BR112013025481B1 - Composições farmacêuticas, uso destas e kits para prevenir e/ou tratar uma doença por hiv em humanos - Google Patents

Composições farmacêuticas, uso destas e kits para prevenir e/ou tratar uma doença por hiv em humanos Download PDF

Info

Publication number
BR112013025481B1
BR112013025481B1 BR112013025481-5A BR112013025481A BR112013025481B1 BR 112013025481 B1 BR112013025481 B1 BR 112013025481B1 BR 112013025481 A BR112013025481 A BR 112013025481A BR 112013025481 B1 BR112013025481 B1 BR 112013025481B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
hiv
cells
viral
antigen
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
BR112013025481-5A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112013025481A2 (pt
BR112013025481B8 (pt
Inventor
Jean-Marie Andrieu
Louis Lu
Original Assignee
Biovaxim Limited
Institute De Recherche Pour Le Developpement (I.R.D)
Université Paris Descartes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46969619&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BR112013025481(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biovaxim Limited, Institute De Recherche Pour Le Developpement (I.R.D), Université Paris Descartes filed Critical Biovaxim Limited
Publication of BR112013025481A2 publication Critical patent/BR112013025481A2/pt
Publication of BR112013025481B1 publication Critical patent/BR112013025481B1/pt
Publication of BR112013025481B8 publication Critical patent/BR112013025481B8/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo uma mistura de um antígeno do HIV específico e uma bactéria viva não patogênica. O referido antígeno de HIV específico compreende um ou mais epítopos provenientes de proteínas Gag e/ou Pol e está preferivelmente sob a forma de particulado. A referida bactéria é preferivelmente Lactobacillus plantarum. Estas composições são utilizáveis para prevenir e/ou tratar doença provocada por HIV em humanos.

Description

A presente invenpao refere-se a composipoes farmaceuticas compreendendo uma mistura de um antigeno de HIV especifico e uma bacteria nao patogenica. Referido antigeno de HIV especifico compreende um ou mais epitopos provenientes de proteinas Gag e/ou Pol e esta preferivelmente sob uma forma particulada. Referida bacteria e preferivelmente Lactobacillus plantarum. Essas composipoes sao uteis para prevenir e/ou tratar uma doenpa provocada por HIV em humanos.
ANTECEDENTES PARA A INVENCAO
Mais de vinte e cinco anos apos a descoberta do virus da imunodeficiencia humana (HIV), projepoes recentes da World Health Organization e do Joint United Nations Program em HIV/AIDS indicam que se a pandemia progredir em sua taxa atual havera mais do que 30 milhoes de infecpoes em 2011.
Entretanto, apesar de esforpos de pesquisa consideraveis para encontrar tratamentos efetivos para prevenir infecpoes por HIV, as duas vacinas preventivas recentemente testadas falharam (Mc Elrath et al., 2008) ou produziram resultados modestos (Rerks-Ngarm et al., 2009).
Jae-Sung Yu et al. (Clinical and Vaccine Immunology, Relatorio Descritivo da Patente de Invenpao para: "COMPOSIQOES FARMACEUTICAS PARA PREVENIR E/OU TRATAR UMA DOENQA POR HIV EM HUMANOS".
A presente invenpao refere-se a composipoes farmaceuticas compreendendo uma mistura de um antigeno de HIV especifico e uma bacteria nao patogenica. Referido antigeno de HIV especifico compreende um ou mais epitopos provenientes de proteinas Gag e/ou Pol e esta preferivelmente sob uma forma particulada. Referida bacteria e preferivelmente Lactobacillus plantarum. Essas composipoes sao titeis para prevenir e/ou tratar uma doenpa provocada por HIV em humanos.
ANTECEDENTES PARA A INVENCAO
Mais de vinte e cinco anos apos a descoberta do virus da imunodeficiencia humana (HIV), projepoes recentes da World Health Organization e do Joint United Nations Program em HIV/AIDS indicam que se a pandemia progredir em sua taxa atual havera mais do que 30 milhoes de infecpoes em 2011.
Entretanto, apesar de esforpos de pesquisa consideraveis para encontrar tratamentos efetivos para prevenir infecpoes por HIV, as duas vacinas preventivas recentemente testadas falharam (Me Elrath et al., 2008) ou produziram resultados modestos (Rerks-Ngarm et al., 2009).
Jae-Sung Yu et al. (Clinical and Vaccine Immunology, Nov. 2006, vol 13, No. 11, 1204-1211 ) descreveram vetores de Mycobacterium smegmatis recombinantes construidos para expressar o HIV-1 grupo M consenso env gene CON6 quer como uma proteina de superficie, intracelular, ou secretada. Os autores poderiam demonstrar que, em camundongos, M. smegmatis recombinante era imunogenico para a induqao de respostas de celula T de HIV-1 em superficies mucosais.
Ke-Qin Xin et al. (Blood, 1 de julho de 2003, vol 102, No. 1, 223-228) descreveu um vetor de Lactococcus lactis recombinante expressando o loop V2-V4 de HIV-1 Env em sua superficie celular. Imunizaqao oral de camundongos com esse vetor induziu:
- ambas as respostas imunes mucosal e humoral como mostrado detectando niveis elevados de anticorpos de IgG de soro e IgA fecal especificos de HIV; e
- uma resposta imune celular como mostrado por um numero aumentado de celulas de secreqao de IFN-gama especifico de HIV.
Para serem apropriadamente expressados na superficie celular de L. lactis, segmentos de gene de 1 kb ou menos poderiam ser usados.
A maioria dos cientistas envolvidos em patogenese e prevenqao de HIV sente que antes de testar vacinas preventivas para HIV ou outras composiqoes biologicas para prevenir ou tratar infecqao por HIV em seres humanos, seria mais construtivo testar seus correlatives em primates nao humanos (Morgan C, et al., 2008). O primata nao humano de escolha e o macaco rhesus e, dentre os macacos, foi agora conclusivamente demonstrado que os macacos de origem chinesa infectados pelo virus de imunodeficiencia simia (SIV) 23 9 sao o melhor modelo imitando a maioria dos aspectos clinicos, virologicos e imunologicos da evoluqao de infeeqao por HIV em humanos (Marcondes MC, et al. 2006; Stahl-Hennig C, et al. 2007; Chen S, et al. 2008).
Finalmente, a comunidade cientifica agora concorda que, uma vez que composiqao biologica preventive efetiva ou vacina contra SIV 239, seja descoberta no macaco, ela devera, em toda probabilidade, ser adaptavel com sucesso aos humanos para protege-los de AIDS.
Apesar de constantes esforqos de pesquisa da comunidade cientifica, estrategias eficientes preventives e terapeuticas permanecem aguardadas para combater a pandemia de AIDS ao redor do mundo.
Varias bacterias foram descritas como tendo interessantes propriedades de adjuvanticidade e imunomodulantes em administraqao a individuos. Em particular, bacterias de acido latico foram reportadas para promover urn efeito de toler&ncia no sistema imune.
Por exemplo, WO 2006/123230 publicado em 23 de novembro de 2006 no nome de Stallergenes S.A., descreve o uso de utna bacteria selecionada dentre Bifidobacterias e bacterias de acido latico como um adjuvante em uma composiqao imunogenica capaz de induzir tolerancia especifica de antigeno em administraqao sublingual, perlingual ou oral para um individuo. A composiqao imunogenica e proposta para ser usada para tratar alergias, doenqas auto-imunes ou para prevenir rejeiqoes de enxerto.
Ainda por exemplo, WO 2009/093900 publicado em 3 0 de julho de 2 009 no nome de Stichting Top Institute Food and Nutrition, descreve uma composicjao tolerogenica contendo uma quantidade substancial de bacterias de acido latico na fase semi-logaritmica. Essa composiqao induz uma tolerancia imune nao especifica de antigeno quando administrada a um individuo. A composiqao e proposta para ser usada para prevenir, retardar e/ou tratar condiqoes ou doenqas associadas com respostas inflamatorias que possam conduzir a dano de tecido tais como alergias, doenqas autoimunes, e doenqas inflamatorias do intestine.
SUMARIO DA INVENCAO
Os Inventores foram aptos a mostrar que, surpreendentemente, composiqoes farmaceuticas originais como descritas nos Exemplos abaixo induziram uma eficiente proteqao imune especifica de antigeno contra SIV em macacos. Ademais, quando a referida proteqao imune especifica de SIV foi induzida, os inventores demonstraram que foram prevenidas a replicaqao/ disseminaqao de SIV e o subsequente estabelecimento da infecqao in vivo.
De fato, os inventores surpreendentemente mostraram que em administrar uma composiqao farmaceutica como descrita aqui ou mucosalmente ou pela via intradermica ou intraepitelial, replicaqao de virus foi significantemente inibida, ou ainda anulada ou evitada.
Na verdade, os inventores poderiam observar, pela primeira vez, que uma resposta de celula T CD8+ nao citotoxica suprimiu a ativaqao precoce de celulas T CD4+ apresentando antigeno de SIV em macacos. Deste modo, sem desejar estar limitado por teoria, as composiqoes farmaceuticas de acordo com a presente invenqao induzem urn novo tipo inesperado de imunotolerancia especifica de virus em administraqao mucosal ou intradermica ou intraepitelial a individuos. Essa imunotolerancia parece ser uma imunotolerancia induzida por celula T CD8+ supressora especifica de antigeno Gag e/ou Pol de HIV (tambem nomeada aqui de imunotolerancia "Ts" ou imunotolerancia "T supressora"), que e MHC (para "complex© de histocompatibilidade principal")-Ib/E-restrita e nao citotoxica.
A luz dos resultados reportados aqui, e fornecida pela presente invenqao uma nova composiqao farmaceutica capaz de alcanqar uma imunotolerancia de "Ts" como definida acima para prevenir e/ou tratar uma doenqa provocada por HIV em humanos.
Um objeto da presente invenqao e deste modo prover uma composiqao farmaceutica compreendendo uma mistura de urn antigeno e uma bacteria viva nao patogenica, em que, preferivelmente, referido antigeno e particulado e/ou tern urn ou mais epitopos provenientes de proteinas Gag e/ou Pol de HIV, e em que referida bacteria e pref erivelmente Lactobacillus plantarum.
E outro objeto da presente invenqao prover uma composiqao farmaceutica como descrito aqui, para uso como uma vacina.
Outro objeto da presente invenqao e prover urn metodo para prevenir e/ou tratar uma doenqa provocada por HIV em um humano em necessidade do mesmo, compreendendo pelo menos a etapa de administrar mucosalmente (preferivelmente oralmente) ou intradermicamente ou intraepitelialmente uma quantidade efetiva de uma composiqao farmaceutica como mencionado acima ao referido humano.
Ainda outro objeto da presente invenqao e prover um metodo para proteger um humano contra HIV, compreendendo pelo menos a etapa de mucosalmente (preferivelmente oralmente) ou intradermicamente ou intraepitelialmente administrar uma quantidade efetiva de uma composiqao farmaceutica como mencionado acima ao referido humano.
Ainda outro objeto da presente invenqao e prover um metodo para proteger um humano de soroconversao por HIV, compreendendo pelo menos a etapa de mucosalmente (preferivelmente oralmente) ou intradermicamente ou intraepitelialmente administrar uma quantidade efetiva de uma composiqao farmaceutica como mencionado acima ao referido humano.
Ainda outro objeto da presente invenqao e prover um kit farmaceutico para prevenir e/ou tratar uma doenqa provocada por HIV em um humano em necessidade do mesmo, compreendendo: - em um primeiro recipiente, um antigeno; e em um segundo recipiente, uma bacteria nao patogenica, em que referido antigeno e referida bacteria estao em carreadores farmaceuticamente aceitaveis para administraqao mucosal ou intradermica ou intraepitelial, em que preferivelmente referido antigeno e particulado e/ou tem um ou mais epitopos provenientes de proteinas Gag e/ou Pol de HIV, e em que referida bacteria e preferivelmente Lactobacillus plantarum.
BREVE DESCRICAO DOS DESENHOS
A presente invenqao e ilustrada pelas seguintes figuras as quais referenda e feita nos exemplos nao limitantes abaixo. Figura 1: Desafio de SIVmac239 intravenoso (i.v.) de macacos rhesus pre-tratados com urn iSIV/BCG intravaginal. Figura 2: Desafio de SIVmac239 intra-retal (i.r.) de macacos rhesus pre-tratados com urn iSIV/BCG intravaginal. Figura 3: Desafios repetidos de SIVmac239 (3 vezes por i.v. e 2 vezes por i.r. ) de macacos rhesus pre-tratados com um iSIV/BCG intravaginal. Figura 4: Desafio de SIVmac239 intravenoso de macacos rhesus pre-tratados com um iSIV/BCG intravaginal reais um reforqo intradermico. Figura 5: Desafio de SIVmac239 intra-retal de macacos rhesus pre-tratados com um iSIV/BCG intravaginal mais um reforqo intradermico. Figura 6: Desafio de SIVmac239 intra-retal de macacos rhesus pre-tratados com um iSIV/BCG oral. Figura 7: atividade antiviral in vitro de celulas T CD8+ obtidas de macacos rhesus pre-tratados com um iSIV/BCG intravaginal. Figura 8: atividade antiviral in vitro de celulas T CD8+ obtidas dos 4 macacos rhesus pre-tratados com urn iSIV/BCG oral. Figura 9: Supressao especifica de SIV de ativaqao de celulas T CD4 + por celulas T CD8+ autologas obtidas dos 4 macacos rhesus pre-tratados com urn iSIV/BCG oral. Figura 10a: Titulos de anticorpo IgG anti-SIV em amostras de plasma tomadas dos macacos rhesus pre-tratados com iSIV/LP, iSIV ou LP. Figura 10b: Proliferaqao de celulas T especificas de SIV em amostras de PBMC tomadas dos macacos rhesus pre- tratados com iSIV/LP, iSIV ou LP. Figura 10c: Celulas T secretando IFN-gama especificas de SIV em estimulo in vitro na presenqa ou ausencia de celulas T CD8 ou CD25. Figura lOd: Supressao especifica de SIV de ativaqao de celulas T CD4+ por celulas T CD8+ autologas obtidas de 8 macacos rhesus pre-tratados com urn iSIV/LP oral como comparado a animais pre-tratados com urn LP oral (n = 4) ou iSIV (n = 3) . Figura 10e: Celulas T CD8+ especificas de SIV apos 60 dias seguindo administrapao intragastrica de uma preparaqao de iSIV/LP: citotoxicidade de celulas T CD4+ pulsadas de
SIV de AT-2 na presenqa de celulas T CD8+ ou de K562 na presenqa de celulas exterminadoras de natureza humana (hNK) (controles) com ou sem SEB e estimulo de anti-CD3/CD28. Figura 11 a: Atividade antiviral in vitro (em celulas CD4) de celulas T CD8+ autologas obtidas dos 8 macacos rhesus pre-tratados com urn iSIV/LP oral como comparado a animais pre-tratados com urn LP oral (n = 4) ou iSIV (n = 3) . Figura 11 b: Atividade antiviral in vitro (em celulas CD4) de celulas T CD8+ heterologas ou alogenicas obtidas de 4 dos 8 macacos rhesus 80 dias apos o tratamento de urn iSIV/LP oral. Figura 11 c-g: Atividade anti-SIV de celulas T CD8+ apos 60 dias seguindo imunizaqao oral em urn sistema de cultura atrasado (c), inserto (cf), alogenico (e), na presenga de anticorpos anti-MHC-la/ABC ou anti-MHC-Ib/E (f) e nas celulas T CD8+ depletadas de subconjunto TCRDD+ ou v£8+ (g). Figura 12a: Niveis de carga viral de plasma (copias de RNA de SIV por ml de plasma) seguindo desafios de SIVmac239 intra-retal e intravenoso nos macacos rhesus pre-tratados com urn iSIV/LP oral como comparado a animais pre-tratados com urn LP oral ou iSIV. Figura 12b: Niveis de carga viral celular (copias de DNA de SIV por milhoes PBMCs) seguindo desafios de SIVmac239 intra-retal e intravenoso nos macacos rhesus pre- tratados com urn iSIV/LP oral como comparado a animals pre- tratados com urn LP oral ou iSIV. Figura 13: Deplepao de sangue periferico e celulas T CD8+ de linfonodo dos 8 macacos tratados com iSIV/LP por infusao do CMT807 de anticorpo de anti-CD8. a, contagens de celula T CD8+ de sangue periferico antes e apos receber tres injepoes de CMT807; b, % de celulas T CD8+ de linfonodos antes e apos receber tres injepoes de CMT807; c, carga viral de plasma antes e apos receber tres injepoes de CMT807; d, carga de SIV de DNA de PBMC antes e apos receber tres injepoes de CMT807; e, carga de DNA de SIV de linfonodo antes e apos receber tres injepoes de CMT807. Figura 14: Cargas virais de plasma (a) e PBMC (b) seguindo urn terceiro desafio intra-retal efetuado intra- retalmente com SIVB670 em 8 macacos rhesus imunizados com uma preparapao oral feita de iSIV e LP e 2 adicionais macacos simples. Figura 15: Atividade antiviral mediada de celulas T in vitro e de CD8+ in vivo seguindo imunizapao intragastrica com iSIV e LP (iSIV/LP imunizapao No. 2) . a, Atividade anti-SIV (vezes de supressao viral) de celulas T CD8+ durante 60-420 dias pos-imunizapao em 8 macacos rhesus que serao desafiados intra-retalmente; bee, cargas virais de plasma e celular seguindo desafio de SIVmac239 intra-retal daqueles 8 macacos rhesus imunizados com urn iSIV/LP oral e de 8 macacos de controle tratados com LP apenas (n = 4) ou iSIV (n = 4) apenas. Figura 16: Cargas de DNA e RNA de SIV em linfocitos intraepiteliais de mucosa retal (IPLs) (a-b), celulas lamina propria (LPC) (c-d), e em linfonodos pelvicos (PLN) (e) apos desafio intra-retal de SIVmac239 em 8 macacos (imunizaqao de iSIV/LP No. 2).
DESCRICAO DETALHADA DA INVENCAO
A presente invenqao e direcionada a uma composiqao farmaceutica compreendendo uma mistura de urn antigeno e uma bacteria viva nao patogenica. O antigen Devido a grande variabilidade no genoma de HIV, que resulta de mutaqao, recombinaqao, inserqao e/ou deleqao, HIV foi classificado em grupos, subgrupos, tipos, subtipos e genotipos. Ha dois maiores grupos de HIV (HIV-1 e HIV-2) e muitos subgrupos porque o genoma de HIV muda constantemente. A maior diferen<?a entre os grupos e subgrupos e associada com o envelope viral. HIV-1 e classificado em urn subgrupo principal (M) , referido subgrupo sendo dividido em nove subtipos (clades ou subtipos) designados A ate J (Hu et al., JAMA 275:210-216, 1996 ; Korber et al., Science 280: 1868-1871, 1998), e urn 10° subgrupo externo (0) . Muitos outros subgrupos resultando de recombinaqoes in vivo dos previos tambem existem (Papathanasopoulos MA, et al.Virus Genes 2003, 26: 151 -163). Preferivelmente, o virus HIV e HIV-1 ou HIV-2, incluindo todos conhecidos e ate agora clades desconhecidos dos mesmos. Ainda preferivelmente, e HIV-1.
No contexto da presente invenpao, urn "antigeno" e de origem de HIV, que significa que esta relacionado a urn grupo de HIV especifico, subgrupo, tipo, subtipo ou a uma combinaqao de varios subtipos. Preferivelmente, referido antigeno do HIV e urn antigeno de HIV-1 ou HIV-2.
Referido antigeno nao e infeccioso.
Foi suspeito por urn longo tempo pela comunidade cientifica que a ativaqao de celulas T CD4+, o alvo principal de ambos HIV-1 e SIV, contribuiu diretamente para a replicapao viral (Andrieu e Lu, 1 995; Korin e Zack, 1999) . Entretanto, foi apenas recentemente que a interaqao entre ativacjao de celulas T CD4+ e as sucessivas etapas do process© infeccioso de SIV ou HIV foi esclarecida. Em celulas T CD4+ quiescentes, penetraqao de virus foi seguida dentro de 2 horas pos entrada pela apresentaqao na membrana de plasma de epitopos derivados de proteina Gag e Pol de virions de entrada enquanto proteinas Env e Nef necessarias de nova sintese (Sacha et al., 2007) . Entretanto, as subsequentes fases do processo infeccioso, isto e, transcripao reversa seguida por integrapao de virus, foram desenvolvidas muito ineficientemente em celulas quiescentes (Vatakis et al., 2009a e 2009b). Em contrasts, quando celulas T CD4+ foram ativadas antes ou dentro das 48 horas seguindo a apresentapao de epitopos Gag e Pol na membrana de plasma, transcripao reversa de HIV/SIV e integrapao de DNA foram extremamente ativas que permitiu replicapao e liberapao de virus muito eficiente (Vatakis et al., 2009a e 2009b).
Por isso, os inventores postularam que especificamente bloqueando in vivo o desenvolvimento precoce de ativapao de celulas T CD4+ especifica de Gag ou Pol de HIV/SIV apos exposipao a HIV/SIV resultara na prevenpao de replicapao viral ativa.
Tendo isso em mente, a firn de induzir a supressao da ativapao de celulas T CD4+ de apresentapao ao antigeno Gag e/ou Pol, e por sua vez para prevenir a replicapao de HIV in vivo e a disseminata© em humanos expostos ao virus, a composipao farmaceutica da presente invenpao compreende urn antigeno do HIV que preferivelmente tern urn ou mais epitopos provenientes de proteinas Gag e/ou Pol de HIV. Tai antigeno vantajosamente quer contem ou e derivado de Gag e/ou Pol de HIV.
Os termos "um antigeno contend©, ou derivado de, Gag e/ou Pol de um virus HIV" deste modo significa um antigeno do HIV: que compreende pelo menos Gag e/ou Pol (como um "Gag e/ou Pol contendo antigeno"); ou que compreende uma ou mais proteinas codificadas por GAG tai como a proteina de capsideo (p24) e da proteina de matriz (pl7), e/ou uma ou mais proteinas codificadas por POL tai como a integrase, a transcriptase reversa e uma protease (como um "antigeno derivado de Gag e/ou Pol"); ou que compreende um ou mais epitopos provenientes daquelas proteinas (tambem como um "antigeno derivado de Gag e/ou Pol").
Em particular, quaisquer outras proteinas virais ou epitopos destes selecionados no grupo consistindo de ENV, VIF, VPR, VPU para HIV-1, VPX for HIV-2, REV, NEF, TAT, e similares, nao sao componentes essenciais do antigeno compreendidos na composiqao farmaceutica descrita aqui. Qualquer uma dessas proteinas, se presentes, e apenas um componente opcional do antigeno a ser usado na composiqao farmaceutica descrita aqui.
0 antigeno e preferivelmente um antigeno particulado.
Isso significa que e preferivelmente selecionado dentre particulas de virus, particulas de virus recombinante, particulas de tipo virus, bacterias ou fungos recombinantes expressando Gag e/ou Pol, microparticulas polimericas apresentando em sua superficie uma ou mais proteinas virais ou peptideos ou epitopos (contendo ou derivados de Gag e/ou Pol de HIV) . Preferivelmente, urn ou mais epitopos provenientes de Gag e/ou Pol sao produzidos por ou expressados por ou contidos em referido antigeno. Quando particulas de virus recombinante ou particulas de virus ou bacterias ou fungos recombinantes expressando Gag e/ou Pol sao usados, estes sao preferivelmente microorganismos inativados.
0 antigeno pode ser uma particula de virus, uma particula de virus recombinante, uma particula como virus ou uma bacteria ou fungo recombinante expressando Gag e/ou Pol. Tambem pode ser uma ou mais proteinas virais ou peptideos (contendo ou derivadas de Gag e/ou Pol de HIV) , recombinante ou nao, quer na forma de conjugados ou de concatemeros. O antigeno e entao acido nucleico viral independente, is to e, e dependents de DNA nao viral ou de RNA nao viral.
O antigeno pode resultar da expressao de uma sequencia viral de acido nucleico vantajosamente contida em urn microorganismo recombinante apropriado.
Se o antigeno contido na composiqao farmaceutica da presente invenqao e uma bacteria recombinante expressando Gag e/ou Pol, entao referida bacteria recombinante e preferivelmente diferente da bacteria viva nao patogenica que esta tambem compreendida na composiqao.
Quando o antigeno na composiqao farmaceutica de acordo com a presente invenqao e um ou mais proteinas virais ou peptideos (contendo ou derivadas de Gag e/ou Pol de HIV), e preferivelmente sob uma forma de particulado. Em pratica, apropriados antigenos particulados podem ser produzidos por microorganismos vivos tais como leveduras, na mesma maneira como para vacinas de hepatite B de DNA recombinante em que as auto-montagens de polipeptideo de HBsAg expressado em particulas esfericas imunogenicas intimamente semelhantes as particulas de 22 nm naturais encontradas no soro de pacientes com infecqao de HBV cronica (Plotkin et al., 2008).
Alternativamente, quando o antigeno na composiqao farmaceutica de acordo com a presente invenqao e uma ou mais proteinas virais ou peptideos (contendo ou derivadas de Gag e/ou Pol de HIV), ela esta na forma de conjugados. Em tai forma de realizaqao, como e bem conhecido na tecnica, proteinas ou peptideos de interesse sao Carreadores convencionais que sao comercialmente disponiveis sao proteinas inter alia tais como a proteina KLH (hemocianina de lapa keyhole), a proteina de BSA (albumina de soro bovino), a proteina de OVA (ovalbumina), e similares (que pode preferivelmente ser administravel com seguran^a oralmente a humanos). Metodos para produzir conjugados apropriados sao familiares a um versado na tecnica.
Ainda alternativamente, quando o antigeno na composiqao farmaceutica de acordo com a presente invenpao e um ou mais proteinas virais ou peptideos (contendo ou derivadas de Gag e/ou Pol de HIV) , ele esta na forma de concatemeros. Conforme e bem conhecido na tecnica, concatemeros sao feitos de multiples copias de proteinas ou peptideos de interesse que sao fisicamente ligados juntas em uma macromolecula. Em concatemeros, uma copia da proteina ou peptideo de interesse pode ser ligada a outra quer diretamente ou elas podem ser separadas por um brapo sintetico. Uma concatemero deste modo compreende pelo menos duas copias, preferivelmente ate 10 copias ou mais, da proteina ou peptideo de interesse. Metodos para produzir concatemeros apropriados pertencem ao conhecimento geral de uma pessoa versada na tecnica.
Como usado aqui, uma "particula como virus"significa uma particula que se parece intimamente com virions maduros, mas que nao contem material genomico viral de referido virus. Mais precisamente, VLPs, que sao tambem chamados pseudo-virions, representam estruturas de subunidades compostas de multiplas copias de urn capsideo viral e/ou outras proteinas virais. Essas proteinas virais sao capazes de automontagem nos VLPs de simetria esferica definida in vivo. Esses VLPs nao compreendem quaisquer moleculas de acido nucleico codificando para proteinas de virus, e mais precisamente nao contem quaisquer moleculas de acido nucleico. Portanto, VLPs sao nao replicativos e nao infecciosos em natureza, o que os tornam seguros para administraqiao na forma de uma composiqao f armaceutica. Metodos para produzir VLPs sao bem conhecidos do versado na tecnica (ver, por exemplo, Liew et al., 2010; Plummer e Manchester, 2010) . Exemplos nao limitantes de apropriados metodos para produzir VLPs sao descritos em US 5.919.458, EP 386882, WO 91 /07425, US 5.861.282 e WO 91 /05864 descrevendo VLPs de HIV (pseudovirions) que nao compreendem genoma de HIV nem qualquer molecula de acido nucleico.
Como usado aqui, "uma particula de virus recombinante" significa uma particula de virus que contem, ou que expoem em sua superficie, proteinas de diferentes virus. Alem disso, uma particula de virus recombinante pode tambem significar uma bacteria ou outra celula de hospedeiro que contem, produz ou expoe, em sua superficie, uma ou mais proteinas virais ou peptideos ou epitopos contendo ou derivados de Gag e/ou Pol de HIV.
Na verdade, a maioria das particulas de virus recombinante sao particulas de virus em que parte de proteinas estruturais originais (isto e, principalmente proteinas de envelope e proteinas de nticleo) e substituida por proteinas correlativas de outro virus. Como um exemplo, as proteinas de envelope podem ser trocadas. Em tai caso, as particulas de virus recombinantes contem um genoma "quimerico" consistindo de genoma de um virus tendo a sequencia codificando proteinas de envelope trocadas com codificaqiao de sequencia para proteinas de envelope de outro virus. A maioria das particulas de virus recombinante sao replicativas e infecciosas.
Como usado aqui, um virus recombinante compreendendo proteinas de outro virus significa que a particula de virus recombinante contem um ou mais proteinas virais ou peptideos ou epitopos contendo ou derivados de Gag e/ou Pol de HIV, quer internamente ou presente em sua superficie. Exemplos nao limitantes de metodos para produzir particulas de virus recombinante sao descritos para:
* Alfavirus: em WO 02/053757 descrevendo um alfavirus recombinante expressando HIV (Proteina de ENV)
* Retrovirus: em EP 1499736 descrevendo vetores lentivirais expressando glicoproteinas quimericas.
* Adenovirus (tai como tipo 5, 7, ou 35) : em US 2007/077257, US 2007/054395, JP 2007037402, WO 2006/120034, US 2004/253210, US 2004/170647, US 2005/070017, US 2003/228329, US 2004/101957, US 2003/219458, US 2004/009936, US 2004/028652, WO 03/050238, WO 03/038057, WO 03/020893, WO 02/31168, WO 02/22080, WO 01/02607, e US6716823 que descrevem adenovirus recombinantes expressando proteinas de HIV.
* Virus da variola (virus da variola do canario, vacinia, vacinia
Ankara, e virus da variola das aves) em US 5,766,598, EP 0592546, US 2007/048861, US 2006/188961, US 2006/134133, EP 1789438, WO 2005/017208, WO 2004/035006, US 2004/146528, JP 2003321391, EP 1378516, WO 95/07099, JP 7170982, DE 4141741, EP 0449116, JP 1148183, JP 1085072, EP 0592546, EP 0243029, US 2005/287162, JP 2004105187, JP 2004089185, WO 03/095656, EP 0592546, WO 96/40880, US 6.136.318, US 5.670.367 que descrevem pox virus recombinante expressando proteinas virais incluindo proteinas de HIV.
* Bacterias que contem, que produzem ou que expoem em sua superficie, pelo menos uma proteina de urn virus: em US 7,189,402 e WO 96/11708 que descrevem Salmonella ou E. coll expressando Glicoproteinas de HIV (isto e, proteinas de envelope).
Preferivelmente, uma particula de virus recombinante corresponde a um virus de variola, cujo virus de variola e preferivelmente selecionado no grupo compreendendo variola do canario (por exemplo, vetores virais ALVAC tais como o descrito em patente US 5.766.598 e EP 0592546), vacinia (por exemplo, o virus vacinia descrito em pedido de patente internacional WO 95/07099), vacinia Ankara (por exemplo, vetores virais NYVAC tais como aqueles descritos em pedido de patente EP 1789438) , e virus da variola das aves (por exemplo, vetores virais TROVAC tais como aqueles descritos em pedido de patente internacional WO 03/095656) .
Mais preferivelmente, referido virus da variola e um virus da variola de canario. Como um exemplo de particula de virus recombinante correspondendo a variola do virus de canario e expressando peptideo/proteina de HIV, podem-se citar os vetores virais ALVAC descritos em patente US 5.766.598, (incorporados aqui por referenda de coluna 6, linha 18 a coluna 82, linha 36), cujos vetores ALVAC expressam como um exemplo HIV-1 gpl20, HIV-1 gpl60, forma secretada nao divisivel de HIV-1 env, gpl20 HIV-1 ancorado com uma sequencia de transmembrana, Gag/pol de HIV-1, Gag/pol de HIV-1 e env (gpl20) , Gag/pol de HIV-1 e env (gpl60), e Gag/pol de HIV-1 e env (gpl20 com ancora de transmembrana). Preferivelmente, o referido vetor ALVAC expressa Gag/pol de HIV-1 e env (gpl20) , e mais preferivelmente referido vetor ALVAC e ALVAC VCP1521.
Uma "particula de virus" e preferivelmente uma particula de SIV ou uma de HIV tai como uma particula de SIV ou de urn virus HIV que pode confer urn genoma viral mudado (por exemplo, por mutaqao de acido nucleico, substituiqao ou inserqao) resultando na produqao de nao particulas de virus infeccioso.
Particulas de virus contendo urn genoma viral mudado sao descritas em US 7.229.625, US 6.121.021, US 6.923.970, US 6.544.527, US 6.451.322, e US 6.080.408.
Vantajosamente, e tendo particulas de virus ou particulas de virus recombinante seguras para administraqao a urn humano, referidas particulas de virus ou particulas de virus recombinante sao inativadas antes de serem administradas. Tai inativaqao pode ser necessaria para particulas de virus recombinante, mesmo para os nao replicativos.
Como usado aqui "uma particula de virus inativada", referida particula de virus sendo recombinante ou nao, significa uma particula viral, que nao e mais infecciosa e, preferivelmente, nao mais replicativa.
Metodos para inativaqao de particulas virais ou particulas de virus recombinante sao bem conhecidos de um versado na tecnica. Exemplos nao limitantes de inativaqao viral incluem inativaqao quimica tai como tratamento com formalina, cloramina de taurina, formaldeido, paraformaldeido, propiolacteno, beta-propiolactona (REMUNE) ou aldritiol-2 (AT-2, ver US 6,001,155), inativaqao termica, inativaqao fisica tai como UV ou irradiaqao gama ou exposiqao a microondas, e combinapoes dos mesmos. Para uma referenda para inativaqao de HIV, ver AVIV et al. (J. Virol., vol.79(19), p: 12394-12400, 2005).
De acordo com uma forma de realizaqao, a referida inativapao e uma inativaqao quimica selecionada no grupo compreendendo a inativaqao com formalina, cloramina de taurina, formaldeido, paraformaldeido, propiolacteno, beta¬propiolactona (REMUNE) ou aldritiol-2.
Alternativamente ou adicionalmente, a referida inativaqao e uma inativaqao termica. Tai inativapao e bem conhecida do versado na tecnica e, como um exemplo de tai metodo, pode-se citar o descrito nos exemplos. De fato, os inventores surpreendentemente estabeleceram em macacos que virus (isto e, AT-2) quimicamente e/ou termicamente inativados induzem uma imunotolerancia protetora quando associados a uma bacteria viva nao patogenica.
Vantajosamente, para os propositos de administraqao a humanos, particulas de virus sao pelo menos inativadas duas vezes, tipicamente usando pelo menos dois metodos de inativaqao mencionados acima.
Preferivelmente, como ainda mencionado acima, as particulas de virus (recombinante ou nao, VLPs ou nao) que sao usadas como antigenos nas composiqoes farmaceuticas da presente invenqao, nao sao dependentes de acido nucleico (isto e, DNA ou RNA) , o que significa que as particulas de virus nao contem qualquer DNA ou RNA viral, ou se eles contem DNA ou RNA, nao tern papel na imunogenicidade.
Alternativamente, microparticulas polimericas (sob a forma de microcapsulas, microesferas, e similares) de varias estruturas e apresentando em sua superficie uma ou mais proteinas virais ou peptideos ou epitopos contendo ou derivados de Gag e/ou Pol de HIV, podem ser usadas como antigenos nas composiqoes farmaceuticas de acordo com a presente invenqao. Tais microparticulas podem ser feitas de apropriados polimeros biologicos ou quimicos, tais como metacrilato de dextrano, metacrilato de poli(etileneglicol) e/ou gelatina, em que os virus HIV ou proteinas virais ou peptideos ou epitopos contendo ou derivadas de Gag e/ou Pol de HIV podem aderir. Exemplos das microparticulas polimericas podem ser encontrados na literatura (por exemplo, em Wei Li Lee et al. (2010), Sandri et al. (2007), Goldberg et al. (2003), Delie F. (1998), Ponchel et al. (1998), Mathiowitz et al. (1997), Fasano et al. (1997), Chickering et al. (1997)).
Em uma forma de realizaqao preferida, o antigeno em uma composiqao farmaceutica de HIV-1, de acordo com a presente invenqao, e uma ou mais particulas virais capazes de expressar urn ou mais proteinas virais ou peptideos ou epitopos contendo ou derivadas a partir de Gag e/ou Pol de HIV-1. Alternativamente, o antigeno em uma composiqao farmaceutica de HIV-1 de acordo com a presente invenqao e uma ou mais microparticulas polimericas apresentando em sua superficie uma ou mais proteinas virais ou peptideos ou epitopos contendo ou derivados de Gag e/ou Pol de HIV-1.
Preferivelmente, o antigeno a ser usado na composiqao farmaceutica de acordo com a presente invenqao e pelo menos cerca de 110 kDa em tamanho. E preferivelmente pelo menos cerca de 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 kDa ou ainda mais, em tamanho.
Uma quantidade efetiva do antigeno viral a ser usado no contexto da invenqao pode facilmente ser determinada pelo versado, usando o conhecimento geral comum e a luz dos Exemplos descritos a seguir, em conexao com virus SIV ou HIV.
Como um exemplo, quando referido antigeno e um antigen© particulado e e mais especificamente a particula de virus, uma quantidade de particulas de virus e de cerca de 106 a cerca de 1012 por ml de referida mistura.
A bacteria nao patogenica Como conhecido pelos inventores com SIV em macacos, quando administrada pela via mucosal ou a intradermica ou a intraepitelial em conjunto com um antigeno apropriado como definido acima, a bacteria viva nao patogenica compreendida na composiqao farmaceutica e capaz de induzir e preferivelmente manter um estado de imunotolerancia ao antigeno mencionado acima. Em humanos, isso torna possivel prevenir e/ou tratar uma doenqa por HIV.
Referida bacteria pode ser, deste modo, considerada como um adjuvante particular que pode aqui ser designado como um "adjuvante tolerogenico" ou um "carreador tolerogenico" ou um "veiculo tolerogenico" ou um "carreador de tolerancia" ou uma "carreador de tolerizaqao" ou um "veiculo para tolerancia", esses termos sendo sinonimos.
Preferivelmente, todos esses termos equivalentes ref erem-se a uma bacteria viva nao patogenica que e usada em combinaqao com um antigeno do HIV como definido acima a (preferivelmente, imunotolerancia) ao antigeno, por meio disso prevenindo e/ou tratando uma doenqa por HIV em humanes.
firn de conseguir uma proteqao imune especifica Mais preferivelmente, urn "veiculo tolerogenico" e uma bacteria viva nao patogenica que e administrada em mistura com urn antigeno do HIV como definido acima, a firn de alcanpar um ou mais, preferivelmente 2 ou mais, ainda preferivelmente 3 ou mais, dos seguintes efeitos imunoprotetores:
1) Um "veiculo tolerogenico" nao induz significance produpao de anticorpos especificos do antigeno de HIV sistemico:
Em particular, nenhuma produpao significance de anticorpos de IgM e/ou IgG anti-HIV sistemico e observada. Por exemplo, nao ha resposta humoral sistemica significance, isto e, ou nenhuma resposta de anticorpo sistemica detectavel especifica pode ser detectada por metodos de laboratorio clinicos cldssicos tai como o ELISA, ou se anticorpos sistemicos sao detectados, eles nao sao protetores contra infeepao por virus HIV.
2) Um "veiculo tolerogenico" nao induz significance proliferapao especifica de antigeno do HIV de celulas T CD4+:
Em particular, nenhuma proliferapao significance de antigeno das celulas CD4 especificas de HIV e observada em estimulo de antigeno do HIV in vitro como medido por testes padrao tai como aquele descrito nos exemplos acompanhantes.
3) Um "veiculo tolerogenico" nao induz significante produqao de gama interferon por celulas T CD8+ em estimulo de antigeno do HIV in vitro:
Em particular, o nivel de secreqao de gama interferon por celulas T CD8+ que e observado em estimulo de antigeno do HIV in vitro esta abaixo do nivel limiar para urn teste ELIspot.
4) Um "veiculo tolerogenico" induz uma significante resposta de celula T CD8+ suprimindo uma ativaqao de celulas T CD4+ de apresentaqao ao antigeno de HIV:
Em particular, essa resposta pode ser determinada por urn teste in vitro medindo o nivel de inibiqao de replicaqao viral por celulas T CD8+ (indicando uma resposta "significante" de celula T CD8+) como mostrado nos exemplos acompanhantes. Essas celulas T CD8+ sao tambem chamadas celulas T "regulatorias" de CD8+. Ainda em particular, essa resposta e nao citotoxica dado que, por exemplo, nao induz significante produqao de gama interferon. Ainda em particular, essa resposta e restrita ao MHC-Ib/E. Ainda em particular, TCRap parece estar envolvido na resposta de celulas T CD8+ suprimindo replicacjao viral. Ainda em particular, essa resposta suprime a ativaqao de antigeno das celulas T CD4+ apresentando HIV comparado a mesma populaqao celular depletada de celulas T CD8+. Preferivelmente, a referida resposta suprime a ativaqao precoce de celulas T CD4 + de apresentaqao ao antigeno de HIV, em que referida ativaqao "precoce" e medida pelo marcador Ki67+ (Scholzen e Gerdes. J. Cell Physiol. 182,311 -322 (marqo 2000)).
Pelos termos "nao induz" como usado acima em 1 ), 2) e 3), e significado urn resultado abaixo do nivel limiar para urn teste de detecqao quantitative apropriado, em que referido "nivel limiar" e urn valor determinada no teste na base do controle(s) negativo(s): sob esse valor, o resultado e urn resultado negative. Esse valor pode variar de um teste para outro e de urn metodo de deteeqao para outro.
Vantajosamente, o veiculo tolerogenico e selecionado dentre vivos: bacterias nao patogenicas, especialmente probioticos e bacterias comensais; bacterias patogenicas atenuadas; e bacterias patogenicas inativadas (opcionalmente, tambem previamente atenuadas).
0 veiculo tolerogenico pode ser recombinante ou nao.
"Bacterias nao patogenicas" para ser usadas como veiculo tolerogenicos no contexto da presente invenqao geralmente nao induzem qualquer patologia em humanos. Essa e a razao porque elas sao Geralmente Reconhecidas como Seguras (GRAS). E claro, tais bacterias devem ser administraveis a humanas.
Bacterias nao patogenicas preferidas para serem usadas como veiculos tolerogenicos sao bacterias comensais. Tais bacterias sao bem conhecidas do versado na tecnica. Exemplos nao limitantes incluem Bacillus sp. (por exemplo, B. coagulans), Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium brevis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, e similares.
Uma "bacteria comensal" para uso como urn veiculo tolerogenico no contexto da presente invenqao e vantajosamente uma bacteria de acido lactico ou uma bifidobacteria que e mais particularmente selecionada na lista acima, incluindo tambem combinapoes destas. Uma bacteria comensal preferida e Lactobacillus sp., e mais preferivelmente Lactobacillus plantarum. Os Exemplos reportados abaixo mostram para a primeira vez que Lactobacillus plantarum e urn veiculo tolerogenico, conduzindo a imunotolerancia viral quando administrada junto com urn antigeno como definido acima.
Vantajosamente, uma combinaqao de bacterias nao patogenicas, tais como duas ou mais bacterias comensais, pode ser usada como o veiculo tolerogenico.
Como usado aqui, os termos "bacterias patogenicas" referem-se as bacterias induzindo patologias em humanos. Tais bacterias sao bem conhecidas do versado e incluem especie de Listeria inter alia (por exemplo, Monocitogenes Listeria), especie de Corynebacterium, especie de Mycobacterium, especie de Rhococcus, especie de Eubacteria, especie de Bortadella e especie de Nocardia. Preferivelmente, uma bacteria patogenica e selecionada dentre especie de Mycobacterium, e e mais preferivelmente Mycobacterium bovis.
Como usado aqui, "bacterias patogenicas atenuadas" sao bacterias patogenicas que sao menos virulentas comparadas a seu tipo selvagem correlative porque de uma ou varias mutaqoes ou de urn ou mais tratamentos de atenuaqao (por exemplo, tratamento quimico e/ou passagens sucessivas em meios especificos). Tais bacterias patogenicas atenuadas sao bem conhecidas de um versado na tecnica. Exemplos nao limitantes de bacterias patogenicas atenuadas incluem atenuadas Salmonella typhimurium e Mycobacteria com uma preferencia para Mycobacteria atenuada. Como um exemplo de Mycobacteria atenuada, pode-se citar o "Bacille de Calmette Guerin", tambem conhecido como "BCG", e, mais especialmente, dentre outros, as seis cepas de BCG amplamente usadas - o BCG de cepa evolucionariamente precoce japones, as duas cepas evolucionariamente tardias em grupo III DU2 (BCG Danish e Glaxo) , e as tres cepas evolucionariamente tardias em grupo IV DU2 (BCG Connaught, Pasteur, e Tice). Como outro exemplo de Mycobacteria atenuada, pode-se tambem citar BCG recombinante tai como a cepa rBCG30 descrita em HOFT er a/. (2008), o BCG recombinante descrito em WANG et al (20 08) , e tambem o BCG recombinante descrito em pedidos de patentes internacionais WO 2005/11 1205 e WO 02/102409, e descritos em patentes US 7.122.195 e US 6.261.568.
Vantajosamente, em vez de ou adicionalmente a ser atenuadas, as bacterias patogenicas podem ser inativadas para serem usadas como veiculos tolerogenicos no contexto da presente invenqao, mas bacterias patogenicas atenuadas podem tambem ser usadas apos terem sido inativadas.
"Bacterias patogenicas inativadas" sao bem conhecidas de um versado na tecnica. Metodos de preparaqao de tais bacterias patogenicas inativadas formam parte do conhecimento geral comum na tecnica. Como um exemplo de tais metodos, pode-se citara lise mediada por fago, inativaqao quimica tai como tratamento com formalina (ver US 7.393.541), inativaqao termica, inativaqao fisica tai como liofilizaqao (por exemplo, secagem em baixa temperatura estendida) ou U.V ou irradiaqao gama (ver WO 2008/128065) ou exposiqao a microondas, e combinaqoes dos mesmos.
Preferivelmente, referido veiculo tolerogenico e um derivado atenuado de bacterias patogenicas como BCG. Os exemplos reportados abaixo mostram pela primeira vez que BCG e um veiculo tolerogenico, conduzindo a uma imunotolerancia viral quando administrado junto com um antigeno como definido acima.
Quando recombinante, o veiculo tolerogenico de acordo com a presente invenqao nao expressa qualquer proteina ou peptideo ou epitopo de HIV.
Preferivelmente, pelo menos uma quantidade significante das bacterias vivas usadas como um veiculo tolerogenico esta na fase semi-logaritmica. mais preferivelmente, pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mesmo cerca de 100% do numero total de celulas bacterianas esta na fase semi- logaritmica.
Uma quantidade efetiva para um veiculo tolerogenico pode ser facilmente determinada pelo versado e Exemplos de tai quantidade efetiva sao descritos a seguir.
Como um exemplo, uma quantidade de referida bacteria na composigao farmaceutica da presente invengao e de cerca de 104 a cerca de 1014 CFU por ml de referida mistura.
A composigao farmaceutica
A referida composigao e tambem referida aqui como uma "composigao tolerogenica" ou uma "composigao toleroimunogenica", esses termos sendo equivalentes.
O veiculo tolerogenico e o antigeno contendo, ou derivado de, Gag e/ou Pol de um virus HIV sao dois componentes separados e distintos que estao contidos como uma mistura na composigao farmaceutica da presente invengao. Isso significa que referido veiculo tolerogenico e referido antigeno estao presentes como componentes distintos em referida composigao.
Vantajosamente, a composigao farmaceutica da invengao nao compreende qualquer oligonucleotideo (por exemplo, CpG ou dsRNA) como ajudante.
Uma vez que o veiculo tolerogenico e uma bacteria, uma bacteria do mesmo genero e/ou especie pode ser separadamente usada sob uma forma recombinante como uma fonte de antigeno. Por exemplo, a bacteria recombinante contera urn acido nucleico codificando o antigeno colocado sob o controle de apropriadas sequencias regulatorias (incluindo promotores induziveis ou constitutivos), quer em urn vetor de acido nucleico contido na celula ou como uma sequencia de acido nucleico integrada no cromossoma bacteriano. Por meio disso, a bacteria recombinante sera apta a expressar ou produzir referido antigeno. Deste modo, de acordo com uma particular forma de realizaqao, a composiqao farmaceutica da presente invenqao incorpora urn veiculo tolerogenico que e uma bacteria e urn antigeno que e urn ou mais proteinas virais ou peptideos ou epitopos contendo ou derivado de Gag e/ou Pol de HIV, e que foi separadamente produzido por uma bacteria recombinante pertencendo ao mesmo genero e/ou espécie como o veiculo tolerogenico.
Em uma composiqao farmaceutica de acordo com a presente invenqao, quando referido antigeno e urn antigeno particulado e mais especificamente uma particula de virus, a razao na referida mistura de referida particula de virus (expressada em partículas por ml de referida mistura) a referida bactéria (expressada em CFU por ml de referida mistura) é de cerca de 1:10 a cerca de 1 1000, preferivelmente de cerca de 1 :25 a cerca. de 1 :750, ainda preferivelmente de cerca de 1:50 a cerca de 1 :500, ainda preferivelmente de cerca de 1:75 a cerca de 1:250, e ainda mais preferivelmente cerc~ de 1:100.
Administrar a composigao farmaceutica da invencao
Pode ser possivel administrar o veiculo tolerogenico e o antigeno quer simultaneamente, ou separadamente, ou 10 sequencialmente.
E deste mode urn objeto da presente invengao prover urn kit farmaceutico para prevenir e/ou tratar uma doenga provocada por HIV em urn humano em necessidade do mesmo, compreendendo: em urn primeiro recipiente, um antigeno como definido acima; e em um segundo recipiente, uma bacteria viva nao patogenica como definido acima, em que referido antigeno e referida bacteria estao em carreadores farmaceuticamente aceitaveis para administragao mucosal ou intradermica ou intraepitelial.
E tambem um objeto da presente invengao prover produtos contendo: uma bacteria viva nao patogenica como um veiculo tolerogenico como definido acima; e um antigeno particulado ou um antigeno tendo um ou mais epitopos provenientes de proteinas Gag e/ou Pol de HIV como definido acima, como uma composição farmaceutica combinada para uso simultaneo, separado ou sequencial para prevenir e/ou tratar uma doença de HIV em um humano em necessidade do mesmo. Referida prevenqao e/ou tratamento e (sao) conseguido(s) atraves de administrar mucosalmente ou intradermicamente ou intraepitelialmente referida composipao farmaceutica combinada ao referido humano. Para fazer assim, pode ser possivel administrar o veiculo tolerogenico e o antigeno quer simultaneamente, ou separadamente, ou sequencialmente.
Como um exemplo, a bacteria viva nao patogenica pode ser administrada oralmente (por exemplo, como um farmaco oral ou um suplemento alimentar), considerando que o antigeno e administrado mucosalmente, ou intradermicamente ou intraepitelialmente.
E claro, apropriados veiculos farmacêuticos podem ser usados a firn de assegurar uma liberapao adequada de cada ao sitio esperado (por exemplo, uma superficie mucosal). O tempo e dose para administrar cada do veiculo tolerogenico e o antigeno serao facilmente adaptados pelo versado.
Preferivelmente, a composipao farmaceutica de acordo com a presente invenpao e uma composipao farmaceutica mucosal ou intradermica ou intraepitelial. Ainda preferivelmente, e uma composipao farmaceutica oral.
Como usado aqui, uma "composipao farmaceutica mucosal ou intradermica ou intraepitelial" e uma composipao farmaceutica para administrapao mucosal ou intradermica ou intraepiteliana, que significa que esta formulada para tai administrapao.
Em particular, a composipao farmaceutica pode ainda compreender urn ou mais veiculos farmaceuticos apropriados (ou suportes) para liberapao mucosal ou intradermica ou intraepitelial de referido antigeno e de referida bacteria.
Preferivelmente, uma "liberapao mucosal" e aqui selecionada dentre as liberapoes nasal, oral, sub-lingual, traqueal, faringeana, bronquiana, esofageana, gdstrica, duodenal, intestinal, retal, prepucio e vaginal. A "liberapao mucosal" e uma liberapao a uma superficie mucosal, tai como nasal, oral, sub-lingual, traqueal, bronquiana, faringeana, esofageana, gastrica, e mucosal do duodeno, intestines grosso e delgado, incluindo o reto, bem como de mucosas do prepucio e vaginal. No presente contexto, a superficie mucosal tambem inclui a superficie
externa do olho, isto e, a mucosa de e envolvendo o olho. Ainda preferivelmente, a superficie mucosal refere-se a cosa vaginal e digestiva, e mais preferivelmente a mucosa digestiva. Ainda preferivelmente, a liberapao mucosal e uma liberapao oral.
Deste modo, a composipao farmaceutica pode tambem compreender urn ou mais veiculos farmaceuticos dependendo da via de administrapao. Os versados na tecnica farmaceutica sao familiares com, ou podem prontamente averiguar veiculos para liberapao de farmaco para uma superficie mucosal ou para uma liberapao intradermica ou intraepitelial. Referencias uteis nesta considerapao sao Chien (Novel deliver of drug system, caps. 3 a 6 e 9, Marcel Dekker, 1992), Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6a. Ed. (various editors, 1989-1998, Marcel Dekker); e Pharmaceutical Dosage Forms and drug delivery Systems (ANSEL et a/., 1 994, WI LLIAMS & WILKINS).
Metodos exemplares de vias para liberapao de farmaco utilizaveis na invenpao sao brevemente descritos abaixo.
Administrapao a mucosa bronquiana, bronquiolar, traqueal, nasal, oral, de prepucio ou de faringe pode ser obtida formulando a composipao farmaceutica como inalavel, pulverizdvel e similares (por exemplo, pulverizapao nasal, pulverizapao de aerossol ou pulverizapao de bomba e similares), solupao, gel, etc. Dispositivos nebulizadores adequacies para liberaqao de composiqoes f armaceuticas a mucosa nasal, de traqueias e de bronquios sao bem conhecidas na tecnica e, portanto nao serao descritas em detalhes aqui. A composiqao farmaceutica pode entao compreender um veiculo selecionado no grupo compreendendo soluqoes, emulsoes, microemulsoes, emulsoes oleo em agua, lipidios anidros e emulsoes oleo em agua, outros tipos de emulsoes.
Administraqao a mucosa vaginal pode ser obtida formulando a composiqao farmaceutica como soluqao, enema, espuma, supositorio, comprimido vaginal ou gel topico. Veiculos preferidos para liberaqao vaginal incluem veiculos hidrofilicos e hidrofobicos tai como aqueles comumente usados em formular emulsao ou preparaqoes de gel (por exemplo, emulsao gel oleo/agua).
Administraqao a mucosa de trato digestive pode ser obtida formulando a composiqao farmaceutica como capsula, microcapsula. Veiculos preferidos para liberaqao digestiva correspondem a capsulas e microcapsulas (por exemplo, capsulas e microcapsulas de pectina e/ou alginato) geralmente dadas pelos tais como aquelas comumente usadas em formulaqao de preparaqoes para liberaqao digestiva (por exemplo, as microcapsulas descritas em pedido de patente internacional WO 2007/140613). Alternativamente, liberaqao digestiva pode ser obtida consumindo ou administrando liquidos e/ou alimentos apropriados, tais como bebidas, iogurtes, e similares.
Administraqao intradermica ou intraepiteliana e bem conhecida do versado na tecnica. Administrate intradermica (por exemplo, injeqao) pode, por exemplo, ser feita com dispositivos de agulha tai como aqueles descritos em patente US 6.933.319 e em pedido de patente internacional WO 2004/1025, ou com apropriados dispositivos sem agulha.
A composiqao farmaceutica pode ainda compreender pelo menos um agente de absorqao. "Agentes de absorqao" sao bem conhecidos de um versado na tecnica. Como exemplos, podem- se citar tensoativos, tai como derivados de polioxietileno de esteres parciais de acido graxo de anidridos de sorbitol (por exemplo, Tween® 80, Polioxyl 40 Estearato, Polioxietileno 50 Estearato, polioxietileno-9-lauril eter e Octoxinol), sais biliares tais como glicocolato de sodio, micelas mistas, enaminas, doadores de oxido nitrico (por exemplo, S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina, NORI, NOR4 que sao preferivelmente co-administrados com um sequestrador de NO tai como carboxi-PITO ou doclofenaco sodico), salicilato de sodio, glicerol Sster de dcido acetoacetico (por exemplo, gliceril-1,3-diacetoacetato ou 1,2-isopropilidenoglicerina-3- acetoacetato), ciclodextrina ou derivados de beta-ciclodextrina (por exemplo, 2- hidroxipropil-beta-ciclodextrina e heptaquis (2,6-di-0- metil-beta-ciclodextrina)), acido graxo de cadeia media tai como mono- e diglicerideos (por exemplo, extratos de caprato de sodio de oleo de coco, Capmul) , ou triglicerideos (por exemplo, amilodextrina, Estaram 299, Miglyol 810), polimeros tai como carboximetilcelulose, carbopol, policarbofil, tragacanto e alginato de sodio, e outros agentes de absorqao adaptadas para liberaqao mucosal ou intradermica ou intraepitelial. Para uma referenda com respeito a principles gerais com relaqao a agentes de absorqao, que foram usados com sucesso em liberaqao mucosal ou intradermica ou intraepitelial de farmacos, ver Chien, Novel Drug delivery Systems, Ch. 4 (Marcel Dekker, 1992) .
A composiqao farmaceutica pode ainda compreender urn ou mais aditivos (por exemplo, diluentes, excipientes, estabilizadores, preservatives, e similares). Ver, geralmente, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6a. Ed. (various editors, 1989-1998, Marcel Dekker); and Pharmaceutical Dosage Forms e Drug delivery Systems (ANSEL et al., 1994, WILLIAMS & WILKINS).
Como discutido abaixo, dosagens apropriadas da composiqao farmaceutica de acordo com a presente invenção a serem administradas a um individuo humano podem ser determinadas dependendo de uma ou mais caracteristicas de referido individuo tai como sexo, idade, peso, saude, etc.
Como um exemplo, quando o antigeno e particulado e, mais especificamente, quando e uma particula de virus, uma dose de cerca de 108 a cerca de 1014 particulas de virus por dia pode ser administrada ao referido humane. Como outro exemplo, uma dose de bacteria viva nao patogenica de cerca de 106 a cerca de 1016 CFU por dia pode ser administrada ao referido humano.
Aplicacoes da composicao farmaceutica da invencao
E um objeto da presente invengao prover uma composigao farmaceutica como descrito acima, para uso como um medicamento, preferivelmente como uma vacina.
A presente invengao tambem se refere a um metodo para prevenir e/ou tratar uma doenga provocada por HIV em um humano em necessidade do mesmo, compreendendo pelo menos a etapa de mucosalmente ou intradermicamente ou intraepitelialmente administrar uma quantidade efetiva de uma composigao farmaceutica como definido acima ao referido humano.
De acordo com a presente invengao, para propositos preventives, um "humano em necessidade disto" pode ser qualquer humano, preferivelmente tendo pelo menos cerca de 2 anos de idade. Para propositos terapeuticos, um "humano em necessidade disto e um humano a ser tratado porque ele/ela esta sofrendo de uma doenqa de HIV.
Uma "doenqa de HIV" refere-se a qualquer disturbio imune relacionado a HIV, incluindo AIDS bem como estagios mais iniciais de progressao de doenqa, incluindo soroconversao (estabelecimento de infecqao cronica).
A presente invenqao ainda refere-se a um metodo para proteger um humano contra HIV, compreendendo pelo menos a etapa de mucosalmente ou intradermicamente ou intraepitelialmente administrar uma quantidade efetiva de uma composiqao farmaceutica como definida acima ao referido humano.
Em particular, tai metodo possibilita proteger um humano de uma infecqao de HIV se mucosalmente exposto a HIV e/ou de replicaqao de HIV se intravenosamente exposto a HIV.
A presente invenqao ainda refere-se a um metodo para proteger um humano de soroconversao de HIV, compreendendo pelo menos a etapa de mucosalmente ou intradermicamente ou intraepitelialmente administrar uma quantidade efetiva de uma composicjao farmaceutica como definido acima ao referido humano. Por meio disso, referido humano nao se tornara soropositivo e nao exibira um significante nivel de anticorpos de HIV.
O termo "vacinaqao" refere-se a aqao(oes) (especialmente, administrar a composiqao farmaceutica da presente invenqao) que e (sao) tomada(s) para prevenir e/ou tratar uma doenqa provocada por HIV em um humano. Preferivelmente, a composiqao farmaceutica da invenqao e util para induzir e, preferivelmente, manter imunotolerancia a um antigeno contend©, ou derivado de, Gag e/ou Pol de um virus HIV em um humano que e para dizer, em outras palavras, para vacinar (ou "tolerizar") referido humano. Deste modo, vacinar um humano usando o farmaco da presente invenqao e considerado como uma "vacinaqao tolerogenica" (ou uma "tolerizaqao" ou a "tolerisaqao").
Se, apos a administraqao mucosal ou a intradermica ou a intraepitelial da composiqao farmaceutica da invenqao (isto e, apos vacinaqao tolerogenica) , a imunotolerancia e induzida com sucesso em um humano, referido humano e considerado como sendo "vacinado" (ou 11 tolerizado" ou "tolerante") . A resposta, isto e, a replicaqao viral como avaliada pela carga de RNA de plasma viral de um humano "vacinado" a um desafio infeccioso viral in vivo e reduzida por pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 70%, ainda mais pref erivelmente por pelo menos cerca de 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 98% ou 99%, ou ainda mais (99,5%, 99,8%, 99,9%, 100%), relative a carga de RNA de plasma viral de um humane de controle a quer o antigeno sozinho ou o antigeno associado com um adjuvante padrao (como definido acima) ou a composite farmaceutica ou um placebo, foi administrada.
De acordo com a presente invenqao, uma vacinacjao tolerogenica pode compreender uma ou varias administrates consecutivas da composiqao farmaceutica. Preferivelmente, a vacinaqao tolerogenica pode compreender pelo menos duas ou mais administrates consecutivas (isto e, vacinaqoes), e mais preferivelmente mais do que duas administrates consecutivas de referida composiqao.
Vantajosamente, o intervalo entre vacinaqoes tolerogenicas consecutivas e compreendido entre 1 minuto e 3 meses, preferivelmente entre 15 minutos e 2 meses.
Ainda vantajosamente, as vacinaqoes tolerogenicas da invent0 podem tambem incluir vacinaqoes tolerogenicas de revocaqao um ou varies anos apos a primeira vacinaqao tolerogenica mucosal ou intradermica ou intraepitelial (por exemplo, 1 a 10 anos).
As novas vacinaqoes tolerogenicas apds a primeira vacinaqao tolerogenica mucosal ou intradermica ou intraepitelial podem ser selecionadas dentre vacinaqces tolerogenicas mucosais ou intradermicas ou intraepiteliais.
Perceptivelmente, se as novas vacinaqoes tolerogenicas sao injeqoes intraepiteliais ou intradermicas, entao uma resposta (de produ^ao de interferon gama) humoral e/ou uma citotoxica sistemica especifica pode ser detectavel, mas tendo nenhum papel na prevenqao ou tratamento da doenca.
De acordo com a presente invenqao, uma quantidade efetiva da composição farmaceutica e administrada a um humano em necessidade disto. Os termos "quantidade efetiva" significam uma quantidade suficiente para conseguir o efeito biologico desejado, que e aqui um efeito curative ou protetor (em outras palavras, um efeito imunoprotetor) ate induqao de uma imunotolerancia, preferivelmente uma imunotolerancia "Ts". E entendido que a dosagem efetiva sera dependente da idade, sexo, saude, e peso do individuo a ser tratado, o tipo de tratamento concorrente, se qualquer, a frequencia de tratamento, e a natureza do efeito esperado. As faixas de doses efetivas providas abaixo nao sao pretendidas para limitar a invenqao e representar faixas de dose preferidas. Entretanto, a dosagem preferida pode ser adaptada ao individuo, como e entendido e determinavel pelo versado na tecnica, sem experimentaqao indevida. Ver, por exemplo, Ebadi, Pharmacology, Little, Brown e Co., Boston, Mass. (1985).
Por exemplo, com relaqao a HIV, uma dosagem tipica para um adulto humano sera de cerca de 106 - 1012 particulas de virus HIV (isto e, VLP, recombinants ou particulas de virus nao recombinante) por dose, com 108 - 1010 preferido. E claro, qualquer que seja dosagem usada, deve ser uma quantidade segura e efetiva como determinado por metodos conhecidos, como tambem descritos aqui.
Ademais, o versado na tecnica pode tambem determinar na luz de seu conhecimento geral a quantidade efetiva de veiculo tolerogenico a ser administrada a um humano a firn de alcanqar o efeito biologico desejado.
Como um exemplo, referida quantidade efetiva para derivado atenuado de bacterias patogenicas (por exemplo, BCG) esta compreendida na faixa de 104 a 1012, pref erivelmente 105 a 1010 CFU (unidade de formaqao de colonia) , e mais preferivelmente 106 a 108 CFU por dose. Como outro exemplo, referida quantidade efetiva para derivado atenuado de bacterias patogenicas ou bacterias patogenicas inativadas (por exemplo, BCG) esta compreendida na faixa de 0,001 mg a 1 g, preferivelmente 0,01 a 100 mg, e mais preferivelmente 0,1 a 10 mg por dose.
Como outro exemplo, referida quantidade efetiva para bacterias nao patogenicas (por exemplo, Lactobacillus sp.) esta compreendida na faixa de cerca de 106-1014 CFU, e mais preferivelmente cerca de 1010- 1012 CFU por dose.
Como descrito acima, as composiqoes farmaceuticas da presente invenqao sao adequadas para prevenir uma futura doenqa de HIV em um humane, ou para tratar um humane ainda sofrendo de uma doenqa de HIV.
Para fins terapeuticos, "o antigeno contendo, ou derivado de, Gag e/ou Pol de um virus HIV" como definido acima, pode ser autologo, isto e, pode ser derivado do virus HIV infectando o humano a ser tratado. Em tai caso, por exemplo, o virus HIV pode ser isolado do humano, entao pode ser cultivado e inativado (preferivelmente pelo menos inativado duas vezes), para ser finalmente associado com um veiculo tolerogenico de modo a obter uma composiqao farmaceutica como descrito acima.
Ainda por exemplo, a composiqao farmaceutica compreendendo um antigeno autologo ou nao autologo contendo ou derivado de HIV Gag e/ou Pol pode ser administrado ao humano durante um tratamento antiviral convencional que teria primeiro deixado a uma carga viral indetectavel. O tratamento antiviral convencional pode entao ser parado apos uma ou mais vacinaqoes tolerogenicas usando a composiqao farmaceutica, desde que uma apropriada supressao viral de replicaqao ex vivo de celulas CD4 infectadas agudamente nao autologas seja alcanqada por celulas de CD8 especificas de virus autologo, ou desde que apropriada supressao de ativaqiao de celulas T CD4 induzida por celulas T CD8 seja alcanqada.
Em particular, para fins terapeuticos, a composiqao farmaceutica pode ser administrada uma vez apenas durante a vida do humano a ser tratado. Alternativamente, pode ser administrada duas ou mais vezes durante a vida do humano a ser tratado, no mesmo dia ou em diferentes dias separados por urn periodo variando, por exemplo, de cerca de 1 dia a cerca de 1 ano, ou mais. Mais particularmente, ela pode ser administrada todos os dias ou periodicamente, por periodos variando, por exemplo, de cerca de 1 dia a cerca de 1 ano, ou mais. Se necessario, a composição farmaceutica pode ser administrada ao longo de toda a vida do humano a ser tratado.
A presente invenqao ainda prove urn metodo in vitro para determinar se um humano esta protegido contra urn virus HIV, compreendendo: isolar celulas T CD8 de sangue periferico de uma amostra de sangue de referido humano vacinado; cultivar sob condiq:oes apropriadas: (i) referidas celulas T CD8 isoladas com celulas T CD4+ alogenicas ou autologas que foram infectadas agudamente in vitro por uma cepa viral equivalence ao referido virus HIV; e (ii) referidas celulas T CD4+ alogenicas ou autologas infectadas agudamente in vitro; a) recuperar os sobrenadantes de cultura; b) media a carga viral era referidos sobrenadantes; e c) determinar se referido humano esta protegido contra referido virus HIV, ou nao.
Por "uma cepa viral equivalente a um virus HIV a ser testado", e significado que referida cepa viral origina-se de um virus selvagem e tern caracteristicas essenciais similares aquelas do virus HIV a ser testado (por exemplo, pode-se citar a cepa viral HTLVI I IB originando-se de um HIV-1 individual: HTLVIIIB pode ser considerado como "uma cepa viral equivalente a HIV-1 ). Preferivelmente, referida cepa viral se originara de um virus selvagem que e o virus HIV a ser testado. Referida cepa viral deste modo representa um modelo apropriado para estudos envolvendo um virus HIV, especialmente um virus selvagem HIV. A cepa viral e claro bem adaptada para tais estudos, especialmente em termos de seguranqa.
Todas as etapas acima podem ser efetuadas usando tecnicas padrao que sao bem conhecidas da pessoa versada na tecnica. Em particular, as condiqoes de cultura apropriadas para etapa b) fazem parte do conhecimento geral no campo da invenqao (tai como os metodos convencionais descritos nos Exemplos abaixo).
A carga viral pode ser medida em etapa d) por metodos convencionais tais como aqueles descritos nos Exemplos abaixo.
A carga viral no sobrenadante recuperado da cultura de referida celulas T CD4+ alogenicas ou autologas infectadas agudamente in vitro de acordo com sub-etapa b) (ii) sera usada como uma referenda para a determinaqao em etapa e) . Vantajosamente calcula-se a "supressao percentual (%) " ou "razao supressiva" ou "efeito antiviral", por exemplo, comparando a media geometrica de concentraqao viral nos sobrenadantes em cavidades em duplicate (ou triplicate ou quadruplicate ou mais) contendo apenas celulas das celulas T CD4 + alogenicas ou autologas infectadas agudamente in vitro com a media geometrica de concentraqao viral nos sobrenadantes de cavidades em duplicata (ou triplicata ou quadruplicata ou mais) contendo celulas T CD8, e celulas das celulas T CD4+ alogenicas ou autologas infectadas agudamente in vitro.
Entao, referida determinaqao em etapa e) e preferivelmente efetuada como segue: - Se a razao supressiva e maior que cerca de 100, pode-se concluir que referido humano esta protegido. Tipicamente, esse sera o caso se urn humano nao infectado preventive eficiente ou se um humane infectado per HIV for administrado com um tratamento terapeutico eficiente, referido tratamento preventive ou terapeutico eficiente compreendendo preferivelmente uma composiqao farmaceutica de acordo com a presente invenqao, e deste modo nao sera necessario ainda administrar qualquer tratamento preventive ou terapeutico ao por HIV foi administrado com tratamento antiviral humano, tao longo quanto permanece protegido.- Se a razao supressiva for menor do que cerca de 100, pode-se concluir que referido humano nao esta protegido contra referido virus. Entao, o humano, quer um humano nao infectado por HIV ou um humano infectado por HIV, vantajosamente sera administrado a tratamento preventive ou terapeutico compreendendo uma composiqao farmaceutica de acordo com a presente invenqao, respectivamente, e o metodo in vitro acima sera efetuado uma vez ou mais em intervales de tempo apropriados para assegurar ao humano tornar-se protegido.
Tambem, a presente invenqao prove um kit para determinar in vitro se um humano esta protegido contra um virus HIV, compreendendo celulas T CD4+ alogenicas ou autologas que podem ser infectadas por uma cepa viral, referida cepa viral sendo, como definido acima, equivalente a referido virus HIV a ser testado. O kit pode tambem incluir uma adequada cepa viral em concentraqao apropriada para infetar as celulas T CD4+ alogenicas ou autologa mencionadas acima e/ou reagentes apropriados e/ou controles e/ou meios (tais como meios para colocaqao em suspensao celular, cultura celular, armazenamento celular, etc.). O kit da presente invenqao pode ser especifico a um particular tipo de virus HIV, ou pode ser adaptado a varies tipos de virus, referidos tipos de virus sendo proximos (em particular, filogeneticamente proximos).
A presente invenqao pode facilmente ser adaptada a firn de ser usada para prevenir e/ou tratar quaisquer doenqas infecciosas cronicas. Exemplos nao limitantes de tais doenqas sao: hepatite B e C, virus papiloma humano (HPV), EBV e outros virus de herpes, tuberculose, lepra, leishmaniose, etc.
Globalmente, cada vez onde um ou vdrios antigenos patogenicos associados com as infecqoes ou doenqas mencionadas acima estao envolvidos na ativa<?ao especifica de celulas T CD4 + que apresenta epitopos derivados de proteinas ou peptideos patogenicos mencionados acima, a supressao/prevenqao especifica de ativaqao de celula T CD4+ pode ser criada por celulas T CD8+ nao citotoxicas geradas por composicjoes f armaceuticas mucosais ou intraepiteliais ou intrad^rmicas associando o antigeno mencionado acima(s) e um veiculo tolerogenico como descrito aqui.
E aqui mostrado que infecqoes virais e doenqas associadas podem ser prevenidas e/ou tratadas em mamiferos/humanos usando composiqoes farmaceuticas da presente invenqao. Baseado nesse ensinamento, e possivel fornecer outras composiqoes farmaceuticas compreendendo (i) veiculos tolerogenicos como descritos aqui; e (ii) quaisquer antigenos de origem viral, bacteriana, de fungo, de protozodrio ou de parasita. Tais composiqoes farmaceuticas sao formuladas para liberaqao apropriada (preferivelmente, mucosal ou intradermica ou intraepitelial) de referidos veiculos tolerogenicos e de referido antigenos. Elas sao uteis para prevenir e/ou tratar infecqoes cronicas em mamiferos causadas pelo virus, bacterias, fungos, protozoarios ou parasitas dos quais os antigenos sao derivados. Um exemplo e uma composiqao farmaceutica bacteriana compreendendo (i) um veiculo tolerogenico como descrito aqui; e (ii) um antigeno derivado de Mycobacteria tuberculosis. Essa composiqao farmaceutica bacteriana e formulada para liberaqao apropriada tpreferivelmente, mucosal ou intradermica ou intraepitelial) de referido antigeno e de referido veiculo tolerogenico. De particular interesse para prevenir e/ou tratar tuberculose em humanos e tai composiqao farmaceutica bacteriana em que o antigeno micobacteriano e derivado do Bacilo de Koch.
A protegao imune alcangada pela composigao farmaceutica da invengao.
Tolerancia e a capacidade fisiologica do sistema imune de reconhecer antigenos tornados atrav^s do sistema mucosal e para desenvolver anergia geralmente associada com outras modificagoes imunologicas para urn encontro subsequente com os mesmos antigenos. Tolerancia foi frequentemente mostrada para elicitar slgA mucosal permitindo contengao de anticorpo de antigenos mucosais sem estimular o compartimento imune sistemico. TGF-beta, uma citocina regulatoria foi tambem alguma vez envolvida no desenvolvimento de tolerancia. A supressao ativa por celulas T regulatorias CD25+ foi tambem frequentemente sugerida como urn mecanismo potencial de tolerancia mucosal (Faria e Weiner, 2005; Mestecky et al., 2007). Entretanto, nenhuma dessas modificagoes imunologicas foi observada na imunotolerancia induzida por composigao farmaceutica descrita na presente invengao, que e principalmente caracterizada pela atividade de celulas T CD8+ que suprime a ativagao de cdlulas T CD4+ apresentando antigeno de epitopo de virus, urn tipo de reagao imune ate agora nao reconhecido e, mais especificamente, urn tipo completamente novo de tolerancia imune.
As expressoes "tolerancia", "tolerancia imunologica", "imunotolerancia", "imunotolerancia a urn virus", "novo tipo de tolerancia especifica de virus", "imunotolerancia a antigenos virais", "imunotolerancia a imunogenes virais", e "imunotolerancia "Ts"" sao sinonimos. Isso foi mostrado pelos inventores para corresponder em macacos a uma resposta de celulas T CD8+ forte ativamente induzida nao citotoxica restrita ao MHC-Ib/E suprimindo a ativapao de celulas T CD4 + precoce de apresentapao ao antigeno Gag e/ou Pol de HIV associado com uma ausencia de proliferapao de celulas T CD4+, junto com uma ausencia de secrepao de interferon gama por celulas T CD8+ em estimulo de antigeno de SIV inativado e uma ausencia de produpao de anticorpos de IgM e IgG anti-SIV sistemicos. Tambem, os inventores poderiam demonstrar que TCRDD e \/(38 nao foram envolvidos em supressao de celulas T CD8+ de replicapao viral, sugerindo que TCR p deve desempenhar um papel central no reconhecimento de apresentapao ao MHC-Ib/E-peptideo em celulas T CD4+ infectadas.
Uma "resposta imune comum a um antigeno derivado de um virus" pode ser observada inter alia em vacinapao com uma composipao de vacina preventiva convencional compreendendo um antigeno contend©, ou derivado de, Gag e/ou Pol de um virus HIV e um adjuvants padrao ou convencional (isto e, qualquer forma de adjuvante fisico, quimico ou biologico objetivado em estimular e/ou facilitar e/ou aumentar a resposta imune associada com o antigeno, tai como as descritas no capitulo intitulado "Adjuvants" em "Vaccines" por S. Plotkin et al) . Tai "resposta imune comum a um antigeno derivado de um virus" envolve respostas imunes humorais, celulares, ou ambas, humoral e celular, e e convencionalmente caracterizada por: (i) a proliferaqao de celulas CD4 especificas de virus em estimulo especifico in vitro; e/ou (ii) a induqao de uma resposta humoral sistemica especifica atraves da produqao de anticorpos sistemicos contra proteinas e/ou peptideos antigenicos virais; e/ou (iii) a induqao de uma resposta celular especifica associada com a producjao de interferon gama por celulas T CD8, e/ou (iv) a ausencia de resposta de celula T CD8+ nao citotoxica suprimindo a ativaqao de celulas T CD4+ de apresentaqao ao antigeno Gag e/ou Pol de HIV.
Por contraste, uma composiqao farmaceutica compreendendo um antigeno contend©, ou derivado de, Gag e/ou Pol de um virus HIV e um veiculo tolerogenico, como provide pela presente invenqao, gera uma "imunotolerancia a um virus" e, mais particularmente, uma "imunotolerdncia a "Ts"" que e caracterizada nos Exemplos abaixo com relaqao a SIV em macacos, por: (i) a ausencia de proliferaqao de celulas CD4 especificas de virus em estimulo especifico in vitro; e (ii) a ausencia de qualquer resposta humoral sistemica significante, isto e, ou nenhuma resposta de anticorpo sistemica detectavel especifica pode ser detectada por metodos de laboratorio clinicos classicos tais como ELISA, ou se anticorpos sistemicos sao detectados, eles nao sao protetores contra a infecqao por virus SIV; e (iii) a ausencia de qualquer resposta citotoxica de celulas T CD8+ associada com a produqao de interferon gama (por exemplo, detectavel por ELIspot) mediante estimulo adequado in vitro, ou se uma resposta de celula T CD8 citotoxica e detectada, ela nao e protetora contra infecqao por virus SIV; e (iv) como um aspecto essencial, a resposta de celulas T CD8+ nao citotoxica forte, ativamente induzida, nao restrita a MHC-Ib/E CD25 suprimindo a ativapao precoce de celulas T CD4+ de apresentapao ao antigeno de SIV.
Como mencionado acima, a composiqao farmaceutica da presente invenqao compreende um veiculo tolerogenico e um antigeno contendo, ou derivado de, Gag e/ou Pol de um virus HIV. Na verdade, um veiculo tolerogenico combinado ao antigeno viral induz um estado de imunotolerancia especifica de virus em um humane, ao inves de elicitar uma resposta imune comum, como definido acima. Deste modo, o antigeno administrado pela via mucosal ou a intradermica ou a intraepitelial, sozinho ou associado com um adjuvante padrao e geralmente capaz de elicitar uma resposta imune comum, exceto quando esta associado com um veiculo tolerogenico como na composiqao farmaceutica da presente invent^ao. Sob essas circunstancias especificas, a associaqao veiculo tolerogenico / antigeno na composiqao farmaceutica da presente invenqao induz uma imunotolerancia como definido acima. Isso significa que imunotolerancia pode apenas ser conseguida em administrar (pela via mucosal ou a intradermica ou a intraepitelial) uma apropriada mistura de um veiculo tolerogenico e um antigeno contendo, ou derivado de, Gag e/ou Pol de um virus HIV. Se tai e administrado a um humano na ausencia do outro, o humano nao estara "vacinado" ou "tolerizado".
Como mostrado nos exemplos abaixo (usando S IV no modelo de macaco), a imunotolerancia (tambem chamada imunotolerancia "Ts") induzida ou conseguida em administrar a composiqao farmaceutica de acordo com a presente invenqao e caracterizada por uma resposta de celulas T CD8+ (em particular, nao citotoxicas e/ou restritas ao MHC-Ib/E) que suprime a ativaqao (especialmente a ativaqao precoce) de celulas T CD4 + apresentando antigen© SIV Gag e/ou Pol; e vantajosamente por um ou mais de: 1 ) uma ausencia de proliferaqao de celulas T CD4+; 2) a ausencia de secreqao significance de interferon gama por celulas T CD8+ em estimulo de antigeno de SIV; e 3) a ausencia de produ^ao significance de anticorpos de IgM e IgG anti-SIV sistemicos.
Pelos termos "ausencia de secrecpao significance de interferon gama por celulas T CD8+ em estimulo de antigeno de HIV ou SIV", e significado aqui que o nivel de secreqao de interferon gama por celulas T CD8+ que e observado em estimulo de antigeno de HIV ou SIV e zero ou fraco. Uma "fraca" secrecjao de interferon gama por celulas T CD8+ em estimulo de antigeno de HIV ou SIV e tipicamente menor do que cerca de 80 SFCs por 2X105 PBMCs.
Pelos termos "falta de producjao significance de anticorpos IgM e IgG anti-HIV e anti-SIV sistematicos", e significado aqui que o nivel de produ<?ao de anticorpos IgM e IgG anti-HIV e anti-SIV sistematicos que e observado e zero ou baixo. Uma "baixa" produqao de anticorpos anti-HIV e anti-SIV sistematicos e tipicamente um titulo de anti-HIV ou anti-SIV de cerca de 300 ou menos.
Deste modo, a composipao farmaceutica de acordo com a presente invenqao induz e preferivelmente mantem uma proteqao imune especifica de antigeno contra HIV em urn humano, em que referida proteqao imune e preferivelmente caracterizada por: - a reduqao e preferivelmente a supressao de uma carga viral de HIV no referido humano comparada a apropriados controles experimentais; e/ou - celulas T CD8+ que suprimem a ativapao de celulas T CD4+ de apresentaqao ao antigeno Gag e/ou Pol de HIV no referido humano comparadas a apropriados controles experimentais.
Vantajosamente, referida proteqao imune e determinada no referido humano pela detecpao in vitro da presenqa ou da atividade de celulas T regulatorias de CD8+ provenientes de referido humano. Tai detecqao pode ser efetuada por tecnicas in vitro padrao, tai como aquelas descritas nos Exemplos abaixo.
Todas as patentes, pedidos de patente e publicaqoes referidos acima sao, assim, aqui incorporados por referenda.
EXEMPLOS PARTE A - MATERIALS E METODOS GERAIS
A-l Animais. Macacos rhesus Chineses criados em colonias (Macaca mulatta) foram alojados de acordo coni as regulagoes do National Institutes of Health 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals'. Todos os animais estavam em boa saude, com 2-4 anos de idade, pesando 4-6 kg e eram soronegativos para virus 1 linfotropico de celulas T simio SIV, SRV, virus de hepatite B, e virus B. Raio-x e teste de pele (PPD) foram efetuados em entrada para todos animais para excluir potenciais portadores de tuberculose.
A-II Tipificagao de classe I de MIIC. Alelos de classe I MHC classicos de macacos rhesus foram genotipados em amostras de celulas mononucleares de sangue periferico (PBMC) usando testes PCR de iniciadores especificcs de sequencia (SSP) para sequencias de Mamu-A e Mamu-B representativas como previamente descrito (Muhl et al., 2002; Loffredo et al., 2007).
A-III Preparagoes virais antigenicas.
III-l. A produgao de SIV foi efetuada em celulas CEM174 inoculadas com SIVmac239 (presente de P. A. Marx). Os sobrenadantes de cultura foram coletados em produgao viral de selegao com palito.
III-2. SIVmac239 inativado por AT-2-: SIVmac239 foi inativado por 250 pM aldritiol (AT-) (Sigma) por 2 horas e foi lavado tres vezes por ultracentrifugagao. O virus inativado AT-2 foi usado em uma dose final de 109particulas virais para cada administrapao (isto e, vacinapao).
III-3. SIVmac239 inativado por calor: SIVmac239 foi inativado a 56°C por 30 minutos. 0 virus inativado por calor foi usado em uma dose final de 109 particulas virais para cada administrapao.
III-4. SIVmac239 inativada por calor - AT-2: SIVmac239 foi inativado por 250 pM aldritiol (AT-2) (Sigma) por 2 horas e foi lavado tres vezes por ultracentrifugapSo. Entao, o virus foi submetido a uma temperatura de 56°C por 30 minutos. 0 virus inativado e usado em uma dose final de 109 particulas virais para cada administrapao.
III-5. As preparapoes de virus inativado foram inoculadas a celulas CEM174 para verificar a inibipSo de 100% de infectividade viral.
A-IV. Teste para respostas de anticorpo a SIV. Anticorpos anti-SIV IgG, IgM, e IgA em plasma foram titulados por urn teste de anticorpo de imunoflorescencia (IFA) (Mederle et al., 2003). Brevemente, diluipoes duas vezes seriais de plasma de teste foram incubadas com laminas fixadas a celulas CEM174 infectadas com SIV a 37°C durante 30 minutos. Apos lavagem com Hanks, IgG (Sigma) anti-macaco de alvo conjugado de FITC, IgM (ADI, San Antonio, Texas), ou IgA (ADI) foram adicionados adicionais 30 minutos (a 37°C). Titulos de anticorpo foram determinados como reciprocos da maior diluiqao para alcanpar uma colorapao de imunoflorescencia positive. A sensibilidade de teste IFA foi um titulo de 20 para IgG e um titulo de 5 para IgM e IgA. Quando uma amostra de plasma foi negativa para o IFA (abaixo da sensibilidade de teste), um valor de 1 foi designado para facilitar a analise de dados.
Secreqoes mucosais foram coletadas por lavagem do reto com PBS usando um cateter para instilaqao gastrica como descrito previamente (Tsai et al., 1993). Brevemente, inibidor de tripsina (10 g/ml) e EDTA (5 x 10-4 M) (Sigma) foram adicionados as amostras que foram entao centrifugadas por 10 minutos a 10000 x g a 4 °C. Sobrenadantes foram coletados e suplementados com flucreto de fenilmetilsulfonila (10-3 M) e azida sodica (0,01 %) (Sigma) . Amostras foram armazenadas a -80 °C ate uso. Titulos Anti-SIV IgA em reto foram detectados pelo teste IFA acima.
A-V. Citometria de fluxo. Analise de citometria de fluxo foi efetuada com FACScalibur (BD Biosciences, San Jose, California) usando anticorpos monoclonais rotulados em flubrescencia contra o seguinte: CD3-PE-Cy7 (clone SP34- 2), CD4-PE (clone MT477), CD8-PerCP (clone RPA-T8), e APC anti-camundongo de coelho secundario (BD Biosciences). 0 Ki-67-PE ( BD Biosciences) e anticorpo monoclonal anti-P27 conjugado a FITC (Fitzgerald, Concord, MA) ou anticorpo monoclonal anti-P27 conjugado a biotina (Fitzgerald) copulados com APC-SAv (BD Biosciences) foram usados para coloracjao intracelular apos permeabilizaqao.
Anticorpos monoclonais conjugados a PE contra TCRDD (clone Bl), Vp8 ,e antigenos CD (CD7, CD16, CD28, CD62L, CD95, CD122, CD137, CD150, CD183, CD184, CD195, CD196, CD 197, CD226, CD272, e CD305) foram comprados de BD Bicsciences; Anticorpos monoclonais conjugados a PE contra antigenos CD (CD11 a, CD25, CD27, CD39, CD101, CD129, CD215; CD277, e CD357) foram comprados de BioLegend (San Diego, CA, USA); e anticorpos monoclonais conjugados a PE contra antigenos CD (CD127, CD247, e CD279) foram comprados de eBioscience (San Diego, CA, USA).
A-VI. Proliferacao celular. PBMCs foram obtidos como descrito previamente (Lu et al. 2003). A proliferaqao de celulas T CD4+ ou CD8+ especificas de SIV foi avaliada por diacetato de carboxi-fluoresceina, teste de rotulaqao de succinimidil ester (CFSE) (Molecular Probes, Eugene, Oregon) de acordo com instruqao do fabricante. PBMC foram coloridos com 3 pM CFSE por 15 minutos a 37 °C. Apos lavagem, as celulas rotuladas de CFSE foram estimuladas por 5 dias com 10 pg/ml proteina P27 de nucleo de SIV recombinante (ImmunoDiagnostics, Wobun, MA) , 2 pg/ml peptideos gag de SIV com 15 meros (GLS, Shanghai, China), 109/ml SIV inativado por AT-2- ou meio sozinho. Apos rotulagao com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4 ou anti-CD8, PBMC foram fixados em 1 % paraformaldeido para citometria de fluxo.
A-VII. Ativagao celular. PBMCs frescos, depletados (ou nao) com CD8 ou CD25 por esferas magneticas foram infectadas em unica vez com SIVmac239 tratado com AT-2 por 2 horas em uma concentragao viral de 1010/ml. Celulas infectadas foram estimuladas durante a noite com enterotoxina B de estafilococo (2,5 pg/ml) e anticorpos anti-CD3 (2,5 g/ml)/anti-CD28 (2,5 Mg/ml). Coloragao intracelular de SIV P27 e Ki-67 foi efetuada 48 horas apos estimulo a firn de determinar a porcentagem de ativagao (Ki- 674-) dentro de celulas (P27-I-) CD44- infectadas.
A-VIII teste ELIspot. Os testes ELIspot de IFN-y e IL- 10 de macacos rhesusforam efetuados em PBMC nao cultivado na presenga ou na ausencia de SIV inativado por P27 ou AT- 2- usando urn kit comercial (Cell Sciences, Canton, MA). Um kit ELISPOT de TGF-bl foi comprado de R&D Systems (Minneapolis, MN) . Os dados foram lidos com urn leitor ELISPOT automatizado (AID, GmbH, Straberg, Alemanha). 0 numero de celulas de formaqao de pontos especificas de SIV (SFCs) foi calculado subtraindo os SPCs nao especificos na presence de meio sozinho.
A-IX. Teste antiviral. Celulas T CD4+ autologas de cada animal purificado por rotulaqao positiva magnetica (MicroBeads, Miltenyi Biotec) foram infectadas agudamente com SIVmac239 (10~3MOI) na presenqa ou na ausencia de celulas T CD8+ magneticamente purificadas em uma razao de CD4/CD3 de 1:2 e entao estimuladas com SEB (Sigma) por 16 horas. Apos lavagem, as celulas foram cultiveidas em quadruplicate em um volume final de 200 pl por cavidade de meio RPMI 1640 (Invitrogen, Shanghai, China) contendo 100 IU de rlL2 humano em placas de 96 cavidades por 5 dias a 37°C na presenqa de 5% C02. As cultures celulares foram substituidas uma vez com metade de meio fresco em dia 3. Os sobrenadantes de culture coletados em dia 5 foram usados para a mediqao de carga viral por um RT-PCR de tempo real (ver abaixo). Supressao percentual (%) foi calculada comparando a media geometrica de concentraqao viral nos sobrenadantes de culture de cavidades de duplicata contendo apenas celulas infectadas de CD4+ com a media geometrica de concentraqao viral nos sobrenadantes de cavidades de quadruplicate contendo as celulas de CD8+ e CD4+ misturadas. Celulas T CD4+ foram tambem co-cultivadas comcelulas T CD8F alogenicas a fim de determinar a correlagao entre supressao viral e restrigao de HLA.
A-X. Medigoes de carga viral. SIV RAN em plasma ou DNA de SIV associado a celula foram quantificados por urn RT-PCR de tempo' real ou'PCR usando iniciadores (sentido, SEQ ID No. 1 : 5'-GAGGAAAAGAAATTTGGAGCAGAA-3'; anti-sentido, SEQ ID No. 2: 5'-GCTTGATGGTCTCCCACACAA-3') e sonda (SEQ ID No. 3: 5 -FAM-AAAGTTGCACCCCCTATGACATTAATCAGATGTTA-TAMRA-3') especificamente otimizados para SIVmac239 e para SIVmac251.
A-XI Teste de celulas T supressoras especificas de SIV. PBMCs frescos, depletados (ou nao) com qualquer CD8 ou CD25 por anticorpos anti-CD8 ou anti-CD25 conjugados a esferas magneticas de acordo com o protocolo provide pelo fabricante (Miltenyi Biotec) foram infectados com SIVmac239 por 2 horas a 0,5 multiplicidade de infeegao (MOI). Celulas infectadas foram tratadas durante a noite com enterotoxina B de estafilococo (SEB) (2,5 pg/ml) (Sigma) e anticorpos anti-CD3 (2,5 pg/ml)/anti-CD28 (2,5 pg/ml)'(BD Biosciences). Coloragao intracelular simultanea de SIV P27 e Ki-67 foi efetuada 48 horas apos estimulo in vitro a fim de determiner a porcentagem (%) de ativagao de celulas T (Ki-67+) dentro de populagoes celulares infectadas (P27+).
A-XII Desafios Virais.
XII-1. A produgao de SIV foi efetuada em macacos PBMC inoculados com SIVmac239 (presente de P.A. Marx). Os sobrenadantes de cultura foram coletados em produ<?ao viral . tipo palito.
XII-2. Desafio intra-retal (IRC): Seguindo vacinaqao, os animais foram inoculados (repetidamente) intra-retalmente com 5000 MID 100 isto e 5 x 105 TCID50 de SIVmac239 patogenico. Essa dose infecciosa geralmente resulta em uma infec<;ao sistemica de 100% Macaco rhesus chines com uma carga viral de plasma de pico (106-107 10 copias/ml) entre dia 10 e dia 14. Todos os animais desafiados com SIV foram avaliados clinicamente e biologicamente a cada 2 semanas por 1 mes e a cada 1 mes em seguida. XII-3. Desafio Intravenoso (IVC) : Seguindo vacinacjao, 15 os animais foram inoculados (repetidamente) intravenosamente com 5 MID 100 isto e 500 TCID50 (titulados em ' linhagem' celular CEM174) de SIVmac23 9 patogenico (presente de Dr. P.A. Marx de Aaron Diamond AIDS Research Center, New York, USA) . Essa dose infecciosa geralmente 20 resulta em uma infecQao sistemica de 100% macacos rhesus Chineses com uma carga viral de plasma de pico (106-107 copias/ml) entre dia 10 e dia 14. Todos os animais desafiados com SIV foram avaliados clinicamente e biologicamente a cada 2 semanas por 1 mes e a cada mes em seguida.
A-XIII Analise estatistica. Dados nao pareadcs entre diferentes grupos de animais ou dados pareados antes e apos imunizagao foram comparados respectivamente por teste Mann- Whitney ou de Wilcoxon.
PARTE B - MATERIAIS E METODOS ESPECIFICOS B-I- USO DE BCG COMO UM VEICULO TOLEROGENICO B-I-I Preparagao de BCG
1-1. BCG vivo: BCG vivo preparado em Copenhagen no Statens Serum Institut (cepa SSI 1 331 ) foi comprado de Laboratories Sanofi-Pasteur Merck, Sharp and Dome (SPMSD) e foi usado em uma concentragao final de 5xl06 cfu para administragao intestinal ou intravaginal ou em uma concentragao final de 5xl05 cfu para cada administragao intradermica de reforgo.
1-2. BCG inativado por secagem por congelamento estendido (EFD): A cepa SSI 133 de BCG vivo foi morta por 5 dias de secagem por congelamento estendida (EFD) sob urn vacuo de menos que 20 pm Hg e e usada em uma' dose final correspondendo a 5xl06cfu para cada administragao intestinal ou intravaginal ou 5xl05 cfu 'para cada administragao intradermica.
1-3. BCG inativado por calor: A cepa SSI 133 de ECG viva foi colocada em autoclave por 15 minutos a 115°C em tampao de borato e e usada em uma dose final correspondendo a 5xl06 cfu para cada administragao intestinal ou intravaginal ou 5xl05 para cada administragao intradermica.
B-I- II Composigoes farmaceuticas A composigao foi preparada recentemente com o uso de RPMI 1640 (Invitrogen, Shanghai, China) contend© um dos antigenos de SIV e o veiculo tolerogenico.
B-I- III Imunizagao do animal No rnomento de imunizagao, animais foram anestesiados com cloridrato de etilamina e zolazepan (0,7 mg/kg) injetado intramuscularmente.
III-l. imunizagao Intravaginal (IVI): Animais femeas foram imunizados sob anestesia por injegao intravaginal por 4 horas de um mililitrb de composigao farmaceutica ou de um veiculo tolerogenico descrito previamente como um controle. Uma imunizagao de reforgo com a composigao farmaceutica ou com o veiculo tolerogenico foi dada com a mesma dose no mesmo sitio em 8 semanas. Todos os animais foram avaliados clinicamente e biologicamente a cada duas semanas apos a primeira imunizagao.
III-2. Imunizagao Oral (intra-gastrica) (IGI): animais machos ou femeas sob anestesia foram administrados intragastricamente com 15 ml de 0,1 M bicarbonate de sodio 15 minutos antes de ingestao de composigao farmaceutica ou de um veiculo tolerogenic© descrito acima ccmo um controle. Adicionais 15 ml da solupao de bicarbonate de sodio foram dados imediatamente apos administraqao. A mesma vacinapao tolerogenica que a inicial foi repetida duas vezes em intervale de 1 mes para cada animal. Todos os animais foram avaliados clinicamente e biologicamente a cada duas semanas apos a primeira imunizaqao.
III-.3 Imunizaqao de reforqo intraddrmica (IDI): animais femeas imunizados intravaginalmente (ver seqao IVI acima) receberam em 90 dias apos a primeira imunizaqao sob anestesia um reforqo intradermico com 0,1 ml de composicao farmaceutica conterido 109 copias de SIV inativado por AT-2 e 5xl05 efu de BCG vivo. Todos os animais foram avaliados clinicamente e biologicamente a cada duas semanas apos a primeira imunizaqao.
B-I-IV Teste antiviral. 0 limiar correspondendo a imunidade esteril apos desafio intra-retal e pelo menos 20, r.-IT- USO de Lactobacillus plantarumCOMO UM VEICULO TOI.EROGENICO.
B-II-I. PreparagSo bacterlana (prepara^ao veiculo tolerogenico). Lactobacillus plantarum (LP) (ATCC8014) foi cultivado a 37°C em meio MRS com uma taxa de rotaqao de 200 rpm. Para obter LP na fase de logaritmo (semi-logaritmico) de cultura bacteriana, bacterias foram cultivadas ate alcangar uma densidade optica de 1,0 .a 600 nm com uma concentragao final de ,LP de cerca de 1010 cfu/ml (obtida em . cerca de 3,5 horas).
B-II-II Imunizagao de animal por liberagao oral 5 (intra-gastrica). Animais foram alimentados durante a noite (sem cafe da manha) . Ao mesmo tempo de administragao oral, animais foram anestesiados com cloridrato de tiletamina e zolazepan (0,7 mg/kg) intramuscularmente injetados.
Imunizagao No. 1 : Oito animais foram administrados 10 intragastricamente 30 ml de urn vez de uma preparagao viral- bacteriana contendo 4 x 107copias/ml de DI-SIV e 3 x 109 cfu/ml de LP vivo em solugao de maltodextrina (20%) . Apos essa primeira imunizagao, macacos receberam intragastricamente: 25 ml a mesma preparagao viral- 15 bacteriana (isto e, composigao farmaceutica) a cada 30 minutes por 3 horas. Esse protocol© de liberagao oral foi efetuado 5 vezes sobre 5 dias uteis consecutivos. Como controles, 4 animais foram administrados LP vivo apenas e outros 3 receberam apenas duas vezes SIV inativado em 20 paralelb.
Imunizagao No. 2: doze animais (iSIV/LP#9-20) foram intragastricamente administrados com 30 ml de uma preparagao de 4 x 107 copias/ml de iSIV (SIVmac239 inativado por AT-2/por calor) e 3 x 109 cfu/ml de LP vivo em soluqao de maltodextrina (20%). Entao, animals receberam 25 ml da mesma preparaqao a cada 30 minutos por 3 horas (6 vezes) em 5 dias consecutivos. Seis animais (LP#5-10) foram intragastricamente administrados com 30 ml de 3 x 109 cfu/ml de LP vivo em soluqao de maltodextrina (20%). Entao, animais receberam 25 ml da mesma preparaqao a cada 30 minutos por 3 horas (6 vezes) em 5 dias consecutivos. Finalmente, outros 6 animais (iSIV#5-10) foram intragastricamente administrados com 30 ml de uma preparacao de 4 x 107 copias/ml de iSIV apenas. Entao, animais receberam 25 ml da mesma preparaqao a cada 30 minutos por 3 horas (6 vezes) em 5 dias consecutivos.
B-II-ill - Deplecao de celulas CDS* T in vivo. Macacos foram primeiro anestesiados e entao receberam uma injeqao intravenosa de urn anticorpo monoclonal anti-CDS quimerico (cMT-807, Centocor Research & Development, Inc., Malvern, Pennsylvania, USA) a 5 mg/kg em dias 0, 4, e 7) como descrito anteriormente (Schmitz et al., 1999). Amostras de sangue periferico (5 ml) foram extraidas de cada animal em dia 0 e em varies pontes de tempo apos injecao de anticorpo.
B-II-IV Teste antiviral. O limiar correspondendo a imunidade esteril apos desafio intra-retal e de pelo menos 100,
B-II-V Teste de supressao de SIV de celulas T CD8+. Celulas T CD4 + autologas de cada animal purificado por rotula^ao positive magnetica (MicroBeads, Miltenyi Biotec) foram infectadas ’agudamente com SIVmac239 (10‘3 multiplicidade de infecqao) na presenqa ou na ausencia de celulas T CD8+ magneticamente purificadas em uma razao de CD4/CDB de 1: 3 e entao estimuladas com SEB e anticorpos anti-CD3/anti-CD28 por 16 horas. Apos lavagem, as celulas foram cultivadas em quadruplicate em placas de 96 cavidades. Cultures foram mantidas em urn volume final de 200 pl por cavidade de meio de RPMI 1640 contendo 100 IU de rlL2 humane (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) por 5 dias. Sobrenadantes de cultura coletados a dia 5 foram usados para a mediqao de carga viral por um RT-PCR de tempo real (ver abaixo). A supressao de vezes foi calculada como segue: a media geometrica de concentracao viral nos sobrenadantes de cultura das celulas alvo CD4+ infectadas apenas/ a media geometrica de concentraqao viral nos sobrenadantes das celulas T CD8+ e CD4+ mistas).
Em alguns experimentos, celulas T CD8+ e CD4 + mistas foram cultivadas sem contato celula a celula usando um sistema de inserqao em multicavidades (BD Biosciences) (CDS na cavidade de inserq:ao e CD4 no cavidade de fundo) ;
celulas T CD4+ foram co-cultivadas com celulas T CD8-i- alogenicas a firn de determinar a correlaqao entre supressao viral e restripao de MHC; e celulas T CD8+ e CD4 + mistas foram tambem co-cultivadas na presenpa de anticorpos anti- MHC-ABC (BioLegend) ou anti-MHC-E (Cell Science) para definir os rnodos de restripao de MHC. Para definir os subconjuntos de celulas T CD8+ associadas com atividade antiviral, celulas T CD8+ foram purificadas de PBMCs imediatamente apos sua deplepao com conjugado-PE anti- TCRCD, anti-v|38, ou outros anticorpos de antigeno anti-CD usando microesferas anti-PE atraves de uma coluna LD (Miltenyi Biotec).
B-II-VT Teste de citotoxicidade de celulas T CD8+ especificas para SIV. Ambas as celulas T CD8+ purificadas (celulas efetoras) e celulas T CD4+ purificadas pulsadas com IO10 SIVmac239 tratado com AT-2 (celulas alvo) foram rotuladas com 40 nM 3,3'dihexiloxacarbocianina (DiOC6) (Marchetti et al., 1996) (Molecular Probes) por 10 min a 37°C. Celulas alvo foram rotuladas com anti-CD4 conjugadas de PerCP-Cy5 (BD Eioscience) por 20 min em gelo. Apos lavagem 3 vezes, celulas efetoras foram misturadas com celulas alvo em uma placa de 96 cavidades de fundo em U em diferentes razoes de E/T (3:1, 1:1, 0,3:1) em triplicata. Celulas K562 (alvo) com anti-CD32 conjugado a APC (BD Bioscience) e celulas (efetoras) purificadas CD56+ (NK) de 4 doadores saudaveis foram incluidas como urn controle de teste. Apos 4 horas de incubaqao a 37°C na presenga de SEB e anti-CD3/anti-CD28, celulas foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo. Citotoxicidade percentual foi calculada como segue: 100 x (% de celulas alvo apoptoticas totals - % de celulas alvo apoptoticas espontaneas) / (100 - % de celulas alvo apoptoticas espontaneas).
B-II-VII Desafios virais. Primeiro estudo: Quatro meses apos a administragao oral da vacina ou dos controles no primeiro lote de experimento (imunizagao No. 1) , os 8 animals imunizados e seus 7 controles foram inoculados intra-retalmente com 2500 MID100 (100.000 TCID50) de SIVmac239 patogenico, dois meses mais tarde, 4 macacos vacinados e ja protegidos foram re- desafiados por via intra-retal (100.000 TCID50) enquanto os 4 outros macacos protegidos foram intravenosamente re- desaf iados com ’ 5 MID100 (200 TCID50) de SIVmac239, como controles, 2 macacos receberam urn desafio intra-retal e outros 2 urn' desafio intravenoso. Essas doses infecciosas geralmente resultam em uma infecgao sistemica de 100% do macaco rhesus chines com uma carga viral de plasma de pico (107 - 109 vp/ml) entre dia 10 e dia 14.
Segundo estudo (imunizagao No. 2) : Em dia 420 apos- imunizagao no segundo conjunto de estudo, 16 animals (8 macacos imunizados com iSIV e LP) e 8 controles (4 iSIV e 4 LP) foram desafiados intra-retalmente com 100.000 TCID50 de SIVmac239,
PARTE C - RESULTADOS C-l BCG E UM VEICULO TOLEROGENICO C-I-l Proteqao contra o desafio de SIVmac239 intravenoso seguindo administraqao intravaginal:
Seis animais (Composi$oes_l, 2, 3, 4, 5, e 6) foram administradas intravaginalmente comum mililitro de uma composiqao tolerogenica compreendendo virus inativado por AT-2 como urn antigeno e BCG vivo. Uma administracao de reforqo foi dada com a mesma composicao tolerogenica no mesmo sitio em 8 semanas.
Simultaneamente, 5 outros animais (controles_l, 2, 3, 4, e 5) receberam intravaginalmente urn mililitro de uma composiqao compreendendo apenas BCG vivo. Uma administracao de reforqo foi tambem dada com a mesma'composiqao no mesmo sitio em 8 semanas.
Quatro meses apos a administraqao inicial, todos os 11 animais (Composicoes_l -6 e controles_l-5) foram desafiados por uma inoculacao viral intravenosa.
As cargas virais foram determinadas regularmente no plasma dos animais tratados.
Figura 1 mostra as cargas virais (Copias de RNA de SIV no plasma /ml) como uma funqao de tempo (dias) em animais que receberam a composiqao (Composiqoes_l-6) e em animais de controle (controles_l -5) seguindo urn desafio viral intravenoso simples.
Os resultados mostram que, apos desafio viral intravenoso, os 5 animais de controle (Controles_l -5) mostraram uma infecqao primaria tipica com uma carga viral de plasma de pico (106-107 copias/ml) entre dias 10-14 pos desafio como esperado. A carga viral de plasma desse grupo de animais de controle permaneceu ainda elevada (>105 vp/ml) durante os 60 dias de apos desafio viral e em seguida.'
Em contraste, 4/6 animais que receberam intravaginalmente a composiqao tolerogenica feita de urn SIVmac239 inativado por AT-2 mais BCG mostraram urn pico de carga viral de plasma muito baixo (< 1 000 vp/m 1 ; entre dias 10-14), que se tornou indetectavel (<10 vp/ml) rapidamente (urn mes apos desafio viral) . Os 2 animais com urn elevado pico de carga viral de plasma (> 106 copias/ml) tiveram urn menor nivel de carga viral de ponto de ajuste (<1000 copias/ml) que o grupo de controle (> 105 copias/ml) em dia 60.
C-I-II- Proteqao contra o desafio de SIVmac239 intra- retal seguindo administragao intravaginal da composiqao:
Sete animais (composiqoes_7, 8, 9, 1 0, 11, 12, e 13) foram administrados intravaginalmente com um mililitro de uma composiqao tolerogenica compreendendo virus inativado por AT-2 como um antigeno e BCG vivo como um veiculo tolerogenic©. Uma administraqao de reforpo foi dada com a mesma composicao no mesmo sitio em 8 semanas.
Simultaneamente, cinco outros animais (controles_6, 7, 8, 9, e 10) receberam intravaginalmente um mililitro de uma composipao compreendendo apenas BCG vivo. Uma administraqao de reforpo foi tambem dada com a mesma composiqao no mesmo sitio em 8 semanas.
Quatro meses apos a administraqao initial, todos os 12 animais (composiqoes_7-13 e controles_6-l 0) foram desafiados com SIVmac239 atraves de uma inoculapao viral intra-retal.
As cargas virais foram determinadas regularmente no plasma dos animais tratados e de controle.
Figura 2 mostra as cargas virais (copias de RNA de plasma de SIV/ml) como uma funqao de tempo (dias) em animais que receberam a composiqao (composipoes_7-13) e em animais de controle (controles_6-10) seguindo desafios virais intra-retais.
Os resultadds mostram que, seguindo desafios virais intra-retais, os animais que receberam a administrapao intravaginal de BCG vivo apenas (controles_6-10) mostraram uma infecpao primaria tipica com uma carga viral de plasma de pico (106-107 vp/ml) entre dias 10-14 pos-desafio como esperado. A carga viral de ponto de verificaqao de plasma desse grupo de animais de controle permaneceu ainda elevada (>105 copias/ml) durante os 60 dias apos o desafio viral.
Em contrasts, 4/7 animais que receberam intravaginalmente SIVmac23 9 inativado por AT-2 mais BCG vivo mostraram nivel de carga viral surpreendentemente indetectavel (<10 copias/ml) durante urn periodo de 60 dias apos o desafio. Cs 3 outros animais mostraram uma infecpao primaria tipica com uma carga viral de plasma de pico entre dias 10-14 pos-desafio. Entretanto, sua carga viral de ponto de verificaqao (103-105 copias/ml) foi significantemente menor que o nivel dos animais de controle (>105) .
C-I-III- Proteqao contra desafio repetidamente desafios intravenosos ou de SIVmac239 intra-retal seguindo administraqiao intravaginal da composiqao farmaceutica:
Dois e oito meses mais tarde, os 3 animais com uma carga viral indetectavel seguindo desafio intravenoso (composiq:oes_l, _2, e _3) foram submetidos a urn segundo e urn terceiro desafio intravenoso com a mesma dose de inoculo viral.
Apos o segundo e terceiro desafios virais intravenosos desse grupo de macacos, uma similar carga viral de plasma de pico baixo foi observada em dia 10. Entretanto, por 30 dias apos desafio viral, cargas virais tornam-se novamente indetectaveis (Figura 3).
Dezesseis e vinte tres meses apos a administraqao inicial da composiqao, os 3 animais que ja tinham passado por urn total de 3 desafios intravenosos (cornposiqoes_l, _2, e _3) foram ainda desafiados por inoculaqao intra-retal.
Como esperado, esses 3 animais (que inicialmente receberam intravaginalmente SIVmac239 inativado por AT-2 mais BCG) nao mcstraram novamente nenhum pico detectavel (<10 copias/ml) de carga viral de plasma apos 2 sucessivos desafios virais intra-retais (Figura 3).
Esses resultados estabeleceram que eficiencia em inibir replicaqao viral e estavel uma vez que essa inibiqao e ainda observada em mais do que 20 meses apos a administraqao inicial da composiqao
C-I-IV- Proteqao contra o desafio de SIVmac239 intravenoso ou intra-retal seguindo administraqao intravaginal da composiqrao farmaceutica mais urn reforqo intradermico:
Como esperado, apos seguir desafios virais intravenosos (controles 1 7 e 1 8, Figura 4) ou intra-retal (controles 19 e 20, Figura 5) , os 4 animais que receberam administrapao intravaginal de BCG vivo apenas mostraram uma infecpao primaria tlpica com uma carga viral de plasma de pico (10G-107 vp/ml) entre dias 10-14 pos-desafio como esperado. A carga viral de ponto de verificapao de plasma desse grupo de animais de controle permaneceu ainda elevada (>105 copias/ml) por 60 dias apos o desafio viral.
Em contrasts, os 3/4 (75%) de animais (composipoes 14, 15, e 17) que receberam intravaginalmente a composipao feita de SIVmac239 inativado por A.T-2 e BCG vivo mais urn reforpo intradermico com a mesma composipao mostraram carga viral de plasma indetectavel (<10 copias/ml) durante urn periodo de 60 dias pos-desafio intravenoso (ver Figura 4). 0 restante, urn animal (composipao 16) mostrou uma infecpao primaria com uma carga viral de plasma de pico (>105 copias/ml) entre dias 10-14 apos-desafio (ver Figura 4). Entretanto, sua carga viral de ponto de verificapao alcanpou urn nivel relativamente baixo (104 copias/ml) em dia 60.
Ad'emais, os 4/4 (100%) animais (composipoes 18-21) que receberam intravaginalmente a composipao feita de SIVmac239 inativado por AT-2 mais BCG vivo mais urn reforpo intradermico da mesma composipao mostraram carga viral de plasma indetectavel (<10 copias/ml) durante urn periodo de 60 dias pos-desafio intra-retal (ver Figura 5).
C-I-V- Proteqao contra o desafio de SIVmac239 intra- retal seguindo administrate oral da composigao farmaceutica:
Quatro animals (composiqdes_22, _23, _24, e _25) foram administrados intragastricamente com urn mililitro de uma composiqao compreendendo virus inativado por AT-2 e BCG vivo.
Simultaneamente, quatro outros animals (controles 21 - 24) receberam intragastricamente urn mililitro de BCG vivo apenas.
A mesma administrate dada inicialmente a cada animal foi repetida tres vezes a dia 15, 30 e 60 seguindo a primeira etapa de administrate0•
Os resultados mostram que apos desafio viral intra- retal (efetuado em dia 90) , os 4 animais que receberam ECG vivo apenas (controles 21 -24) mostraram uma infect© primaria tipica com uma carga viral de plasma de pico (106¬107 copias/ml) entre dias 10-14 apos-desafio considerando que os 4 animais (compositoes_22-25) que receberam a composite de SIV inativado por AT-2 mais BCG vivo mostraram surpreendentemente uma carga viral de plasma indetectavel (<10 c6pias/ml; entre dias 10-14) (Figura 6).
C-I-VI- Correlates imune e protet© contra desafio deSIVmac239 seguindo a administraqao da composigao feita de virus inativado por AT-2 mais BCG vivo:
Nenhum anticorpo sistemico direcionado contra SIV foi detectado no sangue dos animais tratados. Entretanto, alguma resposta humoral sistemica especifica foi detectada quando administragao de composigao de reforgo intradermico foi usada. Consequentemente, a protegao observada contra infecgao por SIV para os animais tratados nao resulta de uma resposta humoral sistemica.
Ademais, nao foram detectaveis linfocitos T citotoxicos produzindo interferon- gama especifico de SIV convencionais por ELIspot (dados nao mostrados). Para o proposito de avaliar se uma resposta celular nao convencional especifica de SIV existiu, amostras de sangue foram extraidas para cada animal tratado ou de controle, e celulas CD4+ e CD8+ foram purificadas a partir de cada amostra de acordo com metodos convencionais. As celulas CD4+ previamente obtidas foram cultivadas e entao infectadas com SIVmac239 de acordo com metodos convencionais. As celulas CD4+ infectadas por SIV foram entao cultivadas na presence ou na ausencia das, previamente obtidas, celulas CD8+ autologas por 5 dias. A concentragao de SIV no sobrenadante foi avaliada por urn PCR real quantitative.
Figura 7 mostra uma duplicaqao de supressao de replicaqao viral em CD4 + infectadas de SIV obtidas na presenqa ou na ausencia de celulas CD8+ autologas obtidas no curso dos experimentos apresentados em Figura 2. As CD8 testadas foram obtidas de animais que receberam, pela via intravaginal, a composiqao de virus inativado por AT-2 mais BCG (composic?oes_7-13) ou de animais de controle (controles 6-10).
Os resultados mostram que as celulas T CD8 de animais protegidos contra infecqao por virus (composiqao_7, composipao _8, composiqao _10, e composiqao _11 ) fornecem urn nivel de supressao viral em celulas CD4 infectadas por SIV maior que 20 vezes, considerando que as celulas T CD8 de animais nao protegidos contra infecqao por virus (composiqao_9, composipao_l 2, e composi<7ao_l 3) fornecem urn nivel de supressao viral inferior ou igual a 10 vezes (Figura 7) . Ademais, uma supressao viral maior do que 2 0 vezes fo.i tambem observada nos 4 animais protegidos contra desafios virais intravenosos apresentados em Figura 1 (dados nao mostrades).
Figura 3 mostra os niveis de supressao viral em CD4+ infectadas por SIV obtidas na presenpa ou na ausencia de celulas CD8+ autologas obtidas no curso dos experimentos apresentados em Figura 6. As CD8 testadas foram obtidas dos 4 animais que receberam a composiqao (coniposiqoes_22-25) por administracjao oral de virus inativado por AT2 mais BCG ou dos 4 animais de controls (controles 21 -24).
Figura 9 mostra os niveis de ativaqao de celulas T (Ki67+) em populaqiao celular de CD4 infectadas por SIV (P27 + ) obtidas na presenqia ou na ausencia de celulas CD8 + autologas obtidas no curso dos experimentos apresentados em Figura 6. As CD8 testadas foram obtidas dos 4 animais que receberam a composiqao (composiqoes_22-25) por administraqao oral de virus inativado por AT-2 mais BCG ou dos 4 animais de controle (controles 21 -24). Uma supressao especifica de SIV de ativaqiao de celulas T CD4->- por celulas T CD8+ autologas foi observada nos 4 animais que receberam a composiqao.
Os resultados confirmam que a prevenqiao de infecqao por SIV sistemica ou mucosal obtida por administraqao intravaginal ou oral de inativadas por AT2- mais BCG induziu urn estado de imunotolerancia caracterizado por uma resposta de celulas T CD8+ nao citotoxica associada com uma anergia celular de CD4 infectada por SIV. Em vista desses resultados, BCG pode deste modo ser identificado como urn adjuvante tolerogenico.
Tomadas juntas, essas descobertas demonstraram que urn estado uniforme de imunotolerancia a antigenos de SIV e pela primeira vez alcanqiado por adtninistraqdo intravaginal ou oral (ou intragastrica) de uma composiqao feita de virus de SIV inativados mais BCG vivo. Ao mesmo tempo, foi mostrado pela primeira vez que uma administrapao intravaginal ou oral de uma composiqao farmaceutica compreendendo virus de SIV inativado por AT-2 mais BCG vivo de acordo com a invenqao e efetiva (>50%) para prevenir infecqao viral cronica seguindo desafio intra-retal ou intravenoso.
C-II- Uso de Lactobacillus plantarum COMO UM VEICULO TOLERCGENICO
C-II-1- Induqao de imunotolerancia especifica de SIV porco-administraqao oral de SIV inativados duplos e
Lactobacillus plantarum (iSIV/LP) Por urn lado, anticorpos especificos de SIV (IgG, IgM, e IgA) nao foram detectados em animais tratados com iSIV/LP oral (Figura 10a) . Por outro lado, nenhuma proliferate© celular significance de T CD4 + de sangue periferico especifico de P27 de SIV foi observada em animais tratados com iSIV/LP enquanto animais tratados com iSIV mostraram significance proliferaqao celular T CD4 + de sangue periferico especifico para P27.
C-II-II- Atividades anti-ativagao e antiviral de celulas CD8+ nao citotoxicas Prolif eraqao de celulas T CD8+ de sangue periferico especifico para P27 de SIV foi observada tanto em animais tratados com iSIV/LP como iSIV (Figura 10b) . Entretanto, nao foram detectadas celulas T secretando interferon-gama (em estimulo in vitro) em animais tratados com iSIV/LP e a depleqao de quaisquer celulas CD8+ ou CD25+ nao alterou a nao responsividade de celulas T efetoras especificas para P27 (Figura 10c). Ademais, uma forte supressao de ativaqao (Ki-67+) de celulas T CD4 + infectadas (P27+) por celulas T CD8+ nao citotdxicas foi tambem observada em PBMCs infectados in vitro agudamente extraidos de animais tratados com iSIV/LP e a depleqao de celulas CD25+ nao alterou a supressao potente operada por celulas T CD25 e CD8+ na ativaqao de celulas T CD4 + infectadas (Figura 16d).
Deve-se notar o fato que nenhuma lise celular foi detectada por urn teste de citotoxicidade altamente sensivel (Marchetti et al., 1996) apds co-iricubar celulas T' CD 8+ e celulas T CD4+ pulsadas com SIVmac239 nao replicativo na presenca ou a ausencia de SEB e anticorpos anti-CD3/anti- CD28 (Figura lOe).
Finalmente, as celulas T CD8+ de sangue periferico extraidas de animais tratados a partir de 2 meses per iSIV/LP mostraram uma forte atividade de inibiqao contra replicaqao viral 'em celulas T CD4+ autoIogas' agudamente infectadas in vitro (Figura 11 a) . Ademais, tai forte atividade antiviral de celulas CD8 + T foi tambem observada igualmente em celulas T CD4+ heterologas agudamente infectadas in vitro (Figura 11 b), sugerindo que um mecanismo restrito nao classic© HLA.1 esta envolvido na atividade supressora/inibidora de celulas T CD8+.
Cdlulas T CD8+ de sangue periferico purificadas extraidas de macacos imunizados coni LP/iSIV > 2 meses antes tiveram uma forte atividade antiviral em celulas T CD4+ autologas agudamente infectadas com SIVmac239 estimuladas durante a noite com SEB e anticorpos anti-JD3/anti-CD28 e entao co-cultivadas por 5 dias. Uma vez que a ativaqao de celulas T CD4 + especificas para SIV e estabelecida (48 horas apos-estimulo), adicionar as celulas T CD8+ pode nao mais inibir a replicapao viral (Figura 11 c) . Essa observapao discute contra a lise potencial de celulas T CD4 H alvo (produtivamente infectadas) por celulas T CD8+ 'em cultura ’ prolongada, cotno sugerido por um estudo ixfiterior sobre diabete tipo 1 autoimune humano (Jiang et al., 2010). Essa atividade antiviral mediada por celulas T CD8+ necessitou contato cel’ula a celula (Figura 11 d) e tambem foi um MHC1 classico nao restrito como mostrado pela forte inibipao de replicaqao viral operada por celulas T CDS+ em celulas T CD4+ infectadas agudamente de outros animais imunizados ou de aniraais de controls (Figura 11 e). Finalmente, a atividade antiviral mediada por CD8 foi bloqueada por- um anticorpo anti-MHC-Ib/E, mas nao pelo anticorpo anti-MHC-Ia/ABC, indicando uma atividade de celulas T CD8 + restritas ao MHC-Ib/E nao classicas (Figura Ilf) .
E estabelecido que uma expressao de celulas T CD8-I- TCR e necessaria para reconhecer complexes de MHC-Ib/E-peptideo carregados por celulas T CD4+ alvo (Sarantopoulos et al., 2004; Van Kaer, 2010). usando uma deple^ao .in vitro por microesferas magneticas conjugadas a anticorpo, TCRyS e Vp8 foram mostradas como nao estando envolvidas em supressao de replicaqao viral de celula T CD8+ (Figura 11 g) . TCRap deste modo parece desempenhar um papel central no reconhecimento de apresentaqao de MHC-Ib/E-peptideo em celulas T CD4+ infectadas. Ademais, depletando celulas T CD8+ com anticorpos anti-humanos disponiveis reagindo cruzado com antigenos de membrana CD (para "diferenciaqao de agrvpamentos") de primatas nao humanos (CD7, CDlla, CD16, CD25 (IL-2RA), CD27, CD28, CD39, CD62L, CD95, CD1C1, CD122 (IL-2RB) ,'CD127 (IL-7R) , CD 129 (IL-9R) , CD 137, CD 150, CD183 (CXCR3) , CD184 (CXCR4), CD 195 (CCR5) , CD196 (CCR6) , CD197 (CCR7) , CD215 (IL-1 5Ra) , 'CD218 (IL-18Ra), CD223 (LAG3), CD226, CD247, CD272, CD277,’ CD279 (PD-1) , CD305 (LAIR1), c CD357), nenhum antigeno CD associado com atividade de celulas T CDS* restritas ao MHC-Ib/E poderia ser identificado.
(Tabela 1). Tabela 1 abaixo mostra a atividade 5 antiviral (supressao de vez.es, media geometrica + S E ) de celulcis T CD8 + extraidas de 0 animais imunizados com iSIV/LP antes e apos depleoes de subconjuntos* definidos por antigeno CD no primeiro estudo de imvnizacao (imunizaqao ntimero 1).
Figure img0001
*Em cada lote de experimento, foi efetuada atividade antiviral (vezes de supressao, media geometrica + SE) de celulas T CD8+ extraidas de 8 animais imunizados de iSIV/LP depletadas (ou nao) com 2 anticorpos de antigeno anti-CD.
C-II-III Proteqao de animais de desafios intra-retais
Tres meses apos a administraqiao de iSIV/LP ou preparaqioes de controle, os 8 animais imunizados com iSIV/LP e os 7 animais de controle foram intra-retalmente desafiados com uma dose elevada simples (100.000 TCID50) de SIVmac239. Oito dos 8 animais tratados com iSIV/LP foram protegidos de desafio intra-retal por SIVmac239 patogenico enquanto os 4 animais tratados com iSIV e os 4 animais tratados com LP foram infectados pelo mesmo desafio intra- retal viral (Figura 12a e b, parte esquerda das Figuras).
C-II-IV Proteqao de animais de desafio intravenoso por imunotolerancia oral
Dois meses apos o primeiro desafio, 4 dos 8 macacos receberam urn segundo desafio atraves da via intravenosa (200 TCID50). Todos eles mostram urn leve pico de replicapao (< 200 copias de DNA de SIV/milhoes PBMC e 200 copias de RNA de SIV/ml de plasma) em dia 10 pos-desafio; entretanto por dia 30, PBMC SIV DNA diminuiu para^ 10 copias/milhoes celulas e plasma SIV RNA foi indetectavel (£ 10 copias/ml), indicando a ausencia de replicaqao ativa in vivo do virus (Figura 12a e b, parte da direita das Figuras). Em contraste, 2 animais naturais que receberam o mesmo desafio por SIVmac239 intravenoso (200 TCID50) foram infectados com sucesso. Os 4 macacos restantes foram intra-retalmente re-desafiados (100.000 TCID50) e todos eles permaneceram completamente protegidos (Figura 12a e b, parte da direita das Figuras).
C-II-V Confirmaqao in vivo do papel de celulas T CD8+
Cinco meses apos esse segundo desafio, a fim de confirmar in vivo o papel de celulas T CD8+, 3 injeqoes intravenosas de um anticorpo anti-CD8 monoclonal quimerico de camundongo-humano (cMT-807, Centocor) foram dadas durante um periodo de uma semana (dias 300, 304 e 307 pos- imunizaqao) aos 8 macacos ja desafiados para temporariamente depletar suas celulas T CD8+ de sangue periferico e orgaos linfoides (Figura 13a e b) . Nenhuma emergencia de RNA ou DNA viral foi detectada nos 4 macacos re-desafiados por via intra-retal, demonstrando novamente sua proteqao esteril completa; em contraste, uma forte replicaqao viral acompanhou a depleqao de celulas T CD8+ de orgaos linfoides dos 4 animals intravenosamente desafiados como mostrado por suas cargas virais de plasma que alcanqaram um pico a 106 copias RNA /ml e seu PBMC e cargas provirais de linfonodos que alcancparam 104 copias DNA /106 celulas por dia 15 (o ponto mais baixo de depleqao de celulas T CD8+); por dias 60-90, quando os 4 macacos recuperaram concentraqoes de celulas T CD8+ de linha de base, RNA de SIV de plasma e PBMC e DNA de SIV de linfonodos recuperou tambem niveis de linha de base (Figura 13 c, dee). Isso confirmou o papel unico de celulas T CD8+ por iSIV/LP no controle de replicapao viral in vivo em animais intravenosamente desafiados com SIV em que virus competente de replicaqao permaneceu latente em provavelmente em celulas T CD4+ de memoria quiescente.
Oito meses apos o segundo desafio, os 4 macacos intra- retalmente re-desafiados, bem como os 4 intravenosamente re-desafiados receberam urn terceiro desafio, dessa vez atraves da via intra-retal com SIVB670 (100.000 TCID50) , uma cepa de SIV infecciosa distinta. Os 8 animais permaneceram completamente protegidos durante os 12 meses seguintes como mostrados por seus niveis de DNA e RNA de SIVB670 indetectaveis considerando que 2 animais natives foram infectados com sucesso pelo mesmo desafio com SIVB670, demonstrando que celulas T CD8+ restritas ao MHC- Ib/E geradas em LP/iSIVmac239 foram protetoras cruzadas atraves de prevenqao da ativaqao de celulas T CD4+ infectadas por outras cepas de SIV (Figuras 14a e b).
Para determinar a duraqao de eficacia para prevenir doenqas por SIV nos animais tratados com iSIV/LP, uma segunda imunizaqao com iSIV/LP foi conduzida em 8 novos macacos de origem chinesa e a atividade antiviral in vitro de suas celulas T CD8+ foi verificada horas adicionais sem desafio por SIV. Tai atividade antiviral in vitro foi detectada como de 60 dias pos-imunizapao como comparado aos animais de controle ou tratados com LP (n = 4) ou iSIV (n = 4) apenas.
Niveis de atividade anti-SIV ex-vivo foram mantidos ate dia 420 em 7 dos 8 macacos enquanto a atividade antiviral de um macaco progressivamente diminuiu de dia 360 para alcanqar niveis de linha se base de macacos de controle por dia 420 (Figura 15a). Em dia 420 apos- imunizaqao, os 16 animais foram intra-retalmente desafiados com 100.000 TCID50 de SIVmac239. Sete dos 8 animais imunizados com iSIV/LP adquiriram uma imunidade esteril sem qualquer emergencia de RNA e DNA de SIV em plasma e PBMC (Figura 15b e c) , bem como em linfocitos de mucosa retal (onde eles foram medidos de dia 1 pos desafio) e linfonodos pelvicos (Figura 16a a 16e) enquanto um macaco imunizado foi completamente infectado. Importantemente, a evoluqao da atividade antiviral ex-vivo dos 8 macacos vacinados permitiu prever a partir do dia 3 60 apos imunizaqao (isto e, 60 dias antes seu desafio) os 7 macacos protegidos e o um nao protegido (Figura 15a a c).
C-II-VI Conclusoes
E descrito aqui, no modelo de macaco, que a administrapao de SIVmac239 (iSIV) inativado e Lactobacillus plantarum (LP) comensal (referido como um adjuvante tolerogenico) gera celulas T CD8+ restritas a MHC-Ib/E que induziram a supressao de ativaqao de celulas T CD4+ de apresentaqao ao antigeno SIV e, assim, a supressao de replicaqao de SIV e a proteqao de macacos dos desafios com SIV.
Uma mistura feita de iSIV e LP inativados foi administrada intragastricamente a urn total de 16 animais e 15 controles. Quatro a 14 meses mais tarde, todos os animais foram desafiados intra-retalmente com SIVmac239 patogenico.
Proteqao completa contra infecqao de SIV foi observada em 15 dos 16 animais administrados com iSIV/LP; em contraste, infecqao foi estabelecida em todos os animais de controle e urn primata vacinado. 0 primata nao protegido pode ser previsto por urn teste com antiviral ex vivo 60 dias antes do desafio intra-retal. Oito animais protegidos permaneceram protegidos apos urn segundo desafio com SIVmac239 dado intravenosamente em 4 primatas e intra- retalmente nos outros 4.
Os 8 animais com liberaqao de iSIV/LP tiveram completa ausencia de proliferaqao de celulas T CD4+ de sangue periferico especifico de SIV e nao criaram quaisquer anticorpos sistemicos especificos de SIV (IgG, IgM, ou IgA).
Alem disso, suas celulas T CD8+ de sangue periferico especifico de SIV apresentaram varias particularidades: 1) elas proliferaram bem, mas sem secreqao de interferon-y mediante estimulo in vitro; 2) elas fortemente suprimiram a ativaqao de celulas T CD4+ autologas agudamente infectadas; 3) ambas funpoes permaneceram inalteradas apos depleqao de celulas CD25+; 4) elas inibiram tambem replicaqao de SIV em celulas T CD4+ alogenicas infectadas agudamente; e 5) sua aqao supressiva/ inibidora foi restrita a MHC- Ib/E.
Esses resultados mostram que a co-administraqao intragastrica de iSIV e LP permite aos macaco desenvolver celulas T regulatorias CD8+ nao citotoxicas especificas de virus restritas a MHC-Ib/E que gera uma imunotolerancia especifica de SIV e que muito surpreendentemente tai imunotolerancia especifica de virus esta associada com proteqao com vacina de animais contra o estabelecimento de infecqao por SIV.
E mostrado aqui acima que a composiqao farmaceutica de acordo com a presente invenqao previne infecqoes por HIV e SIV em humanos/mamiferos. Essa aqao preventive e obtida em macacos induzindo uma imunotolerancia de "Ts" nos indivlduos tolerogenicamente vacinados (isto e, os mamiferos foram administrados com a composiqao farmaceutica). Referida imunotolerancia "Ts" e aqui demonstrada para envoiver celulas T regulatorias CD8 supressivas restritas a MHC-Ib/E nao citotoxicas especificas de virus, cuja presenqa e a atividade sao mostradas para: -inibir a replicaqao de SIV em celulas T CD4 + agudamente infectadas de macacos tendo sido administrados com a composiqao farmaceutica da presente invenqao (in vitro); e/ou -prevenir a replicaqao de SIV em macacos tolerogenicamente vacinados que sao desafiados com SIV infeccioso (in vivo).
Referencias
  • Morgan C, et al. Pios Medicine 2008, 5: 1200-1204 Marcondes MC, et al. Viral Immunol 2006,19:679-689 Stahl-Hennig C, et al. J Med Primatol 2007,36: 195-205 Chen S, et al. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao 2008,30: 156-160
  • Hu et al., JAMA 275:210-216, 1996
  • Korber et al. , Science 280: 1868-1871 , 1998
  • Papathanasopoulos MA, et al. Virus Genes 2003,26: 151-163
  • RAVIV et al. J. Virol., vol.79(19), p: 12394-12400, 2005
  • Chien, Novel Drug Delivery Systems, Ch. 4 (Marcel Dekker, 1992)
  • Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6a-ed. (vdrios editores, 1989-1998, Marcel Dekker)
  • Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (ANSEL et al., 994, WILLIAMS & WILKINS)
  • Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, Mass. (1985)
  • WONG et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.104(8), p:2591 -2595, 2007
  • Fuller. J. Appl. Bacteriol. 66:365-378 (1989)
  • I. Mederle, R. Le Grand, B. Vaslin et al., Vaccine 21 (27-30), 4153 (2003)
  • W. Lu, X. Wu, Y. Lu et al., Nature medicine 9 (1), 27 (2003)
  • A. S. Fauci, Nature 384 (6609), 529 (1996)
  • Faria and Weiner, Immunol Rev 206, 232 (2005)
  • Mestecky et al., J Immunol 179 (9), 5633 (2007)
  • HOFT et al. (J Infect Dis., vol.198(10), p: 1491 -1501 , 2008)
  • WANG et al (Med Microbiol Immunol., 2008 May 20)
  • Rerks-Ngarm et al. N. Engl. J. Med. Vaccination with AL VAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand, 2009 Oct. 20 (epub)
  • McElrath et al. The Lancet, Volume 372, Issue 9653, paginas 1894 - 1905, 29 de novembro de 2008
  • Tsai et al., Laboratory animal science 43 (5), 41 1 (1993)
  • Wei Li Lee et al. Small, (p 1003-101 1 ) Publicado Online :31de marqo de 2010 12: 16PM DOI:10.1002/smll.200901985
  • Delie F. Adv Drug Deliv Rev. 1998;34:221-233
  • Mathiowitz et al. Nature. 1997;386:410-414
  • Goldberg et al. Nat Rev Drug Discov. 2003;2:289-295
  • Fasano et al. J Clin Invest. 1997;99: 1 158-1164
  • Sandri et al. Eur J Pharm Biopharm. 2007;65:68-77
  • Chickering et al. J Control Release. 1997;48:35A*6
  • Ponchel et al. Adv Drug Deliv Rev. 1998;34: 191-219
  • Plotkin et al. Vaccines, Saunders Elsevier Fifth edition, 2008, pages 215 & 216 Korin e Zack, Journal of virology 73 (8), 6526 (1999) Vatakis et al., Journal of virology 83 (12), 6222 (2009a)
  • Vatakis et al., Journal of virology 83 (7), 3374 (2009b) Andrieu and Lu, Immunol Today 16 (1 ), 5 (1995) Sacha et al., J Immunol 178 (5), 2746 (2007)
  • Schmitz et al., The American journal of pathology 154 (6), 1923 (1999)
  • Liew et al., 2010. Journal of Biotechnology 150:224- 231
  • Plummer and Manchester, 2010. Viral nanoparticles and virus-like particles: platforms for contemporary vaccine design. John Wiley & Sons, Inc. WIRES Nanomedicine and Nanobiotechnology. DOI: 10.1002/wnan.1 19 Ke-Qin Xin et al. Blood 102 (1 ), 223-228 (1 July 2003)
  • Jae-Sung Yu et al. Clinical and Vaccine Immunology 13(1 1 ), 1204-121 1 (Nov. 2006) Scholzen e Gerdes. J. Cell Physiol. 182,31 1 -322 (March 2000)
  • Muhl, et al. MHC class I alleles influence set-point viral load and survival time in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys. J Immunol 169, 3438-3446
  • (2002) Loffredo et al. Mamu-B*08-positive macaques control simian immunodeficiency virus replication. Journal of virology 81 , 8827-8832 (2007) Sarantopoulos et al. Qa-1 restriction of CD8 + suppressor T cells.
  • The Journal of clinical investigation 114, 1218-1221 (2004)
  • Jiang ei al. HLA-E-restricted regulatory CD8(+) T cells are involved in development and control of human autoimmune type 1 diabetes. The Journal of clinical investigation 120, 3641 -3650 (2010)
  • Van Kaer, L. Comeback kids: CD8(+) suppressor T cells are back in the game. The Journal of clinical investigation 120, 3432-3434 (2010)
  • Marchetti, P., et al. Mitochondrial permeability 10 transition is a central coordinating event of apoptosis. The Journal of experimental medicine 184, 1 155-1 160 (1996)

Claims (11)

  1. Composipao farmaceutica caracterizada pelo fato de que compreende uma mistura de particulas virais de HIV inativadas e uma bacteria nao patogenica, em que a referida bacteria nao patogenica e uma bacteria de Lactobacillus ou BCG.
  2. Composipao farmaceutica, de acordo com a reivindicapao 1, caracterizada pelo fato de que e uma composipao farmaceutica mucosal ou intradermica ou intraepitelial.
  3. Composipao farmaceutica, de acordo com a reivindicapao 2, caracterizada pelo fato de que e uma composipao farmaceutica oral.
  4. Uso de uma composipao farmaceutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicapoes 1 a 3, caracterizado pelo fato de que e para a produpao de um medicamento para prevenir e/ou tratar uma doenpa provocada por HIV em um humano em necessidade do mesmo.
  5. Uso de uma composipao farmaceutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicapoes 1 a 3, caracterizado pelo fato de que e para a produpao de um medicamento para proteger um humano contra HIV.
  6. Uso de uma composipao farmaceutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicapoes 1 a 3, caracterizado pelo fato de que e para a produpao de um medicamento para proteger um humano da soroconversao por HIV.
  7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicapoes 4 a 6, caracterizado pelo fato de que induz e preferivelmente mantem uma protepao imune especifica de antigeno contra HIV em um humano.
  8. Uso, de acordo com a reivindicapao 7, caracterizado pelo fato de que a referida protepao imune e definida pela redupao e preferivelmente a supressao de uma carga viral de HIV no referido humano.
  9. Uso, de acordo com a reivindicapao 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a referida protepao imune e definida por celulas T regulatorias CD8+ suprimindo a ativapao de celulas T CD4+ de apresentapao ao antigeno Gag e/ou Pol de HIV no referido humano.
  10. Uso, de acordo com a reivindicapao 9, caracterizado pelo fato de que a referida protepao imune e determinada no referido humano pela detecpao in vitro da presenpa ou da atividade de celulas T regulatorias CD8+ provenientes do referido humano e em que as referidas celulas T regulatorias CD8+ sao celulas T regulatorias CD8+ restritas ao MHC-Ib/E.
  11. Kit farmaceutico caracterizado pelo fato de que compreende: - em um primeiro recipiente, particulas virais de HIV inativadas; e - em um segundo recipiente, uma bactéria viva não patogênica selecionada dentre Lactobacillus e BCG, o referido antígeno e a referida bactéria estando em veículos farmaceuticamente aceitáveis para administração mucosal ou intradérmica ou intraepitelial.
BR112013025481A 2011-04-06 2012-04-06 Composições farmacêuticas, uso destas e kits para prevenir e/ou tratar uma doença por hiv em humanos BR112013025481B8 (pt)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2011/072481 2011-04-06
CNPCT/CN2011/072481 2011-04-06
US201161534088P 2011-09-13 2011-09-13
US61/534,088 2011-09-13
CNPCT/CN2012/070761 2012-01-30
CNPCT/CN2012/070761 2012-01-30
US201261609051P 2012-03-09 2012-03-09
US61/609,051 2012-03-09
PCT/IB2012/000857 WO2012137071A2 (en) 2011-04-06 2012-04-06 Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an hiv disease in humans

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BR112013025481A2 BR112013025481A2 (pt) 2018-12-11
BR112013025481B1 true BR112013025481B1 (pt) 2020-06-23
BR112013025481B8 BR112013025481B8 (pt) 2022-11-22

Family

ID=46969619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112013025481A BR112013025481B8 (pt) 2011-04-06 2012-04-06 Composições farmacêuticas, uso destas e kits para prevenir e/ou tratar uma doença por hiv em humanos

Country Status (19)

Country Link
US (1) US9839684B2 (pt)
EP (3) EP2694101B1 (pt)
JP (1) JP6054370B2 (pt)
KR (1) KR101814857B1 (pt)
CN (1) CN105709221B (pt)
AP (1) AP2013007166A0 (pt)
AU (1) AU2012238351B2 (pt)
BR (1) BR112013025481B8 (pt)
CA (1) CA2832022C (pt)
CL (1) CL2013002836A1 (pt)
DK (1) DK2694101T3 (pt)
ES (1) ES2606511T3 (pt)
IL (1) IL228666A (pt)
MX (1) MX343037B (pt)
PL (1) PL2694101T3 (pt)
PT (1) PT2694101T (pt)
RU (1) RU2609769C2 (pt)
SG (1) SG194079A1 (pt)
WO (1) WO2012137071A2 (pt)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL159048A0 (en) * 2001-06-21 2004-05-12 Genentech Inc Sustained release formulation
JO3753B1 (ar) 2011-10-14 2021-01-31 Otsuka Pharma Co Ltd قرص يتألف من 7-[4-(4-بينزو[بي]ثيوفين-4-ايل-ببرازين-1-1ايل)بوتكسيل]-1اتش-كوينولين-2-وان أو ملح منه
JP6464201B2 (ja) * 2015-01-30 2019-02-06 国立大学法人 東京大学 乳酸菌含有組成物、ｈｐｖ感染症及びｈｐｖ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物、及び粘膜免疫誘導剤
US11077185B2 (en) 2019-03-21 2021-08-03 21C Bio Vaccine to pathogenic immune activation cells during infections
AU2020243095A1 (en) * 2019-03-21 2021-10-21 21C Bio Vaccine to pathogenic immune activation cells during infections
KR102507852B1 (ko) * 2020-01-10 2023-03-09 이뮤노바이옴 주식회사 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주, 균주 유래 다당체 및 이의 용도
EP4288091A1 (en) * 2021-02-02 2023-12-13 Provaxus, Inc. Novel immunomodulation platform and methods of use

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0243029A1 (en) 1986-04-08 1987-10-28 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus gene
JPS6485072A (en) 1987-09-25 1989-03-30 Nat Inst Health Recombinant vaccinia virus
JPH01148183A (ja) 1987-12-04 1989-06-09 Hiroshi Shibuta 組み換えワクチニアウイルス
JP3140757B2 (ja) 1989-02-06 2001-03-05 デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート パッケージング欠陥ｈｉｖプロウイルス、細胞系及びその使用
GB8923123D0 (en) 1989-10-13 1989-11-29 Connaught Lab A vaccine for human immunodeficiency virus
US5861282A (en) 1989-10-16 1999-01-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Non-infectious HIV particles and uses therefor
HUT60506A (en) 1989-11-20 1992-09-28 Oncogen Process for producing non-replicable, recombinant retrovirus particles and antiviral and immunogenic preparations
ES2140380T5 (es) 1990-03-21 2005-03-16 Geneart Gmbh Secuencias de adn que codifican polipeptidos gag retroviricos modificados y vacunas que las contienen o agregados de las mismas.
MY109299A (en) 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
WO1992015672A1 (en) 1991-03-07 1992-09-17 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US5766598A (en) 1991-03-07 1998-06-16 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canarypoxvirus expression vectors containing heterologous DNA segments encoding lentiviral gene products
EP1156102A1 (en) 1991-06-14 2001-11-21 Virogenetics Corporation Immunodeficiency virus recombinant poxvirus vaccine
DE69133333T2 (de) 1991-08-26 2004-07-29 Baxter Healthcare S.A. Ein intaktes FPV-tk-Gen enthaltender rekombinanter Virus der Vogelpocken
DE4141741A1 (de) 1991-12-13 1993-06-17 Gisela Kielmann Verfahren zur bekaempfung des human imune deficiency virus
US6511845B1 (en) 1992-08-07 2003-01-28 Alan R. Davis Methods for producing an immune response against HIV-1
US6136318A (en) 1993-02-26 2000-10-24 Cochran; Mark D. Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
WO1995007099A1 (fr) 1993-09-09 1995-03-16 The Nisshin Oil Mills, Ltd. Vaccin et procede pour sa production
JPH07170982A (ja) 1993-09-09 1995-07-11 Nisshin Oil Mills Ltd:The ワクチンおよびその製造方法
US6080408A (en) 1994-08-22 2000-06-27 Connaught Laboratories Limited Human immunodeficiency virus type 1 nucleic acids devoid of long terminal repeats capable of encoding for non-infectious, immunogenic, retrovirus-like particles
AU3958895A (en) 1994-10-18 1996-05-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Membrane expression of heterologous genes
AU729518B2 (en) 1995-06-07 2001-02-01 Syntro Corporation Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
US5741492A (en) 1996-01-23 1998-04-21 St. Jude Children's Research Hospital Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
JPH1085072A (ja) 1996-09-13 1998-04-07 Kichinosuke Takemaru 家具転倒防止器具
US6001155A (en) 1997-03-17 1999-12-14 Pease; John R. Polyphasic pressurized homogenizer
HRP980143A2 (en) * 1997-04-09 1999-02-28 Soo Sung Ko 4,4-disubstituted-3,4-dihydro-2 (1h)-quinazolinones useful as hiv reverse transcriptase inhibitors
US5895758A (en) * 1997-06-10 1999-04-20 Bio-Energy Systems Strain of lactobacillus Plantarum
WO1998056931A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Institut Pasteur Attenuated recombinant mycobacteria useful as immunogens or as vaccine components
JP3899165B2 (ja) 1997-08-06 2007-03-28 ビー・エル・オートテック株式会社 ロボットアームの過負荷保護装置
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6121021A (en) 1997-12-16 2000-09-19 Connaught Laboratories Limited Constitutive expression of non-infectious HIV-like particles
US7189402B1 (en) 1998-02-06 2007-03-13 Research Development Foundation Live vaccine for human immunodeficiency virus
US6828460B2 (en) 1999-03-22 2004-12-07 Pfizer Inc. Resorcinol derivatives
US20040009936A1 (en) 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
CA2378539A1 (en) 1999-07-06 2001-01-11 Merck & Co., Inc. Adenovirus carrying gag gene hiv vaccine
EP1084709A1 (en) 1999-09-17 2001-03-21 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Oral recombinant lactobacilli vaccines
JP2003512077A (ja) 1999-10-26 2003-04-02 インターナショナル エイズ バクシーン イニシアティブ アルファウイルスレプリコンを発現する侵襲性細菌
US20040105871A1 (en) 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
US6544780B1 (en) 2000-06-02 2003-04-08 Genphar, Inc. Adenovirus vector with multiple expression cassettes
US20020155127A1 (en) 2000-06-02 2002-10-24 Danher Wang Genetic vaccine against human immunodeficiency virus
WO2002022080A2 (en) 2000-09-15 2002-03-21 Merck & Co., Inc. Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized hiv1-gag, pol, nef and modifications
US6733993B2 (en) 2000-09-15 2004-05-11 Merck & Co., Inc. Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications
US20040101957A1 (en) 2001-09-14 2004-05-27 Emini Emilio A. Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized hiv1-gag, pol.nef and modifications
WO2002031168A2 (en) 2000-10-10 2002-04-18 Genstar Therapeutics Minimal adenoviral vector and recombinant vaccines based thereon
GB0030857D0 (en) 2000-12-18 2001-01-31 Medical Res Council Therapeutic compositions
KR20020059856A (ko) 2001-01-08 2002-07-16 김철중 에이치아이브이 유사입자의 제조
AU2002252199B2 (en) 2001-03-08 2008-01-03 Emory University MVA expressing modified HIV envelope, GAG, and POL genes
WO2002102409A1 (en) 2001-06-19 2002-12-27 Medical Research Council Inactivated mycobacterial ompatb and uses thereof
AU2002332736A1 (en) 2001-08-30 2003-03-18 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of New adenovirus type 7 vectors
US20070077257A1 (en) 2001-09-14 2007-04-05 Emini Emilio A Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing condon optimized HIV1-Gag, Pol, Nef and modifications
CA2467271A1 (en) 2001-11-14 2003-06-26 Novavax, Inc. Mycobacterial vaccine
WO2003050238A2 (en) 2001-12-11 2003-06-19 University Of Iowa Research Foundation Receptor-targeted adenoviral vectors
US20040009937A1 (en) 2002-01-31 2004-01-15 Wei Chen Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system
WO2003063786A2 (en) 2002-01-31 2003-08-07 Symbigene, Inc. Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system
DE60326444D1 (de) 2002-04-26 2009-04-16 Inst Clayton De La Rech Verbesserte chimäre glykoproteine und pseudotypisierte lentivirale vektoren
JP2003321391A (ja) 2002-04-30 2003-11-11 Japan Science & Technology Corp 組換えワクシニアウイルスを用いたｈｉｖワクチン
DE10221411B4 (de) 2002-05-14 2004-07-08 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Rekombinantes Fowlpox-Virus
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
CA2487895A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Ciphergen Biosystems, Inc. Defensins: use as antiviral agents
CN1490056A (zh) 2002-10-18 2004-04-21 ��¡���ɵ°��̲��о����� 针对hiv-1的免疫方法和组合物
WO2004087201A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mva virus expressing modified hiv envelope, gag, and pol genes
JP2007518460A (ja) 2003-05-09 2007-07-12 イントラヴァック インコーポレーテッド 皮内、皮下及び筋肉内注射用の無針注射器及びアンプル
WO2005017208A1 (en) 2003-07-31 2005-02-24 George Mason Intellectual Properties, Inc. Compositions and methods for treating or preventing hiv infection
AU2004269379A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-10 The Immune Response Corporation Immunogenic HIV compositions and related methods
JP2007037402A (ja) 2003-11-28 2007-02-15 Primmune:Kk 抗ヒト免疫不全ウイルス感染防御用キメラ５型／３５型アデノウイルスベクター
WO2005111205A1 (en) 2004-05-18 2005-11-24 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Tuberculosis vaccine
US8541167B2 (en) * 2004-06-03 2013-09-24 Saint Louis University Methods and compositions for vaccination
WO2006012320A1 (en) 2004-06-25 2006-02-02 Dow Agrosciences Llc Process for the preparation of 4-trifluoromethyl-2(1h)-pyridinone
WO2006026667A2 (en) 2004-08-27 2006-03-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant mva viruses expressing glade a/g, clade b, and clade c modified hiv, gag and pol genes
CN101056977B (zh) * 2004-10-04 2013-01-30 拜欧瓦克西姆有限公司 用于治疗hiv感染患者的亚型匹配的灭活全病毒疫苗
EP1856143A2 (en) 2005-02-24 2007-11-21 Medical Research Council Hivcon: anhiv immunogen and uses thereof
AU2006245920A1 (en) 2005-05-12 2006-11-16 Glaxo Group Limited Vaccine composition
EP1723965A1 (en) 2005-05-18 2006-11-22 Stallergenes Sa Compositions for antigen-specific induction of immuno-tolerance via oral immunization
WO2007140613A1 (en) 2006-06-06 2007-12-13 Mcgill University Fermented milk product and use thereof
JP5713672B2 (ja) 2007-04-12 2015-05-07 ジェニファー ライター， 結核のワクチンおよびその使用方法
WO2009093900A1 (en) 2008-01-25 2009-07-30 Stichting Top Institute Food And Nutrition Mid-log phase lactic acid bacteria for inducing immune tolerance in a subject

Also Published As

Publication number Publication date
MX2013011540A (es) 2014-04-16
ES2606511T3 (es) 2017-03-24
RU2609769C2 (ru) 2017-02-02
KR20140042800A (ko) 2014-04-07
EP3173096A1 (en) 2017-05-31
US9839684B2 (en) 2017-12-12
CL2013002836A1 (es) 2014-07-25
RU2013147745A (ru) 2015-05-20
CN105709221A (zh) 2016-06-29
CN105709221B (zh) 2020-11-17
CA2832022A1 (en) 2012-11-10
IL228666A0 (en) 2013-12-31
US20140302089A1 (en) 2014-10-09
CA2832022C (en) 2019-01-08
AU2012238351A1 (en) 2013-10-24
JP6054370B2 (ja) 2016-12-27
JP2014511856A (ja) 2014-05-19
AU2012238351B2 (en) 2016-11-24
KR101814857B1 (ko) 2018-01-04
EP3000476A1 (en) 2016-03-30
WO2012137071A3 (en) 2012-11-29
NZ616283A (en) 2014-10-31
BR112013025481A2 (pt) 2018-12-11
DK2694101T3 (en) 2017-01-09
AP2013007166A0 (en) 2013-10-31
PT2694101T (pt) 2016-12-19
SG194079A1 (en) 2013-11-29
PL2694101T3 (pl) 2017-07-31
WO2012137071A2 (en) 2012-10-11
EP2694101B1 (en) 2016-09-14
EP2694101A2 (en) 2014-02-12
MX343037B (es) 2016-10-20
BR112013025481B8 (pt) 2022-11-22
IL228666A (en) 2017-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2832022C (en) Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an hiv disease in humans
US10849971B2 (en) Compositions and methods for the treatment or prevention of human immunodeficiency virus infection
JP2007528368A (ja) シクロフィリンａ結合部位に基づく免疫原性組成物およびワクチンの開発方法
Cayabyab et al. Current and novel approaches to vaccine development against tuberculosis
Andrieu et al. Mucosal SIV vaccines comprising inactivated virus particles and bacterial adjuvants induce CD8+ T-regulatory cells that suppress SIV-positive CD4+ T-cell activation and prevent SIV infection in the macaque model
Kraehenbuhl et al. Mucosal vaccines: where do we stand?
Sun et al. Dendritic cell-targeted recombinantLactobacilli induce DC activation and elicit specific immune responses against G57 genotype of avian H9N2 influenza virus infection
Nardelli et al. Oral administration of an antigenic synthetic lipopeptide (MAP-P3C) evokes salivary antibodies and systemic humoral and cellular responses
Poles et al. Induction of intestinal immunity by mucosal vaccines as a means of controlling HIV infection
WO2012137072A1 (en) Therapeutic vaccine compositions inducing tolerance to hiv for treating hiv infections in humans
CN107899009B (zh) 用于预防和/或治疗人中的hiv疾病的药物组合物
WO2013010300A1 (zh) 四种及四种以上载体的hiv组合疫苗及应用
ANDRIEU et al. Sommaire du brevet 2832022
Feng et al. A novel recombinant bacterial vaccine strain expressing dual viral antigens induces multiple immune responses to the Gag and gp120 proteins of HIV-1 in immunized mice
NZ616283B2 (en) Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an hiv disease in humans
OA17025A (en) Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an HIV disease in humans.
Guo et al. Immune responses induced by Mycobacterium tuberculosis heat-resistant antigen (Mtb-HAg) upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin in mice
Aghasadeghi et al. Induction of strong and specific humoral and T-helper 1 cellular responses by HBsAg entrapped in the methanobrevibacter smithii archaeosomes
Mata et al. Listeria monocytogenes as an alternative vaccine vector for HIV
Poonam Induction of strong cellular immune responses in the gut mucosa against HIV-1 using a combination vaccine of recombinant Clostridium perfringens and HIV-1 virus like particles
Kraynyak Modulation of the immune response at systemic and mucosal sites by DNA vaccine adjuvants in HIV and influenza models

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B65X Notification of requirement for priority examination of patent application
B65Y Grant of priority examination of the patent application (request complies with dec. 132/06 of 20061117)
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/04/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: BIOVAXIM LIMITED (GB) ; INSTITUTE DE RECHERCHE POUR LE DEVELOPPEMENT (I.R.D) (FR) ; UNIVERSITE DE PARIS (FR)

B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: BIOVAXIM LIMITED (GB) ; INSTITUTE DE RECHERCHE POUR LE DEVELOPPEMENT (I.R.D) (FR) ; UNIVERSITE PARIS CITE (FR)

B21F Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time

Free format text: REFERENTE A 11A ANUIDADE.

B24J Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12)

Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2717 DE 31-01-2023 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.