컨센서스 (consensus) env 유전자 CON6를 표면, 세포내, 또는 분비된 단백질로서 발현하도록 제작된 재조합 미코박테리움 스메그마티스 (Mycobacterium smegmatis) 벡터가 기재되어 있다. 저자들은 마우스에서 재조합 엠. 스메그마티스가 점막 표면에서 HIV-1 T-세포 반응의 유도를 위해 면역원성임을 입증할 수 있었다.

문헌 [Ke-Qin Xin et al. (Blood, 1 July 2003, vol 102, No. 1, 223-228)에는 그의 세포 표면 상에 HIV-1 Env의 V2-V4 루프를 발현하는 재조합 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis) 벡터가 기재되어 있다. 상기 벡터를 사용한 마우스의 경구 면역화는 다음을 유도하였다:

- 높은 수준의 HIV-특이적 혈청 IgG 및 대변 IgA 항체를 검출함으로써 밝혀진 점막 및 체액성 면역 반응; 및

- HIV-특이적 IFN-감마-분비 세포의 수 증가에 의해 밝혀진 세포성 면역 반응.

엘. 락티스 세포 표면 상에 적절하게 발현되도록 하기 위해, 1 kb 이하의 유전자 분절을 사용할 수 있다.

HIV 발병기전 및 예방 연구에 참여하는 대부분의 과학자는 인간에서 HIV 감염을 예방 또는 치료하기 위한 HIV 예방 백신 또는 다른 생물학적 조성물의 시험 전에, 비인간 영장류에서 그의 대응물을 시험하는 것이 보다 건설적이라고 느낀다 (문헌 [Morgan C, et al., 2008]). 선택된 비 인간 영장류는 짧은 꼬리 히말라야 원숭이 (macaque rhesus)이고, 짧은 꼬리 원숭이 중에서 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV) 239에 의해 감염된 중국 기원의 짧은 꼬리 원숭이가 인간에서 HIV 감염의 진전의 임상적, 바이러스학적 및 면역학적 측면을 가장 잘 모방하는 최선의 모델임이 최종적으로 밝혀졌다 (문헌 [Marcondes MC, et al. 2006]; [Stahl-Hennig C, et al. 2007]; [Chen S, et al. 2008]).

마지막으로, 현재 과학계는 SIV 239에 대한 효과적인 예방적 생물학적 조성물 또는 백신이 짧은 꼬리 원숭이에서 발견된다면, 이것은 인간을 AIDS로부터 보호하기 위해 인간에게 성공적으로 적용가능할 가능성이 아주 높다는 사실에 동의한다.

과학계의 끊임없는 연구 노력에도 불구하고, 전세계적인 AIDS 발병에 대처하기 위해 효율적인 예방 및 치료적 전략은 아직 개발되지 않은 상태이다.

대상체에게 투여시에 흥미로운 아주반트성 (adjuvanticity) 및 면역조정 특성을 갖는 다양한 박테리아가 설명되었다. 특히, 락트산 박테리아가 면역계에 대해 관용 효과를 촉진하는 것으로 보고되었다.

예를 들어, 스탈러제네스 에스.에이. (Stallergenes S.A.)의 이름으로 2006년 11월 23일 공개된 WO 2006/123230에는 대상체에게 설하, 혀 주위 또는 경구 투여시에 항원-특이적 관용을 유도할 수 있는 면역원성 조성물 내의 아주반트 (adjuvant)로서, 비피도박테리아 (Bifidobacteria) 및 락트산 박테리아로부터 선택된 박테리아의 용도가 기재되어 있다. 면역원성 조성물은 알러지, 자가면역 질환의 치료 또는 이식 거부를 예방하기 위해 사용되는 것으로 제안된다.

또 다른 예로서, 스티칭 탑 인스티튜트 푸드 앤드 뉴트리션 (Stichting Top Institute Food and Nutrition)의 이름으로 2009년 7월 30일 공개된 WO 2009/093900에는 중간 로그기 (mid-log phase)의 실질적인 양의 락트산 박테리아를 함유하는 면역관용원성 (tolerogenic) 조성물이 기재되어 있다. 상기 조성물은 대상체에게 투여될 때 비 항원-특이적 면역 관용을 유도한다. 조성물은 조직 손상, 예컨대 알러지, 자가면역 질환, 및 장의 염증성 질환을 야기할 수 있는 염증성 반응과 연관된 병태 또는 질환의 예방, 지연 및/또는 치료를 위한 사용이 제안된다.

발명의 개요

본 발명자들은 놀랍게도 아래 실시예에서 설명되는 본래의 제약 조성물이 짧은 꼬리 원숭이에서 SIV에 대한 효율적인 항원-특이적 면역 보호를 유도함을 밝혀낼 수 있었다. 또한, 상기 SIV-특이적 면역 보호가 유도될 때, 본 발명자들은 이것이 SIV 복제/전염 및 생체내에서 후속적인 감염의 확립을 억제함을 밝혀내었다.

실제로, 본 발명자들은 놀랍게도 본원에 개시된 제약 조성물을 점막으로 또는 피내 또는 상피내 경로에 의해 투여할 때, 바이러스 복제가 유의하게 억제되거나, 또는 심지어 제거 또는 예방됨을 밝혀내었다.

실제로, 본 발명자들은 비-세포독성 CD8+ T 세포 반응이 짧은 꼬리 원숭이에서 SIV 항원-제시 CD4+ T 세포의 조기 활성화를 억제함을 최초로 관찰할 수 있었다. 따라서, 이론에 매이기를 원하지 않지만, 본 발명에 따른 제약 조성물은 대상체에게 점막으로 또는 피내 또는 상피내 투여시에 예기치 않은 새로운 종류의 바이러스-특이적 면역관용을 유도한다. 상기 면역관용은 MHC ("Major Histocompatibility Complex")-Ib/E-제한되고 비-세포독성인 HIV Gag 및/또는 Pol 항원-특이적 억제성 CD8+ T 세포-유도된 면역관용 (또한, 본원에서 "Ts" ("T suppressive") 면역관용)으로 칭함)인 것으로 보인다.

본원에서 보고된 결과에 비추어, 인간에서 HIV 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 상기 규정된 "Ts" 면역관용을 달성할 수 있는 신규한 제약 조성물이 본 발명에서 제공된다.

본 발명의 목적은 따라서 항원과 살아있는 비-병원성 박테리아의 혼합물을 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이고, 여기서 바람직하게는, 상기 항원은 미립자이고/이거나, HIV Gag 및/또는 Pol 단백질로부터의 하나 이상의 에피토프를 갖고, 상기 박테리아는 바람직하게는 락토바실루스 플란타룸이다.

본 발명의 또 다른 목적은 백신으로서 사용하기 위한, 본원에서 설명되는 제약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간에 대해 상기 언급한 바와 같은 유효량의 제약 조성물을 점막으로 (바람직하게는 경구로) 또는 피내 또는 상피내 투여하는 단계를 적어도 포함하는, HIV 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 인간에서 HIV 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간에 대해 상기 언급한 바와 같은 유효량의 제약 조성물을 점막으로 (바람직하게는 경구로) 또는 피내 또는 상피내 투여하는 단계를 적어도 포함하는, 인간을 HIV에 대해 보호하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간에 대해 상기 언급한 바와 같은 유효량의 제약 조성물을 점막으로 (바람직하게는 경구로) 또는 피내 또는 상피내 투여하는 단계를 적어도 포함하는, 인간을 HIV 혈청전환 (seroconversion)으로부터 보호하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

- 제1 용기 내에 항원, 및

- 제2 용기 내에 비-병원성 박테리아

를 포함하는, HIV 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 인간에서 HIV 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 제약 키트를 제공하는 것이고, 여기서 상기 항원 및 상기 박테리아는 점막 또는 피내 또는 상피내 투여를 위한 제약상 허용되는 담체 내에 존재하고, 바람직하게는 상기 항원은 미립자이고/이거나, HIV Gag 및/또는 Pol 단백질로부터의 하나 이상의 에피토프를 갖고, 상기 박테리아는 바람직하게는 락토바실루스 플란타룸이다.

본 발명은 아래 비-제한적인 예에서 참고로 하는 다음 도면에 의해 예시된다.
도 1: 질내 iSIV/BCG로 예비처리한 히말라야 원숭이 (rhesus macaque)의 정맥내 (i.v.) SIVmac239 시험접종 (challenge).
도 2: 질내 iSIV/BCG로 예비처리한 히말라야 원숭이의 직장내 (i.r.) SIVmac239 시험접종.
도 3: 질내 iSIV/BCG로 예비처리한 히말라야 원숭이의 반복된 SIVmac239 시험접종 (i.v. 3회 및 i.r. 2회).
도 4: 질내 iSIV/BCG + 피내 추가접종 (booster)으로 예비처리한 히말라야 원숭이의 정맥내 SIVmac239 시험접종.
도 5: 질내 iSIV/BCG + 피내 추가접종으로 예비처리한 히말라야 원숭이의 직장내 SIVmac239 시험접종.
도 6: 경구 iSIV/BCG로 예비처리한 히말라야 원숭이의 직장내 SIVmac239 시험접종.
도 7: 질내 iSIV/BCG로 예비처리한 히말라야 원숭이로부터 얻은 CD8+ T 세포의 시험관내 항바이러스 활성.
도 8: 경구 iSIV/BCG로 예비처리한 4마리의 히말라야 원숭이로부터 얻은 CD8+ T 세포의 시험관내 항바이러스 활성.
도 9: 경구 iSIV/BCG로 예비처리한 4마리의 히말라야 원숭이로부터 얻은 자가 CD8+ T 세포에 의한 CD4+ T-세포 활성화의 SIV-특이적 억제.
도 10a: iSIV/LP, iSIV 또는 LP로 예비처리한 히말라야 원숭이로부터 얻은 혈장 샘플 내의 항-SIV IgG 항체 역가.
도 10b: iSIV/LP, iSIV 또는 LP로 예비처리한 히말라야 원숭이로부터 얻은 PBMC 샘플에서 SIV-특이적 T-세포 증식.
도 10c: CD8 또는 CD25 T 세포의 존재 또는 부재 하에 시험관내 자극시에 SIV-특이적 IFN-감마-분비 T 세포.
도 10d: 경구 LP (n = 4) 또는 iSIV (n = 3)로 예비처리한 동물에 비해 경구 iSIV/LP로 예비처리한 8마리의 히말라야 원숭이로부터 얻은 자가 CD8+ T 세포에 의한 CD4+ T-세포 활성화의 SIV-특이적 억제.
도 10e: iSIV/LP 제제의 위내 투여 60일 후에 SIV-특이적 CD8+ T 세포: SEB 및 항-CD3/CD28 자극의 존재 또는 부재 하에서 CD8+ T 세포의 존재 하의 AT-2 SIV-펄싱된 (pulsed) CD4+ T 세포의 세포독성 또는 인간 천연 킬러 세포 (hNK)의 존재 하의 K562 (대조군)의 세포독성.
도 11a: 경구 LP (n = 4) 또는 iSIV (n = 3)로 예비처리한 동물에 비해 경구 iSIV/LP로 예비처리한 8마리의 히말라야 원숭이로부터 얻은 자가 CD8+ T 세포의 시험관내 항바이러스 활성 (CD4 세포에서).
도 11b: 경구 iSIV/LP의 처리 80일 후에 8마리의 히말라야 원숭이 중 4마리로부터 얻은 이종 또는 동종이형 (allogenic) CD8+ T 세포의 시험관내 항바이러스 활성 (CD4 세포에서).
도 11c-g: 지연된 (c), 삽입 (d), 동종이형 (e) 배양 시스템에서, 항-MHC-Ia/ABC 또는 항-MHC-Ib/E 항체 (f)의 존재 하에, 및 TCRγδ⁺ 또는 Vβ8⁺ 하위세트가 고갈된 CD8+ T 세포 (g)에서 경구 면역화 60일 후에 CD8+ T 세포의 항-SIV 활성.
도 12a: 경구 LP 또는 iSIV로 예비처리한 동물에 비해 경구 iSIV/LP로 예비처리한 히말라야 원숭이에서 직장내 및 정맥내 SIVmac239 시험접종 후에 혈장 바이러스 로드 (load) 수준 (혈장 1 ml 당 SIV RNA 카피).
도 12b: 경구 LP 또는 iSIV로 예비처리한 동물에 비해 경구 iSIV/LP로 예비처리한 히말라야 원숭이에서 직장내 및 정맥내 SIVmac239 시험접종 후에 세포성 바이러스 로드 수준 (1백만개 PBMC 당 SIV DNA 카피).
도 13: 항-CD8 항체 cMT807의 주입에 의한 8마리의 iSIV/LP-처리한 짧은 꼬리 원숭이의 말초 혈액 및 림프절 CD8⁺ T 세포의 고갈. a, cMT807의 3회 주사 전 및 후의 말초 혈액 CD8⁺ T-세포 계수; b, cMT807의 3회 주사 전 및 후의 림프절 CD8⁺ T 세포의 %; c, cMT807의 3회 주사 전 및 후의 혈장 바이러스 로드; d, cMT807의 3회 주사 전 및 후의 PBMC DNA SIV 로드; e, cMT807의 3회 주사 전 및 후의 림프절 SIV DNA 로드.
도 14: iSIV 및 LP로 제조된 경구 제제로 면역화된 8마리의 히말라야 원숭이 및 2마리의 추가의 나이브 (

) 원숭이에서 SIVB670을 사용하여 직장 내에서 수행된 제3 직장내 시험접종 후의 혈장 (a) 및 PBMC (b) 바이러스 로드.
도 15: iSIV 및 LP를 사용한 위내 면역화 (iSIV/LP 면역화 No. 2) 후의 시험관내 및 생체내 CD8+ T 세포-매개 항바이러스 활성. a, 직장 내에서 시험접종되는 8마리의 히말라야 원숭이에서 면역화 후 60-420일 동안 CD8+ T 세포의 항-SIV 활성 (바이러스 억제 배수); b 및 c, 경구 iSIV/LP로 면역화된 8마리의 히말라야 원숭이 및 LP 단독 (n = 4) 또는 iSIV (n = 4) 단독으로 처리한 8마리의 대조군 원숭이의 직장내 SIVmac239 시험접종 후의 혈장 및 세포성 바이러스 로드.
도 16: 8마리의 짧은 꼬리 원숭이에서 SIVmac239의 직장내 시험접종 (iSIV/LP 면역화 No. 2) 후의 직장 점막 상피내 림프구 (IPL) (a-b), 고유판 (lamina propria) 세포 (LPC) (c-d), 및 골반 림프절 (PLN) (e) 내의 SIV DNA 및 RNA 로드.

본 발명은 항원과 살아있는 비-병원성 박테리아의 혼합물을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

항원

돌연변이, 재조합, 삽입 및/또는 결실에 의한 HIV 게놈의 큰 가변성 때문에, HIV는 군, 하위군, 타입, 하위타입 및 유전자형으로 분류되었다. HIV 게놈이 지속적으로 돌연변이하기 때문에 2개의 주요 HIV 군 (HIV-1 및 HIV-2) 및 많은 하위군이 존재한다. 군과 하위군 사이의 주요 차이는 바이러스 외피 (envelope)와 연관된다. HIV-1은 주요 하위군 (M) (상기 하위군은 A 내지 J로 지정된 9개의 하위타입 (분기군 (clade) 또는 하위타입)으로 분할됨) (문헌 [Hu et al., JAMA 275:210-216, 1996]; [Korber et al., Science 280:1868-1871, 1998]), 및 제10 이상치 (outlier) 하위군 (O)으로 분류된다. 이전의 하위군의 생체내 재조합에 의한 많은 다른 하위군이 또한 존재한다 (문헌 [Papathanasopoulos MA, et al. Virus Genes 2003, 26:151-163]). 바람직하게는, HIV 바이러스는 그의 모든 공지의 및 지금까지 알려지지 않은 분기군을 포함하는 HIV-1 또는 HIV-2이다. 추가로 바람직하게는, 이 바이러스는 HIV-1이다.

본 발명의 문맥에서, "항원"은 HIV 기원의 것이고, 이것은 항원이 특이적 HIV 군, 하위군, 타입, 하위타입 또는 몇몇 하위타입의 조합에 관련됨을 의미한다. 바람직하게는, 상기 HIV 항원은 HIV-1 또는 HIV-2 항원이다.

상기 항원은 비-감염성이다.

HIV-1 및 SIV 둘 모두의 주요 표적인 CD4⁺ T 세포의 활성화가 바이러스 복제에 직접 기여함이 과학계에 의해 오랫동안 의심되었다 (문헌 [Andrieu and Lu, 1995]; [Korin and Zack, 1999]). 그러나, 최근에 이르러서야 CD4⁺ T 세포 활성화와 SIV 또는 HIV 감염 과정의 연속적인 단계 사이의 상호작용이 명확해졌다. 휴지 (quiescent) CD4⁺ T 세포에서, 바이러스 침투에 이어서, 도입 후 2시간 내에 유입되는 비리온의 Gag 및 Pol 단백질-유래된 에피토프가 형질막에 제시되지만, Env 및 Nef 단백질은 신생 (de novo) 합성을 필요로 하였다 (문헌 [Sacha et al., 2007]). 그러나, 후속 감염 과정의 기, 즉, 역전사, 이어서 바이러스 통합은 휴지 세포에서 매우 비효율적으로 발생하였다 (문헌 [Vatakis et al., 2009a and 2009b]). 이와 대조적으로, CD4+ T 세포가 형질막에서 Gag 및 Pol 에피토프의 제시 전 또는 제시 후 48시간 이내에 활성화될 때, HIV/SIV 역전사 및 DNA 통합은 극히 높은 활성을 보이고, 이것은 매우 효율적인 바이러스 복제 및 방출을 허용하였다 (문헌 [Vatakis et al., 2009a and 2009b]).

따라서, 본 발명자들은 HIV/SIV 노출 후에 HIV/SIV Gag 또는 Pol-특이적 CD4⁺ T-세포 활성화의 조기 발생을 생체내에서 특이적으로 차단하면, 활성 바이러스 복제의 예방이 유도될 것이라고 추정하였다.

이를 기초로 하여, HIV Gag 및/또는 Pol 항원-제시 CD4⁺ T 세포의 활성화의 억제를 유도하고 바이러스에 노출된 인간의 생체내에서 HIV 복제 및 전염을 억제하기 위해서, 본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 HIV Gag 및/또는 Pol 단백질로부터의 하나 이상의 에피토프를 갖는 HIV 항원을 포함한다. 그러한 항원은 유리하게는 HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된다.

용어 "HIV 바이러스의 Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 항원"은 따라서

- 적어도 Gag 및/또는 Pol을 포함하거나 ("Gag 및/또는 Pol을 함유하는 항원"으로서); 또는

- GAG에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질, 예컨대 캡시드 단백질 (p24) 및 매트릭스 (matrix) 단백질 (p17), 및/또는 POL에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질, 예컨대 인테그라제, 역전사효소 및 프로테아제를 포함하거나 ("Gag 및/또는 Pol"로부터 유래된 항원"으로서); 또는

- 이들 단백질로부터의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 (또한 "Gag 및/또는 Pol"로부터 유래된 항원"으로서)

HIV 항원을 의미한다.

특히, ENV, VIF, VPR, VPU (HIV-1의 경우), VPX (HIV-2의 경우), REV, NEF, TAT 등으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 임의의 다른 바이러스 단백질 또는 그의 에피토프는 본원에서 개시되는 제약 조성물에 포함되는 항원의 필수적인 성분이 아니다. 존재하는 경우에, 임의의 이들 단백질은 단지 본원에 개시된 제약 조성물에 사용되는 항원의 선택가능한 성분일 뿐이다.

항원은 바람직하게는 미립자 항원이다. 이것은 항원이 바람직하게는 바이러스 입자, 재조합 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자, Gag 및/또는 Pol-발현 재조합 박테리아 또는 진균, 그들의 표면 상에 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 또는 에피토프 (HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된)를 제시하는 중합체 미세입자로부터 선택됨을 의미한다. 바람직하게는, Gag 및/또는 Pol로부터의 하나 이상의 에피토프는 상기 항원에 의해 생산되거나, 발현되거나, 또는 항원에 함유된다. 재조합 바이러스 입자 또는 바이러스 입자 또는 Gag 및/또는 Pol-발현 재조합 박테리아 또는 진균이 사용될 때, 이들은 바람직하게는 불활성화된 미생물이다.

항원은 바이러스 입자, 재조합 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자 또는 Gag 및/또는 Pol-발현 재조합 박테리아 또는 진균일 수 있다. 또한, 항원은 재조합체이거나 아닌, 접합체 또는 콘카테머 (concatemer) 형태의 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 (HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된)일 수 있다. 이때, 항원은 바이러스 핵산과 무관하고, 즉, 항원은 비 바이러스 DNA- 또는 비 바이러스 RNA-의존성이다.

항원은 유리하게는 적절한 재조합 미생물 내에 함유된 바이러스 핵산 서열의 발현에 의해 생성될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물 내에 함유된 항원이 Gag 및/또는 Pol-발현 재조합 박테리아인 경우, 상기 재조합 박테리아는 바람직하게는 조성물에 역시 포함되는 살아있는 비-병원성 박테리아와 상이하다.

본 발명에 따른 제약 조성물 내의 항원이 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 (HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된)일 경우, 항원은 바람직하게는 미립자 형태로 존재한다. 실제로, 적절한 미립자 항원은, 발현된 HBsAg 폴리펩티드가 만성 HBV 감염 환자의 혈청에서 발견되는 천연적인 22-nm 입자와 매우 유사한 면역원성 구형 입자로 자가회합하는 재조합 DNA B형 간염 백신에 대한 것과 동일한 방식으로 살아있는 미생물, 예컨대 효모에 의해 생산될 수 있다 (문헌 [Plotkin et al., 2008]).

별법으로, 본 발명에 따른 제약 조성물 내의 항원이 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 (HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된)일 경우, 항원은 접합체의 형태이다. 그러한 실시양태에서, 당업계에 공지된 바와 같이, 관심있는 단백질 또는 펩티드는 적절한 담체에 공유 접합된다. 상업적으로 이용가능한 통상적인 담체는 특히 단백질, 예컨대 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin)) 단백질, BSA (소 혈청 알부민) 단백질, OVA (난알부민) 단백질 등이다 (이것은 바람직하게는 인간에게 경구로 안정하게 투여될 수 있다). 적절한 접합체의 방법은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다.

별법으로, 본 발명에 따른 제약 조성물 내의 항원이 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 (HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된)일 경우에, 항원은 콘카테머 형태이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 콘카테머는 하나의 거대분자 내에서 함께 물리적으로 연결된 관심있는 단백질 또는 펩티드의 다중 카피로 이루어진다. 콘카테머에서, 관심있는 단백질 또는 펩티드의 한 카피는 다른 카피에 직접 연결될 수 있거나 또는 합성 아암 (arm)에 의해 떨어져 존재할 수 있다. 따라서, 콘카테머는 관심있는 단백질 또는 펩티드의 적어도 2 카피, 바람직하게는 10 이하의 카피 또는 그 초과를 포함한다. 적절한 콘카테머를 생산하는 방법은 당업계의 숙련인의 일반적인 지식에 속한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "바이러스-유사 입자" (VLP)는 성숙 비리온에 밀접하게 유사하지만, 상기 바이러스의 바이러스 게놈 물질을 함유하지 않는 입자를 의미한다. 보다 자세하게 설명하면, 슈도-비리온 (pseudo-virion)으로도 불리는 VLP는 바이러스 캡시드 및/또는 다른 바이러스 단백질의 다중 카피로 이루어진 서브유닛 구조를 나타낸다. 이들 바이러스 단백질은 생체내에서 규정된 구면 대칭의 VLP로 자가회합할 수 있다. 이들 VLP는 바이러스 단백질을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함하지 않고, 보다 정확하게는 임의의 핵산 분자도 함유하지 않는다. 따라서, VLP는 특성상 비-복제성 및 비-감염성이고, 이런 특성은 VLP를 제약 조성물의 형태로 투여하기에 안전하게 만든다. VLP의 생산 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Liew et al., 2010]; [Plummer and Manchester, 2010] 참조). VLP의 생산을 위한 적절한 방법의 비제한적인 예는 HIV 게놈 및 임의의 핵산 분자를 포함하지 않는 HIV VLP (슈도비리온)를 개시하고 있는 US 5,919,458, EP 386882, WO 91/07425, US 5,861,282 및 WO 91/05864에 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합 바이러스 입자"는 상이한 바이러스로부터의 단백질을 함유하거나 그의 표면에 노출한 바이러스 입자를 의미한다. 또한, 재조합 바이러스 입자는 HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 또는 에피토프를 함유하거나 그의 표면에 노출한 바이러스 입자도 의미한다.

실제로, 대부분의 재조합 바이러스 입자는 본래의 구조 단백질 (즉, 주로 외피 단백질 및 코어 단백질)의 일부가 또 다른 바이러스로부터의 대응물 단백질로 교체된 바이러스 입자이다. 예로서, 외피 단백질이 교환될 수 있다. 그러한 경우에, 재조합 바이러스 입자는 외피 단백질을 코딩하는 서열이 또 다른 바이러스로부터의 외피 단백질을 코딩하는 서열로 교환된 바이러스의 게놈으로 이루어진 "키메릭 (chimeric)" 게놈을 함유한다. 대부분의 재조합 바이러스 입자는 복제성 및 감염성이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 또 다른 바이러스로부터의 단백질을 포함하는 재조합 바이러스는 재조합 바이러스 입자가 HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 또는 에피토프를 내부에 또는 그의 표면에 함유함을 의미한다. 재조합 바이러스 입자의 생산 방법의 비제한적인 예는 다음과 같이 문헌에 설명되어 있다:

* 알파바이러스: HIV (ENV 단백질)를 발현하는 재조합 알파바이러스를 개시하는 WO 02/053757

* 레트로바이러스: 키메릭 당단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터를 개시하는 EP 1499736.

* 아데노바이러스 (예컨대 타입 5, 7, 또는 35): HIV 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 개시하는 US 2007/077257, US 2007/054395, JP 2007037402, WO 2006/120034, US 2004/253210, US 2004/170647, US 2005/070017, US 2003/228329, US 2004/101957, US 2003/219458, US 2004/009936, US 2004/028652, WO 03/050238, WO 03/038057, WO 03/020893, WO 02/31168, WO 02/22080, WO 01/02607, 및 US6716823.

* 두창 바이러스 (카나리아 두창 (canarypox), 우두, 우두 앙카라형 (vaccinia Ankara), 및 계두 (fowlpox) 바이러스): HIV 단백질을 포함하는 바이러스 단백질을 발현하는 재조합 두창 바이러스를 개시하는 US 5,766,598, EP 0592546, US 2007/048861, US 2006/188961, US 2006/134133, EP 1789438, WO 2005/017208, WO 2004/035006, US 2004/146528, JP 2003321391, EP 1378516, WO 95/07099, JP 7170982, DE 4141741, EP 0449116, JP 1148183, JP 1085072, EP 0592546, EP 0243029, US 2005/287162, JP 2004105187, JP 2004089185, WO 03/095656, EP 0592546, WO 96/40880, US 6,136,318, US 5,670,367.

* 바이러스로부터의 적어도 하나의 단백질을 함유하거나, 생산하거나 그의 표면에 노출하는 박테리아: HIV 당단백질 (즉, 외피 단백질)을 발현하는 살모넬라 (Salmonella) 또는 이. 콜라이 (E. coli)를 개시하는 US 7,189,402 및 WO 96/11708.

바람직하게는, 재조합 바이러스 입자는 두창바이러스에 대응하고, 여기서 두창 바이러스는 바람직하게는 카나리아 두창 (예를 들어, ALVAC 바이러스 벡터, 예컨대 특허 US 5,766,598 및 EP 0592546에 개시된 것), 우두 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 95/07099에 개시된 것), 우두 앙카라형 (예를 들어, NYVAC 바이러스 벡터, 예컨대 특허 출원 EP 1789438에 개시된 것), 및 계두 바이러스 (예를 들어, TROVAC 바이러스 벡터, 예컨대 국제 특허 출원 공개 WO 03/095656에 개시된 것)를 포함하는 군에서 선택된다.

보다 바람직하게는, 상기 두창바이러스는 카나리아 두창바이러스이다. 카나리아 두창 바이러스에 대응하고 HIV 펩티드/단백질을 발현하는 재조합 바이러스 입자의 예로서, 특허 US 5,766,598, (컬럼 6, 18행 내지 컬럼 82, 36행, 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 ALVAC 바이러스 벡터를 언급할 수 있고, 여기서 ALVAC 벡터는 예를 들어 HIV-1 gp120, HIV-1 gp160, HIV-1 env의 비 절단가능한 분비된 형태, 막횡단 (transmembrane) 서열에 고정된 HIV-1 gp120, HIV-1 gag/pol, HIV-1 gag/pol 및 env (gp120), HIV-1 gag/pol 및 env (gp160), 및 HIV-1 gag/pol 및 env (막횡단 앵커 (anchor)를 갖는 gp120)를 발현한다. 바람직하게는, 상기 ALVAC 벡터는 HIV-1 gag/pol 및 env (gp120)를 발현하고, 가장 바람직하게는 상기 ALVAC 벡터는 ALVAC vCP1521이다.

"바이러스 입자"는 바람직하게는 비-감염성 바이러스 입자의 생산을 야기하는 돌연변이된 바이러스 게놈 (예를 들어, 핵산 돌연변이, 치환 또는 삽입에 의한)을 함유할 수 있는 SIV 또는 HIV 입자, 예컨대 SIV 또는 HIV 바이러스 입자이다.

돌연변이된 바이러스 게놈을 함유하는 바이러스 입자는 US 7,229,625, US 6,121,021, US 6,923,970, US 6,544,527, US 6,451,322, 및 US 6,080,408에 개시되어 있다.

유리하게는, 및 바이러스 입자 또는 재조합 바이러스 입자를 인간에 투여하기에 안전하도록 만들기 위해, 상기 바이러스 입자 또는 재조합 바이러스 입자는 투여 전에 불활성화된다. 그러한 불활성화는 재조합 바이러스 입자에 대해, 심지어 비-복제성 입자의 경우에도 필요할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "불활성화된 바이러스 입자" (재조합되거나 되지 않은)는 더 이상 감염성이 아니고, 바람직하게는 더 이상 복제성이 아닌 바이러스 입자를 의미한다.

바이러스 입자 또는 재조합 바이러스 입자의 불활성화를 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 바이러스 불활성화의 비제한적인 예는 화학적 불활성화, 예컨대 포르말린, 타우린 클로라민, 포름알데히드, 파라포름알데히드, 프로피올락텐, 베타-프로피올락톤 (REMUNE) 또는 알드리티올-2 (AT-2, US 6,001,155 참조) 처리, 열 불활성화, 물리적 불활성화, 예컨대 U.V 또는 감마선 조사 또는 마이크로파 노출, 및 이들의 조합을 포함한다. HIV 불활성화에 대해서는, 문헌 [RAVIV et al. (J. Virol., vol.79(19), p: 12394-12400, 2005)]을 참조한다.

한 실시양태에 따르면, 상기 불활성화는 포르말린, 타우린 클로라민, 포름알데히드, 파라포름알데히드, 프로피올락텐, 베타-프로피올락톤 (REMUNE) 또는 알드리티올-2 불활성화를 포함하는 군에서 선택되는 화학적 불활성화이다.

별법으로 또는 추가로, 상기 불활성화는 열 불활성화이다. 상기 불활성화는 숙련된 당업자에게 잘 알려져 있고, 상기 방법의 예로서 실시예에서 개시되는 것을 언급할 수 있다. 실제로, 본 발명자들은 놀랍게도 짧은 꼬리 원숭이에서 화학적으로 (즉, AT-2) 및/또는 열 불활성화된 바이러스가 살아있는 비-병원성 박테리아와 조합될 때 보호성 면역관용을 유도함을 확립하였다.

유리하게는, 인간에게 투여하기 위해, 바이러스 입자는 일반적으로 상기 언급된 적어도 2가지의 불활성화 방법을 사용하여 적어도 2회 불활성화된다.

바람직하게는, 상기에서도 언급된 바와 같이, 본 발명의 제약 조성물에 항원으로서 사용되는 바이러스 입자 (재조합되거나 되지 않은, VLP이거나 아닌)는 핵산 (즉, DNA 또는 RNA) 의존성이 아니고, 이것은 바이러스 입자가 임의의 바이러스 DNA 또는 RNA를 함유하지 않거나, 또는 DNA 또는 RNA를 함유하는 경우에는 이것이 면역원성에서 어떠한 역할도 수행하지 않음을 의미한다.

별법으로, 다양한 구조를 갖고 그들의 표면 상에 HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 또는 에피토프를 제시하는 중합체 미세입자 (미세캡슐, 미세구 등의 형태의)가 본 발명에 따른 제약 조성물에 항원으로서 사용될 수 있다. 상기 미세입자는 HIV 바이러스 또는 HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 바이러스 단백질 또는 펩티드 또는 에피토프가 그 위에 부착될 수 있는 적절한 생물학적 또는 화학적 중합체, 예컨대 메타크릴화 덱스트란, 메타크릴화 폴리(에틸렌글리콜) 및/또는 젤라틴으로 이루어질 수 있다. 중합체 미세입자의 예는 문헌 (예를 들어, [Wei Li Lee et al. (2010)], [Sandri et al. (2007)], [Goldberg et al. (2003)], [Delie F. (1998)], [Ponchel et al. (1998)], [Mathiowitz et al. (1997)], [Fasano et al. (1997)], [Chickering et al. (1997)])에서 볼 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 HIV-1 제약 조성물 내의 항원은 HIV-1 Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 또는 에피토프를 발현할 수 있는 하나 이상의 바이러스 입자이다. 별법으로, 본 발명에 따른 HIV-1 제약 조성물 내의 항원은 그들의 표면 상에 HIV-1 Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 또는 에피토프를 제시하는 하나 이상의 중합체 미세입자이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 제약 조성물에 사용되는 항원은 적어도 약 110 kDa의 크기이다. 바람직하게는, 항원은 적어도 약 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 kDa 또는 심지어 이보다 더 큰 크기이다.

본 발명의 측면에서 사용되는 바이러스 항원의 유효량은 SIV 또는 HIV 바이러스와 관련하여 통상적인 일반적인 지식을 사용하고 아래에 개시되는 실시예에 비추어 숙련된 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.

예로서, 상기 항원이 미립자 항원, 보다 구체적으로 바이러스 입자일 때, 바이러스 입자의 양은 상기 혼합물 1 ml 당 약 10⁶ 내지 약 10¹²개이다.

비-병원성 박테리아

짧은 꼬리 원숭이에서 SIV를 사용하여 본 발명자들에 의해 제시된 바와 같이, 상기 규정된 적절한 항원과 함께 점막 또는 피내 또는 상피내 경로에 의해 투여될 때, 제약 조성물에 포함되는 살아있는 비-병원성 박테리아는 상기 언급된 항원에 대한 면역관용을 유도하고 바람직하게는 그 상태를 유지할 수 있다. 인간에서, 이것은 HIV 질환의 예방 및/또는 치료를 가능하게 만든다.

따라서, 상기 박테리아는 본원에서 "면역관용원성 아주반트" 또는 "면역관용원성 담체" 또는 "면역관용원성 비히클 (vehicle)" 또는 "관용의 담체" 또는 "관용 유도 (tolerization) 담체" 또는 "관용 비히클"으로서 지정될 수 있는 특정 아주반트로서 간주될 수 있고, 상기 용어들은 동의어이다.

바람직하게는, 상기 모든 동등한 용어는 항원에 대한 특이적 면역 보호 (바람직하게는, 면역관용)를 달성하여 인간에서 HIV 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해서 상기 규정된 HIV 항원과 조합하여 사용되는 살아있는 비-병원성 박테리아를 의미한다.

보다 바람직하게는, "면역관용원성 비히클"은 다음 면역보호 효과 중 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상을 달성하기 위해서 상기 규정된 HIV 항원과 혼합하여 투여되는 살아있는 비-병원성 박테리아이다:

1) "면역관용원성 비히클"은 전신성 HIV 항원-특이적 항체의 유의한 생산을 유도하지 않는다:

특히, 전신성 항-HIV IgM 및/또는 IgG 항체의 유의한 생산이 관찰되지 않는다. 예를 들어, 유의한 전신 체액성 반응이 존재하지 않고, 즉 특이적인 검출가능한 전신 항체 반응이 전통적인 임상 실험 방법, 예컨대 ELISA에 의해 검출될 수 없거나, 또는 전신 항체가 검출되면, 이들은 HIV 바이러스 감염에 대해 보호 작용을 보이지 않는다.

2) "면역관용원성 비히클"은 CD4+ T 세포의 유의한 HIV 항원-특이적 증식을 유도하지 않는다:

특히, 표준 검정, 예컨대 수반되는 실시예에서 설명되는 검정에 의해 측정될 때 HIV 항원-특이적 CD4 세포의 유의한 증식이 시험관내 HIV 항원 자극시에 관찰되지 않는다.

3) "면역관용원성 비히클"은 시험관내 HIV 항원 자극시에 CD8+ T 세포에 의한 감마-인터페론의 유의한 생산을 유도하지 않는다:

특히, 시험관내 HIV 항원 자극시에 관찰된 CD8+ T 세포에 의한 감마 인터페론 분비의 수준은 ELIspot 검정에 대한 역치 수준 미만이다.

4) "면역관용원성 비히클"은 HIV 항원-제시 CD4+ T 세포의 활성화를 억제하는 유의한 CD8+ T 세포 반응을 유도한다:

특히, 상기 반응은 수반되는 실시예에서 제시되는 바와 같이 CD8+ T 세포에 의한 바이러스 복제의 억제 수준 ("유의한" CD8+ T 세포 반응을 나타냄)을 측정하는 시험관내 시험에 의해 결정할 수 있다. 이들 CD8+ T 세포는 또한 CD8+ "조절" T-세포로 불린다. 보다 특히, 상기 반응은 감마-인터페론의 유의한 생산을 유도하지 않음을 고려하면, 이것은 비-세포독성이다. 보다 특히, 상기 반응은 MHC-Ib/E-제한된다. 보다 특히, TCRαβ는 바이러스 복제를 억제하는 CD8+ T 세포 반응에 관여하는 것으로 보인다. 보다 특히, 상기 반응은 CD8+ T 세포가 고갈된 동일한 세포 집단에 비해 HIV 항원-제시 CD4+ T 세포의 활성화를 억제한다. 바람직하게는, 상기 반응은 HIV 항원-제시 CD4+ T 세포의 조기 활성화를 억제하고, 상기 "조기" 활성화는 Ki67+ 마커에 의해 측정된다 (문헌 [Scholzen and Gerdes. J. Cell Physiol. 182, 311-322 (March 2000)]).

상기 1), 2) 및 3)에서 사용된 용어 "유도하지 않는다"는 적절한 정량적 검출 검정에 대한 역치 수준 미만의 결과를 의미하고, 상기 "역치 수준"은 음성 대조군(들)을 기초로 하여 검정에서 결정된 값이고: 상기 값 미만이면, 결과는 음성 결과이다. 상기 값은 검정마다 및 검출 방법마다 상이할 수 있다.

유리하게는, 면역관용원성 비히클은 살아있는 다음과 같은 살아있는 박테리아로부터 선택된다:

- 비-병원성 박테리아, 특히 활생균 (probiotics) 및 공생 박테리아;

- 약독화된 (attenuated) 병원성 박테리아; 및

- 불활성화된 (임의로 또한 사전에 약독화된) 병원성 박테리아.

면역관용원성 비히클은 재조합되거나 되지 않을 수 있다.

본 발명의 측면에서 면역관용원성 비히클로서 사용되는 "비-병원성 박테리아"은 일반적으로 인간에서 임의의 병상을 유도하지 않는다. 이 때문에 이들은 일반적으로 안전한 것으로 인정된다 (Generally Recognized As Safe (GRAS)). 물론, 상기 박테리아는 인간에게 투여가능하여야 한다.

면역관용원성 비히클로서 사용되는 바람직한 비-병원성 박테리아는 공생 박테리아이다. 그러한 박테리아는 숙련된 당업자에게 잘 알려져 있다. 비-제한적인 예는 바실루스 (Bacillus) 종 (예를 들어, 비. 코아굴란스 (B. coagulans)), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 브레베 ( Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 롱굼 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 락티스 (Bifidobacterium lactis), 에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli), 락토바실루스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실루스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 존소니이 (Lactobacillus johnsonii), 락토바실루스 플란타룸, 락토바실루스 레우테리 (Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실루스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실루스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 락토코쿠스 락티스, 스트렙토코커스 테르모필루스 (Streptococcus thermophilus) 등을 포함한다.

본 발명의 측면에서 면역관용원성 비히클로서 사용하기 위한 "공생 박테리아"은 보다 특히 상기 목록의 조합물을 비롯하여 상기 목록에서 선택되는 락트산 박테리아 또는 비피도박테리움이 유리하다. 바람직한 공생 박테리아는 락토바실루스 종, 보다 바람직하게는 락토바실루스 플란타룸이다. 아래에서 보고되는 실시예는 락토바실루스 플란타룸이 상기 규정된 항원과 함께 투여될 때 바이러스 면역관용을 유발하는 면역관용원성 비히클임을 처음으로 보여준다.

유리하게는, 비-병원성 박테리아, 예컨대 2 이상의 공생 박테리아의 조합물이 면역관용원성 비히클로서 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "병원성 박테리아"은 인간을 병상을 유도하는 박테리아를 의미한다. 상기 박테리아는 숙련된 당업자에게 잘 알려져 있고, 특히 리스테리아 (Listeria) 종 (예를 들어, 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes)), 코리네박테리움 (Corynebacterium) 종, 미코박테리움 종, 로코커스 (Rhococcus) 종, 유박테리아 (Eubacteria) 종, 보르타델라 (Bortadella) 종 및 노카르디아 (Nocardia) 종을 포함한다. 바람직하게는, 병원성 박테리아는 미코박테리움 종 중에서 선택되고, 보다 바람직하게는 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis)이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "약독화된 병원성 박테리아"은 하나 또는 몇몇의 돌연변이 또는 하나 이상의 약독화 처리 (예를 들어, 화학적 처리 및/또는 특이적 배지 상에서의 연속 계대배양) 때문에 그의 야생형 대응물에 비해 덜 병독성인 병원성 박테리아이다. 상기 약독화된 병원성 박테리아는 당업자에게 잘 알려져 있다. 약독화된 병원성 박테리아의 비제한적인 예는 약독화된 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 및 미코박테리아 (Mycobacteria)를 포함하고, 약독화된 미코박테리아가 바람직하다. 약독화된 미코박테리아의 예로서, "BCG"로도 알려진 "칼메르-게랑간균 (Bacille de Calmette Guerin)", 및 보다 특히 6개의 널리 사용되는 BCG 균주 - 진화상 초기 균주 BCG 재퍼니즈 (Japanese), DU2 그룹 III 내의 2개의 진화상 후기 균주 (BCG 대니쉬 (Danish) 및 글락소 (Glaxo)), 및 DU2 그룹 IV 내의 3개의 진화상 후기 균주 (BCG 코노트 (Connaught), 파스퇴르 (Pasteur), 및 타이스 (Tice))를 언급할 수 있다. 약독화된 미코박테리아의 또 다른 예로서, 또한 재조합 BCG, 예컨대 문헌 [HOFT et al. (2008)]에 개시된 균주 rBCG30, 문헌 [WANG et al. (2008)]에 개시된 재조합 BCG, 및 또한 국제 특허 출원 공개 WO 2005/111205 및 WO 02/102409, 및 특허 US 7,122,195 및 US 6,261,568에 개시된 재조합 BCG를 언급할 수 있다.

유리하게는, 약독화 대신에 또는 이에 추가로, 병원성 박테리아는 본 발명의 측면에서 면역관용성 비히클로서 사용되도록 불활성화될 수 있지만, 약독화된 병원성 박테리아는 또한 불활성화된 후에 사용될 수 있다.

"불활성화된 병원성 박테리아"은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 불활성화된 병원성 박테리아의 제조 방법은 당업계의 통상적인 일반적인 지식의 일부를 혀성한다. 상기 방법의 예로서, 파지 매개 용해, 화학적 불활성화, 예컨대 포르말린 처리 (US 7,393,541 참조), 열 불활성화, 물리적 불활성화, 예컨대 동결건조 (예를 들어, 연장 동결 건조 (Extended Freeze Drying)) 또는 U.V 또는 감마선 조사 (WO 2008/128065 참조) 또는 마이크로파 노출, 및 이들의 조합을 언급할 수 있다.

바람직하게는, 상기 면역관용원성 비히클은 BCG처럼 병원성 박테리아의 약독화된 유도체이다. 아래 보고된 실시예는 BCG가 상기 규정된 항원과 함께 투여될 때 바이러스 면역관용을 유발하는 면역관용원성 비히클임을 처음으로 보여준다.

재조합될 때, 본 발명에 따른 면역관용원성 비히클은 임의의 HIV 단백질 또는 펩티드 또는 에피토프를 발현하지 않는다.

바람직하게는, 면역관용원성 비히클로서 사용되는 적어도 유의한 양의 살아있는 박테리아는 중간 로그기의 것이다. 보다 바람직하게는, 박테리아 세포의 총수의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 심지어 약 100%가 중간 로그기의 것이다.

면역관용원성 비히클의 유효량은 당업자가 쉽게 결정할 수 있고, 그러한 유효량의 예가 아래에서 개시된다.

예로서, 본 발명의 제약 조성물 내의 상기 박테리아의 양은 상기 혼합물 1 ml 당 약 10⁴ 내지 약 10¹⁴ CFU이다.

제약 조성물

상기 조성물은 또한 본원에서 "면역관용원성 조성물" 또는 "관용-면역원성 조성물"로 언급되고, 이들 용어는 동등한 것이다.

면역관용원성 비히클 및 HIV 바이러스의 Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 항원은 본 발명의 제약 조성물 내에 혼합물로서 함유되는 2개의 분리된 별개의 성분이다. 이것은 상기 면역관용원성 비히클 및 상기 항원이 상기 조성물에 별개의 성분으로 존재함을 의미한다.

유리하게는, 본 발명의 제약 조성물은 아주반트로서 임의의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, CpG 또는 dsRNA)를 포함하지 않는다.

면역관용원성 비히클은 박테리아가기 때문에, 동일한 속 및/또는 종의 박테리아가 항원의 공급원으로서 재조합 형태로 별개로 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 박테리아는 적절한 조절 서열 (유도가능한 또는 구성적 프로모터 포함)의 제어 하에 위치하는 항원을 코딩하는 핵산을, 세포 내에 함유된 핵산 벡터 상에 또는 박테리아 염색체 내에 통합된 핵산 서열로서 함유할 것이다. 이에 의해, 재조합 박테리아는 상기 항원을 발현하거나 생산할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 제약 조성물은 박테리아인 면역관용원성 비히클, 및 HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 하나 이상의 바이러스 단백질 또는 펩티드 또는 에피토프이고 면역관용원성 비히클과 동일한 속 및/또는 종에 속하는 재조합 박테리아에 의해 별개로 생산된 항원을 포함한다.

본 발명에 따른 제약 조성물에서, 상기 항원이 미립자 항원 및 보다 구체적으로 바이러스 입자일 때, 상기 바이러스 입자 (상기 혼합물 1 ml 당 입자로 표현됨) 대 상기 박테리아 (상기 혼합물 1 ml 당 CFU로 표현됨)의 상기 혼합물 내의 비율은 약 1:10 내지 약 1:1000, 바람직하게는 약 1:25 내지 약 1:750, 보다 바람직하게는 약 1:50 내지 약 1:500, 훨씬 더 바람직하게는 약 1:75 내지 약 1:250, 보다 더 바람직하게는 약 1:100이다.

본 발명의 제약 조성물의 투여

면역관용원성 비히클 및 항원을 동시에, 또는 별개로, 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은

- 제1 용기 내에 상기 규정된 바와 같은 항원; 및

- 제2 용기 내에 상기 규정된 바와 같은 살아있는 비-병원성 박테리아

를 포함하고, 상기 항원 및 상기 박테리아는 점막 또는 피내 또는 상피내 투여를 위한 제약상 허용되는 담체 내에 존재하는 것인, HIV 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 인간에서 HIV 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은

- 상기 규정된 바와 같은 면역관용원성 비히클로서 살아있는 비-병원성 박테리아; 및

- 상기 규정된 바와 같은 HIV Gag 및/또는 Pol 단백질로부터의 하나 이상의 에피토프를 갖는 미립자 항원 또는 항원

을 포함하는, HIV 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 인간에서 HIV 질환의 예방 및/또는 치료시에 동시의, 별개의 또는 순차적인 사용을 위한 조합 제약 조성물로서의 제품을 제공하는 것이다. 상기 예방 및/또는 치료는 상기 조합 제약 조성물을 상기 인간에게 점막에 또는 피내 또는 상피내 투여함으로써 달성된다. 이를 위해서, 면역관용원성 비히클 및 항원을 동시에, 또는 별개로, 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

예로서, 살아있는 비-병원성 박테리아는 경구로 (예를 들어, 경구 약물 또는 식품 보충제로서) 투여될 수 있는 반면, 항원은 점막, 또는 피내 또는 상피내 투여된다.

물론, 적절한 제약 비히클은 예상된 부위 (예를 들어, 점막 표면)로 각각의 적합한 전달을 보장하기 위해 사용될 수 있다. 각각의 면역관용원성 비히클 및 항원의 투여를 위한 시간 및 용량은 숙련된 당업자에 의해 쉽게 조정될 것이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 제약 조성물은 점막 또는 피내 또는 상피내 제약 조성물이다. 또한 바람직하게는, 이것은 경구 제약 조성물이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "점막 또는 피내 또는 상피내 제약 조성물"은 점막 또는 피내 또는 상피내 투여를 위한 제약 조성물이고, 이것은 이것이 상기 투여를 위해 제제화됨을 의미한다.

특히, 제약 조성물은 상기 항원 및 상기 박테리아의 점막 또는 피내 또는 상피내 전달을 위한 하나 이상의 적절한 제약 비히클 (또는 지지체)를 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게는, "점막 전달"은 본원에서 비내, 경구, 설하, 기관, 인두, 기관지, 식도, 위, 십이지장, 장, 직장, 포피 및 질내 전달로부터 선택된다. "점막 전달"은 점막 표면, 예컨대 비내, 경구, 설하, 기관, 기관지, 인두, 식도, 위, 및 직장을 포함하는 십이지장, 소장 및 대장의 점막, 및 포피 및 질 점막으로의 전달이다. 본 문맥에서, 점막 표면은 또한 눈의 외부 표면, 즉, 눈을 둘러싸는 눈의 점막을 포함한다. 보다 바람직하게는, 점막 표면은 질 및 소화성 점막, 보다 바람직하게는 소화성 점막을 의미한다. 보다 바람직하게는, 점막 전달은 경구 전달이다.

따라서, 제약 조성물은 또한 투여 경로에 따라 하나 이상의 제약 비히클을 포함할 수 있다. 제약 기술의 당업자는 점막 표면으로의 전달 또는 피내 또는 상피내 전달을 위한 비히클을 잘 알고 있거나 이를 쉽게 확인할 수 있다. 이와 관련하여 유용한 참조문헌은 [Chien (Novel Drug delivery system, Chapters 3 through 6 및 9, Marcel Dekker, 1992), Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6^th Ed. (various editors, 1989-1998, Marcel Dekker)]; 및 [Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (ANSEL et al., 1994, WILLIAMS & WILKINS).

본 발명에서 유용한 약물 전달을 위한 예시적인 방법 및 경로를 아래에 간단히 설명한다. 기관지, 세기관지, 기관, 비내, 경구, 포피 또는 인두 점막에 대한 투여는 제약 조성물을 흡입가능 스프레이 등 (예를 들어, 비내 스프레이, 에어로졸 스프레이 또는 펌프 스프레이 등), 용액, 겔 등으로서 제제화함으로써 달성할 수 있다. 제약 조성물을 코 점막, 기관 및 세기관지에 전달하기 적합한 연무기 (nebulizer) 장치는 당업계에 공지되어 있고, 따라서 본원에서 설명하지 않을 것이다. 제약 조성물은 용액, 에멀젼, 미세에멀젼, 수중유 에멀젼, 무수 액체 및 수중유 에멀젼, 다른 타입의 에멀젼을 포함하는 군에서 선택되는 비히클을 포함할 수 있다.

질 점막에 대한 투여는 제약 조성물을 용액, 관장제, 포움 (foam), 좌제, 질내 정제 또는 국소 겔로 제제화함으로써 달성할 수 있다. 질내 전달을 위한 바람직한 비히클은 친수성 및 소수성 비히클, 예컨대 에멀젼 또는 겔 제제 (예를 들어, 오일/물 에멀젼 겔)의 제제화에 통상 사용되는 것을 포함한다.

소화관 점막에 대한 투여는 제약 조성물을 캡슐, 미세캡슐로 제제화함으로써 달성할 수 있다. 소화 전달에 바람직한 비히클은 일반적으로 경구 투여되는 캡슐 및 미세캡슐 (예를 들어, 펙틴 및/또는 알기네이트의 캡슐 및 미세캡슐), 예컨대 소화 전달을 위한 제제의 제제화시에 통상 사용되는 것 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2007/140613에 개시된 미세캡슐)에 대응한다. 별법으로, 소화 전달은 적절한 액체 및/또는 식품, 예컨대 음료, 요거트 등을 소비하거나 투여함으로써 달성할 수 있다.

피내 또는 상피내 투여는 숙련된 당업자에게 잘 알려져 있다. 피내 투여 (예를 들어, 주사)는 예를 들어 바늘-장치, 예컨대 특허 US 6,933,319 및 국제 특허 출원 공개 WO 2004/101025에 개시된 것, 또는 적절한 무바늘 장치를 사용하여 수행할 수 있다.

제약 조성물은 추가로 적어도 하나의 흡수제를 포함할 수 있다. "흡수제"는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예로서, 계면활성제, 예컨대 소르비톨 무수물의 지방산 부분 에스테르의 폴리옥시에틸렌 유도체 (예를 들어, 트윈(Tween)® 80, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 50 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 옥톡시놀), 담즙산염, 예컨대 나트륨 글리코콜레이트, 혼합된 미셀 (micelle), 에나민, 질소 산화물 공여자 (예를 들어, 바람직하게는 NO 제거제 (scavenger), 예컨대 카르복시-PITO 또는 도클로페낙 나트륨과 동시 투여되는 S-니트로소-N-아세틸-DL-페니실라민, NOR1, NOR4), 살리실산나트륨, 아세토아세트산의 글리세롤 에스테르 (예를 들어, 글리세릴-1,3-디아세토아세테이트 또는 1,2-이소프로필리덴글리세린-3-아세토아세테이트), 시클로덱스트린 또는 베타-시클로덱스트린 유도체 (예를 들어, 2-히드록시프로필-베타-시클로덱스트린 및 헵타키스(2,6-디-O-메틸-베타-시클로덱스트린)), 중간쇄 지방산, 예컨대 모노- 및 디글리세리드 (예를 들어, 코코넛 오일의 나트륨 카프레이트-추출물, 카프물 (Capmul)), 또는 트리글리세리드 (예를 들어, 아밀로덱스트린, 에스타람 (Estaram) 299, 미글리올 (Miglyol) 810), 중합체, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 카르보폴, 폴리카르보필, 트라가칸트 및 나트륨 알기네이트, 및 점막 또는 피내 또는 상피내 전달을 위해 변형된 다른 흡수제를 언급할 수 있다. 약물의 점막 또는 피내 또는 상피내 전달에 성공적으로 사용된 흡수제에 대한 일반적인 원리에 대한 참조문헌에 대해서는, 문헌 [Chien, Novel Drug Delivery Systems, Ch. 4 (Marcel Dekker, 1992)]을 참조한다.

제약 조성물은 하나 이상의 첨가제 (예를 들어, 희석제, 부형제, 안정화제, 보존제 등)를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6^th Ed. (various editors, 1989-1998, Marcel Dekker)]; 및 [Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (ANSEL et al., 1994, WILLIAMS & WILKINS)]을 참조한다.

아래 개시된 바와 같이, 인간 대상체에게 투여되는 본 발명에 따른 제약 조성물의 적절한 투여량은 상기 대상체의 하나 이상의 특징, 예컨대 성별, 연령, 체중, 건강 등에 따라 결정될 수 있다.

예로서, 항원이 미립자일 때, 보다 구체적으로, 바이러스 입자일 때, 1일 당 약 10⁸ 내지 약 10¹⁴개 바이러스 입자의 용량이 상기 인간에게 투여될 수 있다. 또 다른 예로서, 1일 당 약 10⁶ 내지 약 10¹⁶ CFU의 살아있는 비-병원성 박테리아의 용량이 상기 인간에게 투여될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물의 용도

본 발명의 목적은 의약으로서, 바람직하게는 백신으로서 사용하기 위한, 상기 설명된 바와 같은 제약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 상기 인간에게 상기 규정된 바와 같은 유효량의 제약 조성물을 점막 또는 피내 또는 상피 내로 투여하는 단계를 적어도 포함하는, HIV 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 인간에서 HIV 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 예방 목적을 위해, "~를 필요로 하는 인간"은 바람직하게는 적어도 약 2세인 임의의 인간일 수 있다. 치료 목적을 위해, "~를 필요로 하는 인간은 HIV 질환으로 고통받기 때문에 치료되는 인간이다.

"HIV 질환"은 AIDS 및 혈청전환 (만성 감염의 확립)을 포함하는 질환 진행의 보다 초기 단계를 포함하는 임의의 HIV-관련 면역 장애를 의미한다.

본 발명은 추가로 상기 인간에게 상기 규정된 바와 같은 유효량의 제약 조성물을 점막 또는 피내 또는 상피 내로 투여하는 단계를 적어도 포함하는, HIV에 대해 인간을 보호하기 위한 방법에 관한 것이다.

특히, 그러한 방법은 HIV에 점막 노출될 경우에는 HIV 감염으로부터 및/또는 HIV에 정맥내 노출될 경우에는 HIV 복제로부터 인간을 보호할 수 있도록 한다.

본 발명은 또한 상기 인간에게 상기 규정된 바와 같은 유효량의 제약 조성물을 점막 또는 피내 또는 상피 내로 투여하는 단계를 적어도 포함하는, HIV 혈청전환으로부터 인간을 보호하기 위한 방법에 관한 것이다. 이에 의해, 상기 인간은 혈청반응 양성이 되지 않을 것이고, 유의한 수준의 HIV 항체를 보이지 않을 것이다.

용어 "백신접종"은 인간에서 HIV 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 실시되는 행위(들) (특히, 본 발명의 제약 조성물의 투여)를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 제약 조성물은 인간에서 HIV 바이러스의 Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 항원에 대한 면역관용을 유도하고, 바람직하게는 유지하기에, 즉 다시 말해서 상기 인간의 백신접종 (또는 "관용 유도")에 유용하다. 따라서, 본 발명의 제약 물질을 사용한 인간의 백신접종은 "면역관용원성 백신접종" (또는 "관용 유도" 또는 "관용유도")로 간주된다.

본 발명의 제약 조성물의 점막 또는 피내 또는 상피내 투여 후에 (즉, 면역관용원성 백신접종 후에), 면역관용이 인간에서 성공적으로 유도되면, 상기 인간은 "백신접종된" (또는 "관용유도된" 또는 "면역관용성인") 것으로 간주된다. 생체내 바이러스 감염성 시험접종에 대한 "백신접종된" 인간의 반응, 즉, 혈장 바이러스 RNA 로드에 의해 평가되는 바이러스 복제는 항원 단독 또는 표준 아주반트 (상기 규정된 바와 같은) 또는 비제약 조성물 또는 위약과 조합된 항원이 투여된 대조군 인간의 혈장 바이러스 RNA 로드에 비해 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 98% 또는 99%, 또는 심지어 이보다 더 (99.5%, 99.8%, 99.9%, 100%) 감소된다.

본 발명에 따르면, 면역관용원성 백신접종은 제약 조성물의 1회 또는 수회 연속 투여를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역관용원성 백신접종은 상기 조성물의 적어도 2회 이상의 연속 투여 (즉, 백신접종), 보다 바람직하게는 2회 초과의 연속 투여를 포함할 수 있다.

유리하게는, 연속적인 면역관용원성 백신접종 사이의 간격은 1분 내지 3개월, 바람직하게는 15분 내지 2개월이다.

보다 유리하게는, 본 발명의 면역관용원성 백신접종은 또한 제1 점막 또는 피내 또는 상피내 면역관용원성 백신접종 1년 또는 수년 (예를 들어, 1 내지 10년) 후의 추후 (recall) 면역관용원성 백신접종을 포함할 수 있다.

제1 점막 또는 피내 또는 상피내 면역관용원성 백신접종 후의 새로운 면역관용원성 백신접종은 점막, 피내 및 상피내 면역관용원성 백신접종으로부터 선택될 수 있다. 현저하게, 새로운 면역관용원성 백신접종이 상피내 또는 피내 주사이면, 특이적 전신 체액성 및/또는 세포독성 (감마 인터페론 생성-) 반응이은 검출가능할 수 있지만, 이것은 질환의 예방 또는 치료에 대한 영향을 주지 않는다.

본 발명에 따르면, 유효량의 제약 조성물을 그를 필요로 하는 인간에게 투여한다. 용어 "유효량"은 본원에서 면역관용, 바람직하게는 "Ts" 면역관용의 유도를 통한 치유 또는 보호 효과 (즉, 면역보호 효과)인 요구되는 생물학적 효과를 달성하기 위해 충분한 양을 의미한다. 효과적인 투여량은 치료되는 대상체의 연령, 성별, 건강, 및 체중, 존재할 경우 병용 치료의 종류, 치료의 빈도 및 예상된 효과의 특성에 따라 결정될 것이 이해된다. 아래에서 제공되는 효과적인 용량의 범위는 본 발명을 제한하고자 의도하지 않고, 바람직한 용량 범위를 나타낸다. 그러나, 바람직한 투여량은 과도한 실험을 수행하지 않으면서 당업자에 의해 이해되고 결정될 수 있기 때문에 대상체에게 조정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, Mass. (1985)]을 참조한다.

예를 들어, HIV에 대해 인간 성인에 대한 일반적인 투여량은 용량당 약 10⁶ - 10¹²개의 HIV 바이러스 입자 (즉, VLP, 재조합 또는 비-재조합 바이러스 입자)일 것이고, 10⁸ - 10¹⁰개가 바람직하다. 물론, 어떠한 투여량이 사용되더라도, 이것은 본원에서 설명되는 바와 같이 공지의 방법에 의해 결정할 때 안전하고 유효한 양이어야 한다.

또한, 당업자는 그의 일반적인 지식에 비추어 요구되는 생물학적 효과를 달성하기 위해 인간에게 투여되는 면역관용원성 비히클의 유효량을 결정할 수 있다.

예로서, 병원성 박테리아 (예를 들어, BCG)의 약독화된 유도체에 대한 상기 유효량은 용량당 10⁴ 내지 10¹², 바람직하게는 10⁵ 내지 10¹⁰ CFU (콜로니 형성 단위), 보다 바람직하게는 10⁶ 내지 10⁸ CFU의 범위에 포함된다. 또 다른 예로서, 병원성 박테리아 또는 불활성화된 병원성 박테리아 (예를 들어, BCG)의 약독화된 유도체에 대한 상기 유효량은 용량당 0.001 mg 내지 1 g, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10 mg의 범위에 포함된다.

또 다른 예로서, 비-병원성 박테리아 (예를 들어, 락토바실루스 종)에 대한 상기 유효량은 용량당 약 10⁶-10¹⁴ CFU, 보다 바람직하게는 약 10¹⁰-10¹² CFU의 범위에 포함된다.

상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 제약 조성물은 인간에서 미래의 HIV 질환을 예방하기 위해, 또는 이미 HIV 질환으로 고통받는 인간을 치료하기 위해 적합하다.

치료 목적을 위해, 상기 규정된 바와 같은 "HIV 바이러스의 Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 항원"은 자가 항원일 수 있고, 즉 치료되는 인간을 감염시킨 HIV 바이러스로부터 유래될 수 있다. 이 경우에, 예를 들어, HIV 바이러스는 인간으로부터 단리될 수 있고, 이어서 상기 설명된 바와 같은 제약 조성물을 얻기 위해 면역관용원성 비히클과 최종적으로 조합하기 위해 배양되고 불활성화 (바람직하게는 적어도 2회 불활성화)될 수 있다.

추가로, 예를 들어, HIV Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 자가 또는 비-자가 항원을 포함하는 제약 조성물은 먼저 비검출가능한 바이러스 로드를 야기한 통상적인 항바이러스 처리 동안 인간에게 투여될 수 있다. 이어서, 통상적인 항바이러스 처리는 급성 감염된 비-자가 CD4 세포의 적절한 생체외 바이러스 복제 억제가 자가 바이러스-특이적 CD8 세포에 의해 달성되거나 또는 CD8 T 세포에 의해 유도되는 CD4 T 세포 활성화의 적절한 억제가 달성되면, 제약 조성물을 사용한 하나 이상의 면역관용원성 백신접종 후에 중지될 수 있다.

특히, 치료 목적을 위해, 제약 조성물은 치료되는 인간의 생애 동안 단지 1회만 투여될 수 있다. 별법으로, 이것은 동일한 날에 또는 예를 들어 약 1일 내지 약 1년 또는 이보다 긴 기간 떨어진 상이한 날에 치료되는 인간의 생애 동안 2회 이상 투여될 수 있다. 보다 특히, 이것은 예를 들어 약 1일 내지 약 1년, 또는 이보다 긴 기간 동안 매일 또는 주기적으로 투여될 수 있다. 필요한 경우, 제약 조성물은 치료되는 인간의 생애 내내 투여될 수 있다.

본 발명은

a) 상기 백신접종된 인간의 혈액 샘플로부터 말초 혈액 CD8 T 세포를 단리하고;

b) 적절한 조건 하에

(i) 상기 HIV 바이러스에 대해 동등한 바이러스 균주에 의해 시험관내에서 급성 감염된 동종이형 또는 자가 CD4+ T 세포와 함께 상기 단리된 CD8 T 세포; 및

(ii) 상기 시험관내에서 급성 감염된 동종이형 또는 자가 CD4+ T 세포

를 배양하고;

c) 배양 상청액을 회수하고;

d) 상기 상청액 내의 바이러스 로드를 측정하고;

e) 상기 인간이 상기 HIV 바이러스에 대해 보호되는지의 여부를 결정하는 것

을 포함하는, 인간이 HIV 바이러스에 대해 보호되는지 결정하기 위한 시험관내 방법을 추가로 제공한다

"시험되는 HIV 바이러스에 동등한 바이러스 균주"는 상기 바이러스 균주가 야생형 바이러스로부터 기원하고 시험되는 HIV 바이러스의 것에 유사한 본질적인 특징을 갖는다는 것을 의미한다 (예를 들어, 개별적인 HIV-1로부터 기원하는 바이러스 균주 HTLVIIIB를 언급할 수 있고: HTLVIIIB는 HIV-1"에 동등한 바이러스 균주"로 간주될 수 있다). 바람직하게는, 상기 바이러스 균주는 시험되는 HIV 바이러스인 야생형 바이러스로부터 기원할 것이다. 상기 바이러스 균주는 따라서 HIV 바이러스, 특히 야생 HIV 바이러스를 수반하는 연구를 위한 적절한 모델을 나타낸다. 바이러스 균주는 물론 특히 안전성의 측면에서 상기 연구에 아주 적합하다.

상기 모든 단계는 당업계의 숙련인에게 잘 공지된 표준 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 특히, 단계 b)에 대한 적절한 배양 조건은 본 발명의 분야의 일반적인 지식의 일부 (예컨대 아래 실시예에서 설명되는 통상적인 방법)이다.

바이러스 로드는 통상적인 방법, 예컨대 아래 실시예에서 설명되는 방법에 의해 단계 d)에서 측정될 수 있다.

하위 단계 b)(ii)에 따라 상기 시험관내에서 급성 감염된 동종이형 또는 자가 CD4+ T 세포의 배양액으로부터 회수된 상청액 내의 바이러스 로드는 단계 e)에서의 결정을 위한 참조물로서 사용될 것이다. 유리하게는, 예를 들어, 시험관내에서 급성 감염된 동종이형 또는 자가 CD4+ T 세포로부터의 세포만을 함유하는 이중 (또는 3중 또는 4중 또는 그 초과의) 웰로부터의 상청액 내의 바이러스 농도의 기하 평균을 CD8 T 세포, 및 시험관내에서 급성 감염된 동종이형 또는 자가 CD4+ T 세포로부터의 세포를 함유하는 이중 (또는 3중 또는 4중 또는 그 초과의) 웰로부터의 상청액 내의 바이러스 농도의 기하 평균과 비교함으로써 "억제 퍼센트 (%)" 또는 "억제 비율" 또는 "항바이러스 효과"를 계산할 것이다.

이어서, 상기 단계 e)의 결정은 바람직하게는 다음과 같이 수행한다:

- 억제 비율이 약 100보다 높으면, 상기 인간이 보호된다고 결론지을 수 있다. 일반적으로, 이것은 HIV-비 감염된 인간에게 효율적인 예방적 항바이러스 처치를 시행하거나 또는 HIV-감염된 인간에게 효율적인 치료적 처치를 시행할 경우에 그러할 것이고, 상기 효율적인 예방적 또는 치료적 처치는 바람직하게는 본 발명에 따른 제약 조성물을 포함하고, 따라서 보호 상태가 유지되는 한 인간에게 임의의 예방적 또는 치료적 처치를 추가로 시행할 필요는 없을 것이다.

- 억제 비율이 약 100보다 낮으면, 상기 인간은 상기 바이러스에 대해 보호되지 않는다고 결론지을 수 있다. 이때, HIV-비 감염된 인간 또는 HIV-감염된 인간에게 유리하게는 각각 본 발명에 따른 제약 조성물을 포함하는 예방적 또는 치료적 처치가 시행될 것이고, 상기 시험관내 방법은 인간이 보호됨을 보장하기 위해 적절한 시간 간격으로 1회 이상 수행될 것이다.

또한, 본 발명은 상기 규정된 바와 같이 시험되는 상기 HIV 바이러스에 동등한 바이러스 균주에 의해 감염될 수 있는 동종이형 또는 자가 CD4+ T 세포를 포함하는, 인간이 HIV 바이러스에 대해 보호되는지를 시험관내에서 결정하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 또한 상기 언급한 동종이형 또는 자가 CD4+ T 세포를 감염시키기에 적절한 농도의 적절한 바이러스 균주 및/또는 적절한 시약 및/또는 대조군 및/또는 배지 (예컨대, 세포 현탁, 세포 배양, 세포 저장을 위한 배지 등)를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 특정 종류의 HIV 바이러스에 특이적일 수 있거나, 또는 밀접한 (특히, 계통발생적으로 밀접한) 다양한 종류의 바이러스에 적합하도록 조정될 수 있다.

본 발명은 임의의 만성 감염성 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용되도록 쉽게 조정될 수 있다. 상기 질환의 비제한적인 예는 B형 및 C형 간염, 인간 유두종 바이러스 (HPV), EBV 및 다른 헤르페스 바이러스, 결핵, 나병, 레이쉬마니아증 (leishmaniosis) 등이다.

전체적으로, 상기 언급한 감염 또는 질환과 연관된 하나 또는 몇몇의 병원성 항원이 상기 언급된 병원성 단백질 또는 펩티드로부터 유래된 에피토프를 제시하는 CD4+ T 세포의 특이적 활성화에 관련될 때마다, CD4+ T 세포의 활성화의 특이적 억제/방지는 상기 언급된 항원(들) 및 본원에서 설명되는 면역관용원성 비히클을 포함하는 점막 또는 상피내 또는 피내 제약 조성물에 의해 생성되는 비-세포독성 CD8+ T 세포에 의해 유도될 수 있다.

바이러스 감염 및 연관 질환이 본 발명의 제약 조성물을 사용하여 포유동물/인간에서 예방 및/또는 치료될 수 있음이 본원에서 제시된다. 이 내용을 기초로 하여, (i) 본원에 개시된 면역관용원성 비히클; 및 (ii) 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물 또는 기생충 기원의 임의의 항원을 포함하는 다른 제약 조성물을 제공하는 것이 가능하다. 상기 제약 조성물은 상기 면역관용원성 비히클 및 상기 항원의 적절한 전달 (바람직하게는, 점막 또는 피내 또는 상피내)을 위해 제제화된다. 이들은 항원이 그로부터 유래되는 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물 또는 기생충에 의해 유발되는 포유동물의 만성 감염의 예방 및/또는 치료에 유용하다. 그 예는 (i) 본원에서 설명되는 면역관용원성 비히클; 및 (ii) 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)로부터 유래된 항원을 포함하는 박테리아 제약 조성물이다. 상기 박테리아 제약 조성물은 상기 항원 및 상기 면역관용원성 비히클의 적절한 전달 (바람직하게는, 점막 또는 피내 또는 상피내)을 위해 제제화된다. 인간에서 결핵을 예방 및/또는 치료하기 위해 특히 관심을 끄는 대상은 미코박테리아 항원이 코희 (Koch)의 바실루스로부터 유래되는 상기 박테리아 제약 조성물이다.

본 발명의 제약 조성물에 의해 달성된 면역 보호

관용은 점막 시스템을 통해 흡수된 항원을 인식하고 동일한 항원과의 후속 접촉에 대한 다른 면역학적 변형과 일반적으로 연관된 무반응 (anergy)을 발생시키는 면역계의 생리학적 능력이다. 관용은 전신 면역 구역 (compartment)을 자극하지 않으면서 점막 항원의 항체 억제 (containment)를 허용하는 점막 sIgA를 유도하는 것으로 자주 밝혀졌다. TGF-베타 조절 시토카인은 또한 때때로 관용 발생에 관련된다. 또한, CD25+ 조절 T 세포에 의한 능동 억제는 점막 내성의 가능한 메카니즘으로서 자주 제시되었다 (문헌 [Faria and Weiner, 2005]; [Mestecky et al., 2007). 그러나, 상기 면역학적 변형은 지금까지 인식되지 않은 면역 반응의 종류, 보다 구체적으로, 완전히 새로운 종류의 면역 관용인, 주로 바이러스-에피토프 항원-제시 CD4+ T 세포의 활성화를 억제하는 CD8+ T 세포의 활성을 특징으로 하는 본 발명에서 설명되는 제약 조성물-유도된 면역관용에서 관찰되지 않았다.

표현 "관용", "면역학적 관용", "면역관용", "바이러스에 대한 면역관용", "새로운 종류의 바이러스-특이적 관용", "바이러스 항원에 대한 면역관용", "바이러스 면역원에 대한 면역관용", 및 ""Ts" 면역관용"은 동의어이다. 이것은 짧은 꼬리 원숭이에서 불활성화된 SIV 항원 자극시에 CD8+ T 세포에 의한 감마 인터페론 분비의 결여 및 전신성 항-SIV IgM 및 IgG 항체 생산의 결여와 함께, CD4+ T 세포 증식의 부재와 연관된 HIV Gag 및/또는 Pol 항원-제시 CD4+ T 세포의 조기 활성화를 억제하는 능동적으로 유도된 강한 비-세포독성, MHC-Ib/E-제한된 CD8+ T 세포 반응에 상응하는 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 또한, 본 발명자들은 TCRγδ 및 Vβ8이 바이러스 복제의 CD8+ T 세포 억제에 관여하지 않음을 보여줄 수 있고, 이것은 TCRαβ가 감염된 CD4+ T 세포 상의 MHC-Ib/E-펩티드의 인식에서 중용한 역할을 수행하여야 함을 시사한다.

"바이러스로부터 유래된 통상적인 면역 반응"은 특히 HIV 바이러스의 Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 항원 및 표준 또는 통상적인 아주반트 (즉, 항원과 연관된 면역 반응의 자극 및/또는 촉진 및/또는 증가를 목적으로 하는 임의의 형태의 물리적, 화학적 또는 생물학적 아주반트, 예컨대 문헌 [S. Plotkin et al., "Vaccines"]의 "Adjuvants" 표제의 챕터에 설명된 것)를 포함하는 통상적인 예방 백신 조성물을 사용한 백신접종시에 관찰될 수 있다. 상기 "바이러스로부터 유래된 항원에 대한 통상적인 면역 반응"은 체액성, 세포성, 또는 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 모두를 수반하고, 통상적으로 다음을 특징으로 한다:

(i) 특이적 시험관내 자극시에 바이러스-특이적 CD4 세포의 증식; 및/또는

(ii) 바이러스 항원성 단백질 및/또는 펩티드에 대한 전신 항체의 생산을 통한 특이적 전신 체액성 반응의 유도; 및/또는

(iii) CD8 T 세포에 의한 감마 인터페론 생산과 연관된 특이적 세포성 반응의 유도, 및/또는

(iv) HIV Gag 및/또는 Pol 항원-제시 CD4+ T 세포의 활성화를 억제하는 비-세포독성, CD8+ T 세포 반응의 부재.

이와 대조적으로, HIV 바이러스의 Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 항원 및 본 발명에서 제공되는 바와 같은 면역관용원성 비히클을 포함하는 제약 조성물은 "바이러스에 대한 면역관용", 보다 특히 짧은 꼬리 원숭이에서 SIV에 대해 아래 실시예에서 아래와 같이 특성화된 ""Ts" 면역관용"을 생성한다:

(i) 특이적 시험관내 자극시에 바이러스-특이적 CD4 세포 증식의 부재; 및

(ii) 임의의 유의한 전신 체액성 반응의 부재, 즉 특이적인 검출가능한 전신 항체 반응이 전통적인 임상 실험 방법, 예컨대 ELISA에 의해 검출될 수 없거나, 또는 전신 항체가 검출되면, 이들은 SIV 바이러스 감염에 대해 보호 작용을 보이지 않음; 및

(iii) 적절한 시험관내 자극시에 감마 인터페론 (예를 들어, ELIspot에 의해 검출가능한)의 생산과 연관된 임의의 세포독성 CD8+ T 세포 반응의 부재, 또는 세포독성 CD8 T 세포 반응이 검출되면, 이는 SIV 바이러스 감염에 대해 보호 작용을 보이지 않음; 및

(iv) 필수적인 특징으로서, SIV 항원-제시 CD4+ T 세포의 조기 활성화를 억제하는 능동적으로-유도된 강한 비-세포독성, 비 CD25 MHC-Ib/E-제한된 CD8+ T 세포 반응.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 제약 조성물은 면역관용원성 비히클 및 HIV 바이러스의 Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 항원을 포함한다. 실제로, 바이러스 항원과 조합된 면역관용원성 비히클은 상기 규정된 바와 같은 통상적인 면역 반응을 유도하는 대신에 인간에서 바이러스-특이적 면역관용 상태를 유도한다. 따라서, 단독으로 또는 표준 아주반트와 함께 점막 또는 피내 또는 상피내 경로에 의해 투여된 항원은 본 발명의 제약 조성물에서처럼 면역관용원성 비히클과 조합될 때를 제외하고 일반적으로 통상적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기 특이적 환경 하에서, 본 발명의 제약 조성물 내의 면역관용원성 비히클/항원의 조합은 상기 규정된 바와 같은 면역관용을 유도한다. 이것은 면역관용이 면역관용원성 비히클 및 HIV 바이러스의 Gag 및/또는 Pol을 함유하거나 이로부터 유래된 항원의 적절한 혼합물의 투여시에만 (점막 또는 피내 또는 상피내 경로에 의한) 달성될 수 있음을 의미한다. 어느 하나가 다른 하나의 부재 하에 인간에게 투여될 경우에는, 인간은 "백신접종" 또는 "관용유도"되지 않을 것이다.

아래 실시예 (짧은 꼬리 원숭이 모델에서 SIV를 사용하는)에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 제약 조성물의 투여시에 유도되거나 달성되는 면역관용 ("Ts" 면역관용으로도 불림)은 SIV Gag 및/또는 Pol 항원-제시 CD4+ T 세포의 활성화 (특히, 조기 활성화)를 억제하는 CD8+ T 세포 반응 (특히, 비-세포독성 및/또는 MHC-Ib/E-제한됨); 및 유리하게는 1) CD4+ T 세포 증식의 부재; 2) SIV 항원 자극시에 CD8+ T 세포에 의한 유의한 감마 인터페론 분비의 결여; 및 3) 전신성 항-SIV IgM 및 IgG 항체의 유의한 생산의 결여 중의 하나 이상을 특징으로 한다.

용어 "HIV 또는 SIV 항원 자극시에 CD8+ T 세포에 의한 유의한 감마 인터페론 분비의 결여"는 본원에서 HIV 또는 SIV 항원 자극시에 관찰된 CD8+ T 세포에 의한 감마 인터페론 분비의 수준이 0이거나 약함을 의미한다. HIV 또는 SIV 항원 자극시에 CD8+ T 세포에 의한 "약한" 감마 인터페론 분비는 일반적으로 약 80 SFC/2X10⁵ PBMC 미만이다.

용어 "전신성 항-HIV 또는 항-SIV IgM 및 IgG 항체의 유의한 생산의 결여"는 본원에서 관찰된 전신성 항-HIV 또는 항-SIV IgM 및 IgG 항체의 생산 수준이 0이거나 약함을 의미한다. 전신성 항-HIV 또는 항-SIV 항체의 "약한" 생산은 일반적으로 약 300 이하의 항-HIV 또는 항-SIV의 역가이다.

따라서, 본 발명에 따른 제약 조성물은 인간에서 HIV에 대한 항원-특이적 면역 보호를 유도하고 바람직하게는 유지하고, 상기 면역 보호는 바람직하게는 다음을 특징으로 한다:

- 적절한 실험 대조군에 비해 상기 인간에서 HIV 바이러스 로드의 감소 및 바람직하게는 억제; 및/또는

- 적절한 실험 대조군에 비해 상기 인간에서 HIV Gag 및/또는 Pol 항원-제시 CD4+ T 세포의 활성화를 억제하는 CD8+ T 세포.

유리하게는, 상기 면역 보호는 상기 인간으로부터 CD8+ 조절 T-세포의 존재 또는 활성을 시험관내 검출함으로써 상기 인간에서 결정된다. 그러한 검출은 표준 시험관내 기술, 예컨대 아래 실시예에서 설명된 기술에 의해 수행할 수 있다.

상기 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 본원에 참고로 포함된다.

실시예

파트 A - 일반적인 물질 & 방법

A-I. 동물. 집단 사육한 중국 히말라야 원숭이 (마카카 뮬라타 (Macaca mulatta))를 미국 국립보건원 실험동물 관리 지침 (National Institutes of Health 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals')의 규정에 따라 수용하였다. 모든 동물은 건강하고 체중 4-6 kg의 2-4세 동물이었고, SIV, SRV, 유인원 T 세포 림프친화성 바이러스 1, B형 간염 바이러스, 및 B 바이러스에 대해 혈청음성이었다. 잠재적인 결핵 보균자를 배제하기 위해 모든 동물의 참여시에 X선 및 피부 시험 (PPD)을 수행하였다.

A- II . MHC 클래스 I 분류. 히말라야 원숭이의 전통적인 MHC 클래스 I 대립유전자는 이전에 설명된 (문헌 [Muhl et al., 2002]; [Loffredo et al., 2007]) 바와 같이 대표적인 Mamu-A 및 Mamu-B 서열에 대해 서열-특이적 프라이머 (SSP) PCR 검정을 이용하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플에서 유전자형 결정하였다.

A- III . 항원성 바이러스 제제.

III-1. SIV 생산은 SIVmac239 (피.에이. 막스 (P.A. Marx)로부터 기증받음)를 접종한 CEM174 세포에서 수행하였다. 배양 상청액을 최고 바이러스 생산에서 수집하였다.

III-2. AT-2-불활성화된 SIVmac239: SIVmac239를 2시간 동안 250 μM 알드리티올 (AT-) (시그마 (Sigma))에 의해 불활성화하고 초원심분리에 의해 3회 세척하였다. AT2-불활성화된 바이러스는 각각의 투여 (즉, 백신접종)를 위해 10⁹ 바이러스 입자의 최종 용량으로 사용하였다.

III-3. 열-불활성화된 SIVmac239: SIVmac239를 30분 동안 56℃에서 불활성화하였다. 열-불활성화된 바이러스는 각각의 투여를 위해 10⁹ 바이러스 입자의 최종 용량으로 사용하였다.

III-4. AT-2-열-불활성화된 SIVmac239: SIVmac239를 2시간 동안 250 μM 알드리티올 (AT-2) (시그마)에 의해 불활성화하고 초원심분리에 의해 3회 세척하였다. 이어서, 바이러스를 30분 동안 56℃ 온도에 적용하였다. 불활성화된 바이러스는 각각의 투여를 위해 10⁹ 바이러스 입자의 최종 용량으로 사용하였다.

III-5. 바이러스 감염성의 100% 억제를 확인하기 위해, 불활성화된 바이러스 제제를 CEM174 세포에 접종하였다.

A- IV . SIV 에 대한 항체 반응의 검정. 혈장 내의 항-SIV IgG, IgM, 및 IgA 항체를 면역형광 항체 (IFA) 검정에 의해 적정하였다 (문헌 [Mederle et al., 2003]). 간단히 설명하면, 시험 혈장의 연속 2배 희석액을 SIV-감염된 CEM174 세포-부착 슬라이드와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 행크 (Hanks) 용액으로 세척한 후, FITC-접합된 목적 항-짧은 꼬리 원숭이 IgG (시그마), IgM (ADI, 미국 텍사스주 샌 안토니오), 또는 IgA (ADI)를 추가로 30분 동안 (37℃에서) 첨가하였다. 항체 역가는 양성 면역형광 염색에 도달하기 위한 최고 희석액의 역수로서 결정하였다. IFA 검정의 감도는 IgG에 대해 20의 역가, 및 IgM 및 IgA에 대해 5의 역가이다. 혈장 샘플이 IFA에 대해 음성 (검정 감도 미만)일 때, 데이타 분석을 용이하게 하기 위해 1의 값을 할당하였다.

점막 분비물은 이전에 설명된 바와 같이 위 점적을 위한 카테터를 사용하여 PBS로 직장을 세척하여 수집하였다 (문헌 [Tsai et al., 1993]). 간단히 설명하면, 트립신 억제제 (10 ㎍/ml) 및 EDTA (5 x 10^-4 M) (시그마)를 샘플에 첨가한 후, 이를 4℃에서 10000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (10^-3 M) 및 나트륨 아지드 (0.01%) (시그마)를 보충하였다. 샘플을 사용시까지 -80℃에서 저장하였다. 직장 내 항-SIV IgA 역가를 상기 IFA 검정에 의해 검출하였다.

A-V. 유동 세포 측정. CD3-PE-Cy7 (클론 SP34-2), CD4-PE (클론 MT477), CD8-PerCP (클론 RPA-T8), 및 2차 토끼 항-마우스-APC (비디 바이오사이언시즈)에 대한 형광-표지된 모노클로날 항체를 사용하여 FACScalibur (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산 호세))로 유동 세포 측정 분석을 수행하였다. Ki-67-PE (비디 바이오사이언시즈) 및 FITC-접합된 항-P27 모노클로날 항체 (피츠제랄드 (Fitzgerald, 미국 매사추세츠주 콩코드)), 또는 APC-SAv (비디 바이오사이언시즈)와 결합된 비오틴-접합된 항-P27 모노클로날 항체 (피츠제랄드)를 투과화 후 세포내 염색을 위해 사용하였다.

TCRγδ (클론 B1), Vβ8, 및 CD 항원 (CD7, CD16, CD28, CD62L, CD95, CD122, CD137, CD150, CD183, CD184, CD195, CD196, CD197, CD226, CD272, 및 CD305)에 대한 PE-접합된 모노클로날 항체를 비디 바이오사이언시즈로부터 구입하고; CD 항원 (CD11a, CD25, CD27, CD39, CD101, CD129, CD215, CD277, 및 CD357)에 대한 PE-접합된 모노클로날 항체를 바이오레전드 (BioLegend, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 구입하고; CD 항원 (CD127, CD247, 및 CD279)에 대한 PE-접합된 모노클로날 항체를 이바이오사이언스 (eBioscience, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 구입하였다.

A- VI . 세포 증식. PBMC는 이전에 설명된 바와 같이 수득하였다 (문헌 [Lu et al. 2003]). SIV-특이적 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증식은 제조자의 지시에 따라 카르복시-플루오레세인 디아세테이트, 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 표지 검정 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes, 미국 오레곤주 유진))에 의해 평가하였다. PBMC를 37℃에서 15분 동안 3 μM CFSE로 염색하였다. 세척 후에, CFSE-표지된 세포를 5일 동안 10 ㎍/ml 재조합 SIV 코어 단백질 P27 (이뮤노다이아그노스틱스 (ImmunoDiagnostics, 미국 매사추세츠주 워번)), 2 ㎍/ml SIV gag 15-mer 펩티드 (GLS, 중국 상하이), 10⁹/ml AT-2-불활성화된 SIV 또는 배지 단독으로 자극하였다. 항-CD3 및 항-CD4 또는 항-CD8 항체를 표지한 후에, 유동 세포 측정을 위해 PBMC를 1% 파라포름알데히드로 고정시켰다.

A- VII . 세포 활성화. 자기 비드에 의해 CD8 또는 CD25로 고갈된 (또는 그렇지 않은) 신선한 PBMC를 2시간 동안 AT-2-처리한 SIVmac239로 10¹⁰/ml의 바이러스 농도로 1회 감염시켰다. 감염된 세포를 스타필로코커스 (staphylococcal) 내독소 B (2.5 ㎍/ml) 및 항-CD3 (2.5 ㎍/ml)/항-CD28 (2.5 ㎍/ml) 항체로 밤새 자극하였다. 감염된 (P27+) CD4+ 세포 내에서 활성화 (Ki-67+)의 백분율을 결정하기 위해, 자극 48시간 후에 SIV P27 및 Ki-67의 세포내 염색을 수행하였다.

A- VIII . ELISPOT 검정. 히말라야 원숭이 IFN-γ 및 IL-10 ELISPOT 검정을 시판 키트 (셀 사이언시즈 (Cell Sciences, 미국 매사추세츠주 캔턴))를 사용하여 P27 또는 AT-2-불활성화된 SIV의 존재 또는 부재 하에 비배양된 PBMC에서 수행하였다. TGF-b1 ELISPOT 키트는 알앤디 시스템즈 (R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스)로부터 구입하였다. 데이타는 자동화 ELISPOT 판독기 (AID GmbH, 독일 스트라쓰베르크)로 판독하였다. SIV-특이적 스폿 (spot) 형성 세포 (SFC)의 수는 배지 단독의 존재 하에 비특이적 SPC를 차감함으로써 계산하였다.

A- IX . 항바이러스 검정. 자기 양성-표지 (마이크로비즈 (MicroBeads), 밀테니이 바이오테크 (Miltenyi Biotec))에 의해 정제된 각각의 동물로부터의 자가 CD4+ T 세포를 1:2의 CD4/CD8 비에서 자기에 의해 정제된 CD8+ T 세포의 존재 또는 부재 하에 SIVmac239 (10^-3 MOI)로 급성 감염시킨 후, SEB (시그마)로 16시간 동안 자극하였다. 세척 후에, 세포를 5% CO₂의 존재 하에 37℃에서 5일 동안 96-웰 플레이트 내에서 100 IU의 인간 rIL2를 함유하는 200 ㎕/웰의 RPMI 1640 배지 (인비트로겐 (Invitrogen, 중국 상하이))의 최종 부피로 4중으로 배양하였다. 세포 배양액을 제3일에 절반의 새로운 배지로 1회 교체하였다. 제5일에 수집한 배양 상청액을 실시간 RT-PCR에 의한 바이러스 로드의 측정을 위해 사용하였다 (아래 참조). 억제 퍼센트 (%)는 CD4+ 감염된 세포만을 함유하는 이중 웰로부터의 배양 상청액 내의 바이러스 농도의 기하 평균을 혼합된 CD8+ 및 CD4+ 세포를 함유하는 4중 웰로부터의 상청액 내의 바이러스 농도의 기하 평균과 비교함으로써 계산하였다. 바이러스 억제와 HLA 제한 사이의 상호관련성을 결정하기 위해 CD4+ T 세포를 또한 동종이형 CD8+ T 세포와 함께 동시-배양하였다.

A-X. 바이러스 로드 측정. 혈장 내의 SIV RAN 또는 세포-결합 SIV DNA를 SIVmac239 및 SIVmac251에 대해 특이적으로 최적화된 프라이머 (센스, 서열 1: 5'-GAGGAAAAGAAATTTGGAGCAGAA-3'; 안티센스, 서열 2: 5'-GCTTGATGGTCTCCCACACAA-3') 및 프로브 (서열 3: 5'-FAM-AAAGTTGCACCCCCTATGACATTAATCAGATGTTA-TAMRA-3')를 사용하여 실시간 RT-PCR 또는 PCR에 의해 정량하였다.

A- XI . SIV -특이적 억제성 T-세포 검정. 제조자 (밀테니이 바이오테크)가 제공한 프로토콜에 따라 자기 비드-접합된 항-CD8 또는 항-CD25 항체에 의해 CD8 또는 CD25 고갈된 (또는 그렇지 않은) 신선한 PBMC를 SIVmac239로 2시간 동안 0.5 감염 다중도 (MOI)로 감염시켰다. 감염된 세포를 스타필로코커스 내독소 B (SEB) (2.5 ㎍/ml) (시그마) 및 항-CD3 (2.5 ㎍/ml)/항-CD28 (2.5 ㎍/ml) 항체 (비디 바이오사이언시즈)로 밤새 처리하였다. 감염된 (P27+) 세포 집단 내에서 T-세포 활성화 (Ki-67+)의 백분율 (%)을 결정하기 위해, 시험관내 자극 48시간 후에 SIV P27 및 Ki-67의 동시 세포내 염색을 수행하였다.

A- XII . 바이러스 시험접종.

XII-1. SIVmac239 (피.에이. 막스로부터 기증받음)를 접종한 짧은 꼬리 원숭이 PBMC에 대해 SIV 생산을 수행하였다. 배양 상청액을 최고 바이러스 생산에서 수집하였다.

XII-2. 직장내 시험접종 (IRC): 백신접종 후에, 동물에게 5000 MID100, 즉, 5 x 10⁵ TCID₅₀의 병원성 SIVmac239로 (반복적으로) 직장내 접종하였다. 상기 감염성 용량은 일반적으로 제10일 내지 제14일에 피크 혈장 바이러스 로드 (10⁶-10⁷ 카피/ml)를 갖는 100% 중국 히말라야 원숭이의 전신 감염을 일으킨다. 모든 SIV-시험접종한 동물을 1개월 동안 2주마다 및 그 후 1개월마다 임상적으로 및 생물학적으로 평가하였다.

XII-3. 정맥내 시험접종 (IVC): 백신접종 후에, 동물에게 5 MID100, 즉, 500 TCID₅₀ (CEM174 세포주에서 적정함)의 병원성 SIVmac239 (미국 뉴욕주 아아론 다이아몬드 에이즈 리써치 센터 (Aaron Diamond AIDS Research Center)의 피.에이. 막스 박사로부터 기증받음)을 (반복적으로) 정맥내 접종하였다. 상기 감염성 용량은 일반적으로 제10일 내지 제14일에 피크 혈장 바이러스 로드 (10⁶-10⁷ 카피/ml)를 갖는 100% 중국 히말라야 원숭이의 전신 감염을 일으킨다. 모든 SIV-시험접종한 동물을 1개월 동안 2주마다 및 그 후 1개월마다 임상적으로 및 생물학적으로 평가하였다.

A- XIII . 통계적 분석. 상이한 동물 군들 사이의 손상된 데이타, 또는 면역화 전후의 대응 (paired) 데이타를 각각 만-휘트니 (Mann-Whitney) 또는 윌콕슨 (Wilcoxon) 시험에 의해 비교하였다.

PART B - 구체적인 물질 & 방법

B-I. 면역관용원성 비히클로서 BCG 의 사용

B-I-I. BCG 의 제조.

I-1. 생 BCG: 스타텐스 세럼 인스티투트 (Statens Serum Institut, 코펜하겐)에서 제조된 생 BCG (균주 SSI 1331)를 SPMSD (Laboratories Sanofi-Pasteur Merck, Sharp and Dome)로부터 구입하고, 장 또는 질내 투여를 위해 5x10⁶ cfu의 최종 농도로 또는 각각의 피내 추가접종 투여를 위해 5x10⁵ cfu의 최종 농도로 사용하였다.

I-2. 연장 동결 건조 (EFD) 불활성화된 BCG: 생 SSI 133 BCG 균주를 20 μm Hg 미만의 진공 하에 5일 연장 동결-건조 (EFD)에 의해 치사시키고, 각각의 장 또는 질내 투여를 위해 5x10⁶ cfu 또는 각각의 피내 투여를 위해 5x10⁵ cfu에 상응하는 최종 용량으로 사용하였다.

I-3. 열 불활성화된 BCG: 생 SSI 133 BCG 균주를 보레이트 완충제 내에서 115℃에서 15분 동안 고압살균하고, 각각의 장 또는 질내 투여를 위해 5x10⁶ cfu 또는 각각의 피내 투여를 위해 5x10⁵에 상응하는 최종 용량으로 사용하였다.

B-I- II . 제약 조성물

조성물은 SIV 항원 중 하나 및 면역관용원성 비히클을 함유하는 RPMI 1640 (인비트로겐, 중국 상하이)을 사용하여 새로 제조하였다.

B-I- III . 동물 면역화

면역화 시에, 염산티렙타민 및 졸라제판 (0.7 mg/kg)을 근육내 주사하여 동물을 마취시켰다.

III-1. 질내 면역화 (IVI): 1 ml의 제약 조성물 또는 대조군으로서 이전에 개시된 하나의 면역관용원성 비히클을 4시간 동안 질내 주사함으로써 마취 하에 암컷 동물을 면역화하였다. 제약 조성물 또는 면역관용원성 비히클을 사용한 추가접종 면역화는 8주에 동일한 부위에서 동일한 용량으로 제공하였다. 모든 동물을 제1 면역화 후에 2주마다 임상적으로 및 생물학적으로 평가하였다.

III-2. 경구 (위내) 면역화 (IGI): 수컷 또는 암컷 동물에게 마취 하에 제약 조성물 또는 대조군으로서 상기 개시된 하나의 면역관용원성 비히클의 섭취 15분 전에 15 ml의 0.1 M 중탄산나트륨을 위내 투여하였다. 투여 직후에 추가의 15 ml의 중탄산나트륨 용액을 투여하였다. 초기의 것과 동일한 면역관용원성 백신접종을 각각의 동물에게 1개월 간격으로 2회 반복하였다. 모든 동물을 제1 면역화 후에 2주마다 임상적으로 및 생물학적으로 평가하였다.

III-3. 피내 추가접종 면역화 (IDI): 암컷 질내 면역화한 동물 (상기 IVI 섹션 참조)에게 제1 면역화 90일 후에 마취 하에 10⁹ 카피의 AT-2-불활성화된 SIV 및 5x10⁵ cfu의 생 BCG를 함유하는 제약 조성물 0.1 ml을 피내 추가접종하였다. 모든 동물을 제1 면역화 후에 2주마다 임상적으로 및 생물학적으로 평가하였다.

B-I- IV . 항바이러스 검정. 직장내 시험접종 후 살균 (sterile) 면역성에 상응하는 역치는 적어도 20이다.

B- II . 면역관용원성 비히클로서 락토바실루스 플란타룸의 사용

B- II -I. 박테리아 제제 ( 면역관용원성 비히클 제제). 락토바실루스 플란타룸 (LP) (ATCC8014)을 200 rpm의 회전 속도로 MRS 배지 내에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아 배양의 로그 (중간 로그) 기에서 LP를 얻기 위해, 박테리아를 약 10¹⁰ cfu/ml의 최종 LP 농도 (약 3.5시간에 얻어짐)를 갖는 600 nm에서 1.0의 광학 밀도에 도달할 때까지 배양하였다.

B- II - II . 경구 ( 위내 ) 전달에 의한 동물 면역화. 동물을 밤새 굶겼다 (아침식사 없이). 경구 투여 시간에, 염산티렙타민 및 졸라제판 (0.7 mg/kg)을 근육내 주사하여 동물을 마취시켰다.

면역화 No . 1: 8마리의 동물에게 말토덱스트린 (20%) 용액 내의 4 x 10⁷ 카피/ml의 DI-SIV 및 3 x 10⁹ cfu/ml의 살아있는 LP를 함유하는 바이러스-박테리아 제제 30 ml을 위내 투여하였다. 상기 제1 면역화 후에, 원숭이에게 25 ml의 동일한 바이러스-박테리아 제제 (즉, 제약 조성물)를 3시간 동안 30분마다 위내 제공하였다. 상기 경구 전달 프로토콜을 연속 5일에 걸쳐 5회 수행하였다. 대조군으로서, 4마리의 동물에게 살아있는 LP 단독을 투여하고, 다른 3마리에 평행으로 불활성화된 SIV를 단지 2회 제공하였다.

면역화 No . 2: 12마리의 동물 (iSIV/LP#9-20)에게 말토덱스트린 (20%) 용액 내의 4 x 10⁷ 카피/ml의 iSIV (AT-2/열-불활성화된 SIVmac239) 및 3 x 10⁹ cfu/ml의 살아있는 LP의 제제 30 ml을 위내 투여하였다. 이어서, 동물에게 연속 5일에 25 ml의 동일한 제제를 3시간 동안 30분마다 (6회) 제공하였다. 6마리의 동물 (LP#5-10)에게 말토덱스트린 (20%) 용액 내의 3 x 10⁹ cfu/ml의 살아있는 LP 30 ml을 위내 투여하였다. 이어서, 동물에게 연속 5일에 25 ml의 동일한 제제를 3시간 동안 30분마다 (6회) 제공하였다. 마지막으로, 또 다른 6마리의 동물 (iSIV#5-10)에게 4 x 10⁷ 카피/ml의 iSIV 단독의 제제 30 ml을 위내 투여하였다. 이어서, 동물에게 연속 5일에 25 ml의 동일한 제제를 3시간 동안 30분마다 (6회) 제공하였다.

B- II - III . 생체내에서 CD8 + T 세포의 고갈. 짧은 꼬리 원숭이를 먼저 마취시킨 후, 이전에 설명된 (문헌 [Schmitz et al., 1999]) 바와 같이 키메릭 항-CD8 모노클로날 항체 (cMT-807, 센토코 리서치 앤 디벨롭먼트, 인크. (Centocor Research & Development, Inc., 미국 펜실베니아주 맬번))의 정맥내 주사를 5 mg/kg로 제0, 4, 및 7일에 제공하였다. 제0일에 및 항체 주사 후 다양한 시점에 각각의 동물로부터 말초 혈액 샘플 (5 ml)을 취하였다.

B- II - IV . 항바이러스 검정. 직장내 시험접종 후 살균 면역성에 상응하는 역치는 적어도 100이다.

B- II -V. CD8 + T 세포 SIV 억제 검정. 자기 양성-표지 (마이크로비즈, 밀테니이 바이오테크)에 의해 정제된 각각의 동물로부터의 자가 CD4+ T 세포를 1:3의 CD4/CD8 비에서 자기에 의해 정제된 CD8+ T 세포의 존재 또는 부재 하에 SIVmac239 (10^-3 감염 다중도)로 급성 감염시킨 후, SEB 및 항-CD3/항-CD28 항체로 16시간 동안 자극하였다. 세척 후에, 세포를 96-웰 플레이트 내에서 4중으로 배양하였다. 배양액을 100 IU의 인간 rIL2 (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하 (Roche Diagnostics GmbH, 독일 만하임))를 함유하는 200 ㎕/웰의 RPMI 1640 배지의 최종 부피 내에 5일 동안 유지하였다. 제5일에 수거한 배양 상청액을 실시간 RT-PCR에 의한 바이러스 로드의 측정을 위해 사용하였다 (아래 참조). 억제 배수는 다음과 같이 계산하였다: 감염된 CD4+ 표적 세포만으로부터의 배양 상청액 내의 바이러스 농도의 기하 평균/혼합된 CD8+ 및 CD4+ T 세포로부터의 상청액 내의 바이러스 농도의 기하 평균.

일부 실험에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포를 멀티웰 인서트 (Multiwell Insert) 시스템 (비디 바이오사이언시즈)을 사용함으로써 (인서트 웰 내에 CD8 및 저변 웰 내에 CD4) 세포-대-세포 접촉 없이 배양하고; 바이러스 억제 및 MHC 제한 사이의 상호관련성을 결정하기 위해 CD4+ T 세포를 동종이형 CD8+ T 세포와 함께 동시 배양하고; MHC 제한의 방식을 규정하기 위해 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 또한 항-MHC-ABC (바이오레전드) 또는 항-MHC-E (셀 사이언스 (Cell Science)) 항체의 존재 하에 동시-배양하였다. 항바이러스 활성과 연관된 CD8+ T 세포의 하위세트를 규정하기 위해, LD 컬럼 (밀테니이 바이오테크)을 통해 항-PE 마이크로비드를 사용하여 PE-접합된 항-TCRγδ, 항-Vβ8, 또는 다른 항-CD 항원 항체를 사용한 그들의 고갈 직후에 PBMC로부터 CD8+ T 세포를 정제하였다.

B- II - VI . SIV -특이적 CD8 + T 세포의 세포독성 검정. 10¹⁰ AT-2-처리한 SIVmac239 (표적 세포)로 펄싱한 정제된 CD4+ T 세포 및 정제된 CD8+ T 세포 (이펙터 (effectoror) 세포)를 37℃에서 10 min 동안 40 nM 3,3'디헥실옥사카르보시아닌 (DiOC₆) (문헌 [Marchetti et al., 1996]) (몰레큘라 프로브스)으로 표지하였다. 표적 세포를 얼음 상에서 20 min 동안 PerCP-Cy5-접합된 항-CD4 (비디 바이오사이언시즈)로 표지하였다. 3회 세척한 후, 이펙터 세포를 U자형 바닥의 96-웰 플레이트 내에서 표적 세포와 상이한 E/T 비 (3:1, 1:1, 0.3:1)로 3중으로 혼합하였다. APC-접합된 항-CD32 (비디 바이오사이언시즈)를 갖는 K562 세포 (표적) 및 4마리의 건강한 공여자로부터의 정제된 CD56⁺ (NK) 세포 (이펙터)를 검정 대조군으로서 포함시켰다. SEB 및 항-CD3/항-CD28의 존재 하에 37℃에서 4 hr 인큐베이션 후에, 세포를 수거하고 유동 세포 측정에 의해 분석하였다. 세포독성 %는 다음과 같이 계산하였다: 100 x [(총 세포자멸 표적 세포의 % - 자발적 세포자멸 표적 세포의 %) / (100 - 자발적 세포자멸 표적 세포의 %)].

B- II - VII . 바이러스 시험접종.

제1 연구: 제1 배치 (batch)의 실험 (면역화 No. 1)에서 백신 또는 대조군의 경구 투여 후 4개월 후에, 8마리의 면역화한 동물 및 그들의 7마리의 대조군에게 2500 MID₁₀₀ (100.000 TCID₅₀)의 병원성 SIVmac239를 직장내 접종하였다. 2개월 후에, 4마리의 백신접종한 동물 및 이미 보호된 원숭이를 직장내 경로 (100.000 TCID₅₀)에 의해 재시험접종한 한편, 4마리의 다른 보호된 원숭이를 5 MID₁₀₀ (200 TCID₅₀)의 SIVmac239로 정맥 내로 재시험접종하였다. 대조군으로서, 2마리의 원숭이를 직장 내로 시험접종하고, 다른 2마리를 정맥 내로 시험접종하였다. 이들 감염성 용량은 일반적으로 제10일 내지 제14일에 피크 혈장 바이러스 로드 (10⁷ - 10⁹ vp/ml)를 갖는 100% 중국 히말라야 원숭이의 전신 감염을 일으킨다.

제2 연구 (면역화 No. 2): 제2 세트의 연구에서 면역화 후 제420일에, 16마리의 동물 (iSIV 및 LP로 면역화한 8마리의 원숭이) 및 8마리의 대조군 (4 iSIV 및 4 LP)를 100,000 TCID₅₀의 SIVmac239로 직장 내로 시험접종하였다.

PART C - 결과

C-I. BCG 는 면역관용원성 비히클이다

C-I-I. 질내 투여 후 정맥내 SIVmac239 시험접종에 대한 보호:

6마리의 동물 (조성물_1, 2, 3, 4, 5, 및 6)에게 항원으로서 AT2-불활성화된 바이러스 및 생 BCG를 포함하는 면역관용원성 조성물 1 ml을 질내 투여하였다. 추가접종 투여를 8주에 동일한 부위에서 동일한 면역관용원성 조성물로 제공하였다.

동시에, 다른 5마리의 동물 (대조군_1, 2, 3, 4, 및 5)에게 생 BCG만을 포함하는 조성물 1 ml을 질내 제공하였다. 추가접종 투여는 또한 8주에 동일한 부위에서 동일한 조성물로 제공하였다.

초기 투여 4개월 후에, 11마리의 모든 동물 (조성물_1-6 및 대조군_1-5)을 정맥내 바이러스 접종에 의해 시험접종하였다.

처리한 동물의 혈장 내에서 바이러스 로드를 규칙적으로 결정하였다.

도 1은 단일 정맥내 바이러스 시험접종 후에 조성물을 제공한 동물 (조성물_1-6) 및 대조군 동물 (대조군_1-5)에서 바이러스 로드 (혈장 SIV RNA 카피/ml)를 시간 (일)의 함수로서 보여준다.

결과는 정맥내 바이러스 시험접종 후에, 5마리의 대조군 동물 (대조군_1-5)은 예상된 바와 같이 시험접종 후 제10-14일에 피크 혈장 바이러스 로드 (10⁶- 10⁷ 카피/ml)를 갖는 전형적인 1차 감염을 보였음을 보여준다. 상기 군의 대조군 동물의 혈장 바이러스 로드는 바이러스-시험접종 후 60일에 걸쳐 및 그 후에 여전히 높게 (>10⁵ vp/ml) 유지되었다.

이와 반대로, AT-2-불활성화된 SIVmac239 + BCG로 이루어진 면역관용원성 조성물을 질내 제공한 4/6 동물은 매우 낮은 혈장 바이러스 로드 피크 (<1000 vp/ml; 제10-14일)를 보였고, 이것은 빠르게 (바이러스 시험접종 1개월 후에) 비검출가능하게 되었다 (<10 vp/ml). 높은 혈장 바이러스 로드 피크 (>10⁶ 카피/ml)를 갖는 2마리의 동물은 제60일에 대조군 (>10⁵ 카피/ml)보다 더 낮은 목표점 (set-point) 바이러스 로드 수준 (<1000 카피/ml)을 가졌다.

C-I- II . 조성물의 질내 투여 후 직장내 SIVmac239 시험접종에 대한 보호:

7마리의 동물 (조성물_7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13)에게 항원으로서 AT2-불활성화된 바이러스 및 면역관용원성 비히클로서 생 BCG를 포함하는 면역관용원성 조성물 1 ml을 질내 투여하였다. 추가접종 투여는 8주에 동일한 부위에 동일한 조성물로 제공하였다.

동시에, 5마리의 다른 동물 (대조군_6, 7, 8, 9, 및 10)에게 생 BCG만을 포함하는 조성물 1 ml을 질내 제공하였다. 추가접종 투여는 또한 8주에 동일한 부위에 동일한 조성물로 제공하였다.

초기 투여 4개월 후에, 12마리의 모든 동물 (조성물_7-13 및 대조군_6-10)에게 SIVmac239를 직장내 바이러스 접종을 통해 시험접종하였다.

처리한 동물 및 대조군 동물의 혈장 내에서 바이러스 로드를 규칙적으로 결정하였다.

도 2는 직장내 바이러스 시험접종 후 조성물을 제공한 동물 (조성물_7-13)에서 및 대조군 동물 (대조군_6-10)에서 바이러스 로드 (혈장 SIV RNA 카피/ml)를 시간 (일)의 함수로서 보여준다.

결과는 직장내 바이러스 시험접종 후에, 생 BCG 단독을 질내 투여한 5마리의 동물 (대조군_6-10)이 예상된 바와 같이 시험접종 후 제10-14일에 피크 혈장 바이러스 로드 (10⁶-10⁷ vp/ml)를 갖는 전형적인 1차 감염을 보였음을 보여준다. 상기 군의 대조군 동물의 혈장 목표점 바이러스 로드는 바이러스-시험접종 후 60일에 걸쳐 여전히 높게 (>10⁵ 카피/ml) 유지되었다.

이와 반대로, AT-2-불활성화된 SIVmac239 + 생 BCG를 질내 제공한 4/7마리의 동물은 놀랍게도 시험접종 후 60일의 기간에 걸쳐 비검출가능한 바이러스 로드 수준 (<10 카피/ml)을 보였다. 다른 3마리의 동물은 시험접종 후 제10-14일에 피크 혈장 바이러스 로드를 갖는 전형적인 1차 감염을 보였다. 그러나, 그들의 목표점 바이러스 로드 (10³-10⁵ 카피/ml)는 대조군 동물의 수준 (>10⁵)보다 유의하게 더 낮았다.

C-I- III . 제약 조성물의 질내 투여 후 반복적인 정맥내 또는 직장내 SIVmac239 시험접종에 대한 보호:

2 및 8개월 후에, 정맥내 시험접종 후 비검출가능한 바이러스 로드를 갖는 3마리의 동물 (조성물_1, _2, 및 _3)을 동일한 용량의 바이러스 접종물로 제2 및 제3 정맥내 시험접종하였다.

상기 군의 원숭이의 제2 및 제3 정맥내 바이러스 시험접종 후에, 유사한 낮은 피크 혈장 바이러스 로드가 제10일에 관찰되었다. 그러나, 바이러스 시험접종 후 30일에, 바이러스 로드는 다시 비검출가능하게 되었다 (도 3).

조성물의 초기 투여 16 및 23개월 후에, 이미 총 3회 정맥내 시험접종 (조성물_1, _2, 및 _3)한 3마리의 동물에게 직장내 접종에 의해 추가 시험접종하였다.

예상된 바와 같이, 이들 3마리의 동물 (초기에 질내 AT-2-불활성화된 SIVmac239 + BCG를 제공)은 다시 2회 연속 직장내 바이러스 시험접종 후에 검출가능한 (<10 카피/ml) 혈장 바이러스 로드 피크를 보이지 않았다 (도 3).

이들 결과는 상기 억제가 조성물의 초기 투여 후 20개월 초과 동안 여전히 관찰되므로 바이러스 복제를 억제하는 효율이 안정함을 확립하였다.

C-I- IV . 제약 조성물의 질내 투여 + 피내 추가접종 후 정맥내 또는 직장 내 SIVmac239 시험접종에 대한 보호:

예상된 바와 같이, 정맥내 (대조군 17 및 18, 도 4) 또는 직장내 (대조군 19 및 20, 도 5) 바이러스 시험접종 후에, 생 BCG 단독을 질내 투여한 4마리의 동물은 예상된 바와 같이 시험접종 후 제10-14일에 피크 혈장 바이러스 로드 (10⁶-10⁷ vp/ml)을 갖는 전형적인 1차 감염을 보여주었다. 상기 군의 대조군 동물의 혈장 목표점 바이러스 로드는 바이러스 시험접종 60일 후에 여전히 높게 (>10⁵ 카피/ml) 유지되었다.

이와 반대로, AT-2-불활성화된 SIVmac239 및 생 BCG로 이루어진 조성물을 질내 제공하고 동일한 조성물을 피내 추가접종한 3/4 (75%)마리의 동물 (조성물 14, 15, 및 17)이 정맥내 시험접종 후 60일의 기간에 걸쳐 비검출가능한 혈장 바이러스 로드 (<10 카피/ml)을 보여주었다(도 4 참조). 나머지 1마리의 동물 (조성물 16)은 시험접종 후 제10-14일에 피크 혈장 바이러스 로드 (>10⁵ 카피/ml)를 갖는 1차 감염음 보여주었다 (도 4 참조). 그러나, 그의 목표점 바이러스 로드는 제60일에 비교적 낮은 수준 (10⁴ 카피/ml)에 도달하였다.

또한, AT-2-불활성화된 SIVmac239 + 생 BCG로 이루어신 조성물을 질내 제공하고 동일한 조성물을 피내 추가접종한 4/4마리 (100%)의 동물 (조성물 18-21)은 직장내 시험접종 후 60일의 기간에 걸쳐 비검출가능한 혈장 바이러스 로드 (<10 카피/ml)를 보여주었다 (도 5 참조).

C-I-V. 제약 조성물의 경구 투여 이후 직장내 SIVmac239 시험접종에 대한 보호:

4마리의 동물 (조성물_22, _23, _24, 및 _25)에게 AT2-불활성화된 바이러스 및 생 BCG를 포함하는 조성물 1 ml을 위내 투여하였다.

동시에, 다른 4마리의 동물 (대조군 21-24)에게 1 ml의 생 BCG 단독을 위내 제공하였다.

초기에 각각의 동물에게 제공된 동일한 투여를 제1 투여 단계 후 제15, 30 및 60일에 3회 반복하였다.

결과는 직장내 바이러스 시험접종 (제90일에 수행됨) 후에, 생 BCG 단독을 제공한 4마리의 동물 (대조군 21-24)은 시험접종 후 제10-14에 피크 혈장 바이러스 로드 (10⁶-10⁷ 카피/ml)를 갖는 전형적인 1차 감염을 보여준 반면, AT-2-불활성화된 SIV + 생 BCG 조성물을 제공한 4마리의 동물 (조성물_22-25)은 놀랍게도 비검출가능한 혈장 바이러스 로드 (<10 카피/ml; 제10-14일)를 보여주었음을 보여준다 (도 6).

C-I- VI . 면역 관련 및 AT2 -불활성화된 바이러스 + 생 BCG 로 이루어진 조성물의 투여 후 SIVmac239 시험접종에 대한 보호:

SIV에 대해 생성된 전신 항체는 처리한 동물의 혈액에서 검출되지 않았다. 그러나, 피내 추가접종 조성물 투여를 이용할 때 일부 특이적 전신 체액성 반응이 검출되었다. 결과적으로, 처리한 동물에 대해 SIV 감염에 대한 관찰된 보호는 전신 체액성 반응으로부터 생성되지 않는다.

또한, 통상적인 SIV-특이적 감마 인터페론-생산 세포독성 T 림프구는 ELIspot에 의해 검출가능하지 않았다 (데이타를 제시하지 않는다). SIV-특이적 비-통상적인 세포성 반응이 존재하는지 여부의 평가 목적을 위해, 각각의 처리한 동물 또는 대조군 동물로부터 혈액 샘플을 취하고, 통상적인 방법에 따라 각각의 샘플로부터 CD4+ 및 CD8+ 세포를 정제하였다. 앞서 얻어진 CD4+ 세포를 배양한 후, 통상적인 방법에 따라 SIV mac239로 감염시켰다. 이어서, SIV-감염된 CD4+ 세포를 앞서 얻어진 자가 CD8+ 세포의 존재 또는 부재 하에 5일 동안 배양하였다. 상청액 SIV 농도를 정량적 실시간 PCR에 의해 검정하였다.

도 7은 도 2에 제시된 실험의 과정에서 얻어진 자가 CD8+ 세포의 존재 또는 부재 하에 얻어진 SIV-감염된 CD4+ 세포에서 바이러스 복제의 억제의 배수를 보여준다. 시험된 CD8은 질내 경로에 의해 AT2-불활성화된 바이러스 + BCG의 조성물을 투여한 동물 (조성물_7-13)로부터 또는 대조군 동물 (대조군 6-10)로부터 얻었다.

결과는 바이러스 감염에 대해 보호된 동물 (조성물_7, 조성물_8, 조성물_10, 및 조성물_11)로부터 CD8 T 세포가 SIV-감염된 CD4 세포에서 20배를 초과하는 바이러스 억제 수준을 제공하는 반면, 바이러스 감염에 대해 비-보호된 동물 (조성물_9, 조성물_12, 및 조성물_13)로부터 CD8 T 세포가 10배보다 더 열등하거나 동등한 바이러스 억제 수준을 제공함을 보여준다 (도 7). 또한, 20배 이상의 바이러스 억제가 또한 도 1에 제시된 정맥내 바이러스 시험접종에 대해 보호된 4마리의 동물에서 관찰되었다 (데이타를 제시하지 않는다).

도 8은 도 6에 제시된 실험의 과정에서 얻어진 자가 CD8+ 세포의 존재 또는 부재 하에 얻어진 SIV-감염된 CD4+ 세포에서 바이러스 억제 수준을 보여준다. 시험된 CD8은 AT2-불활성화된 바이러스 + BCG의 경구 투여에 의해 조성물을 투여한 4마리의 동물 (조성물_22-25)로부터 또는 4마리의 대조군 동물 (대조군 21-24)로부터 얻었다.

도 9는 도 6에 제시된 실험의 과정에서 얻어진 자가 CD8+ 세포의 존재 또는 부재 하에 얻어진 SIV (P27+)-감염된 CD4 세포 집단에서 T-세포 활성화 (Ki-67+)의 수준을 보여준다. 시험된 CD8은 AT2-불활성화된 바이러스 + BCG의 경구 투여에 의해 조성물을 투여한 4마리의 동물 (조성물_22-25)로부터 또는 4마리의 대조군 동물 (대조군 21-24)로부터 얻었다. 자가 CD8+ T 세포에 의한 CD4+ T-세포 활성화의 SIV-특이적 억제가 조성물을 투여한 4마리의 동물에서 관찰되었다.

결과는 AT2-불활성화된 바이러스 + BCG의 질내 또는 경구 투여에 의해 얻어진 전신 또는 점막 SIV 감염의 예방이 SIV-감염된 CD4 세포 무반응과 연관된 비-세포독성 CD8+ T-세포 반응을 특징으로 하는 면역관용의 상태를 유도하였음을 확인한다. 따라서, 이들 결과의 면에서, BCG는 면역관용원성 아주반트로서 확인될 수 있다.

함께 살펴보면, 이들 발견은 SIV 항원에 대한 면역관용의 항정 상태 (steady state)가 최초로 불활성화된 SIV 바이러스 + 생 BCG로 이루어진 조성물의 질내 또는 경구 (또는 위내) 투여에 의해 달성됨을 입증하였다. 동시에, 본 발명에 따른 AT2-불활성화된 SIV 바이러스 + 생 BCG를 포함하는 제약 조성물의 질내 또는 경구 투여가 직장내 또는 정맥내 시험접종 후 만성 바이러스 감염을 예방하기 위해 효과적임 (>50%)을 최초로 보여주었다.

C- II . 면역관용원성 비히클로서 락토바실루스 플란타룸의 사용

C- II -I. 이중 불활성화된 SIV 및 락토바실루스 플란타룸 ( iSIV / LP )의 경구 동시-투여에 의한 SIV -특이적 면역관용의 유도

한편, SIV-특이적 항체 (IgG, IgM, 및 IgA)는 경구 iSIV/LP로 처리한 동물에서 검출되지 않았다 (도 10a). 그 반면에, iSIV/LP-처리한 동물에서 유의한 SIV P27-특이적 말초 혈액 CD4+ T 세포 증식이 관찰되지 않은 한편, iSIV-처리한 동물은 유의한 P27-특이적 말초 혈액 CD4+ T 세포 증식을 보이지 않았다.

C- II - II . 비-세포독성 CD8 + 세포의 항-활성화 및 항바이러스 활성

SIV P27-특이적 말초 혈액 CD8+ T 세포 증식은 iSIV/LP-처리한 동물 및 iSIV-처리한 동물 모두에서 관찰되었다 (도 10b). 그러나, 인터페론-감마 분비 T 세포 (시험관내 자극시에)는 iSIV/LP-처리한 동물에서 검출되지 않았고, CD8+ 또는 CD25+ 세포의 고갈은 P27-특이적 이펙터 T 세포의 비반응성을 변경시키지 않았다 (도 10c). 또한, 비-세포독성 CD8+ T 세포에 의한 감염된 (P27+) CD4+ T 세포의 활성화 (Ki-67+)의 강한 억제는 iSIV/LP-처리한 동물로부터 취한 급성으로 시험관내 감염된 PBMC에서 또한 관찰되었고, CD25+ 세포의 고갈은 감염된 CD4+ T 세포의 활성화에 대해 CD25-CD8+ T 세포가 작용하는 강력한 억제를 변경시키지 않았다 (도 10d).

SEB 및 항-CD3/항-CD28 항체의 존재 또는 부재 하에 비-복제성 SIVmac239로 펄싱한 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 동시-인큐베이팅한 후에 고-감수성 세포독성 검정에 의해 (문헌 [Marchetti et al., 1996]) 세포 용해가 검출되지 않았다는 사실이 중요하다 (도 10e).

마지막으로, ≥2개월 이후로 iSIV/LP로 처리한 동물로부터 취한 말초 혈액 CD8+ T 세포는 급성으로 시험관내 감염된 자가 CD4+ T 세포에서 바이러스 복제에 대해 강한 억제 활성을 보여주었다 (도 11a). 추가로, CD8+ T 세포의 그러한 강한 항바이러스 활성은 급성으로 시험관내 감염된 이종 CD4+ T 세포에서 또한 동등하게 관찰되었고 (도 11b), 이것은 비-전통적인 HLA1 제한된 메카니즘이 CD8+ T 세포의 억제성/억제 활성에 관여함을 제안한다.

≥2개월 더 일찍 LP/iSIV로 면역화한 짧은 꼬리 원숭이로부터 취한 정제된 말초 혈액 CD8+ T 세포는 SEB 및 항-CD3/항-CD28 항체로 밤새 자극한 후 5일 동안 동시-배양한 자가 급성 SIVmac239-감염된 CD4+ T 세포에 대해 강한 항바이러스 활성을 가졌다. 일단 SIV-특이적 CD4+ T 세포 활성화가 확립된 후 (자극 48시간 후), CD8+ T 세포를 첨가하여도 더 이상 바이러스 복제를 억제할 수 없었다 (도 11c). 상기 관찰은 인간 자가면역 1형 당뇨병에서 선행 연구 (문헌 [Jiang et al., 2010])에 의해 제안된 바와 같은, 연장된 배양에서 CD8+ T 세포에 의한 표적 (생산적으로 감염된) CD4+ T 세포의 잠재적인 용해에 반박한다. 상기 CD8+ T 세포-매개 항바이러스 활성은 세포-대-세포 접촉을 필요로 하고 (도 11d), 또한 다른 면역화한 동물로부터 또는 대조군 동물로부터 급성 감염된 CD4+ T 세포에 대해 CD8+ T 세포가 작용하는 바이러스 복제의 강한 억제에 의해 보여지는 바와 같이 전통적인 MHC1a-비제한성이었다 (도 11e). 마지막으로, CD8-매개 항바이러스 활성은 항-MHC-Ib/E 항체에 의해 차단되었지만 항-MHC-Ia/ABC 항체에 의해 차단되지 않았고, 이것은 비-전통적인 MHC-Ib/E-제한된 CD8+ T 세포 활성을 나타낸다 (도 11f).

CD8+ T 세포 TCR 발현은 표적 CD4+ T 세포에 의해 운반되는 MHC-Ib/E-펩티드 복합체를 인식하기 위해 필수적임이 확립되었다 (문헌 [Sarantopoulos et al., 2004]; [Van Kaer, 2010]). 항체-접합된 자기 마이크로비드의 시험관내 고갈을 이용하여, TCRγδ 및 Vβ8이 바이러스 복제의 CD8+ T 세포 억제에 관여하지 않는 것으로 나타났다 (도 11g). 따라서, TCRαβ가 감염된 CD4+ T 세포 상의 MHC-Ib/E-펩티드 제시의 인식에서 중심 역할을 하는 것으로 보인다. 또한, 비-인간 영장류의 막 CD ("분화 집단 (Cluster Differentiation)") 항원 (CD7, CD11a, CD16, CD25 (IL-2RA), CD27, CD28, CD39, CD62L, CD95, CD101, CD122 (IL-2RB), CD127 (IL-7R), CD129 (IL-9R), CD137, CD150, CD183 (CXCR3), CD184 (CXCR4), CD195 (CCR5), CD196 (CCR6), CD197 (CCR7), CD215 (IL-15Ra), CD218 (IL-18Ra), CD223 (LAG3), CD226, CD247, CD272, CD277, CD279 (PD-1), CD305 (LAIR1), 및 CD357)과 교차-반응하는 이용가능한 항-인간 항체를 사용하여 CD8+ T 세포를 고갈시킴으로써, MHC-Ib/E-제한된 CD8⁺ T 세포 활성과 연관된 CD 항원은 확인될 수 없었다 (표 1). 아래 표 1은 제1 면역화 연구 (면역화 No. 1)에서 CD 항원-규정된 하위세트*의 고갈 전후에 8마리의 iSIV/LP-면역화한 동물로부터 취한 CD8+ T 세포의 항바이러스 활성 (억제 배수, 기하 평균±SE)을 보여준다.

C- II - III . 경구 면역관용에 의한 직장내 시험접종으로부터 동물의 보호

iSIV/LP 또는 대조군 제제의 투여 3개월 후에, 8마리의 iSIV/LP-면역화한 동물 및 7마리의 대조군 동물을 단일 고용량 (100,000 TCID₅₀)의 SIVmac239로 직장 내로 시험접종하였다. 8마리의 iSIV/LP-처리한 동물 중 8마리가 병원성 SIVmac239의 직장내 시험접종으로부터 보호된 한편, 4마리의 iSIV-처리 동물 및 4마리의 LP-처리 동물은 동일한 직장내 바이러스 시험접종에 의해 감염되었다 (도 12a 및 b, 도면의 좌측 부분).

C- II - IV . 경구 면역관용에 의한 정맥내 시험접종으로부터 동물의 보호

상기 제1 시험접종 2개월 후에, 8마리의 원숭이 중 4마리에게 정맥내 경로를 통해 제2 시험접종을 제공하였다 (200 TCID₅₀). 이들 모두는 시험접종 제10일 후에 근소한 복제 피크 (≤200 SIV DNA 카피/1백만개 PBMC, 및 200 SIV RNA 카피/혈장 ml)를 보였지만; 제30일에, PBMC SIV DNA는 ≤10 카피/1백만개 세포로 감소하였고, 혈장 SIV RNA는 검출가능하지 않았고 (≤10 카피/ml), 이것은 바이러스의 생체내 능동 복제의 결여를 나타낸다 (도 12a 및 b, 도면의 우측 부분). 이와 반대로, 동일한 정맥내 SIVmac239 시험접종 (200 TCID₅₀)을 제공한 2마리의 나이브 동물은 성공적으로 감염되었다. 나머지 4마리의 원숭이를 직장내 재-시험접종하였고 (100.000 TCID₅₀), 이들은 모두 충분히 보호된 상태로 남았다 (도 12a 및 b, 도면의 우측 부분).

C- II -V. CD8 + T 세포의 역할의 생체내 확인

상기 제2 시험접종 5개월 후에, CD8+ T 세포의 생체내 역할을 확인하기 위해, 마우스-인간 키메릭 모노클로날 항체-CD8 항체 (cMT-807, 센토코)의 3회 정맥내 주사를 말초 혈액 및 림프 기관으로부터 그들의 CD8+ T 세포를 일시적으로 고갈시키기 위해 8마리의 이미 시험접종된 원숭이에게 1주 기간에 걸쳐 제공하였다 (면역화 제300일, 304일 및 307일 후) (도 13a & b). 바이러스 RNA 또는 DNA 출현은 직장내 경로로 재-시험접종된 4마리의 짧은 꼬리 원숭이에서 검출되지 않았고, 이것은 그들의 충분한 살균 보호를 다시 입증하지만; 이와 반대로, 강한 바이러스 복제는 10⁶ RNA 카피/ml에서 피크인 그들의 혈장 바이러스 로드 및 그들의 PBMC 및 림프절 프로바이러스 로드 (제15일에 10⁴ DNA 카피/10⁶ 세포에 도달하고 (CD8+ T 세포 고갈의 최저점); 제60-90일에, 4마리의 원숭이가 기준선 CD8+ T 세포 농도를 회복할 때, 혈장 SIV RNA 및 PBMC 및 림프절 SIV DNA가 또한 기준선 수준을 회복하였다 (도 13c, d & e))에 의해 보여지는 바와 같이 4마리의 정맥내 시험접종된 동물의 림프 기관으로부터 CD8+ T 세포의 고갈을 동반하였다. 이것은 복제-유능 바이러스가 아마도 휴지 기억 CD4+ T 세포에서 잠복 상태로 남아있는 정맥내 SIV-시험접종된 동물에서 생체내 바이러스 복제의 제어에서 iSIV/LP-유도된 CD8+ T 세포의 독특한 역할을 확인하였다.

제2 시험접종 8개월 후에, 4마리의 직장내 재시험접종된 원숭이뿐만 아니라 4마리의 정맥내 재시험접종된 원숭이에게 제3 시험접종을 제공하였고, 이때 직장내 경로를 통해 SIVB670 (100,000 TCID₅₀) (별개의 감염성 SIV 균주)를 제공하였다. 8마리의 동물은 비검출가능한 SIVB670 DNA 및 RNA 수준에 의해 나타나는 바와 같이 다음 12개월에 걸쳐 완전히 보호된 상태로 유지되니 한편, 2마리의 나이브 동물은 동일한 SIVB670 시험접종에 의해 성공적으로 감염되었고, 이것은 LP/iSIVmac239-생성된 MHC-Ib/E-제한된 CD8+ T 세포가 다른 SIV 균주에 의해 감염된 CD4+ T 세포의 활성화를 방지하는 것을 통해 교차-보호되었음을 입증한다 (도 14a & b).

iSIV/LP-처리한 동물에서 SIV 질환을 예방하는 효능의 지속기간을 결정하기 위해, iSIV/LP를 사용한 제2 면역화를 8마리의 중국 기원의 새로운 짧은 꼬리 원숭이에서 수행하고, 그들의 CD8+ T 세포의 시험관내 항바이러스 활성을 SIV 시험접종 없이 시간 경과에 따라 점검하였다. 그러한 시험관내 항바이러스 활성은 LP (n = 4) 또는 iSIV (n = 4) 단독으로 처리한 대조군 동물에 비해 면역화 60일 후로부터 검출하였다.

생체외 항-SIV 활성 수준은 8마리의 원숭이 중 7마리에서 제420일까지 유지된 한편, 1마리의 원숭이의 항바이러스 활성은 제360일로부터 제420일에 대조군 원숭이의 기준선 수준에 도달하기까지 점차 감소하였다 (도 15a). 면역화 제420일 후에, 16마리의 동물에게 100,000 TCID₅₀의 SIVmac239를 직장내 시험접종하였다. 8마리의 iSIV/LP-면역화한 동물 중 7마리가 혈장 및 PBMC (도 15b & c) 뿐만 아니라 직장 점막 림프구 (시험접종 제1일 후에 이들이 측정된) 및 골반 림프절 (도 16a 내지 16e)에서 임의의 SIV RNA 및 DNA 출현 없이 살균 면역성을 획득한 한편, 1마리의 면역화한 원숭이는 완전히 감염되었다. 중요하게는, 8마리의 백신접종된 원숭이의 생체외 항바이러스 활성의 전개는 면역화 제360일 후 (즉, 시험접종 60일 전)부터 7마리의 보호된 원숭이 및 비보호된 원숭이를 예측하는 것을 허용하였다 (도 15a 내지 c).

C- II - VI . 결론

짧은 꼬리 원숭이 모델에서, 불활성화된 SIVmac239 (iSIV) 및 공생 락토바실루스 플란타룸 (LP) (면역관용원성 아주반트로서 언급됨)의 투여가 SIV 항원-제시 CD4+ T 세포의 활성화의 억제를 유도하고 그에 의해 SIV 복제의 억제 및 SIV 시험접종으로부터 짧은 꼬리 원숭이의 보호를 유도하는, MHC-Ib/E-제한된 CD8+ T 세포를 생성함을 본원에서 개시한다.

불활성화된 iSIV 및 LP로 이루어진 혼합물을 총 16마리의 동물 및 15마리의 대조군에 위내 투여하였다. 4 내지 14개월 후에, 모든 동물에게 병원성 SIVmac239를 직장내 시험접종하였다.

SIV 감염에 대한 완전한 보호는 16마리의 iSIV/LP-투여한 동물 중 15마리에서 관찰되었고; 그 반대로 모든 대조군 동물 및 1마리의 백신접종된 원숭이에서 감염이 확립되었다. 비보호된 원숭이는 직장내 시험접종 60일 전에 생체외 항바이러스 검정에 의해 예측될 수 있다. 8마리의 보호된 동물은 4마리의 원숭이에서 정맥내 제공되고 다른 4마리에서 직장내 제공된 제2 SIVmac239 시험접종 후에 보호된 상태로 유지되었다.

8마리의 iSIV/LP-전달한 동물은 SIV-특이적 말초 혈액 CD4+ T 세포 증식이 완전 결여되고, 임의의 전신 SIV-특이적 항체 (IgG, IgM, 또는 IgA)를 출현하지 않았다.

또한, 그들의 SIV-특이적 말초 혈액 CD8+ T 세포는 다음의 몇몇 특징을 가졌다:

1) 이들은 잘 증식하지만 시험관내 자극시에 인터페론-γ 분비가 없었다;

2) 이들은 급성 감염된 자가 CD4+ T 세포의 활성화를 강하게 억제하였다;

3) 두 기능은 CD25+ 세포의 고갈 후에 변하지 않고 유지되었다;

4) 이들은 급성 감염된 동종이형 CD4+ T 세포에서 SIV 복제를 또한 억제하였다;

5) 이들의 억제성/억제 작용은 MHC-Ib/E-제한성이었다.

이들 결과는 iSIV 및 LP의 위내 동시-투여가 짧은 꼬리 원숭이가 SIV-특이적 면역관용을 생성하는 바이러스-특이적 비-세포독성 MHC-Ib/E-제한된 CD8+ 조절 T 세포를 발생시키도록 하고, 매우 놀랍게도 그러한 바이러스-특이적 면역관용이 SIV 감염의 확립에 대해 동물의 백신 보호와 연관함을 보여준다.

본 발명에 따른 제약 조성물은 인간/포유동물에서 HIV 및 SIV 감염을 예방한다는 것을 위에서 보여주었다. 상기 예방 작용은 면역관용원성으로-백신접종된 대상체 (즉, 제약 조성물을 투여한 포유동물)에서 "Ts" 면역관용을 유도함으로써 짧은 꼬리 원숭이에서 얻어진다. 상기 "Ts" 면역관용은 바이러스-특이적 비-세포독성 MHC-Ib/E-제한된 억제성 CD8 조절 T 세포를 포함하는 것으로 본원에서 입증되었고, 그의 존재 및 활성은:

- 본 발명의 제약 조성물을 투여한 짧은 꼬리 원숭이의 급성-감염된 CD4+ T 세포에서 SIV 복제를 억제하고/하거나 (시험관내);

- 감염성 SIV를 시험접종한 면역관용원성으로-백신접종된 짧은 꼬리 원숭이에서 SIV 복제를 예방하는 (생체내) 것으로 나타났다.

참조문헌

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Claims (33)

1. 불활성화된 HIV 바이러스 입자, 및
   비-병원성 락트산 박테리아
   의 혼합물을 포함하는, HIV 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 인간에서 HIV 질환을 예방 또는 치료하기 위한 경구 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 불활성화된 HIV가 HIV-1 또는 HIV-2인 제약 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 박테리아가 락토바실루스 (Lactobacillus) 박테리아인 제약 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 락토바실루스 박테리아가 락토바실루스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실루스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 존소니이 (Lactobacillus johnsonii), 락토바실루스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 레우테리 (Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실루스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실루스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 및 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   a) 제약 조성물 내의 불활성화된 HIV 바이러스 입자의 양이 상기 혼합물 1 ml 당 10⁶ 내지 10¹²개이거나, 또는
   b) 제약 조성물 내의 상기 비-병원성 락트산 박테리아의 양이 상기 혼합물 1 ml 당 10⁴ 내지 10¹⁴ CFU이거나, 또는
   c) 상기 a)와 b) 둘다
   인 제약 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼합물 내의 상기 바이러스 입자 대 상기 박테리아의 비가 1:10 내지 1:1000인 제약 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼합물 내의 상기 바이러스 입자 대 상기 박테리아의 비가 1:100인 제약 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, HIV 감염에 대해 보호하는 백신으로서 사용하기 위한 제약 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 HIV 질환이 AIDS 또는 만성 HIV 감염인 제약 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, HIV에 대해 인간을 보호하기 위한 방법에 사용하기 위한 제약 조성물.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, HIV 혈청전환으로부터 인간을 보호하기 위한 방법에 사용하기 위한 제약 조성물.
12. 제7항에 있어서, 1회 또는 수회 연속적으로 투여되는 제약 조성물.
13. 제7항에 있어서,
    a) 1일 당 10⁸ 내지 10¹⁴개 불활성화된 HIV 바이러스 입자의 용량이 인간에게 투여되거나, 또는
    b) 1일 당 10⁶ 내지 10¹⁶ CFU의 상기 비-병원성 락트산 박테리아의 용량이 인간에게 투여되거나, 또는
    c) 상기 a)와 b) 둘다
    인 제약 조성물.
14. 제1항 또는 제2항에 정의된 불활성화된 HIV 바이러스 입자, 및
    제1항에 정의된 비-병원성 락트산 박테리아
    를 포함하고, 상기 불활성화된 HIV 바이러스 입자 및 상기 비-병원성 락트산 박테리아가 상기 인간에게 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여되는 것인, HIV 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 인간에서 HIV 질환을 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물.
15. - 제1 용기 내에 불활성화된 HIV 바이러스 입자, 및
    - 제2 용기 내에 비-병원성 락트산 박테리아
    를 포함하고, 상기 HIV 바이러스 입자 및 상기 박테리아가 경구 투여를 위한 제약상 허용되는 담체 내에 존재하는 것인, HIV 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 인간에서 HIV 질환을 예방 또는 치료하기 위한 제약 키트.
    
    
    
    
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