MXPA06001996A

MXPA06001996A - Composiciones de hiv inmunogeneticas y metodos relacionados.

Info

Publication number: MXPA06001996A
Application number: MXPA06001996A
Authority: MX
Inventors: Ronald B Moss
Original assignee: Immune Response Corp Inc
Priority date: 2003-08-28
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2006-06-20
Also published as: AP2006003530A0; OA13246A; BRPI0413906A; US20070253979A1; CN101291691A; CR8251A; IL173740A0; ZA200602246B; WO2005021726A3; WO2005021726A2; AU2004269379A1; EP1670893A4; AU2004269379A2; CA2535527A1; JP2007523884A; EP1670893A2; US20050196411A1

Abstract

La invencion proporciona composiciones inmunogenicas que mejoran la duracion y resistencia de la respuesta inmune en un mamifero. Las composiciones inmunogenicas contienen un antigeno HIV, un inmunomero y un adyuvante. El antigeno HIV puede ser un virus HIV exterminado completo exento de proteina envolvente externa gp120. Alternativamente, el antigeno HIV puede ser un virus HIV exterminado completo. O un antigeno p24. Tambien se proporcionan equipos, los componentes de los cuales, cuando se combinan, producen las composiciones inmunogenicas de la invencion. La invencion tambien proporciona metodos para hacer las composiciones inmunogenicas, combinando un antigeno HIV, un inmunomero y opcionalmente un adyuvante. La invencion proporciona ademas un metodo para inmunizar a un mamifero, mejorando una respuesta inmune en el mamifero administrando al mamifero una composicion inmunogenica que contiene un antigeno HIV, un inmunomero y opcionalmente un adyuvante. Tambien se proporciona un metodo para inhibir en un mamifero administrando al mamifero una composicion inmunogenica que contiene un antigeno HIV, un inmunomero y opcionalmente un adyuvante.

Description

COMPOSICIONES DE HIV INMUNOGENICAS Y MÉTODOS RELACIONADOS INFORMACIÓN DE ANTECEDENTES . Esta invención, se relaciona con Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirido (SIDA) y, más específicamente, con composiciones inmunogénicas para uso al prevenir y tratar SIDA. Más de 30 millones de gente en todo el mundo están ahora infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , el ' virus responsable del SIDA. Aproximadamente 90% de los individuos infectados con HIV viven en países en desarrollo, incluyendo África de sub-Sahara y partes del Sudeste de Asia, aun cuando el HIV epidémico se está dispersando rápidamente en todo el mundo. • las drogas terapéuticas antivirales que reducen la carga viral y hacen lenta la progresión a SIDA se han hecho disponibles recientemente. Sin embargo, estas drogas son prohibitivamente costosas para uso en naciones en desarrollo. De esta manera permanece una necesidad urgente de desarrollar vacunas preventivas y terapéuticas efectivas para reducir el SIDA epidémico global. A la fecha, el HIV ha probado ser un blanco difícil para desarrollo de vacuna efectiva. Debido a la propensión de HIV de- mutar rápidamente, existen ahora numerosas cepas que predominan en diferentes partes del mundo cuyos epítopes difieren. Adicionalmente, en un individuo infectado particular, un virus de HIV puede escapar del control del sistema inmune del huésped desarrollando mutaciones en un epítope. Permanece una necesidad de desarrollar vacunas de HIV mejoradas que estimulen el sistema inmune para reconocer un espectro amplio de epítopes conservados, incluyendo epitopes de antigeno de núcleo p24. Durante los años de 1990, más de 30 diferentes vacunas de HIV-1 candidatas entraron en pruebas clinicas humanas . Estas vacunas producen varias respuestas inmunes humorales y celulares, que difieren en tipo y resistencia dependiendo de los componentes de vacuna particular. Permanece la necesidad de desarrollar composiciones de vacuna de HIV que produzca fuertemente las respuestas inmunes particulares correlacionadas con protección contra infección de HIV. La naturaleza de respuestas inmunes de HIV protectoras se ha dirigido a través de estudios de individuos que han permanecido sin infectar a pesar de exposición repetida a HIV, o que han sido infectados con HIV durante muchos años sin desarrollar el SIDA. Estos estudios han mostrado que las células de ayuda CD4+ T se correlacionan bien con la protección contra infección de HIV y la progresión de enfermedad subsecuente. Además de las respuestas de célula de ayuda T CDr4+ especificas de antigeno, las respuestas de célula CD8+ citotóxica se consideran importantes al prevenir la infección de HIV inicial y la progresión de enfermedad. Durante una respuesta inmune anti-viral efectiva, las células CD8+ T activadas exterminan directamente las células infectadas con virus y secretan citoquinas con actividad antiviral. El sistema de ^quimioquina también parece ser importante en la protección contra infección inicial de HIV y progresión de enfermedad, La infección de células inmunes por los aislados más primarios de HIV requiere la interacción del virus con CCR5, cuyo papel biológico normal es como el receptor principal de los RANTES de ß -quimioquinas, MIP-?a y ?? -ß. Los polimorfismos genéticos resultando en expresión disminuida del receptor de CCR5 se han mostrado que- proporcionan resistencia a la infección de HIV. Adicionalmente, una correlación significativa entre niveles de ?-quimioquina y resistencia a infección de HIV, tanto en individuos expuestos como en células cultivadas, se ha demostrado . Se ha sugerido que las ^-quimioquinas pueden bloquear la capacidad de infección de HIV mediante varios mecanismos, incluyendo competir con o interferir con HIV que se liga a CCR5, y regular descendentemente la superficie de CCR5. Debido a la importancia de las ?-quimioquinas al prevenir infección de HIV inicial y progresión de enfermedad. Una composición inmunogénica de HIV efectiva debe inducir niveles elevados de producción de ß -quimioquina, tanto antes de la invención como en respuesta a virus infeccioso. Las composiciones inmunogénicas de HIV capaces de inducir producción de /J-quimioquina se han descritos. Sin embargo, no se han descrito las composiciones inmunogénicas que estimulan niveles elevados de producción de la /^-quimioquina, inducen respuesta inmune celular y humoral Thl específica de HIV fuerte, duradera con actividad citotóxica específica de HIV. Las composiciones que producen ciertos tipos de respuestas inmunes específicas de HIV pueden no producir otras respuestas protectoras importantes. Por ejemplo, Deml y col., clin. Chem. Lab. Med. 37:199-204 (1999), describe una vacuna que contiene un antígeno envolvente de HÍV-1 gpl60, una secuencia de ADN inmuno estimulante y adyuvante de alumbre, que, a pesar de inducir una respuesta de citoquina tipo Thl específica de antígeno, fue incapaz de inducir una respuesta especifica de antígeno citotóxica de T linfocito. Además, una vacuna que contiene antígenos envolventes no se esperaría que induzca una respuesta inmune contra proteínas de núcleo mas altamente conservadas de HIV. De esta manera, existe la necesidad de composiciones inmunogénicas y métodos que ayudarán a prevenir infección de HIV o cuando menos harán lenta la progresión a SIDA en individuos infectados . la presente invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas también. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona composiciones inmunogénicas que se pueden utilizar para mejorar la potencia de respuestas inmunes en un mamífero. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden mejorar la anchura, tipo, resistencia y duración de las respuestas inmunes inducidas . Las composiciones inmunogénicas contienen un antigeno HIV optimizado, una molécula de ácido nucleico aislada que contiene un imunomero y opcionalmente un adyuvante. El antigeno HIV puede ser un virus de HIV exterminado completo exento de proteína gpl20 envolvente externa. El antigeno HIV también pueden ser partículas de HIV defectuosas en proteasa tales como partículas L2. Alternativamente, el antigeno HIV puede ser un virus de HIV exterminado total, o una combinación de antígenos HIV o péptidos seleccionados, incluyendo antigeno p24, nef, gp41, y lo semejante. En las composiciones inmunogénicas de la invención en las que está presente un adyuvante, el adyuvante puede ser apropiado para administración a un humano, ün adyuvante de ejemplo es Adyuvante de Freund Incompleto. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden mejorar adicionalmente los niveles de producción de ?-quimioquina, interferón-y (IFNy) , interleuquina 2 (IL2), factor alfa de necrosis de tumor (TNFa) , e interleuquina 15 (IL15), y/o producción de anticuerpo IgG2b especifico de HIV en un mamífero. Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden mejorar las células CD4+ T de ayuda específica de HIV, una respuesta de linfocito T citotóxico especifico de HIV, y respuestas de linfocito T supresoras no citotóxicas en un mamífero. También se proporcionan equipos, que contienen un antígeno HIV, un inmunómero y opcionalmente un adyuvante. Los componentes de los equipos, cuando se combinan, producen las composiciones inmunogénicas de la invención. La invención también proporciona un método para inmunizar a un mamífero administrando al mamífero una composición inmunogénica que contiene un antígeno HIV, una molécula de ácido nucleico aislada que contiene inmunómero y opcionalmente un adyuvante. También se proporciona un método para inhibir SIDA, mejorando una respuesta inmune en el mamífero administrando al mamífero una composición inmunogénica que contiene un antígeno HIV, una molécula de ácido nucleico aislada que contiene un inmunómero y opcionalmente un adyuvante. En los métodos de la invención, el mamífero puede ser un primate, tal como un humano, o un roedor. En ciertas modalidades del método, el primate es una madre preñada o un bebé. Un humano puede ser seronegativo de HIV o seropositivo de HIV. Las composiciones inmunogénicas se pueden administrar venta osamente al mamífero dos o más veces y por una variedad de rutas de administración, incluyendo subcutáneamente, intramuscularmente e intramucosamente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La 'Figura 1 muestra las estructuras químicas de enlazadores de ejemplo para enlazar oligonucleótidos para formar un inmunómero (Yu y col., J. Med. Che. 45:4540-4548 82002); Yu y col., Nucí. Acids Res. 30:4460-4469 (2002)). La Figura 2 muestra un diagrama esquemático del inmunómero HYB2055, conocido también como Amplivax1411. La Figura 3 muestra la inducción de citoquinas específicas de HIV, RANTES, ????a, MIP1?, interleuquina-10 (IL-10) e IL-5 mediante Inmunogeno HIV-1. El inmunogeno se administró subcutáneamente. indica significado versus salina . La Figura 4 muestra la producción inducida por inmunogeno HIV-1 de interferón-y específico de HIV (iFNy) se mejora por Amplivax1* de una manera dependiente de dosis, indica significado versus inmunogeno de HIV-1 solo. La Figura 5 muestra el evento de AmplivaxMR sobre niveles de producción de RANTES, ????a, MIP1?, IL-10 e 11-5. ?1 inmunógeno se administró subcutáneamente. indica significado versus salina. La Figura 6 muestra producción de IFNy especifica de HIV mejorada mediante Amplivax*®. Resultados similares se encontraron para RANTES, ????a, MI 1/7 e 11-10. El inmunógeno se administró subcutáneamente. indica significado versus salina. La Figura 7 muestra el efecto de mejora de Amplivax31 en Gélulas T que secretan IFNy especifica de HIV en un ensayo Elispot. El inmunógeno se administró subcutáneamente. indica significado versus inmunógeno HIV-1 solo. la Figura 8 muestra que la producción de IFNy especifica de HIV se mejoró mediante Amplivax*® en una manera dependiente de dosis. El inmunógeno se administró subcutáneamente. indica significado versus inmunógeno HIV-1 solo. La Figura 9 muestra que la producción de RATES especifico de HIV se mejoró mediante Amplivax*® de una manera dependiente de dosis. El inmunógeno se administro subcutáneamente. "*" indica significado versus inmunógeno HIV-1 solo. La Figura 1Q muestra que la producción de ???-?a HlV-especifica se mejoró mediante Amplivax*® de una manera dependiente de dosis. El inmunogeno se administró subcutáneamente. indica significado versus inmunogeno solo . La Figura 11 muestra que la producción de MIP-1? especifico de HIV se mejoró mediante Amplivax™ de una manera dependiente de dosis. El inmunogeno se administró subcutáneamente. indica significado versos inmunogeno HIV-1 solo. La Figura 12 muestra que la producción de 11-10 especifica de HIV se mejoró mediante Amplivax™ de una manera dependiente de dosis. El inmunogeno se administró subcutáneamente. indica significado versos inmunogeno HIV-1 solo. La Figura 13 muestra que la producción de IL-5 especifico de HIV se redujo mediante A plivax^ proporcionado subcutáneamente (SC) . indica significado contra inmunógeno Hiv-l solo. La Figura 14 muestra el efecto de AmplivaxMR sobre títulos de anticuerpo p24 inducido por inmunogeno HIV-1 en ratones. El inmunógeno se administró subcutáneamente. La Figura 15 muestra que HIV-1 cuya vacuna exterminada en IFA (inmunógeno HIV-1) indujo producción de citoquina especifica de HIV durante administración subcutánea (SC) e intramuscular (IM) .

La Figura 16 muestra que Amplivax"5 se puede añadir antes, o después de emulsión con IFA y mejorar la producción de IFNy. La Figura 17 muestra que AmplívaxMR se puede añadir antes o después de emulsión con IFA y mejorar la producción de RA TES. La Figura 18 muestra que HIV-1 cuyo antigeno de vacuna exterminado con Amplivax1111 disparó producción de IFNy Especifica de HIV en ratones inmunizados subcutáneamente sin IFA. indica significado contra inmunógeno HIV-1.

El antígeno HIV es vacuna exterminada completa de HIV sin IFA. La Figura 19 muestra que el antígeno de vacuna exterminado completo de HIV-1 con Amplivax1® disparó actividad de célula CD8+ T que secreta IFNy específico de HIV en ratones inmunizados subcutáneamente con IFA. indica significado contra inmunógeno HIV-1 (administrado IM) . El antígeno HIV es vacuna exterminada completa de HIV sin IFA. La Figura 20 muestra que el antígeno de vacuna exterminado completo de HIV-1 con Amplivax1*01 disparó producción de RANTES específico de HIV en ratones inmunizados subcutáneamente sin IFA. indica significado contra inmunógeno HIV-1 (administrado IM) . El antígeno HIV es vacuna exterminada completa de HIV sin IFA.

La Figura 21 muestra que los porcentajes de células CD8+ T productoras de a-defensina se aumentan mediante Amplivax1^ añadido ex vivo. La Figura 22 muestra células CD8+ T productoras de IFNy especifica de HIV en pacientes tratados con REMUNE1R) y controles positivos de HIV (0 ug/ml de Amplivax1^) . La Figura 23 muestra células CD8+ T productoras de IFNy especifico de HIV en presencia de 0.1 ug/ml de Amplivax^ añadido ex vivo. La Figura 24 muestra células CD8+ T productoras de IFNy especifico de HIV en presencia de 1 ug/ml de Amplivax™ añadido ex vivo. La Figura 25 muestra células CD8+ T productoras de IFNy especificas de HIV en presencia de 10 ug/ml de Amplivax^ añadido ex vivo. La Figura 26 muestra ensayo ELIspot de IFN-y en células mononucleares de sangre periféricas (PBMCs) . Se usó HYB2055 a 1 ug/ml. La Figura 27 muestra Gam ios fenotipiGOS de células CD4 T después de Ia inyección de REMUNE(R) en pacientes inocentes de terapia antirretroviral (ART) . La Figura 28 muestra cambios fenotípicos en células CD8 T después de Ia inyección de REMUNE<R) en pacientes inocentes de ART. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones de HIV inmunogénicas que contienen un antigeno de HIV, una molécula de ácido nucleico aislada que contiene un inmunómero, y opcionalmente un adyuvante. También se proporcionan equipos que contienen los componentes de dichas composiciones, para uso juntas. La invención también proporciona métodos para inmunizar a un mamífero con dichas composiciones, o con los componentes de dichas composiciones, de manera de mejorar la respuesta inmune en el mamífero inmunizado con relación al antígeno de HIV solo. Ventajosamente, las composiciones de la invención también pueden inducir células de ayuda CD4 T específicas de HIV y células CD8+ T que proporcionan respuestas inmunes de Thl potentes contra un espectro amplio de epítopes HIV, proporcionando una fuerte respuesta de linfocito citotoxico T específico de HIV. De esta manera, las composiciones inmunogénicas de la invención son útiles para prevenir infección de HIV y/o hacer lenta la progresión a SIDA en individuos infectados. Las composiciones y métodos se pueden utilizar para producir respuestas Thl inmunes celulares y humorales específicas para epítopes HIV conservados, producir células de ayuda CD4 T específicas de HIV, actividad de linfocito citotoxico t específico de HIV, estimulan la producción de quimoquinas y citoquinas tales como ß-quimoquinas, interferón-y, interleuquina 2 (IL2), interleuquina 7 (IL7) , interleuquina 15 (IL15) , alfa-defensina, y lo semejante, y aumentar células de memoria. Estas vacunas se pueden administrar a través de varias rutas de administración. Estas vacunas se pueden utilizar para prevenir la transmisión maternal de HIV, para vacuna de recién nacidos, niños e individuos de riesgo elevado, y para vacuna de individuos infectados. Estas vacunas también se pueden utilizar en combinación con otras terapias de HIV, incluyendo terapia antirretroviral (ART) con diversas combinaciones de inhibidores de nucleasa y proteasa y agentes para bloquear entrada viral, tales como T20 (ver Bald in y col., Curr. Med. Chem. 10:1633-1642 (2003) ) . Como se utiliza en la presente, el término VHIV" se refiere a todas las formas, subtipos y variaciones del virus HIV, y es sinónimo con los términos antiguos HTLVIII y LAV. Varias lineas de célula capaces de propagar HIV o permanentemente infectadas con el virus HIV se han desarrollado y depositado con la ATCC, incluyendo células HuT 78 y el derivado H9 de HuT 78, asi como aquellos que tienen número de acceso CCL 214, TIB 161, CRL 1552 y CRL 8543, que se describen en la Patente de E.ü.A. No. 4,725,669 y Gallo, Scientific American 256:46 (1987). Como se utiliza en la presente, el término ""virus HIV exterminado entero" se refiere a un virus HIV inactivado, intacto. Un HIV inactivado se refiere a un virus que no puede infectar y/o replicar. Como se utiliza en la presente, el término "proteina envolvente externa" se refiere a aquella porción de la glicoproteína de membrana de un retrovirus que sobresale más allá de la membrana, en oposición a la proteina de transmembrana, gp41. Como se utiliza en la presente "virus HIV exento de proteínas envolventes externas" se refiere a una preparación de partículas HIV o productos de gene HIV exentos de la proteina envolvente externa gpl20, pero contiene las partes más genéticamente conservadas del virus (por ejemplo, p24 y gp41) . Un HIV exento de la proteína envolvente externa gpl20 también se refiere en la presente como REMUNE1*. Como se utiliza en la presente, el término "antígeno p24 de HIV" se refiere al producto de gene de la región de horquilla de HIV, caracterizado como teniendo un peso molecular relativo aparente de aproximadamente 24,000 daltons, designado p24. El término "antígeno p24 de HIV" también se refiere a modificaciones y fragmentos de p24 que tienen la actividad inmunológica de p24. Aquellos expertos en el ramo pueden determinar modificaciones apropiadas de p24, tales como adiciones, omisiones o substituciones de aminoácidos naturales o análogos de aminoácido, que sirven, por ejemplo, para aumentar su estabilidad o biodisponibilidad o facilitar su purificación, sin destruir su actividad inmunológica. Asimismo, aquellos expertos en el ramo pueden determinar fragmentos apropiados de p24 que tienen la actividad inmunológica de p24. Un fragmento inmunológicamente activo de p24 puede tener de 6 residuos del polipéptido hasta el polipéptido de longitud completa menos un aminoácido. Otros antigenos HIV codificados por otros productos de gene HIV pueden incluir fragmentos o modificaciones similares a aquellos arriba descritos para el antigeno p24 de HIV. Otros antigenos de HIV de ejemplo incluyen, por ejemplo, gp41, nef y los semejantes. Como se utiliza en la presente, un "inmunómero" se refiere a un oligonucleótido que comprende dos oligonucleótidos menores enlazados en sus extremos 3' , resultando en un oligonucleótido que tiene dos extremos b' . Los dos oligonucleótidos menores del inmunómero pueden ser secuencias o longitudes idénticas o no idénticas, pero generalmente son idénticas . Además de esta actividad inmunoestimulante, un inmunómero contiene un enlace 3f -3f y por lo tanto no tiene extremo 3' libre, aumentando de esta manera la resistencia a la digestión de nucleasa. Los oligonucleótidos menores del inmunómero son generalmente cuando menos alrededor de 5 o 6 nucleótidos que se enlazan juntos para formar dos extremos 5' , pero pueden ser más largos tal como 7, 8, 9, 10, 11, 1°2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o aun oligonucleótidos menores más largos del inmunómero. Un experto en el ramo puede determinar fácilmente una longitud y/o secuencia de inmunómero suficiente para estimular una respuesta inmune mayor que la que se puede ver con antigeno solo» De esta manera, en una modalidad, un inmunómero comprende dos oligonucleótidos idénticos enlazados a través de sus extremos 3' . Un inmunómero también puede incluir bases modificadas. Los inmunómeros se describen, por ejemplo, en andimalla y col., Bioorg. Med. Chem. 9:807-813 (2001); Yu y col., Nucí. Acids Res. 30:4460-4469 82002); Yu y col., Bioorg. Med. Chem. 11:459-464 (2003); Bhagat y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 300:853-861 (2003); y Yu y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 297:83-90 (2002); Yu y col., Nucí.

Acids Res. 30:1613-1619 (2002); Yu y col., J. Med. Chem. 45:4540-4548 (2002); Kandimalla y col, Bioconjugate Chem. 13:966-974 (2002); Yu y col., Bioorganic Med. Chem. lett. 10:2585-2588 (2000); Agrawal y Kandimalla, Trends Mol. Med. 8:114-121 (2002); cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia. Estos inmunómeros pueden tener actividad inmunoestimulante más potente que las secuencias inmunoestimulantes que contienen CpG. Un inmunómero mejora la respuesta inmune en un mamífero cuando se administra en combinación Gon un antígeno. Un inmunómero puede ser un inmunómero CpG o inmunoraero libre de GpG, como se discute abajo. Un inmunómero de ejemplo se describe en los Ejemplos X y XI. Como se utiliza en la presente, un "inmunómero CpG" se refiere a un inmunómero, como se describe arriba, que contiene especifreamente un motivo CpG. De esta manera, un inmunómero CpG es un oligonucleótido que comprende dos oligonucleótidos menores idénticos o no idénticos, en donde cuando menos uno de los oligonucleótidos menores contiene cuando menos un motivo CpG. Como se utiliza en la presente, un "inmunómero libre de CpG" se refiere a un inmunómero que excluye especifreamente un motivo CpG. De esta manera, un inmunómero libre de CpG es un oligonucleótido que comprende dos oligonucleótidos menores idénticos o no idénticos, en donde ninguno de los oligonucleótidos menores contiene un motivo CpG. Un inmunómero puede contener bases modificadas (ver Kandimalla y col., supra, 2001). Por ejemplo, un inmunómero puede contener análogos de CpG. Por ejemplo, un inmunómero puede contener un análogo de pirimidina de desoxicitosina, designado Y. Los análogos de desoxicitidina particularmente útiles para uso en un inmunómero son deoxi-5-hidroxicitidina o deoxi-N4-detilcitidina . En otra modalidad, un inmunómero puede contener un análogo de purina de guanina, designado R Un análogo de deoxiguanina particularmente útil es 7-deazguanina. De esta manera, un inmunómero puede contener un motivo YpG, un motivo CpR, o un motivo YpR, en donde Y y R son análogos de citosina y guanina, respectivamente , Los métodos para enlazar dos oligonucleótidos menores para formar un inmunómero se han descrito previamente (Kandimalla y col., bioorg. Med. Chem. 9:807-813 (2001); Yu y col., Nucle. Acids Res. 30:4460-4469 (2002) ; Yu y col., Bioorg, Med. Chem. 11:459-464 82003); Bhagat y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 300:853-861 (2003) ; y Yu y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 297:83-90 (2002); Yu y col., Nucí. Acids Res. 30:1613-1619 82002); Yu y col., J. Med. Chem. 45:4540-4548 (2002); Kandimalla y col., Bioconjugate chem. 13:966-974 (2002); Yu y col., Bioorganic Med. Chem. Lett. 10:2585-2588 (2000); Agra al y Kandimalla, Trends Mol. Med. 8.114-121 (2002)) . Los enlazadores de ejemplo incluyen, por ejemplo, enlaces 3f-3f a través de un enlazador de glicerilo (Yu y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 297:83-90 (2002) . Los enlazados pueden ser enlazadores de alquilo, alquilo ramificado o etilenglicol, como se describe en Yu y col., J. Med. Chem. 45:4540-4548 (2002) (ver Figura 1) . Uno experto en el ramo reconocerá fácilmente que estos y otros métodos se pueden usar para enlazar oligonucleótidos a través de sus extremos 3¡ para generar dos extremos 5' libres. Como se utiliza en la presente, el término "secuencia inmunoestimulante" o "ISS" se refiere a una secuencia de nucleótido que contiene un motivo CpG no metilado que es capaz de mejorar la respuesta inmune en un mamífero cuando se administra en combinación con un antígeno. Las secuencias inmunoestimulantes se describen, por ejemplo, en la publicación de PCT WO 98/55495. .Como se utiliza en la presente el término "molécula de ácido nucleico que contiene un inmunomero" se refiere a un ácido nucleico de ADN o RNA de hebra sencilla o doble, lineal, circular o ramificado, que contiene un inmunomero. Una molécula de ácido nucleico que contiene un inmunomero puede contener un solo xnmunómero. Una molécula de ácido nucleico también puede contener más de un inmunomero si uno o ambos de los extremos 5' libres está enlazado al extremo 5' de otra secuencia de ácido nucleico para generar otro extremo 3'" potencial para enlace de un inmunomero adicional. Dicha molécula de ácido nucleico, además del inmunomero, puede ser de cualquier longitud mayor de 6 bases o pares de base, y es generalmente mayor a aproximadamente 15 bases o pares de base, tal como mayor a alrededor de 20 bases o pares de base, y puede ser de varios kb de longitud. Cuando dicho ácido nucleico que contiene un inmunómero es circular, o cuando contiene múltiples inmunómeros que requieren enlaces 5r -5r , se entiende que los extremos 5¡ libres están enlazados, por ejemplo, como se describe en Kandimalla y col., Bioconjugate Chetu. 13:966-974 (2002), y Yu y col., Bioorgan. Med. Chem. 10:2585-2588 (2000), en tanto que el enlace 5' -5' no interfiera con la actividad inmunoestimulante del inmunómero incrustado en el ácido nudeico, Gomo se encuentra Gon inmunómeros cortos (Kandimalla y col., supra, 2002, y Yu y col., supra, 2000). Un ácido nucleico que contiene un inmunómero puede contener adicionalmente secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más antigenos HIV para uso como una vacuna de ADN. Un inmunómero o molécula de ácido nucleico que contiene un inmunómero se puede generar, por ejemplo, sintetizando químicamente oligonucleótidos y enlazando químicamente los oligonucleótidos a través de sus extremos 3', como se describe en la presente. Además, un inmunómero o molécula de ácido nucleico que contiene un inmunómero se puede generar sintetizando recombinantemente las dos mitades del inmunómero o ácido nucleico que contiene un inmunómero y enlazando químicamente las dos mitades a través de sus extremos 3r . Un inmunómero puede Gontener nucleótidos naturales o modificados o enlaces de nucleótido naturales o no naturales. las modificaciones conocidas en el ramo, incluyen, por ejemplo, modificaciones del grupo 3' OH . o 5' OH, modif caciones de la base de nucleótido, modificaciones del componente de azúcar, y modificaciones del grupo fosfato. Un enlace de nucleótido no natural puede ser, por ejemplo, un enlace de fosforiotiato en lugar de un enlace de fosfodiéster, que aumenta la resistencia de la molécula de ácido nucleico a degradación de nucleasa. Varias modificaciones y enlaGes se describen, por ejemplo, en la publicación de PCT WO 98/55495. Como se utiliza en la presente, el término "adyuvante" se refiere a una substancia que, cuando se añade a un agente inmunogénico, mejora no específicamente o da potencia a una respuesta inmune al agente en el huésped recipiente durante exposición a la mezcla. Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, alumbre (sales de aluminio), liposomas y micropartículas, tales como poliestixeno, almidón, polifosf szeno y polilactida/poliglicósidos . Los adyuvantes también pueden incluir, por ejemplo, mezclas de escualeno (SAF-I) , péptido de muramilo, derivados de saponina, preparaciones de pared de célula de micobacteria, lípido ? de monofosforilo, derivados de ácido micólico, agentes tensioaGtivos de copolimero de bloque no iónico, Quil A, subunidad de toxina B de cólera, polifosfazeno y derivados, y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs) tales como aquellos descritos por Takaashi y col. (1990) Nature 344:873-875, Para uso veterinario y para producción de anticuerpos en animales, los componentes mitogénicos de adyuvante de Freund (tanto completo como incompleto) se pueden usar. En humanos, el Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) es un adyuvante particularmente útil. Varios adyuvantes apropiados son bien conocidos en el ramo y se revisan, por ejemplo, por Warren y Chedid, CRC Critical Reviews in Immunology 8:83 (1988). Como se utiliza en la presente, "SIDA" se refiere a la fase sintomática de infección de HIV, e incluye tanto Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida (comúnmente conocida como SIDA) y "ARC" o Complejo Relacionado con SIDA, como se describe por Adler, Brit. Med. J. 294: 1145 (1987) . Las manifestaciones inmunológicas y clínicas de SIDA son bien conocidas en el ramo e incluyen, por ejemplo, infecciones oportunistas y cánceres de deficiencia inmune. Como se utiliza en la presente, el término "inhibir SIDA" se refiere a un efecto profiláctico o terapéutico benéfico de la composición inmunogénica con relación a infección de HIV o síntomas de SIDA. Estos efectos benéficos incluyen, por ejemplo, prevenir o retrasar la infección inicial de un individuo expuesto a HIV; reducir la carga viral en un individuo infectado con HIV; prolongar la fase asintomática de infección de HIV; mantener bajas cargas virales en pacientes infectados con HIV cuyos niveles de virus se han bajado a través de terapia anti-retroviral (ART) ; aumentar niveles de células CD4 T o reducir la disminución en células CD4T, tanto especificas como no especificas de HIV-1, en pacientes inocentes de droga y en pacientes tratados con ART, aumentar la salud total o calidad de vida en un individuo con SIDA; y prolongar la esperanza de vida de un individuo con SIDA. Un clínico puede comparar el efecto de inmunización con la condición del paciente antes del tratamiento, o con la condición esperada de un paciente no tratado, para determinar si el tratamiento es efectivo al inhibir SIDA. Como se utiliza en la presente, el término "mejora" con respecto a una respuesta inmune se pretende que signifique que la composición inmunogénica produce una mayor respuesta inmune que una composición que contiene antígeno HIV solo. En el caso en donde la composición inmunogénica contiene los tres componentes antígeno HIV, inmunómero y adyuvante, la composición inmunogénica produce una mayor respuesta inmune que una composición que contiene cualesquiera dos de los tres componentes de la composición inmunogénica, administrada en las mismas cantidades y siguiendo el mismo programa de inmunización. Los componentes de las composiciones inmunogénicas de la invención pueden actuar en sinergia. Una respuesta inmune mejorada puede ser, por ejemplo, producción aumentada de quimoquinas y/o citoquinas para promueven células de memoria, un aumento en células de memoria, un aumento en producción de IgG2b, un aumento en actividad de linfoci o citotóxico T, un aumento en producción de ?quimoquina o IL15, y lo semejante. Como un ejemplo de una respuesta inmune mejorada, las composiciones inmunogéniGas de la invención pueden aumentar la producción de y-interferón por ambas células CD4 (función de ayuda) y células CD8 (linfocitos citotóxicos T; CTLs) . Como se utiliza en la presente, el término "/3"Quimoquina" se refiere a un miembro de la clase de polipéptidos quimioatractivos, pequeños que incluye RANTES, proteína-1? inflamatoria de macrofago (MIP-1?) y proteína -la (MIP-la) . Las propiedades físicas y funcionales de las /J-quimoquinas son bien conocidas en el ramo. En el caso de producción de ?-quimoquina mejorada, la producción de ?-quimoquina puede ser "producción de ß-quimoquina específica de HIV", que se refiere a la producción de una ?-quimoquina en respuesta a estímulo de células T con un antígeno HIV. Alternativamente, o adicionalmente, la producción de ?-quimoquina que se mejora puede ser "producción de ?-quimoquina no específica", que se refiere a la producción de una ?-quimoquina en ausencia de estímulo de células T con un antígeno HIV. Como se utiliza en la presente, el término "equipo" se refiere a componentes empacados o marcados para usarse juntos. Por ejemplo, un equipo puede contener un antígeno HIV, un inmunómero y un adyuvante en tres recipientes separados. Alternativamente, un equipo puede contener cualesquiera dos componentes en un recipiente, y un tercer componente y cualesquiera componentes adicionales en uno o más recipientes separados. Opcionalmente, un juego contiene además instrucciones para combinar los componentes de manera de formular una composición inmunogénica apropiada para administración a un mamífero. La invención proporciona una composición inmunogénlca que contiene un antígeno HIV, un inmunómero, y opcionalmente un adyuvante. La composición inmunogénlca mejora la respuesta inmune en un mamífero administrado con la composición. En una modalidad, la composición inmunogénica mejora una respuesta de linfocito citotoxico T específico de HIV (CTL) en un mamífero. En otra modalidad, la composición inmunogénica mejora las 'células T de ayuda CD4+ específicas de HIV. En una modalidad, el antígeno HIV en la composición inmunogénica es un virus HIV exterminado completo, que se puede preparar mediante métodos conocidos en el ramo. Por ejemplo, el virus HIV se puede preparar mediante cultivo de una muestra de sangre periférica de individuos infectados. En un método de ejemplo de cultivar virus HIV, células mononucleares de sangre periférica (por ejemplo, linfocitos) se puede obtener formando en capas un espécimen de sangre venenosa heparinizada sobre un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y centrifugando el espéGimen. Las Gélulas mononucleares luego se recogen, activan, como con fitohemaglutinina durante dos a tres días, y se cultivan en un medio apropiado, de preferencia suplementado con interleuquina 2 (IL2) . El virus se puede detectar ya sea mediante un ensayo para transcriptasa de reversa, mediante un ensayo de captura de antigeno para p24, mediante inmunofluorescencia o mediante microscopía electrónica para detectar la presencia de partículas virales en células, todos los cuales son métodos bien conocidos por aquellos expertos en el ramo. Los métodos para aislar partículas de HIV exterminadas completas se describen, por ' ejemplo, en Richieri y col., Vaccine 16:119-129 (1998), y Patentes de E.U.A. Nos. 5,661,023 y 5,256,767. En una modalidad, el virus HIV es un aislado HZ321 de un individuo infectado en Zaire en 1976, que se describe en Choi y col., AIDS Res.

Hum. Retroviruses 13:357-361 (1997), Se conocen varios métodos en el ramo para hacer un virus no infeccioso (ver. por ejemplo Hanson, MEDICAL VIROLOGY II (1983), de la Maza y Peterson, eds., Elsevier). Por ejemplo, el virus se puede inactivar mediante tratamiento con productos químicos o mediante condiciones físicas tales como calor o irradiación. De preferencia, el virus se trata con un agente o agentes que mantienen las propiedades inmunogénicas del virus. ?or ejemplo, el virus se puede tratar con beta-propiolactona o radiación gamma, o ambas, beta-propiolactona y radiación gamma, a dosis y durante tiempos suficientes para inactivar el virus . En otra modalidad/ el antígeno HIV en la composición irimunogénica es un virus HIV exterminado entero exento de proteínas envolventes externas, que se puede preparar mediante métodos conocidos en el ramo. A fin de preparar virus entero exterminado exento de proteínas envolventes externas, el virus aislado se trata de manera de remover las proteínas envolventes externas. Dicha remoción se logra de preferencia medíante congelación y descongelación repetidas del virus en conjunción con métodos físicos que ocasionan la hinchazón y contracción de las partículas virales, aún cuando otros métodos físicos o no físicos, tales como sonicación, también se pueden emplear solos o en combinación.

En todavía otra modalidad, el antigeno HIV en la composición inmunogénica es uno ' o más productos de gene substancialmente purificados de HIV. Dichos productos de gene incluyen aquellos productos codificados por los genes de horquilla (p55, p39, p24, pl7 y pl5), los genes pol (p66/p51 y p31-34) y la glicoproteina de transmembrana gp41; y la proteína nef. Estos productos de gene se pueden usar solos o en combinación con otros antígenos HIV. El antígeno HIV también puede ser fragmentos de péptido de productos de gene HIV que producen una respuesta inmune. El producto de gene substancialmente purificado de HIV puede ser un antígeno de HIV p24 substancialmente purificado u otros antígenos de HIV y productos de gene. El p24, así como otros antígenos HIV, se pueden purificar substancialmente del virus mediante métodos bioquímicos conocidos en el ramo, o se pueden producir clonando y expresando el gene apropiado en un organismo huésped tal como células bacteriales, fúngales o de mamífero, mediante métodos bien conocidos en el ramo. Alternativamente, el antígeno p24, o una modificación o fragmento del mismo que retiene la actividad inmunológica de p24, así como otros antígenos HIV o modificaciones o fragmentos de los mismos, se pueden sintetizar, utilizando métodos bien conocidos en el ramo, tales como síntesis de péptico automatizada. La determinación de si una modificación o fragmento de p24 retiene la actividad inm nológica de p24, asi como otros antigenos HIV o modificaciones o fragmentos de los mismos, se pueden sintetizar, utilizando métodos bien conocidos en el ramo, tales como síntesis de péptido automatizada. La determinación de si una modificación o fragmento de p24 retiene la actividad inmunológica de p24f u otros antígenos virales retienen su actividad inmunológica respectiva, se puede hacer, por ejemplo, por la capacidad de estimular la proliferación in vitro de PBMCs previamente inmunizados Gomo se analiza mediante ensayos de proliferación de linfocito convencionales (LPA) conocidos en el ramo (ver el Ejemplo III) , inmunizando un mamífero y comparando las respuestas inmunes así generadas, o probando la capacidad de la modificación o fragmento de competir con p24 para ligarse a un anticuerpo p24, u otros antígenos HIV a sus anticuerpos respectivos. En todavía otra modalidad, el antígeno HIV en la composición inmunogénica es un producto de gene substancialmente purificado de un HIV defectuoso de proteasa (ver las patentes de E.U.A. Nos. 6,328,976 y 6,557,296} . El proceso de réplica para HXV-1 tiene un régimen de error de aproximadamente uno por 5-10 pares de base. Puesto que el genoma viral completo es justamente bajo 10,000 pares de base, resto resulta en un régimen de error de aproximadamente sobre par de base por ciclo de réplica. Este régimen de mutación elevado contribuye a variabilidad extensa de los viruses dentro de cualquier persona y aún variabilidad más amplia a través de poblaciones . Esta variabilidad ha resultado entres variantes de HIV-1 que se describen y alrededor de 10 subespecies de virus llamadas "clades". Estas distinciones están basadas en la estructura de las proteínas envolventes, que son especialmente variables. La variante M (por mayor) es en mucho la más prevalente mundialmente . Dentro de la variante M los clades A, B, C, D, E, F, G, H, I, J y K, con clades A a E representando la vasta mayoría de infecciones globalmente. Los clades A, C y D son dominantes en África. El clase B es más prevalente en Europa, Norte y Sudamérica y Asia Sudoriental . Los clades E y C son dominantes en Asia. Estos clades difieren uno del otro en tanto como Hay dos resultados importantes del régimen de mutación muy elevado de HXV-1 que tienen consecuencias profundas para la epidemia. Primero, el régimen de mutación elevado es uno de los mecanismos que permite que el virus escape del control por terapias de droga. Estos nuevos viruses representan cepas resistentes. El régimen de mutación elevado también permite al virus escapar al sistema inmune del paciente alterando las estructuras que son reconocidas por los componentes inmunes . Una consecuencia añadida de esta extensa variabilidad es que el virus también puede escapar de control por vacunas, y las vacunas basadas en proteínas envolventes probablemente serán no efectivas . La mayor variación en estructura se ve en las proteínas envolventes gpl20 y gp41. Se ve menos variación en las diversas proteínas internas. Como se describe en la presente, REMUNE es un inmunógeno que se hace del virus completo sin sus proteínas gpl20, pero contiene la mayoría de los epítopes altamente conservados del virus HIV-1. Tanto el números ' de estos epítopes como su incidencia inferior de mutación significan que un virus HIV exento de proteínas envolventes externas tales como REMUNE estimula las respuestas inmunes que tienen una mayor probabilidad de éxito en individuos. Además, la línea de células HuT 78 se infectó a propósito con una cepa muy temprana de virus HIV que contiene ambos clades A y G para antígenos conservados, que se habían retenido a través de la mayoría de variaciones en clades vistas mundialmente, y esta línea de célula infectada con HIV HuT 78 proporcionó virus usados como antígeno HIV, De esta manera, el uso de un virus HIV con múltiples clades tempranos que también está exento de proteínas envolventes externas para inmunización puede ser efectivo a través de clades proporcionando antígenos conservados que se pueden reconocer por la mayoría de los pacientes . El antígeno HIV y un inmunómero se pueden mezclar juntos, o se pueden conjugar con ya sea un enlace covalente o no covalente. Los métodos para conjugar antígenos y moléculas de ácido nucleico son conocidos en el ramo, y los métodos de ejemplo se describen en la publicación de PCT WO 98/55495. ün componente de oligonucleótido de un inmunómero se puede preparar utilizando métodos bien conocidos en el ramo incluyendo, por ejemplo, síntesis de oligonucleótido, PCR, degradación enzimático o química de moléculas de ácido nucleico mayores, y procedimientos de aislamiento de polinucleótido convencionales. Los métodos para producir un componente de oligonucleótido de un inmunómero, incluyendo un oligonucleótido que contiene una o más bases o enlaces modificados se describen, por ejemplo, en la publicación de PCT WO 98/55495. Aquellos expertos en el ramo pueden determinar fácilmente si ún inmunómero particular es efectivo al mejorar una respuesta inmune deseada en un mamífero particular inmunizando un mamífero de la misma especie, o una especie conocida en el ramo que exhibe respuestas inmunes similares, con una composición que contiene un inmunómero particular. Una variedad de ensayos conocidos en el ramo se pueden utilizar luego para caracterizar y comparar las características de las respuestas inmunes inducidas. Por ejemplo, un inmunómero optimizado para incluirse en una composición inmunogénica para administración a un humano se puede determinar en un humano o un primate no humano, tal como un mandril, chimpancé, macaco o mono evaluando su actividad inmune, por ejemplo mediante LPA, ELISPOT y/o relaciones de anticuerpo IgGl/G2 producido . Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden contener además un adyuvante, tal como un adyuvante demostrado que es seguro en humanos. Un adyuvante de ejemplo es el Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) . Otro adyuvante de ejemplo contiene componentes de pared de célula de micobacteria y lípido A de monofosforilo, tal como el adyuvante comercialmente disponible DETOX™. Otro adyuvante de ejemplo es alumbre. La preparación y formulación de adyuvantes en composiciones inmunogénicas son bien conocidas en el ramo. Opcionalmente, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden contener o formularse junto con otros ingredientes farmacéu icamente aceptables, incluyendo agua estéril o salina fisiológicamente tamponada. Un ingrediente farmacéuticamente aceptable puede ser cualquier compuesto que aGtúa, por ejemplo, la estabilizar, solubilizar, emulsionar, tamponar o mantener la esterilidad de la composición inmunogénica, que es compatible con administración a un mamífero y no hace a la composición inmunogénica inefectiva para su propósitos pretendido. Estos ingredientes y sus usos son bien conocidos en el ramo. La invención también proporciona equipos que contienen un antígeno HIV, inmunomero, y opcionalmente un adyuvante. Los componentes del equipo, cuando se combinan, producen una composición inmunogénica que mejora una respuesta inmune en un mamífero. Los componentes del equipo se pueden combinar ex vivo para producir una composición inmunogénica que contiene un antígeno HIV, un inmunomero y opcionalmente un adyuvante. Alternativamente, cualesquiera dos componentes se pueden combinar ex vivo, y administrar con un tercer componente, de modo que una composición inmunogénica se forma in vivo. Por ejemplo, un antígeno HIV se puede emulsionar en, disolver en, mezclar con, o adsorber a un adyuvante e inyectarse a un mamífero, precedido o seguido por inyección de inmunomero. Asimismo, cada componente del equipo se puede administrar separadamente. Aquellos expertos en el ramo entienden que hay diversos métodos para combinar y administrar un antígeno HIV, un inmunomero, y opcionalmente un adyuvante, de manera de mejorar la respuesta inmune en un mamífero. Como se discute abajo con mayor detalle, una composición inmunogénica de la invención se puede administrar local o sistémicamente mediante métodos bien conocidos en el ramo, incluyendo, pero no limitado a rutas intramuscular, intradermal, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, oral u otras rutas mucosales. Como se describe en la presente, REMÜNE se ha encontrado que es inmunogénico en la mayoría de los pacientes, aun cuando con grados variables de potencia y duración (Ejemplo VIII) . Por lo tanto, una composición inmunogénica que comprende HIV exenta de proteínas envolventea externas combinada con adyuvante IFA, tal como REMUNE, se puede utilizar para inducir una respuesta inmune en la mayoría de los pacientes infectados con HIV. Las composiciones inmunogénicas de la invención mejoran la resistencia y potencia de la respuesta inmune a un inmunógeno HIV tal como REMUNEm, mejorando de esta manera la eficacia terapéutica y/o preventiva de una vacuna. Una respuesta inmune mejorada puede ser, por ejemplo producción aumentada de células T de ayuda CD4+ específicas de HIV-1, quimoquinas y/o Gitoquinas, un aumento en Gélulas de memoria, un aumento en producción de anticuerpo total y más específicamente en la relación de producción de IgG2b, un aumento en actividad de linfocito Gitotóxico T, un aumento en j§-quimoquina o producción de 1115 y lo semejante. De esta manera, las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden utilizar para mejorar el perfil de citoquina TH1 (IFNy elevado, relaciones elevadas de IgG2/IgGl) . Como se describe en la presente, los componentes de las composiciones inmunogénicas de la invención pueden actuar en sinergia, Por ejemplo, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden mejorar la producción de fcjuimoquina elucidando la producción de una GonGentraGión superior de ?-quimoquina de lo que se esperaría añadiendo los efectos de combinaciones en pares de componentes de la composición inmunogénica. Las células de memoria se necesitan para mantener la inmunidad de término prolongado después del estado de infección agudo inicial. Durante la fase de contracción después de una etapa aguda inicial de infección, una cantidad significativa de las células inmunes inducidas contra el agente infeccioso se destruyen por apóptosis, con solamente las células sobrevivientes permaneciendo capaces de convertirse en células de memoria. Por lo tanto, protegiendo las células CD4 y CDE8 T específicas de HIV de apóptosis se promueve un aumento en ambas células de ayuda CD4 específica de HIV y células de memoria CD8 CTL. Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden utilizar para aumentar las células de memoria, promoviendo de esta manera las funciones de ayuda de término prolongado y la inmunidad mediada por célula. Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden utilizar para aumentar el número de células de memoria disminuyendo la apóptosis o estimulando factores que promueven la supervivencia de células de memoria. Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden utilizar para desplazar una TH2 a una respuesta TH1, aumentando de esta manera las respuestas inmunes mediadas por célula, incluyendo una respuesta CD8+ más fuerte. De esta manera, las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden utilizar para reforzar la respuesta inmune en un paciente, quien de otra manera solamente está respondiendo de manera débil, y convertir la respuesta en inmunidad mediada por célula. Las composiciones inmunogénicas de la invención de esta manera se pueden utilizar para aumentar la resistencia y duración de una respuesta inmune en un paciente que habria respondido de manera débil a un antigeno HIV similar como aquel usado en la composición inmunogénica. Una composición inmunogénica de la invención es efectiva al mejorar una respuesta inmune, por ejemplo producción de ?-quimoquina y/o IL15, IFN, IL2, TNFa, células de ayuda CD4 especificas de HIV aumentadas, producción de anticuerpo IgG2b, produGGión de linfocito citotóxico T (CTL) especifico de HIV producción de IFNy mediante células CD4+ y células CD8 T y lo semejante, en un mamífero administrado con la composición. Como se describió en la solicitud de E.U.A. o. De Serie 09/565,906, presentada el 5 de mayo de 2000, y WO 00/67787, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia, y en los Ejemplos I y III, abajo, la producción de RANTES de ?-quimoquina se puede detectar y cuantificar usando en ensayo ELISA de sobrenadantes de células T (tales como células de nodo de linfo o células de sangre periférica) de mamíferos administrados con la composición. A fin de determinar la producción de ?-quimoquina específica de antígeno, las células T de un mamífero inmunizado se pueden estimular con antígeno HIV en combinación con timocitos que presentan antígeno, y los niveles de ?-quimoquina medidos en el sobrenadante, A fin de determinar la producción de /7-quimoquina no específica, ya sea el sobrenadante de célula T o una muestra de sangre o plasma de un mamífero inmunizado se puede ensayar. De manera similar, la producción de otras ?-quimoquinas, tales como MIP-la, y MIP-1?, se puede detectar y cuantificar utilizando los ensayos ELISA comercxalmente disponibles, de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los métodos para medir la producción de citoquina, incluyendo inferieron, IL15, IL2, TNFG, IL10 e IL7f mediante ELISPOT, ELISA, o manchado de citoquina intracelular son bien conocidos por aquellos expertos en el ramo (ver, por ejemplo, Robbins y col., AIDS 17.1121-1126 (2003) ) . Una composición inmunogénica de la invención puede ser capaz además de mejorar la producción de anticuerpo IgG2b especifico de HIV en un mamífero administrado con la composición. Los niveles elevados de anticuerpos IgG2b, que están asociados con la respuesta tipo Ihl, están correlacionados con la protección contra HIV y progresión a SIDA. De esta manera, la invención proporciona composiciones que pueden aumentar una respuesta de TH1. Una composición inmunogénica de la invención puede ser capaz además de mejorar respuestas de linfocito citotoxico T (CTL) especifico de HIV en un mamífero administrado con la composición. Una composición inmunogénica de la invención puede aumentar la producción de IFN-y en arabas, células CD4+ T y células CD8+ T. La producción de IFN-y mediante células CD4+T se caracteriza por una respuesta de ayuda CD4 clásica importante a la inmunidad mediada por célula. Las células CD4+ T que producen tanto IF como IL2 pueden ser más efectivas. La producción de IFN-y mediante células CD8+ T es representativa de una respuesta de linfocito Gitotóxico T (CTL) , y está altamente correlacionada con actividad citolitica. Las células que producen arabos IFN y TNFa pueden ser más efectivas. La actividad de CTL es un componente importante de una respuesta inmune anti-HIV profiláctica o terapéutica. Los métodos para determinar si una respuesta CTL se mejora después de la administración de una composición inmunogénica de la invención son bien conocidos en el ramo, e incluyen ensayos citoliticos y ensayos LPA (descrito, por ejemplo, en Deml y col., supra (1999); ver Ejemplo III), y ensayos ELISA y ELISPOT para producción de IFN-y especifica de CD8 (ver la solicitud de E.U.A. No. De serie 09/565,906 y WO 00/67787 y los Ejemplos I y II abajo), manchado intracelular y análisis FACS utilizando una miríada de anticuerpos contra marcadores de superficie de célula. La invención también proporciona un método para inmunizar a un individuo. El método consiste en mejorar la respuesta inmune en un individuo administrando a un mam fero una composición inmunogénicas que contiene un antígeno HIV, un inmunomero, y opcionalmente un adyuvante. Los componentes de la composición inmunogénica se pueden administrar en cualquier orden o combinación, de modo que la composición inmunogénica se forme ex vivo o in vivo. En una modalidad particular, el antigeno HIV, inmunomero y adyuvante opcional se administran simultáneamente o a aproximadamente al mismo tiempo, en aproximadamente el mismo sitio. Sin embargo, administrando los componentes dentro de varios minutos o varias horas uno del otro también puede ser efectivo al proporcionar una composición inmunogénica que una respuesta inmune. Adicionalmente, administrando los componentes en diferentes sitios en el mamífero también puede ser efectivo al proporcionar una composición inmunogénica que mejora una respuesta inmune. Un experto en el ramo puede determinar fácilmente un tiempo y ubicación apropiados para administrar separadamente los componentes, es decir, el antigeno HIV, inmunómero y componentes adyuvantes opcionales, para proporcionar una respuesta inmune suficiente administrando los componentes separados en diversos tiempos y ubicaciones y midiendo la respuesta inmune. La composición inmunogénica también se puede administrar múltiples veces, si se desea, por ejemplo 2 o más, 3 o más, 4 o más 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más o 10 o más, o cualquier número deseado de veces para estimular o mejorar una respuesta inmune especifica de HIV. Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden administrar a un humano para inhibir SIDA, tal como previniendo la infección inicial de un individuo expuesto a HIV, reduciendo la carga viral en un individuo infectado con HIV, prolongando la fase asintomática de infección de HIV, aumentando la salud total o calidad de vida en un individuo con SIDA, o prolongando la esperanza de vida de un individuo con SIDA. Como se describe en la presente, la administración a un mamífero de una composición inmunogénica que contiene un antígeno HIV, una molécula de ácido nucleico aislada que contiene un inmunómero, y opcionalmente un adyuvante estimula las respuestas inmunes correlacionadas con protección contra infección de HIV y progresión a SIDA. En particular, las composiciones inmunogénicas mejoran la respuesta inmune más efectivamente de lo que se esperaría por combinación de cualquiera de los componentes individuales o, en una composición de tres componentes que contiene antígeno HIV, inmunómero y adyuvante, cualesquiera dos componentes de las composiciones inmunogénicas. Adicionalmente, las composiciones inmunogénicas promueven respuestas inmunes fuertes tipo Thl, incluyendo tanto citoquinas de tipo Thl (por ejemplo IFN-y) , es isotipos de anticuerpo tipo Thl (por ejemplo, IgG2b) . De esta manera, las composiciones inmunogénicas de la invención serán efectivas como vacunas para prevenir la infección de HIV cuando se administran a individuos seronegativos, y para reducir la carga viral, prolongar la fase asintomática de infección y afectar positivamente la salud o extensión de vida de un individuo seropositivo, Los individuos que se han expuesto al virus de HIV usualmente expresan en su suero ciertos anticuerpos específicos para HIV. Estos individuos se denominan "seropositivos" para HIV, en contraste con individuos que son seronegativos". La presencia de anticuerpos específicos de HIV se puede determinar mediante sistemas de ensayo comercialmente disponibles. En la actualidad, las pruebas serologicas para detectar la presencia de anticuerpos al virus son el método más ampliamente usado para determinar la infección. Estos métodos, sin embargo, pueden resultar en ambos negativos, como cuando un individuo ha contraído el virus pero todavía no se monta todavía una respuesta inmune, y en positivos falsos, como cuando un feto puede adquirir los anticuerpos, pero no el virus de la madre. Cuando las pruebas serologicas proporcionan una indicación de infección, puede ser necesario considerar que todos aquellos que prueban seropositivos como de hecho, estar infectados. Además, algunos de esos individuos que se encuentra que son seronegativos de hecho pueden ser tratados como estando infectados si ciertas otras indicaciones de infección, tales como contacto con un portador conocido, se satisfacen. Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden administrar a un individuo que es seronegativo o seropositivo de HIV. En el individuo seropositivo puede ser deseable administrar la composición como parte de un régimen de tratamiento que incluye tratamiento con agentes antivirales, tales como inhibidores de proteasa. Los agentes antivirales y sus usos en regímenes de tratamiento son bien conocidos en el ramo, y un régimen apropiado para un individuo particular se puede determinar por un clínico experto . Como se describe en la solicitud de E.U.A. Serie No. 09/565,906 y WO 00/67787 y se describe en la presente y en el Ejemplo IV abajo, la administración de las composiciones inmunogénicas de la invención a un feto de primate o a un neonato de primate resulta en la generación de una fuerte respuesta inmune anti-HIV, indicando que los sistemas inmunes de los fetos y bebés son capaces de montar una respuesta inmune a dichas composiciones que deben proteger al niño de infección de HIV o progresión a SIDA. Consecuentemente, las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden administrar una madre preñada infectada con HIV para impedir la transmisión de HIV al feto, o a un feto, un bebé, un niño o un adulto como una vacuna ya sea profiláctica o terapéutica. La dosis de la composición inmunogénica, o componentes de la misma, que se va a administrar en los métodos de la invención se selecciona de manera de ser efectiva al estimular las respuestas inmunes deseadas. Generalmente, una composición inmunogénica formulada para una sola administración contiene entre alrededor de 1 a 200 ug de antígeno de proteína. Una composición inmunogénica generalmente contiene alrededor de 100 ug de antigeno de proteina para administración a un primate, tal como un humano. Como se describe en la solicitud de E.U.A. Serie No. 09/565,906 y WO 00/67787 y se describe en la presente y se muestra en el Ejemplo IV, abajo, alrededor de 100 ug de antigeno HIV en una composición inmunogénica produce una fuerte respuesta inmune en un primate. Aproximadamente 10 ug de antígeno HIV es apropiada para administración a un roedor. Uno experto en el ramo puede determinar fácilmente una cantidad apropiada de antígeno HIV a incluir en una composición inmunogénica de la invención suficiente para estimular una respuesta inmune. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden contener además de aproximadamente 5 ug a aproximadamente 100 ug de un inmunómero, y pueden contener hasta 10 mg de inmunómero, si se desea. Por ejemplo, en una dosis para administración a un humano, la dosis puede ser alrededor de 0.01 mg a alrededor de 5 mg, por ejemplo, alrededor de 0.05 mg, alrededor de 0.1 mg, alrededor de 0.2 mg, alrededor de 0.3 mg, alrededor de 0.4 mg, alrededor de 0.5 mg, alrededor de 0.6 mg, alrededor de 0.7 mg, alrededor de 0,8 mg. Alrededor de 0.9 mg, alrededor de 1 mg, alrededor de 1.1 rng, alrededor de 1.2 mg, alrededor de 1.3 mg, alrededor de 1.4 mg. alrededor de 1.5 mg. alrededor de 1.7 mg, o alrededor de 2 mg, la cantidad de inmunómero para administrar es generalmente de alrededor de 0.1 mg/kg a alrededor de 0.25 mg/kg hasta alrededor de 5 mg/kg, y puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0.2, aproximadamente 03, aproximadamente 0.4, aproximadamente 0.5, aproximadamente 0.6, aproximadamente 0.7, aproximadamente 0.8, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1, aproximadamente 1.2, aproximadamente 1.5, aproximadamente 1.7, aproximadamente 2, aproximadamente 2.5, aproximadamente 3, aproximadamente 3.5, aproximadamente 4, aproximadamente 4.5, o aproximadamente 5 mg/kg. la cantidad de inmunómero también puede ser alrededor de 0.2 ug/kg, alrededor de 0.5 ug/kg, alrededor de 1 ug/kg. Alrededor de 2 ug/kg, alrededor de 3 ug/kg, alrededor de ug/kg, alrededor de 5 ug/kg, alrededor de 6 ug/kg, alrededor de 7 ug/kg, alrededor de 8 ug/kg, alrededor de 9 ug/kg, alrededor de 10 ug/kg alrededor de 11 ug/kg, alrededor de 12 ug/kg, alrededor de 13 ug/kg, alrededor de 14 ug/kg, alrededor de 15 ug/kg, alrededor de 16 ug/kg, alrededor de 17 ug/kg, alrededor de 18 ug/kg, alrededor de 19 ug/kg, alrededor de 20 ug/kg, alrededor de 22 ug/kg, alrededor de 25 ug/kg y lo semejante. Como se describió anteriormente en la solicitud de E.U.A. No. De Serie 09/565,906 y WO 00/67787, la relación de cuando menos 5:1 en peso de molécula de ácido nucleico a antigeno HIV fue más efectiva que las relaciones inferiores para elucidar respuestas inmunes. Uno experto en el ramo puede determinar fácilmente una relación apropiada u optimizada de inmunómero a antigeno HIV para elucidar una respuesta inmune. Por ejemplo, la relación se puede variar y la respuesta inmune medida mediante métodos descritos en la presente para determinar una relación apropiada u optimizada de inmunómero a antigeno HIV. En los roedores, una cantidad efectiva de un inmunómero en una composición inmunogenética es de 5 ug a más de 50 ug, tal como aproximadamente 100 ug. En primates, alrededor de 500 ug de un inmunómero es apropiada en una composición inmunogénica. Aquellos expertos en el ramo pueden determinar fácilmente una cantidad apropiada de inmunómero para producir una respuesta inmune deseada. Como con todas las composiciones inmunogénicas, las cantidades inmunológicamente efectivas se determinan empíricamente, pero se pueden basar, por ejemplo, en cantidades inmunológicamente efectivas en modelos animales, tales como roedores y primates no humanos. Los factores que se van a considerar incluyen la antigenicidad, la formulación (por ejemplo, volumen, tipo de adyuvante) , la ruta de administración, el número de dosis de inmunización a ser administrado, la condición física, peso y edad del individuo y lo semejante. Estos factores son bien conocidos en el ramo de vacuna y esta bien dentro de la experiencia de inmunologos hacer dichas determinaciones sin experimentación indebida. Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden administrar local o sistémicamente mediante cualquier método conocido en el ramo, incluyendo, pero no limitado a rutas intramuscular, intradermal, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, oral u otras rutas mucosales . Las composiciones inmunogénicas se pueden administrar en un portador farmacéutico no tóxico, apropiado, o se puede formular en microcápsulas o como un implante de liberación sostenida. Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden administrar múltiples veces, si se desea, a fin de sostener la respuesta inmune deseada. La ruta apropiada, formulación y programa de inmunización se pueden determinar por aquellos expertos en el ramo. Se entiende que las modificaciones que no afectan substancialmente la actividad de las diversas modalidades de esta invención también se incluyen dentro de la definición de la invención proporcionadas en la presente. Consecuentemente, los siguientes ejemplos se pretenden para ilustrar pero no limitar la presente invención» EJEMPLO I Producción de respuestas de citoquina, anticuerpo y quimoquina mediante composiciones inmunogénicas HIV. Este ejemplo está diseñado para mostrar que las composiciones inmunogénicas que contienen un antigeno HIV, inmunómero y un adyuvante, son estimulantes potentes de producción de IFN-y (un Thl (CD8) y Th2 (CD4 de ayuda) citoquina) , respuestas de anticuerpo y producción de ?-quimoquina en un mamífero. Por lo tanto, las composiciones inmunogénicas que contienen un antigeno HIV, un inmunómero y un adyuvante median respuestas inmunes potentes de los tipos que son importantes al proteger contra infección de HIV y progresión de enfermedad, indicando que estas composiciones serán vacunas profilácticas y terapéuticas efectivas, Inmunómeros . Los inmunómeros se sintetizan como se describió previamente (Kandimalla y col., Bioorg. Med. Chem. 9:807-813 (2001); Yu y col., Nucí. Acids Res. 30:4460-4469 (2002); Yu y col., Bioorg. Med. Chem. 11:459-464 82003); Bhagat y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 300:853-861 (2003); y Yu y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 297:83-90 (2002); Yu y col., Nucle. Acids Res. 30.1613-1619 (2002); Yu y col., J. Med. Chem. 45:4540-4548 (2002); Kandimalla y col., BioGonjugate chem. 13:966-974 (2002); Yu y col., Bioorganic Med. Chem. Lett. 10:2585-2588 (2000); Agrawal y Kandimalla, Trends Mol. Med. 8.114-121 (2002)). Inmunizaciones: El antigeno HIV-1 se prepara esencialmente como se describió previamente (WO 00/67787) .

Brevemente, el antigeno HIV-1 se prepara de partículas de virus obtenidas de cultivos de un Hut 78 crónicamente infectado con un aislado de virus de Zaire (HZ321) que se ha caracterizado como subtipo ?", que contiene un- virus recombinante env A/gag G (Choi y col., AIDS Res. Hum.

Retroviruses 13:357-361 81997)). El gpl20 se agota durante el proceso de purificación de dos pasos . El antígeno se inactiva mediante la adición de ?-propiolactona e irradiación gamma a 50 kGy. El análisis de mancha Western y HPLC se usa para mostrar niveles no detectables de gpl20 en la preparación de este antígeno (Prior y col,, Pharm. Tech. 19:30-52 (1995)). Para experimentos in vitro, p24 nativo se lisa de preferencia de antígeno HIV-1 purificado con 2% de tritón X-100 y luego se purifica con resina Pharmacia Sepharosem Fast Flow S. La cromatografía se lleva a cabo a pH = 5.0, y p24 se eluye con gradiente de sal lineal. La pureza del producto final se calcula y se encuentra generalmente que es >99% por ambas, electroforesis SDS (sulfato de dodecilo de sodio) y cromatografía líquida de alta presión de fase invertida.

El inmunómero se añade al antigeno HIV-1 diluido en un volumen de cuando menos 5% del volumen final. El CFA (adyuvante de Freund completo) se prepara resuspendiendo micobacteria tuberculosis H37RA (DIFCO, Detroit, Michigan) a 10 mg/ml en IFA (DIFCO, Detroit, Michigan) . IFA o ISA 51(R) se formula añadiendo una parte del agente tensioactivo Montanide 80 (monoleato de manida de alta pureza, Seppie, Paris) a nueve partes de Drakeol 6 VR aceite mineral ligero (Panreco, Karnes City, Pennsylvania) . El antigeno HIV-1 agotado en gpl20 se diluye en PBS a 200 ug/ml y se emulsiona con volúmenes iguales de CFA o IFA con o sin inmunómero. Ratones C57B1, mantenidos en una instalación libre de patógeno, se inyectan intradérmicamente con 100 ul de emulsión. Cada animal recibe 1-10 ug del antígeno HIV-1 inactivado en ya sea CFA, I8FA, 10-100 ug de inmunómero, o IFA más a 10-100 ug de inmunómero. Dos semanas después, los animales se aumentan subcutáneamente en la base de la cola usando el mismo régimen, excepto que los animales imprimados con antigeno Hiv-l en CFA se aumentan en su lugar con antigeno HIV-1 en IFA. Los ratones se imprimen y aumentan con antigeno HIV-1 en presencia del inmunómero. Los controles negativos se administran como salina o IFA en salina. En el dia 28, los animales se sacrifican para análisis de Gitoguina, quimoquina y anticuerpo . ELISA por anticuerpo especifico de antigeno. Se recogió sangre entera de animales inmunizados mediante punción cardíaca al final del estudio. Los tubos SST se centrifugan a 800 rpm durante 20 minutos. Los sueros se colocan en alícuotas y se almacenan a -20°C hasta que se ensayan. Las placas de PVC (placas de bifenilo policlorado, Falcon, Oxnard, California) se revisten con p24 nativo diluido en PBS a 1 ug/ml y se almacenaron a 4°C durante la noche. Las plaGas se bloquean añadiendo 200 ul por pozo de 4% de BSA en PBS durante 1 hora. Los sueros se diluyen en 1% de BSA en PBS a 1:100 seguido por dilución de cuatro veces en serie. 100 ul de sueros diluidos se añaden en duplicado y se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavan con 0.05% de Tween 20 en PBS tres veces y se secan con secante. La detección de anticuerpos secundarios (biotina IgG de cabra o antiratón de rata, biotina IgGl de cabra o antiratón de rata, o biotina de LgG2a de cabra o antiratón de rata, por ejemplo, Zymed, San Francisco, California) se diluyen en 1% de BSA en BPS. 100 ul de anticuerpo secundario diluido se añaden a cada pozo y se incuban a temperatura ambiente durante otra hora. Después de lavar el exceso de anticuerpo secundario, se añade strep-avidina-biotina-HRP (Pierce, RoGkford, Illinois) a 50 ul por pozo y se incuban durante 30 minutos. Las placas se lavan con 0.05% de T een 20 y PBS tres veces. Se añade substrato de ABTS (KPL, Gaithersburg, Maryland) hasta que se desarrolla un color azuloso-verde. La reacción se detiene mediante la adición de 1% de SDS y la placa se lee a absorción de 405 nm. La respuesta de anticuerpo reportada como titulo de anticuerpo de 50% es la recíproca de la dilución igual a 50% del enlace máximo (lectura óptica más elevada) para cada muestra dada. El valor de absorción (OD @ 405 nm) se traza Gontra dilución de anticuerpo en una escala de registro, proporcionando una curva de respuesta de dosis sigmoidal. 505 del enlace máximo se calcula multiplicando el OD más elevado por 0.5. El valor de 50% se ubica en la curva y el valor de eje x correspondiente se reporta como la dilución de anticuerpo. El Ensayo ELISA para Análisis de Citoquina y Quimoquina. Los nodos de linfo de drenaje (inguinal y popliteal superficial) se aislan de animales inmunizados dos semanas después de la promoción. Suspensiones de célula sencilla de estos nodos de linfo se preparan mediante disociación mecánica utilizando 70 um de tamiz de malla estéril. Las células T se purifican de células de nodo de linfo mediante el método de lavado. Brevemente, platos petri (100 x 15 mm) se revisten previamente con 20 ug/ml de IgG de anti-ratón de conejo durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los platos petri se lavan dos veces con PBS enfriado con hielo y una vez con 2% de suero AB humano enfriado con hielo en PBS. 1 x 107 células de nodo de linfo se añaden a las placas previamente levadas y se incuban a 4°C durante 90 minutos. Las células no adherentes (células T enriquecidas) luego se recogen y transfieren en tubos cónicos de 50 mi estériles. Las placas se lavan dos veces y se combinan con las células no adherentes . Las células luego se centrifugan y los gránulos de célula se resuspenden en medios completos a 4 x 106 células/ml (5% de suero AB humano en RPMI 1640, con 25 mM de hépes, 2 mM de L-glutamina, 100 ug de estreptomicina y 5 x 10~6 M S-mercaptoetanol) . Timocitos irradiados con gamma de un ratón C58BL se usan como células que presentan antigeno. 2 x 105 células T enriquecidas y 5 x 10s timocitos se añaden a cada pozo de una placa de fondo redondo 96. El antigeno HIV-1 y p24 nativo se diluyen en medio completo 10 ug/ml mientras que con A se diluye a 5 ug/ml. 100 ul de cada antigeno o mitógeno de célula T se añaden en triplicados. Las placas se incuban a 5% de C02f 37 °C durante 72 horas. Los sobrenadantes se recogen y almacenan a -70°C hasta que se ensayan. Los muestras se ensayan para IL-4, IFN-y y RA TES utilizando equipos comercialmente disponibles (por ejemplo, Biosource7 Camarillo, California) específicos para citoquinas y quimoquinas de ratón. Métodos estadísticos. La estadística no paramétrica Mann- hitney U se utiliza para compara grupos. Todos los valores p son de dos colas. Adyuvante de Freund Completo (CFA) es actualmente el adyuvante más potente conocido para estimular respuestas inmunes mediadas por célula. Sin embargo, CFA no es un adyuvante apropiado para uso en humanos debido a asuntos de seguridad. De esta manera, la combinación de inmunómero e IFA por uso en la composición inmunogénica de HIV proporciona vacunas seguras y efectivas para terapia humana . Para examinar la respuesta inmune relacionada con dosis a IFN-y, ratones C57BL se inmunizan con antígeno HIV-1 agotado en gpl20 inactivado, emulsionado en IFA que contiene concentraciones diferentes de inmunómero. Para examinar si también puede promover la respuesta de anticuerpo a un antígeno HIV-1,- se ensayan sueros para isotitpo total IgG y Th2 (IgGl e IgG2a) respuestas de anticuerpo a antígeno p24. De esta manera, las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden utilizar para mejorar producción de Jquimoquina en un individuo . Debido a la correlación fuerte entre niveles de ^-quimoquina y protección de invención de HIV y progresión de enfermedad, las composiciones de la invención serán -más efectivas que otras composiciones descritas para inhibir SIDA. EJEMPLO II Producción de respuestas inmunes de CD4 y CD8 mediante composiciones inmunogénicas de HIV Este ejemplo está diseñado para mostrar la inducción de funciones de ayuda de CD4 potente, respuestas inmune de tipo Thl especifico de HIV CD8, y un desplazamiento a relaciones superiores de anticuerpo IgG2a/IgGl después de la inmunización Gon una composición inmunogénica que contiene un antigeno HIV, un inmunómero y un adyuvante, Las respuestas especificas de antigeno por CD8+, linfocitos citotóxicos T son un factor importante al prevenir la inyección HIV inicial y progresión de enfermedad. De esta manera, este ejemplo proporciona evidencia adicional que las composiciones inmunogénicas de la invención son vacunas profilácticas y terapéuticas efectivas . El antigeno HIV, inmunómero e IFA se preparan esencialmente como se describe en el Ejemplo I: Ratones C57BL se inmunizan esencialmente como se describe en el Ejemplo I, y se sacrifican en el dia 28 para ELISPOT y análisis de anticuerpo p24. El análisis de anticuerpo p24 se realiza esencialmente como se describe en el Ejemplo I. ELISP0T5 para gamma-interferón de poblaciones de célula T en volumen y purificadas. Las suspensiones de célula sencilla se preparan de bazos de los ratones inmunizados adelgazando y presionando a través de un tamiz de nylon de malla fina estéril en RPMI 1640 (Hyclone, Logan, XJta ) . Los espenocitos se purifican mediante centrifugación de gradiente ficoll. Células CD4 y CD8 se aislaron mediante agotamiento de cuenta magnética» 2 x 107 células se manchan con 5 ug de CD4 anti ratón de conejo o rata o CD8 de anti ratón de conejo o rata. Las células se incuban en hielo durante 30 minutos y se lavan con 2% de suero Humano AB enfriado con hielo en PBS . Dynabeads previamente lavadas (DYNAL, Oslo, Noruega) revestidas con IgG de anti ratón de cabra se añaden a la suspensión de célula y se incuban a 4°C durante 20 minutos con mezclado constante . CD4, CD8 purificadas y espelnocitos no agotados se resuspenden en medio completo (5% de suero Humano AB inactivado en RPMI 1640, pen-strep,, L-glutamina y ß-??) a 5x10s células/ml y usadas por ensayo ELISPOT para enumerar las células . que secretan IFN-y individuales. Brevemente, placas de microtitulo de fondo de nitrocelulosa de 96 pozos (Millipore Co., Bedford, R.ü. ) Se revisten con 400 ngs por pozo de IFN-y de anti ratón de conejo (Biosource, Camarillo, California) . Después de incubación durante la noche a 4°C, las placas se lavan con PBS estéril y se bloquean con suero AB humano al 5% en RPMI 640 que contiene pen-strep, l-glutamina y ß-??) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan con E?BS estéril y 5xl05 por pozo de espelnocitos (CD4 purificado, CD8 purificado o no agotado) se añadieron en triplicado y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5% de CO2. Las células se cultivan con medio, OVA (ovalbúmina de huevo de pollo, Sigma-Aldreich, St. Louis, Missouri), p24 nativo o antigeno HIV-1 agotado en gpl20. Esplenocidos de CD4 purificado y CD8 purificado se ensayan en medio completo que contiene 20 unidades/ml de IL-2 de rata recombinante (Pharmingen, San Diego, CA) . Después de lavar células no ligadas, 400 ng por pozo del IFN-y anti ratón de conejo policlonal se añaden y se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas, luego se lavan y manchan con biotina IgG anti ratón de cabra (Zymed, San Francisco, California) . Después de extensas lavadas con PBS estéril, complejo de fosfatase alcalina de avidina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se añaden e incuban durante otra hora a temperatura ambiente. Las manchas se desarrollan añadiendo substrato de fosfato alcalino cromogénico (Sigma, St. Louis, MO) , y las células IFN-y se cuentan utilizando un microscopio de disección (X 40) con una fuente de luz de luz elevada 3000 (Olympus, Lake Success, NY) . Métodos Estadísticos, La estadística no paramétríca Mann-whitney ü se utiliza para comparar los grupos. La correlación de rango Spearman se realiza para examinar las relaciones entre producción de interferón gamma CD4 y CD8. Todos los valores p son de dos colas. La producción de IFN-y por esplenocitos no agotados, y por CD4+ purificado o poblaciones de CD8+ purificadas, se examina. La producción de IFN-y mediante células CD4+ es una respuesta inmune Thl característica, mientras que la producción de IFN-y por células CD8+ es una correlación de actividad citolitica de linfocito T citotóxico (CTL) . También se examina IgG, IgGl e IgG2b total específico para p24. En resumen, este Ejemplo muestra que una composición inmunogénica que contiene un antígeno HIV, un inmunómero y un adyuvante se puede utilizar para generar respuestas inmunes específicas de HIV de CD4 y CD8 específicas de HIV potentes. La inducción de células de ayuda CD4 T puede ser pivotal para generación de células de efecto CD8. Las células CD8 pueden servir como efectores contra virus HIV mediante varios mecanismos, incluyendo actividad citolitica directa (CTL), así como a través de la liberación de factores supresores antivirales, tales como ?-quimoquinas y otros factores menos bien caracterizados. Consecuentemente, las composiciones descritas en la presente son superiores a otras composiciones descritas para uso como vacunas de HIV. EJEMPLO III Comparación de respuestas inmunes producidas por diferentes composiciones inmunogénicas y programas de inmunización. Este ejemplo está diseñado para mostrar que un ácido nucleico que contiene un inmunómero es más efectivo al producir respuestas inmune protectoras, incluyendo producción de R¾ TES y producción de anticuerpo IgG2b especifico de HIV, cuando se administran simultáneamente con antigeno HIV y un adyuvante que cuando se usan para imprimar al mamífero una semana antes de la administración del antígeno y adyuvante. Este ejemplo también muestra que una composición que contiene un antigeno HIV, un inmunómero y un adyuvante promueve proliferación de linfocito dependiente de antígeno más efectivamente que una composición que contiene solamente HIV e IFA. El antigeno HIV, inmunómeros e IFA se preparan esencialmente como se describe en el Ejemplo I. Ratones C57bBL (cuando menos tres por grupo) se inmunizan en el día 7 y, cuando se indica, se imprimen., en el día 0, con las siguientes composiciones mostradas en el Cuadro 1. Cuadro 1 Grupo Día 0 Día 7 A Inmunómero HIV-1 B HIV-1 C Inmunómero HIV-1/IFA D ' HIV-1/IFA E HIV-1/1FA/Inmunómero Los animales se sacrifican en el día 21 para análisis de citoquina, quimoguina y anticuerpo, esencialmente como se describe en el Ejemplo I, asi como para análisis de proliferación de linfocito. Ensayo de proliferación de linfocito. Se preparan suspensiones de célula sencilla de los nodos de lindo de drenaje de animales inmunizados. Células B se agotan de las células de nodo de linfo mediante separación. Brevemente, las células de nodo de linfo se incuban con IgG de anti ratón en platos petri previamente revestidos durante 90 minutos. Las células no adherentes (células T enriquecidas) se recogen y resuspenden en medio de cultivo de tejido completo a 4xl06 células/ml. Las células T enriquecidas se cultivan con p24 o antigeno HIV-1 en presencia de' timocitos gamma-irradiados a 37 °C, 5% de C02 durante 40-48 horas. Las muestras se impulsan con timidina tritiada y se incuban durante otras 16 horas. Las células se recogen, y la incorporación de timidina tritiada se cuenta utilizan contador de destello beta. La producción de citoquina en células T, por ejemplo, IFN-y y -quimoquinas tales como RANTES, MIP-1?, y ???-? se determina utilizando métodos bien conocidos por aquellos expertos en el ramo. Los niveles de suero de IgG, IgGl e IgG2b total específicos para p24 también se examinan. Además, las respuesta proliferantes de célula T a antígeno p24 y a HIV pgl20-agotado se examinan. De esta manera, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden producir efectivamente citoquina Thl específica de HIV (IFN-y) y respuestas humorales (anticuerpos IgG2), y pueden mejorar la producción tanto no especifica como específica de ?-quimoquina específica de HIV. Estos respuestas a las composiciones inmunogénicas se correlacionan con respuestas proliferantes de linfocito T específico de HIV fuertes. EJEMPLO IV Inmunización de un primate con una composición inmunogénica de HIV. Este ejemplo está diseñado para mostrar que las' composiciones inmunogénicas que contienen un antígeno HIV, un inmunómero y un adyuvante son efectivas al mejorar respuestas inmune específicas de HIV en primates . Tres fetos de macaco se inyectan en útero con una composición inmunogénica que contiene HIV-1 agotado en gpl20 (100 ug total de proteína, equivalente a 10 unidades p24) en IFA con 500 ug de inmunómero. Cuatro semanas después, los fetos se promueven utilizando el mismo régimen.

Las células mononucleares de sangre periférica de los macacos neonatales se recogen, y se ensayan las respuestas proliferantes a p24 y antigeno HIV-1. La producción de anticuerpos específicos de HIV, citoquinas y ?-quimoquinas también se miden en los mismos macacos. Estos resultados muestran que los tipos de respuestas inmunes producidas por las composiciones inmunogénicas descritas en los Ejemplos I-III anteriores, para roedores, también se producen en primates. Estos resultados demuestran que las composiciones inmunogénicas de HIV y métodos de la invención son efectivos en primates al estimular respuestas Inmuno específicas de HIV, Además, estos resultados demuestran que los fetos y bebés son capaces de. producir respuestas fuertes inmunes a HIV a las composiciones inmunogénicas de la invención, indicando que estas composiciones serán útiles para prevenir transmisión materna de HIV y como vacunas pediátricas. EJEMPLO V Respuesta inmune a vacuna con inmunógeno HIV agotado en gp!20 inactivado, combinado con inmunómero en un modelo de rató ¿ Ratones C57BL/6 (6-8 semanas de edad) se inyectan como se indica abajo. El número por grupo es generalmente Guando menos 8-10 ratones. 1) PBS 2) Inmunómero a 30 ug por ratón = 1.5 mg/kg 3) Inmunómero (dosis más elevada de 90 ug) = 4.5 mg/kg 4} Inmunógeno HIV-1 (10 ug) 5) Inmunógeno HIV-1 + Inmunómero 810 ug,- 30 ug, 90 ug) 6) Inmunógeno HIV-1 + Inmunómero 30 ug El antlgeno HIV-1 agotado en gpl20 se diluye en salina tamponada con fosfato (PBS) a concentración de 200 ug/ml y se emulsiona en volúmenes iguales de IFAr con y sin inmunómero. El inmunómero se añade al antigeno HIV-1 diluido antes de la emulsión en un volumen de cuando menos 5% del volumen final. Una inyección intradérmica sencilla inicial se realiza en el tiempo 0 seguida por inyección intradérmica después de 2 semanas. Los ratones se sacrifican 2 semanas después de la inyección de promoción. El inmunógeno HIV-1 es antigeno HIV-1 agotado en gpl20 inactivado en IFA. Análisis inmunológicos . Células mononucleares de bazo frescas se aislan y estimulan in vitro durante 4 dias (Davis y col,, J, Immunol. 160:870-876 (1998). Las células aisladas se estimulan en medio solo; con antigeno p24 nativo; o con antigeno HIV-1. La producción de varias citoquinas se evalúan usando métodos ELISA. Las citoquinas de ejemplo a ensayar incluyen, por ejemplo, ????, IL-12, IL-4, IL-5, IL-10, ????a, KI?lßr RANTES, -defensina como se describe en la presente y se describió anteriormente, y se ensayan mediante métodos bien conocidos por aquellos expertos en el ramo . La producción de antigeno p24 y de IFNy especifica de antigeno HIV-1 en linfocitos de CD4 y CD8 se evalúa en ensayos ELISPOT, como se describe en los Ejemplos I y II. La proliferación de antígeno p24, antigeno HIV-1 y linfocito especifico de LPS se evalúan en un ensayo de proliferación convencional utilizando métodos bien conocidos. EJEMPLO VI Efecto in vitro de inmunómero en respuesta inmune especifica de HIV generada por PBMCs de pacientes infectados con HIV previamente inmunizados con inmunógeno HIV-1. Este ejemplo describe la evaluación de la capacidad de un inmunómero de aumentar respuestas inmunes especificas de HIV in vitro en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes que han sido tratados con antigeno HIV-1 agotado en gpl20 inactivado en IFA (REMU E) .

Los siguientes grupos de pacientes se examinaron, 15 infectados con HIV, pacientes tratados con HAART + REMUNE; 15 infectados con HIV, pacientes tratados con HAART. Los pacientes se hacen coincidir para duración de enfermedad, cuentas de CD4, viremia HIV, y ausencia/presencia de inhibidor de proteasa (PI) . Sangre entera 8530 mi) se retira por venipunción en tubos que contienen EDTA para análisis subsecuente. El inmunómero se añade a las PBMCs a las siguientes concentraciones: 0.1 ug/ml, 1.0 ug/ml, 10.0 ug/ml. Las respuestas especificas a diversos antigenos se miden, por ejemplo, antigenos HIV antigeno p24, antigeno HIV-1, péptidos env, péptidos gag, y flu (antigeno de control) . Otros antigenos HIV también se pueden medir, si se desea. La producción de IFNy especifica de antigeno en. linfocitos CD4 y CD8 se evalúa en ensayos ELISPQT, como se describe en los Ejemplos I y II. La proliferación de linfocito especifico de antigeno se evalúa en un ensayo de proliferación convencional. La producción de RANTES, -defensina se evalúa mediante manchado intracelular en CD8+ con métodos de clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS) . Si se desea, otras citoquinas y otros tipos de célula se pueden ensayar. EJEMPLO VII Efecto in vivo de inmunómero de respuesta inmune especifica de HIV en modelo de murina de Trímera Este ejemplo describe el uso de un modelo de ratón Trímera para determinar el efecto de una composición inmunogénica HIV que contiene inmunómeros. Un modelo de ratón Trímera se utiliza para probar el efecto de inmunómeros cuando se combina con un antígeno HIV. Ambas respuestas inmune inducidas así como inmunidad protectora se pueden supervisar. Ratones Trímera se generan GQIUQ se describió previamente (Reisner and Dagan, Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998); lian y col., Curr. Opín. Mol Ther. 4:102-109 (2002); Patente de E.ü.A. No. 6,254,867; WO 97/47654). Brevemente, un huésped de ratón normal se hace inmuno-incompetente mediante una irradiación de cuerpo total de dosis dividida letal . Los ratones luego se radioprotegen mediante médula espinal de hueso SCID de murina agotada en célula T y se convierten en ratones Trímera mediante inyección intraperitoneal de leucocitos mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) . El injerto de las células humanas en los ratones Trímera se verifica mediante análisis de clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS) de marcadores de célula T humana tal como CD3 u otros. Los ratones Trímera se infectan con HIV como un modelo de SIDA. Brevemente, los ratones Trímera se infectan con una o más cepas de HIV-1. Los animales de control son ratones Trímera inyectados con medio solamente (sin HIV-1) y ratones no inyectados con PBMCs. Los ratones se evalúan en diversos puntos de tiempo para infección de HIV-1 determinando los niveles de HIV-1 RNA en plasma, la presencia de ADN proviral, y virus activo en experimentos de cocultivo. La presencia de HIV-1 ADN proviral se demuestra mediante PCR de una secuencia de HIV-1 tal como gag. Para probar una com osició inmunogénica que contiene un inmunómero para estimulo de una respuesta inmune,- los ratones Trímera se inyectan con HIV-1 agotado en gpl2Q, con o sin cuando menos un inmunómero y con o sin adyuvante. Diversas relaciones de antigeno e inmunómero se pueden utilizar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo V, y se prueba para una respuesta inmune optimizada. Alternativamente, las composiciones anteriores se impulsan hacia células dendriticas derivadas de monocito autólogo humanas (Des), y estas Des se inyectan en los ratones Trimera. Opcionalmente, los ratones se pueden promover con una composición similar. Después de la inmunización, linfocitos de sangre y peritoneales se recogen. La presencia de inmunoglobulinas específicas para antígenos HIV se determina. Además, respuestas contra HIV celular especificas se determinan en linfocitos humanos aislados de los ratones. Por ejemplo, la producción de IFNy en linfocitos humanos recuperados de los ratones Trímera se determina siguiendo la exposición a antígenos HIV-1, La respuesta inmunogénica mejorada a antigeno HIV en presencia de iniuunómero se determina. La inmunidad protectora se supervisa de una manera similar, excepto que los ratones se inmunizan con las diversas composiciones antes de la inoculación con HIV infeccioso. La capacidad de las diversas composiciones de influenciar el nivel de viremia siguiente se mide, como se describe arriba. La vacuna más eficaz es la que proporciona el Gontrol más efectivo de virus circulante y/o prolongar la supervivencia . EJEMPLO VIII Inmunización de pacientes infectados Gon HIV con REMUNE1® Este ejemplo describe la inmunización de pacientes infectados con HIV con REMUNE*® (antigeno HIV-1 agotado en GP120 en IFA) y demuestra que la mayoría de los pacientes pueden montar respuestas inmunes, aún cuando a resistencias y duraciones variables. El objetivo de este estudio particular fue evaluar respuestas inmunológ cas específicas de HIV-1 después de tratamiento con REMUNE en combinación con terapia retroviral altamente activa (HAART) (indinvir / ACV /2TC) comparada con Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) más HAART. El protocolo de estudio fue un estudio de múltiples centro, controlado por adyuvante, grupo paralelo, de dos brazos, doble ciego, aleatorio. El número de sujetos (total y para cada tratamiento) fue 52 pacientes al azar, con 43 pacientes evaluables en intento de tratar análisis (22 REMÜNE + HAART; 21 IFA + HAART) . El diagnóstico y criterios para inclusión fue pacientes infectados con HIV-1 con cuentas de CD4 >350 células/uL sin uso previo de inhibidores de proteasa de HIV o lamivudina (3TC) . El producto de prueba, dosis y modo de administración fueron REMUNE (Inmunómero HIV-1); 10 unidades (igual a 10 ug/ml de contenido de p24), volumen de 1.0 mi dado IM (lote No. 8155-015 y 8155-017). Para duración de tratamiento, los pacientes recibieron HAART durante 32 semanas, REMUNE o placebo IFA (control) se proporcionó en las semanas 4, 16 y 28. La terapia de referencia, dosis, y modo de administración fueron controlados por adyuvante; el placebo IFA se utilizó (lotes Nos: 8144-006 y 8160-005). El criterio de eficacia primaria fue respuestas proliferantes de linfocito (LP) a estimulo de antigeno HIV-1 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) . El criterio de eficacia secundaria incluyó respuesta de LP a p24 nativo y estimulo de BaL antigeno HIV-1 en PBMC; la respuesta de quiraoquina a p24 nativo y estímulo de antigeno HTV en PBMC; actividad de gag CTL (en un subjuego de pacientes); cambios en cuenta de célula CD4 y por ciento de CD4; cambios en carga viral medida en RNA de plasma y ADN de PBMC; y respuesta de prueba de piel DTH a antigenos HIV-1 y p24. Los métodos estadísticos usaron fueron Fisher' s Exact Test (dos colas) en un análisis de intento de tratar la prueba Mann-Whitney de dos lados. El análisis primario definió régimen de respuesta como índice de estímulo (SI) a antígeno HIV-1 cinGO veces sobre la línea de base en dos puntos de tiempo. Los resultados mostraron que hubo 14/22 (64%) que respondieron en el grupo REMUNE + HAART y 4/21 (19%) que respondieron en el grupo IFA + HAART (p = 0.005) . El análisis secundario definió el régimen de respuesta como SI a antígeno HIV-1 tipo BAL y/o antígeno p24 tres veGes sobre la línea de base en dos puntos de tiempo. Los resultados mostraron que hubo 15/22 (68%) que respondieron en el grupo de REMÜNE + HAART y 5/21 (24%) que respondieron en el grupo IFA + HAART (p=0.006). La magnitud de la respuesta LP a antígeno HIV-1 (HZ321) entre sujetos que reciben REMÜNE + HAART fue mayor que entre aquellos que reciben IFA + HAART (p=0.0028), definido como la relación para cada sujeto del SI de medio geométrico medido después de la primera inyección al medio geométrico de valores antes de tratamiento.

Hubo un régimen de respuesta de LP mayor estadísticamente significativo a p24 nativo (p=0.0002) y a antígeno HIV-1 BaL (p=0.007) en el REMUNE + HAART comparado con el grupo IFA + HAART. No hubo diferencias en régimen de respuesta LP para recordar antígenos (candida, estreptoquinasa, tétano) entre los dos grupos. La producción de MIP-l/¾por PBMC estimulada con antígeno HIV-1 aumentó significativamente en el grupo REMUNE + HAART (p=00007 en la semana 32) comparada con el grupo IFA + HAART. Hubo un mayor régimen de respuesta de prueba de piel DTH en el grupo de REMUNE + HAART comparado con el grupo IFA + HAART para antígenos HIV-1 (53% contra 9%) y p24 nativo (47% contra 0%) . La administración de REMUNE más ZDV/3TC/indinavir resultó en un estímulo significativo de respuestas de proliferación de linfocito (LP) a antígeno HIV-1 en términos de ambos, el número de los que responden y magnitud de la respuesta. Para régimen de respuesta, definido como índice de estímulo a antígeno HIV-1 cinco veces sobre la línea de base en dos puntos de tiempo, hubo un número significativamente superior de los que responden (p=0.005) en el grupo REMUNE más ZDV/3TC/indinavir (14/22, 64%) que en el grupo IFA más ZDV/3TC/indinavir (4/21, 19%) . Un porcentaje elevado de sujetos que reciben REMUNE generaron fuerte respuesta LP a antígeno p24 nativo, demostrando que EMUNE puede generar respuestas específicamente a los antigenos de núcleo más conservados de HIV. El tratamiento con IFA no estimuló respuestas inmunes especificas de HIV-1 a ningún antigeno. REMÜNE más ZDV/3TCD/indinavir produjo un régimen de respuesta de proliferación de linfocito signi icativamente superior a p24 nativo purificado (p = 0.0002). la administración de REMÜNE estimuló respuestas LP al antigeno de inmunización HIV-1 (HZ321) asi como a un antigeno HIV-1 que es clade B, antigeno HIV-1 BaL7 demostrando que las respuestas inmune generadas por REMUNE son clade cruzado y no limitadas al agente de inmunización. REMUNE más ZDV/3TC/indinavir produjo una régimen de respuesta de proliferación de linfocito significativamente superior a antigenos HIV-1 BaL (p=0.007) comparado con IFA más ZDV/3TC/indinavir. La producción de ???-lyf? estimulada por antigeno ' se aumentó significativamente en el grupo de REMUNE más ZDV/3TC/indinavir a través del estudio (p=0.0007 en la semana 32) y no cambió en el grupo IFA más ZDV/3TC/indinavir durante el estudio. Los sujetos en ambos grupos mostraron aumentos significativos en cuenta de célula CD4 y disminuciones significativas en HIV RNA den plasma y número de copia de HIV ADN proviral. Hubo una tendencia de menos riesgo de reGaida en el grupo de REMUNE más ZDV/3TC/indinavir en un análisis de tiempo a recaída de HIV RNA 6/22 (27%) de REMUNE más ZDV/3TC/indinavir los sujetos recayeron entre la Semana 16 y 32 contra 12/21 (57%) de los sujetos de IFA más ZDV/3TC/indinavir (p=Q„08 mediante prueba de rango de registro) . Una respuesta más fuerte, más duradera se espera administrando las composiciones inmunogénicas de la invención que incluyen un antígeno HIV tal como REMUNE y uno o más inmunómeros. Estos resultados demuestran que REMUNE estimula una respuesta inmune en la mayoría de los pacientes. EJEMPLO IX Inmunización de pacientes infectados con HIV con REMUNE"11 e Inmunómeros Este ejemplo describe la inmunización de pacientes infectados con HIV con REMUNE e inmunómeros. Se condujo un estudio con el objetivo de evaluar las respuestas inmunológicas específicas de HIV-1 después de tratamiento con REMUNE en combinación con inmunómeros y/o terapia retroviral altamente activa (HAART) (indinavir/ZDV/3TC) comparado con Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) más inmunómeros y/o HAART. La metodología utiliza un estudio controlado por adyuvante, de grupo paralelo, dos brazos, doble ciego, aleatorio. El diagnóstico y criterio para inclusión de pacientes infectados con HIV-1 son pacientes con cuentas de CD4 >340 Gélulas/uL sin uso previo de inhibidores de proteasa de HIV o lamivudina (3TC) . Otro criterio para seleccionar pacientes también se puede utilizar. El producto de prueba, dosis, y modo de administración son REMU E (Inmunógeno HIV-1); 10 unidades (igual a contenido de 10 ug/m.1 p24), volumen de 1.0 mi dado IM. Una dosis de inmunómero entre aproximadamente 1 a 5 mg/kg se administra. Otras dosis de inmunómero, ya sea mayor o menor, también se puede probar para mejora efectiva de una respuesta inmune. Para duradón de tratamiento en padentes que se están tratando con HAART, los pacientes reciben HAART durante 32 semanas. REMUNE o placebo IFA (control) e inmunómero se proporciona en las semanas 4, 15 y 28. La terapia de referencia, dosis y modo de administración, son control de adyuvante, en el que el placebo IFA se utiliza. El criterio para evaluación es similar a" aquel descrito en el Ejemplo VIII para eficacia y seguridad. Además, los ensayos para determinar una respuesta inmune se pueden incluir, por ejemplo, interferon ALISPOT, relaciones de anticuerpo IgGl/IgG2, ensayos ELISA para producción de citoquinas, ensayo de proliferación de linfocito, estimulo de células de bazo, y lo semejante, como se describe en la presente y se describió en los Ejemplos I-III y V. La combinación de inmunómeros con REMUNE u otro antigeno HIV se espera que mejore la respuesta inmune en comparación con antigeno HIV sin inmunómeros. De esta manera, la respuesta inmune en el presente ejemplo se espera que sea más fuerte y/o tenga una duración más prolongada que aquella observada en el Ejemplo VIII. Este ejemplo describe el efecto mejorado de administrar antigeno HIV con inmunómero para estimular una respuesta inmune en pacientes infectados con HIV, EJEMPLO X Antigeno HIV-1 con un Inmunómero Produce Inmunidad especifica de HIV. Este ejemplo describe el uso de antigeno HIV y un inmunómero para estimular la inmunidad especifica de HIV. El Inmunógeno HIV-1 es un candidato de vacuna de virus exterminado entero agotado en gpl20 formulado con Adyuvante de Freund Incompleto (IFA), previamente reportado que induce respuestas inmunes especificas de HIV-1; oligonucleótidos sintéticos que contienen motivos de dinucleótido de citosina-guanina (CpG) inmunoestimulantes son estimuladores potentes de respuestas inmunes mediadas por célula. La posibilidad de generar inmunogenicidad mejorada de Inmunógeno HIV-1 en combinación con un adyuvante inmunómero (AmplivaxMR) se estudió en un modelo de ratón. En experimentos subsecuentes, se verificó que respuestas inmunes especificas de HIV se pudieron producir por el virus exterminado entero agotado en gpl20 sin IFA (Antigeno HIV-1) + Amplivax1®. En estos estudios, el inmunógeno HIV-1 usado fue vacuna de virus exterminado entero agotado en gpl20 formulada con Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) . Los experimentos se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo V. Este inmunógeno induce respuestas inmunes específicas de HIV. Amplivax™1 es un oligonucleótido inmunomodulador, también mencionado en 1 presente como un inmunómero, que contiene una estructura novedosa y un motivo inmunomodulador sintético» Este inmunómero induce perfiles inmunoestimulantes distintos. La Figura 2 muestra un diagrama esquemático del inmunómero Amplivax1*1, también denominado como HYB2055. HYB2055 es un oligonucleótido inmunomodulador (IMO) de segunda generación que consiste de una estructura novedosa de motivo inmunoestimulante, CpR, sintético. Este inmunómero estimula el sistema inmune señalando a través de TLR9 y induce respuestas inmunes de Thl. El inmunómero muestra estabilidad metabólica mejorada. Una prueba de fase I en voluntarios saludables se ña completado. Estos estudios de ratón se iniciaron para evaluar la capacidad de Amplivax"11 (HYB2055) para mejorar la inmunogenicidad de vacuna exterminada completa de HIV-1 en IFA (inmunógeno HIV-1) en un modelo de ratón» Estos estudios también examinaron si respuestas inmunes específicas de HIV se pueden producir por el virus exterminado completo sin IFA (antígeno HIV-1) usado en combinación con Amplivax1^. Brevemente, ratones C57/BL6 se inmunizaron subcutáneamente (SC) o intramuscularmente (IM) (día 0 y 14) con 10 ug de vacuna exterminada entera de HIV en adyuvante de Freund incompleto (IFA) (Inmunógeno HIV-1) más tres dosis de Amplivax™- (90, 30 o 10 ug/ratón) o con vacuna exterminada completa de HIV (Antígeno HIV-1 sin IFA, 10 ug/ratón) y Amplivax^1 (90 ug/ratón). Los animales inmunizados con Inmunógeno HIV-1, con Amplivax1® solo, o con PBS se usaron como controles (8-10/grupo) . El inmunómero de ratón HYB 2048, se uso como un compuesto de referencia. Los ratones se sacrificaron en el día 28. La producción de citoquina estimulada por antígeno HIV-1 y p24 y células T que secretan IFNy se evaluaron en células mononucleares de bazo frescas. La producción de anticuerpo p24 se evaluó en suero. Como se muestra en la Figura 3, el Inmunógeno HIV-1 induce producción de RANTES específico de HIV, ????a. ???? . IL-10 e IL-5. El Cuadro 2 muestra que la combinación de Inmunógeno HIV-1 y Amplivax1*1 desplazó citoquina hacia respuestas tipos Thl . El inmunógeno se administró SC. Los valores mostrados son valores medios. Cuadro 2 IFN-y RANTES ??-1a ???-?ß IL-10 IL-5 Perfil pg/ml pg/ml pg/ml pg/ml pg/ml pg/ml de cito- quina Inmunógeno HIV-1 solo 12 101 28 317 67 644 Th2 Inmunógeno HXV-1 más Amplivax 1783 700 83 438 257 6 Thl Amplivax solo 0.06 107 27 91 3 - - Un análisis similar se muestra en el Cuadro 3, que también muestra la relación de Estimulo de IFN-y a IL-5, fue con antigeno HIV-1. IFN-y e IL-5 se midieron mediante ELISA. Cuadro 3 IFN-g IL-5 IFN-g/IL-5 Perfil de pg/ml pg/ml pg/ml Citoquina Inmunógeno HIV-1 12 644 0.02 Tipo Th2 Inmunógeno HIV-1 + Amplivax 1828 5.7 321 Tipo Thl Amplivax .064 5.4 La Figura 4 muestra producción de IFNy especifico de HIV se mejora mediante Amplivax™ en una manera dependiente de dosis. La cantidad de inmunómero utilizada se muestra entre paréntesis (ug/ratón) . Resultados similares se vieron para RANTES, ????a, MIPl/? e IL-10. La Figura 5 muestra el efecto de Amplivax"1 en niveles de producción inducida por inmunogeno HIV-1 de RANTES, ????a, MIPl?, IL-10 e IL-5, La Figura 6 muestra que la producción de IFNy específico de HIV se mejora mediante Amplivax1® (datos mostrado para ug/ratón de Amplivax11111) . Resultados similares se encontraron para RANTES, ????a, MIPl/? e IL-10» Como se muestra en la figura 7, Amplivax1® tiene un efecto de mejora sobre células T que secretan IFNy específica de HIV en un ensayo Elispot. El inmunogeno se administró subcutáneamente. La cantidad de inmunómero usado se muestra entre paréntesis (ug/ratón) . La Figura 8 muestra que la producción de IFNy específico de HIV se mejoró mediante AmplivaxMR de una manera dependiente de dosis. La cantidad de inmunómero usada se muestra entre paréntesis (ug/ratón) . La Figura 9 muestra que la producción de RANTES específico de HIV se mejoró mediante' AmplivaxMR de una manera dependiente de dosis, La Figura 10 muestra que la producción ???-? específico de HIV se mejoró mediante Amplivax™ de una manera dependiente de dosis . La cantidad de inmunómero usado se muestra entre paréntesis (ug/ratón). La Figura 11 muestra que la producción de MIP-1/? específica de HIV se mejoró mediante Amplivax1* de una manera dependiente de dosis. La cantidad de Inmunómero usada se muestra entre paréntesis (ug/ratón) . La Figura 12 muestra que la producción de IL-10 especifica de HIV se mejoró mediante Amplivaxw en una manera dependiente de dosis» La cantidad de inmunómero usada se muestra entre paréntesis (ug/ratón) . La Figura 13 muestra que la producción de IL-5 especifica de HIV se redujo mediante Amplivax^ proporcionada subcutáneamente. La cantidad de inmunómero usada se muestra entre paréntesis (ug/ratón) . La Figura 14 muestra el efecto de Amplivax^ sobre títulos de anticuerpo p24 inducido por inmunógeno HIV-1 en ratones . La cantidad' de inmunómero usado se muestra entre paréntesis ,(ug/ratón) , La Figura 15 muestra que vacuna exterminada completa de HIV-1 en IFA (inmunógeno HIV-1) indujo producción de citoquina especifica de HIV durante administración subcutánea (SC) e intramuscular (IM) . La Figura 16 muestra que AmplivaxMR se puede añadir antes o después de emulsión con IFA y mejorar la producción de IFNy. La Figura 17 muestra que Amplivax*® se puede añadir antes o después de emulsión con IFA y mejora producción de RANTES . Como se muestra en el Cuadro 4, la combinación de Inmunógeno HIV-1 y Amplivax1-ÍR desplaza el perfil de citoquina hacia respuestas tipo Thl. Cuadro 4 Relación de Relación de Perfil de IFN-y/IL-10 IFN-y/IL-5 Citoquina Inmunogeno HIV-1 1,42 0,02 tipo T 2 Inmunógeno HIV-1 + Amplivaxm 74,04 321 tipo Thl Amplivax1* La Figura 18 muestra que vacuna exterminada entera HIV-1 con Amplivax1^ disparó producción de IFNy especifica de HIV en ratones inmunizados subcutáneamente sin IFA. La Figura 19 muestra que vacuna exterminada entera HIV-1 con Amplivax"11 disparó actividad de célula CD8+ T que secreta IFNy especifica de HIV en ratones inmunizados subcutáneamente sin IFA. La Figura 20 muestra que vacuna exterminada entera de HIV-1 con Amplivax^ disparó producción de RA TES específico de HIV en ratones inmunizados subcutáneamente sin IFA. Los ratones C57/BL6 inmunizados subcutáneamente con una combinación de Inmunógeno HIV-1 y AmplivaxMR mostró producción específica de HIV significativamente mejorada de anticuerpo p24, IF -y específico de HIV (tanto cantidad como número de células CD4 y CD8 T que lo producen) , quimoquinas (RANTES, ???-? , ???-1?) , e IL-10 cuando se compara con Inmunógeno HIV-1 o Amplivax141 solo. De manera importante, las mejoras por Amplívax1® todavía se observaron si el antígeno HIV-1 no se emulsionó con IFA. La inmunización con ambas combinaciones de Amplivax*® + Inmunógeno HIV-1 y Amplivax1* + Antígeno HIV-1 mejoró producción especifica de HIV y de p24 de XFNy, RANTES, MIP la. MIP 1ß e IL10 asi como el número de células productoras de IFNy comparadas con Inmunógeno HIV-1 o Amplivax solo. La magnitud de respuestas inmunes observadas en ratones inmunizados con el Inmunógeno HIV -1 o con el Antigeno HIV-1 en combinación con Amplivax fue comparable . Estos resultados muestran que la inmunización con Inmunógeno HIV-1 más Amplivax5® mejoró significativamente producción especifica de HIV de IFNy, RANTES, MIP-l , MIP-1? e IL10 asi como el número de células productoras de IFNy comparado con Inmunógeno HIV-1 o AmplivaxMR solo. La magnitud de respuestas inmunes observadas en ratones inmunizados con antigeno HIV-1 y Amplivax1* (sin IFA) fue comparable con las respuestas obtenidas con Inmunógeno HIV-1 (Antigeno HIV-1 más IFA) y Amplivax^. El Amplivax1® en asociación con la vacuna de virus exterminada completa produce fuertes respuestas inmunes especificas de HIV independientemente del uso de IFA. Amplivax en asociación con ya sea Inmunógeno HIV-1 o antigeno HIV-1 produce fuertes respuestas inmunes especificas de virus independientemente- del uso de IFA. La inmunogenicidad fuerte de la combinación de HIV-1 + Amplivax garantiza su uso como una vacuna terapéutica para pacientes infectados con HIV.

EJEMPLO XI El Efecto de Inmunógeno HIV en Combinación con un Inmunomero o respuestas Inmunes especificas de HIV in vitro Utilizando Células Mononucleares de Sangre Periferia Humana. Este ejemplo describe el efecto de Amplivax1411 en respuestas inmunes especificas de HIV in vitro en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) . Estos estudios se iniciaron para evaluar si Amplivax™ podía aumentar respuestas inmunes especificas de HIV in vitro de PBMCs humanas de pacientes infectados con HIV tratados con antiretroviral, que fueron o no inmunizados con vacuna exterminada entera de HIV-1. Amplívax1* se investigó ex vivo por su capacidad de mejorar el estímulo de antígeno HIV de PBMC aislada de HIV + pacientes tratados con terapia antiretroviral (ART) . Los pacientes fueron no inmunizados o previamente inmunizados con Inmunógeno HIV-1. Ambos grupos de pacientes tuvieron cuentas de CD4 comparables, viremia de plasma de HIV, duración de infección, y ART. Los resultados mostraron que Amplivax1* indujo respuestas inmunes mediadas por célula específica de HIV más fuertes en pacientes vacunados con Inmunógeno HIV-1, como se mide por manchas totales producidas en el ensayo ELISPOT de IFNy y un porcentaje superior de células productoras de alfa defensina, Jtoi os efectos fueron más evidentes utilizando 1 ug/ml de ¾mplivaxMR. Brevemente, los pacientes hablan sido vacunados con 6-24 dosis de vacuna exterminada entera de HIV (REMÜNE(r) = Inmunógeno HIV-1) . La última dosis se proporcionó 6-8 meses antes de recolección de sangre. Los pacientes no vacunados se emparejaron para CD4, viremia HIV y exposición a HAART. Se añadió Amplivax1^ a PBMCs a 4 concentraciones (0, 0.1, 1.0 y 10 ug/ml). Las células se estimularon con antigenos HIV-1, nP24, gag y flu. La evaluación de CD8+, células productoras de IFNy se llevó a cabo mediante ELIspot . El análisis de células productoras de a-defensiva fue mediante métodos de clasif cación de célula activada por fluorescencia (FACS) . La Figura 21 muestra que porcentajes de células CD8+ T productoras de a-defensina se aumentan por Amplivax"5 añadidas ex vivo. La Figura 22 muestra células CD8+ T productoras de IFNy especificas de HIV en pacientes tratados con REMUNE(R), y controles positivos de HIV (sin Amplivax1^) . La Figura 23 muestra células CD8+ T productoras de IFNy especificas de HIV en presencia de 0.1 ug/ml de Amplivax1* añadido ex vivo. La figura 24 muestra células CD8+ T productoras de IFNy especificas de HIV en presencia de 1 ug/ml de ArnplivaxMR añadido e vivo. La Figura 25 muestra células CD8+ T productoras de IFNy específica de HIV en presencia de 10 ug/ml de Am livax^ añadido ex vivo. La Figura 26 muestra ensayo ELIspot de IFN-yen células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) . Se usó HYB2055 a 1 ug/ml. Se han generado datos preliminares para REMUNEÍR) (inmunógeno HIV-i más IFA) en pacientes inocentes de HAART. La prueba, cuando se completa, supervisará cincuenta sujetos Hiv-l positivos con HIV-1 R A en la escala de 10,000 - 40,000 copias/mL y células CD4 por encima de 350 células/uL. Los pacientes fueron aleatorios en tres grupos: REMUNEÍR> (inmunógeno HIV-1 en IFA); adyuvante IFA; o salina. Los cambios fenotipicos en células CD4 T (Figura 27) y para células CD8 (Figura 28) se observaron después de la primera inyección de REMÜNE(R) en terapia antiretroviral (ART) en pacientes inocentes. Los datos preliminares en los primeros pocos pacientes se muestran. Los pacientes adicionales se analizarán de manera similar. Los datos preliminares de un prueba clínica en marcha en pacientes inocentes de droga + HIV sugieren que el Inmunógeno HIV-1 también tiene un efecto positivo sobre la generación de respuestas inmunes específicos de HIV en esta población de pacientes. El efecto de mejora potencial de Amplivax™ se examinará en un rollo sobre prueba en estos mismos pacientes añadiendo m livax^ al Inmunógeno HIV-1 como parte de la vacuna. A través de esta solicitud, se ha hecho referencia a varias publicaciones. Las exposiciones de estas publicaciones en su totalidad se incorporan por la presente por referencia en esta solicitud a fin de describir más completamente el estado del ramo al que pertenece esta, invención. Aún cuando la invención se ha descrito con referencia a las modalidades expuestas, aquellos expertos en el ramo apreciarán fácilmente que los experimentos específicos detallados son solamente ilustrativos de la invención. Se debe entender que se pueden hacer diversas modificaciones sin abandonar el espíritu y alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES 1. - Una composición inmunogénica que comprende: (a) un virus HIV exterminado completo exento de proteina envolvente externa- gpl20; (b) un inmunómero; y (c) un adyuvante. 2. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus HIV es HIV-1. 3. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus HIV es un virus de cepa HZ321. 4. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico aislada comprende una estructura de fosforotioato. 5. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus HIV se conjuga a la molécula de ácido nucleico. 6. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el inmunómero es un inmunómero CpG. 7. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el inmunómero es un inmunómero libre de CpG. 8. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el adyuvante es apropiado para uso en humanos . 9. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el adyuvante comprende adyuvante de Freund incompleto (IFA) . 10. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el adyuvante comprende componentes de pared de célula de mlcobacteria y lipido A de monofosforilo. 11. - La composición inmunogénico de conformidad Gon la reivindicación 1, en donde el adyuvante comprende alumbre . 12. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde la composición mejora la producción de jS-quimoquina. 13. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 12, en donde la producción mejorada de ?-quimoquina es producción de ?-quimoquina no especifica. 14. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 12, en donde la producción mejorada de ?-quimoquina es producción de ?-quimoquina especifica de HIV. 15. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde la /?-quimoquina es RANTES . 16,- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde la composición mejora la producción de anticuerpo IgG2b específico de HIV en un mamífero. 17.- La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, en donde la composición mejora una respuesta de linfocito citotoxico T (CTL) específico de HIV en un mamífero. 18. - La composición inmunogénica de conformidad Gon la reivindicación 1, en donde la GomposiGión mejora las células %T de ayuda CD4+ específicas de HIV. 19.- Un equipo que comprende. (a) un virus HIV exterminado completo exento de proteína envolvente externo gpl20; (b) un inmunómero; y (c) un adyuvante, los componentes de equipo, cuando se combinan, produciendo una composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1. 20.- Un método para hacer la composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, que comprende combinar: (a) un virus HIV exterminado entero exento de proteína envolvente externa gpl20f (b) un inmunómero; y (c) un adyuvante. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la combinación es ex vivo. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la combinación es in vivo. 23. - Un método para inmunizar a un mamífero, que comprende mejorar una respuesta inmune en el mamífero administrando al mamífero la composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1. 24 = - Un método para inhibir SIDA, que comprende mejorar una respuesta inmune en un mamífero administrando al mamífero la composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 23 o reivindicación 24, en donde el mamífero es un primate. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el primate es un bebé. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el primate está preñado. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el primate es un humano. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 28, en donde el humano es seronegativo de HIV. 30. - El método de conformidad con . la reivindicación 28, en donde el humano es seropositivo de HIV. 31. - El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde el mamífero es un roedor. 32. - El método de conformidad con la reivindicación 30 o reivindicación 31, en donde la composición se administra al mamífero dos o más vedes. 33. - El método de conformidad con la reivindicación 23 o 24, en donde la composición se administra al mamífero dos o más veces. 34. - El método de conformidad con la reivindicación 23 o 24, en donde la composición se administra subcutáneamente, intramuscularmente o intramucosalmente .