JP2014511856A

JP2014511856A - ヒトにおけるｈｉｖ疾患を予防するおよび／または治療するための医薬組成物

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Publication number: JP2014511856A
Application number: JP2014503228A
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Inventors: ジャン−マリー・アンドリュー; ルイ・ルー
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Priority date: 2011-04-06
Filing date: 2012-04-06
Publication date: 2014-05-19
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Abstract

本発明は、特異的なHIV抗原および非病原性生細菌の混合物を含む医薬組成物に関する。前記特異的HIV抗原は、Gagおよび/またはPolタンパク質由来の1つまたは複数のエピトープを含み、好ましくは粒子形態をしている。前記細菌は、好ましくは、ラクトバチルスプランタルムである。これらの組成物は、ヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するのに有用である。

Description

本発明は、特異的HIV抗原および非病原性細菌の混合物を含む医薬組成物に関する。前記特異的HIV抗原は、Gagおよび/またはPolタンパク質由来の1つまたは複数のエピトープを含み、好ましくは粒子形態をしている。前記細菌は、好ましくは、ラクトバチルスプランタルム(Lactobacillus plantarum)である。これらの組成物は、ヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するのに有用である。

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の発見後25年以上経ち、世界保健機関(World Health Organization)および国連合同エイズ計画(Joint United Nations Program on HIV/AIDS)の最近の予測は、大流行が現在の速度で進行すると、2011年までに感染症が3000万を超えるであろうということを示している。

しかしながら、HIV感染症の予防のための有効な治療を見つけるための相当な研究努力にもかかわらず、2つの最近試験された予防ワクチンは、失敗した(Mc Elrathら、2008)または限られた成果しかもたらさなかった(Rerks-Ngarmら、2009)。

Jae-Sung Yuら(Clinical and Vaccine Immunology、Nov. 2006、vol 13、No. 11、1204-1211)は、表面、細胞内、または分泌タンパク質のいずれかとしてHIV-1 グループM コンセンサスenv遺伝子CON6を発現するように構築された組換えスメグマ菌ベクターを記載した。著者らは、マウスにおいて、組換えスメグマ菌が、粘膜表面でのHIV-1 T細胞応答の誘発について免疫原性であることを実証することができた。

Ke-Qin Xinら(Blood、1 July 2003、vol 102、No. 1、223-228)は、その細胞表面上にHIV-1 EnvのV2-V4ループを発現する組換えラクトコッカスラクティス(Lactococcus lactis)ベクターを記載した。このベクターを用いるマウスの経口免疫は、
-高度なレベルのHIV特異的血清IgGおよび糞便IgA抗体の両方の検出によって示される粘膜および体液性免疫応答ならびに
-HIV特異的IFN-ガンマ分泌細胞の数の増加によって示される細胞性免疫応答を誘発した。

ラクトコッカスラクティス細胞表面上に適切に発現するために、1kb以下の遺伝子セグメントを使用することができた。

HIV病原性および予防に関与するほとんどの科学者らは、人間においてHIV感染症を予防するまたは治療するためのHIV予防ワクチンまたは他の生物学的組成物を試験する前に、非ヒト霊長類においてそれらの相当物を試験することがより建設的であろうと感じる(Morgan C,ら、2008)。最適な非ヒト霊長類は、アカゲザルであり、マカクの中で、サル免疫不全ウイルス(SIV)239が感染した中国起源のマカクが、ヒトにおけるHIV感染症の発生についてのほとんどの臨床的、ウイルス学的、および免疫学的側面を模倣する最良のモデルであることがこれまでに決定的に示されてきた(Marcondes MC,ら 2006; Stahl-Hennig C,ら 2007; Chen Sら 2008)。

最後に、科学界は、現在、一度、SIV 239に対する有効な予防生物学的組成物またはワクチンがマカクにおいて発見されたら、十中八九、AIDSからヒトを保護するために、それをヒトにうまく適応することができるはずであることに同意している。

科学界の絶え間ない研究努力にもかかわらず、予防および治療上の効率的な戦略が世界的なAIDS大流行と戦うために待ち望まれ続けている。

様々な細菌は、対象への投与に際して興味深いアジュバント活性および免疫調節性の特性を有することが記載されている。特に、乳酸菌は、免疫系に対して寛容性効果を促すことが報告された。

たとえば、Stallergenes S.Aの名のもとに2006年11月23日に公開されたWO2006/123230は、対象への舌下、経舌、または経口投与に際して抗原特異的寛容性を誘発することができる免疫原性組成物中のアジュバントとしてビフィズス菌および乳酸菌から選択される細菌の使用を記載している。この免疫原性組成物は、アレルギー、自己免疫性疾患の治療のためにまたは移植片拒絶の予防のために使用されることが提唱される。

しかし、たとえば、Stichting Top Institute Food and Nutritionの名のもとに2009年7月30日に公開されたWO2009/093900は、かなりの量の対数中期(mid-log phase)の乳酸菌を含有する寛容原性組成物を記載している。この組成物は、対象に投与された場合に、非抗原特異的免疫寛容を誘発する。この組成物は、アレルギー、自己免疫性疾患、および腸の炎症性疾患などのような組織損傷に至り得る炎症応答と関連する状態または疾患を予防する、遅延させる、および/または治療するために使用されることが提唱される。

WO2006/123230 WO2009/093900 US5,919,458 EP386882 WO91/07425 US5,861,282 WO91/05864 WO02/053757 EP1499736 US2007/077257 US2007/054395 JP2007037402 WO2006/120034 US2004/253210 US2004/170647 US2005/070017 US2003/228329 US2004/101957 US2003/219458 US2004/009936 US2004/028652 WO03/050238 WO03/038057 WO03/020893 WO02/31168 WO02/22080 WO01/02607 US6716823 US5,766,598 EP0592546 US2007/048861 US2006/188961 US2006/134133 EP1789438 WO2005/017208 WO2004/035006 US2004/146528 JP2003321391 EP1378516 WO95/07099 JP7170982 DE4141741 EP0449116 JP1148183 JP1085072 EP0243029 US2005/287162 JP2004105187 JP2004089185 WO03/095656 WO96/40880 US6,136,318 US5,670,367 US7,189,402 WO96/11708 US7,229,625 US6,121,021 US6,923,970 US6,544,527 US6,451,322 US6,080,408 US6,001,155 WO2005/111205 WO02/102409 US7,122,195 US6,261,568 US7,393,541 WO2008/128065 WO2007/140613 US6,933,319 WO2004/101025

Jae-Sung Yuら(Clinical and Vaccine Immunology、Nov. 2006、vol 13、No. 11、1204-1211) Ke-Qin Xinら(Blood、1 July 2003、vol 102、No. 1、223-228) Huら、JAMA 275:210-216、1996; Korberら、Science 280: 1868-1871、1998 Papathanasopoulos MAら Virus Genes 2003、26: 151-163 RAVIVら(J. Virol.、vol.79(19)、12394〜12400頁、2005) Scholzen and Gerdes. J. Cell Physiol. 182、311-322 (March 2000) Chien (Novel Drug delivery system、Chapters 3 through 6 and 9、Marcel Dekker、1992) Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed. (various editors、1989-1998、Marcel Dekker) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (ANSELら、1994、WI LLIAMS & WILKINS) Chien、Novel Drug Delivery Systems、Ch. 4 (Marcel Dekker、1992) Ebadi、Pharmacology、Little, Brown and Co.、Boston、Mass. (1985)

発明者らは、驚くべきことに、下記の実施例において記載されるオリジナルの医薬組成物が、マカクにおけるSIVに対して効率的な抗原特異的免疫保護を誘発したことを示すことができた。さらに、前記SIV特異的免疫保護が誘発された場合、発明者らは、それが、インビボにおいてSIV複製/伝播および感染症の続く確立を予防したことを示した。

実際、発明者らは、驚くべきことに、粘膜にまたは皮内もしくは上皮内ルートのいずれかによる本明細書で開示される医薬組成物の投与に際して、ウイルス複製が、著しく阻害されたまたはさらに抑止されたもしくは予防されたことを示した。

実際に、発明者らは、非細胞傷害性CD8+T細胞応答が、マカクにおいてSIV抗原提示CD4+T細胞の早期活性化を抑制することを初めて観察することができた。したがって、理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明による医薬組成物は、対象への粘膜または皮内もしくは上皮内投与に際して、予想外の新しいタイプのウイルス特異的免疫寛容を誘発する。この免疫寛容は、HIV Gagおよび/またはPol抗原特異的抑制性CD8+T細胞誘発免疫寛容であるように思われ(「T抑制性」免疫寛容について本明細書において「Ts」免疫寛容とも命名した)、これは、MHC(「主要組織適合遺伝子複合体」)-Ib/E拘束性であり、非細胞傷害性である。

本明細書において報告される結果を考慮して、ヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するために上記に定義される「Ts」免疫寛容を達成することができる新規な医薬組成物が本発明によって提供される。

本発明の目的は、したがって、抗原および非病原性生細菌の混合物を含む医薬組成物を提供することであり、好ましくは、前記抗原が、粒子でありならびに/またはそれが、HIV Gagおよび/もしくはPolタンパク質由来の1つまたは複数のエピトープを有し、前記細菌が、好ましくは、ラクトバチルスプランタルムである。

本発明の他の目的は、ワクチンとして使用するための、本明細書において記載される医薬組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、その必要のあるヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するための方法であって、前記ヒトに、上記に言及される医薬組成物の有効量を粘膜に(好ましくは経口的に)または皮内にもしくは上皮内に投与する工程を少なくとも含む方法を提供することである。

本発明の他の目的は、HIVからヒトを保護するための方法であって、前記ヒトに、上記に言及される医薬組成物の有効量を粘膜に(好ましくは経口的に)または皮内にもしくは上皮内に投与する工程を少なくとも含む方法を提供することである。

本発明の他の目的は、HIVセロコンバージョンからヒトを保護するための方法であって、前記ヒトに、上記に言及される医薬組成物の有効量を粘膜に(好ましくは経口的に)または皮内にもしくは上皮内に投与する工程を少なくとも含む方法を提供することである。

本発明の他の目的は、その必要のあるヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するための医薬キットであって、
-第1の容器中に抗原および
-第2の容器中に非病原性細菌
を含み、前記抗原および前記細菌が、粘膜または皮内もしくは上皮内投与のための薬学的に許容できるキャリア中にあり、好ましくは、前記抗原が、粒子でありならびに/またはそれが、HIV Gagおよび/またはPolタンパク質由来の1つまたは複数のエピトープを有し、前記細菌が、好ましくは、ラクトバチルスプランタルムである、医薬キットを提供することである。

本発明は、下記の非限定的な実施例において言及される以下の図によって示される。

膣内iSIV/BCGにより前処理したアカゲザルの静脈内(i.v.) SIVmac239の抗原投与を示す図である。膣内iSIV/BCGにより前処理したアカゲザルの直腸内(i.r.) SIVmac239の抗原投与を示す図である。膣内iSIV/BCGにより前処理したアカゲザルのSIVmac239の繰り返し抗原投与(i.v.によって3回およびi.r.によって2回)を示す図である。膣内iSIV/BCGおよび皮内ブースターにより前処理したアカゲザルの静脈内SIVmac239抗原投与を示す図である。膣内iSIV/BCGおよび皮内ブースターにより前処理したアカゲザルの直腸内SIVmac239抗原投与を示す図である。経口iSIV/BCGにより前処理したアカゲザルの直腸内SIVmac239抗原投与を示す図である。膣内iSIV/BCGにより前処理したアカゲザルから得られたCD8+T細胞のインビトロにおける抗ウイルス活性を示す図である。経口iSIV/BCGにより前処理した4頭のアカゲザルから得られたCD8+T細胞のインビトロにおける抗ウイルス活性を示す図である。経口iSIV/BCGにより前処理した4頭のアカゲザルから得られた自己由来のCD8+T細胞によるCD4+T細胞活性化のSIV特異的抑制を示す図である。 iSIV/LP、iSIV、またはLPにより前処理したアカゲザルから採取した血漿試料における抗SIV IgG抗体力価を示す図である。 iSIV/LP、iSIV、またはLPにより前処理したアカゲザルから採取したPBMC試料におけるSIV特異的T細胞増殖を示す図である。 CD8またはCD25T細胞の存在下または非存在下におけるインビトロにおける刺激に際してのSIV特異的IFN-ガンマ分泌T細胞を示す図である。経口LP(n=4)またはiSIV(n=3)により前処理した動物と比較した、経口iSIV/LPにより前処理した8頭のアカゲザルから得られた自己由来のCD8+T細胞によるCD4+T細胞活性化のSIV特異的抑制を示す図である。 iSIV/LP調製物の胃内投与の後の60日後のSIV特異的CD8+T細胞:SEBおよび抗CD3/CD28刺激ありまたはなしでの、CD8+T細胞の存在下におけるAT-2 SIV適用CD4+T細胞またはヒトナチュラルキラー細胞(hNK)の存在下におけるK562(対照)の細胞傷害性を示す図である。経口LP(n=4)またはiSIV(n=3)により前処理した動物と比較した、経口iSIV/LPにより前処理した8頭のアカゲザルから得られた自己由来のCD8+T細胞インビトロにおける抗ウイルス活性(CD4細胞における)を示す図である。経口iSIV/LPの処理の80日後の、8頭のアカゲザルのうちの4頭から得られた異種または同種異系CD8+T細胞のインビトロにおける抗ウイルス活性(CD4細胞における)を示す図である。〜遅発(c)、インサート(d)、同種異系(e)培養系における、抗MHC-Ia/ABCまたは抗MHC-Ib/E(f)の存在下における、TCRγδ⁺またはVβ8⁺サブセットを枯渇させたCD8+T細胞(g)における、経口免疫の60日後のCD8+T細胞の抗SIV活性を示す図である。経口LPまたはiSIVにより前処理した動物と比較した、経口iSIV/LPにより前処理したアカゲザルにおける直腸内および静脈内SIVmac239抗原投与後の血漿ウイルス量レベル(1mlの血漿当たりのSIV RNAコピー)を示す図である。経口LPまたはiSIVにより前処理した動物と比較した、経口iSIV/LPにより前処理したアカゲザルにおける直腸内および静脈内SIVmac239抗原投与後の細胞性ウイルス量レベル(100万PBMC当たりのSIV DNAコピー)を示す図である。抗CD8抗体cMT807の注入による8頭のiSIV/LP処理マカクの末梢血およびリンパ節CD8+T細胞の枯渇を示す図である。a、cMT807の3回の注射を受ける前およびその後の末梢血CD8+T細胞数;b、cMT807の3回の注射を受ける前およびその後のリンパ節CD8+T細胞の%;c、cMT807の3回の注射を受ける前およびその後の血漿ウイルス量;d、cMT807の3回の注射を受ける前およびその後のPBMC DNA SIV量;e、cMT807の3回の注射を受ける前およびその後のリンパ節SIV DNA量。 iSIVおよびLPからできている経口調製物により免疫化した8頭のアカゲザルならびに2頭のさらなるナイーブサルにおける、SIVB670により直腸内に実行した第3の直腸内抗原投与後の血漿(a)およびPBMC(b)ウイルス量を示す図である。 iSIVおよびLPによる胃内免疫化(iSIV/LP免疫化第2)後のインビトロおよびインビボにおけるCD8+T細胞媒介性抗ウイルス活性を示す図である。a、直腸内に抗原投与される8頭のアカゲザルにおける免疫化後の60〜420日の間のCD8+T細胞の抗SIV活性(ウイルス抑制の倍数);bおよびc、経口iSIV/LPにより免疫化したそれらの8頭のアカゲザルおよびLPのみ(n=4)またはiSIV(n=4)のみにより処理した8頭の対照サルの直腸内SIVmac239抗原投与後の血漿および細胞性ウイルス量。 8頭のマカクにおけるSIVmac239の直腸内抗原投与(iSIV/LP免疫化第2)後の直腸粘膜上皮内リンパ球(IPL)(a〜b)、基底膜細胞(LPC)(c〜d)、および骨盤リンパ節(PLN)(e)におけるSIV DNAおよびRNA量を示す図である。

本発明は、抗原および非病原性生細菌の混合物を含む医薬組成物に関する。

抗原
突然変異、組換え、挿入、および/または欠失に起因するHIVゲノムにおける多大な多様性により、HIVは、グループ、サブグループ、タイプ、サブタイプ、および遺伝子型に分類されてきた。HIVゲノムが絶えず突然変異するので、2つの主なHIVグループ(HIV-1およびHIV-2)ならびに多くのサブグループがある。グループおよびサブグループの間の主な差異は、ウイルスエンベロープと関連する。HIV-1は、主なサブグループ(M)に分類され、前記サブグループMは、A〜Jと呼ばれる9つのサブタイプ(クレードまたはサブタイプ)(Huら、JAMA 275:210-216、1996; Korberら、Science 280: 1868-1871、1998)および第10の分類外(outlier)サブグループ(O)に分けられる。以前のサブグループのインビボにおける組換えに起因する他の多くのサブグループもまた、存在する(Papathanasopoulos MAら Virus Genes 2003、26: 151-163)。好ましくは、HIVウイルスは、その知られているおよびこれまでに知られていないクレードをすべて含むHIV-1またはHIV-2である。しかし、好ましくは、それは、HIV-1である。

本発明の関連において、「抗原」は、HIV起源由来のものであり、これは、それが、特異的なHIVグループ、サブグループ、タイプ、サブタイプ、またはいくつかのサブタイプの組み合わせと関係することを意味する。好ましくは、前記HIV抗原は、HIV-1またはHIV-2の抗原である。

前記抗原は、非感染性である。

HIV-1およびSIVの両方の主な標的であるCD4+T細胞の活性化が、ウイルス複製に直接貢献することは、科学界によって長い間疑われてきた(Andrieu and Lu、1995; Korin and Zack、1999)。しかしながら、CD4+T細胞活性化およびSIVまたはHIV感染方法の連続工程の間の相互作用が明らかにされたのはつい最近になってのことである。静止状態のCD4+T細胞において、ウイルス侵入は、入って来るビリオンのGagおよびPolタンパク質由来エピトープの形質膜での提示によって、進入後、2時間の範囲内で続いたが、EnvおよびNefタンパク質は、新規合成を必要とした(Sachaら、2007)。しかしながら、感染方法の続くフェーズ、すなわち、逆転写、その後に続くウイルス統合は、静止状態の細胞において非常に非効率的に発生した(Vatakisら、2009a and 2009b)。対照的に、形質膜でのGagおよびPolエピトープの提示前にまたはその後48時間以内にCD4+T細胞が活性化された場合、HIV/SIV逆転写およびDNA統合は非常に活性であり、これは、非常に効率的なウイルス複製および放出を可能にした(Vatakisら、2009a and 2009b)。

よって、発明者らは、HIV/SIV曝露後のHIV/SIV GagまたはPol特異的CD4+T細胞活性化の初期発生をインビボにおいて特異的に遮断することが、活性ウイルス複製の予防をもたらすであろうと仮定した。

これを念頭において、HIV Gagおよび/またはPol抗原提示CD4+T細胞の活性化の抑制を誘発し、その結果として、ウイルスに曝露されたヒトにおけるHIV複製および伝播をインビボにおいて予防するために、本発明の医薬組成物は、HIV Gagおよび/またはPolタンパク質由来の1つまたは複数のエピトープを好ましくは有するHIV抗原を含む。そのような抗原は、有利には、HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来するのいずれかである。

用語「HIVウイルスのGagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する抗原」は、したがって、
-少なくともGagおよび/もしくはPol(「Gagおよび/もしくはPolを含有する抗原」として)を含むまたは
-カプシドタンパク質(p24)およびマトリックスタンパク質(p17)などのようなGAGによってコードされる1つもしくは複数のタンパク質ならびに/またはインテグラーゼ、逆転写酵素、およびプロテアーゼなどのようなPOLによってコードされる1つもしくは複数のタンパク質を含む(「Gagならびに/またはPolに由来する抗原」として)または
-それらのタンパク質由来の1つもしくは複数のエピトープを含む(また「Gagおよび/もしくはPolに由来する抗原」として)HIV抗原を意味する。

特に、ENV、VIF、VPR、HIV-1についてのVPU、HIV-2についてのVPX、REV、NEF、TATなどからなる群において選択される任意の他のウイルスタンパク質またはそのエピトープは、本明細書で開示される医薬組成物中に含まれる抗原の必須の構成成分ではない。これらのタンパク質のいずれも、存在する場合、本明細書において開示される医薬組成物において使用されることとなる抗原の任意選択の構成成分にすぎない。

抗原は、好ましくは、粒子抗原である。これは、それが、好ましくは、ウイルス粒子、組換えウイルス粒子、ウイルス様粒子、Gagおよび/またはPol発現組換え細菌または菌類、それらの表面上に1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチドを提示するポリマー微粒子またはエピトープ(HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する)から選択されることを意味する。好ましくは、Gagおよび/またはPol由来の1つまたは複数のエピトープは、前記抗原によって産生されるまたはそれによって発現されるまたはその中に含有される。組換えウイルス粒子またはウイルス粒子もしくはGagおよび/またはPol発現組換え細菌もしくは菌類が使用される場合、これらは、好ましくは、不活性化微生物である。

抗原は、ウイルス粒子、組換えウイルス粒子、ウイルス様粒子、またはGagおよび/もしくはPol発現組換え細菌もしくは菌類であってもよい。それはまた、コンジュゲートまたはコンカテマーのいずれかの形態をした、組換えまたは組換えでない、1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチドであってもよい(HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する)。抗原は、そのうえ、ウイルス核酸非依存性である、すなわち、それは、非ウイルスDNAまたは非ウイルスRNA依存性である。

抗原は、適切な組換え微生物の中に有利に含有されるウイルス核酸配列の発現に起因してもよい。

本発明の医薬組成物の中に含有される抗原が、Gagおよび/またはPol発現組換え細菌である場合、前記組換え細菌は、好ましくは、これもまた組成物中に含まれる非病原性生細菌と異なる。

本発明による医薬組成物中の抗原が、1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチド(HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する)である場合、それは、好ましくは、粒子形態をしている。実際に、適切な粒子抗原は、発現されたHBsAgポリペプチドが、自己集合して、慢性HBV感染症を有する患者の血清において見つけられる天然の22nm粒子に非常に類似している免疫原性球状粒子になる組換えDNA B型肝炎ワクチンと同じ様式で、酵母などのような生微生物によって産生されてもよい(Plotkinら、2008)。

その代わりに、本発明による医薬組成物中の抗原が、1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチド(HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する)である場合、それは、コンジュゲートの形態をしている。そのような実施形態において、それが当技術分野においてよく知られているように、興味のあるタンパク質またはペプチドは、適切なキャリアに共有結合でコンジュゲートされる。市販で入手可能な従来のキャリアは、とりわけ、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)タンパク質、BSA(ウシ血清アルブミン)タンパク質、OVA(オバルブミン)タンパク質などのようなタンパク質である(これらは、好ましくはヒトに経口的に安全に投与できる)。適切なコンジュゲートを産生するための方法は、当業者によく知られている。

その代わりに、本発明による医薬組成物中の抗原が、1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチド(HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する)である場合、それは、コンカテマーの形態をしている。それが当技術分野においてよく知られているように、コンカテマーは、1つの高分子中に物理的に相互に連結される、興味のあるタンパク質またはペプチドの複数のコピーからできている。コンカテマーにおいて、興味のあるタンパク質またはペプチドのコピーはまた、別のものに直接連結することもできるまたはそれらは、合成アームによって分離することができる。コンカテマーは、したがって、興味のあるタンパク質またはペプチドの少なくとも2つのコピー、好ましくは10までのまたはそれ以上のコピーを含む。適切なコンカテマーを産生する方法は、当業者の一般知識である。

本明細書において使用されるように、「ウイルス様粒子」(VLP)は、成熟ビリオンに非常に類似しているが、前記ウイルスのウイルスゲノム物質を含有しない粒子を意味する。より正確には、偽ビリオンとも呼ばれるVLPは、複数のコピーのウイルスカプシドおよび/または他のウイルスタンパク質から構成されるサブユニット構造を示す。これらのウイルスタンパク質は、インビボにおいて、自己集合して、明確な球状の対称性のVLPになることができる。これらのVLPは、ウイルスタンパク質をコードするいかなる核酸分子をも含まず、より正確には、いかなる核酸分子をも含有しない。そのため、VLPは、事実上、複製にかかわらず、非感染性であり、これは、それらを、医薬組成物の形態での投与にとって安全にする。VLPを産生する方法は、当業者からよく知られている(たとえばLiewら、2010; Plummer and Manchester、2010を参照されたい)。VLPを産生する適切な方法の非限定的な例は、HIVゲノムもいかなる核酸分子も含まないHIV VLP(偽ビリオン)を開示するUS5,919,458、EP386882、WO91/07425、US5,861,282、およびWO91/05864において記載されている。

本明細書において使用されるように、「組換えウイルス粒子」は、異なるウイルス由来のタンパク質を含有する、またはその表面に曝露するウイルス粒子を意味する。そのほかに、組換えウイルス粒子はまた、HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチドまたはエピトープを含有する、産生する、またはその表面に曝露する細菌または他の宿主細胞を意味することもできる。

実際に、ほとんどの組換えウイルス粒子は、本来の構造タンパク質(すなわち主にエンベロープタンパク質およびコアタンパク質)の一部分が、他のウイルス由来の相当物であるタンパク質と交換されるウイルス粒子である。例として、エンベロープタンパク質を取り換えることができる。そのような場合、組換えウイルス粒子は、エンベロープタンパク質をコードする配列が他のウイルス由来のエンベロープタンパク質をコードする配列と取り換えられているウイルスゲノムで構成される「キメラ」ゲノムを含有する。ほとんどの組換えウイルス粒子は、複製性であり、感染性である。

本明細書において使用されるように、他のウイルス由来のタンパク質を含む組換えウイルスは、組換えウイルス粒子が、内部にまたはその表面に存在する、HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチドまたはエピトープを含有することを意味する。組換えウイルス粒子を産生する方法の非限定的な例は、
*アルファウイルスについては、HIV(ENVタンパク質)を発現する組換えアルファウイルスを開示するWO02/053757、
*レトロウイルスについては、キメラ糖タンパク質を発現するレンチウイルスベクターを開示するEP1499736、
*アデノウイルス(5、7、または35型など)については、HIVタンパク質を発現する組換えアデノウイルスを開示するUS2007/077257、US2007/054395、JP2007037402、WO2006/120034、US2004/253210、US2004/170647、US2005/070017、US2003/228329、US2004/101957、US2003/219458、US2004/009936、US2004/028652、WO03/050238、WO03/038057、WO03/020893、WO02/31168、WO02/22080、WO01/02607、およびUS6716823、
*ポックスウイルス(カナリアポックス、ワクシニア、ワクシニアアンカラ、および鶏痘ウイルス)については、HIVタンパク質を含むウイルスタンパク質を発現する組換えポックスウイルスを開示するUS5,766,598、EP0592546、US2007/048861、US2006/188961、US2006/134133、EP1789438、WO2005/017208、WO2004/035006、US2004/146528、JP2003321391、EP1378516、WO95/07099、JP7170982、DE4141741、EP0449116、JP1148183、JP1085072、EP0592546、EP0243029、US2005/287162、JP2004105187、JP2004089185、WO03/095656、EP0592546、WO96/40880、US6,136,318、US5,670,367、
*ウイルス由来の少なくとも1つのタンパク質をそれらの表面に含有する、産生する、または曝露する細菌については、HIV糖タンパク質(すなわちエンベロープタンパク質)を発現するサルモネラまたは大腸菌(E. coli)を開示するUS7,189,402およびWO96/11708に記載されている。

好ましくは、組換えウイルス粒子は、ポックスウイルスに対応し、このポックスウイルスは、カナリアポックス(たとえば、US5,766,598およびEP0592546において開示されているものなどのようなALVACウイルスベクター)、ワクシニア(たとえばWO95/07099において開示されているワクシニアウイルス)、ワクシニアアンカラ(たとえば、EP1789438において開示されているものなどのようなNYVACウイルスベクター)、ならびに鶏痘ウイルス(たとえば、WO03/095656において開示されているものなどのようなTROVACウイルスベクター)を含む群において好ましくは選択される。

より好ましくは、前記ポックスウイルスは、カナリア痘ウイルスである。カナリア痘ウイルスに相当し、HIVペプチド/タンパク質を発現する組換えウイルス粒子の例として、US5,766,598(6段18行目〜82段36行目への参照によって本明細書に組み込まれる)において開示されているALVACウイルスベクターを挙げることができ、このALVACベクターは、例として、HIV-1 gp120、HIV-1 gp160、HIV-1 envの切断可能でない分泌形態、膜貫通配列により固定されたHIV-1 gp120、HIV-1 gag/pol、HIV-1 gag/polおよびenv(gp120)、HIV-1 gag/polおよびenv(gp160)、ならびにHIV-1 gag/polおよびenv(膜貫通アンカーを有するgp120)を発現する。好ましくは、前記ALVACベクターは、HIV-1 gag/polおよびenv(gp120)を発現し、最も好ましくは、前記ALVACベクターは、ALVAC vCP1521である。

「ウイルス粒子」は、好ましくは、非感染性ウイルス粒子の産生をもたらす突然変異ウイルスゲノム(たとえば核酸突然変異、置換、または挿入による)を含有してもよい、SIVまたはHIVウイルス粒子などのようなSIVまたはHIV粒子である。

突然変異ウイルスゲノムを含有するウイルス粒子は、US7,229,625、US6,121,021、US6,923,970、US6,544,527、US6,451,322、およびUS6,080,408において開示されている。

有利には、また、ウイルス粒子または組換えウイルス粒子をヒトへの投与にとって安全にするために、前記ウイルス粒子または組換えウイルス粒子は、投与される前に不活性化される。そのような不活性化は、組換えウイルス粒子に、複製にかかわらないウイルス粒子でさえ、必要であってもよい。

本明細書において使用されるように、「不活性化ウイルス粒子」、組換えまたは組換えでない前記ウイルス粒子は、もはや感染性ではなく、好ましくは、もはや複製にかかわらないウイルス粒子を意味する。

ウイルス粒子または組換えウイルス粒子の不活性化のための方法は、当業者からよく知られている。ウイルス不活性化の非限定的な例は、ホルマリン、タウリンクロラミン、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、プロピオラクトン、ベータ-プロピオラクトン(REMUNE)、またはアルドリチオール-2(AT-2、US6,001,155を参照されたい)処理などのような化学的な不活性化、熱による不活性化、U.Vまたはガンマ線照射またはマイクロ波曝露などのような物理的な不活性化、およびその組み合わせを含む。HIV不活性化のための参考文献については、RAVIVら(J. Virol.、vol.79(19)、12394〜12400頁、2005)を参照されたい。

一実施形態によれば、前記不活性化は、ホルマリン、タウリンクロラミン、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、プロピオラクトン、ベータ-プロピオラクトン(REMUNE)、またはアルドリチオール-2不活性化を含む群において選択される化学的な不活性化である。

その代わりにまたはさらに、前記不活性化は、熱による不活性化である。そのような不活性化は、当業者からよく知られており、そのような方法の例として、実施例において開示されるものを挙げることができる。実際、発明者らは、化学的に(すなわちAT-2)および/または熱的に不活性化されたウイルスが、非病原性生細菌と組み合わせられた場合に保護免疫寛容を誘発することをマカクにおいて驚くべきことに確立した。

有利には、ヒトへの投与のために、ウイルス粒子は、典型的に、上記に言及される不活性化のうちの少なくとも2つの方法を使用して、少なくとも2回不活性化される。

好ましくは、さらに上記に言及されるように、本発明の医薬組成物において抗原として使用されるウイルス粒子(組換えまたは組換えでない、VLPまたはVLPでない)は、核酸(すなわちDNAまたはRNA)依存性ではなく、これは、ウイルス粒子がいかなるウイルスDNAもRNAも含有しないことを意味するまたはそれらがDNAまたはRNAを含有する場合、それは免疫原性における役割を有していない。

その代わりに、様々な構造をしており、HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチドまたはエピトープをそれらの表面上に提示するポリマー微粒子(マイクロカプセル、マイクロスフェアなどの形態をした)は、本発明による医薬組成物において抗原として使用されてもよい。そのような微粒子は、メタクリル化デキストラン、メタクリル化ポリ(エチレングリコール)、および/またはゼラチンなどのような適切な生物学的または化学的ポリマーからできていてもよく、その上に、HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来するHIVウイルスまたはウイルスタンパク質またはペプチドまたはエピトープが付着することができる。ポリマー微粒子の例は、文献において(たとえばWei Li Leeら(2010)、Sandriら(2007)、Goldbergら(2003)、Delie F. (1998)、Ponchelら(1998)、Mathiowitzら(1997)、Fasanoら(1997)、Chickeringら(1997)において)見つけることができる。

好ましい一実施形態において、本発明によるHIV-1医薬組成物における抗原は、HIV-1 Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチドまたはエピトープを発現することができる1つまたは複数のウイルス粒子である。その代わりに、本発明によるHIV-1医薬組成物における抗原は、HIV-1 Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチドまたはエピトープをそれらの表面上に提示する1つまたは複数のポリマー微粒子である。

好ましくは、本発明による医薬組成物において使用されることとなる抗原は、サイズが少なくとも約110kDaである。それは、好ましくは、サイズが少なくとも約120、130、140、150、160、170、180、190、200kDa、またはさらにそれ以上である。

本発明の関連において使用されることとなるウイルス抗原の有効量は、SIVまたはHIVウイルスに関して、共通の一般知識を使用し、また、以下に開示される実施例を考慮して、当業者によって容易に決定することができる。

例として、前記抗原が粒子抗原であり、より詳細にはウイルス粒子である場合、ウイルス粒子の量は、前記混合物の1ml当たり約10⁶〜約10¹²である。

非病原性細菌
マカクにおけるSIVにより発明者によって示されるように、上記に定義される適切な抗原と一緒に粘膜または皮内もしくは上皮内ルートによって投与される場合、医薬組成物中に含まれる非病原性生細菌は、前述の抗原に対する免疫寛容の状態を誘発し、好ましくは維持することができる。ヒトにおいて、これは、HIV疾患を予防するおよび/または治療することを可能にする。

前記細菌は、したがって、「寛容原性アジュバント」または「寛容原性キャリア」または「寛容原性ビヒクル」または「寛容性のキャリア」または「寛容化のキャリア」または「寛容性のためのビヒクル」として本明細書において指定することができる特定のアジュバントと見なすことができ、これらの用語は、同義である。

好ましくは、これらの同義語はすべて、抗原に対する特異的免疫保護(好ましくは免疫寛容)を達成し、それによって、ヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するために、上記に定義されるHIV抗原と組み合わせて使用される非病原性生細菌を指す。

より好ましくは、「寛容原性ビヒクル」は、1つまたは複数の、好ましくは2以上の、さらに好ましくは3以上の以下の免疫保護(immunoprotecting)効果を達成するために、上記に定義されるHIV抗原との混合剤において投与される非病原性生細菌である。
1)「寛容原性ビヒクル」は、全身性のHIV抗原特異的抗体の有意な産生を誘発しない:
特に、全身性の抗HIV IgMおよび/またはIgG抗体の有意な産生は、観察されない。たとえば、有意な全身性の体液性応答はない、すなわち、特異的な検出可能な全身性の抗体応答は、ELISAなどのような古典的な臨床検査方法によって検出することができないまたは全身性の抗体が検出される場合、それらは、HIVウイルス感染症に対して保護的ではない。
2)「寛容原性ビヒクル」は、CD4+T細胞の有意なHIV抗原特異的増殖を誘発しない:
特に、HIV抗原特異的CD4細胞の有意な増殖は、添付の実施例において記載されるものなどのような標準的なアッセイによって測定されるように、インビトロにおけるHIV抗原刺激に際して観察されない。
3)「寛容原性ビヒクル」は、インビトロにおけるHIV抗原刺激に際してCD8+T細胞によるガンマ-インターフェロンの有意な産生を誘発しない:
特に、インビトロにおけるHIV抗原刺激に際して観察される、CD8+T細胞によるガンマインターフェロン分泌のレベルは、ELIspotアッセイについて閾値レベル未満である。
4)「寛容原性ビヒクル」は、HIV抗原提示CD4+T細胞の活性化を抑制する有意なCD8+T細胞応答を誘発する:
特に、この応答は、添付の実施例において示されるように、CD8+T細胞(「有意な」CD8+T細胞応答を示すによる)ウイルス複製の阻害のレベルを測定するインビトロ試験によって決定することができる。これらのCD8+T細胞はまた、CD8+「調節性」T細胞とも呼ばれる。さらに、特に、たとえば、それが、ガンマ-インターフェロンの有意な産生を誘発しないので、この応答は、非細胞傷害性である。さらに、特に、この応答は、MHC-Ib/E拘束性である。さらに、特に、TCRαβは、ウイルス複製を抑制するCD8+T細胞応答に関与するように思われる。さらに、特に、この応答は、CD8+T細胞が枯渇された同じ細胞集団と比較して、HIV抗原提示CD4+T細胞の活性化を抑制する。好ましくは、前記応答は、HIV抗原提示CD4+T細胞の早期活性化を抑制し、前記「早期」活性化は、Ki67+マーカーによって測定される(Scholzen and Gerdes. J. Cell Physiol. 182、311-322 (March 2000))。

1)、2)、および3)において上記に使用されたように、用語「誘発しない」によって、それは、適切な定量的検出アッセイについての閾値レベル未満の結果を意味し、前記「閾値レベル」は、ネガティブ対照に基づいてアッセイにおいて決定される値である:この値未満で、結果はネガティブな結果となる。この値は、アッセイによって、また、検出の方法によって変動し得る。

有利には、寛容原性ビヒクルは、生物:
-非病原性細菌、とりわけプロバイオティクスおよび共生細菌;
-弱毒化された病原性細菌;ならびに
-不活性化病原性細菌(任意選択で、さらに以前に弱毒化された)
から選択される。

寛容原性ビヒクルは、組換えであってもよいまたはそうでなくてもよい。

本発明の関連における寛容原性ビヒクルとして使用されることとなる「非病原性細菌」は、一般的に、ヒトにおいていかなる病状をも誘発しない。これは、それらが、Generally Recognized As Safe(GRAS)である理由である。もちろん、そのような細菌は、ヒトに投与できなければならない。

寛容原性ビヒクルとして使用されることとなる好ましい非病原性細菌は、共生細菌である。そのような細菌は、当業者によく知られている。非限定的な例は、バチルス種(たとえばB.コアグランス(B. coagulans))、ビフィドバクテリウムアニマリス(Bifidobacterium animalis)、ビフィドバクテリウムブレーベ(Bifidobacterium breve)、ビフィドバクテリウムインファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウムロングム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウムビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウムラクティス(Bifidobacterium lactis)、大腸菌、ラクトバチルスアシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルスブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルスカゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルスパラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルスジョンソニ(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルスプランタルム、ラクトバチルスロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルスラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルスガセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルスサリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ラクトコッカスラクティス、ストレプトコッカスサーモフィルス(Streptococcus thermophilus)などを含む。

本発明の関連における寛容原性ビヒクルとして使用される「共生細菌」は、有利には、より詳細には、上記のリストにおいて選択される乳酸菌またはビフィドバクテリウムであり、その組み合わせもまた含む。好ましい共生細菌は、ラクトバチルス種、より好ましくは、ラクトバチルスプランタルムである。下記に報告される実施例は、ラクトバチルスプランタルムが、上記に定義される抗原と一緒に投与された場合にウイルス免疫寛容をもたらす寛容原性ビヒクルであることを初めて示した。

有利には、2つ以上の共生細菌などのような非病原性細菌の組み合わせは、寛容原性ビヒクルとして使用されてもよい。

本明細書において使用されるように、用語「病原性細菌」は、ヒトにおいて病状を誘発する細菌を指す。そのような細菌は、当業者からよく知られており、とりわけリステリア種(たとえばリステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes))、コリネバクテリア種、マイコバクテリウム種、ロドコッカス種、ユーバクテリア種、ボルタデラ(Bortadella)種、およびノカルジア種を含む。好ましくは、病原性細菌は、マイコバクテリウム種の中で選択され、より好ましくは、マイコバクテリウムボビス(Mycobacterium bovis)である。

本明細書において使用されるように、「弱毒化された病原性細菌」は、1つもしくはいくつかの突然変異または1つもしくは複数の弱毒化処理(たとえば化学的処理および/または特異的な培地上での連続継代培養)のために、それらの野生型相当物と比較して有毒でない病原性細菌である。そのような弱毒化された病原性細菌は、当業者からよく知られている。弱毒化された病原性細菌の非限定的な例は、弱毒化されたサルモネラチフィリウム(Salmonella typhimurium)およびマイコバクテリア、好ましくは弱毒化されたマイコバクテリアを含む。弱毒化されたマイコバクテリアの例として、「BCG」と知られている「カルメットゲラン杆菌」、とりわけ、その中でも、6つの広く使用されるBCG株-進化的に早期の株BCG Japanese、DU2 III群における2つの進化的に後期の株(BCG DanishおよびGlaxo)、ならびにDU2 IV群における3つの進化的に後期の株(BCG Connaught、Pasteur、およびTice)を挙げることができる。弱毒化されたマイコバクテリアの他の例として、HOFTら(2008)において開示されている株rBCG30、WANG et al (2008)において開示されている組換えBCG、ならびにさらに、WO2005/111205およびWO02/102409において開示され、また、US7,122,195およびUS6,261,568において開示されている組換えBCGなどのような組換えBCGもまた挙げることができる。

有利には、弱毒化の代わりにまたはそれに加えて、病原性細菌は、本発明の関連において寛容原性ビヒクルとして使用されるように不活性化されてもよいが、弱毒化された病原性細菌もまた、不活性化された後に使用されてもよい。

「不活性化された病原性細菌」は、当業者からよく知られている。そのような不活性化された病原性細菌の調製の方法は、当技術分野における共通の一般知識の一部分を形成する。そのような方法の例として、ファージ媒介性の溶解、ホルマリン処理(US7,393,541を参照されたい)などのような化学的な不活性化、熱による不活性化、凍結乾燥(たとえば長期凍結乾燥(Extended Freeze Drying))またはU.Vまたはガンマ線照射(WO2008/128065を参照されたい)またはマイクロ波曝露などのような物理的な不活性化、およびその組み合わせを挙げることができる。

好ましくは、前記寛容原性ビヒクルは、BCGのような病原性細菌の弱毒化された誘導体である。下記に報告される実施例は、BCGが、上記に定義される抗原と一緒に投与された場合にウイルス免疫寛容をもたらす寛容原性ビヒクルであることを初めて示した。

組換えである場合、本発明による寛容原性ビヒクルは、いかなるHIVタンパク質またはペプチドまたはエピトープも発現しない。

好ましくは、少なくとも、寛容原性ビヒクルとして使用される有意な量の生細菌は、対数中期にある。より好ましくは、細菌細胞の総数の少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはさらに約100%は、対数中期にある。

寛容原性ビヒクルについての有効量は、当業者によって容易に決定することができ、そのような有効量の例は、以下に開示される。

例として、本発明の医薬組成物における前記細菌の量は、前記混合物の1ml当たり約10⁴〜約10¹⁴CFUである。

医薬組成物
前記組成物はまた、「寛容原性組成物」または「免疫寛容原性(tolero-immunogenic)組成物」とも本明細書において呼ばれ、これらの用語は、等価である。

寛容原性ビヒクルならびにHIVウイルスのGagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する抗原は、本発明の医薬組成物に混合物として含有される、2つの別々で別個の構成成分である。これは、前記寛容原性ビヒクルおよび前記抗原が、前記組成物において別個の構成成分として存在することを意味する。

有利には、本発明の医薬組成物は、アジュバントとしていかなるオリゴヌクレオチド(たとえばCpGまたはdsRNA)も含まない。

寛容原性ビヒクルが細菌であるので、同じ属および/または種の細菌は、抗原の供給源として組換え形態で別々に使用されてもよい。たとえば、組換え細菌は、細胞に含有される核酸ベクター上にまたは細菌染色体に統合された核酸配列として、適切な調節性配列(プロモーター-誘発性または恒常的)の対照下に配置される抗原をコードする核酸を含有するであろう。それによって、組換え細菌は、前記抗原を発現するまたは産生することができるであろう。したがって、特定の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、細菌である寛容原性ビヒクルならびに寛容原性ビヒクルと同じ属および/または種に属する組換え細菌によって別々に産生された、HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する1つまたは複数のウイルスタンパク質またはペプチドまたはエピトープである抗原を組み込む。

本発明による医薬組成物において、前記抗原が粒子抗原、より詳細にはウイルス粒子である場合、前記細菌(前記混合物の1ml当たりCFUで表現される)に対する前記ウイルス粒子(前記混合物の1ml当たりの粒子で表現される)の前記混合物における比は、約1:10〜約1:1000、好ましくは、約1:25〜約1:750、さらに好ましくは、約1:50〜約1:500、さらに好ましくは、約1:75〜約1:250、さらに好ましくは、約1:100である。

本発明の医薬組成物の投与
寛容原性ビヒクルおよび抗原を同時にまたは別々にまたは連続的に投与することが可能であってもよい。

したがって、本発明の目的は、その必要のあるヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するための医薬キットであって、
-第1の容器中に上記に定義される抗原および
-第2の容器中に上記に定義される非病原性生細菌
を含み、前記抗原および前記細菌が、粘膜または皮内もしくは上皮内投与のための薬学的に許容できるキャリア中にある医薬キットを提供することである。

その必要のあるヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療する際の同時の、別々の、または連続的な使用のための併用医薬組成物として、
-上記に定義される寛容原性ビヒクルとしての非病原性生細菌ならびに
-上記に定義されるHIV Gagおよび/またはPolタンパク質由来の1つまたは複数のエピトープを有する粒子抗原または抗原を含有する産物を提供することもまた、本発明の目的である。前記予防および/または治療は、粘膜にまたは皮内にもしくは上皮内に前記併用医薬組成物を前記ヒトに投与することを介して達成される。そうするために、寛容原性ビヒクルおよび抗原を同時にまたは別々にまたは連続的に投与することが可能であってもよい。

例として、非病原性生細菌は、経口的に(たとえば経口薬剤または食物補助剤として)投与されてもよく、それに対して、抗原は、粘膜にまたは皮内にもしくは上皮内に投与される。

もちろん、適切な医薬ビヒクルは、期待される部位(たとえば粘膜表面)へのそれぞれの適した送達を確実にするために使用されてもよい。寛容原性ビヒクルおよび抗原のそれぞれを投与する時間および用量は、当業者によって容易に適合されるであろう。

好ましくは、本発明による医薬組成物は、粘膜または上皮内もしくは皮内医薬組成物である。さらに、好ましくは、それは、経口医薬組成物である。

本明細書において使用されるように、「粘膜または上皮内もしくは皮内医薬組成物」は、粘膜または上皮内もしくは皮内投与のための医薬組成物であり、これは、それが、そのような投与のために製剤されていることを意味する。

特に、医薬組成物は、前記抗原および前記細菌の粘膜または上皮内もしくは皮内送達のための、1つまたは複数の適切な医薬ビヒクル(または支持体)をさらに含む。

好ましくは、「粘膜送達」は、経鼻、経口、舌下、気管、咽頭、気管支、食道、胃、十二指腸、腸、直腸、包皮、および膣送達から本明細書において選択される。「粘膜送達」は、鼻、口、舌下、気管、気管支、咽頭、食道、胃、ならびに十二指腸の粘膜、直腸を含む小腸および大腸ならびに包皮および膣粘膜などのような粘膜表面への送達である。本発明の文脈において、粘膜表面はまた、眼の外部表面、すなわち、眼の粘膜および眼を取り囲む粘膜を含む。さらに、好ましくは、粘膜表面は、膣および消化粘膜、より好ましくは消化粘膜を指す。さらに、好ましくは、粘膜送達は、経口送達である。

したがって、医薬組成物はまた、投与のルートに依存して、1つまたは複数の医薬ビヒクルを含んでいてもよい。医薬の技術分野における当業者らは、粘膜表面への薬剤送達のためのまたは皮内もしくは上皮内送達のためのビヒクルに精通しているまたはそれを容易に見定めることができる。この点に関しての有用な参考文献は、Chien (Novel Drug delivery system、Chapters 3 through 6 and 9、Marcel Dekker、1992)、Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed. (various editors、1989-1998、Marcel Dekker);およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (ANSELら、1994、WI LLIAMS & WILKINS)である。

本発明において有用な薬剤送達のための例示的な方法およびルートは、下記に簡潔に記載される。

気管支、細気管支、気管、鼻、口、包皮、または咽頭粘膜への投与は、吸入剤(inhalable)、スプレーなど(たとえば鼻腔スプレー、エアゾルスプレー、またはポンプスプレーなど)、水剤、ゲルなどとして医薬組成物を製剤することによって得ることができる。鼻粘膜、気管、および細気管支拡張症への医薬組成物の送達に適した噴霧器デバイスは、当技術分野においてよく知られており、そのため、本明細書で詳細には記載しない。それから、医薬組成物は、水剤、エマルション、マイクロエマルション、水中油型エマルション、無水脂質、および水中油型エマルション、他のタイプのエマルションを含む群において選択されるビヒクルを含んでいてもよい。

膣粘膜への投与は、水剤、浣腸剤、泡状物質、座剤、腟錠、または局所ゲルとして医薬組成物を製剤することによって得ることができる。膣送達のための好ましいビヒクルは、エマルションまたはゲル調製物(たとえば油/水エマルションゲル)を製剤するのに共通して使用されるものなどのような親水性および疎水性ビヒクルを含む。

消化管粘膜への投与は、カプセル、マイクロカプセルとして医薬組成物を製剤することによって得ることができる。消化送達のための好ましいビヒクルは、消化送達のための調製物を製剤するのに共通して使用されるものなどのような、一般的に経口的な所定のカプセルおよびマイクロカプセル(たとえばペクチンおよび/またはアルギン酸のカプセルおよびマイクロカプセル)に相当する(たとえばWO2007/140613において開示されているマイクロカプセル)。その代わりに、消化送達は、飲料、ヨーグルトなどのような適切な液体および/または食料を消費するまたは投与することによって得られてもよい。

皮内または上皮内投与は、当業者によく知られている。皮内投与(たとえば注射)は、たとえば、US6,933,319およびWO2004/101025において開示されているものなどのような針デバイスによりならびに適切な無針デバイスにより行うことができる。

医薬組成物は、少なくとも1つの吸着剤をさらに含んでいてもよい。「吸着剤」は、当業者からよく知られている。例として、ソルビトール無水物の脂肪酸部分エステルのポリオキシエチレン誘導体などのような界面活性剤(たとえばTween(登録商標)80、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリオキシエチレン50ステアレート、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、およびオクトキシノール)、グリココール酸ナトリウムなどのような胆汁酸塩、混合ミセル、エナミン、一酸化窒素ドナー(たとえばS-ニトロソ-N-アセチル-DL-ペニシラミン、NOR1、NOR4-これらは、好ましくは、カルボキシ-PITOまたはジクロフェナクナトリウムなどのようなNOスカベンジャーと同時投与される)、サリチル酸ナトリウム、アセト酢酸のグリセロールエステル(たとえばグリセリル-1,3-ジアセトアセテートまたは1,2-イソプロピリデングリセリン-3-アセトアセテート)、シクロデキストリンまたはベータ-シクロデキストリン誘導体(たとえば2-ヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリンおよびヘプタキス(2,6-ジ-O-メチル-ベータ-シクロデキストリン))、モノおよびジグリセリドなどのような中鎖脂肪酸(たとえばヤシ油のカプリル酸ナトリウム抽出物、Capmul)、またはトリグリセリド(たとえばアミロデキストリン、Estaram 299、Miglyol 810) 、カルボキシメチルセルロース、カーボポール、ポリカルボフィル、トラガント、およびアルギン酸ナトリウムなどのようなポリマー、ならびに粘膜または上皮内もしくは皮内送達に適合させた他の吸着剤を挙げることができる。使用され、薬剤の粘膜または上皮内もしくは皮内送達に成功してきた吸着剤に関する一般的な原理に関する参考文献については、Chien、Novel Drug Delivery Systems、Ch. 4 (Marcel Dekker、1992)を参照されたい。

医薬組成物は、1つまたは複数の添加剤(たとえば希釈剤、賦形剤、安定剤、保存剤など)をさらに含んでいてもよい。一般的に、Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed. (various editors、1989-1998、Marcel Dekker);およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (ANSELら、1994、WILLIAMS & WILKINS)を参照されたい。

下記に開示されるように、ヒト対象に投与されることとなる本発明による医薬組成物の適切な投薬量は、性別、年齢、体重、健康状態などのような前記対象の1つまたは複数の特徴に依存して決定されてもよい。

例として、抗原が粒子である場合、より詳細には、それがウイルス粒子である場合、1日当たり約10⁸〜約10¹⁴のウイルス粒子の用量が、前記ヒトに投与されてもよい。他の例として、1日当たり約10⁶〜約10¹⁶CFUの非病原性生細菌の用量が、前記ヒトに投与されてもよい。

本発明の医薬組成物の適用
本発明の目的は、医薬として、好ましくはワクチンとして使用するための、上記に記載される医薬組成物を提供することである。

本発明はまた、その必要のあるヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するための方法であって、前記ヒトに、上記に定義される医薬組成物の有効量を粘膜にまたは皮内にもしくは上皮内に投与する工程を少なくとも含む方法に関する。

本発明によれば、予防目的のために、「その必要のあるヒト」は、好ましくは少なくとも約2歳の、任意のヒトとすることができる。治療目的のために、「その必要のあるヒト」は、彼/彼女がHIV疾患に罹患しているために治療されることとなるヒトである。

「HIV疾患」は、AIDSおよびセロコンバージョン(慢性感染症の確立)を含む疾患進行の早期の段階を含む、任意のHIV関連性の免疫不全を指す。

本発明は、HIVからヒトを保護するための方法であって、前記ヒトに、上記に定義される医薬組成物の有効量を粘膜にまたは皮内にもしくは上皮内に投与する工程を少なくとも含む方法にさらに関する。

特に、そのような方法は、粘膜でHIVに曝露された場合にHIV感染症からおよび/または静脈内でHIVに曝露された場合にHIV複製からヒトを保護するのを可能にする。

本発明は、HIVセロコンバージョンからヒトを保護するための方法であって、前記ヒトに、上記に定義される医薬組成物の有効量を粘膜にまたは皮内にもしくは上皮内に投与する工程を少なくとも含む方法にさらに関する。それによって、前記ヒトは、セロポジティブにならず、有意なレベルのHIV抗体を示さないであろう。

用語「ワクチン接種」は、ヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するために使用される作用(とりわけ、本発明の医薬組成物の投与)を指す。好ましくは、本発明の医薬組成物は、ヒトにおけるHIVウイルスのGagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する抗原に対する免疫寛容を誘発する、好ましくは維持するのに、すなわち、言いかえれば、前記ヒトにワクチン接種する(または「寛容化する」)のに有用である。したがって、本発明の医薬品を使用するヒトのワクチン接種は、「寛容原性ワクチン接種」(または「寛容化」もしくは「免疫寛容化」)と見なされる。

本発明の医薬組成物の粘膜または皮内もしくは上皮内投与後に(すなわち寛容原性ワクチン接種後に)、ヒトにおける免疫寛容の誘発に成功した場合、前記ヒトは、「ワクチン接種された」(または「寛容化した」もしくは「寛容性がある」)と見なされる。応答、すなわちインビボにおけるウイルス感染性の抗原投与に対する「ワクチン接種された」ヒトの血漿ウイルスRNA量によって評価されるウイルス複製は、少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約75%または80%または85%または90%または95%または98%または99%またはそれ以上(99.5%、99.8%、99.9%、100%)、抗原のみもしくは標準的なアジュバント(上記に定義される)と組み合わせられた抗原または医薬組成物なしもしくはプラセボが投与された対照ヒトの血漿ウイルスRNA量に比べて、低下する。

本発明によれば、寛容原性ワクチン接種は、医薬組成物の1回または数回の継続的な投与を含んでいてもよい。好ましくは、寛容原性ワクチン接種は、少なくとも2回以上の継続的な投与(すなわちワクチン接種)、より好ましくは、前記組成物の2回を超える継続的な投与を含んでいてもよい。

有利には、継続的な寛容原性ワクチン接種の間隔は、1分間〜3か月、好ましくは15分間〜2か月である。

さらに有利には、本発明の寛容原性ワクチン接種はまた、第1の粘膜または上皮内もしくは皮内寛容原性ワクチン接種の1年または数年(たとえば1〜10年)後のリコール寛容原性ワクチン接種を含んでいてもよい。

第1の粘膜または皮内もしくは上皮内寛容原性ワクチン接種後の新たな寛容原性ワクチン接種は、粘膜、皮内、および上皮内ワクチン接種から選択されてもよい。注目すべきことに、新たな寛容原性ワクチン接種が上皮内または皮内注射である場合、特異的な全身性の体液性および/または細胞傷害性(ガンマインターフェロン産生)応答が検出可能であるかもしれないが、疾患の予防または治療における役割を有していない。

本発明によれば、医薬組成物の有効量は、その必要のあるヒトに投与される。用語「有効量」は、所望の生物学的作用を達成するのに十分な量を意味し、これは、本明細書で、免疫寛容、好ましくは「Ts」免疫寛容の誘発を通しての根治的または保護効果(言いかえれば免疫保護効果)となる。有効投薬量は、治療されることとなる対象の年齢、性別、健康状態、および体重、もしあれば併用療法の種類、治療の頻度、ならびに期待される効果の性質に依存性であろうということが理解される。下記に提供される有効量の範囲は、本発明を限定するようには意図されず、好ましい用量範囲を示す。しかしながら、好ましい投薬量は、不必要な実験を伴うことなく当業者によって理解され、決定できるように、対象に適合することができる。たとえばEbadi、Pharmacology、Little, Brown and Co.、Boston、Mass. (1985)を参照されたい。

たとえば、HIVに関して、ヒト成人についての典型的な投薬量は、用量当たり約10⁶〜10¹²HIVウイルス粒子(すなわちVLP、組換えまたは非組換えウイルス粒子)であろう、好ましくは、10⁸〜10¹⁰であろう。もちろん、本明細書において記載されるように、いかなる投薬量が使用されても、それは、知られている方法によって決定されるように安全であり、有効量であるはずである。

さらに、当業者はまた、彼または彼女の一般知識に照らして、所望の生物学的作用を達成するために、ヒトに投与されるべき、寛容原性ビヒクルの有効量を決定することができる。

例として、病原性細菌の弱毒化された誘導体(たとえばBCG)についての前記有効量は、用量当たり10⁴〜10¹²、好ましくは10⁵〜10¹⁰CFU(コロニー形成単位)、より好ましくは10⁶〜10⁸CFUの範囲で含まれる。他の例として、病原性細菌の弱毒化された誘導体または不活性化された病原性細菌(たとえばBCG)についての前記有効量は、用量当たり0.001mg〜1g、好ましくは0.01〜100mg、より好ましくは0.1〜10mgの範囲で含まれる。

他の例として、非病原性細菌(たとえばラクトバチルス種)についての前記有効量は、用量当たり約10⁶〜10¹⁴CFU、より好ましくは約10¹⁰〜10¹²CFUの範囲で含まれる。

上記に記載されるように、本発明の医薬組成物は、ヒトにおける将来のHIV疾患を予防するのにまたはHIV疾患に以前から罹患しているヒトを治療するのに適している。

治療目的のために、上記に定義される「HIVウイルスのGagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する抗原」は、自己由来のものであってもよい、すなわち、それは、治療されることとなるヒトに感染しているHIVウイルスに由来してもよい。そのような場合において、たとえば、HIVウイルスは、ヒトから単離されてもよく、それから、それは、培養され、不活性化され(好ましくは少なくとも2回不活性化され)、上記に記載される医薬組成物を得るために、最終的に寛容原性ビヒクルと組み合わせられてもよい。

さらに、たとえば、HIV Gagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する自己由来または非自己由来抗原を含む医薬組成物は、検出不可能なウイルス量を最初にもたらしたかもしれない従来の抗ウイルス治療の間に、ヒトに投与されてもよい。それから、従来の抗ウイルス治療は、医薬組成物を使用する1回または複数回の寛容原性ワクチン接種後に停止されてもよい、ただし、非自己由来の急性的に感染させたCD4細胞の適切なエキソビボウイルス複製抑制が、自己由来のウイルス特異的CD8細胞によって達成されることを条件とするまたはただし、CD8 T細胞によって誘発されるCD4 T細胞活性化の適切な抑制が達成されることを条件とする。

特に、治療目的のために、医薬組成物は、治療されることとなるヒトの一生の間に1回だけ投与されてもよい。その代わりに、それは、治療されることとなるヒトの一生の間に2回以上、同じ日にまたはたとえば約1日〜約1年間もしくはそれ以上の範囲にある期間によって分けられる異なる日に投与されてもよい。より詳細には、それは、たとえば約1日〜約1年間またはそれ以上の範囲にある期間、毎日または周期的に投与されてもよい。必要ならば、医薬組成物は、治療されることとなるヒトの一生の最初からずっと投与されてもよい。

本発明は、ヒトがHIVウイルスから保護されるかどうかを決定するためのインビトロにおける方法であって、
a)前記ワクチン接種したヒトの血液試料から末梢血CD8 T細胞を単離する工程、
b)適切な条件下で、
(i)前記HIVウイルスと等価なウイルス株によってインビトロにおいて急性的に感染させた同種異系のまたは自己由来のCD4+T細胞と共に、前記単離されたCD8 T細胞をおよび
(ii)前記インビトロにおいて急性的に感染させた同種異系のまたは自己由来のCD4+T細胞を培養する工程、
c)培養上清を回収する工程、
d)前記上清におけるウイルス量を測定する工程、ならびに
e)前記ヒトが前記HIVウイルスから保護されるかどうかを決定する工程
を含む、方法をさらに提供する。

「試験されることとなるHIVウイルスと等価なウイルス株」によって、前記ウイルス株が、野生のウイルスに起源を持ち、試験されることとなるHIVウイルスの特徴に類似する本質的な特徴を有することを意味する(たとえば、個人のHIV-1に起源を持つウイルス株HTLVIIIBを挙げることができる:HTLVIIIBは、HIV-1「に等価なウイルス株」と見なすことができる。好ましくは、前記ウイルス株は、試験されることとなるHIVウイルスである野生のウイルスに起源を持つであろう。前記ウイルス株は、したがって、HIVウイルス、とりわけ野生のHIVウイルスに関する研究についての適切なモデルを示す。ウイルス株は、もちろん、とりわけ安全性の面から、そのような研究に十分に適合している。

上記の工程はすべて、当業者からよく知られている標準的な技術を使用して実行することができる。特に、工程b)についての適切な培養条件は、本発明の分野における一般知識の一部である(下記の実施例において記載される従来の方法など)。

ウイルス量は、下記の実施例において記載されるものなどのような従来の方法によって工程d)において測定することができる。

副工程b)(ii)による前記インビトロにおいて急性的に感染させた同種異系のまたは自己由来のCD4+T細胞の培養物から回収された上清におけるウイルス量は、工程e)における決定のための基準として使用されるであろう。有利には、「抑制パーセント(%)」または「抑制性の比」または「抗ウイルス効果」は、たとえば、インビトロにおいて急性的に感染させた同種異系のまたは自己由来のCD4+T細胞由来の細胞のみを含有する、二通り(または三通りまたは四通りまたはそれ以上)のウェル由来の上清におけるウイルス濃度の幾何平均をCD8 T細胞およびインビトロにおいて急性的に感染させた同種異系のまたは自己由来のCD4+T細胞由来の細胞を含有する、二通り(または三通りまたは四通りまたはそれ以上)のウェル由来の上清におけるウイルス濃度の幾何平均と比較することによって、計算されるであろう。

それから、工程e)における前記決定は、好ましくは、以下のように実行される。
-抑制性の比が、約100よりも高度である場合、前記ヒトが保護されると結論付けることができる。典型的に、これは、HIV非感染ヒトに、効率的な予防抗ウイルス治療が投与されまたはHIV感染ヒトに、効率的な治療的処置が投与され、前記効率的な予防治療または治療的処置が、好ましくは、本発明による医薬組成物を含み、したがって、ヒトが保護され続ける限り、あらゆる予防治療または治療的処置をヒトにさらに投与する必要はないであろうという場合であろう。
-抑制性の比が、約100よりも低い場合、前記ヒトが前記ウイルスから保護されないと結論付けることができる。それから、ヒト、HIV非感染ヒトまたはHIV感染ヒトは、有利には、それぞれ、本発明による医薬組成物を含む予防治療または治療的処置が投与されるであろう、また、上記のインビトロにおける方法は、ヒトが保護されるようになることを確かめるために、適切な時間間隔で、1回またはそれ以上実行されるであろう。

さらに、本発明は、ヒトがHIVウイルスから保護されるかどうかをインビトロにおいて決定するためのキットであって、ウイルス株によって感染させることができる同種異系のまたは自己由来のCD4+T細胞を含み、前記ウイルス株が、上記に定義されるように、試験されることとなる前記HIVウイルスと等価である、キットを提供する。キットはまた、前述の同種異系のもしくは自己由来のCD4+T細胞を感染させるための適切な濃度の適切なウイルス株ならびに/または適切な試薬ならびに/または対照および/もしくは培地(細胞浮遊、細胞培養、細胞保存などのための培地など)を含んでいてもよい。本発明のキットは、特定のタイプのHIVウイルスに対して特異的であってもよいまたはそれは、様々なタイプのウイルスに適合していてもよく、前記タイプのウイルスは、類似している(特に、系統学的に類似している)。

本発明は、あらゆる慢性の伝染病を予防するおよび/または治療するために使用されるように容易に適合することができる。そのような疾患の非限定的な例は、B型肝炎およびC型肝炎、ヒトパピローマウイルス(HPV)、EBVおよび他のヘルペスウイルス、結核、ハンセン症、リーシュマニア症などである。

全体的に、前述の感染症または疾患と関連する1つまたは数個の病原性の抗原が、前述の病原性のタンパク質またはペプチドに由来するエピトープを提示するCD4+T細胞の特異的な活性化に関与するごとに、CD4+T細胞の活性化の特異的な抑制/予防を、本明細書において記載される前述の抗原および寛容原性ビヒクルを組み合わせた、粘膜または皮内もしくは上皮内医薬組成物によって生成される非細胞傷害性CD8+T細胞によって起こすことができる。

ウイルス感染症および関連する疾患は、本発明の医薬組成物を使用して哺乳動物/ヒトにおいて予防するおよび/または治療することができることが本明細書において示される。この教示に基づいて、(i)本明細書において開示される寛容原性ビヒクルおよび(ii)ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生動物起源由来の任意の抗原を含む他の医薬組成物を提供することが可能である。そのような医薬組成物は、前記寛容原性ビヒクルおよび前記抗原の適切な送達(好ましくは粘膜、皮内、または上皮内)のために製剤される。それらは、抗原が由来するウイルス、細菌、菌類、原生動物、または寄生動物によって引き起こされる哺乳動物における慢性感染症を予防するおよび/または治療するのに有用である。例として、(i)本明細書において記載される寛容原性ビヒクルおよび(ii)マイコバクテリウムツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)に由来する抗原を含む細菌医薬組成物がある。この細菌医薬組成物は、前記抗原および前記寛容原性ビヒクルの適切な送達(好ましくは粘膜、皮内、または上皮内)のために製剤される。ヒトにおける結核を予防するおよび/または治療するのに特に興味深いのは、マイコバクテリウム抗原がコッホ杆菌に由来するそのような細菌医薬組成物である。

本発明の医薬組成物によって達成される免疫保護
寛容性は、粘膜系を通して取り込まれた抗原を認識するためのおよび一般的に、同じ抗原との続く遭遇に対して、他の免疫学的な修飾と関連するアネルギーを発生させるための、免疫系の生理学的な能力である。寛容性は、全身性の免疫コンパートメントの刺激を伴うことなく、粘膜抗原の抗体封じ込めを可能にする粘膜slgAを誘発することが頻繁に示された。調節性サイトカインであるTGF-ベータもまた、寛容性の発生に関与した。CD25+調節性T細胞による活性な抑制もまた、粘膜の寛容性の可能性のあるメカニズムとして頻繁に示唆された(Faria and Weiner、2005; Mesteckyら、2007)。しかしながら、これらの免疫学的な修飾のどれも、ウイルスエピトープ抗原提示CD4+T細胞の活性化を抑制するCD8+T細胞の活性によって主に特徴付けられ、これまでに認識されていない免疫反応のタイプであり、より詳細には、全く新しいタイプの免疫寛容である、本発明において記載される、医薬組成物誘発性の免疫寛容において観察されなかった。

「寛容性」、「免疫学的寛容」、「免疫寛容」、「ウイルスに対する免疫寛容」、「新しいタイプのウイルス特異的寛容性」、「ウイルス抗原に対する免疫寛容」、「ウイルス免疫原に対する免疫寛容」、および「「Ts」免疫寛容」という表現は、同義である。これは、マカクにおいて、不活性化されたSIV抗原による刺激に際してのCD8+T細胞によるガンマインターフェロン分泌の欠如ならびに全身性の抗SIV IgMおよびIgG抗体の産生の欠如と共に、CD4+T細胞の増殖がない状態と関連する、HIV Gagおよび/またはPol抗原提示CD4+T細胞の早期活性化を抑制する、活発に誘発された強力な非細胞傷害性MHC-Ib/E拘束性CD8+T細胞応答に相当することが発明者らによって示された。また、発明者らは、TCRγδおよびVβ8が、ウイルス複製のCD8+T細胞による抑制に関与しなかったことを示すことができ、TCRαβが、感染したCD4+T細胞上のMHC-Ib/Eペプチド提示の認識において中心的な役割を果たすはずであることを示唆した。

「ウイルスに由来する抗原に対する通常の免疫応答」は、HIVウイルスのGagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する抗原ならびに標準的なまたは従来のアジュバント(すなわち、S. Plotkin et alによる「Adjuvants in Vaccines」と題する章において記載されるものなどのような、抗原と関連する免疫応答を刺激するおよび/または促進するおよび/または増加させることを目的とする物理的、化学的、または生物学的アジュバントの任意の形態)を含む従来の予防ワクチン組成物によるワクチン接種に際してとりわけ観察することができる。そのような「ウイルスに由来する抗原に対する通常の免疫応答」は、体液性、細胞性、または体液性および細胞性免疫応答の両方を含み、従来、
(i)特異的なインビトロにおける刺激に際してのウイルス特異的CD4細胞の増殖ならびに/または
(ii)ウイルス抗原タンパク質および/もしくはペプチドに対する全身性の抗体の産生を介しての特異的な全身性の体液性応答の誘発ならびに/または
(iii)CD8 T細胞によるガンマインターフェロンの産生と関連する特異的な細胞性応答の誘発ならびに/または
(iv)HIV Gagおよび/もしくはPol抗原提示CD4+T細胞の活性化を抑制する非細胞傷害性CD8+T細胞応答のない状態によって特徴付けられる。

対照的に、本発明によって提供されるHIVウイルスのGagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する抗原ならびに寛容原性ビヒクルを含む医薬組成物は、「ウイルスに対する免疫寛容」、より詳細には「「Ts」免疫寛容」を生成し、これは、マカクにおけるSIVに関する下記の実施例において、
(i)特異的なインビトロにおける刺激に際してのウイルス特異的CD4細胞の増殖がない状態および
(ii)あらゆる著しい全身性の体液性応答がない状態、すなわち、特異的な検出可能な全身性の抗体応答は、ELISAなどのような古典的な臨床検査方法によって検出することができないまたは全身性の抗体が検出される場合、それらは、SIVウイルス感染症に対して保護的ではないおよび
(iii)適切なインビトロにおける刺激に際してのガンマインターフェロン(たとえば、ELIspotによって検出可能な)の産生と関連するあらゆる細胞傷害性CD8+T細胞応答がない状態または細胞傷害性CD8 T細胞応答が検出される場合、それは、SIVウイルス感染症に対して保護的ではないおよび
(iv)本質的な特徴として、SIV抗原提示CD4+T細胞の早期活性化を抑制する、活発に誘発された強力な非細胞傷害性非CD25MHC-Ib/E拘束性CD8+T細胞応答によって特徴付けられる。

上記に言及されるように、本発明の医薬組成物は、寛容原性ビヒクルならびにHIVウイルスのGagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する抗原を含む。実際に、ウイルス抗原と組み合わせられた寛容原性ビヒクルは、上記に定義されるような通常の免疫応答を誘発する代わりに、ヒトにおけるウイルス特異的免疫寛容の状態を誘発する。したがって、単独でまたは標準的なアジュバントと組み合わせて、粘膜または皮内もしくは上皮内ルートによって投与された抗原は、それが、本発明の医薬組成物におけるように寛容原性ビヒクルと組み合わせられる場合を除いて、通常の免疫応答を一般的に誘発し得る。これらの特異的な環境下で、本発明の医薬組成物における寛容原性ビヒクル/抗原の組み合わせにより、上記に定義される免疫寛容が誘発される。これは、免疫寛容が、寛容原性ビヒクルならびにHIVウイルスのGagおよび/またはPolを含有するまたはそれに由来する抗原の適切な混合物を投与する(粘膜または皮内もしくは上皮内ルートにより)際にのみ達成することができることを意味する。一方が、他方がない状態でヒトに投与される場合、ヒトは、「ワクチン接種」または「寛容化」されないであろう。

下記の実施例(マカクモデルにおけるSIVを使用)において示されるように、本発明による医薬組成物を投与する際に誘発されるまたは達成される免疫寛容(「Ts」免疫寛容とも呼ばれる)は、SIV Gagおよび/またはPol抗原提示CD4+T細胞の活性化(とりわけ早期活性化)を抑制するCD8+T細胞応答(特に非細胞傷害性および/またはMHC-Ib/E拘束性);ならびに有利には、1)CD4+T細胞の増殖がない状態;2)SIV抗原刺激に際してのCD8+T細胞による著しいガンマインターフェロン分泌の欠如;ならびに3)全身性の抗SIV IgMおよびIgG抗体の著しい産生の欠如の1つまたは複数によって特徴付けられる。

「HIVまたはSIV抗原刺激に際してのCD8+T細胞による著しいガンマインターフェロン分泌の欠如」という用語によって、HIVまたはSIV抗原刺激に際して観察される、CD8+T細胞によるガンマインターフェロン分泌のレベルが、ゼロであるまたは弱いことが本明細書において意味される。HIVまたはSIV抗原刺激に際してのCD8+T細胞による「弱い」ガンマインターフェロン分泌は、典型的に2×10⁵ PBMC当たり約80SFC未満である。

「全身性の抗HIVまたは抗SIV IgMおよびIgG抗体の著しい産生の欠如」という用語によって、観察される全身性の抗HIVまたは抗SIV IgMおよびIgG抗体の産生のレベルが、ゼロであるまたは弱いことが本明細書において意味される。全身性の抗HIV抗体または抗SIV抗体の「弱い」産生は、典型的に、約300以下の抗HIVまたは抗SIVの力価である。

したがって、本発明による医薬組成物は、ヒトにおけるHIVに対する抗原特異的免疫保護を誘発し、好ましくは維持し、前記免疫保護が、好ましくは、
-適切な実験対照と比較した、前記ヒトにおけるHIVウイルス量の低下および好ましくは抑制ならびに/または
-適切な実験対照と比較して、前記ヒトにおけるHIV Gagおよび/またはPol抗原提示CD4+T細胞の活性化を抑制するCD8+T細胞によって特徴付けられる。

有利には、前記免疫保護は、前記ヒト由来のCD8+調節性T細胞の存在または活性をインビトロにおいて検出することによって前記ヒトにおいて決定される。そのような検出は、下記の実施例において記載されるものなどのような標準的なインビトロにおける技術によって実行されてもよい。

上記に言及される特許、特許出願、および刊行物はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる。

A部-一般的な材料&方法
A-I 動物.コロニー飼育中国アカゲザル(マカカムラタ)を、National Institutes of Health 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals'の規則に従って収容した。動物はすべて、良好な健康状態にあり、2〜4歳、体重が4〜6kgであり、また、SIV、SRV、サルT細胞リンパ好性ウイルス1、B型肝炎ウイルス、およびBウイルスについてセロネガティブであった。X線および皮膚試験(PPD)は、結核の潜在的なキャリアを除外するためにすべての動物について登録時に実行した。

A-II MHCクラスI分類.アカゲザルの古典的なMHCクラスI対立遺伝子は、以前に記載された(Muhlら、2002; Loffredoら、2007)、代表的なMamu-AおよびMamu-B配列について、配列特異的プライマー(SSP)PCRアッセイを使用して、末梢血単核細胞(PBMC)試料において遺伝子型を同定した。

A-III 抗原性ウイルス調製物.
III-1.SIV産生は、SIVmac239(P. A. Marxの寄贈)を接種したCEM174細胞で実行した。培養上清は、最良(pick)のウイルス産生時に収集した。

III-2.AT-2不活性化SIVmac239:SIVmac239は、2時間、250μΜアルドリチオール(AT-)(Sigma)によって不活性化し、超遠心分離によって3回洗浄した。AT2不活性化ウイルスは、それぞれの投与(すなわちワクチン接種)について10⁹ウイルス粒子の最終用量で使用した。

III-3.熱不活性化SIVmac239:SIVmac239は、30分間、56℃で不活性化した。熱不活性化ウイルスは、それぞれの投与について10⁹ウイルス粒子の最終用量で使用した。

III-4.AT-2熱不活性化SIVmac239:SIVmac239は、2時間、250μΜアルドリチオール(AT-2)(Sigma)によって不活性化し、超遠心分離によって3回洗浄した。それから、ウイルスを、30分間、56℃の温度にさらした。不活性化ウイルスは、それぞれの投与について10⁹ウイルス粒子の最終用量で使用する。

III-5.不活性化ウイルス調製物は、ウイルス感染性の100%の阻害を検証するために、CEM174細胞に接種した。

A-IV SIVに対する抗体応答についてのアッセイ。血漿における抗SIV IgG、IgM、およびIgA抗体は、免疫蛍光法抗体(IFA)アッセイ(Mederleら、2003)によって力価を測定した。手短かに言えば、試験血漿の段階2倍希釈液を、30分間、37℃で、SIV感染CEM174細胞接着スライドと共にインキュベートした。ハンクスにより洗浄した後、FITCコンジュゲートヤギ抗マカクIgG(Sigma)、IgM(ADI、San Antonio、Texas)、またはIgA(ADI)をさらに30分間(37℃で)追加した。抗体力価は、ポジティブ蛍光免疫染色を得るための最高の希釈の逆数として決定した。IFAアッセイの感度は、IgGについて20の力価であり、IgMおよびIgAについて5の力価であった。血漿試料がIFAについてネガティブである場合(アッセイ感度未満)、データ分析を容易にするために1の値を指定した。

粘膜分泌物は、以前に記載されたように(Tsaiら、1993)、胃注入のためのカテーテルを使用してPBSにより直腸を洗浄することによって収集した。手短かに言えば、トリプシン阻害剤(10μg/ml)およびEDTA(5×10-4M)(Sigma)を試料に追加し、それから、これを4℃、10000xgで10分間遠心分離した。上清を収集し、フェニルメチルスルホニルフッ化物(10-3M)およびアジ化ナトリウム(0.01%)(Sigma)を補足した。試料は、使用まで-80℃で保存した。直腸における抗SIV IgA力価は、上記のIFAアッセイによって検出した。

A-V フローサイトメトリー。フローサイトメトリー分析は、以下:CD3-PE-Cy7(クローンSP34-2)、CD4-PE(クローンMT477)、CD8-PerCP(クローンRPA-T8)に対する蛍光標識モノクローナル抗体および二次ウサギ抗マウス-APC(BD biosciences)を使用して、FACScalibur(BD biosciences、San Jose、California)により実行した。Ki-67-PE(BD biosciences)およびFITCコンジュゲート抗P27モノクローナル抗体(Fitzgerald、Concord、MA)またはAPC-SAv(BD biosciences)とカップリングしたビオチンコンジュゲート抗P27モノクローナル抗体(Fitzgerald)を透過処理後に細胞内染色に使用した。

TCRγδ(クローンB1)、Vβ8、ならびにCD抗原(CD7、CD16、CD28、CD62L、CD95、CD122、CD137、CD150、CD183、CD184、CD195、CD196、CD197、CD226、CD272、およびCD305)に対するPEコンジュゲートモノクローナル抗体をBD biosciencesから購入した;CD抗原(CD11a、CD25、CD27、CD39、CD101、CD129、CD215、CD277、およびCD357)に対するPEコンジュゲートモノクローナル抗体をBioLegend(San Diego、CA、USA)から購入した;CD抗原(CD127、CD247、およびCD279)に対するPEコンジュゲートモノクローナル抗体をeBioscience(San Diego、CA、USA)から購入した。

A-VI 細胞増殖。PBMCは、以前に記載されたように(Luら 2003)得た。SIV特異的CD4+またはCD8+T細胞の増殖は、メーカーの指示に従って、カルボキシ-フルオレセインジアセテート,スクシンイミジルエステル(CFSE)標識アッセイ(Molecular Probes、Eugene、Oregon)によって評価した。PBMCは、37℃で15分間、3μΜ CFSEにより染色した。洗浄後に、CFSE標識細胞を、10μg/ml組換えSIVコアタンパク質P27(ImmunoDiagnostics、Wobun、MA)、2μg/ml SIV gag 15アミノ酸長ペプチド(GLS、Shanghai、China)、10⁹/ml AT-2不活性化SIV、または培地のみにより5日間刺激した。抗CD3および抗CD4または抗CD8抗体により標識した後に、PBMCは、フローサイトメトリーのために1%パラホルムアルデヒドにおいて固定した。

A-VII 細胞活性化。磁気ビーズによってCD8またはCD25を枯渇させた(またはしなかった)新鮮なPBMCを、10¹⁰/mlのウイルス濃度で2時間、AT-2処理SIVmac239により1回感染させた。感染細胞は、ブドウ球菌エンテロトキシンB(2.5μg/ml)および抗CD3(2.5μg/ml)/抗CD28(2.5μg/ml)抗体により一晩刺激した。SIV P27およびKi-67の細胞内染色は、感染(P27+)CD4+細胞内の活性化(Ki-67+)のパーセンテージを決定するために刺激の48時間後に実行した。

A-VIII ELISPOTアッセイ。アカゲザルIFN-γおよびIL-10 ELISPOTアッセイは、市販のキット(Cell Sciences、Canton、MA)を使用して、P27またはAT-2不活性化SIVの存在下または非存在下において非培養PBMCにおいて実行した。TGF-b1 ELISPOTキットは、R&D Systems(Minneapolis、MN)から購入した。データは、自動化ELISPOTリーダー(AID、GmbH、Stra berg、Germany)により読み取った。SIV特異的スポット形成細胞(SFC)の数は、培地のみがある状態での非特異的SPCを減じることによって計算した。

A-IX 抗ウイルスアッセイ。磁気ポジティブ標識(MicroBeads、Miltenyi Biotec)によって精製したそれぞれの動物由来の自己由来CD4+T細胞を、1:2のCD4/CD8比で、磁気的に精製したCD8+T細胞の存在下または非存在下において、SIVmac239(10^-3MOI)により急性的に感染させ、それから、16時間、SEB(Sigma)により刺激した。洗浄後、細胞は、5%CO₂の存在下において、37℃で5日間、96ウェルプレートにおいて、100IUのヒトrIL2を含有するRPMI 1640培地(Invitrogen、Shanghai、China)のウェル当たり200μlの最終容量において四通り、培養した。細胞培養は、3日目に新鮮な培地の半分と1回交換した。5日目に収集した培養上清は、リアルタイムのRT-PCRによってウイルス量の測定に使用した(以下を参照されたい)。抑制パーセント(%)は、CD4+感染細胞のみを含有する二通りのウェル由来の培養上清におけるウイルス濃度の幾何平均を、混合性のCD8+およびCD4+細胞を含有する四通りのウェル由来の上清におけるウイルス濃度の幾何平均と比較することによって計算した。CD4+T細胞はまた、ウイルス抑制およびHLA拘束性の間の相関性を決定するために同種異系CD8+T細胞と共培養した。

A-X ウイルス量測定値。血漿中のSIV RNAまたは細胞関連性のSIV DNAは、SIVmac239およびSIVmac251のために特異的に最適化したプライマー(センス、配列番号1:5'-GAGGAAAAGAAATTTGGAGCAGAA-3';アンチセンス、配列番号2:5'-GCTTGATGGTCTCCCACACAA-3')およびプローブ(配列番号3:5'-FAM-AAAGTTGCACCCCCTATGACATTAATCAGATGTTA-TAMRA-3')を使用して、リアルタイムRT-PCRまたはPCRによって定量化した。

A-XI SIV特異的抑制性T細胞アッセイ。メーカー(Miltenyi Biotec)によって提供されるプロトコールにより磁気ビーズコンジュゲート抗CD8または抗CD25抗体によってCD8またはCD25を枯渇させた(またはしなかった)新鮮なPBMCは、0.5の感染多重度(MOI)で2時間、SIVmac239を感染させた。感染細胞は、ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)(2.5μg/ml)(Sigma)および抗CD3(2.5μg/ml)/抗CD28(2.5μg/ml)抗体(BD Biosciences)により一晩処理した。SIV P27およびKi-67の同時の細胞内染色は、感染(P27+)細胞集団内のT細胞活性化(Ki-67+)のパーセンテージ(%)を決定するためにインビトロにおける刺激の48時間後に実行した。

A-XII ウイルス抗原投与。
XII-1.SIV産生は、SIVmac239(P. A. Marxの寄贈)を接種したマカクPBMCで実行した。培養上清は、最良のウイルス産生時に収集した。

XII-2.直腸内抗原投与(IRC):ワクチン接種の後に、動物は、5000 MID 100、すなわち5×10⁵ TCID50の病原性SIVmac239を直腸内に接種した(繰り返し)。この感染性の用量は、一般的に、10日目〜14日目にピーク血漿ウイルス量(10⁶〜10⁷コピー/ml)で100%の中国アカゲザルの全身感染症をもたらす。SIV抗原投与動物はすべて、1か月間2週間ごとにまた、その後1か月ごとに臨床的にまた生物学的に評価した。

XII-3.静脈内抗原投与(IVC):ワクチン接種の後に、動物は、5 MID 100、すなわち500TCID50)(CEM174細胞株において力価を測定)の病原性SIVmac239(Aaron Diamond AIDS Research Center、New York、USAのDr. P.A. Marxの寄贈)を静脈内に接種した(繰り返し)。この感染性の用量は、一般的に、10日目〜14日目にピーク血漿ウイルス量(10⁶〜10⁷コピー/ml)で100%の中国アカゲザルの全身感染症をもたらす。SIV抗原投与動物はすべて、1か月間2週間ごとにまた、その後1か月ごとに臨床的にまた生物学的に評価した。

A-XIII 統計分析。異なる群の動物の独立データまたは免疫化前および後の対応データは、それぞれ、Mann-WhitneyまたはWilcoxon検定によって比較した。

B部-特定の材料&方法
B-I-寛容原性ビヒクルとしてのBCGの使用
B-I-I BCGの調製物
I-1.生BCG:Statens Serum InstitutでCopenhagenにおいて調製された生BCG(SSI 1331株)は、Laboratories Sanofi-Pasteur Merck, Sharp and Dome (SPMSD)から購入し、腸もしくは膣内投与に5×10⁶cfuの最終濃度でまたはそれぞれの皮内追加免疫投与に5×10⁵cfuの最終濃度で使用した。

I-2. 長期凍結乾燥(EFD)不活性化BCG:生SSI 133 BCG株は、20μm Hg未満の真空下で、5日間の長期凍結乾燥(EFD)によって死滅させ、それぞれの腸もしくは膣内投与のための5×10⁶cfuまたはそれぞれの皮内投与のための5×10⁵cfuに相当する最終用量で使用する。

I-3. 熱不活性化BCG:生SSI 133 BCG株は、ホウ酸緩衝剤において115℃で15分間、オートクレーブし、それぞれの腸もしくは膣内投与のための5×10⁶cfuまたはそれぞれの皮内投与のための5×10⁵に相当する最終用量で使用する。

B-I-II 医薬組成物
組成物は、SIV抗原のうちの1つおよび寛容原性ビヒクルを含有するRPMI 1640(Invitrogen、Shanghai、China)を使用して新たに調製した。

B-I-III 動物免疫化
免疫化の時に、動物は、筋肉内に注射したチレタミン塩酸塩およびゾラゼパム(0.7mg/kg)により麻酔をかけた。

III-1.膣内免疫化(IVI):雌動物は、1ミリリッターの医薬組成物または対照として以前に開示される1つの寛容原性ビヒクルの4時間の膣内注射によって麻酔下で免疫化した。医薬組成物または寛容原性ビヒクルによるブースター免疫化は、8週間目に同じ部位に同じ用量で与えた。動物はすべて、第1の免疫化後に2週間ごとに臨床的にまた生物学的に評価した。

III-2.経口(胃内)免疫化(IGI):医薬組成物または対照として上記に開示される1つの寛容原性ビヒクルの摂取の15分前に、麻酔下の雄または雌動物に、15mlの0.1M重炭酸ナトリウムを胃内に投与した。15mlの重炭酸ナトリウム溶液を投与直後にさらに与えた。最初のものと同様の同じ寛容原性ワクチン接種を、それぞれの動物に1か月の間隔で2回繰り返した。動物はすべて、第1の免疫化後に2週間ごとに臨床的にまた生物学的に評価した。

III-3.皮内追加免疫免疫化(IDI):雌の膣内免疫化動物(上記のIVI部を参照されたい)に10⁹コピーのAT-2不活性化SIVおよび5×10⁵cfuの生BCGを含有する0.1mlの医薬組成物により皮内ブースターを麻酔下で第1の免疫化後の90日目に与えた。動物はすべて、第1の免疫化後に2週間ごとに臨床的にまた生物学的に評価した。

B-I-IV 抗ウイルスアッセイ。直腸内抗原投与後の無菌免疫に相当する閾値は、少なくとも20である。

B-II 寛容原性ビヒクルとしてのラクトバチルスプランタルムの使用
B-II-I 細菌調製物(寛容原性ビヒクル調製物)。ラクトバチルスプランタルム(LP)(ATCC8014)は、200rpmの回転速度でMRS培地において37℃で培養した。細菌培養物の対数(対数中)期にLPを得るために、細菌は、600nmで1.0の光学濃度を得るまで培養し、最終LP濃度は、約10¹⁰cfu/mlであった(約3.5時間で得た)。

B-II-II 経口(胃内)送達による動物免疫化。動物に一晩絶食させた(朝食なし)。経口投与の時に、動物は、筋肉内に注射したチレタミン塩酸塩およびゾラゼパム(0.7mg/kg)により麻酔をかけた。

免疫第1:8頭の動物に、マルトデキストリン(20%)溶液中4×10⁷コピー/mlのDI-SIVおよび3×10⁹cfu/mlの生LPを含有するウイルス細菌調製物からできている30mlを胃内に投与した。この第1の免疫化の後に、サルは、3時間の間に、それぞれ30分間、25mlの同じウイルス細菌調製物(すなわち医薬組成物)を胃内に受け続けた。この経口送達プロトコールは、5日連続の作業日にわたり5回実行した。対照として並行して、4頭の動物に生LPのみを投与し、他の3頭は、2回不活性化したSIVのみを受けた。

免疫第2:12頭の動物(iSIV/LP#9〜20)に、マルトデキストリン(20%)溶液中4×10⁷コピー/mlのiSIV(AT-2/熱不活性化SIVmac239)および3×10⁹cfu/mlの生LPの30mlの調製物を胃内に投与した。それから、動物は、5日連続で3時間30分間ごとに(6回)、25mlの同じ調製物を受け続けた。6頭の動物(LP#5〜10)に、マルトデキストリン(20%)溶液中30mlの3×10⁹cfu/mlの生LPを胃内に投与した。それから、動物は、5日連続で3時間30分間ごとに(6回)、25mlの同じ調製物を受けていた。最終的に、さらに6頭の動物(iSIV#5〜10)に、4×10⁷コピー/mlのiSIVのみの30mlの調製物を胃内に投与した。それから、動物は、5日連続で3時間30分間ごとに(6回)、25mlの同じ調製物を受けていた。

B-II-III インビボにおけるCD8⁺T細胞の枯渇。マカクは、最初に麻酔をかけ、それから、以前に記載されるように(Schmitzら、1999)、0、4、および7日目に、5mg/kg、でキメラ抗CD8モノクローナル抗体(cMT-807、Centocor Research & Development, Inc.、Malvern、Pennsylvania、USA)の静脈内注射を与えた。末梢血試料(5ml)は、抗体注射後に0日目および様々な時点でそれぞれの動物から採取した。

B-II-IV 抗ウイルスアッセイ。直腸内抗原投与後の無菌免疫に相当する閾値は、少なくとも100である。

B-II-V CD8+T細胞SIV抑制アッセイ。磁気ポジティブ標識(MicroBeads、Miltenyi Biotec)によって精製したそれぞれの動物由来の自己由来CD4+T細胞を、1:2のCD4/CD8比で、磁気的に精製したCD8+T細胞の存在下または非存在下において、SIVmac239(10^-3感染多重度)により急性的に感染させ、それから、16時間、SEBおよび抗CD3/抗CD28抗体により刺激した。洗浄後、細胞は、96ウェルプレートにおいて四通りで培養した。培養は、5日間、100IUのヒトrIL2(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)を含有するRPMI 1640培地のウェル当たり200μlの最終容量で維持した。5日目に収集した培養上清は、リアルタイムのRT-PCRによってウイルス量の測定に使用した(以下を参照されたい)。抑制倍数は以下のように計算した:感染CD4+標的細胞のみ由来の培養上清におけるウイルス濃度の幾何平均/混合性のCD8+およびCD4+T細胞由来の上清におけるウイルス濃度の幾何平均)。

いくつかの実験において、CD8+およびCD4+T細胞は、Multiwell Insert System(BD Biosciences)を使用することによって、細胞間接触を伴うことなく培養した(インサートウェル中にCD8およびボトムウェル中にCD4);CD4+T細胞は、ウイルス抑制およびMHC拘束性の間の相関性を決定するために同種異系CD8+T細胞と共培養した;CD8+およびCD4+T細胞はまた、MHC拘束性の型式を定義するためにも、抗-MHC-ABC(BioLegend)抗体または抗-MHC-E(Cell Science)抗体の存在下において共培養した。抗ウイルス活性と関連するCD8+T細胞のサブセットを定義するために、CD8+T細胞は、LDカラム(Miltenyi Biotec)を通しての抗PEマイクロビーズを使用する、PEコンジュゲート抗TCRγδ、抗Vβ8、または他の抗CD抗原抗体によるそれらの枯渇の直後にPBMCから精製した。

B-II-VI SIV特異的CD8+T細胞の細胞傷害性アッセイ。10¹⁰ AT-2処理SIVmac239を適用した精製CD8+T細胞(エフェクター細胞)および精製CD4+T細胞の両方(標的細胞)を、37℃で10分間、40nM 3,3'ジヘキシルオキサカルボシアニン(DiOC₆)(Marchettiら、1996)(Molecular Probes)により標識した。標的細胞は、氷上で、20分間、PerCP-Cy5コンジュゲート抗CD4(BD Bioscience)により標識した。3回洗浄した後に、エフェクター細胞は、三通り、異なるE/T比(3:1、1:1、0.3:1)で、U底96ウェルプレートにおいて標的細胞と混合した。APCコンジュゲート抗CD32(BD Bioscience)を有するK562細胞(標的)および4人の健康なドナー由来の精製CD56⁺(NK)細胞(エフェクター)は、アッセイ対照として含めた。SEBおよび抗CD3/抗CD28の存在下における37℃での4時間のインキュベーションの後に、細胞は、収集し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞傷害性パーセントは、以下のように計算した:100×(総アポトーシス標的細胞の%-自発的アポトーシス標的細胞の%)/(100-自発的アポトーシス標的細胞の%)。

B-II-VII ウイルス抗原投与。
第1の研究:実験の第1のバッチ(免疫化第1)におけるワクチンまたは対照の経口投与の4か月後に、8頭の免疫化動物およびそれらの7頭の対照に、2500 MID₁₀₀(100.000TCID₅₀)の病原性SIVmac239を直腸内に接種した。2か月後に、4頭のワクチン接種された、また、既に保護されているサルは、直腸内ルートによって再抗原投与し(100.000TCID₅₀)、同時に、4頭の他の保護されたサルは、5MID100(200TCID₅₀)のSIVmac239により静脈内で再抗原投与した。対照として、2頭のサルは、直腸内抗原投与を受け、他の2頭は静脈内抗原投与を受けた。これらの感染性の用量は、一般的に、10日目〜14日目にピーク血漿ウイルス量(10⁷〜10⁹vp/ml)で100%の中国アカゲザルの全身感染症をもたらす。

第2の研究(免疫化第2):研究の第2のセットにおける免疫化後の420日目に、16頭の動物(iSIVおよびLPにより免疫化した8頭のサル)および8頭の対照(4頭のiSIVおよび4頭のLP)に、100,000TCID₅₀のSIVmac239を直腸内で抗原投与した。

C部-結果
C-I BCGは寛容原性ビヒクルである
C-I-I膣内投与の後の静脈内SIVmac239抗原投与に対する保護:
6頭の動物(組成物_1、2、3、4、5、および6)に、抗原としてのAT2不活性化ウイルスおよび生BCGを含む1ミリリッターの寛容原性組成物を膣内に投与した。ブースター投与は、8週間目に、同じ部位に、同じ寛容原性組成物を与えた。

同時に、5頭の他の動物(対照_1、2、3、4、および5)に、生BCGのみを含む1ミリリッターの組成物を膣内に与えた。ブースター投与もまた、8週間目に、同じ部位に、同じ組成物を与えた。

最初の投与の4か月後に、11頭の動物(組成物_1〜6および対照_1〜5)はすべて、静脈内ウイルス接種によって抗原投与した。

ウイルス量は、処理動物の血漿において定期的に決定した。

図1は、1回の静脈内ウイルス抗原投与の後の、組成物を受けた動物(組成物_1〜6)におけるおよび対照動物(対照_1〜5)における時間(日)の関数としてのウイルス負荷(血漿SIV RNAコピー/ml)を示す。

結果は、静脈内ウイルス抗原投与後に、5頭の対照動物(対照_1〜5)が、期待されるように、抗原投与後の10〜14日目に、ピーク血漿ウイルス量(10⁶〜10⁷コピー/ml)により、典型的な一次感染を示したことを示す。対照動物のこの群の血漿ウイルス量は、ウイルス抗原投与後の60日間にわたりまたその後なお高度なままであった(>10⁵vp/ml)。

対照的に、AT-2不活性化SIVmac239およびBCGからできている寛容原性組成物を膣内に受けた4/6の動物は、非常に低い血漿ウイルス量ピーク(<1000vp/ml;10〜14日目)を示し、これは、急速に(ウイルス抗原投与の1か月後)検出不可能になった(<10vp/ml)。高度な血漿ウイルス量ピーク(>10⁶コピー/ml)を有する2頭の動物は、60日目に、対照群(>10⁵コピー/ml)よりも低いセットポイントウイルス量レベル(<1000コピー/ml)を有した。

C-I-II-組成物の膣内投与後の直腸内SIVmac239抗原投与に対する保護:
7頭の動物(組成物_7、8、9、10、11、12、および13)に、抗原としてのAT2不活性化ウイルスおよび寛容原性ビヒクルとしての生BCGを含む1ミリリッターの寛容原性組成物を膣内に投与した。ブースター投与は、8週間目に、同じ部位に、同じ組成物を与えた。

同時に、5頭の他の動物(対照_6、7、8、9、および10)に、生BCGのみを含む1ミリリッターの組成物を膣内に与えた。ブースター投与もまた、8週間目に、同じ部位に、同じ組成物を与えた。

最初の投与の4か月後に、12頭の動物(組成物_7〜13および対照_6〜10)はすべて、直腸内ウイルス接種を通してSIVmac239により抗原投与した。

ウイルス量は、処理および対照動物の血漿において定期的に決定した。

図2は、直腸内ウイルス抗原投与後の、組成物を受けた動物(組成物_7〜13)におけるおよび対照動物(対照_6〜10)における時間(日)の関数としてのウイルス負荷(血漿SIV RNAコピー/ml)を示す。

結果は、直腸内ウイルス抗原投与の後に、生BCGのみの膣内投与を受けた5頭の動物(対照_6〜10)が、期待されるように、抗原投与後の10〜14日目に、ピーク血漿ウイルス量(10⁶〜10⁷vp/ml)により、典型的な一次感染を示した。対照動物のこの群の血漿セットポイントウイルス量は、ウイルス抗原投与後の60日間にわたりなお高度なままであった(>10⁵コピー/ml)。

対照的に、AT-2不活性化SIVmac239および生BCGを膣内に受けた4/7の動物は、驚くべきことに、抗原投与後の60日間の期間にわたり、検出不可能なウイルス量レベル(<10コピー/ml)を示した。3頭の他の動物は、抗原投与後の10〜14日目に、ピーク血漿ウイルス量により、典型的な一次感染を示した。しかしながら、それらのセットポイントウイルス量(10³〜10⁵コピー/ml)は、対照動物のレベル(>10⁵)よりも著しく低かった。

C-I-III-医薬組成物の膣内投与の後の繰り返しの静脈内または直腸内SIVmac239抗原投与に対する保護:
2および8か月後に、静脈内抗原投与(組成物_1、_2、および_3)後に検出不可能なウイルス量を有する3頭の動物に、同じ用量のウイルス接種材料による第2および第3の静脈内抗原投与を受けさせた。

サルのこの群の第2および第3の静脈内ウイルス抗原投与後に、同様の低いピーク血漿ウイルス量が10日目に観察された。しかしながら、ウイルス抗原投与後の30日目までに、ウイルス量は再び検出不可能になった(図3)。

組成物の最初の投与の16および23か月後に、合計3回の静脈内抗原投与(組成物_1、_2、および_3)を既に受けていた3頭の動物を、直腸内接種によってさらに抗原投与した。

期待されるように、これらの3頭の動物(最初にAT-2不活性化SIVmac239およびBCGを膣内に受けた)は、2回の連続直腸内ウイルス抗原投与後に検出可能な血漿ウイルス量ピークを再び示さなかった(<10コピー/ml)(図3)。

これらの結果は、この阻害が組成物の最初の投与の20か月後を超えて、なお観察されるので、ウイルス複製の阻害に対する効率が安定していることを確証した。

C-I-IV-医薬組成物の膣内投与および皮内ブースター後の静脈内または直腸内SIVmac239抗原投与に対する保護:
期待されるように、静脈内(対照17および18、図4)または直腸内(対照19および20、図5)ウイルス抗原投与後に生BCGのみの膣内投与を受けた4頭の動物が、期待されるように、抗原投与後の10〜14日目に、ピーク血漿ウイルス量(10⁶〜10⁷vp/ml)により、典型的な一次感染を示した。対照動物のこの群の血漿セットポイントウイルス量は、ウイルス抗原投与後の60日間までなお高度なままであった(>10⁵コピー/ml)。

対照的に、AT-2不活性化SIVmac239および生BCGからできている組成物を膣内に受け、同じ組成物による皮内ブースターに受けた3/4(75%)の動物(組成物14、15、および17)は、静脈内抗原投与後の60日間の期間にわたり、検出不可能な血漿ウイルス量(<10コピー/ml)を示した(図4を参照されたい)。残り1頭の動物(組成物16)は、抗原投与後10〜14日目に、ピーク血漿ウイルス量(>10⁵コピー/ml)により一次感染を示した(図4を参照されたい)。しかしながら、そのセットポイントウイルス量は、60日目に、比較的低いレベル(10⁴コピー/ml)に到達した。

さらに、AT-2不活性化SIVmac239および生BCGからできている組成物を膣内に受け、同じ組成物の皮内ブースターを受けた4/4(100%)の動物(組成物18〜21)は、直腸内抗原投与後の60日間の期間にわたり、検出不可能な血漿ウイルス量(<10コピー/ml)を示した(図5を参照されたい)。

C-I-V- 医薬組成物の経口投与後の直腸内SIVmac239抗原投与に対する保護:
4頭の動物(組成物_22、_23、_24、および_25)に、AT2不活性化ウイルスおよび生BCGを含む1ミリリッターの組成物を胃内に投与した。

同時に、4頭の他の動物(対照21〜24)に、1ミリリッターの生BCGのみを胃内に与えた。

それぞれの動物に最初に与えた同じ投与を、第1の投与工程後の15、30、および60日目に3回繰り返した。

結果は、直腸内ウイルス抗原投与(90日目に実行)後に、生BCGのみを受けた4頭の動物(対照21〜24)が、抗原投与後の10〜14日目に、ピーク血漿ウイルス量(10⁶〜10⁷コピー/ml)により、典型的な一次感染を示したのに対して、AT-2不活性化SIVおよび生BCG組成物を受けた4頭の動物(組成物_22〜25)は、驚くべきことに、検出不可能な血漿ウイルス量(<10コピー/ml;10〜14日目に)を示した(図6)。

C-I-VI- AT2不活性化ウイルスおよび生BCGからできている組成物の投与後のSIVmac239抗原投与に対する免疫の相関現象および保護:
SIVに対して向けられる全身性の抗体は、処理された動物の血液において検出されなかった。しかしながら、皮内追加免疫組成物投与が使用された場合に、いくつかの特異的な全身性の体液性応答が検出された。結果的に、処理された動物についてSIV感染症に対して観察された保護は、全身性の体液性応答に起因しない。

さらに、従来のSIV特異的ガンマインターフェロン産生細胞傷害性リンパ球は、ELIspotによって検出可能ではなかった(データ示さず)。SIV特異的な通常のものではない細胞性応答が存在するかどうかを評価する目的で、血液試料を、それぞれの処理または対照動物について採取し、CD4+およびCD8+細胞を従来の方法によりそれぞれの試料から精製した。あらかじめ得たCD4+細胞を培養し、それから、従来の方法によりSIVmac239により感染させた。それから、SIV感染CD4+細胞は、5日間、あらかじめ得た自己由来のCD8+細胞の存在下または非存在下において培養した。上清SIV濃度は、定量的リアル-PCRによってアッセイした。

図7は、図2において提示される実験の過程において得られた自己由来のCD8+細胞の存在下または非存在下において得られるSIV感染CD4+におけるウイルス複製の抑制倍数を示す。試験したCD8は、膣内ルートによって、AT2不活性化ウイルスおよびBCGの組成物(組成物_7〜13)を受けた動物からまたは対照動物(対照6〜10)から得た。

結果は、ウイルス感染症から保護された動物由来のCD8 T細胞(組成物_7、組成物_8、組成物_10、および組成物_11)が、20倍を超える、SIV感染CD4細胞におけるウイルス抑制のレベルをもたらすのに対して、ウイルス感染症から保護されなかった動物由来のCD8 T細胞(組成物_9、組成物_12、および組成物_13)が、10倍に劣るまたはそれと等しいウイルス抑制のレベルもたらすことを示す(図7)。さらに、20倍を超えるウイルス抑制はまた、図1において提示される静脈内ウイルス抗原投与から保護された4頭の動物においても観察された(データ示さず)。

図8は、図6において提示される実験の過程において得られた自己由来のCD8+細胞の存在下または非存在下において得られるSIV感染CD4+におけるウイルス抑制のレベルを示す。試験したCD8は、経口投与によって、AT2不活性化ウイルスおよびBCGの組成物(組成物_22〜25)を受けた動物からまたは対照動物(対照21〜24)から得た。

図9は、図6において提示される実験の過程において得られた自己由来のCD8+細胞の存在下または非存在下において得られたSIV(P27+)感染CD4細胞集団におけるT細胞活性化(Ki-67+)のレベルを示す。試験したCD8は、経口投与によって、AT2不活性化ウイルスおよびBCGの組成物(組成物_22〜25)を受けた動物からまたは対照動物(対照21〜24)から得た。自己由来のCD8+T細胞によるCD4+T細胞活性化のSIV特異的抑制は、組成物を受けた4頭の動物において観察された。

結果は、AT2不活性化およびBCGの膣内または経口投与によって得られた全身性または粘膜SIV感染症の予防が、SIV感染CD4細胞アネルギーと関連する非細胞傷害性CD8+T細胞応答によって特徴付けられる免疫寛容の状態を誘発したことを確認する。これらの結果を考慮して、BCGは、したがって、寛容原性アジュバントとして同定することができる。

まとめると、これらの結果は、SIV抗原に対する免疫寛容の定常状態は、不活性化されたSIVウイルスおよび生BCGからできている組成物の膣内または経口(もしくは胃内)投与によって初めて達成されることを実証した。同時に、本発明によるAT2不活性化SIVウイルスおよび生BCGを含む医薬組成物の膣内または経口投与は、直腸内または静脈内抗原投与の後に慢性ウイルス感染症を予防するのに有効である(>50%)ことが初めて示された。

C-II-寛容原性ビヒクルとしてのラクトバチルスプランタルムの使用
C-II-I-二重不活性化SIVおよびラクトバチルスプランタルム(iSIV/LP)の経口同時投与によるSIV特異的免疫寛容の誘発
一方では、SIV特異的抗体(IgG、IgM、およびIgA)は、経口iSIV/LPにより処理された動物において検出されなかった(図10a)。他方では、著しいSIV P27特異的末梢血CD4+T細胞増殖は、iSIV/LP処理動物において観察されなかったが、iSIV処理動物は、著しいP27特異的末梢血CD4+T細胞増殖を示した。

C-II-II-非細胞傷害性CD8+細胞の抗活性化および抗ウイルス活性
SIV P27特異的末梢血CD8+T細胞増殖は、iSIV/LP処理およびiSIV処理動物の両方において観察された(図10b)。しかしながら、インターフェロンガンマ分泌T細胞(インビトロにおける刺激に際して)は、iSIV/LP処理動物において検出されず、CD8+またはCD25+細胞の枯渇は、P27特異的エフェクターT細胞の非応答性を改変しなかった(図10c)。さらに、非細胞傷害性CD8+T細胞による感染(P27+)CD4+T細胞の活性化(Ki-67+)の強力な抑制もまた、iSIV/LP処理動物から採取した、急性的にインビトロにおいて感染させたPBMCにおいて観察され、CD25+細胞の枯渇は、感染CD4+T細胞の活性化に対するCD25-CD8+T細胞によって作用される強力な抑制を改変しなかった(図10d)。

注目すべき事実は、SEBおよび抗CD3/抗CD28抗体の存在下または非存在下において非複製SIVmac239を適用したCD8+T細胞およびCD4+T細胞を共インキュベートした後に、高感度細胞傷害性アッセイ(Marchettiら、1996)によって細胞溶解が検出されなかったことである(図10e)。

最終的に、iSIV/LPによって2か月以上処理した動物から採取した末梢血CD8+T細胞は、急性的にインビトロにおいて感染させた自己由来のCD4+T細胞においてウイルス複製に対する強力な抑制活性を示した(図11a)。さらに、CD8+T細胞のそのような強力な抗ウイルス活性はまた、急性的にインビトロにおいて感染した異種CD4+T細胞においても同様に観察され(図11b)、非古典的HLA1拘束性メカニズムが、CD8+T細胞の抑制性/阻害活性に関与することを示唆した。

2か月以上前にLP/iSIVにより免疫化したマカクから採取した精製末梢血CD8+T細胞は、SEBおよび抗CD3/抗CD28抗体により一晩刺激し、それから5日間共培養した、自己由来の、急性的にSIVmac239に感染させたCD4+T細胞に対して強力な抗ウイルス活性を有した。一度、SIV特異的CD4+T細胞活性化が確立されたら(刺激の48時間後)、CD8+T細胞を追加しても、もはやウイルス複製を阻害することはできない(図11c)。この観察は、ヒト自己免疫性1型糖尿病における従来の研究によって示唆されるような(Jiangら、2010)、長期間の培養における、CD8+T細胞による、標的(増殖性に感染した)CD4+T細胞の潜在的な溶解に反証する。このCD8+T細胞媒介性抗ウイルス活性は、細胞間接触を必要とし(図11d)、また、他の免疫化動物由来のまたは対照動物由来の急性的に感染させたCD4+T細胞に対する、CD8+T細胞によって作用されるウイルス複製の強力な阻害によって示されるように、古典的MHCIa非拘束性でもあった(図11e)。最終的に、CD8媒介性抗ウイルス活性は、抗MHC-Ia/ABC抗体によってではなく、抗MHC-Ib/E抗体によって遮断され、非古典的MHC-Ib/E拘束性CD8+T細胞活性を示した(図11f)。

CD8+T細胞TCR発現が、標的CD4+T細胞によって運ばれるMHC-Ib/E-ペプチド複合体を認識するのに必要であることが確立されている(Sarantopoulosら、2004; Van Kaer、2010)。抗体コンジュゲート磁気マイクロビーズによるインビトロにおける枯渇を使用し、TCRγδおよびVβ8がウイルス複製のCD8+T細胞抑制に関与しないことが示された(図11g)。TCRαβは、したがって、感染したCD4+T細胞上のMHC-Ib/Eペプチド提示の認識において中心的な役割を果たすように思われる。さらに、非ヒト霊長動物の膜CD(「表面抗原分類」)抗原(CD7、CD11a、CD16、CD25(IL-2RA)、CD27、CD28、CD39、CD62L、CD95、CD101、CD122(IL-2RB)、CD127(IL-7R)、CD129(IL-9R)、CD137、CD150、CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD195(CCR5)、CD196(CCR6)、CD197(CCR7)、CD215(IL-15Ra)、CD218(IL-18Ra)、CD223(LAG3)、CD226、CD247、CD272、CD277、CD279(PD-1)、CD305(LAIR1)、およびCD357)と交差反応する入手可能な抗ヒト抗体によりCD8+T細胞を枯渇することによって、MHC-Ib/E拘束性CD8+T細胞活性と関連するCD抗原を同定することができなかった(表1)。下記のTable 1(表1)は、第1の免疫研究(免疫第1)においてCD抗原により定義したサブセット^*の枯渇前および枯渇後の8頭のiSIV/LP免疫化動物から採取したCD8+T細胞の抗ウイルス活性(抑制倍数、幾何平均±SE)を示す。

C-II-III 経口免疫寛容による直腸内抗原投与からの動物の保護
iSIV/LPまたは対照調製物の投与の3か月後に、8頭のiSIV/LP免疫化および7頭の対照動物を、SIVmac239の単一の高用量(100,000 TCID₅₀)により直腸内に抗原投与した。8頭のiSIV/LP処理動物のうちの8頭が、病原性SIVmac239の直腸内抗原投与から保護されたが、4頭のiSIV処理および4頭のLP処理動物は、同じ直腸内ウイルス抗原投与によって感染した(図12aおよび図12b、図の左部分)。

C-II-IV 経口免疫寛容による静脈内抗原投与からの動物の保護
この第1の抗原投与の2か月後に、8頭のサルのうちの4頭が、静脈内ルートを介しての第2の抗原投与を受けた(200TCID₅₀)。それらはすべて、抗原投与後の10日目に、複製のわずかなピークを示した(≦200 SIV DNAコピー/100万PBMCおよび血漿の200SIV RNAコピー/ml)が、しかしながら、30日目までに、PBMC SIV DNAは、≦10コピー/100万細胞まで減少し、血漿SIV RNAは検出不可能となり(≦10コピー/ml)、ウイルスのインビボにおける活性な複製の欠如を示した(図12aおよび図12b、図の右部分)。対照的に、同じ静脈内SIVmac239抗原投与(200TCID₅₀)を受けた2頭のナイーブ動物は、感染に成功した。4頭の残りのサルに、直腸内に再抗原投与し(100.000TCID₅₀)、それらはすべて、完全に保護されたままであった(図12aおよび図12b、図の右部分)。

C-II-V CD8+T細胞の役割についてのインビボにおける確認
この第2の抗原投与の5か月後に、CD8+T細胞の役割をインビボにおいて確認するために、マウスヒトキメラモノクローナル抗CD8抗体(cMT-807、Centocor)の3回の静脈内注射を、1週間(免疫化後300、304、および307日目)の期間にわたって、末梢血およびリンパ器官からそれらのCD8+T細胞を一時的に枯渇させるために8頭の既に抗原投与されているサルに与えた(図13aおよび図13b)。ウイルスRNAまたはDNAの出現は、直腸内ルートによって再抗原投与された4頭のマカクにおいて検出されず、再びそれらの完全な無菌の保護を実証し、対照的に、強力なウイルス複製は、10⁶RNAコピー/mlでピークに達したそれらの血漿ウイルス量ならびに15日目(CD8+T細胞枯渇の最下点)までに10⁴DNAコピー/10⁶細胞に到達したそれらのPBMCおよびリンパ節のプロウイルス量によって示されるように、4頭の静脈内で抗原投与された動物のリンパ器官由来のCD8+T細胞の枯渇に付随し、4頭のサルが、ベースラインCD8+T細胞濃度に戻った60〜90日目までに、血漿SIV RNAならびにPBMCおよびリンパ節SIV DNAもまたベースラインレベルに戻った(図13c、図13dおよび図13e)。これは、複製コンピテントウイルスが静止状態の記憶CD4+T細胞において推測上、潜伏したままである、静脈内でSIV抗原投与された動物におけるインビボにおけるウイルス複製の対照におけるiSIV/LP誘発性CD8+T細胞のユニークな役割を確認した。

第2の抗原投与の8か月後に、4頭の直腸内で再抗原投与されたサルおよび4頭の静脈内で再抗原投与されたサルは、今回、別個の感染性SIV株であるSIVB670(100,000TCID₅₀)による直腸内ルートを介して、第3の抗原投与を受けた。8頭の動物は、それらの検出不可能なSIVB670 DNAおよびRNAレベルによって示されるように、次の12か月にわたって完全に保護されたままであり、それに対して、2頭のナイーブ動物は、同じSIVB670の抗原投与によって感染に成功し、LP/iSIVmac239生成MHC-Ib/E拘束性CD8+T細胞が、他のSIV株によって感染させたCD4+T細胞の活性化の予防を通して交差保護的であったことを実証した(図14aおよび図14b)。

iSIV/LP処理動物におけるSIV疾患を予防する効能の期間を決定するために、iSIV/LPによる第2の免疫化を、中国起源の8頭の新しいマカクにおいて行い、それらのCD8+T細胞のインビトロにおける抗ウイルス活性を、SIV抗原投与なしである期間にわたってチェックした。そのようなインビトロにおける抗ウイルス活性は、LP(n=4)またはiSIV(n=4)のみにより処理した対照動物と比較して、免疫化後60日目から検出された。

エキソビボ抗SIV活性レベルは、8頭のサルのうちの7頭において420日目まで維持されたが、1頭のサルの抗ウイルス活性は、360日目から次第に減少し、420日目までに対照サルのベースラインレベルに到達した(図15a)。免疫化後の420日目に、16頭の動物を、100,000TCID₅₀のSIVmac239により直腸内で抗原投与した。8頭のiSIV/LP免疫化動物のうちの7頭は、血漿およびPBMC(図15bおよび図15c)ならびに直腸粘膜リンパ球(それらは抗原投与の1日目から測定した)および骨盤リンパ節(図16a〜図16e)において、いかなるSIV RNAおよびDNAの出現も伴うことなく無菌免疫を獲得したが、1頭の免疫化したサルが完全に感染した。重要なことには、8頭のワクチン接種したサルのエキソビボ抗ウイルス活性の発生は、免疫化後の360日目(すなわちそれらの抗原投与の60日前)から7頭の保護されたサルおよび保護されなかったサルを予測することを可能にした(図15a〜図15c)。

C-II-VI 結論
マカクモデルにおいて、不活性化されたSIVmac239(iSIV)および共生ラクトバチルスプランタルム(LP)(寛容原性アジュバントと呼ばれる)の投与が、SIV抗原提示CD4+T細胞の活性化の抑制ならびにそれによってSIV複製の抑制およびSIVの抗原投与からのマカクの保護を誘発したMHC-Ib/E拘束性CD8+T細胞を生成することが本明細書において開示される。

不活性化されたiSIVおよびLPからできている混合物を、合計16頭の動物および15頭の対照に胃内に投与した。4〜14か月後に、動物すべてに、病原性SIVmac239により直腸内に抗原投与した。

SIV感染症に対する完全な保護は、16頭のiSIV/LP投与動物のうちの15頭の動物において観察され、対照的に、感染症は、すべての対照動物および1頭のワクチン接種したサルにおいて確立された。保護されなかったサルは、直腸内の抗原投与の60日前にエキソビボ抗ウイルスアッセイによって予測することができる。8頭の保護された動物は、4頭のサルにおいて静脈内におよび他の4頭において直腸内に与えられた第2のSIVmac239抗原投与後に保護されたままであった。

8頭のiSIV/LP送達動物は、SIV特異的末梢血CD4+T細胞増殖の完全な欠如を有し、いかなる全身性のSIV特異的抗体(IgG、IgM、またはIgA)も産生しなかった。

さらに、それらのSIV特異的末梢血CD8+T細胞は、数個の特殊性を有した:
1)それらは、インビトロにおける刺激に際して、十分に、しかしインターフェロン-γ分泌を伴うことなく増殖した;
2)それらは、強く急性的に感染させた自己由来のCD4+T細胞の活性化を抑制した;
3)両方の機能は、CD25+細胞の枯渇後に変わらなかった;
4)それらはまた、急性的に感染させた同種異系CD4+T細胞においてもSIV複製を阻害した;および
5)それらの抑制性/阻害作用は、MHC-Ib/E拘束性であった。

これらの結果は、マカクが、SIV特異的免疫寛容を生成するウイルス特異的非細胞傷害性MHC-Ib/E拘束性CD8+調節性T細胞を発生させるのをiSIVおよびLPの胃内同時投与が可能にすることならびに非常に驚くべきことに、そのようなウイルス特異的免疫寛容が、SIV感染症の確立に対する動物のワクチン保護と関連することを示す。

本発明による医薬組成物が、ヒト/哺乳動物におけるHIVおよびSIV感染症を予防することが上記に示される。この予防作用は、寛容原性ワクチン接種対象(すなわち、医薬組成物が投与された哺乳動物)において「Ts」免疫寛容を誘発することによってマカクにおいて得られる。前記「Ts」免疫寛容は、ウイルス特異的非細胞傷害性MHC-Ib/E拘束性抑制性CD8調節性T細胞を伴うことが本明細書において実証され、その存在および活性は、
-本発明の医薬組成物が投与されたマカクの急性的に感染したCD4+T細胞におけるSIV複製を阻害する(インビトロにおいて)および/または
-感染性SIVにより抗原投与される寛容原性ワクチン接種マカクにおけるSIV複製を予防する(インビボにおいて)ことが示される。
(参考文献)

Claims

粒子抗原および非病原性細菌の混合物を含む医薬組成物。
前記抗原が、HIV Gagおよび/またはPolタンパク質由来の1つまたは複数のエピトープを有する、請求項1に記載の医薬組成物。
HIV Gagおよび/またはPolタンパク質由来の1つまたは複数のエピトープを有する抗原ならびに非病原性細菌の混合物を含む医薬組成物。
前記抗原が、粒子抗原である、請求項3に記載の医薬組成物。
前記抗原が、サイズが少なくとも約110kDaである、請求項1から4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記粒子抗原が、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、組換えウイルス粒子、コンジュゲートウイルスタンパク質、およびコンカテマーウイルスタンパク質から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記組換えウイルス粒子または前記ウイルス粒子が、不活性化されている、請求項6に記載の医薬組成物。
HIV Gagタンパク質由来の前記エピトープが、カプシドタンパク質(p24)およびマトリックスタンパク質(p17)由来のエピトープから選択される、請求項2から7のいずれか一項に記載の組成物。
HIV Polタンパク質由来の前記エピトープが、インテグラーゼ、逆転写酵素、およびプロテアーゼ由来のエピトープから選択される、請求項2から7のいずれか一項に記載の組成物。
前記細菌が、生きている、請求項1から9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記細菌が、弱毒化された病原性細菌、不活性化された病原性細菌(任意選択で、さらに弱毒化されている)、および非病原性乳酸菌から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記細菌が、ラクトバチルス細菌である、請求項11に記載の医薬組成物。
前記細菌が、ラクトバチルスプランタルムである、請求項12に記載の医薬組成物。
前記粒子抗原が、ウイルス粒子であり、ウイルス粒子の量が、前記混合物の1ml当たり約10⁶〜約10¹²である、請求項6から13のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記細菌の量が、前記混合物の1ml当たり約10⁴〜約10¹⁴CFUである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記粒子抗原が、ウイルス粒子であり、前記混合物における前記細菌に対する前記ウイルス粒子の比が、約1:10〜約1:1000、好ましくは約1:100である、請求項6から15のいずれか一項に記載の医薬組成物。
粘膜または皮内もしくは上皮内医薬組成物である、請求項1から16のいずれか一項に記載の医薬組成物。
経口医薬組成物である、請求項17に記載の医薬組成物。
その必要のあるヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するための方法における使用のための、請求項1から18のいずれか一項に記載の医薬組成物。
HIVからヒトを保護するための方法において使用するための、請求項1から18のいずれか一項に記載の医薬組成物。
HIVセロコンバージョンからヒトを保護するための方法において使用するための、請求項1から18のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記粒子抗原が、ウイルス粒子であり、1日当たり約10⁸〜約10¹⁴のウイルス粒子の用量が、前記ヒトに投与される、請求項19から21のいずれか一項に記載の医薬組成物。
1日当たり約10⁶〜約10¹⁶CFUの前記細菌の用量が、前記ヒトに投与される、請求項19から22のいずれか一項に記載の医薬組成物。
ヒトにおけるHIVに対する抗原特異的免疫保護を誘発し、好ましくは維持する、請求項1から23のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記免疫保護が、前記ヒトにおけるHIVウイルス量の低下および好ましくは抑制によって特徴付けられる、請求項24に記載の医薬組成物。
前記免疫保護が、前記ヒトにおけるHIV Gagおよび/またはPol抗原提示CD4+T細胞の活性化を抑制するCD8+調節性T細胞によって特徴付けられる、請求項24または25に記載の医薬組成物。
前記免疫保護が、前記ヒト由来のCD8+調節性T細胞の存在または活性をインビトロにおいて検出することによって前記ヒトにおいて決定される、請求項26に記載の医薬組成物。
前記CD8+調節性T細胞が、MHC-Ib/E拘束性CD8+調節性T細胞である、請求項26または27に記載の医薬組成物。
前記HIVが、HIV-1またはHIV-2である、請求項2から28のいずれか一項に記載の医薬組成物。
その必要のあるヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するための医薬キットであって、
-第1の容器中に粒子抗原、および
-第2の容器中に非病原性生細菌
を含み、前記抗原および前記細菌が、粘膜または皮内もしくは上皮内投与のための薬学的に許容できるキャリア中にある医薬キット。
前記抗原が、HIV Gagおよび/またはPolタンパク質由来の1つまたは複数のエピトープを有する、請求項30に記載の医薬のキット。
その必要のあるヒトにおけるHIV疾患を予防するおよび/または治療するための医薬キットであって、
-第1の容器中に、HIV Gagおよび/またはPolタンパク質由来の1つまたは複数のエピトープを有する抗原、ならびに
-第2の容器中に非病原性生細菌
を含み、前記抗原および前記細菌が、粘膜または皮内もしくは上皮内投与のための薬学的に許容できるキャリア中にある医薬キット。
前記抗原が、粒子抗原である、請求項32に記載の医薬キット。