CN117202926A - 新型免疫调节平台及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了包含基因修饰的益生菌微生物的方法、系统和组合物。在一些实施方案中，基因修饰的益生菌微生物产生至少一种病毒外壳蛋白和/或至少一种包含与病毒外壳蛋白连接的抗原多肽的融合蛋白。

Description

新型免疫调节平台及其使用方法

相关申请的交叉引用

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序列表

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技术领域

本公开涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本公开提供了一种重组细菌，该重组细菌被基因修饰以产生至少一种抗原多肽，所述抗原多肽包括，例如，病毒样颗粒(VLP)，或包含与至少一种附加的抗原多肽连接的VLP的融合蛋白。在一些实施方案中，VLP或VLP-融合蛋白在宿主益生可食用细菌(诸如嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus))中重组产生，以产生能够调节免疫系统的抗原，包括但不限于充当疫苗。本文还提供包含RNA-细菌噬菌体的病毒样颗粒(VLP)和/或包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含与至少一种抗原连接的VLP。

背景技术

胃肠道是一个复杂而动态的生态系统，包含多种多样的微生物集[1]。人类胃肠道中的绝大多数微生物细胞是细菌，在门水平上属于两个门，即拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)，尽管也存在其他门。宿主生理学和肠道微生物群密切相关。沿着胃肠道的每个不同解剖区域都有其自身的生理化学条件特点，并且这些变化的条件对微生物群施加选择性压力，这些事实可以明显看出这一点。影响肠道微生物群组成的生理化学条件包括：肠蠕动性、pH、氧化还原电位、营养供应、宿主分泌物(例如，盐酸、消化酶、胆汁和粘液)以及完整的回盲瓣的存在。因此，胃肠道拥有许多不同的生态位，每个生态位都包含不同的微生物生态系统，这些生态系统根据胃肠道内的位置而变化。微生物密度沿胃肠道增加的事实已经证明了这一点。事实上，每克肠道内容物，微生物密度从胃和十二指肠中的10¹-10⁴个微生物细胞，空肠和回肠中的10⁴-10⁸个细胞增加到结肠和粪便中的10¹⁰-40¹²个细胞。

最近，人类肠道微生物组(IM)的宏基因组估计包含330万个微生物基因，基因比人类基因组多约150倍[2]。除了我们自己的基因组之外，这种广泛的基因的存在表明，肠道微生物对人体的深远影响是可以预期的。

IM在人体的代谢，营养，生理和免疫过程中起着重要作用[3]。它通过从其他难以消化的膳食多糖(诸如抗性淀粉和膳食纤维)中提取能量来发挥重要的代谢活性。这些代谢活动还导致基本营养素的产生，诸如短链脂肪酸(SCFA)、维生素(例如，维生素K、维生素B12和叶酸)和氨基酸，而人类无法自行产生这些营养素。

IM的另一个重要作用是，它通过诸如定植抗性和产生抗微生物化合物等机制参与对病原体的防御[43]。此外，IM参与胃肠道感觉和运动功能、肠道屏障和粘膜免疫系统的发展、成熟和维持。

由于众所周知IM在人类健康和疾病中起着重要作用，因此通过益生菌、益生元和合生元操纵这些微生物是改善和维持健康的有吸引力的方法。根据世界卫生组织(WHO)制定的定义，益生菌是“活的微生物，当以足够的量施用时，会给宿主带来健康益处”[4]。此外，益生元用于操纵胃肠道中的微生物群组成。益生元的定义甚至比益生菌的定义更通用：“不可消化的食物成分，当以足够量被摄入时，选择性地刺激肠道微生物群中一个或有限数量的微生物属/物种的生长和/或活性，从而给宿主带来健康益处”。益生菌和益生元两者的混合物被称为合生元。

益生菌微生物对健康有大量益处。一般来说，这些健康益处可分为三个级别的益生菌作用[5]。第一，益生菌微生物可以直接与胃肠道(1级)作用，例如通过与IM直接相互作用或通过酶活性。第二，它们可以直接与肠粘液层和上皮(2级)相互作用，从而影响肠道屏障功能和粘膜免疫系统。第三，益生菌可以在胃肠道外(3级)产生影响，例如对全身免疫系统和其他器官(如肝脏和大脑)产生影响。

有人已经提出了IM在几种疾病和病症的发病机制中的作用[6]。近年来的多项研究假设微生物组对正常宿主功能至关重要，而宿主微生物组相互作用受损则促进许多常见病症的发病机制。其中，最近更多的注意力关注微生物组参与糖耐量受损、2型糖尿病(T2DM)和其他代谢病症的发病机制，所述其他代谢病症包括代谢综合征(MetS)，包括肥胖、非酒精性脂肪性肝病和相关并发症[7]。

由于通过益生菌/益生元调节肠道微生物群的组成被证明是可能的，因此益生菌/益生元的消费已成为社会的常态。益生菌以膳食补充剂和食物的形式消费，所述食物诸如酸奶、开菲尔(kefir)、印尼豆豉(tempeh)、德国酸菜(sauerkraut)和泡菜(kimchi)，这些食物因其益生菌健康益处而受到热捧。

除了用于支持一般健康和免疫力外，益生菌还被研究为疫苗佐剂和疫苗递送系统[8]。出于多种原因，开发改进的疫苗接种策略始终至关重要。

首先是需要提供更高水平的免疫力以对抗主要通过粘膜表面进入人体的病原体。疫苗通常通过胃肠外给药。然而，许多疾病使用胃肠道(GI)作为进入的主要门户。因此，霍乱和伤寒是由摄入病原体伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和霍乱弧菌(Vibriocholera)以及随后在黏膜上皮(内衬胃肠道)处定植(霍乱弧菌)或易位(伤寒沙门氏菌)引起的[9]。同样，结核病(TB)最初是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染肺部引起的[10]。通过注射免疫产生血清反应(体液免疫)，其包括占优势的IgG反应，这种反应在预防感染方面效果最差。这就是为什么许多疫苗部分有效或保护时间短的原因之一[11]。

其次，需要提供无针施用途径。当前疫苗接种计划的一个主要问题是它们至少需要注射一次。一个例子是破伤风疫苗。虽然保护持续10年，但儿童最初注射3剂，然后每5年加强一次[44]。许多人会因为害怕注射而选择不加强。相比之下，在破伤风死亡率很高的发展中国家，问题往往在于使用重复使用或未灭菌的针头。

第三，需要提高安全性并尽量减少不良副作用。许多疫苗由活生物体组成，这些活生物体要么是非致病性的(减毒的)，要么是以某种方式灭活的。虽然原则上认为这是安全的，但有证据表明必须开发更安全的方法。例如，在1949年(京都事件)，68名儿童因接受被污染的白喉疫苗死亡。同样，在1995年的Cutter事件中，105名儿童患上了脊髓灰质炎。发现脊髓灰质炎疫苗没有用福尔马林正确灭活。许多其他疫苗，例如MMR(麻疹-腮腺炎-风疹)疫苗和百日咳疫苗，都受到副作用的传闻的困扰，诸如自闭症谱系和自身免疫[12]。

第四，需要为储存和运输设施差阻碍了有效免疫计划的发展中国家提供经济性疫苗。在必须进口疫苗的发展中国家，假定疫苗将正确储存和分发。对发展中国家来说，在冷藏条件下将疫苗保持在适宜的卫生条件下的相关费用是巨大的。对于一些疫苗诸如口服脊髓灰质炎疫苗和卡介苗(BCG)疫苗，疫苗在2-8℃下只能存活1年[13]。对发展中国家来说，需要一种可以在环境温度下长期储存的稳定疫苗是现在的高度优先事项。理想情况下，这种类型的疫苗应在环境温度下稳定，能够承受温度变化和干燥。最后，一种生产简单的疫苗将为发展中国家带来巨大的益处，并有可能在该国生产。

因此，本领域需要开发用于口服递送的稳定疫苗平台[14]。

发明内容

本文公开了包含基因修饰的益生菌微生物的方法、系统和组合物。在一些实施方案中，基因修饰的益生菌微生物产生至少一种病毒外壳蛋白和/或至少一种包含与病毒外壳蛋白连接的抗原多肽的融合蛋白。

本文还公开了包含新型疫苗递送系统的方法和组合物。在一些实施方案中，疫苗递送系统包括基因修饰的益生菌微生物，该益生菌微生物被改造以产生至少一种融合蛋白，该融合蛋白包含与病毒外壳蛋白连接的抗原多肽。

本文还公开了包含基因修饰的益生菌微生物的方法和组合物，所述益生菌微生物被改造以单独生产病毒外壳蛋白。在一些实施方案中，基因修饰的益生菌微生物被配制成疫苗。

在一些实施方案中，本文提供了修饰的益生菌微生物。在一些实施方案中，修饰的微生物包含编码异源蛋白的核酸序列，所述异源蛋白包括以下一种或多种：病毒外壳蛋白；以及抗原肽和病毒外壳蛋白的融合体。在一些实施方案中，修饰的益生菌微生物包括选自下列的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、酵母属(Saccharomyce)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和芽孢杆菌属(Bacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、气球菌属(Aerococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、四联球菌属(Teragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)、魏斯氏菌属(Weisella)以及基因组序列相关的其他此类细菌。在一些实施方案中，修饰的益生菌微生物包括选自下列的乳杆菌属：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、Lactobacillus reuterior和发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，以及基因组序列相关的其他此类细菌。在一些实施方案中，修饰的益生菌微生物包括嗜酸乳杆菌。

在一些实施方案中，编码异源蛋白的核酸序列被整合到微生物的基因组中或编码在微生物内的质粒或载体上。例如，在一些实施方案中，编码异源蛋白的核酸序列被整合到微生物的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(upp)基因或其他合适的基因组基因座处。在一些实施方案中，修饰的益生菌微生物表达异源蛋白，并且表达的蛋白质自组装形成病毒样颗粒(VLP)。在一些实施方案中，修饰的微生物包含VLP。在一些实施方案中，异源核酸编码抗原肽和病毒外壳蛋白的融合体，并且融合蛋白自组装形成VLP。在一些实施方案中，异源核酸编码抗原肽和病毒外壳蛋白的融合体，并且表达的蛋白不自组装形成VLP。

在一些实施方案中，编码融合蛋白的核酸序列还包含以下一种或多种：连接抗原肽和外壳蛋白的接头序列；和免疫刺激序列。

在一些实施方案中，病毒外壳蛋白包括下列中的一种或多种：PP7、MS2、AP205、Qβ、R17、SP、PP7、GA、M11、MX1、f4、Cb5、Cb12r、Cb23r、7s和f2外壳蛋白或其他VLP形成蛋白。例如，在一些实施方案中，病毒外壳蛋白包括细菌噬菌体AP205外壳蛋白。

在一些实施方案中，修饰的益生菌微生物是活的培养物、活的孢子形式或灭活的。在一些实施方案中，微生物是死亡的或被冻干的。

本文还公开了包含如上所述的益生菌微生物的营养或治疗组合物。在一些实施方案中，组合物被配制成食品或饮料或以其他方式掺入食品供应中。在一些实施方案中，食品或饮料包括乳制品，例如奶、酸奶、奶酪或冰淇淋。在一些实施方案中，组合物被配制成用于口服施用的胶囊、粉剂、片剂、液体或小药囊剂。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于经鼻、直肠、肠胃外或经粘膜递送。

本文公开了用于接种受试者的方法，包括：施用有效量的如上所述的治疗组合物。本文还公开了向受试者提供营养补充剂的方法，包括施用营养有效量的如上所述的组合物。在一些实施方案中，施用包括口服施用。在一些实施方案中，施用包括经鼻、直肠、肠胃外或经粘膜递送。在一些实施方案中，治疗有效量或营养有效量作为一个或多个剂量提供。在一些实施方案中，治疗或营养有效量通过在一周、两周、三周或一个月的时程中施用多个剂量提供。在一些实施方案中，治疗或营养有效量作为在单次施用中的单剂量提供。

本发明的这些和其他实施方案、方面、优点和特征将在随后的描述中部分阐述，并且通过参考本发明的以下描述和引用的附图或通过本发明的实践，对本领域技术人员来说是显而易见的。附图示出了一个或多个实施方式，并且这些实施方式不一定代表本发明的全部范围。

附图说明

当考虑以下详细描述时，本发明将得到更好的理解，并且除上述那些之外的特征、方面和优点将变得明显。这些详细描述参考了以下附图，其中：

图1示出了示例性AP205病毒样颗粒表面的结构，含有自组装的外壳蛋白复合物并在其表面上暴露疫苗抗原肽。在该实例中，包含至少一个表位的抗原肽与外壳蛋白的每个拷贝的C-和N-末端(以红色和蓝色显示)均连接。

图2提供基于质粒的同源重组构建体的示意图。在本实例中，益生菌微生物的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因(upp基因)(上图)被靶向插入抗原-VLP(Provaxus VLP编码平台)序列(下图)。示例性质粒包括靶标插入位点的同源序列(“上游”和“下游”)。“上游”和“下游”同源序列位于待插入的抗原-VLP序列的两侧。本实例中的质粒还包括用于生长选择的抗生素抗性基因(ABR)和用于促进质粒序列和宿主基因之间重组的recT基因。

图3A-B提供不含(A)和含有(B)recT基因的示例性质粒。

图4A-B提供upp基因中的重组序列的BLAST分析，证明跨多个菌株的基因替换策略的可行性。(A)与嗜酸乳杆菌NCFM(SEQ ID NO:26)具有100％同一性。(B)与卷曲乳杆菌菌株STI具有86-89％同一性。碱基序列来自嗜酸乳杆菌(SEQ ID NO:27)。虽然该图表明各种物种中的upp序列和同源序列适用于基因替换/同源重组策略，但其他遗传基因座同样适合作为靶标，并且可以理解，本发明的方法和组合物不意在受本文所使用的基因替换靶标、序列或特定的基因替换方法的限制。

图5A-C显示了三种示例性抗原-CP融合蛋白的结构。(A)显示具有与CP的一端(C-末端或N-末端)连接的单个抗原的CP-融合蛋白单体。(B)显示具有连接到CP的不同末端(CP的C-末端和N-末端中的每一个)的两个相同的抗原序列的抗原-CP融合蛋白单体。(C)显示了具有两个不同的抗原序列的抗原-CP融合蛋白单体，每个抗原序列与CP的不同末端(C-末端和N-末端中的每个)连接。

具体实施方式

在本文中本发明使用若干定义进行描述，所述定义如下所述并贯穿整个申请。

除非上下文另有规定或另有说明，否则术语“一种”、“一个”和“该”意指“一个或多个”。例如，“一种抗原”应解释为“一种或多种抗原”。

如本文所用，“大约”、“大致”、“基本上”和“显著地”将被本领域普通技术人员所理解，并且会根据其使用的上下文而在一定程度上变化。如果这些术语的使用对于本领域普通技术人员来说不清楚，鉴于其使用的上下文，“大约”和“大致”将意指特定术语的加或减≤10％，“基本上”和“显着地”将意指特定术语的加或减>10％。

如本文所用，术语“包括”和“包括有”与术语“包含”和“包含有”具有相同的含义，因为后面的术语是“开放式”过渡术语，不将权利要求仅限于这些过渡术语之后所列举的要素。术语“由…组成”虽然涵盖在术语“包含”的范围内，但应解释为“封闭式”过渡用语，将权利要求仅限于这一过渡用语之后所列举的要素。术语“基本上由…组成”虽然涵盖在术语“包含”的范围内，但应解释为“部分封闭式”过渡用语，允许在这一过渡用语之后具有附加的要素，但前提是这些附加的要素不会对权利要求的基本特征和新颖特征产生重大影响。

如本文所用，术语“受试者”可以与术语“患者”或“个体”互换使用，并且可以包括“动物”，特别是“哺乳动物”。哺乳动物受试者可包括人类和其他灵长类动物、家畜、农场动物和伴侣动物，如狗、猫、豚鼠、仓鼠、雪貂、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。鸟类物种，如鸡、鹅、火鸡、鸭等，也涵盖在该术语的范围内。

如本文所用，“有需要的受试者”是指处于感染由微生物引起的感染的风险的受试者，或被微生物(诸如病毒、酵母、细菌或寄生虫感染)感染的受试者。该术语还涵盖怀疑具有或诊断为具有由微生物诸如病毒、酵母、细菌或寄生虫感染引起的感染的受试者。如本文所用，短语“有需要”表示受试者的状态，其中治疗或预防措施是合乎需要的。这种状态可以包括但不限于具有由感染引起的疾病或病况(例如，病毒、酵母、细菌或寄生虫感染)或处于任何此类感染风险的受试者。在一些实施方案中，有需要的受试者包括被诊断患有癌症或有癌症风险的受试者。如本领域所知，癌症表达可以被免疫系统识别和攻击的特异性抗原(例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤特异性新表位[15]和肿瘤相关抗原)。肿瘤抗原的类别包括突变癌基因和肿瘤抑制基因的产物、过表达或异常表达的细胞蛋白、致癌病毒产生的肿瘤抗原、改变的细胞表面糖脂和糖蛋白、瘤胎抗原、细胞类型特异性分化抗原。可用于本发明的方法和组合物中的肿瘤抗原的一些非限制性实例包括在生殖细胞肿瘤和肝细胞癌中发现的甲胎蛋白(AFP)；在肠癌中发现的癌胚抗原(CEA)；在卵巢癌中发现的CA-125；在乳腺癌中发现的MUC-1和/或上皮肿瘤抗原(ETA)；在恶性黑色素瘤中发现的酪氨酸酶和/或黑色素瘤相关抗原(MAGE)，和在各种肿瘤中发现的KRAS、TP53的异常产物，以及个体特异性新抗原。

本文所用的“病毒载量”是指存在于患者或动物的血液、唾液或其他液体或组织样品中的病毒量。病毒载量也称为病毒滴度或病毒血症。病毒载量可以通过多种标准方式进行测量，包括通过斑块测定或病毒核酸的拷贝当量，例如，每毫升血浆的病毒RNA(vRNA)基因组(vRNA拷贝当量/毫升)。该数量可以通过标准方法确定，例如包括，PCR或RT-PCR。在一些实施方案中，本文公开的组合物(疫苗)在施用于有需要的受试者之后，与先前未接受疫苗的对照受试者相比，导致所述受试者的病毒载量(在随后的攻毒后)降低。

如本文所用的术语“疫苗”是指用于产生免疫应答(例如，诱导抗体应答、激活T细胞等)的物质，并且其提供针对一种或多种疾病的免疫力，使其免受所述疾病的病原体的侵害。疫苗可包括，例如，微生物的弱化或死亡形式，或从引起疾病的微生物中分离的组分(例如，表面蛋白或肽或其抗原片段，毒素分子或由微生物产生或表达的毒素分子的组分)，或与之类似的合成产物。在一些实施方案中，疫苗包含来源于目标微生物的蛋白质或肽。在一些实施方案中，疫苗是病毒疫苗(即，用于改善或预防由天然病毒感染引起的疾病的疫苗)。示例性病毒疫苗包括但不限于流感疫苗、甲型和乙型肝炎疫苗、人乳头状瘤病毒疫苗、带状疱疹疫苗、天花疫苗、麻疹疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、日本脑炎疫苗、风疹疫苗、轮状病毒疫苗、黄热病疫苗、水痘病毒疫苗、拉沙/马丘波/胡宁/瓜纳里托(lassa/machupo/junin/guanarito)(和其他出血性沙粒病毒)疫苗、埃博拉病毒疫苗、艾滋病毒(HIV)疫苗和冠状病毒疫苗(例如SARS-CoV-2)。在一些实施方案中，疫苗是癌症疫苗(即，改善或预防癌症的疫苗，所述癌症可能由病毒(例如HPV)引起，也可能不是由病毒(例如HPV)引起的)。在一些实施方案中，本文公开的组合物(例如，呈递抗原蛋白的VLP)被配制成疫苗。

如本文所用，术语“病毒感染”是指受试者中任何不希望的病毒存在和/或复制。这种不希望的病毒存在可能会对宿主受试者的健康和福祉产生负面影响。术语“病毒感染”涵盖涉及几种病毒病原体物种的感染以及涉及单一病毒物种的感染，包括病毒的突变版本(例如，天然或非天然存在的变体)。在某些情况下，病毒感染是由选自流感病毒、冠状病毒(例如SARS-CoV-2)、腺病毒、诺如病毒、轮状病毒和呼吸道合胞病毒的病毒引起的。

如本文所用，术语“细菌感染”是指受试者中任何不希望的细菌存在和/或生长。这种不希望的细菌存在可能会对宿主受试者的健康和福祉产生负面影响。虽然术语“细菌感染”不应被视为涵盖通常存在于受试者中的细菌的生长和/或存在，例如在受试者的消化道中，但它可以涵盖此类细菌的病理性过度生长。术语“细菌感染”涵盖涉及几种细菌病原体物种的感染以及涉及单一细菌物种的感染，包括细菌物种的突变版本(例如，天然或非天然存在的变体和代谢无活性形式的抗生素耐药细菌)。涉及多个细菌病原体物种的感染也称为复杂、并发、混合、双重、继发、协同、合并、多种微生物或共感染。

如本文所用，术语“酵母感染”或“真菌感染”可互换使用，并且是指受试者中酵母的任何不希望的存在和/或生长。这种不希望的酵母存在可能会对宿主受试者的健康和福祉产生负面影响。虽然术语“酵母感染”不应被视为涵盖通常存在于受试者中的酵母的生长和/或存在，例如作为受试者皮肤、肠道、口腔和阴道粘膜正常菌群的成员，但它可以涵盖此类酵母的病理性过度生长。术语“酵母感染”涵盖涉及几个酵母物种的感染以及涉及单一酵母物种或酵母的突变版本(例如，天然或非天然存在的变体)的感染。

如本文所用，术语“抗原”是指将其施用于有需要的受试者以引起针对该抗原的免疫应答的作用剂，其可包括针对该抗原的保护性免疫应答，诸如在疫苗接种中。合适的抗原可包括病毒、蛋白质(多肽、肽)、碳水化合物、脂质、核酸及其任意组合。在一些实施方案中，抗原是“多聚体的”，每个VLP包含超过一个相同的表位。如本文所用，术语“表位”意指抗体结合抗原的部分或被B-和/或T淋巴细胞和/或抗原呈递细胞(例如树突细胞)识别的抗原的部分。

如本文所用，术语“免疫应答”是指导致B-和/或T淋巴细胞和/或抗原呈递细胞活化或增殖的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。“免疫原性的”是指用于刺激活生物体的免疫系统的作用剂，使得免疫系统的一种或多种功能增加并针对免疫原性作用剂。

如本文所用，术语“病毒样颗粒”(VLP)或“细菌噬菌体的病毒样颗粒”是指类似于细菌噬菌体结构的病毒样颗粒(VLP)，具有非复制性和非感染性，并且缺乏足以感染的多个病毒基因，或缺乏至少编码细菌噬菌体的复制机器的一个或多个基因，并且通常还缺乏编码负责病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白的一种或多种基因。该定义还涵盖细菌噬菌体的病毒样颗粒，其中上述一种或多种基因仍然存在但无活性，因此也产生细菌噬菌体的非复制性和非传染性病毒样颗粒。VLP包括RNA细菌噬菌体和其他病毒的VLP。虽然VLP不包括用于感染和复制的基因，但在某些实施方案中，编码病毒外壳蛋白的基因可以在VLP内。

在一些实施方案中，本文描述的VLP包括单链RNA细菌噬菌体的外壳蛋白的组装体(参见例如，RNA Bacteriophages，在The Bacteriophages中.Calendar,R L编.OxfordUniversity Press.2005)。该组的已知病毒攻击多种细菌，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter)。每个都具有高度相似的基因组组织、复制策略和病毒粒子结构。因此，本发明涵盖以下任一种病毒的外壳蛋白，并且不限于PP7、MS2、AP205、Qβ、R17、SP、PP7、GA、M11、MX1、f4、Cb5、Cb12r、Cb23r、7s和f2细菌噬菌体。VLP通常是由细菌噬菌体外壳蛋白(CP)的一个或多个亚基自组装形成的衣壳结构。在一些实施方案中，VLP衣壳结构由外壳蛋白单链二聚体或外壳蛋白单体的自组装形成；在一些实施方案中，外壳蛋白由三聚体组装而成，例如CP链A、B和C(参见例如[24]，该文的全部内容通过引用并入本文)。组装该细菌噬菌体家族的二十面体衣壳壳体所需的信息完全包含在外壳蛋白本身中。例如，纯化的外壳蛋白可以在由RNA存在所刺激的过程中在体外形成衣壳。此外，在细胞中由质粒表达的外壳蛋白在体内组装成病毒样颗粒。外壳蛋白的非限制性实例包括如下所示(SEQ ID NO:28)的AP205不动杆菌细菌噬菌体外壳蛋白(NCBI参考编号NP_085472.1)。

要理解的是，本发明不旨在受特定外壳蛋白或其氨基酸序列的限制；此类序列的变体以及合成的外壳蛋白也涵盖在本公开的范围中。

如本文所用，VLP可以由一个或多个不同的抗原-CP融合蛋白亚基的自组装聚集体构成，由此每个亚基被称为“单体”或一起被称为“单体”。构成VLP的抗原-CP融合蛋白单体的确切数量可以取决于以下因素：诸如但不限于所选的外壳蛋白，宿主细胞中存在附加的重组基因或修饰，与CP相连以形成融合体的抗原序列的身份，以及抗原序列是否连接至(i)CP的N-末端，(ii)CP的C-末端，或(iii)CP的N-末端和C-末端两者。在构成VLP的两种或更多种不同的抗原-CP融合蛋白单体的情况下，VLP中每种不同的抗原-CP融合蛋白的确切比例可以取决于以下因素：诸如但不限于所选的外壳蛋白，宿主细胞中存在附加的重组基因或修饰，与CP相连以形成融合体的抗原序列的身份，以及抗原序列是否连接至(i)CP的N-末端，(ii)CP的C-末端，或(iii)CP的N-末端和C-末端两者。可以调节VLP中抗原-CP融合蛋白单体的数量。

如本文所用，术语“结合价(valency)”是指由益生菌细胞中表达的一种或多种抗原-CP融合蛋白单体所展示的不同抗原的数量，无论这些单体是否组装成VLP。术语“单价”是指仅表达一种独特抗原的情况。术语“多价”是指表达两种或更多种独特抗原的情况。在一个实施方案中，抗原-CP融合蛋白单体可以具有与CP的一个末端(C-末端或N-末端)相连的单个抗原序列。当仅表达一种这样的融合蛋白时，则仅展示一种独特抗原，因此结合价为1，并且这种融合体在本文中称为“单价单体”(图5A)。在备选实施方案中，抗原-CP融合蛋白单体可以具有两个相同的抗原序列，其中每个相同的抗原序列与CP的不同末端(C-末端和N-末端中的每个)相连。当仅表达一种这样的融合蛋白时，仅展示一种独特抗原，因此结合价为1(尽管每个单体两种情况)，并且这种融合体在本文中称为“单价-2单体”(图5B)。在又一个实施方案中，抗原-CP融合蛋白单体可以具有两个不同的抗原序列，其中每个抗原序列与CP的不同末端(C-末端和N-末端中的每个)相连。当仅表达一种这样的融合蛋白时，则展示两种独特抗原，因此结合为2，并且这种融合体在本文中称为“二价单体”(图5C)。单价单体、单价-2单体和二价单体可以单独表达，或以任意组合表达。表达单个单价单体的益生菌细胞在展示的抗原数量方面将是单价的；同样，如果益生菌细胞表达的这种单体组装成VLP，那么产生的VLP将是单价的。表达单个单价-2单体的益生菌细胞在展示的抗原数量方面也将是单价的；同样，如果益生菌细胞表达的这种单体组装成VLP，那么产生的VLP将是单价的。表达单个二价单体的益生菌细胞在展示的抗原数量方面将是二价的；同样，如果益生菌细胞表达的这种单体组装成VLP，那么产生的VLP将是二价的。一起表达单价、单价-2单体和二价单体的任意组合的益生菌细胞将展示两种或更多种独特抗原，结合价将等于展示的独特抗原的数量；同样，如果益生菌细胞表达的这种单体组合组装成VLP，那么产生的VLP将是多价的，其结合价等于展示的独特抗原的数量。

作为实例但不限于，本文举例的AP205外壳蛋白通常组装成包含180个外壳蛋白单体的VLP，这些单体自组装成90个二聚体并随后组装成等面体大分子复合物。因此，在包含一种抗原与AP205外壳蛋白的融合体的实施方案中(其中单个抗原与外壳蛋白的一个末端相连)，可以预期在组装的VLP中具有1的结合价。备选地，在包含两种抗原与AP205外壳蛋白的融合体的实施方案中(其中一种抗原与外壳蛋白的一个末端相连，另一抗原与外壳蛋白的另一末端相连)，由于AP205组装体的性质，可以预期结合价为2。

作为另一实例，单个益生菌宿主可包含表达病毒外壳蛋白的两种不同的重组构建体。第一构建体可以包括单独的外壳蛋白；第二构建体可以包括融合到单个抗原的外壳蛋白。因此，组装的VLP可以包括一定百分比的带有抗原的外壳蛋白，以及一定百分比的没有抗原的外壳蛋白。作为实例，如果两个构建体由相同的启动子驱动，则每个构建体产生的蛋白量预计相等，并且组装的VLP的结合价预期约为50％。如果构建体之间的启动子强度不同，例如，如果一个启动子是诱导性的，一个是组成性的，那么可以调节VLP内包含的单价单体、单价-2单体和/或二价单体的数量。

根据本公开的免疫原性组合物包含VLP，在某些实施方案中它是高度抗原呈递的。如本文所用，高度抗原呈递结合价是指这样的VLP(或外壳蛋白-抗原融合体的集合)，其中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％的外壳蛋白(在VLP中或在外壳蛋白样品中)展示抗原。VLP抗原呈递的水平可以通过本领域公知的方法确定。非限制性的方法包括晶体结构分析(例如，分析N-末端和/或C-末端，和/或表面元件，诸如环)，基于相关晶体结构的计算建模，低温电子显微镜和原子力显微镜。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病况的进展、基本上改善病况的临床或美学症状或基本上阻止病况的临床或美学症状的出现。就本公开而言，“进行治疗”或“治疗”描述了为对抗疾病、病况或病症而对患者的管理和护理。这些术语包括预防性(即预防的)和姑息性治疗。“治疗”包括施用本发明的组合物以防止症状或并发症的发作，减轻症状或并发症，或消除疾病、病况或病症。如本文所用，术语“治疗”及其衍生的词语并不一定意味着100％或完全治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为其具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本公开的方法可以对受试者中的疾病提供任何程度的任何水平的治疗或预防。此外，由本发明的方法提供的治疗或预防可以包括治疗或预防疾病或疾病状态的一种或多种病况或症状，例如，细菌、病毒、寄生虫或外来抗原诸如朊病毒或毒液，或感染，或正在治疗或预防的癌症。同样，就本文的目的而言，“预防”可以涵盖延迟疾病或其症状或病况的发作。

如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指有效引起期望的生物或医学反应的量，包括当施用于受试者以治疗疾病时足以对疾病实施这种治疗的化合物的量，或有效防止感染或疾病发作的量。有效量将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重等而有所不同。有效量可以包括一定范围的量。如本领域所理解的，有效量可以是一个或多个剂量，即，可以要求单剂量或多个剂量来达到期望的治疗结果。在施用一种或多种治疗剂的情况下，可以考虑有效量，并且如果与一种或多种其他作用剂联合使用，可以达到或达到了期望的或有益的结果，则可以考虑给予有效量的单一作用剂。由于化合物的组合作用(例如，加和或协同效应)，可任选地降低任何共施用化合物的合适剂量。

因此，在一些实施方案中，“有效量”可用于在上下文中描述用于产生或实现预期结果的VLP的数量或含有VLP的组合物的量，无论该结果是否涉及预防和/或治疗感染或与感染相关的病症或疾病状态，包括病毒或细菌感染或如本文中另行描述的那些。在一些实施方案中，“有效量”可以指许多本公开的工程化、治疗性、益生菌微生物(例如，被修饰为产生抗原VLP)，或包含导致预防和/或治疗感染或与感染相关的病症或疾病状态的此类微生物的组合物的量，所述病症或疾病状态包括：病毒、酵母、细菌或寄生虫感染，癌症，或如本文中另行描述的那些。

如本文所用，术语“益生菌”是指生物体，通常是细菌，其被认为对其动物宿主有益而不是有害。本文公开的方法和组合物可包括改造益生菌微生物，并以多种形式将改造的生物体施用于受试者，例如，作为活培养物、已死的、作为孢子或以冻干形式。现在流行的概念是，肠道中益生菌生物体的积累有益于宿主生物体的整体健康，并且有报告表明益生菌的施用可用于治疗肠道疾病以及其他疾病和病况。在本公开的一些实施方案中，益生菌被用作口服疫苗的递送载体。示例性益生菌包括但不限于：乳杆菌属、酵母属、双歧杆菌属、链球菌属、大肠杆菌、芽孢杆菌属、明串珠菌属、片球菌、乳球菌属、气球菌属、肉食杆菌属、肠球菌属、酒球菌属、芽孢乳杆菌属、四联球菌属、漫游球菌属、魏斯氏菌属以及基因组序列相关的其他此类细菌。

在一些实施方案中，使用乳酸菌。乳酸菌(LAB)包括一组革兰氏阳性细菌，例如包括以下属的物种：乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌、乳球菌属、链球菌属，以及更多的外围气球菌属、肉食杆菌属、肠球菌属、酒球菌属、芽孢乳杆菌属、四联球菌属、漫游球菌属和魏斯氏菌属。在一些实施方案中，使用乳杆菌属物种。作为实例，但不限于此，示例性乳杆菌属物种包括嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、类干酪乳杆菌、路氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌；和异型发酵物种，Lactobacillusreuterior和发酵乳杆菌，以及基因组序列相关的其他此类细菌。其他的乳杆菌属物种包括ATCC 53544、ATCC 53545和ATCC 4356。为了简洁起见，本文公开的方法和组合物使用嗜酸乳杆菌举例说明。然而，要理解的是，本发明不受如此限制，并且可以口服施用的任何益生菌微生物，以及已知在肠道中定植的益生菌微生物都可以如本文所述被改造用于产生VLP和/或抗原VLP。

如本文所用，术语“recT”是指基因或其基因产物。本领域已知，recT基因产物与单链DNA结合，还促进互补单链DNA的复性[17]。recT蛋白在重组中起作用，其功能类似于λredB[18]。在一些实施方案中，recT基因(或redB基因，或其他具有类似功能的基因)可以包含在质粒或载体中，以增强或帮助转录模板重组到宿主基因组中。

多核苷酸

术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸”和“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸(这些术语可以互换使用)或其任何片段。这些短语也指基因组、天然或合成来源的DNA或RNA(可以是单链或双链，并且可以代表有义链或反义链)。

如本文中所用，术语“核酸”和“寡核苷酸”可以指多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)以及作为嘌呤或嘧啶碱基的N糖苷的任何其他类型的多核苷酸。术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”之间没有预期的长度区别，这些术语将互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。为了用于本发明的方法，寡核苷酸还可以包括核苷酸类似物，其中碱基、糖或磷酸主链被修饰，以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸类似物。

寡核苷酸可以通过任何合适的方法制备，包括通过以下的方法直接化学合成：诸如Narang等人,1979,Meth.Enzymol.68:90-99的磷酸三酯法；Brown等人,1979,Meth.Enzymol.68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage等人,1981,Tetrahedron Letters 22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺法；以及美国专利号4,458,066的固相载体法，每篇文献均通过引用并入本文。寡核苷酸和修饰的核苷酸的缀合物的合成方法综述参见Goodchild,1990,Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187，该综述通过引用并入本文。

关于多核苷酸序列，术语“百分比同一性”和“％同一性”是指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配百分比。这种算法可以以标准化和可重复的方式在被比较的序列中插入空位，以优化两个序列之间的比对，从而实现两个序列的更有意义的比较。核酸序列的百分比同一性可以按照本领域的理解来确定。(参见，例如，美国专利号7,396,664，其全文通过引用并入本文)。美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST)提供了一套常用且免费可用的序列比较算法，该工具可从多个来源获得，包括NCBI,Bethesda,Md.，在其网站上。BLAST软件套件包括各种序列分析程序，包括“blastn”，其用于将已知的多核苷酸序列与来自各种数据库的其他多核苷酸序列进行比对。还有一种称为“BLAST 2序列”的工具可用，其用于两个核苷酸序列的直接成对比较。“BLAST 2序列”可以在NCBI网站上以交互方式访问和使用。“BLAST 2序列”工具可用于blastn和blastp(如上所述)。

关于多核苷酸序列，百分比同一性可以在整个限定的多核苷酸序列的长度上测量，例如，如由特定的SEQ ID编号限定，或者可以在较短的长度上测量，例如，在从较大的限定序列中获取的片段的长度上，例如，至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少70个、至少100个或至少200个连续核苷酸的片段。这样的长度只是示例性的，并且要理解，由本文所示的序列、在表格、附图或序列表中支持的任何片段长度可用于描述可以测量百分比同一性的长度。

关于多核苷酸序列，“变体”、“突变体”或“衍生物”可以定义为利用在美国国家生物技术信息中心网站可获得的“BLAST 2序列”工具使用blastn在其中一个核酸序列的一定长度上，与特定核酸序列具有至少50％序列同一性的核酸序列。(参见TatianaA.Tatusova,Thomas L.Madden(1999),"Blast 2sequences-a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences",FEMS Microbiol Lett.174:247-250)。这样的一对核酸可以显示，例如，在一定的限定长度上至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更高的序列同一性。

由于遗传密码的简并性，不显示高度同一性的核酸序列可以编码相似的氨基酸序列，其中多个密码子可以编码单个氨基酸。要理解，核酸序列的变化可以使用这种简并性来获得以产生多个核酸序列，这些核酸序列都编码基本相同的蛋白质。例如，本文所设想的多核苷酸序列可以编码蛋白质并且可以针对在特定宿主中的表达进行密码子优化。在本领域，已经为许多宿主生物体(包括人、小鼠、大鼠、猪、大肠杆菌、植物和其他宿主细胞)制备了密码子使用频率表。

“重组核酸”是一种非天然存在的序列，或者具有由两个或更多个以其他方式分离的序列节段人工组合而成的序列。这种人工组合通常通过化学合成或更常见地通过人工操作核酸的分离节段来实现，例如，通过本领域已知的基因工程技术。术语重组包括仅通过添加、置换或缺失部分核酸而改变的核酸。通常，重组核酸可以包括可操作地与启动子序列连接的核酸序列。这种重组核酸可以是例如用于转化细胞的载体的一部分。

本文公开的核酸可以是“基本上分离或纯化的”。术语“基本上分离或纯化的”是指从其天然环境中移出的核酸，并且和与其天然缔合的其他组分至少60％分开，优选至少75％分开，更优选至少90％分开，甚至更优选至少95％分开。

术语“启动子”是指引导RNA聚合酶和其他反式作用转录因子从包括顺式作用DNA序列的DNA模板起始RNA转录的顺式作用DNA序列。启动子可以包括在真核细胞中起作用的真核启动子和在原核细胞中起作用的原核启动子。

如本文所用，“工程化转录模板”或“工程化表达模板”是指充当转录至少一个RNA的底物的非天然存在的核酸。如本文所用，“表达模板”和“转录模板”具有相同的含义，并且可以互换使用。工程化表达模板包括由DNA或RNA组成的核酸。用于表达模板中的合适核酸来源包括基因组DNA、cDNA和可转化为cDNA的RNA。基因组DNA，cDNA和RNA可以来自宿主细胞或病毒来源以及任何物种，包括现存和灭绝的生物体。作为实例，在一些实施方案中，转录模板存在于载体中，诸如质粒载体并包括编码DNA疫苗的平台序列，包括以下一种或多种：启动子、抗原序列、接头或铰链序列、VLP序列、his标签或其他可检测的标志物、免疫刺激序列和终止子。在一些实施方案中，表达模板的两侧是整合序列。

如本文所用，术语“整合序列”是指促进异源核酸序列位点定向插入到宿主基因组中的序列。示例性整合序列优选在终止密码子和终止子之间，和在具有高组成性或诱导性表达的基因的下游。例如，嗜酸乳杆菌中的整合序列包括但不限于upp序列(例如，如图4所示)、slpA序列(例如，LBA0169)、eno序列(例如，LBA0889)和lacZ序列(例如，LBA1462)。(参见例如，[30]，其全文通过引用并入本文)。其他细菌中的直系同源基因，以及与它们的周围基因排列相似的基因也是用于整合本公开的表达模板的合适基因座。(参见例如，图2；图3A-B)。

本文所设想的多核苷酸序列可以存在于表达载体中。例如，载体可包含编码与启动子可操作地连接的蛋白质的ORF的多核苷酸。“可操作连接”是指其中第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系的情况。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接到该编码序列。可操作连接的DNA序列可以非常接近或是连续的，并且在必要时在同一阅读框中连接两个蛋白质编码区。本文所设想的载体可包含与编码蛋白质的多核苷酸可操作地连接的异源启动子。“异源启动子”是指不是正在表达的蛋白质或RNA的天然或内源性启动子的启动子。

如本文所用，“表达”是指从DNA模板转录多核苷酸的过程(诸如转录成mRNA或另一RNA转录物)和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。

术语“载体”是指可以将核酸(例如DNA)引入宿主生物体或宿主组织中的载体，包括但不限于整合到宿主细胞的基因组中。有各种类型的载体，包括质粒载体、细菌噬菌体载体、粘粒载体、细菌载体和病毒载体。如本文所用，“载体”可以指已被改造以表达异源多肽(例如，本文公开的外壳蛋白和外壳蛋白-抗原融合蛋白)的重组核酸。如本文所用，“异源蛋白”是指对正在表达它的生物体而言不是天然的或内源性的蛋白质。重组核酸通常包括用于表达异源多肽的顺式作用元件，尽管在某些情况下，载体可以将异源多肽引入宿主基因组，使得内源宿主基因组顺式作用元件用于异源多肽表达。载体可以包括表达载体。

多肽、多肽和蛋白质

如本文所用，术语“氨基酸”和“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列(这些术语可以互换使用)，或这些中任何一种的片段，以及天然存在的或合成的分子。在“氨基酸序列”被引用为指天然存在的蛋白质分子的序列的情况下，“氨基酸序列”和类似术语并不意味着将氨基酸序列限于与所列举的蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸序列。

本文所设想的氨基酸序列可以包括相对于参考氨基酸序列的保守氨基酸置换和/或非保守氨基酸置换。例如，变体多肽可以包括相对于野生型多肽的保守氨基酸置换和/或非保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是预计对参考多肽的性质干扰最小的那些置换。换言之，保守氨基酸置换基本上保留了参考蛋白的结构和功能。下表提供了示例性保守氨基酸置换的列表。

相反，“非保守氨基酸置换”是预测对参考多肽的性质干扰最大的那些置换。例如，非保守氨基酸置换可以不保留参考蛋白的结构和/或功能(例如，用极性氨基酸替代非极性氨基酸和/或用带负电荷的氨基酸替代带正电荷的氨基酸)。

“缺失”是指氨基酸或核苷酸序列的变化，导致相对于参考序列缺少一个或多个氨基酸残基或核苷酸。缺失可以去除至少1、2、3、4、5、10、20、50、100或200个氨基酸残基或核苷酸。缺失可以包括内部缺失或末端缺失(例如，参考多肽的N-末端截短和/或C-末端截短)。

“片段”是氨基酸序列的一部分，其序列与参考序列相同，但长度短于参考序列。一个片段可包含至多参考序列的整个长度，减去至少一个氨基酸残基。例如，片段可分别包含参考多肽的5至1000个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，片段可包含参考多肽的至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、250或500个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，片段的长度可以在选自参考多肽的5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、250或500、1000或2000个连续氨基酸残基等的任何值所界定的范围内。片段可包含参考多肽的百分比。例如，片段可包括包含参考多肽的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的连续氨基酸。片段可以优先地从分子的某些区域选择。术语“至少一个片段”涵盖全长多肽。

“同源性”是指两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换的序列同一性。同源性、序列相似性和百分比序列同一性可以使用本领域和本文描述的方法来确定。

短语“百分比同一性”和“％同一性”，例如，当应用于多肽序列时，是指使用标准化算法比对的至少两个多肽序列之间的残基匹配百分比。多肽序列比对的方法是众所周知的。一些比对方法考虑了保守氨基酸置换。上文更详细地解释的这类保守置换通常保留置换位点的电荷和疏水性，从而保留多肽的结构(因此保留功能)。氨基酸序列的百分比同一性可以按照本领域的理解来确定。(参见，例如，美国专利号7,396,664，其全文通过引用并入本文)。美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul,S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403 410)提供了一套常用且免费可用的序列比较算法，该工具可从多个来源获得，包括NCBI,Bethesda,Md.，在其网站上。BLAST软件套件包括各种序列分析程序，包括“blastp”，其用于将已知的氨基酸序列与来自各种数据库的其他氨基酸序列进行比对。

百分比同一性可以在整个限定的多肽序列的长度上测量，例如，如由特定的SEQID编号限定，或者可以在较短的长度上测量，例如，在从较大的限定的多肽序列中获取的片段的长度上，例如，至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少70个或至少150个连续残基的片段。这样的长度只是示例性的，并且要理解，由本文所示的序列、在表格、附图或序列表中支持的任何片段长度可用于描述可以测量百分比同一性的长度。

特定多肽序列的“变体”可以定义为利用在美国国家生物技术信息中心网站可获得的“BLAST 2序列”工具使用blastp在其中一个多肽序列的一定长度上，与特定多肽序列具有至少50％序列同一性的多肽序列。(参见Tatiana A.Tatusova,Thomas L.Madden(1999),"Blast 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences",FEMS Microbiol Lett.174:247-250)。这样的一对多肽可以显示，例如，在其中一个多肽的一定的限定长度上至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更高的序列同一性。“变体”可以具有与参考多肽基本相同的功能活性。

如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含至少两个结构域的蛋白质，这些结构域由已经连接的独立基因编码，使得它们被转录并翻译为单个单元，产生单个多肽。作为实例，本公开的抗原-外壳蛋白融合体包括与细菌噬菌体外壳蛋白(CP)融合的抗原多肽(例如，在细菌噬菌体AP205外壳或“帽”蛋白的5'或3'末端处融合)。这种融合体可以任选地包括连接抗原肽和CP的一个或多个接头序列、一个或多个肽标签(例如，His标签)以及一个或多个免疫刺激肽。

益生菌组合物

本文公开了一种新型疫苗平台，其包含经改造的益生菌微生物，所述益生菌微生物被修饰以产生细菌噬菌体外壳蛋白或包含与细菌噬菌体外壳蛋白相连的一种或多种抗原(例如多价抗原)的融合蛋白。外壳蛋白自组装，产生病毒样颗粒(VLP)，在VLP的外表面上呈递抗原蛋白。

当被受试者口服摄入时，在一些实施方案中，修饰的益生菌将在肠道中定植并产生展示抗原的VLP。这些VLP将刺激受试者的免疫系统，从而对携带相同或相似抗原的微生物的后续攻毒产生保护性免疫应答，或用于攻击现有攻毒挑战，诸如肿瘤或现症感染。在一些实施方案中，益生菌被修饰为仅表达外壳蛋白(不与抗原融合或连接)。因此，在一些实施方案中，益生菌将产生调节免疫系统以有益于受试者的VLP。虽然用抗原VLP刺激免疫系统的优势是不言而喻的，但非抗原VLP通常也会刺激受试者的免疫系统，为受试者提供一些益处。

先前的研究表明，VLP可以通过充当佐剂刺激T辅助1型(Th1)淋巴细胞来激活免疫系统，并且与空VLP相比，当来自细菌宿主的非特异性RNA被包封时，这种激活可以增强高达1,000倍[45]。基于这些结果，预期益生菌中产生的VLP将导致免疫系统的一般刺激，这反过来可能导致增强对各种病原体感染的抵抗力。

工程化益生菌微生物

对本公开的微生物进行修饰(改造)以产生细菌噬菌体外壳蛋白(CP)或包含与细菌噬菌体外壳蛋白连接的抗原蛋白的融合蛋白。虽然可以对微生物进行修饰以包括表达载体(例如，质粒表达载体)以产生融合蛋白，但优选地，对微生物进行修饰以将编码CP或CP-抗原融合蛋白的核酸序列整合到微生物的基因组中。在一些实施方案中，微生物可以用多个转录模板进行改造；转录模板可以包含相同或不同的蛋白质(例如，CP蛋白和/或CP-抗原融合蛋白)用于表达。本文公开的组合物不受所采用的基因工程方法的限制，并且将核酸稳定地整合到所选择的益生菌微生物中的任何适当手段都是可接受的。下面概述了示例性的非限制性的方法。

将核酸序列整合到宿主基因组中的方法在本领域是众所周知的；几十年来，赋予微生物以新的或改变的特性的DNA添加一直是生物技术的基础。

如上所述，DNA可以使用复制性质粒添加到微生物中。可以构建从质粒诱导性或组成性表达的示例性构建体，例如，如[25]中所述。通常，这种表达系统往往是不稳定的，限制了它们的应用效用。因此，已经开发出将DNA分子稳定地整合到细胞内(通常整合到宿主染色体中)的方法。

关于随机插入，噬菌体Mu驱动的转位系统可以将Mu DNA随机插入细菌染色体，其已广泛应用于体外DNA转位。其功能取决于转座体的形成，转座体是细胞中Mu编码转座酶MuA和DNA的复合物。一旦形成，它可以诱导DNA裂解和DNA链转化。(参见例如[42])。

关于位点特异性整合(也称为“基因替换”)，CRISPR-Cas系统也可用于基因整合。CRISPR包括30-40bp的短直接重复序列的阵列，可以转录成前体crRNA(precrRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。该系统的另一个元件，向导RNA(gRNA)，是tracrRNA和成熟crRNA的融合体。gRNA的作用是通过指引RNA引导的DNA核酸内切酶Cas9裂解基因靶标来将靶标和酶结合在一起。CRISPR-Cas用途广泛，可应用于多种细胞，包括各种益生菌细菌菌株。(参见例如，[16])。

位点特异性整合也可以通过使用线性DNA的同源重组系统来实现，用于诸如酵母和天然感受态细菌(如枯草芽孢杆菌)的生物体。备选地，可以使用携带同源重组构建体的整合质粒。由于质粒是环状的，质粒和宿主基因组之间的重组事件(例如，单交叉或双交叉事件)可以将整个质粒或质粒的选定部分整合到染色体中。

作为实例，λRed系统是最实用和应用最广泛的方法之一。它含有三种必需蛋白质，包括来自I-细菌噬菌体的Exo、Beta和Gam，可以将双链DNA(dsDNA)或单链DNA(ssDNA)应用于特定的染色体靶标。当与包括Cre/loxP和Flp/FRT的位点特异性重组酶(SSR)系统联合使用时，λRed系统几乎可以操纵任何遗传改变。(参见例如，[16]，其全文通过引用并入本文)。

视觉导向的基因替代的其他选项包括不导致宿主生物体被标记(例如，抗生素抗性)以供选择的系统(参见例如，[23]；[30]，它们的全文通过引用并入本文)。示例性系统包括使用载体和upp-逆选择性基因替代系统(参见例如，[41]，其全文通过引用并入本文)及其改良形式。仅作为实例，图2以及图3A和3B提供了可用于将目标序列整合到益生菌微生物中的载体示意图。

图2提供了利用upp-逆选择性基因替代系统和recT活性进行同源重组的质粒载体的一般示意图。质粒载体包括表达模板(例如，启动子、编码抗原-CP的序列和终止子)。

图3A和3B提供了用于同源重组的一个质粒实施方案的非限制性工作例。

在一些实施方案中，在基于pWV01复制起始点的质粒上编码转录模板(例如，无标志物的(或未标记的)DNA疫苗编码平台序列)，该质粒可以在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间穿梭，并且还含有在嗜酸乳杆菌LBA1432启动子(胆汁诱导性，(参见例如，[28]，其全文通过引用并入本文)控制下的可选的路氏乳杆菌recT基因，用于提高疫苗平台DNA序列稳定整合到宿主的基因组中的效率，所述宿主例如嗜酸乳杆菌。

如本文所用，“无标志物的”或“未标记的”是指被整合到宿主基因组中或以其他方式在宿主基因组中表达或可表达的(例如，通过质粒或载体)的表达构建体，其不包括可选择标志物(例如抗生素抗性)。

在一些实施方案中(例如，如图3所示)，基因组整合的无标志物的(或未标记的)DNA疫苗编码平台(例如，转录模板)序列包括以下(从5'到3'端)：基因组靶向序列(在尿嘧啶磷酸核糖基转移酶编码基因(upp)开放阅读框(ORF)的5'端>500个碱基)，然后是嗜酸乳杆菌特异性双向终止子，组成性LA185，pgm启动子或其他组成性启动子以用于表达AP205蛋白编码序列(该编码序列包含用于三肽铰链序列的3'克隆位点)，然后是6xHis标签序列，然后是表位编码序列和树突细胞靶向肽(DCpep)，嗜酸乳杆菌双向终止子，然后是基因组靶向序列(在UPP开放阅读框(ORF)的3'端>500个碱基)(参见例如，图2和图3；参见[23,25,26,27]，它们的全文通过引用并入本文)。这里的基因组插入位点是upp基因的基因座，在细菌中是通用的。

如上所述，在upp基因座插入无标志物的(或未标记的)DNA疫苗编码平台序列。然而，本文公开的组合物和方法不旨在受整合位点的限制，并且包含附加的或备选位点。因此，无标志物的(或未标记的)DNA疫苗编码平台序列可以整合在一个或多个附加的或备选基因组基因座处。例如，嗜酸乳杆菌中的基因间区域优选在终止密码子和终止子之间以及在具有高组成性或诱导性表达的基因的下游，可以用外源性DNA(诸如无标志物的(或未标记的)DNA疫苗编码平台序列)替换或中断。作为附加的实例，嗜酸乳杆菌中slpA(LBA0169)、ENO(LBA0889)、lacZ(LBA1462)和slpX LBA0444–LBA0447基因座下游的基因间位置可以用外源性DNA替换或中断(参见，例如，[29,30]，它们的全文通过引用并入本文)。其他几种细菌中的直系同源基因，以及它们周围基因排列的一些相似性，为在不同细菌物种中无标志物的(或未标记的)DNA疫苗编码平台序列的整合提供了多种选项。

转录模板

本文公开的修饰的益生菌微生物包括转录模板，例如无标志物的(或未标记的)DNA疫苗编码平台序列。转录模板也可以在掺入微生物之前存在于载体中，诸如质粒载体中。作为实例，在一些实施方案中，转录模板包括至少一个与病毒外壳蛋白序列相连以产生抗原-CP融合蛋白的抗原肽序列。在一些实施方案中，转录模板包括不与抗原肽连接的病毒外壳蛋白序列。转录模板可任选地包括以下中的一种或多种：启动子序列、接头或铰链序列(例如，连接抗原肽和外壳蛋白)、his标签或其他可检测的蛋白质标志物、免疫刺激序列和至少一个终止子。在一些实施方案中，表达模板的两侧是整合序列。

单个益生菌微生物可以被修饰以表达和呈递单个抗原肽或多个不同的抗原肽。通过引入不同的转录模板(例如，在宿主微生物基因组中的不同位点处)，每个转录模板编码不同的抗原肽，可以产生不同的VLP“种类”。在一些实施方案中，VLP可以是“混合的”并呈递多种不同的抗原蛋白。

还公开了“调整”一个或多个不同的CP或抗原-CP融合体的表达水平的选项。通过利用具有不同强度，和/或在微生物内诱导性或组成性的启动子，可以调节表达水平以更好地适应受试者的需求或解决感染情况。作为实例，对于传染病疫苗或癌症疫苗，可能需要以高水平表达多种抗原(例如，使得修饰的益生菌微生物产生最大量的抗原VLP)——在这种情况下，保证快速、积极的反应。在其他实施方案中，可能需要较低的组成性表达水平，例如，使受试者对变应原敏化[19]。此外，编码VLP特异性外壳蛋白的两个基因拷贝可以以不同水平共表达(例如，来自强启动子和弱启动子)，以实现天然的和抗原编码的CP的嵌合组合物，这可以促进和稳定VLP的自组装[20]。

启动子和终止子

在所选择的益生菌菌株中表达的任何启动子都可用于表达CP-抗原融合体，包括导致CP或CP-抗原融合体表达的任何组成性或诱导性启动子。通常，根据所需表达的水平和时机以及将被修饰以表达蛋白质的生物体来选择启动子。本领域技术人员将能够容易地选择合适的启动子并将其克隆到载体中，以重组成相容的益生菌宿主微生物。仅作为实例，嗜酸乳杆菌LA185、pgm启动子可以代替嗜酸乳杆菌LBA1432启动子，或者可以选择另一种胆汁诱导性启动子来增加疫苗在小肠中的表达。

同样，由所选择的益生菌微生物使用的任何合适的终止序列都可以掺入转录模板中。

抗原

任何抗原肽都可以用于本发明的情形。许多细菌和病毒抗原是公知的，并且可以很容易地掺入到所公开的疫苗平台中，并且新的抗原肽可以通过本领域公知的方法衍生。这些方法包括体内、体外和计算机模拟鉴定抗原部分。例如，抗原可以通过其与人类血清的反应性来鉴定。如本领域已知的，抗原肽的长度不同，并且本公开的方法具有适当的灵活性，以便不受抗原大小或类型的限制。在一些实施方案中，抗原-外壳蛋白融合体可以表达，但不能组装成VLP。在一些实施方案中，VLP组装是合乎需要的，并且抗原大小(例如，氨基酸序列的长度)和抗原在融合体中相对于CP的位置可能影响VLP组装和组装的VLP中的抗原呈递。本领域已知，不同的CP具有不同的构型和VLP组装特性。因此，CP-抗原融合构建体的设计需要考虑已知的CP参数，以辅助开发和实验测试各种构建体用于VLP组装和抗原呈递。

仅作为实例而非限制，在一些实施方案中，其中使用AP205-抗原融合体并且需要VLP组装，抗原肽的长度为约6-2000、约6-1000、约或6-200个氨基酸，或长度为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或约200个氨基酸。在一些实施方案中，抗原肽的长度为约1-180、约20-170、约30-160、约40-150、约50-140、约60-130、约70-120、约80-110或约90-100个氨基酸。在一些实施方案中，抗原肽的长度为约5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20个氨基酸或约5-10个氨基酸。在一些实施方案中，抗原肽的长度为约10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20个氨基酸。在一些实施方案中，抗原肽的长度为约30-80、30-70、30-60、30-50或约30-40个氨基酸。在一些实施方案中，抗原肽的长度为约10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100个氨基酸。在一些实施方案中，抗原肽的长度为约200-约1000个氨基酸、长度为约250-300、约300-350、约350-400、约400-450、约450-500、约500-550、约550-600、约600-650、约650-700、约700-750、约750-800、约800-850、约850-900、约900-950、约950-1000、约250-950、约300-900、约350-850、约400-800、约450-750、约500-700、约550-650、或约600-700、约200-750、约250-700、约300-650、约350-600、约400-550、或约450-500个氨基酸。在一些实施方案中，抗原肽是多价的。

仅作为实例而不作为限制，可用于本发明的方法和组合物中的抗原肽包括来自SARS-CoV-2的抗原刺突蛋白序列，例如：

YNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEI(SEQ ID NO:1)，

LKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVE(SEQ ID NO:2)，

TVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGL(SEQ ID NO:3)，YLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRV(SEQ ID NO:4)，

VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSN(SEQ IDNO:5)，

VRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSF(SEQ ID NO:6)，

RQIAPGQTGKIADYNYKLPD(SEQ ID NO:7)，

SYGFQPTNGVGYQ(SEQ ID NO:8)，

YAWNRKRISNCVA(SEQ ID NO:9)，

KPFERDISTEIYQ(SEQ ID NO:10)，

NYNYLYRLFR(SEQ ID NO:11)，

FNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHA(SEQ ID NO:12)，

FNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHA(SEQ ID NO:13)，

LKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVK(SEQ ID NO:14)，

YLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRV(SEQ IDNO:15)，和

FNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHA(SEQ ID NO:16)。

外壳蛋白和VLP

RNA-细菌噬菌体CP已被证明在细菌宿主中表达时自组装成VLP。仅出于示例目的，讨论了AP205噬菌体CP。AP205噬菌体VLP已显示出高容量和对外来插入的耐受性，并且可以在其CP N-末端和/或C-末端耐受长氨基酸序列添加，而不会影响衣壳自组装(参见例如，[24])。由于二聚体中一个AP205单体CP的N-末端与另一个单体的C-末端非常接近，并且两个末端都展示在VLP的表面上，因此两个或至少一个末端都可用于展示肽或多肽抗原序列。

AP205 CP的结构完整性使得至少一种抗原能够以N-mer肽的形式展示在VLP上(例如，长度为6至200个或更多个氨基酸)，在AP205 CP的任一末端处(参见例如，图1)。如前所述，本公开不限于AP205 CP；本技术提供了足够的灵活性，使得其他病毒CP可以以相同的成功和功效使用。

免疫刺激肽

在一些实施方案中，免疫刺激肽(例如参见US2013/0287810A1，其全文通过引用并入本文)，也称为免疫刺激序列，与所选抗原一起融合到VLP上。例如，FYPSYHSTPQRP(SEQ IDNO:17)是一种树突细胞刺激肽[27]，以及类毒素诸如白喉类毒素CRM197或衍生肽、破伤风神经毒素TetX蛋白或衍生肽诸如VNNESSEVIVHK(SEQ ID NO:18)可用于增强免疫应答。在一些实施方案中，宿主益生菌细胞可以用多个表达模板改造，使得第一表达模板表达CP-抗原融合体，第二模板表达CP-免疫刺激肽融合体。两个不同表达模板的启动子可以相同，也可以不同。

间隔区序列

任选地可以包括间隔区序列，例如，在转录模板的任何功能结构域之间。例如，在抗原肽序列和外壳蛋白序列之间，和/或在免疫刺激肽序列和CP之间可以包括间隔区。间隔区序列可以为2-20个氨基酸长，5-15个氨基酸长，8-11个氨基酸长，或更小，例如1-4个氨基酸长。在一些实施方案中，间隔区可用于增强自组装VLP的外表面上的抗原呈递。

营养和治疗组合物

本文公开了营养和治疗性益生菌组合物，其包含一种或多种益生菌微生物，所述益生菌微生物被改造以产生VLP，或呈递一种或多种抗原的VLP。在一些实施方案中，包含经改造以产生VLP(非抗原表达)的益生菌微生物的组合物可用作营养补充剂。在一些实施方案中，包含被改造以产生表达抗原的VLP的益生菌微生物的组合物可用作治疗剂。

在一些实施方案中，益生菌组合物被配制成用于口服施用，例如作为食品或食品补充剂。作为实例但非限制，益生菌组合物可以配制成奶制品，并且可以以奶、酸奶、奶酪或冰淇淋的形式提供。食品可以配制成非乳制品，诸如基于水果的产品或基于大豆的产品。此类食品可以是固体或液体/可饮用形式。此外，食品可以含有所有常规添加剂，包括但不限于蛋白质、维生素、矿物质、微量元素和其他营养成分。

在一些实施方案中，营养或治疗性益生菌组合物被配制成用于口服施用的液体、粉剂、胶囊、片剂或小药囊剂。在一些实施方案中，胶囊或片剂可包括肠溶衣，益生菌组合物可包括一种或多种营养或药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，载剂可以是用于口服施用的胶囊。在这样的实施方案中，胶囊的外壳可任选地由明胶或纤维素制成。纤维素、淀粉、壳聚糖和/或藻酸盐具有将制剂保持在肠液中的益处，不允许在上消化道中过早分解，因此产品可以到达所需的目的地。备选地，可以将成分组合并形成片剂。在片剂形式中，纤维素淀粉，壳聚糖和/或藻酸盐也可以存在，充当粘合剂将片剂固定在一起。益生菌组合物可进一步包含一种或多种赋形剂，以通过防止成分粘附到机器上来促进制造过程。此外，这种赋形剂可以使胶囊或片剂形式更容易吞咽和通过肠道消化。赋形剂可以是植物硬脂酸酯、硬脂酸镁、硬脂酸、抗坏血酸棕榈酸酯、棕榈酸视黄酯或羟丙基甲基纤维素。还可以添加本领域已知的额外的着色剂、风味剂和赋形剂。配制的益生菌组合物可以按配制的那样施用(例如，作为胶囊或片剂)，或者可以与食物或饮料组合施用。

营养或治疗性益生菌组合物可以包括以多种形式提供的微生物，包括但不限于冻干、孢子形式(例如在混悬液中)、作为活培养物、作为死的或灭活的微生物(例如，热灭活或热杀伤)或其组合。作为实例，在一些实施方案中，包含活微生物的组合物可以经口摄入，并继续在肠道定植。然后，修饰的益生菌将产生VLP并刺激受试者的免疫系统。在一些实施方案中，微生物可以在培养物中生长并产生VLP，或者被诱导以产生VLP。然后可以杀死包含VLP的微生物，冻干或以其他方式处理以进行进一步加工或储存。理想情况下，任何处理方法或进一步加工都应保持至少一部分VLP和/或抗原蛋白完好无损，无论微生物的状态或状况如何。在一些实施方案中，VLP是分离的。

在一些实施方案中，微生物可以配制并以营养或治疗有效剂量提供。在一些实施方案中，营养或治疗有效剂量可以包括每剂约1x10¹-1x10³个、每剂1x10³-1x10²⁰个、1x10⁵-1x10¹⁵个微生物；每剂约1x10⁶-1x10¹⁴个微生物；每剂约1x10⁷-1x10¹³个微生物；每剂约1x10⁸-1x10¹²个微生物，每剂约1x10⁹-1x10¹¹个微生物；每剂约1x10¹⁰-9x10¹⁰个微生物；或每剂约3x10¹⁰个微生物，或每剂少于10³个微生物。

方法

本文提供了在有需要的受试者中治疗或降低细菌或病毒感染发生率的方法(即，为受试者接种疫苗)。所述方法包括施用有效量的本公开的治疗组合物(例如，工程化益生菌和/或抗原VLP)。

出于治疗(例如，疫苗接种)目的，确切的剂量可以由个体医生根据待治疗的患者选择。调整剂量和施用以提供足够水平的活性剂或维持所需的效应。考虑的其他因素包括疾病状态的严重程度，例如病况的程度、病史；患者的年龄、体重和性别；饮食，施用的时间和频率；药物组合；反应敏感性；施用方式；以及对疗法的耐受性/反应。对于任何活性剂，治疗有效剂量最初可以在细胞培养测定或动物模型中估计，通常是小鼠、兔子、狗或猪。动物模型还用于确定期望的浓度范围和施用途径。

治疗性益生菌组合物的有效剂量可以每天一次、每天两次、每天三次、每天四次或更多次施用给有需要的受试者。在一些实施方案中，有效剂量的治疗性益生菌组合物作为单剂量单次施用。在一些实施方案中，有效剂量的治疗性益生菌组合物每天、每隔一天、每三天或每周一次施用，持续至少约1周、至少约2周、约3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或至少约12周。在一些实施方案中，治疗性益生菌组合物根据疾病状态、病况或症状指示定期施用。作为实例，但非限制，在一些实施方案中，有效剂量的治疗性益生菌组合物作为单剂量单次施用。

在一些实施方案中，包含工程化益生菌诸如嗜酸乳杆菌的治疗组合物与一种或多种附加的活性剂联合施用。作为实例，附加的活性剂包括抗酸剂，诸如钙盐和/或镁盐，其中和胃酸度。所述附加的活性剂可以与益生菌组合物同时施用(例如，作为同一制剂的一部分)，或者可以分开施用，与益生菌组合物同时或在不同时间施用。因此，在一些实施方案中，向有需要的受试者施用包含益生菌和一种或多种附加的活性剂的组合物。

本发明的方法不旨在受施用方式的限制，并且在一些实施方案中，合适的施用途径可以例如包括口服、直肠、经粘膜、经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接脑室内、静脉内、腹膜内、鼻内、注射。

实施例

实施例1

将来自SARS-CoV-2的抗原刺突蛋白序列克隆到图3B所示的质粒载体中。示例性抗原刺突蛋白序列包括下列：

在公开的方法和组合物中使用的其他序列：

刺突蛋白核酸序列被定位成邻接AP205外壳蛋白(CP)核酸序列，使得在表达时产生包含抗原刺突蛋白和外壳蛋白的融合蛋白。上述十种刺突蛋白特异性肽中的每一种都作为单个克隆位于CP的C-末端。然后使用基于滚环复制和/或共表达recT的载体通过同源重组将抗原-VLP编码平台引入嗜酸乳杆菌中。

使用电穿孔以2.5kV/cm,25uFD和400ohms将载体转化到嗜酸乳杆菌中，并在含有5ug/ml红霉素的MRS板上选择。

将诱导的转化体接种在仅含有5-氟尿嘧啶(100ug/ml)的MRS板上，在37℃选择以在UPP1基因座进行基因组整合。

使用引物序列[TCGCAAGGACACAGGTTCAA(SEQ ID NO:20)和GCATCTCCCAAACCAGGGAA(SEQ ID NO: 21)；GTCCTGCACCTAAACCGGAA (SEQ ID NO: 22)和GCATCTCCCAAACCAGGGAA(SEQ ID NO: 23)；TCGCAAGGACACAGGTTCAA (SEQ ID NO: 24)和TTCCGGTTTAGGTGCAGGAC(SEQ ID NO:25)]通过PCR和测序确认在upp1处的同源整合。

然后测试重组细菌中抗原VLP的表达。预期修饰的嗜酸乳杆菌将继续生长、繁殖并产生抗原VLP。抗原呈递性VLP的表达水平使用蛋白质印迹法利用His标签标记和检测来确定[21]。

对VLP的评估预期表明，VLP在表达为单价单体时展示约180个抗原肽，或当表达为二价单体或单价-2单体时，每个VLP展示360个抗原肽。此外，对His-标签纯化的VLP的电子显微镜分析可用于验证细菌细胞中的自组装，并根据抗原肽的分子量测量粒径，其粒径估计的范围为直径从30nm到60nm或更大。

还预期VLP展示的抗原蛋白与抗体和抗原呈递细胞结合，并诱导包括细胞毒性T细胞在内的免疫应答。为了验证后者，将在动物模型中测试修饰的益生菌。

为了证明本公开的疫苗组合物可以刺激免疫应答，来自接种疫苗的动物的血清可以显示结合具有抗原定向特异性的His标签纯化的VLP，并且进行了疫苗接种实验。

向对SARS-CoV-2病毒易感的6至7周龄转基因ACE2小鼠或仓鼠提供口服剂量的修饰的嗜酸乳杆菌。对照小鼠或仓鼠接受等量的未修饰的嗜酸乳杆菌。六周后，采集血液样品，然后用活病毒经鼻内感染小鼠。在该实验中，使用了小鼠适应的SARS-CoV-2模型。SARS-CoV-2感染通过低病毒接种量模拟。

预期接种疫苗的小鼠和仓鼠将在消化道和血液样品中表现出VLP，并表现出针对SARS-CoV-2刺突蛋白抗原的抗体和T细胞。还预期，与未接种疫苗的对照小鼠和仓鼠相比，接种疫苗的小鼠和仓鼠表现出较少的症状或没有病毒感染症状，并且与对照动物相比具有较低或没有可检测到的病毒载量。

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在上述描述中，对于本领域技术人员来说，显而易见的是，可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下对本文公开的发明进行不同的替换和修改。本文适当地举例说明进行描述的本发明可以在缺少本文未具体公开的任何一个或多个元件、一个或多个限制的情况下实施。已经使用的术语和表述被用作描述而非限制的术语，并且无意在使用此类术语和表述时排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，而是要认识到在本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管本发明已经通过具体实施方案和任选特征来说明，但本文所公开的概念的修改和/或变化可以由本领域技术人员进行，并且这种修改和变化被认为是在本发明的保护范围内。

本文引用了许多专利和非专利参考文献。引用的参考文献通过引用全文并入本文。如果说明书中术语的定义与引用参考文献中的术语定义不一致，则应根据说明书中的定义来解释该术语。

序列表

<110> 普罗瓦克萨斯股份有限公司（Provaxus, Inc.）

White, Kevin

Stolc, Viktor

<120> 新型免疫调节平台及其使用方法

<130> 174700.00015

<150> 63/144,601

<151> 2021-02-02

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突蛋白片段

<400> 1

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

1 5 10 15

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile

20

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突蛋白片段

<400> 2

Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly

1 5 10 15

Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu

20

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突蛋白片段

<400> 3

Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys

1 5 10 15

Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu

20

<210> 4

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突蛋白片段

<400> 4

Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg

1 5 10 15

Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly

20 25 30

Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln

35 40 45

Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

50 55 60

<210> 5

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 5

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

1 5 10 15

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

20 25 30

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

35 40 45

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn

50 55 60

<210> 6

<211> 74

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 6

Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe

1 5 10 15

Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile

20 25 30

Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe

35 40 45

Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

50 55 60

Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

65 70

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 7

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

Lys Leu Pro Asp

20

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 8

Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

1 5 10

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 9

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala

1 5 10

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 10

Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 11

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 12

Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg

1 5 10 15

Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser

20 25 30

Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp

35 40 45

Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp

50 55 60

Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn

85 90 95

Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr

100 105 110

Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser

115 120 125

Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly

130 135 140

Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn

145 150 155 160

Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu

165 170 175

Leu His Ala

<210> 13

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 13

Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg

1 5 10 15

Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser

20 25 30

Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp

35 40 45

Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp

50 55 60

Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn

85 90 95

Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr

100 105 110

Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser

115 120 125

Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly

130 135 140

Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr

145 150 155 160

Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu

165 170 175

Leu His Ala

<210> 14

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 14

Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly

1 5 10 15

Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys

20

<210> 15

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 15

Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg

1 5 10 15

Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly

20 25 30

Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln

35 40 45

Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

50 55 60

<210> 16

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- SARS-CoV-2刺突片段

<400> 16

Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg

1 5 10 15

Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser

20 25 30

Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp

35 40 45

Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp

50 55 60

Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn

85 90 95

Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr

100 105 110

Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser

115 120 125

Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly

130 135 140

Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn

145 150 155 160

Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu

165 170 175

Leu His Ala

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- 树突细胞刺激肽

<400> 17

Phe Tyr Pro Ser Tyr His Ser Thr Pro Gln Arg Pro

1 5 10

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- 破伤风神经毒素TetX衍生肽

<400> 18

Val Asn Asn Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的SARS-CoV-2刺突片段

<400> 19

Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val

1 5 10 15

Ala Ser Gln Ser

20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- upp PCR引物

<400> 20

tcgcaaggac acaggttcaa 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- upp PCR引物

<400> 21

gcatctccca aaccagggaa 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- upp PCR引物

<400> 22

gtcctgcacc taaaccggaa 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- upp PCR引物

<400> 23

gcatctccca aaccagggaa 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- upp PCR引物

<400> 24

tcgcaaggac acaggttcaa 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- upp PCR引物

<400> 25

ttccggttta ggtgcaggac 20

<210> 26

<211> 515

<212> DNA

<213> 嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）

<400> 26

tgttctggct aatattgatt tacccgatga aaataaattt aatttgggta atgatttagt 60

agatgctgat cataatctat ttggcagtct acgatatttt gatgataaag ataacgtaga 120

aacaatatat gttcaaggct ttgatgaagg cgaagaaagt ttagcttata tgaaccgact 180

taataaggca gcaggcggcc atcatttgaa taaataaaaa ataaaacgca aagggcttta 240

aaccctttgc gtttttgatt aaaatattta atgaattaag ttatttgtta ataggaggca 300

tatatgggaa agtttgtagt tttggatcac cctttgattc agcacaaatt aacaattatt 360

cgtcgcaagg acacaggttc aaacgaattt cgtagaattg ttggtgaaat cggtggatta 420

atgacctatg aaattactag agatttacca cttgaagatg ttgaaattga aacaccaatg 480

ggtaagacag tccaaaaaga aatcgccggc aagaa 515

<210> 27

<211> 505

<212> DNA

<213> 嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）

<400> 27

tgacgctatc gctgcattaa agaagcgtgg tgttaaggat attaaattgg cagttttagt 60

agcagctcca gaaggtatta aggcagtcca agaagaaaat cctgatgttg atatttatgc 120

tgcatcagaa gatgataaat tgctggacaa tggttacatt ttccctggtt tgggagatgc 180

cggtgacaga ctcttcggta ctaagtaaac accttttcac aaaaaatatt tactctaatg 240

cgctttcatt ttacacaaag aagatatttg gtgttaagat gatttacgtg ttcgagtttt 300

attcaacacg agaagggagg tcacgaagta atggagaaat catttgtttt taaattcatg 360

ggcttgaatt ttgatcttac tgggatcatt ggttcaacgc taatggcttt ggcagttttt 420

cttatctgcg tttggcttgc acgaaaagta gaaatgaaac caaataaaag acaaaatgta 480

tttgaatatc tattagattt tactg 505

<210> 28

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的- AP205不动杆菌噬菌体外壳蛋白

<400> 28

Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile

1 5 10 15

Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu

20 25 30

Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser

35 40 45

Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly

50 55 60

Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg

65 70 75 80

Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu

85 90 95

Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn

100 105 110

Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp

115 120 125

Thr Thr Ala

130

<210> 29

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 29

Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly

1 5 10 15

Asn Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu

20

<210> 30

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 30

Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr

1 5 10 15

Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu

20 25 30

Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn

35 40 45

Gly Val Gln Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe

50 55 60

Gln Pro

65

<210> 31

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 31

Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn

1 5 10 15

Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val

20 25

<210> 32

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 32

Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly

1 5 10 15

Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr

20 25 30

Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

35 40

<210> 33

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 33

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

1 5 10 15

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

20 25 30

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

35 40 45

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln

50 55 60

Pro Tyr Arg Val

65

<210> 34

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 34

Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys

1 5 10 15

Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp

20 25 30

Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys

35 40

Claims (28)

1.一种修饰的益生菌微生物，其包含：

编码异源蛋白的核酸序列，所述异源蛋白包含：

(a)病毒外壳蛋白；或

(b)抗原肽和病毒外壳蛋白的融合体。

2.根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物，其中所述益生菌微生物包括选自由下列各项组成的组的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、酵母属(Saccharomyce)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和芽孢杆菌属(Bacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、气球菌属(Aerococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、四联球菌属(Teragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)、魏斯氏菌属(Weisella)以及基因组序列相关的其他此类细菌。

3.根据权利要求2所述的修饰的益生菌微生物，其中所述益生菌微生物包括选自由下列各项组成的组的乳杆菌属：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、Lactobacillus reuterior和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)以及基因组序列相关的其他此类细菌。

4.根据权利要求3所述的修饰的益生菌微生物，其包括嗜酸乳杆菌。

5.根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物，其中编码所述异源蛋白的所述核酸序列被整合到所述微生物的基因组中或编码在所述微生物内的质粒或载体上。

6.根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物，其中编码所述异源蛋白的所述核酸序列被整合到所述微生物的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(upp)基因或其他合适的基因组基因座处。

7.根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物，其中所述微生物表达所述异源蛋白，并且其中所述表达的蛋白自组装形成病毒样颗粒(VLP)。

8.根据权利要求7所述的修饰的微生物，其包含VLP。

9.根据权利要求8所述的修饰的益生菌微生物，其中所述异源核酸编码抗原肽和病毒外壳蛋白的融合体，并且其中VLP结合价为1或更大。

10.根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物，其中所述异源核酸编码抗原肽和病毒外壳蛋白的融合体，并且其中所述表达的蛋白不自组装形成VLP。

11.根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物，其中所述核酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白还包含以下的一种或多种：

(c)连接所述抗原肽和外壳蛋白的接头序列；

(d)免疫刺激序列。

12.根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物，其中所述病毒外壳蛋白包括PP7、MS2、AP205、Qβ、R17、SP、PP7、GA、M11、MX1、f4、Cb5、Cb12r、Cb23r、7s和f2外壳蛋白中的一种或多种。

13.根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物，其中所述病毒外壳蛋白包含细菌噬菌体AP205外壳蛋白。

14.根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物，其中所述微生物是活的培养物、活的孢子形式或灭活的。

15.根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物，其中所述微生物是死亡的或被冻干的。

16.一种营养或治疗组合物，其包含根据权利要求1所述的修饰的益生菌微生物。

17.根据权利要求16所述的组合物，其被配制成食品或饮料或以其他方式掺入食品供应中。

18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述食品或饮料包括乳制品。

19.根据权利要求16所述的组合物，其包括奶、酸奶、奶酪、冰淇淋。

20.根据权利要求16所述的组合物，其被配制成用于口服施用的胶囊、粉剂、片剂、液体或小药囊剂。

21.根据权利要求16所述的组合物，其被配制用于经鼻、直肠、肠胃外或经粘膜递送。

22.一种为受试者接种疫苗的方法，其包括：向所述受试者施用有效量的权利要求16所述的组合物。

23.一种向受试者提供营养补充剂的方法，其包括：向所述受试者施用有效量的权利要求16所述的组合物。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中施用包括口服施用。

25.根据权利要求22或23所述的方法，其中施用包括经鼻、直肠、肠胃外或经粘膜递送。

26.根据权利要求22或23所述的方法，其中治疗有效量或营养有效量作为一个或多个剂量提供。

27.根据权利要求26所述的方法，其中治疗或营养有效量通过在一周、两周、三周或一个月的时程内施用多个剂量提供。

28.根据权利要求26所述的方法，其中治疗或营养有效量作为在单次施用中的单剂量提供。