CN101291691A - 免疫原性hiv组合物和相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供免疫原性组合物，其增强哺乳动物中免疫反应的持续时间和强度。所述免疫原性组合物含有HIV抗原、免疫体和佐剂。所述HIV抗原可为缺少外部包膜蛋白gp120的全灭活HIV病毒。或者，所述HIV抗原可为全灭活HIV病毒或p24抗原。本发明还提供试剂盒，其组份当组合时产生本发明的免疫原性组合物。本发明还提供通过将HIV抗原、免疫体和可选佐剂组合来制成所述免疫原性组合物的方法。本发明进一步提供一种通过投予哺乳动物含有HIV抗原、免疫体和可选佐剂的免疫原性组合物来增强所述哺乳动物中的免疫反应而使所述哺乳动物免疫的方法。本发明还提供一种通过投予哺乳动物含有HIV抗原、免疫体和可选佐剂的免疫原性组合物来抑制所述哺乳动物中的AIDS的方法。

Description

免疫原性HIV组合物和相关方法
技术领域
本发明涉及获得性免疫缺陷综合症(AIDS)且更特定地涉及用于预防和治疗AIDS的免疫原性组合物。
背景技术
现今世界上超过3千万的人被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，这个病毒是造成AIDS的原因。尽管HIV的流行迅速散布到全世界范围，但约90％的HIV感染个体生活在发展中国家，包括撒哈拉沙漠以南的非洲和东南亚的部分地区。近来减少病毒负荷并减缓发展成AIDS的抗病毒治疗药物已变得可以获得。然而，这些药物的使用对于发展中国家而言过于昂贵。因而，仍然迫切需要研制用于减少全球AIDS流行的有效预防性和治疗性疫苗。
迄今为止，已证实有效疫苗的研制难以将HIV作为目标。因为HIV倾向于快速变异，所以现在世界不同地区存在的众多主流病毒株具有不同抗原决定部位。另外，在特定的感染个体中，HIV病毒可通过在抗原决定部位上产生突变而避开宿主免疫系统的控制。仍然需要研制改良的HIV疫苗，其刺激免疫系统，以识别保守抗原表位的广谱，抗原表位包括来自p24核心抗原的抗原决定部位。
在20世纪90年代，超过30种的不同候选HIV-1疫苗进入人类临床试验。这些疫苗引起各种体液和细胞免疫反应，其视特定疫苗组份而定在类型和强度上有所不同。仍然需要研制HIV疫苗组合物，其强烈引起与预防HIV感染相关的特定免疫反应。
通过对尽管重复暴露于HIV但仍保持未感染或已被HIV感染许多年但却未发展为AIDS的个体进行研究，已提出保护性HIV免疫反应的性质。这些研究已显示CD4+T辅助细胞与预防HIV感染和随后的疾病发展密切相关。除了抗原特异性CD4+辅助T细胞反应之外，认为CD8+细胞毒素T细胞反应在预防最初HIV感染和疾病发展中也很重要。在有效的抗病毒免疫反应中，活化的CD8+T细胞直接杀死被病毒感染的细胞并分泌具有抗病毒活性的细胞激素。
β-趋化因子系统在预防最初HIV感染及疾病发展中似乎也很重要。最原始的HIV分离体感染免疫细胞需要病毒与CCR5相互作用，CCR5的正常生物学作用是作为β-趋化因子RANTES、MIP-1α和MIP-β的主要受体。已显示导致CCR5受体的表达降低的遗传多态现象提供对HIV感染的抵抗。另外，已证明β-趋化因子含量与对HIV感染的抵抗在暴露个体和培养细胞中均具有显著相关性。已表明β-趋化因子可通过若干机制阻断HIV感染性，包括与HIV竞争结合至CCR5或干扰HIV结合至CCR5并下调表面CCR5。
由于β-趋化因子在预防最初HIV感染和疾病发展中的重要性，有效的HIV免疫原性组合物应包括在感染之前和对感染性病毒作出反应时诱导高含量的β-趋化因子产生。已描述能诱导β-趋化因子产生的HIV免疫原性组合物。然而，刺激产生高含量β-趋化因子的免疫原性组合物诱导强烈、持久的HIV-特异性Th1细胞和体液免疫反应，而HIV-特异性细胞毒素活性尚未有所述。
引起某种类型的HIV-特异性免疫反应的组合物可能不引起其它重要的保护性反应。例如，Deml等人，Clin.Chem.Lab.Med.37：199-204(1999)中描述含有HIV-1 gp160包膜抗原、免疫刺激DNA序列和明矾佐剂的疫苗，尽管其诱导抗原特异性Th1型细胞激素反应，但其不能诱导抗原特异性细胞毒素T淋巴细胞反应。此外，不预期仅含有包膜抗原的疫苗会诱导对抗更高度保守的HIV核心蛋白的免疫反应。
因而，存在对将有助于预防HIV感染或至少减缓感染个体向AIDS发展的免疫原性组合物和方法的需要。本发明满足这一需要并又提供相关的优势。
发明内容
本发明提供可用于增强哺乳动物中免疫反应的效力的免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物可增强所诱导的免疫反应的幅度、类型、强度和持续时间。免疫原性组合物含有最优化的HIV抗原、含有免疫体的经分离核酸分子和可选佐剂。HIV抗原可为缺少外部包膜蛋白gp120的全灭活HIV病毒。HIV抗原也可为蛋白酶缺失的HIV粒子，如L2粒子。或者，HIV抗原可为全灭活HIV病毒，或所选HIV抗原或肽(包括p24抗原、nef、gp41及其类似物)的组合。
在其中存在佐剂的本发明的免疫原性组合物中，佐剂可适用于投予人类。示范性佐剂为不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant)。
本发明的免疫原性组合物可进一步增强哺乳动物中β-趋化因子含量、干扰素-γ(IFNγ)、白细胞间介素2(IL2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞间介素15(IL15)的产生和/或HIV-特异性IgG2b抗体产生。本发明的免疫原性组合物也可增强哺乳动物中HIV-特异性辅助CD4+T细胞、HIV-特异性细胞毒素T淋巴细胞反应和非细胞毒素抑制性T淋巴细胞反应。
本发明还提供含有HIV抗原、免疫体和可选佐剂的试剂盒。所述试剂盒的组份当组合时产生本发明的免疫原性组合物。
本发明还提供通过将HIV抗原、免疫体和可选佐剂组合来制成免疫原性组合物的方法。所述组份可在活体外或活体内组合以获得免疫原性组合物。
本发明还提供通过投予哺乳动物含有HIV抗原、含有免疫体的经分离核酸分子和可选佐剂的免疫原性组合物来使哺乳动物免疫的方法。本发明还提供抑制AIDS的方法，其通过投予哺乳动物含有HIV抗原、含有免疫体的经分离核酸分子和可选佐剂的免疫原性组合物来增强哺乳动物中的免疫反应。在本发明的方法中，所述哺乳动物可为灵长类(如人)或啮齿动物。在所述方法的某些实施例中，所述灵长类为孕期母亲或婴幼儿。人可为HIV血清反应阴性或HIV血清反应阳性。可有利地将免疫原性组合物投予哺乳动物两次或两次以上并通过多种投予途径来投予，包括皮下、肌内和粘膜内。
附图说明
图1显示用于连接寡核苷酸以形成免疫体的示范性连接子的化学结构(Yu等人，J.Med.Chem.45：4540-4548(2002)；Yu等人.，Nucl.Acids Res.30：4460-4469(2002))。
图2显示免疫体HYB2055(也称为AmplivaxTM)的示意图。
图3显示通过HIV-1免疫原诱导HIV-特异性细胞激素RANTES、MIP1α、MIP1β、白细胞间介素-10(IL-10)和IL-5。免疫原经皮下投予。“*”指示与盐水相比具有显著性。
图4显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-1免疫原诱导的HIV-特异性干扰素-γ(IFNγ)产生。“*”指示与单独的HIV-1免疫原相比具有显著性。
图5显示AmplivaxTM对RANTES、MIP1α、MIP1β、IL-10和IL-5的产生水平的效应。免疫原经皮下投予。“*”指示与盐水相比具有显著性。
图6显示由AmplivaxTM引起的增强的HIV-特异性IFNγ产生。对于RANTES、MIP1α、MIP1β和IL-10发现类似结果。免疫原经皮下投予。“*”指示与盐水相比具有显著性。
图7显示在酶联免疫斑点(Elispot)检定中AmplivaxTM对分泌HIV-特异性IFNγ的T细胞的增强效应。免疫原经皮下投予。“*”指示与单独的HIV-1免疫原相比具有显著性。
图8显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性IFNγ产生。免疫原经皮下投予。“*”指示与单独的HIV-1免疫原相比具有显著性。
图9显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性RANTES产生。免疫原经皮下投予。“*”指示与单独的HIV-1免疫原相比具有显著性。
图10显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性MIP-1α产生。免疫原经皮下投予。“*”指示与单独的HIV-1免疫原相比具有显著性。
图11显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性MIP-1β产生。免疫原经皮下投予。“*”指示与单独的HIV-1免疫原相比具有显著性。
图12显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性IL-10产生。免疫原经皮下投予。“*”指示与单独的HIV-1免疫原相比具有显著性。
图13显示通过皮下(SC)给予的AmplivaxTM增强HIV-特异性IL-5产生。“*”指示与单独的HIV-1免疫原相比具有显著性。
图14显示小鼠中AmplivaxTM对HIV-1免疫原诱导的p24抗体滴度的效应。免疫原经皮下投予。
图15显示IFA中的HIV-1全灭活疫苗(HIV-1免疫原)一经皮下(SC)和肌内(IM)投予即诱导HIV-特异性细胞激素产生。
图16显示AmplivaxTM可在与IFA乳化之前或之后添加并增强IFNγ产生。
图17显示AmplivaxTM可在与IFA乳化之前或之后添加并增强RANTES产生。
图18显示在没有IFA的情况下具有AmplivaxTM的HIV-1全灭活疫苗抗原在皮下免疫的小鼠中触发HIV-特异性IFNγ产生。“*”指示与HIV-1免疫原(IM)相比具有显著性。HIV抗原为不含IFA的HIV全灭活疫苗。
图19显示在没有IFA的情况下具有AmplivaxTM的HIV-1全灭活疫苗抗原在皮下免疫的小鼠中触发分泌HIV-特异性IFNγ的CD8+T细胞的活性。“*”指示与HIV-1免疫原(IM投予)相比具有显著性。HIV抗原为不含IFA的HIV全灭活疫苗。
图20显示在没有IFA的情况下具有AmplivaxTM的HIV-1全灭活疫苗抗原在皮下免疫的小鼠中触发HIV-特异性RANTES产生。“*”指示与HIV-1免疫原(IM投予)相比具有显著性。HIV抗原为不含IFA的HIV全灭活疫苗。
图21显示通过活体外添加的AmplivaxTM来增加产生α-防御素的CD8+T细胞的百分数。
图22显示经
Figure A20048002465300071
治疗的患者和HIV阳性对照(0μg/ml AmplivaxTM)中产生HIV-特异性IFNγ的CD8+T细胞。
图23显示在活体外添加的0.1μg/ml AmplivaxTM存在下产生HIV-特异性IFNγ的CD8+T细胞。
图24显示在活体外添加的1μg/ml AmplivaxTM存在下产生HIV-特异性IFNγ的CD8+T细胞。
图25显示在活体外添加的10μg/ml AmplivaxTM存在下产生HIV-特异性IFNγ的CD8+T细胞。
图26显示周围血液单核细胞(PBMC)中的IFN-γ酶联免疫斑点检定。使用1μg/ml的HYB2055。
图27显示在未接受抗逆转录酶病毒疗法(ART)的患者中第一次注射
Figure A20048002465300081
之后CD4T细胞的表型改变。
图28显示在未接受ART的患者中第一次注射
Figure A20048002465300082
之后CD8T细胞的表型改变。
具体实施方式
本发明提供免疫原性HIV组合物，其含有HIV抗原、含有免疫体的经分离核酸分子和可选佐剂。本发明还提供含有所述组合物的组份用于一起使用的试剂盒。本发明还提供用所述组合物或用所述组合物的组份来使哺乳动物免疫的方法，以使得相对于单独的HIV抗原可增强经免疫哺乳动物中的免疫反应。本发明的组合物也可有利地诱导HIV特异性CD4T辅助细胞和CD8+T细胞，所述细胞产生对抗广谱HIV抗原决定部位的有效的Th1免疫反应，从而提供强烈的HIV-特异性细胞毒素T淋巴细胞反应。因而，本发明的免疫原性组合物适用于预防HIV感染和/或减缓感染个体向AIDS发展。所述组合物和方法可用于引起对保守HIV抗原决定部位具有特异性的有效的Th1细胞和体液免疫反应；引起HIV-特异性CD4T辅助细胞、HIV-特异性细胞毒素T淋巴细胞活性；刺激趋化因子和细胞激素(诸如β-趋化因子、干扰素-γ、白细胞间介素2(IL2)、白细胞间介素7(IL7)、白细胞间介素15(IL15)、α-防御素及其类似物)的产生；并增加记忆细胞。所述疫苗可经由多种投予途径来投予。所述疫苗可用于预防HIV的母体传播以用于新生儿、儿童和高危个体的疫苗接种及用于感染个体的疫苗接种。所述疫苗也可与其它HIV疗法组合使用，包括具有核酸酶和蛋白酶抑制剂和阻断病毒进入的药剂(如T20)的多种组合的抗逆转录酶病毒疗法(ART)(参见Baldwin等人，Curr.Med.Chem.10：1633-1642(2003))。
本文中所使用的术语“HIV”指HIV病毒的所有形式、亚型和变种并且与以前的术语HTLVIII和LAV同义。已研制出多种能增殖HIV或被HIV病毒永久感染的细胞株并将其以ATCC存放，包括HuT 78细胞和HuT 78衍生物H9以及具有登记号CCL 214、TIB 161、CRL 1552和CRL 8543的那些细胞株，其描述于美国专利第4,725,669号和Gallo，Scientific American 256：46(1987)中。
本文中所使用的术语“全灭活HIV病毒”指完整、无活性的HIV病毒。无活性的HIV病毒指不能感染和/或复制的病毒。
本文中所使用的术语“外部包膜蛋白”指逆转录酶病毒的部分膜糖蛋白，其与跨膜蛋白gp41相反而突出膜。
本文中所使用的术语“缺少外部包膜蛋白的HIV病毒”指缺少外部包膜蛋白gp120但含有更多病毒的遗传保守部分(例如p24和gp41)的HIV粒子或HIV基因产物的制剂。缺少外部包膜蛋白gp120的HIV在本文中也称作REMUNETM。
本文中所使用的术语“HIV p24抗原”指HIV的gag区域的基因产物，其特征是具有约24,000道尔顿的表观相对分子量并标示为p24。术语“HIV p24抗原”也指具有p24免疫活性的p24的修饰和片段。所属领域的技术人员可确定p24的适当修饰，诸如添加、删除或取代天然氨基酸或氨基酸类似物，用来例如增加p24的稳定性或生物利用性或有助于其纯化而不破坏其免疫活性。同样地，所属领域的技术人员可确定具有p24免疫活性的p24的适当片段。p24的免疫活性片段可具有6个来自多肽之残基直至全长多肽减去一个氨基酸。由其它HIV基因产物编码的其它HIV抗原可包括与HIV p24抗原的上述那些片段或修饰相似的片段或修饰。其它示范性HIV抗原例如包括gp41、nef及其类似物。
本文中所使用的“免疫体”指寡核苷酸，其包含2个更小的在其3′末端连接的寡核苷酸，从而产生具有2个5′末端的寡核苷酸。免疫体的这两个更小的寡核苷酸可为相同或不同序列和/或长度，但一般是相同的。除了其免疫刺激活性之外，免疫体含有3′-3′连接并因此不具有游离3′末端，因而增加对核酸酶消化的抗性。免疫体的更小的寡核苷酸一般为至少约5或6个核苷酸，其连接在一起以形成2个5′末端，但可为更长，诸如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或甚至更长的免疫体的更小寡核苷酸。所属领域的技术人员可轻易确定足以刺激比单独抗原所见更大的免疫反应的免疫体的长度和/或序列。因而，在一个实施例中，免疫体包含两个相同的经由其3′末端连接的寡核苷酸。免疫体也可包括经修饰的碱基。免疫体描述于例如：Kandimalla等人，Bioorg.Med.Chem.9：807-813(2001)；Yu等人，Nucl.Acids Res.30：4460-4469(2002)；Yu等人，Bioorg.Med.Chem.11：459-464(2003)；Bhagat等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.300：853-861(2003)；和Yu等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.297：83-90(2002)；Yu等人，Nucl.Acids Res.30：1613-1619(2002)；Yu等人，J.Med.Chem.45：4540-4548(2002)；Kandimalla等人，Bioconjugate Chem.13：966-974(2002)；Yu等人，Bioorganic Med.Chem. Lett.10：2585-2588(2000)；Agrawal和Kandimalla，Trends Mol.Med.8：114-121(2002)中；其各自以引用的方式并入本文中。所述免疫体可具有比含有CpG的免疫刺激序列更有效的免疫刺激活性。当与抗原组合投予时，免疫体增强哺乳动物中的免疫反应。如下所论述，免疫体可为CpG免疫体或无CpG免疫体。示范性免疫体在实例X和XI中加以描述。
本文中所使用的“CpG免疫体”指如上所述的免疫体，其特定地含有CpG基序。因而，CpG免疫体为包含两个相同或不同的更小寡核苷酸的寡核苷酸，其中至少一个更小寡核苷酸含有至少一个CpG基序。
本文中所使用的“无CpG免疫体”指特定地排除CpG基序的免疫体。因而，无CpG免疫体为包含两个相同或不同的更小寡核苷酸的寡核苷酸，其中没有一个更小寡核苷酸含有CpG基序。
免疫体可含有经修饰的碱基(参见Kandimalla等人，上文，2001)。例如，免疫体可含有CpG类似物。例如，免疫体可含有脱氧胞嘧啶的嘧啶类似物，标示为Y。尤其适用的用于免疫体中的脱氧胞嘧啶核苷类似物为脱氧-5-羟基胞嘧啶核苷或脱氧-N4-乙基胞嘧啶核苷。在另一实施例中，免疫体可含有鸟嘌呤的嘌呤类似物，标示为R。尤其适用的脱氧鸟嘌呤类似物为7-脱氧鸟嘌呤(7-deazguanine)。因而，免疫体可含有YpG基序、CpR基序或YpR基序，其中Y和R分别是胞嘧啶和鸟嘌呤的类似物。
先前已描述连接两个更小寡核苷酸以形成免疫体的方法(Kandimalla等人，Bioorg. Med.Chem.9：807-813(2001)；Yu等人，Nucl.Acids Res.30：4460-4469(2002)；Yu等人，Bioorg.Med.Chem.11：459-464(2003)；Bhagat等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.300：853-861(2003)；和Yu等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.297：83-90(2002)；Yu等人，Nucl.Acids Res.30：1613-1619(2002)；Yu等人，J.Med.Chem.45：4540-4548(2002)；Kandimalla等人，Bioconjugate Chem.13：966-974(2002)；Yu等人，Bioorganic Med.Chem.Lett.10：2585-2588(2000)；Agrawal和Kandimalla，Trends Mol.Med.8：114-121(2002))。示范性连接子例如包括经由甘油基连接子的3′-3′连接(Yu等人，Biochem.Biophys.Res. Comm.297：83-90(2002))。连接子可为烷基、支链烷基或乙二醇连接子，如Yu等人，J. Med.Chem.45：4540-4548(2002)中所述(参见图1)。所属领域的技术人员可轻易认识到可使用这些方法及其它方法来经由寡核苷酸的3′末端将其连接以产生两个游离5′末端。
本文中所使用的术语“免疫刺激序列”或“ISS”指含有未甲基化的CpG基序的核苷酸序列，当与抗原组合投予时，其能增强哺乳动物中的免疫反应。免疫刺激序列例如描述于PCT公开案WO 98/55495中。
本文中所使用的术语“含有免疫体的核酸分子”指含有免疫体的线性、环状或分支的单或双股DNA或RNA核酸。含有免疫体的核酸分子可含有单一免疫体。若游离5′末端中之一个或两个连接至另一个核酸分子序列的5′末端以产生另一个用于连接额外免疫体的潜在3′末端，则核酸分子也可含有一个以上的免疫体。除免疫体之外，所述核酸分子可具有大于6个碱基或碱基对的任何长度，并一般大于约15个碱基或碱基对，诸如大于约20个碱基或碱基对，并在长度上可为若干kb。当含有免疫体的所述核酸为环状时，或当其含有多个需要5′-5′连接的免疫体时，应了解只要5′-5′连接不干扰嵌入核酸的免疫体的免疫刺激活性，游离5′末端就(例如)如Kandimalla等人，Bioconjugate Chem.13：966-974(2002)和Yu等人，Bioorgan.Med.Chem.10：2585-2588(2000)中所述进行连接，如在短免疫体情况下所发现的(Kandimalla等人，上文，2002，和Yu等人，上文，2000)。含有免疫体的核酸可另外含有编码一个或一个以上HIV抗原的核酸序列以用作DNA疫苗。
免疫体或含有免疫体的核酸分子可通过例如本文所揭示的化学合成寡核苷酸和经由其3′末端化学连接寡核苷酸来产生。另外，免疫体或含有免疫体的核酸分子可通过重组合成免疫体或含有免疫体的核酸的两个半部分和经由其3′末端化学连接两个半部分来产生。
免疫体可含有天然或经修饰的核苷酸或天然或非天然核苷酸连接。所属领域已知的修饰包括例如3′OH基或5′OH基的修饰、核苷酸碱基的修饰、糖组份的修饰和磷酸根基团的修饰。非天然核苷酸连接可为例如硫代磷酸酯连接而不是磷酸二酯连接，其增加核酸分子对核酸酶降解的抗性。多种修饰和连接描述于例如PCT公开案WO 98/55495中。
本文中所使用的术语“佐剂”指如下物质：当将其添加到免疫原性药剂中时，一旦受试者接触混合物，就非特异性增强或加强受试者对药剂的免疫反应。佐剂可包括例如水包油乳液、油包水乳液、明矾(铝盐)、脂质体和微粒，诸如聚苯乙烯、淀粉、聚磷氮烯和聚交酯/聚糖苷。佐剂也可包括例如角鲨烯混合物(SAF-I)、胞壁酰基肽、皂草苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制剂、单磷酰基脂质A、分枝菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物界面活性剂、QuilA、霍乱毒素B亚单位、聚磷氮烯及衍生物和免疫刺激复合物(ISCOM)，诸如Takahashi等人(1990)Nature 344：873-875所述的那些复合物。弗氏佐剂(完全和不完全)的促有丝分裂组份可用于兽医用途和用于在动物中产生抗体。在人类中，不完全弗氏佐剂(IFA)是尤其适用的佐剂。所属领域中熟知多种适当的佐剂并由例如Warren和Chedid，CRC Critical Reviews in Immunology 8：83(1988)综述。
本文中所使用的“AIDS”指HIV感染的症状期，并包括获得性免疫缺陷综合症(通常称为AIDS)和“ARC”或AIDS相关的综合症，如Adler，Brit.Med.J.294：1145(1987)所述。AIDS的免疫学和临床表现在所属领域中熟知且包括例如机会性感染和由免疫缺陷导致的癌症。
本文中所使用的术语“抑制AIDS”指免疫原性组合物关于HIV感染或AIDS症状的有益预防或治疗效应。所述有益效应包括例如预防或延缓暴露于HIV的个体的最初感染；在被HIV感染的个体中减少病毒负荷；延长HIV感染的无症状阶段；在病毒含量已经由抗逆转录酶病毒疗法(ART)降低的HIV感染患者中维持低病毒负荷；在未接受药物治疗的患者和用ART治疗的患者中，HIV-1特异性和非特异性地增加CD4T细胞含量或减轻CD4T细胞的减少；增加患AIDS个体的整体健康或生存质量；并延长患AIDS个体的预期寿命。临床医师可将免疫效应与治疗前的患者情况相比，或与未治疗患者的预期情况相比，以确定所述治疗是否有效抑制AIDS。
本文中所使用的关于免疫反应的术语“增强”用以意谓免疫原性组合物比含有单独的HIV抗原的组合物引起更大的免疫反应。在免疫原性组合物含有三种组份HIV抗原、免疫体和佐剂的情况下，以相同量投予并依照相同的免疫进程，免疫原性组合物比含有免疫原性组合物的三种组份中的任何两种的组合物引起更大的免疫反应。本发明的免疫原性组合物的组份可协同作用。增强的免疫反应可为例如：促进记忆细胞的趋化因子和/或细胞激素的产生增加、记忆细胞增加、IgG2b产生增加、细胞毒素T淋巴细胞活性增加、β-趋化因子或IL15产生增加及其类似反应。增强的免疫反应的实例为本发明的免疫原性组合物可通过CD4细胞(辅助功能)和CD8细胞(细胞毒素T淋巴细胞；CTL)增加γ-干扰素的产生。
本文中所使用的术语“β-趋化因子”指一类小的、趋化性多肽的成员，其包括RANTES、巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)和巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)。β-趋化因子的物理和功能性质在所属领域为人所熟知。
在β-趋化因子产生增强的情况下，β-趋化因子产生可为“HIV-特异性β-趋化因子产生”，其指β-趋化因子响应HIV抗原刺激T细胞而产生。或者或另外，增强的β-趋化因子产生可为“非特异性β-趋化因子产生”，其指β-趋化因子在缺乏HIV抗原刺激T细胞的情况下产生。
本文中所使用的术语“试剂盒”指将组份包装并标记以用于一起使用。例如，试剂盒可含有在三个独立容器中的HIV抗原、免疫体和佐剂。或者，试剂盒可含有在一个容器中的任何两种组份，并且第三组份和任何额外组份在一个或一个以上的独立容器中。试剂盒可视情况进一步含有用于将组份组合以调配适于投予哺乳动物的免疫原性组合物的说明书。
本发明提供含有HIV抗原、免疫体和可选佐剂的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物增强经投予组合物的哺乳动物中的免疫反应。在一个实施例中，免疫原性组合物增强哺乳动物中的HIV-特异性细胞毒素T淋巴细胞(CTL)反应。在另一个实施例中，免疫原性组合物增强HIV-特异性CD4+辅助T细胞。
在一个实施例中，免疫原性组合物中的HIV抗原为全灭活HIV病毒，其可通过所属领域中已知的方法来制备。例如，HIV病毒可通过从感染个体的周围血液样本培养来制备。在培养HIV病毒的示范性方法中，来自周围血液的单核细胞(例如淋巴细胞)可通过使肝素化静脉血样本在聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度上分层并将样本离心来获得。接着收集单核细胞，用植物血球凝集素活化2至3天并在适当培养基(优选补充白细胞间介素2(IL2))中培养。可通过逆转录酶检定、通过p24抗原捕捉检定、通过免疫荧光法或通过电子显微术检测病毒以检测细胞中病毒粒子的存在，所有所述方法均为所属领域的技术人员所熟知。
用于分离全灭活HIV粒子的方法描述于例如Richieri等人.Vaccine 16：119-129(1998)和美国专利第5,661,023号和第5,256,767号中。在一个实施例中，HIV病毒为1976年扎伊尔的感染个体中分离的HZ321，其描述于Choi等人，AIDS Res.Hum.Retroviruses13：357-361(1997)中。
用于使病毒成为非感染性的多种方法在所属领域中已知(例如参见Hanson，MEDICAL VIROLOGY II(1983)，de la Maza和Peterson编辑，Elsevier)。例如，可通过用化学品处理或通过物理条件(诸如加热或辐射)来使病毒失活。优选用一种或一种以上维持病毒的免疫原性性质的药剂来处理病毒。例如，病毒可用β-丙内酯或γ-辐射、或β-丙内酯和γ-辐射以足以使病毒失活的剂量和时间来处理。
在另一个实施例中，免疫原性组合物中的HIV抗原为缺少外部包膜蛋白的全灭活HIV病毒，其可通过所属领域中已知的方法来制备。为制备缺少外部包膜蛋白的全灭活病毒，处理经分离的病毒以移除外部包膜蛋白。所述移除优选通过结合造成病毒粒子膨胀和收缩的物理方法将病毒重复冷冻和解冻来完成，尽管其它物理或非物理方法(如超声波处理法)也可单独或组合使用。
在另一实施例中，免疫原性组合物中的HIV抗原为HIV的一种或一种以上大体纯化的基因产物。所述基因产物包括由gag基因编码的产物(p55、p39、p24、p17和p15)、由pol基因编码的产物(p66/p51和p31-34)和跨膜糖蛋白gp41；和nef蛋白。这些基因产物可单独使用或与其它HIV抗原组合使用。HIV抗原也可为引起免疫反应的HIV基因产物的肽片段。
HIV的大体纯化的基因产物可为大体纯化的HIV p24抗原或其它HIV抗原和基因产物。p24以及其它HIV抗原可通过所属领域中已知的生化方法从病毒中大体纯化，或可通过由所属领域中熟知的方法在宿主有机体(诸如细菌、真菌或哺乳动物细胞)中克隆和表达适当基因来产生。或者，可使用所属领域中熟知的方法(诸如自动肽合成法)来合成p24抗原或其保持p24的免疫活性的修饰或片段以及其它HIV抗原或其修饰或片段。例如可通过其刺激先前免疫的PBMC活体外增殖的能力来确定p24的修饰或片段是否保持p24的免疫活性或其它病毒抗原是否保持其分别的免疫活性，其通过所属领域中已知的常规的淋巴细胞增殖检定(LPA)(参见实例III)、通过使哺乳动物免疫并比较如此产生的免疫反应、或测试修饰或片段与p24竞争结合至p24抗体的能力或与其它HIV抗原竞争结合至其分别抗体的能力来分析。
在另一实施例中，免疫原性组合物中的HIV抗原为蛋白酶缺失性HIV的大体上纯化的基因产物(参见美国专利第6,328,976号和第6,557,296号)。
HIV-1的复制过程具有每5-10个碱基对中约1个碱基对的误差率。由于整个病毒基因组刚好少于10,000个碱基对，所以这导致每个复制周期中约1个碱基对的误差率。这一高突变率有助于任何一个人内部的病毒的广泛可变性和跨越种群的更广阔的可变性。
这一可变性已导致三种正在描述中的HIV-1变体和病毒的大约10个亚种，称为“分化枝”。这些区别是基于尤其可变的包膜蛋白的结构。M(代表主要)变体是目前为止世界范围内最流行的变体。M变体内为分化枝A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K，其中分化枝A到E代表全球绝大多数的感染。分化枝A、C和D在非洲占优势。分化枝B在欧洲、北美洲和南美洲和东南亚最流行。分化枝E和C在亚洲占优势。这些分化枝彼此有多达35％不同。
HIV-1的极高突变率有两个重要结果，其对流行病具有深远意义。第一，高突变率是使病毒避开药物治疗控制的机制之一。这些新的病毒代表抗性株。高突变率也使病毒通过改变由免疫组份识别的结构来避开患者免疫系统。这一广泛可变性的附加结果在于病毒也可避开疫苗的控制并且基于包膜蛋白的疫苗很可能无效。
结构上的最大变化见于包膜蛋白gp120和gp41中。较少的变化见于多种内部蛋白中。如本文所揭示，REMUNE为由全病毒制成的免疫原，其不具有全病毒的gp120，但含有HIV-1病毒的大部分高度保守抗原表位。这些抗原决定部位的数目及其低突变率意味着缺少外部包膜蛋白的HIV病毒(如REMUNE)刺激在个体内具有更高成功机会的免疫反应。另外，HuT 78细胞株有目的地经含有保守抗原的分化枝A和G的极早期HIV病毒株感染，所述保守抗原已在世界范围内可见的大多数分化枝变体之间得以保持，并且这个HuT 78HIV感染细胞株提供用作HIV抗原的病毒。因而，也缺少外部包膜蛋白的具有多个早期分化枝的HIV病毒用于免疫可通过提供被多数患者识别的保守抗原而在分化枝之间有效。
HIV抗原和免疫体可一起混合，或可由共价连接或非共价连接来共轭。使抗原和核酸分子共轭的方法在所属领域中已知，且示范性方法描述于PCT公开案WO 98/55495中。
免疫体的寡核苷酸组份可使用所属领域中熟知的方法来制备，包括例如：寡核苷酸合成法、PCR、较大核酸分子的酶促或化学降解和常规的聚核苷酸分离程序。免疫体的寡核苷酸组份(包括含有一个或一个以上经修饰碱基或连接的寡核苷酸)的生产方法描述于例如PCT公开案WO 98/55495中。
通过用含有特定免疫体的组合物使相同物种或所属领域中已知物种的哺乳动物免疫来展示类似的免疫反应，所属领域的技术人员可轻易确定特定的免疫体是否有效增强特定哺乳动物中的所需免疫反应。可接着使用多种所属领域中已知的检定来表征和比较所诱导的免疫反应的特征。例如，供投予人类的包括于免疫原性组合物中的最优化免疫体，其可藉通过例如LPA、酶联免疫斑点法(ELISPOT)和/或所产生的IgG1/G2抗体的比率的方法，来评估其在人类或非人类灵长类动物如狒狒、黑猩猩、猕猴或猴子中的免疫活性加以确认。
本发明的免疫原性组合物可进一步含有佐剂，诸如经证明对人类安全的佐剂。示范性佐剂为不完全弗氏佐剂(IFA)。另一个示范性佐剂含有分枝杆菌细胞壁组份和单磷酰基脂质A，如市售佐剂DETOXTM。另一个示范性佐剂为明矾。免疫原性组合物中佐剂的制备和调配在所属领域中为人所熟知。
本发明的免疫原性组合物可视情况含有其它医药学上可接受的成份或与其它医药学上可接受的成份一起调配，所述成份包括无菌水或生理缓冲盐水。医药学上可接受的成份可为用于例如稳定、溶解、乳化、缓冲免疫原性组合物或维持其无菌性的任何化合物，其适宜投予哺乳动物且不会使免疫原性组合物对其预期目的无效。所述成份及其用途在所属领域中为人所熟知。
本发明还提供含有HIV抗原、免疫体和可选佐剂的试剂盒。所述试剂盒的组份当组合时产生增强哺乳动物中的免疫反应的免疫原性组合物。
试剂盒的组份可活体外组合以产生含有HIV抗原、免疫体和可选佐剂的免疫原性组合物。或者，任何两种组份可活体外组合并与第三组份一起投予，以使得免疫原性组合物在活体内形成。例如，可将HIV抗原乳化于佐剂中、溶解于佐剂中、与佐剂混合或吸附于佐剂并注射入哺乳动物，在这之前或之后注射免疫体。同样地，试剂盒的各组份可独立投予。所属领域的技术人员应了解存在多种组合和投予HIV抗原、免疫体和可选佐剂以增强哺乳动物中的免疫反应的方法。如以下更详细地论述，本发明的免疫原性组合物可通过所属领域中熟知的方法局部或全身投予，包括(但不限于)肌内、皮内、静脉内、皮下、腹膜内、鼻内、经口或其它粘膜途径。
如本文所揭示，已发现尽管具有不同程度的效力和持续时间，但REMUNE在大多数患者中免疫原性(实例VIII)。因此，包含与IFA佐剂组合的缺少外部包膜蛋白的HIV(如REMUNE)的免疫原性组合物可用于诱导大多数HIV感染患者中的免疫反应。本发明的免疫原性组合物增强对HIV免疫原(如REMUNETM)的免疫反应的强度和效力，由此增强疫苗的治疗和/或预防功效。增强的免疫反应可为例如：HIV-1特异性CD4+辅助T细胞、趋化因子和/或细胞激素的产生增加；记忆细胞增加；整个抗体的产生增加且尤其是IgG2b产生比率增加；细胞毒素T淋巴细胞活性增加；β-趋化因子或IL15的产生增加及其类似反应。因而，本发明的免疫原性组合物可用于增强TH1细胞激素概况(高IFNγ、高IgG2/IgG1比率)。如本文所揭示，本发明的免疫原性组合物的组份可协同作用。例如，本发明的免疫原性组合物可通过引起产生与添加免疫原性组合物组份的成对组合的效应所预期的相比更高浓度的β-趋化因子来增强β-趋化因子产生。
在感染的最初急性状态之后维持长期免疫性需要记忆细胞。在感染的最初急性阶段之后的收缩期内，大量的经诱导以对抗感染因子的免疫细胞被细胞凋亡破坏，仅存活的细胞保持能够变成记忆细胞。因此，保护HIV-特异性CD4和CD8T细胞免受细胞凋亡可促进HIV-特异性CD4辅助细胞和CD8CTL记忆细胞的增加。本发明的免疫原性组合物可用于增加记忆细胞，由此促进长期的辅助功能和细胞介导的免疫性。本发明的免疫原性组合物可通过减少细胞凋亡或刺激促进记忆细胞存活的因子来用于增加记忆细胞的数目。
本发明的免疫原性组合物可用于将TH2反应转换为TH1反应，由此增加细胞介导的免疫反应，包括更强烈的CD8+反应。因而，本发明的免疫原性组合物可用于加强患者中的免疫反应并将反应转化为细胞介导的免疫性，否则所述患者仅微弱地反应。本发明的免疫原性组合物因而可用于增加患者中的免疫反应的强度和持续时间，所述患者已经对与免疫原性组合物中所使用的HIV-抗原相似的HIV-抗原微弱地反应。
本发明的免疫原性组合物有效增强经投予所述组合物的哺乳动物中的免疫反应，例如β-趋化因子和/或IL15、IFN、IL2、TNFα的产生增强；HIV-特异性CD4辅助细胞增加；IgG2b抗体的产生增加；HIV-特异性细胞毒素T淋巴细胞(CTL)产生增加；由CD4+细胞和CD8T细胞产生的INFγ增加；及其类似反应。如2000年5月5日申请的美国申请案第09/565,906号和WO 00/67787(各自以引用的方式并入本文中)中及以下的实例I和III中所述，可使用来自经投予组合物的哺乳动物的T细胞(如淋巴结细胞或周围血液细胞)上清液的酶联免疫吸附分析(ELISA)检定来检测和定量β-趋化因子RANTES。为测定抗原-特异性β-趋化因子产生，可用与抗原呈现胸腺细胞组合的HIV抗原刺激来自经免疫哺乳动物的T细胞，且在上清液中测量β-趋化因子的含量。为测定非特异性β-趋化因子产生，可检定来自经免疫哺乳动物的T细胞上清液或血液或血浆样本。类似地，其它β-趋化因子(如MIP-1α和MIP-1β)的产生可使用市售酶联免疫吸附分析检定根据厂商的说明书来检测和定量。
通过酶联免疫斑点法、酶联免疫吸附分析或细胞内细胞激素染色来测量细胞激素(包括干扰素、IL15、IL2、TNFα、IL10和IL7)产生的方法为所属领域的技术人员所熟知(例如参见Robbins等人，AIDS17：1121-1126(2003))。
本发明的免疫原性组合物可进一步能够增强经投予组合物的哺乳动物中的HIV-特异性IgG2b抗体产生。与Th1型反应相关的高含量的IgG2b抗体与预防HIV感染和向AIDS发展有关。因而，本发明提供可增加TH1反应的组合物。
本发明的免疫原性组合物可进一步能够增强经投予组合物的哺乳动物中的HIV-特异性细胞毒素T淋巴细胞(CTL)反应。本发明的免疫原性组合物可通过CD4+T细胞和CD8+T细胞来增加INF-γ的产生。
通过CD4+T细胞的INF-γ产生的特征是对细胞介导的免疫性重要的典型CD4辅助反应。产生IFN和IL2的CD4+T细胞可能最有效。通过CD8+T细胞的INF-γ产生代表细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，并与细胞溶解活性高度相关。产生IFN和TNFα的细胞可能最有效。CTL活性为有效的预防性或治疗性抗HIV免疫反应的重要组份。确定CTL反应是否在投予本发明的免疫原性组合物之后得到增强的方法在所属领域中熟知，并包括细胞溶解检定和LPA检定(例如描述于Deml等人，上文(1999)；参见实例III)、用于CD8-特异性INF-γ产生的酶联免疫吸附分析和酶联免疫斑点检定(参见美国申请案第09/565,906号和WO 00/67787和以下实例I和II)、细胞内染色和使用许多对抗细胞表面标记物的抗体的FACS分析。
本发明还提供使个体免疫的方法。所述方法是由通过投予哺乳动物含有HIV抗原、免疫体和可选佐剂的免疫原性组合物来增强个体中的免疫反应而组成。免疫原性组合物的组份可以任何顺序或组合投予，以使得活体外或活体内形成免疫原性组合物。
在特定实施例中，HIV抗原、免疫体和可选佐剂在大约相同的位点同时投予或在大约相同的时间投予。然而，在若干分钟或若干小时内各自投予组份也可有效地提供增强免疫反应的免疫原性组合物。另外，在哺乳动物中的不同位点投予组份也可有效地提供增强免疫反应的免疫原性组合物。所属领域的技术人员可轻易确定合适的时间和位置以独立投予组份(即HIV抗原、免疫体和可选佐剂组份)，从而通过在不同时间和位置投予独立组份并测量免疫反应来提供充足的免疫反应。需要时，免疫原性组合物也可多次投予，例如2次或2次以上、3次或3次以上、4次或4次以上、5次或5次以上、6次或6次以上、7次或7次以上、8次或8次以上、9次或9次以上、10次或10次以上或任何需要的次数以刺激或增强HIV-特异性免疫反应。
本发明的免疫原性组合物可投予人类以抑制AIDS，诸如通过预防暴露于HIV的个体的最初感染、减少被HIV感染的个体的病毒负荷、延长HIV感染的无症状阶段、增加患AIDS个体中的整体健康或生存质量或延长患AIDS个体的预期寿命。如本文所揭示，投予哺乳动物含有HIV抗原、含有免疫体的经分离核酸分子和可选佐剂的免疫原性组合物可刺激与预防HIV感染和向AIDS发展有关的免疫反应。
详言之，免疫原性组合物比含有HIV抗原、免疫体和佐剂的三组份组合物中的任何个别组份的组合或免疫原性组合物的任何两个组份的组合所预期的更有效地增强免疫反应。另外，免疫原性组合物促进强烈的Th1型免疫反应，包括Th1型细胞激素(例如IFN-γ)和Th1型抗体同种型(例如IgG2b)。因而，本发明的免疫原性组合物当投予血清反应阴性个体时将有效地作为疫苗以预防HIV感染，并将有效地作为疫苗以减少血清反应阳性个体的病毒负荷、延长感染的无症状阶段并积极影响健康或寿命。
已经暴露于HIV病毒的个体通常在其对于HIV特异的血清特定抗体中表达。所述个体称为HIV的“血清反应阳性”，与“血清反应阴性”的个体形成对比。HIV特异性抗体的存在可通过市售检定系统来确定。
目前，检测病毒抗体存在的血清学测试为确定感染的最广泛使用的方法。然而，当个体已经感染病毒但尚未发动免疫反应时，所述方法可导致假阴性；并且当胎儿可能获得抗体而不是来自母亲的病毒时，所述方法可导致假阳性。当血清学测试提供对感染的指示时，可能必需认为所有测试为血清反应阳性的个体实际上正被感染。另外，如果满足某些其它感染指示(诸如与已知载剂接触)，则某些发现是血清反应阴性的个体实际上应作为正被感染而进行治疗。
本发明的免疫原性组合物可投予HIV血清反应阴性或血清反应阳性的个体。在血清反应阳性的个体中，可能需要将组合物作为治疗方案的一部分来投予，所述治疗方案包括用诸如蛋白酶抑制剂的抗病毒剂治疗。抗病毒剂及其在治疗方案中的使用在所属领域中为人所熟知，并且用于特定个体的适当方案可由熟练的临床医师来确定。
如美国申请案第09/565,906号和WO 00/67787中所述及本文和以下实例IV中所揭示，将本发明的免疫原性组合物投予灵长类胎儿或投予灵长类新生儿可导致产生强烈的抗HIV免疫反应，指示胎儿和婴儿的免疫系统能够发动对保护儿童免受HIV感染或免于向AIDS发展的所述组合物的免疫反应。因此，本发明的免疫原性组合物可投予被HIV感染的孕期母亲以预防HIV向胎儿传播，或作为预防性或治疗性疫苗投予胎儿、婴儿、儿童或成人。
选择本发明的方法中待投予的免疫原性组合物或其组份的剂量以使其有效刺激所需的免疫反应。用于单次投予而调配的免疫原性组合物一般含有介于约1到200μg之间的蛋白抗原。用于投予灵长类(如人类)的免疫原性组合物一般含有约100μg蛋白抗原。如美国申请案第09/565,906号和WO 00/67787中所述及本文所揭示和以下实例IV所显示，免疫原性组合物中的约100μg HIV抗原引起灵长类动物中的强烈免疫反应。约10μgHIV抗原适于投予啮齿动物。所属领域的技术人员可轻易确定本发明的免疫原性组合物中待包括的足以刺激免疫反应的HIV抗原的合适量。
本发明的免疫原性组合物可进一步含有约5μg到约100μg免疫体并且需要时，可含有多达10mg免疫体。例如在用于投予人类的剂量中，所述剂量可为约0.01mg到约5mg，例如约0.05mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约1.1mg、约1.2mg、约1.3mg、约1.4mg、约1.5mg、约1.7mg或约2mg。待投予的免疫体的量一般为约0.1mg/kg到约0.25mg/kg到多达约5mg/kg并可为例如约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.2、约1.5、约1.7、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5或约5mg/kg。免疫体的量也可为约0.2μg/kg、约0.5μg/kg、约1μg/kg、约2μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约6μg/kg、约7μg/kg、约8μg/kg、约9μg/kg、约10μg/kg、约11μg/kg、约12μg/kg、约13μg/kg、约14μg/kg、约15μg/kg、约16μg/kg、约17μg/kg、约18μg/kg、约19μg/kg、约20μg/kg、约22μg/kg、约25μg/kg及其类似量。如先前美国申请案第09/565,906号和WO 00/67787中所述，核酸分子与HIV抗原的至少5∶1的重量比率比较低的比率更有效地引起免疫反应。所属领域的技术人员可轻易确定用于引起免疫反应的免疫体与HIV抗原的适当或最优化比率。例如，可变化比率并且可通过本文所揭示的方法测量免疫反应，以确定免疫体与HIV抗原的适当或最优化比率。啮齿动物中，免疫原性组合物中免疫体的有效量为5μg到大于50μg，如约100μg。灵长类动物中，约500μg的免疫体适用于免疫原性组合物中。所属领域的技术人员可轻易确定引起所需免疫反应的免疫体的适当量。
对于所有的免疫原性组合物，免疫学有效量是经验确定的，但可基于例如动物模型(如啮齿动物和非人类灵长类动物)的免疫学有效量。应考虑的因素包括抗原性、配方(例如体积、佐剂类型)、投予途径、待投予的免疫剂量数目、个体的身体情况、体重和年龄及其类似因素。所述因素在疫苗领域为人所熟知并为免疫学家所熟知以进行所述确定而无需过度实验。
本发明的免疫原性组合物可通过所属领域中已知的任何方法局部或全身投予，包括(但不限于)肌内、皮内、静脉内、皮下、腹膜内、鼻内、经口或其它粘膜途径。免疫原性组合物可在合适的、无毒的医药载剂中投予或可调配于微胶囊中或调配为持续释放植入物。需要时，本发明的免疫原性组合物可多次投予以持续所需的免疫反应。适当途径、调配物和免疫进程可通过所属领域的技术人员来确定。
应了解，大体上不影响本发明的多个实施例的功能的修改也包括在本文所提供的本发明的定义内。因此，以下实例意在说明本发明而并非对其进行限制。
实例I
由HIV免疫原性组合物引起细胞激素、抗体和趋化因子反应
设计这一实例以显示含有HIV抗原、免疫体和佐剂的免疫原性组合物为哺乳动物中的IFN-γ产生(Th1(CD8)和Th2(CD4辅助细胞)细胞激素)、抗体反应和β-趋化因子产生的有效刺激剂。因此，含有HIV抗原、免疫体和佐剂的免疫原性组合物介导有效的免疫反应，从而指示这些组合物是有效的预防性和治疗性疫苗，所述免疫反应是在保护个体免受HIV感染和疾病发展中起重要作用的类型。
免疫体。角疫体如先前所述而合成(Kandimalla等人，Bioorg.Med.Chem.9：807-813(2001)；Yu等人，Nucl.Acids Res.30：4460-4469(2002)；Yu等人，Bioorg.Med.Chem.11：459-464(2003)；Bhagat等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.300：853-861(2003)；和Yu等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.297：83-90(2002)；Yu等人，Nucl.Acids Res.30：1613-1619(2002)；Yu等人，J.Med.Chem.45：4540-4548(2002)；Kandimalla等人，Bioconjugate Chem.13：966-974(2002)；Yu等人，Bioorganic Med.Chem.Lett.10：2585-2588(2000)；Agrawal和Kandimalla，Trends Mol.Med.8：114-121(2002))。
免疫。HIV-1抗原基本上如先前所述(WO 00/67787)来制备。简而言之，HIV-1抗原是由经扎伊尔病毒分离体(HZ321)慢性感染的Hut 78的培养物中所获得的病毒粒子来制备，所述扎伊尔病毒分离体的特征是含有env A/gag G重组病毒的亚型“M”(Choi等人，AIDS Res.Hum.Retroviruses 13：357-361(1997))。gp120在两步骤的纯化过程中去除。通过添加β-丙内酯和50kGγ下的γ辐射来使抗原失活。使用西方墨点法和HPLC分析来显示在这个抗原的制备中不可检测含量的gp120(Prior等人，Pharm.Tech.19：30-52(1995))。对于活体外实验，优选用2％曲拉通(triton)X-100使天然p24从纯化的HIV-1抗原中细胞溶解并接着用Pharmacia SepharoseTM快速流动S树脂(PharmaciaSepharoseTM Fast Flow S resin)纯化。在pH＝5.0下进行色谱分离并用线性盐梯度洗提p24。通过SDS(十二烷基硫酸钠)电泳和反相高压液相色谱法评估最终产物的纯度并发现一般是大于99％。以最终体积的至少5％的体积将免疫体添加到稀释的HIV-1抗原中。
CFA(完全弗氏佐剂)通过将结核分枝杆菌H37RA(DIFCO，Detroit，Michigan)以10mg/ml再悬浮于IFA(DIFCO，Detroit，Michigan)中来制备。IFA或ISA
Figure A20048002465300211
通过将1份界面活性剂Montanide 80(高纯度二缩甘露醇单油酸酯，Seppie，Paris)添加到9份Drakeol 6VR轻质矿物油(Panreco，Karnes City，Pennsylvania)中来调配。在PBS中将去除gp120的HIV-1抗原稀释到200μg/ml并与相同体积的含有或不含免疫体的CFA或IFA乳化。
将保持在无病原体设施中的C57B1小鼠用100μl乳液皮内注射。每个动物接受CFA、IFA、10-100μg免疫体中或IFA加10-100μg免疫体中的1-10μg失活HIV-1抗原。两周之后，使用相同的方案在尾根处使动物皮下促升，除了将用CFA中的HIV-1抗原使动物引发改为用IFA中的HIV-1抗原促升。在免疫体的存在下用HIV-1抗原使小鼠引发并促升。可对阴性对照投予盐水或盐水中的IFA。在第28天，处死动物以用于细胞激素、趋化因子和抗体分析。
用于抗原-特异性抗体的酶联免疫吸附分析。通过在研究末期的心脏穿刺从免疫动物收集全血。在800rpm下离心SST管20分钟。将血清等分并储存于-20℃下直至检定。用稀释于PBS中的天然p24以1μg/ml涂布PVC板(多氯化联苯板，Falcon，Oxnard，California)并将板于4℃下储存隔夜。通过在每孔中添加200μl的PBS中的4％BSA来阻断板1小时。将血清以1∶100稀释于PBS中的1％BSA中，接着4倍连续稀释。一式两份添加100μl稀释的血清并在室温下培育2小时。用PBS中的0.05％吐温(Tween)20清洗板3次并将板吸干。将检测的第二抗体(例如山羊或大鼠抗小鼠IgG生物素、山羊或大鼠抗小鼠IgG1生物素或山羊或大鼠抗小鼠IgG2a生物素，例如Zymed，SanFrancisco，California)稀释于PBS中的1％BSA中。将100μl稀释的第二抗体添加到各孔中并又在室温下培育1小时。在清洗过量第二抗体之后，在每孔中添加50μl链霉素-抗生物素蛋白-生物素-HRP(Pierce，Rockford，Illinois)并培育30分钟。用PBS中的0.05％吐温20清洗板3次。添加ABTS基质(KPL，Gaithersburg，Maryland)直至出现泛蓝色-绿色。通过添加1％SDS中止反应并在405nm下读取板的吸收度。
对于每个给出的样本，报导为50％抗体滴度的抗体反应是等于50％最大结合(最高光学读数)的稀释度的倒数。吸收度值(OD@405nm)对对数分度的抗体稀释度作图，得到s形剂量响应曲线。50％最大结合通过用0.5乘以最高OD来计算。50％的值位于曲线上并且相应的x轴值被报导为抗体稀释度。
用于细胞激素和趋化因子分析的酶联免疫吸附分析检定。促升后两周，将引流淋巴结(腹股沟浅淋巴结和膕淋巴结)从免疫动物中分离。通过使用无菌70μm目筛机械分离来制备来自这些淋巴结的单细胞悬浮液。通过淘洗法将T细胞从淋巴结细胞纯化。简而言之，在室温下用20μg/ml的兔抗小鼠IgG预涂布培养皿(petri dish)(100×15mm)45分钟。用冰冷的PBS清洗培养皿2次并用冰冷的PBS中的2％人类AB血清清洗1次。将1×107个淋巴结细胞添加到预清洗的板上并在4℃下培育90分钟。接着收集非粘附细胞(富集T细胞)并将其转移到无菌50ml圆锥管中。将板清洗2次并与非粘附细胞组合。接着离心细胞并将细胞离心块以4×106个细胞/ml再悬浮于完全培养基(RPMI 1640中的5％人类AB血清，具有25mM hepes、2mM L-谷氨酰胺、100μg链霉素和5×10-6Mβ-巯基乙醇)中。
来自C57BL小鼠的γ辐射的胸腺细胞用作抗原呈现细胞。将2×105个富集T细胞和5×105个胸腺细胞添加到96孔圆底板的各孔中。HIV-1抗原和天然p24在完全培养基中稀释到10μg/ml，而con A稀释到5μg/ml。将100μl的各抗原或T细胞有丝分裂原一式三份添加。在5％CO2、37℃下培育板72小时。收集上清液并在-70℃下储存直至检定。使用对小鼠细胞激素和趋化因子特异的市售试剂盒(例如Biosource，Camarillo，California)对样本检定IL-4、IFN-γ和RANTES。
统计方法。利用曼-惠特尼(Mann-Whitney)U非参数统计比较各组。所有p值均为双尾。
完全弗氏佐剂(CFA)当前为已知用于刺激细胞介导的免疫反应的最有效佐剂。然而，由于安全问题，CFA不是用于人类的适当佐剂。因而，用于HIV免疫原性组合物中的免疫体与IFA的组合提供用于人类治疗的安全和有效疫苗。
为检验对IFN-γ的剂量相关的免疫反应，用乳化于含有不同浓度免疫体的IFA中的去除gp120的失活HIV-1抗原使C57BL小鼠免疫。
为检验是否也能促升抗体对HIV-1抗原的抗体反应，检定血清的总IgG和Th2同种型(IgG1和IgG2a)抗体对p24抗原的反应。
因而，本发明的免疫原性组合物可用于增强个体中的β-趋化因子的产生。由于β-趋化因子含量与预防HIV感染和疾病发展的强烈相关性，本发明的组合物将比其它所述的用于抑制AIDS的组合物更有效。
实例II
通过HIV免疫原性组合物引起CD4和CD8免疫反应
设计这一实例以显示在用含有HIV抗原、免疫体和佐剂的免疫原性组合物免疫之后，诱导有效的CD4辅助功能、CD8HIV-特异性Th1型免疫反应和向更高的IgG2a/IgG1抗体比率转换。通过CD8+、细胞毒素T淋巴细胞引起的抗原特异性反应是预防最初HIV感染和疾病发展中的重要因素。因而，这一实例提供本发明的免疫原性组合物为有效的预防性和治疗性疫苗的进一步证据。
HIV抗原、免疫体和IFA基本上如实例I中所述来制备。C57BL小鼠基本上如实例I中所述来免疫并在第28天处死以用于酶联免疫斑点法和p24抗体分析。p24抗体分析基本上如实例I中所述来进行。
用于来自大块的和纯化的T细胞群体的γ-干扰素的酶联免疫斑点法。通过在RPMI1640(Hyclone，Logan，Utah)中将脾切碎并挤压通过无菌细目尼龙筛从免疫小鼠的脾制备单细胞悬浮液。通过聚蔗糖梯度离心来纯化脾细胞。通过磁珠去除来分离CD4和CD8细胞。用5μg兔或大鼠抗小鼠CD4或兔或大鼠抗小鼠CD8将2×107个细胞染色。在冰上培育细胞30分钟并用冰冷的PBS中的2％人类AB血清清洗。将预清洗的涂布有山羊抗小鼠IgG的Dynabeads(DYNAL，Oslo，Norway)添加到细胞悬浮液中并在恒定搅拌下于4℃下培育20分钟。
将纯化的CD4、CD8和未去除的脾细胞以5×106个细胞/ml再悬浮于完全培养基(RPMI 1640中的5％失活人类AB血清，具有青霉素-链霉素(Pen-strep)、L-谷氨酰胺和β-ME)中并用于酶联免疫斑点检定以计数个别的分泌IFN-γ的细胞。简而言之，以每孔400ng兔抗小鼠IFN-γ(Biosource，Camarillo，California)涂布96孔硝化纤维素底微滴定板(Millipore Co.，Bedford，U.K.)。在4℃下培育隔夜之后，在室温下用无菌PBS清洗板并将板用RPMI 1640(含有青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺和β-ME)中的5％人类AB血清阻断1小时。用无菌PBS清洗板并一式三份每孔添加5×105个脾细胞(纯化的CD4、纯化的CD8或未去除的脾细胞)，并在37℃和5％CO2下培育隔夜。将细胞与培养基、OVA(鸡蛋卵清蛋白，Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)、天然p24或去除gp120的HIV-1抗原一起培养。经纯化CD4和经纯化CD8的脾细胞在含有每毫升20单位重组大鼠IL-2(Pharmingen，San Diego，CA)的完全培养基中进行检定。
清洗未结合细胞后，每孔添加400ng多克隆兔抗小鼠IFN-γ并在室温下培育2小时，接着清洗并用山羊抗兔IgG生物素(Zymed，San Francisco，California)染色。在用无菌PBS广泛清洗后，添加抗生物素蛋白碱性磷酸酶复合物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)并又在室温下培育1小时。通过添加产色碱性磷酸盐基质(Sigma，St.Louis，MO)显影斑点并使用具有高光3000光源的解剖显微镜(40倍)(Olympus，Lake Success，NY)对IFN-γ细胞计数。
统计方法。利用曼-惠特尼U非参数统计比较各组。进行斯皮尔曼(Spearman)等级相关以检验CD4与CD8γ干扰素产生之间的关系。所有p值均为双尾。
检验通过未去除的脾细胞引起的IFN-γ产生和通过纯化的CD4+或纯化的CD8+群体引起的IFN-γ产生。通过CD4+细胞引起的IFN-γ产生为特征性Th1免疫反应，而通过CD8+细胞引起的IFN-γ产生与细胞毒素T淋巴细胞(CTL)的细胞溶解活性相关。还检测对p24特异的总IgG、IgG1和IgG2b。
总之，这一实例显示含有HIV抗原、免疫体和佐剂的免疫原性组合物可用于产生有效的HIV-特异性CD4和CD8HIV-特异性免疫反应。CD4T辅助细胞的诱导对于CD8效应细胞的产生可能是关键性的。CD8T细胞可通过若干机制(包括直接细胞溶解(CTL)活性)以及通过释放抗病毒抑制因子(如β-趋化因子)及其它较不明确的因子而作为对抗HIV病毒的效应细胞。因此，本文所述的组合物优于其它用作HIV疫苗的所述组合物。
实例III
比较由不同免疫原性组合物和免疫进程引起的免疫反应
设计这一实例以显示含有免疫体的核酸当与HIV抗原和佐剂同时投予时，比当用于在投予HIV抗原和佐剂之前一周使哺乳动物引发时更有效地引起保护性免疫反应，包括RANTES产生和HIV-特异性IgG2b抗体产生。这一实例也显示含有HIV抗原、免疫体和佐剂的组合物比仅含有HIV和IFA的组合物更有效地促进抗原依赖性淋巴细胞增殖。
HIV抗原、免疫体和IFA基本上如实例I中所述来制备。使C57bBL小鼠(每组至少3只)在第7天免疫并如指示在第0天用表1中所示的以下组合物来引发小鼠。
表1
组    第0天    第7天
A     免疫体   HIV-1
B              HIV-1
C    免疫体    HIV-1/IFA
D              HIV-1/IFA
E              HIV-1/IFA/免疫体
在第21天处死动物并基本上如实例I所述用于细胞激素、趋化因子和抗体分析，以及用于淋巴细胞增殖的分析。
淋巴细胞增殖分析。由免疫动物的引流淋巴结制备单细胞悬浮液。通过淘洗法从淋巴结细胞中去除B细胞。简而言之，用抗小鼠IgG预涂布的培养皿培育淋巴结细胞90分钟。收集非粘附细胞(富集T细胞)并将其以4×106个细胞/ml再悬浮于完全组织培养基中。用p24或HIV-1抗原在γ-辐射的胸腺细胞存在下于37℃、5％CO2下培养富集T细胞40-48小时。用氚化胸腺嘧啶脉冲样本并又培育16小时。收集细胞并使用β-闪烁计数器对并入的氚化胸腺嘧啶计数。
使用所属领域中熟知的方法测定T细胞中细胞激素的产生，例如IFN-γ和β-趋化因子(如RANTES、MIP-1β和MIP-1α)。也检验对p24特异的总IgG、IgG1和IgG2b的血清含量。另外，检验对p24抗原和去除pg120的HIV的T细胞增殖反应。
因而，本发明的免疫原性组合物可有效地引起HIV-特异性Th1细胞激素(IFN-γ)和体液反应(IgG2抗体)，并可增强非特异性和HIV-特异性β-趋化因子产生。对免疫原性组合物的这些反应与强烈的HIV-特异性T淋巴细胞增殖反应相关。
实例IV
用HIV免疫原性组合物免疫灵长类动物
设计这一实例以显示含有HIV抗原、免疫体和佐剂的免疫原性组合物可有效增强灵长类动物中的HIV-特异性免疫反应。
将含有IFA中的去除gp120的HIV-1(100μg总蛋白，等于10个p24单位)与500μg免疫体的免疫原性组合物子宫内注入3只狒狒胎儿中。四周后，使用相同方案促升胎儿。
收集新生狒狒的周围血液单核细胞并检定对p24和HIV-1抗原的增殖反应。
也在相同的狒狒中测量HIV-特异性抗体、细胞激素和β-趋化因子的产生。这些结果显示在灵长类动物中也引起由以上实例I-III中所述的免疫原性组合物对于啮齿动物引起的免疫反应类型。
这些结果证明本发明的HIV免疫原性组合物和方法有效地在灵长类动物中刺激HIV-特异性免疫反应。此外，这些结果证明胎儿和婴儿能够引起对本发明的免疫原性组合物的强烈HIV免疫反应，指示这些组合物将适用于预防HIV的母体传播并用作儿科疫苗。
实例V
小鼠模型中对去除gp120的失活HIV免疫原与免疫体的组合的疫苗接种的免疫反 应
这一实例描述对免疫体在小鼠模型中增强HIV-1抗原和HIV-1免疫原(抗原在IFA中乳化)的免疫原性性的能力进行表征。
如下所指示对C57BL/6小鼠(6-8周年龄)进行注射。每组的数目一般是至少8-10只小鼠。
1)PBS
2)每只小鼠30μg免疫体＝1.5mg/kg
3)免疫体(最高剂量90μg)＝4.5mg/kg
4)HIV-1免疫原(10μg)
5)HIV-1免疫原+免疫体(10μg、30μg、90μg)
6)HIV-1免疫原+免疫体30μg
将去除gp120的HIV-1抗原于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至200μg/ml的浓度并乳化于相同体积的含有或不含免疫体的IFA中。在乳化之前，以最终体积的至少5％的体积将免疫体添加到稀释的HIV-1抗原中。
在第0时进行最初单次皮内注射，接着在2周后皮内注射。在促升注射后的第2周处死小鼠。所使用的HIV-1免疫原为IFA中的去除gp120的失活HIV-1抗原。
免疫学分析。分离新鲜的脾单核细胞并活体外刺激4天(Davis等人J.Immunol160：870-876(1998))。所分离的细胞在单独培养基中用天然p24抗原或用HIV-1抗原刺激。
使用酶联免疫吸附分析方法评估多种细胞激素的产生。待检定的示范性细胞激素包括例如本文中所揭示和先前所述的IFNγ、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10、MIP1α、MEP1β、RANTES、α-防御素并通过所属领域的技术人员熟知的方法来检定。
如实例I和II中所述，在酶联免疫斑点检定中评估CD4和CD8淋巴细胞中P24抗原-特异性和HIV-1抗原-特异性IFNγ产生。
使用熟知方法在标准增殖检定中评估P24抗原-特异性、HIV-1抗原-特异性和LPS-特异性淋巴细胞的增殖。
实例VI
免疫体对由PBMC产生的HIV特异性免疫反应的活体外效应，所述PBMC来自先 前用HIV-1免疫原免疫的HIV感染患者
这一实例描述对免疫体增加患者的周围血液单核细胞(PBMC)中活体外HIV-特异性免疫反应的能力进行评估，所述患者已经用IFA中的去除gp120的失活HIV-1抗原(REMUNE)治疗。
检验下列各组的患者：15个被HIV感染、经HAART+REMUNE治疗的患者；15个被HIV感染、经HAART治疗的患者。所述患者在疾病持续时间、CD4计数、HIV病毒血症和缺少/存在蛋白酶抑制剂(PI)方面相匹配。通过静脉穿刺将全血(530ml)抽取入含有EDTA的管中用于随后的分析。按以下浓度将免疫体添加到PBMC中：0.1μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml。
测量对多种抗原特异的反应，例如HIV抗原、p24抗原、HIV-1抗原、env肽、gag肽；和flu(对照抗原)。需要时，也可测量其它HIV抗原。如实例I和II中所述，在酶联免疫斑点检定中评估CD4和CD8淋巴细胞中抗原特异性IFNγ产生。也在标准增殖检定中评估抗原特异性淋巴细胞的增殖。
通过在CD8+中细胞内染色，用荧光活性细胞分类(FACS)方法评估RANTES、α防御素的产生。需要时，可检定其它细胞激素或其它细胞类型。
实例VII
三嵌合体鼠模型中免疫体对HIV特异性免疫反应的活体内效应
这一实例描述使用三嵌合体小鼠模型测定含有免疫体的HIV免疫原性组合物的效应。
将三嵌合体小鼠模型用于测试当与HIV抗原组合时免疫体的效应。可监测所诱导的免疫反应以及保护免疫性。如先前所述产生三嵌合体小鼠(Reisner和Dagan，Trends Biotechnol.16：242-246(1998)；Ilan等人，Curr.Opin.Mol.Ther.4：102-109(2002)；美国专利第6,254,867号；WO 97/47654)。简而言之，通过致死的分剂量全身辐射使正常小鼠宿主无免疫力。接着通过去除T细胞的鼠SCID骨髓辐射保护小鼠并通过腹膜内注射人类周围血液单核白细胞(PBMC)将小鼠转化为三嵌合体小鼠。通过荧光活性细胞分类(FACS)分析人类T细胞标记(如CD3或其它)来验证人类细胞移植入三嵌合体小鼠。
用HIV感染三嵌合体小鼠以作为AIDS模型。简而言之，用一个或一个以上的HIV-1病毒株感染三嵌合体小鼠。对照动物为仅注射培养基(无HIV-1)的三嵌合体小鼠和未注射PBMC的小鼠。在不同时间点通过测定共培养实验中的血浆HIV-1 RNA含量、前病毒DNA的存在和活性病毒来评估小鼠的HIV-1感染。通过对HIV-1序列(如gag)进行PCR来证明前病毒HIV-1DNA的存在。
为测试含有免疫体的免疫原性组合物对免疫反应的刺激，连同或不连同至少一种免疫体且连同或不连同佐剂，用去除gp120的HIV-1注射三嵌合体小鼠。可使用抗原与免疫体的多种比率，例如实例V中所述，并测试最优化的免疫反应。或者，将组合物脉冲入人类自体单核细胞衍生的树突状细胞(DC)中并将这些DC注射入三嵌合体小鼠中。小鼠视情况可用类似的组合物促升。
在免疫之后，收集血液和腹膜淋巴细胞。测定对HIV抗原特异的免疫球蛋白的存在。另外，在从小鼠分离的人类淋巴细胞中测定特异性细胞抗HIV反应。例如，在暴露于HIV-1抗原之后，测定从三嵌合体小鼠中回收的人类淋巴细胞中IFNγ的产生。测定在免疫体存在下，增强的对HIV抗原的免疫原性反应。
以类似的方式监测保护免疫性，除了在用感染性HIV接种之前用不同组合物使小鼠免疫。如上所述，测量不同组合物影响随后病毒血症的水平的能力。最有效的疫苗为提供对循环病毒的最有效控制和/或延长存活时间的疫苗。
实例VIII
用REMUNE TM 使HIV感染患者免疫
这一实例描述用REMUNE(IFA中的去除GP120的HIV-1抗原)使HIV感染患者免疫并证明大多数患者可发动免疫反应，尽管强度和持续时间不同。这一特定研究的目标是在用与高活性逆转录酶病毒疗法(HAART)(英地那韦(indinavir)/ZDV/3TC)组合的REMUNE治疗之后，与不完全弗氏佐剂(IFA)加上HAART相比来评估HIV-1特异性免疫反应。
研究计划为随机、双盲、双臂、平行组、佐剂对照、多中心研究。受试者的数目(总数和用于各治疗的数目)是随机的52个患者，其中43个可评估的患者进行意向性治疗分析(22个REMUNE+HAART；21个IFA+HAART)。包括HIV-1感染患者的诊断和标准是先前未使用HIV蛋白酶抑制剂或拉米夫定(lamivudine，3TC)的HIV-1感染患者CD4计数大于每微升350个细胞。测试产品、剂量和投予模式为REMUNE(HIV-1免疫原)；10单位(等于10μg/ml的p24含量)，1.0ml EV1的给予体积(批号8155-015和8155-017)。关于治疗的持续时间，患者接受HAART持续2周。REMUNE或IFA安慰剂(对照)在第4、16和28周给予。参照疗法、剂量和投予模式为佐剂对照；使用IFA安慰剂(批号：8144-和8160-005)。
第一功效标准是对周围血液单核细胞(PBMC)中HIV-1抗原刺激的淋巴细胞增殖(LP)反应。第二功效标准包括对PBMC中天然p24和BaL HIV-1抗原刺激的LP反应；对PBMC中天然p24和HIV抗原刺激的趋化因子反应；gag CTL活性(患者亚组中)；CD4细胞数和CD4百分数的改变；作为血浆RNA和PBMC DNA测量的病毒负荷的改变；和对HIV-1和p24抗原的DTH皮肤测试反应。所使用的统计方法为意向性治疗分析中的费氏确切检验(Fisher′s Exact Test)(双尾)和双侧曼-惠特尼检验(two-sidedMann-Whitney test)。
第一分析将反应率定义为在两个时间点，对基线上5倍的HIV-1抗原的刺激指数(SI)。结果显示，REMUNE+HAART组中有14/22(64％)个反应者并且IFA+HAART组中有4/21(19％)个反应者(p＝0.005)。第二分析将反应率定义为在两个时间点，对基线上3倍的BAL型HIV-1抗原和/或p24抗原的SI。结果显示，REMUNE+HAART组中有15/22(68％)个反应者并且IFA+HAART组中有5/21(24％)个反应者(p＝0.006)。在接受REMUNE+HAART的受试者中，对HIV-1(HZ321)抗原的LP反应的量值大于接受IFA+HAART的受试者(p＝0.0028)，所述量值定义为每一受试者第一次注射后所测量的几何平均数SI与预治疗值的几何平均数的比率。
与IFA+HAART组相比，REMUNE+HAART组中对天然p24(p＝0.0002)和对HIV-1BaL抗原(p＝0.007)的LP反应率在统计上显著更大。在两组之间，对唤起抗原(假丝酵母，链激酶，破伤风)的LP反应无差异。与IFA+HAART组相比，REMUNE+HAART组中通过HIV-1抗原刺激的PBMC引起的MIP-1β产生显著增加(第32周p+0.0007)。与IFA+HAART组相比，REMUNE+HAART组中对于HIV-1(53％对9％)和天然p24抗原(47％对0％)的DTH皮肤测试反应率更大。
根据反应者数目和反应的量值，投予REMUNE加ZDV/3TC/英地那韦导致显著刺激对HIV-1抗原的淋巴细胞增殖(LP)反应。对于定义为在两个时间点，对基线上5倍的HIV-1抗原的刺激指数的反应率，REMUNE加ZDV/3TC/英地那韦组(14/22，64％)中比IFA加ZDV/3TC/英地那韦组(4/21，19％)中的反应者数目显著更高(p＝0.005)。
高百分数的接受REMUNE的受试者产生对天然p24抗原的强烈LP反应，证明REMUNE可对更保守的HIV核心抗原特异性地产生反应。IFA治疗不刺激对任何抗原的HIV-1特异性免疫反应。REMUNE加ZDV/3TC/英地那韦产生对纯化的天然p24的显著更高的淋巴细胞增殖反应率(p＝0.0002)。
投予REMUNE刺激对HIV-1(HZ321)免疫抗原以及对HIV-1抗原(即分化枝B，HIV-1BaL抗原)的LP反应，证明由REMUNE产生的免疫反应是交叉分化枝且并不限于免疫剂。与IFA加ZDV/3TC/英地那韦相比，REMUNE加ZDV/3TC/英地那韦产生显著更高的对HIV-1BaL抗原的淋巴细胞增殖反应率(p＝0.007)。
在整个研究中REMUNE加ZDV/3TC/英地那韦组中抗原刺激的MIP-1β的产生显著增加(第32周p＝0.0007)，且在研究期间IFA加ZDV/3TC/英地那韦组中不改变。两组的受试者均显示CD4细胞数的显著增加和血浆HIV RNA和前病毒HIV DNA拷贝数目的显著降低。在时间对HIV RNA复发的分析中，REMUNE加ZDV/3TC/英地那韦组存在较低的复发风险倾向；6/22(27％)的REMUNE加ZDV/3TC/英地那韦受试者在第16周与第32周之间复发，与之相对，12/21(57％)的IFA加ZDV/3TC/英地那韦受试者在第16周与第32周之间复发(对数级检验p＝0.08)。通过投予包括HIV抗原(如REMUNE)和一种或一种以上免疫体的本发明的免疫原性组合物，预期达到更强烈、更持久的反应。
这些结果证明REMUNE刺激大多数患者中的免疫反应。
实例IX
用REMUNE TM 和免疫体使HIV感染患者免疫
这个实例描述用REMUNE和免疫体使HIV感染患者免疫。
进行研究的目的是：评估与不完全弗氏佐剂(IFA)加免疫体和/或HAART相比，在用与免疫体和/或高活性逆转录酶病毒疗法(HAART)(英地那韦/ZDV/3TC)组合的REMUNE治疗之后的HIV-1特异性免疫反应。
方法学使用随机、双盲、双臂、平行组、佐剂对照研究。包括HIV-1感染患者的诊断和标准是先前未使用HIV蛋白酶抑制剂或拉米夫定(3TC)的患者CD4计数大于每微升350个细胞。也可使用选择患者的其它标准。测试产品、剂量和投予模式为REMUNE(HIV-1免疫原)；10单位(等于10μg/ml的p24含量)，1.0ml IM的给予体积。投予约1到5mg/kg之间的免疫体剂量。也可测试其它更高或更低的免疫体剂量对免疫反应的有效增强。关于用HAART治疗的患者的治疗持续时间，患者接受HAART持续32周。REMUNE或IFA安慰剂(对照)和免疫体在第4、16和28周给予。参照疗法、剂量和投予模式为佐剂对照，其中使用IFA安慰剂。
用于评估功效和安全性的标准与实例VIII中描述的相似。另外，可包括用于测定免疫反应的检定，例如本文所揭示和实例I-III和V中所述的干扰素酶联免疫斑点法、IgG1/IgG2抗体比率、细胞激素产生的酶联免疫吸附分析检定、淋巴细胞增殖检定、脾细胞刺激及其类似检定。
预期与不含免疫体的HIV抗原相比，免疫体与REMUNE或其它HIV抗原的组合增强免疫反应。因而，预期本实例中的免疫反应比实例VIII中观察到的免疫反应更强烈和/或持续时间更长。
这一实例描述投予HIV抗原和免疫体在刺激HIV感染患者的免疫反应中的效应得到增强。
实例X
具有免疫体的HIV-1抗原引起HIV-特异性免疫性
这一实例描述使用HIV抗原和免疫体刺激HIV-特异性免疫性。
HIV-1免疫原为用不完全弗氏佐剂(IFA)调配的去除gp120的全灭活病毒疫苗候选物，据先前报告其诱导HIV-1特异性免疫反应；含有免疫刺激胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸基序的合成寡核苷酸为细胞介导的免疫反应的有效刺激物。在小鼠模型中研究产生与免疫体佐剂(AmplivaxTM)组合的HIV-1免疫原的增强免疫原性性的可能性。在随后的实验中验证HIV-特异性免疫反应可由不含IFA的去除gp120的全灭活病毒(HIV-1抗原)加AmplivaxTM来引起。
在这些研究中，所使用的HIV-1免疫原为用不完全弗氏佐剂(IFA)调配的去除gp120的全灭活病毒疫苗。所述实验基本上如实例V中所述来进行。这个免疫原诱导HIV-特异性免疫反应。AmplivaxTM为免疫调节寡核苷酸，在本文中也称为免疫体，其含有新颖结构和合成的免疫调节基序。这个免疫体诱导不同的免疫刺激概况。
图2显示AmplivaxTM免疫体(也称为HYB2055)的示意图。HYB2055为第二代免疫调节寡核苷酸(IMO)，其是由新颖结构和合成的CpR免疫刺激基序组成。这个免疫体通过经由TLR9发送信号来刺激免疫系统并诱导Th1免疫反应。免疫体显示增强的代谢稳定性。已完成健康志愿者的I期试验。
启动这些小鼠研究以评估小鼠模型中AmplivaxTM(HYB2055)增强IFA中的HIV-1全灭活疫苗(HIV-1免疫原)的免疫原性性的能力。这些研究也检验HIV-特异性免疫反应是否可通过与AmplivaxTM组合使用的不含IFA的全灭活病毒(HIV-1抗原)来引起。
简而言之，用不完全弗氏佐剂(IFA)中的10μg HIV全灭活疫苗(HIV-1免疫原)加上3个剂量的AmplivaxTM(每只小鼠90、30或10μg)或用HIV全灭活疫苗(不含IFA的HIV-1免疫原，每只小鼠10μg)和AmplivaxTM(每只小鼠90μg)使C57/BL6小鼠皮下(SC)或肌内(IM)免疫(第0天和第14天)。经HIV-1免疫原、经单独的AmplivaxTM或经PBS免疫的动物用作对照(每组8-10只)。小鼠免疫体HYB 2048用作参照化合物。在第28天处死小鼠。在新鲜的脾单核细胞中评估HIV-1抗原刺激的和p24刺激的细胞激素的产生和分泌IFNγ的T细胞。在血清中评估p24抗体的产生。
如图3所示，HIV-1免疫原诱导HIV-特异性RANTES、MIP1α、MIP1β、IL-10和IL-5产生。表2显示HIV-1免疫原与AmplivaxTM的组合将细胞激素廓型转换为Th1型反应。SC投予免疫原。所显示的值为平均值。
表2
IFN-γpg/ml   RANTESpg/ml  MIP-1αpg/ml  MIP-1βpg/ml   IL-10pg/ml   IL-5pg/ml   细胞激素廓型
单独的HIV-1免疫原 12   101  28  317   67   644   Th2
HIV-1免疫原加Amplivax 1783   700  83  438   257   6   Th1
单独的Amplivax 0.06   107  27  91   3   -   -
类似的分析在表3中显示，其也显示IFN-γ对IL-5的比率。用HIV-1抗原进行刺激。IFN-γ和IL-5由酶联免疫吸附分析测量。
表3
Figure A20048002465300321
图4显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性IFN-γ产生。所使用的免疫体的量在括号中显示(μg/小鼠)。对于RANTES、MIP1α、MIP1β和IL-10可见到相似结果。图5显示AmplivaxTM对HIV-1免疫原诱导的RANTES、MIP1α、MIP1β、IL-10和IL-5的产生水平的效应。图6显示通过AmplivaxTM增强HIV-特异性IFN-γ产生(所示资料是关于每只小鼠90μg AmplivaxTM)。对于RANTES、MIP1α、MIP1β和IL-10可发现相似的结果。如图7中所示，在酶联免疫斑点检定中，AmplivaxTM对分泌HIV-特异性IFN-γ的T细胞具有增强效应。皮下投予免疫原。所使用的免疫体的量在括号中显示(μg/小鼠)。
图8显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性IFNγ产生。所使用的免疫体的量在括号中显示(μg/小鼠)。图9显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性RANTES产生。图10显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性MIP-1α产生。所使用的免疫体的量在括号中显示(μg/小鼠)。图11显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性MIP-1β产生。所使用的免疫体的量在括号中显示(μg/小鼠)。图12显示通过AmplivaxTM以剂量依赖性方式增强HIV-特异性IL-10产生。所使用的免疫体的量在括号中显示(μg/小鼠)。图13显示通过皮下给予的AmplivaxTM减少HIV-特异性IL-5产生。所使用的免疫体的量在括号中显示(μg/小鼠)。
图14显示小鼠中AmplivaxTM对HIV-1免疫原诱导的p24抗体滴度的效应。所使用的免疫体的量在括号中显示(μg/小鼠)。图15显示IFA中的HIV-1全灭活疫苗(HIV-1免疫原)一经皮下(SC)和肌内(IM)投予即诱导HIV-特异性细胞激素产生。
图16显示AmplivaxTM可在与IFA乳化之前或之后添加并增强IFNγ的产生。图17显示AmplivaxTM可在与IFA乳化之前或之后添加并增强RANTES的产生。如表4中所示，HIV-1免疫原与AmplivaxTM的组合将细胞激素廓型转换为Th1型反应。
表4
Figure A20048002465300331
图18显示在没有IFA的情况下具有AmplivaxTM的HIV-1全灭活疫苗在皮下免疫的小鼠中触发HIV-特异性IFNγ产生。图19显示在没有IFA的情况下具有AmplivaxTM的HIV-1全灭活疫苗在皮下免疫的小鼠中触发分泌HIV-特异性IFNγ的CD8+T细胞活性。图20显示在没有IFA的情况下具有AmplivaxTM的HIV-1全灭活疫苗在皮下免疫的小鼠中触发HIV-特异性RANTES产生。
当与单独的HIV-1免疫原或AmplivaxTM相比时，用HIV-1免疫原与AmplivaxTM的组合皮下免疫的C57/BL6小鼠显示显著增强的p24抗体、HIV-特异性IFNγ(产生其的CD4和CD8T细胞的数量和数目)、趋化因子(RANTES、MIP-1α、MIP-1β)和IL-10的HIV-特异性产生。重要的是，如果HIV-1抗原未与IFA乳化，则仍观察到由AmplivaxTM引起的增强。
与单独的HIV-1免疫原或Amplivax相比，用AmplivaxTM+HIV-1免疫原的组合和AmplivaxTM+HIV-1抗原的组合进行免疫均可显著增强HIV-特异性和p24-特异性IFNγ、RANTES、MIP1α、MIP1β和IL-10产生以及产生IFNγ的细胞的数目。在用HIV-1免疫原或用与Amplivax组合的HIV-1抗原免疫的小鼠中所观察到的免疫反应的量值是相当的。
这些结果显示与单独的HIV-1免疫原或AmplivaxTM相比，用HIV-1免疫原加AmplivaxTM免疫显著增强HIV-特异性IFNγ、RANTES、MIP-1α、MIP-1β和IL-10产生以及产生IFNγ的细胞的数目。在用HIV-1抗原和AmplivaxTM(无IFA)免疫的小鼠中所观察到的免疫反应的量值与用HIV-1免疫原(HIV-1抗原加IFA)和AmplivaxTM所获得的反应的量值相当。与使用IFA无关，与全灭活病毒疫苗联合的AmplivaxTM引起强烈的HIV-特异性免疫反应。
与使用IFA无关，与HIV-1免疫原或HIV-1抗原联合的Amplivax引起强烈的病毒特异性免疫反应。HIV-1+Amplivax组合的强烈免疫原性性保证其用作HIV感染患者的治疗疫苗。
实例XI
人类周围血液单核细胞中与免疫体组合的HIV免疫原对活体外HIV-特异性免疫反 应的效应
这一实例描述人类周围血液单核细胞(PBMC)中AmplivaxTM对活体外HIV-特异性免疫反应的效应。
启动这些研究以评估如果AmplivaxTM可增加用抗逆转录酶病毒治疗的HIV感染患者的人类PBMC的活体外HIV-特异性免疫反应，则哪位患者被HIV-1全灭活疫苗免疫或不被免疫。
活体外调查AmplivaxTM增强对分离自用抗逆转录酶病毒疗法(ART)治疗的HIV+患者的PBMC的HIV抗原刺激的能力。患者未经免疫或先前用HIV-1免疫原免疫。两组患者组均具有相当的CD4计数、HIV血浆病毒血症、感染持续时间和ART。通过对IFNγ酶联免疫斑点检定中产生的总斑点和更高百分数的产生α防御素的细胞的测量，结果显示AmplivaxTM在用HIV-1免疫原接种的患者中诱导更强烈的HIV-特异性的细胞介导的免疫反应。使用1μg/ml的AmplivaxTM的两种效应均为最明显。
简而言之，患者已用6-24剂量的HIV全灭活疫苗(
Figure A20048002465300341
免疫原)接种。最后一剂在收集血液前6-8个月给予。未接种的患者在CD4、HIV病毒血症和HAART暴露方面相匹配。以4个浓度(0、0.1、1.0和10μg/ml)将AmplivaxTM添加到PBMC中。用HIV-1、np24、gag和flu抗原刺激细胞。通过酶联免疫斑点法进行CD8+、产生IFNγ的细胞的评估。通过荧光活性细胞分类(FACS)方法分析产生α-防御素的细胞。
图21显示通过活体外添加的AmplivaxTM来增加产生α-防御素的CD8+T细胞的百分数。图22显示治疗患者和HIV阳性对照(无AmplivaxTM)中产生HIV-特异性IFNγ的CD8+T细胞。图23显示在活体外添加的0.1μg/ml AmplivaxTM存在下产生HIV-特异性IFNγ的CD8+T细胞。图24显示在活体外添加的1μg/ml AmplivaxTM存在下产生HIV-特异性IFNγ的CD8+T细胞。图25显示在活体外添加的10μg/mlAmplivaxTM存在下产生HIV-特异性IFNγ的CD8+T细胞。
图26显示周围血液单核细胞(PBMC)中的IFN-γ酶联免疫斑点检定。使用1μg/ml的HYB2055。
在未接受HAART的患者中已产生(HIV-1免疫原加IFA)的初步资料。当试验完成时，其将监测50个HIV-1RNA在每毫升10,000-40,000个拷贝的范围内和CD4细胞在每微升350个细胞以上的HIV-1阳性受试者。患者随机分为3组：(IFA中的HIV-1免疫原)；IFA佐剂；或盐水。
在未接受抗逆转录酶病毒疗法(ART)的患者中，第一次注射
Figure A20048002465300354
之后观察到CD4T细胞(图27)和CD8T细胞(图28)的表型改变。显示首先的少数患者的初步资料。额外患者将类似地加以分析。
正进行临床试验的未接受药物的HIV+患者的初步资料表明，HIV-1免疫原也具有在这个患者群体中产生HIV-特异性免疫反应的阳性效应。通过将AmplivaxTM添加到HIV-1免疫原中以作为疫苗的一部分，AmplivaxTM的潜在增强效应将在这些相同患者中翻转试验(roll-over trial)来检验。
在整个本申请案中，已参考多个公开案。这些公开案的整体揭示内容以引用的方式并入本申请案中，以便更充分地描述本发明所属的技术状态。
尽管已根据所揭示的实施例描述本发明，但所属领域的技术人员应轻易了解所详述的特定实验仅为说明本发明之用。应了解可在不脱离本发明的精神的情况下进行多种修改。

Claims (34)

1.一种免疫原性组合物，其包含：
(a)缺少外部包膜蛋白gp120的全灭活HIV病毒；
(b)免疫体；和
(c)佐剂。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述HIV病毒为HIV-1。
3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述HIV病毒为HZ321病毒株。
4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述经分离的核酸分子包含硫代磷酸酯主链。
5.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述HIV病毒与所述核酸分子共轭。
6.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述免疫体为CpG免疫体。
7.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述免疫体为无CpG免疫体。
8.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂适用于人类。
9.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)。
10.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含分枝杆菌细胞壁组份和单磷酰基脂质A。
11.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含明矾。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物增强β-趋化因子的产生。
13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其中所述增强的β-趋化因子的产生为非特异性β-趋化因子产生。
14.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其中所述增强的β-趋化因子的产生为HIV-特异性β-趋化因子产生。
15.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述β-趋化因子为RANTES。
16.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述组合物增强哺乳动物中的HIV-特异性IgG2b抗体的产生。
17.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述组合物增强哺乳动物中的HIV-特异性细胞毒素T淋巴细胞(CTL)反应。
18.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述组合物增强HIV-特异性CD4+辅助T细胞。
19.一种试剂盒，其包含：
(a)缺少外部包膜蛋白gp120的全灭活HIV病毒；
(b)免疫体；和
(c)佐剂，
所述试剂盒组份当组合时产生根据权利要求1所述的免疫原性组合物。
20.一种制成根据权利要求1所述的免疫原性组合物的方法，其包含将以下物质组合：
(a)缺少外部包膜蛋白gp120的全灭活HIV病毒；
(b)免疫体；和
(c)佐剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述组合在活体外进行。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述组合在活体内进行。
23.一种使哺乳动物免疫的方法，其包含通过投予所述哺乳动物根据权利要求1所述的免疫原性组合物来增强所述哺乳动物中的免疫反应。
24.一种抑制AIDS的方法，其包含通过投予哺乳动物根据权利要求1所述的免疫原性组合物来增强所述哺乳动物中的免疫反应。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物为灵长类动物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述灵长类动物处于婴幼儿期。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述灵长类动物处于孕期。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述灵长类动物为人。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述人为HIV血清反应阴性。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述人为HIV血清反应阳性。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述哺乳动物为啮齿动物。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中将所述组合物投予所述哺乳动物两次或两次以上。
33.根据权利要求23或24所述的方法，其中将所述组合物投予所述哺乳动物两次或两次以上。
34.根据权利要求23或24所述的方法，其中将所述组合物皮下、肌内或粘膜内投予。
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