KR102568343B1

KR102568343B1 - 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주, 균주 유래 다당체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102568343B1
Application number: KR1020210003432A
Authority: KR
Inventors: 임신혁; 샤마 가리마; 쿠마르 샤마 아밋; 박선희
Original assignee: 이뮤노바이옴 주식회사
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2021-01-11
Publication date: 2023-08-22
Also published as: EP4088729A1; JP2023500169A; US20220370525A1; WO2021141473A1; KR20210090570A; KR20210090571A; CN115996737A; KR102507852B1; JP7339450B2; US11690884B2; EP4088729A4

Abstract

본 발명은 신규한 Lactobacillus plantarum IMB19 균주, 균주 유래 다당체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 IMB19 균주 및 상기 균주 유래의 다당체는 뛰어난 CD8+T 세포 활성의 자극 능력 및 Treg 세포의 억제 활성을 나타내며, CPS 종양 내 대식세포 침윤 증가, 대식세포의 염증성(M1) 표현형으로의 분화/재프로그래밍과 같은 다양한 메커니즘을 통해 항 종양 면역 반응을 자극 및 향상 시킨다. 따라서, 본 발명의 균주 및 균주 유래 다당체는 대상에서의 면역의 조절, 특히 면역 증진을 위해 유용하게 사용될 수 있으며, 항-종양 면역 반응을 유도 및 증진시켜, 종양의 성장을 억제시킬 수 있다. 본 발명의 신규 균주 및 균주 유래의 다당체는 예를 들어, 종양, 감염성 질환, 면역기능 이상을 원인 또는 증상으로 하는 다양한 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하다.

Description

신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주, 균주 유래 다당체 및 이의 용도{Novel Lactobacillus plantarum strain, the strain-derived polysaccharide and its use}

본 발명은 신규한 Lactobacillus plantarum IMB19 균주, 균주 유래 다당체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 면역 자극 및 항종양 활성을 갖는 KCTC 14337BP의 기탁번호를 갖는 락토바실러스 플란타룸 IMB19 균주 및 상기 균주 유래의 다당체, 및 이의 면역 조절, 항 종양 및 감염성 질환 치료 용도에 관한 것이다.

포유류는 면역 시스템과 끊임없이 상호 작용하는 일련의 미생물을 보유하고 있다. 공생 미생물은 숙주와 공생관계를 맺으며, 소화, 행동, 면역 시스템의 성숙과 같은 다양한 과정에서 숙주와 상호 작용한다(Cerf-Bensussan N, Gaboriau-Routhiau V. The immune system and the gut microbiota: friends or foes? Nat Rev Immunol 2010;10(10):735-44.). 마찬가지로, 곰팡이는 인체에 존재하며, 숙주의 면역시스템에 영향을 준다(Wheeler ML, Limon JJ, Underhill DM. Immunity to Commensal Fungi: Detente and Disease. Annu Rev Pathol 2017;12:359-85.). 선천성 면역세포는 Toll-유사 수용체(Toll-like receptors, TLRs)와 같은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors, PRRs)를 통해 다당체를 포함한 곰팡이 세포 표면의 다양한 병원균 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)을 검출한다. 신호를 탐지하면 선천성 면역세포가 유전자 발현 profile을 변경하고 후천적 면역을 조율하기 위해 사이토카인과 같은 면역 신호 분자를 생산한다(Iliev ID, Leonardi I. Nat Rev Immunol 2017;17(10):635-46., Underhill DM, Iliev ID. Nat Rev Immunol 2014;14(6):405-16. 및 Brubaker SW, Bonham KS, Zanoni I, et al. Annu Rev Immunol 2015;33:257-90.).

WHO는 프로바이오틱스를 적절한 양으로 투여하는 경우, 숙주의 건강에 도움이 되는 살아있는 미생물로 정의한다(Nat Rev Gastroenterol Hepatol 11, 506-514 (2014)). 프로바이오틱스는 숙주의 장내 미생물상(gut microflora)에 대한 보충제 역할을 하며, 장 장벽 기능을 개선하고 숙주의 면역체계를 조절하는 데 효과적인 것으로 보고되었다(Microb Ecol Health Dis 26, 25877 (2015)). 프로바이오틱스의 대부분은 피르미쿠테스문(phylum Firmicutes)에 속하며, 이는 가장 큰 단일 박테리아 문이고, 이들의 대부분은 “”함량이 낮은 그람양성균으로, 주로 Bacilli 및 Clostridia 그룹으로 분류된다. 락토바실러스 종(Lactobacillus species)은 Lactobacillaceae 과에 속하는 유산균(LAB)이다. 락토바실러스(Lactobacillus)는 뚜렷한 생태학적 지위를 갖는 널리 알려진 미생물 군집이다. 여러 유산균은 전통적으로 우유, 유제품, 발효식품, 소시지 같은 식품과 연관된 것으로 알려져 있다. 락토바실러스는 FDA에 의해 GRAS(Generally Regarded As Safe)로 인정된 미생물 그룹으로 식품 및 기타 산업 분야에서 널리 사용된다. 락토바실러스는 조건혐기성, 비포자형성, 비운동성, 막대모양, 그람 양성 세균으로 분류되며, 일반적으로 카탈라아제 음성으로 간주된다. 락토바실러스는 동종발효(homofermentative) 또는 이종발효(heterofermentative)특성을 나타낼 수 있으며, 1차 발효의 최종산물로 젖산을 생산한다(Front Cell Infect Microbiol 2, 86 (2012)). 락토바실러스는 매끄럽고 볼록한 콜로니를 나타낸다.

LAB 사이의 유사한 생화학 및 형태학적 특성으로 인해 개별 균주를 동정하기 위해서는 분자적 동정 방법이 필요하다. 여러 유산균이 식품, 특히 발효 식품에서 분리 및 특성화 되었다. 발효는 일반적으로 미생물에 기인하는 생화학적 변화를 의미한다. 한국의 전통 음식인 김치는 주로 배추를 발효한 음식으로 영양건강적으로 이로운 효과를 나타낸다(Crit Rev Food Sci Nutr 34, 175-203 (1994)). 김치에는 독특한 미생물 군집이 존재하는 것으로 알려져 있다. 여러 보고에 따르면, 주로 유산균이 김치에 존재하는 것으로 알려져 있으며, Weisellia, Lactobacillus, 및 Leuconostoc는 우점종으로, 특히 Lactobacillus plantarum 균주가 최우점종으로 알려져 있다(Food Sci Biotechnol 19, 641-646 (2010)). Lactobacillus plantarum 은 균주 특이적 프로바이오틱 프로파일및 식품산업에서 기술적 응용으로 인해 가장 연구가 많이된 균주 중 하나이다. 김치 미생물군의 대부분은 배양이 가능하며(Int J Food Microbiol 102, 143-150 (2005)), 이들이 건강상에 미치는 이점을 연구하기 위해 개별 미생물 분리가 필수적이다.

한편, 암의 성장 및 증식은 숙주 면역 반응에 의해 엄격하게 조절된다. 종양 세포의 성장 및 증식을 위해서는 종양세포의 초기 사멸을 유도하는 면역 체계의 감시를 회피할 수 있어야 한다. 종양세포는 사이토카인의 분비, 세포 표면 분자의 발현 등 다양한 경로를 통해 면역 억제성 종양 미세 환경을 형성하여 면역 시스템을 회피함으로써 성장 및 증식한다. 이러한 면역 회피 기전을 대상으로 하는 암 치료 전략으로서, 면역 체계를 유도 내지 강화 시키려는 다양한 노력이 시도되었다. 종양 면역 치료 요법은 종양이 획득한 면역억제 또는 면역 회피 기전을 극복하기 위하여, 면역체계의 종양 인지능력 또는 파괴 능력을 회복 또는 강화시키는 치료 방법이라 할 수 있다. 2011년 이필리무맙(ipilimumab)은 악성 흑색종 환자를 성공적으로 치료한 면역치료제로, 그 이후로도 니볼루맙, 펨브롤리주맙과 같은 다양한 면역 치료제가 지속적으로 개발 되어 왔다.

이러한 종양 면역 치료 요법의 도구로서, 장내 미생물군(gut microbiota)의 중요성 및 이의 응용에 대한 보고 및 사례가 증가하고 있다. 장내 미생물군은 숙주의 국소 및 전신 면역 반응을 형성하는데 필수적인 역할을 한다(Science 330, 1768-1773 (2010), Cell 148, 1258-1270 (2012)). 장내 미생물군의 다양성 및 구성은 화학요법에 대한 반응성에도 영향을 미치는 것으로 나타났다(Cancer Immunol Immunother 55, 1470-1479 (2006); Science 342, 971-976 (2013)). 특히, 특정한 공생 미생물은 자발적인 항 종양 면역의 활성화와 연관되는 것으로 밝혀져 실험(Science 350, 1084-1089 (2015), Science 350, 1079-1084 (2015)) 및 인간 암(Science 359, 91-97 (2018), Nature 453, 620-625 (2008))에서 면역 치료제의 치료 효능에 시너지 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서, 장내 미생물군과 같은 특정 균주들이 점막 외 및 원거리 종양의 진행에도 영향을 미칠 수 있다는 점이 명확하게 밝혀지고 있다. 이러한 다양한 보고들에 기반하여 장내 미생물군의 변경은 효과적이고 실행가능한 임상 치료의 하나의 옵션으로 간주되고 있다. 현재 대부분의 연구는 프로바이오틱스의 관점에서 특정 균주 또는 균주의 집단이 숙주의 면역 시스템 또는 항 종양 면역에 미치는 포괄적인 효과를 입증했지만, 이러한 효과를 나타내는 구체적인 균주 유래의 유효성분 및 이의 신호 경로와 같은 메커니즘에 대한 정보는 거의 밝혀진 바 없다.

특히, 이와 같은 미생물 또는 이의 대사산물 등을 환자의 치료에 이용하기 위해서, 일부 환자는 과다 활성화된 면역반응 (즉, 알레르기 또는 자가면역 질환)을 억제해야 하는 반면, 일부 환자는 면역계를 강화 (즉, 암 또는 바이러스 감염)시킬 필요가 있다. 예를 들어, Th17-유도 프로바이오틱스 균인 비피도박테리움을 류마티스성 관절염 동물 모델에 투여했을 때 관절염 증상을 악화시켰다 (Tze Guan Tan, 113(50):E8141-E8150, 2016). 따라서, 유익한 미생물의 동정 및 그 작용 인자의 메커니즘을 밝히는 것은 치료학적으로 매우 중요하다.

이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 미생물 유래의 다당체의 성분, 구조, 분자량 등과 면역 조절 기능과의 명확한 상관관계 및 메커니즘을 밝히고자 예의 노력한 결과, 한국의 전통 음식인 김치로부터 현저하게 높은 면역 증진 활성을 갖는 신규한 Lactobacillus plantarum에 속하는 균주를 동정하고, 한국생물자원센터에 KCTC 14337BP의 기탁 번호로 기탁하였다. 또한, 상기 신규 균주, Lactobacillus plantarum KCTC 14337BP를 급여하는 경우, 이펙터 T 세포를 현저히 증가시키고, Treg의 생성을 억제하여, 숙주 내에서 면역 시스템을 자극하고 종양의 성장 및 증식을 억제하는 것을 확인하였다.

나아가, 본 발명자들은 신규한 균주의 동정 및 특성에 그치지 않고, 상기 신규 균주의 협막 다당체, 및 이의 특정한 구조를 갖는 분획(CPS-100)이 면역 자극 및 증진 효과를 나타내는 유효분자임을 확인하였으며, CD8+T 세포 기능의 활성화, CPS 종양 내 대식세포 침윤 증가, 대식세포의 염증성 표현형으로의 분화/재프로그래밍과 같은 다양한 메커니즘으로 항-종양 면역 반응을 자극함으로써, 종양의 성장을 현저히 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경 기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행 기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 면역 자극 활성을 갖는 신규한 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 면역 자극 활성을 갖는 상기 균주 유래의 다당체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주 및 균주 유래 다당체의 면역 조절 용도, 및/또는 종양 또는 감염성 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KCTC 14337BP의 기탁 번호를 갖는 락토바실러스 플란타룸 IMB19 균주(Lactobacillus plantarum IMB19)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 균주 및/또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 균주 및/또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 균주 및/또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 균주 및/또는 이의 배양액을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 감염성 질환의 예방, 개선 는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 균주 및/또는 이의 배양액의 면역 조절용도, 및/또는 종양 또는 감염성 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 면역 조절용 조성물을 제조하기 위한 상기 균주 및/또는 이의 배양액의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 상기 균주 및/또는 이의 배양액의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 면역 증진용 식품 조성물을 제조하기 위한 상기 균주 및/또는 이의 배양액의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 면역 증진 활성을 갖는 상기 균주 유래의 협막 다당체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 균주를 배양하는 단계 및 상기 배양된 균주로부터 협막 다당체를 수득하는 단계를 포함하는 면역 증진 활성을 갖는 협막 다당체의 생산방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 항원 제시 세포(antigen presenting cell)에 L. plantarum IMB19 균주 및/또는 화학식 I의 다당체로 프라이밍하는 단계; 및 상기 프라이밍된 항원 제시 세포를 T 세포와 공배양(co-incubation)하는 단계를 포함하는 염증성 T 세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 대식세포에 L. plantarum IMB19 균주 및/또는 화학식 I의 다당체를 처리하여 M1 표현형 대식세포로 분화하는 단계; 및 상기 분화된 M1 표현형 대식세포를 수득하는 단계를 포함하는 M1 표현형 대식세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 염증성 T 세포 및/또는 상기 방법으로 제조된 M1 표현형 대식세포를 유효성분으로 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 IMB19 균주 및 상기 균주 유래의 다당체는 뛰어난 CD8+T 세포 활성의 자극 능력 및 Treg 세포의 억제 활성을 나타내며, CPS 종양 내 대식세포 침윤 증가, 대식세포의 염증성(M1) 표현형으로의 분화/재프로그래밍과 같은 다양한 메커니즘을 통해 항 종양 면역 반응을 자극 및 향상 시킨다. 따라서, 본 발명의 균주 및 균주 유래 다당체는 대상에서의 면역의 조절, 특히 면역 증진을 위해 유용하게 사용될 수 있으며, 항-종양 면역 반응을 유도 및 향상시켜, 종양의 성장을 억제시킬 수 있다. 본 발명의 신규 균주 및 균주 유래의 다당체는 예를 들어, 종양, 감염성 질환, 면역기능 이상을 원인 또는 증상으로 하는 다양한 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하다.

도 1은 김치 유래 균주 처리시 비장세포의 염증성 또는 항염증 사이토카인 수치를 나타낸 것이다.
김치 현탁액의 단계적 희석액을 만들어, MRS-아가 플레이트에 스트리킹하고, 37℃에서 48시간 배양한 뒤 14개의 콜로니로부터 균주를 획득하여 MRS 브로스에서 24시간동안 추가배양하였다. 비장세포와 각각의 균주를 1:10으로 혼합하여 37℃5% CO2 조건에서 48시간동안 배양하였다. 비장세포의 활성화는 ELISA를 통해 배양 상등액의 사이토카인 수치를 측정하여 평가하였다. 상기 데이터는 평균 ± SEM 값이다(n=2). 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 의해 Mock에 대해 계산되었다. *p<0.5, **p<0.01, *p<0.001
도 2는 L. plantarum IMB19 균주의 미생물학적 및 생물학적 특성을 나타낸 도면이다.
도 2A: L. plantarum IMB19 균주의 TEM 사진을 나타낸 것이다. 화살표는 세포벽 주위의 협막층을 나타낸다.
도 2B: 5% 양 혈액 아가에서 48시간 배양한 뒤, L. plantarum IMB19 균주의 용혈 활성, 양성대조군: Bacillus cereus ATCC 27348
도 2C: L. plantarum IMB19 균주에 대한 젤라틴 가수분해 시험. 양성대조군: B. cereus ATCC11778
도 3은 L. plantarum IMB19의 계통도(Cluster dendrogram)를 나타낸 것이다.
계통수(phylogenetic tree)는 L. plantarum 균주 간의 차이를 기반으로 구축되었다. 평균 뉴클레오타이드 지수(Average nucleotide index, ANI)는 OrthANI 알고리즘을 계산하였다. 거리는 게놈의 차이에 정비례한다.
도 4는 다양한 락토바실러스 플란타룸 균주의 Th 17 세포 생성을 확인한 결과이다.
naive CD4+T 세포에 대한 L. plantarum IMB19, L. plantarum 3105, L. plantarum 3106, L. plantarum 3107의 효과를 나타낸 유동세포 분석 데이터이다. L. plantarum IMB19로 프라밍된 수지상 세포를 naive CD4+T 세포, 항-CD3(10ng/ml) 및 IL-2(100U/ml)과 함께 배양하였다.
도 4A의 i는 Th17 세포의 생성을 묘사하는 FACS 플롯이다. 세포는 live CD4+RORγT 세포로 게이트되었다.
도 4A의 ii는 live Live CD4+ RORγT 세포로 게이트된 Th17 세포에 대한 평균 세포 수를 나타내는 바그래프이다.
도 4B는 Live CD4+ T-bet+ T 세포로 게이트된 Th1 세포이다.
도 4C는 Live CD4+ GATA3+ T 세포로 게이트된 Th2 세포이다.
도 4D는 Live CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포로 게이트된 Treg이다.
데이터는 평균±SD로 나타냈으며, 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 의해 Mock에 대해 계산되었다. **p<0.01
도 5는 L. plantarum IMB19의 Treg 억제 및 Th17 세포 유도능을 나타낸 것이다.
도 5A의 i는 Th17 세포의 생성에 대한 L. plantarum IMB19의 효과를 보여주는 대표적인 FACS 플롯 및 막대 그래프이다. L. plantarum IMB19 프라이밍 된 수지상 세포를 나이브 CD4+T 세포, anti-CD3 (0.1μg/ml), TGF-ß(0.5ng/ml), IL-6 (2ng/ml), IL1-ß(2ng/ml), IL-2(100U/ml), 항-IL4 (10μg/ml) 및 항 -IFNγ(10μg / ml)와 함께 공동배양하였다. 세포는 Live CD4 + RORγ+ T 세포로 게이트되었다.
도 5A의 ii는 L. plantarum IMB19로 생성된 Th17 세포에서 인터루킨-17의 수준을 나타내는 대표적인 FACS 플롯 및 막대 그래프이다. 세포는 Live CD4+ RORγIL-17+ T 세포로 게이트되었다.
도 5B는 시험 관내 Treg 세포 생성에 대한 L. plantarum IMB19의 억제 효과를 보여주는 대표적인 FACS 플롯 및 막대 그래프이다. L. plantarum IMB19 프라이밍 된 수지상 세포는 항-CD3 (0.1ug/ml), IL-2 (100U/ml) 및 다양한 농도의 TGF-ß와 함께 나이브 CD4+ T 세포와 공동배양하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. 통계적 유의성은 일반적인 일원 분산 분석으로 분석되었다. ** p <0.01, *** p <0.001
도 6은 L. plantarum IMB19에 의해 강화된 CD8+ T 세포 활성화를 통한 항 종양 면역 반응을 나타낸 것이다.
도 6A는 비장세포-박테리아 공동배양 상등액의 ELISA를 통한 사이토카인 분석결과이다.
도 6B는 L. plantarum IMB19 또는 L. murinus로 프라이밍된 비장 CD11c+ 수지상 세포 및 naive CD8+ T 세포의 공동배양물로부터, IFNγT 세포의 정량결과이다.
도 6C는 L. plantarum IMB19로 프라이밍된 CD11b+F4/80+ 복막 대식세포 및 naive CD8+ T 세포의 공동배양물로부터, IFNγT 세포의 정량결과이다.
도 6D는 는 L. plantarum IMB19로 프라이밍된 비장 CD11c+ 수지상 세포, naive CD4+ T 세포 및 2ng/ml의 TGFβ의 공동배양물로부터 Foxp3+CD4+ T 세포를 정량한 결과이다.
상기 데이터는 평균±SEM 값이며 B는 Tukey's 다중 비교와 함께 일반적인 일원 분산 분석으로 분석되었다. ** p <0.01, **** p <0.0001
도 6E는 in vivo OVA 발현 리스테리아 모노사이토제니즈(LM-OVA) 세포독성 분석을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 6F는 LM-OVA로 감염된 마우스에서 OVA+ 비장세포에 대한 L. plantarum IMB19 매개된 CD8+ T 세포 특이적 세포독성을 나타낸 것이다.
도 6G는 in vivo B16.F10 흑색종 마우스 모델을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 6H는 L. plantarum IMB19 또는 L. murinus로 처리 또는 비처리된 C57/BI6 무균(germ-free) 마우스에서 B16.F10 흑색종 성장 동역학(B116.F10 melanoma growth kinetics)을 나타낸 것이다.
도 6I는 L. plantarum IMB19 또는 L. murinus로 처리 또는 비처리된 C57/BI6 SPF 마우스에서 B16.F10 흑색종 성장 동역학(B116.F10 melanoma growth kinetics)을 나타낸 것이다.
상기 데이터는 평균±SEM 값이며, 6F는 비-파라메트릭 양측 검정(non-parametric, two tailed t-test)으로, 6H 내지 6I는 Dunnet's 다중 비교와 함께 이원 분산 분석으로 분석되었다. **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001
도 7은 L. plantarum IMB19의 CD8+T 세포에 대한 용량 의존적 효과를 나타낸 것이다.
도 7A 내지 7B는 상이한 비율의 L. plantarum IMB19로 프라밍된 비장(7A) 또는 mLN(7B) CD11c+ 수지상세포와 naive CD8+ T 세포의 공동배양물에서 IFNγT 세포를 정량화한 것이다.
도 7C는 100ng/ml의 gp-100의 존재 하에, 상이한 비율의 L. plantarum IMB19로 프라밍된 비장 CD11c+ 수지상세포와 naive pmel TCR 이식 CD8+ T 세포의 공동배양물에서 IFNγT 세포를 정량화한 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이며, Tukey's 다중 비교와 함께 일반적인 일원 분산 분석으로 분석되었다. ** p <0.01, *** p <0.001, **** p <0.0001
도 8은 L. plantarum IMB19의 인터루킨-6 생산을 통한 조절 T-세포의 성장 억제를 나타낸 것이다.
도 8A는 상이한 TGFβ농도에서 L. plantarum IMB19 프라이밍된 비장 CD11c+ 수지상 세포와 naive CD4+ T 세포의 공동배양물에서 Foxp3+CD4+ T 세포를 정량화한 것이다.
도 8B는 2ng/ml의 TGFβ농도에서 L. plantarum IMB19 프라이밍된 비장 CD11c+ 수지상 세포와 naive CD4+ T 세포의 공동배양물에서 사이토카인을 정량화 한 것으로, 총 CD4+ T 세포로 게이트되었다.
도 8C는 IL-6^-/- 비장 DC 및 0.01ng/ml의 TGFβ농도에서 L. plantarum IMB19 프라이밍된 비장 CD11c+ 수지상 세포와 naive CD4+ T 세포의 공동배양물에서 Foxp3+CD4+ T 세포를 정량화한 것이다.
데이터는 평균 ± SEM이며, Tukey's 다중 비교와 함께 일반적인 일원 분산 분석으로 분석되었다. *** p <0.001, ns: 유의미하지 않음
도 9는 미생물 다양성에 변화 없이 L. plantarum IMB19가 종양 면역에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 9A는 도 6H에서의 L. plantarum IMB19를 급여한 종양 보유 마우스의 분변 샘플에 나타난 문(phylums, %)의 계통발생학적 분석결과이다.
도 9B 및 9C는 도 6H에서의 L. plantarum IMB19를 급여한 종양 보유 마우스의 분변 샘플에 나타난 박테리아 β다양성의 알파 다양성 분석(B) 및 주좌표 분석(Principal coordinates analysis)을 나타낸 것이다. 데이터는 두 번의 독립시험 값을 나타낸다.
도 10은 L. plantarum IMB19의 투과전자 현미경(TEM) 사진이다
도 10a는 L. plantarum IMB19 박테리아 군집으로 화살표는 개별 박테리아를 나타낸다.
도 10b는 L. plantarum IMB19로 화살표는 세포벽 주위에 두꺼운 협막층(Capsular layer)을 나타낸다.
도 11은 HF 처리없이(a) 또는 HF 처리하여(b) 시료를 탈인산화시킨 L. plantarum IMB19에서 추출된 CPS 유래의 아세틸화된 메틸글리코사이드의 GC-MS 프로파일을 나타낸 것이다. “i”는 불순물을 나타낸다.
도 12는 L. plantarum IMB19에서 추출된 CPS의 아세틸화 2-(-)-옥틸 유도체(2-(-)-octyl derivatives) (a), 람노스(b), 포도당(c) 및 갈락토오스 아세틸화 2-(-)-옥틸 글리코사이드 표준(d)의 GC-MS프로파일을 나타낸 것이다. “i”는 불순물을 나타낸다.
도 13은 미정제 CPS를 이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하여 얻은 분획의 양성자 스펙트럼을 나타낸 것이다(600MHz, 298K): CPS(a), CPS-10(b), CPS-100(c), CPS-200(d), CPS-400(e), CPS-700(f) 및 CPS7-1000(g). 괄호 안의 숫자는 28mg의 미정제 CPS을 기준으로 각 분획의 수율(mg/mg)을 나타낸다.
도 14는 L. plantarum IMB19의 협막 다당체에 대해 기록된 HSQC 스펙트럼의 확장을 나타낸 것이다(600 MHz, 310K): (a) 아노머 영역(anomeric region)의 확장; (b) 카르비놀 영역(carbinolic area)의 확장. 회색 밀도는 “₂” 탄소에 해당하며, “”은 환원 형태(Galα 및 Galβ로 갈락토오스에 부착된 반복 단위의 당의마이너한 아노머 신호(minor anomeric signals)를 나타낸 것이다. 반복 단위의 구조는 도 20 참조. 레이블은 표 3 참조.
도 15는 HF를 처리하여 샘플을 탈인산화한 후, L. plantarum IMB19에서 추출한 CPS-400의 아세틸화 메틸글리코사이드의 GC-MS 프로파일. “i”는 불순물을 나타내며, MurA는 박테리아의 펩티도글리칸의 구성요소인 무라민산(muramic acid)을 나타낸다.
도 16은 L. plantarum IMB19의 협막 다당체, CPS-100에 대해 기록된 TOCSU(검정) 및 COZY(청록/빨강) 스펙트럼의 확장을 나타낸 것이다(600 MHz, 310K). 반복 단위의 구조는 도 20 참조. 레이블은 표 3 참조.
도 17은 L. plantarum IMB19의 협막 다당체, CPS-100에 대해 기록된 NOESY(검정) 및 COZY(청록/빨강) 스펙트럼의 확장을 나타낸 것이다 (600 MHz, 310K). 반복 단위의 구조는 도 20 참조. 레이블은 표 3 참조.
도 18은 L. plantarum IMB19의 협막 다당체에 대해 기록된 HSQC-TOCSY(a) 및 HMBC(b) NMR스펙트럼의 확장을 나타낸 것이다 (600 MHz, 310K). 반복 단위의 구조는 도 20 참조. 레이블은 표 3 참조.
도 19는 L. plantarum IMB19의 협막 다당체, CPS-100의 일부인 잔긴 B-G의 H-2 양성자 영역을 상세히 도시한 NESY(검정) 및 COZY(청록/빨강) 스펙트럼의 확장을 나타낸 것이다(600 MHz, 310K). 반복 단위의 구조는 도 20 참조. 레이블은 표 3 참조.
도 20은 L. plantarum IMB19의 협막 다당체, CPS-100의 반복 단위의 구조를 나타낸 것이다. 4는 계산된 평균 중합도를 나타낸다. D의 6' 탄소 잔기의 산소에 치환된 인산기(P)는 A의 1' 탄소와 연결되어 중합된 다당체의 반복단위 간 A와 D의 인산다이에스테르(phosphodiester) 결합을 나타낸다.
도 21은 용매 단독 주입(a); CPS-100(b); CPS-400(c)의 HPSEC 프로파일을 나타낸 것이다. 13.6 및 14.74분 에서의 피크는 단독 주입된 용매의 프로파일(a)에서 볼 수 있듯이 용매에서 유발된 아티팩트이다.
도 22는 CPS-400에 대해 기록된 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다(600 MHz, 310K): (a) HSQC-TOCSY (검정) 및 HSQC (청록)의 오버레이; (b) HMBC (검정) 및 HSQC (청록)의 오버레이; (c) HSQC; (d) HSQC-TOCSY; (e) 내지 (h) 상이한 영역의 TOCSY 스펙트럼. “”은 미확인된 마이너 모티프에 속하는 밀도. 구조 단위의 표지 및 묘사는 표 4에 개시하였다.
도 23은 리비톨 G의 밀도를 묘사하는 HSQC-TOCSY (검정/회색) 및 HSQC (청록/빨강)의 확장을 나타낸 것이다. G1 및 G5로부터의 HSQC-TOCSY 상관관계는 회색 점선으로 입증된다. 구조 단위의 표지 및 묘사는 표 4에 개시하였다(600 MHz, 310K).
도 24는 정제된 분획의 협막 다당체의 면역 자극 활성을 확인하기 위해 사이토카인의 수준을 확인한 결과이다. 비장세포는 도 24에 즉 배지(대조군), CPS 분획(CPS-400 및 CPS-100, 50μg/mL), 전체 CPS(50μg/mL) 및 지질다당체(E. Coli 0111:B4 유래 LPS, 0.1 μg/mL)의 존재 하에 비장세포를 배양하였다. 사이토카인 생산의 평가를 위해 세포 배양 상등액을 ELISA로 분석하였다. (a) IFNγ(b) IL-10; (c) TNF-α; (d) IL-6; (e) IL-12; (f) IFNγ의 생산에 대한 CPS-100의 용량 반응 곡선(Dose response curve). (f)에서, EC50(half maximal effective concentration)은 3.16 μM로 계산되었다. 데이터는 유사한 결과의 2 내지 3번의 독립 실험 값이며, 모든 막대 그래프는 평균 ± SD를 나타낸다. * p <0.05, **** p <0.0001 (다중 비교를 위한 사후 Dunnet' 검정(post hoc Dunnet's test)을 사용한 일원 분산 분석); ND, 검출되지 않음.
도 25는 L. plantarum IMB 19 및 CPS의 CD8+ T 세포의 활성화 및 종양 내 침윤 향상을 통한 종양 성장 억제효과를 나타낸 것이다.
도 25A는 L. plantarum IMB 19 또는 CPS로 처리 또는 비처리된 C57/Bi6 SPF 마우스에서의 B16.F10 흑색종 성장 동역학을 나타낸 것이다.
도 25B는 마우스에서 분리된 종양을 나타낸 사진이다.
도 25C 및 25D는 L. plantarum IMB 19(C) 또는 CPS(D) 처리의 시작 후 16 내지 18일 뒤 유동세포 분석으로 결정된 종양 침윤 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 비율을 나타낸 것이다.
데이터는 평균 ± SEM 값이다. 데이터는 Dunnet's 다중 비교를 이용한 이원 분산 분석(A) 또는 비-파라메트릭 양측 검정(non-parametric, two tailed t-test)(C-D)으로 분석되었다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
도 25E 및 25F는 L. plantarum IMB 19(E) 또는 CPS(F)로 처리 또는 비처리시, 종양 침윤 IFNγT 세포의 백분율 및 종양 침윤 CD8+ T 세포의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI)의 양을 나타낸 것이다. 도 25G 내지 25H는 L. plantarum IMB 19(G) 또는 CPS(H)로 처리 또는 비처리시, IFNγT 세포의 빈도를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM 값이다. 데이터는 비-파라메트릭 양측 검정(non-parametric, two tailed t-test)으로 분석되었다. *P<0.05, ns: 유의미하지 않음.
도 26은 L. plantarum IMB19 및 CPS가 종양내 조절 T 세포 집단을 변경시키지 않음을 나타낸 것이다.
도 26A 및 26B는 L. plantarum IMB 19(A) 또는 CPS(B)의 처리 시 종양 침윤된 림프구 내 종양 침윤 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 데이터는 비-파라메트릭 양측 검정(non-parametric, two tailed t-test)으로 분석되었다. *P<0.05, ns: 유의미하지 않음.
도 27은 L. plantarum IMB19의 EMT 유방암의 종양 성장 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 27A는 L. plantarum IMB19 처리 또는 비처리된 Balb/c SPF 마우스에서의 EMT-6 유방암 성장 동역학을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM 이며, Dunnet's 다중 비교와 함께 이원 분산 분석으로 분석되었다. *P<0.05, ***P<0.001.
도 28은 CPS의 B16.F10 흑색종에서 염증성 대식세포의 CPS의 종양 내 침윤 향상 활성을 나타낸 것이다.
도 28A는 종양 접종 후 40시간 뒤, CPS 처리 시 CD45+CD11c+CD11b+ 종양 침윤 대식세포의 수 및 백분율을 나타낸 것이다.
도 28B 및 28C는 CPS 처리시, 종양 침윤 대식세포(B) 및 수지상 세포(C) 상의 활성 마커, CD11b, MHC I, MHC II, CD86 및 CD40를 나타낸 것이다.
도 28D는 CPS 처리시 종양 드레인 림프절(Tumor draining lymph nodes)에서 CD8+CD69+ T 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM 이며, Dunnet's 다중 비교와 함께 이원 분산 분석(A) 또는 비-파라메트릭 양측 검정(non-parametric, two tailed t-test) (B)으로 분석되었다 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 28E 및 28F는 분리 후 즉시(E) 또는 24시간의 IL-4 처리 후(F) 생체 외에서 CPS(10μg/ml)처리된 마우스 복막 대식세포 상의 활성 마커, MHC I, MHC II, iNOS2, CD68, CD40, CD80, 및 CD86을 나타낸 것이다.
도 28G는 종양 접종 40시간 후 분리된 CPS 또는 PBS 처리된 종양 유래 대식세포에서의 풍부화된 M1 대식세포 유전자 시그니쳐를 다비드 경로 분석을 통해 분석한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

공생 미생물이 인간과 같은 숙주의 면역 조절 반응에 깊게 관여하는 것으로 알려지면서, 면역 증진 또는 억제능을 갖는 공생 미생물, 즉 프로바이오틱스에 대한 연구가 활발이 진행되고 있다. 인간과 진화적으로 공존하는 수 많은 미생물 종 중에서, 면역 조절 능력을 갖는 것으로 밝혀진 미생물 종은 극소수에 불과하며, 같은 종의 미생물에서도 균주에 따라 면역 조절 활성이 현저하게 차이나거나, 심지어는 상반되는 효과를 나타낸다. 미생물이 보유하는 활성은 각 미생물마다 매우 다양하고 상이하기 때문에, 최근 면역 조절 능력을 갖는 미생물이 생산하는 유용한 대사산물, 또는 유효 분자와 같은 포스트바이오틱스에 대한 관심이 급등하고 있다. 특히, 만노스, 베타-글루칸과 미생물 유래의 다당체는 숙주의 면역 시스템에 다양한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 그러나, 미생물 유래의 다당체 또한 그 종류 및 구조에 따라 다양한 활성을 가지며, 자이모산과 같은 다당체는 면역 증진 및 억제의 양면성을 동시에 나타내기도 하는 것으로 보고된다. 따라서, 프로바이오틱스 유래의 다당체를 대상의 면역 조절, 특히 인간의 임상적 치료 용도에 사용하기 위해서는 각 다당체의 면역 조절 메커니즘을 밝히는 것이 매우 중요하다. 그러나, 다당체의 구조와 면역 조절 활성과의 연관성에 대한 보고는 거의 보고된 바 없다.

본 발명자들은 포스트바이오틱스의 관점에서, 다당체의 구조와 면역 조절 활성과의 연관성을 밝히고자 예의 노력해 왔으며, 면역 조절능을 나타내는 비피도박테리움, 효모와 같은 다양한 균주 유래의 다당체의 구조와 면역 조절능의 연관성 및 메커니즘을 밝혀내고, 특허 출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2018-0067535호(등록예정), 제2019-0091908호 등).

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 한국의 전통 발효식품인 김치로부터, 높은 면역 자극 활성을 나타내는 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) IMB19 균주를 동정하고, 한국생물 자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 14337BP).

본 발명의 다른 실시예에서, 선천적 면역 시스템과 적응 면역 시스템을 모두 포함하도록 설계한 공동배양 시스템에서, 상기 균주가 면역 자극성 사이토카인(예, IFN-γ)의 증가 및 항염증 사이토카인(예, IL-10)의 억제시키며, 이펙터 T 세포를 현저히 증가시키고, Treg의 생성을 억제하여, 숙주 내에서 면역 시스템을 자극하고 종양의 성장 및 증식을 억제하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, KCTC 14337BP의 기탁 번호를 갖는 락토바실러스 플란타룸 IMB19 균주(Lactobacillus plantarum IMB19)에 관한 것이다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 IMB19 균주(Lactobacillus plantarum IMB19)는 뛰어난 면역 증진 활성 및 항 종양 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 균주는 i) 헬퍼 T 세포의 유도 및 Treg 세포의 분화 억제와 같은 염증성 방향으로의 T 세포 분화 유도, ii) CD8+T 세포의 자극, 활성 향상 및 종양 내 침윤 향상, iii) Treg 세포 활성 억제, iv) 종양 내 대식세포 침윤 증가, v) 대식세포의 염증성 세포로의 활성화 및 M2에서 M1 대식세포로의 재프로그래밍과 같은 다양한 면역 증진 활성 및/또는 항-종양 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 IMB19 균주(이하, L. plantarum IMB19로 약칭함)는 김치로부터 분리되었으며, 16S rRNA 분석, recA 증폭/밴드 비교 및 전체 유전자 서열분석 및 계통학적, 형태학적, 생리학적 분석을 통해 신규한 균주로 동정되고, 기탁되었다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 발효식품, 예를 들어, 김치로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 작고, 매끄러우며, 원형의 반투명한 콜로니를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 비-편모성(non-flagellated)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 막대형(rod-shaped) 콜로니를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 협막 층(capsular layer)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 비용혈성(non-) 또는 γ-용혈성(γ-hemolytic)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 젤라티나아제 활성에 음성인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 히스타민(histamine), 카다베린(cadaverine), 티라민(tyramine) 및/또는 푸트레신(putrescine)과 같은 생체 아민(biogenic amine)을 생성하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 카나마이신에 내성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 면역 증진 및/또는 항 종양 활성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 구체적인 예로, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 i) 헬퍼 T 세포의 유도 및 Treg 세포의 분화 억제와 같은 염증성 방향으로의 T 세포 분화 유도, ii) CD8+T 세포의 자극, 활성 향상 및 종양 내 침윤 향상, iii) Treg 세포 활성 억제, iv) 종양 내 대식세포 침윤 증가, v) 대식세포의 염증성 세포로의 활성화 및 M2에서 M1 대식세포로의 재프로그래밍과 같은 다양한 면역 증진 및 항 종양 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 종양의 성장을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 균주를 급여한 동물 종양 모델에서, CD8+T 세포의 자극, 대식세포에서의 분화, 표현형 유도, Treg의 억제, 면역세포의 종양 침윤 향상 등의 다양한 메커니즘을 통해 현저한 면역 증진 효과 및 항 종양 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서, CPS를 처리시에 종양의 성장이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 균주 및/또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 조절용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 균주 및/또는 이의 배양액을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 조절방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 균주 및/또는 이의 배양액의 면역 조절 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 면역 조절용 조성물을 제조하기 위한 상기 균주 및/또는 이의 배양액의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 용어 “면역 조절”이란, 혈액 내 면역 불균형을 해소하고 면역 항상성을 유지하는 것을 의미한다. 면역 항상성의 유지는 면역을 억제시키는 면역 관용(tolerance)과 면역을 증진하는 면역반응(immunity)간의 균형을 이루는 상태를 일컫는 것으로 이러한 상태의 유지는 종양 및 암을 포함하는 대부분의 질환의 치료에 있어서 필수적인 요소이다. 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 면역 자극 용도로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 조절용 조성물은 면역 자극 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 조절용 조성물은 면역 자극용 또는 면역 증진용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 조절용 조성물은 프로바이오틱스 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 프로바이오틱스는 적절한 양으로 투여하는 경우, 숙주의 건강에 도움이 되는 살아있는 미생물을 의미한다(Nat Rev Gastroenterol Hepatol 11, 506-514 (2014)). 프로바이오틱스는 숙주의 장내 미생물상(gut microflora)에 대한 보충제 역할을 하며, 장 장벽 기능을 개선하고 숙주의 면역체계를 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로바이오틱스 조성물은 프리바이오틱스를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 조절용 조성물은 종양, 감염성 질환, 면역 감소/억제를 원인 또는 증상으로 하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 목적으로, 약학 조성물 또는 식품 조성물 등으로 사용될 수 있으며, 이때 사용량 및 사용 형태는 목적에 따라 적절히 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 조절용 조성물은 다른 약학 조성물 또는 식품 조성물과 병용하여 또는 보조제(adjuvant)로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 다른 약학 조성물은 면역 요법과 관련된 면역 치료제, 면역 세포 치료제 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 다른 식품 조성물은 발효 식품, 발효 식품 제조를 위한 발효 스타터, 영양제와 같은 건강기능식품 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 조절용 조성물은 본 발명의 L. plantarum IMB19 균주 및/또는 이의 배양액 외에도 다른 프로바이오틱 균주, 화합물, 보조제, 첨가제, 담체, 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, “이의 배양액”은 본 발명의 L. plantarum IMB19 균주를 포함하는 배양 원액일 수 있으며, 이의 파쇄물, 원심분리 상등액 또는 펠렛, 농축액, 건조물, 등을 모두 포함하는 포괄적인 의미로 사용된다. 본 발명의 L. plantarum IMB19 균주는 통상적인 락토바실러스 균주의 배양방법을 통해 배양할 수 있다. 본 발명의 균주의 배양방법은 실시예의 일 예로서 기재하였다. 배지로는 천연 배지 또는 합성배지 등을 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모, 대두, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘. 망간, 칼슘. 철, 칼륨 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 등이 첨가될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배양액은 L. plantarum IMB19 균주 및/또는 L. plantarum IMB19 균주 유래의 면역 조절 활성을 갖는 유효성분(예, 다당체)을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 균주의 상태는 액상상태 또는 건조 상태일 수 있으며, 건조 방법은 예를 들어 자연건조, 분무 건조 및 동결 건조 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 L. plantarum IMB19 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 균주 및/또는 이의 배양액을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 균주 및/또는 이의 배양액의 종양 또는 감염성 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 상기 균주 및/또는 이의 배양액의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 용어, “종양” 은 생체 조절기구에서 이탈하여 세포가 자율성을 지니고 과잉 증식하는 현상 또는 이로 인해 생성된 신생물, 또는 과형성물을 모두 포함한다. 상기 종양은 예를 들어, 양성, 전악성, 악성 종양을 모두 포함하며, 보다 구체적인 예로, 조직세포종, 신경교종, 성상세포종, 골종, 각종 암, 예를 들어, 폐암, 소세포 폐암, 위암, 위장관암, 장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 유방암, 피부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 간암, 신장암, 방광암, 췌장암, 뇌암, 육종, 골육종, 흑색종, 림프종(호지킨 림프종, FL, MCL, MZBL, CLL, T-ALL, AML, ALL 등), 혈액암, 백혈병, 건선, 골질환, 섬유증식성 장애, 죽상경화증 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 흑색종, 유방암, 신장암, 폐암, 방광암, 직장암 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, “감염성 질환”은 다양한 병원체의 감염에 의해 유발 또는 악화되는 병원체-관련 질환을 의미한다. 예를 들어, 상기 감염성 질환은, 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물, 기생충, 프리온, 또는 단백질 응집체 등에 감염되어 유발 또는 악화되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 질환을 억제시키거나 질환의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은 그 유효성분의 상술한 면역 증진 효과 및/또는 항 종양 효과를 통해 다양한 질환에 대한 예방 또는 치료 및 항염증 효과를 나타낸다.

상기 약학 조성물은 본 발명의 L. plantarum IMB19 균주 또는 이의 배양액을 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성 성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 치료 요법 또는 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 종양의 예방 또는 치료 용도로 사용되는 경우, 바람직하게는 상기 다른 치료 요법 또는 치료제는 면역 요법 또는 면역세포치료제 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 임상의의 판단에 따라 다양하게 조합되어 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 L. plantarum IMB19 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 면역 증진용 식품 조성물을 제조하기 위한 상기 균주 및/또는 이의 배양액의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 식품 조성물은 면역 활성을 증강시키거나 개선하여 면역 기능의 항상성을 유지시킬 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 개선효과를 나타내는 건강기능식품인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 프리바이오틱스, 프로바이오틱스, 포스트바이오틱스, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정 보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있다.

상기 건강식품(health food)은 일반 식품에 비해 적극적인 건강 유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.

상기 식품조성물은 생리학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검 기초제, 거품 억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 본 발명의 L. plantarum IMB19 균주 또는 이의 배양액과 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 협막 다당체(Capsular polysaccharides)가 본 발명의 L. plantarum IMB19의 면역 증진 활성을 나타내는 유효성분임을 확인 하였다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 분리한 협막 다당체가 L. plantarum IMB19 균주와 마찬가지로 i) 헬퍼 T 세포의 유도 및 Treg 세포의 분화 억제와 같은 염증성 방향으로의 T 세포 분화 유도, ii) CD8+T 세포의 자극, 활성 향상 및 종양 내 침윤 향상, iii) Treg 세포 활성 억제, iv) 종양 내 대식세포 침윤 증가, v) 대식세포의 염증성 세포로의 활성화 및 M2에서 M1 대식세포로의 재프로그래밍과 같은 다양한 메커니즘을 통해 뛰어난 면역 증진 활성 및 항 종양 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 협막 다당체는 NMR을 통해 구조적으로 분석되었다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 면역 증진 활성을 갖는 L. plantarum IMB19 균주 유래의 협막 다당체(Capsular polysaccharides; CPS)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 협막 다당체는 하기 화학식 I의 다당체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:

[화학식 I]

-[-D-B-I-F-G-C-E-H-A-]_n-

A 및 D는 갈락토오스(Galactose)이고,

B, C, E, G 및 H는 람노스(Rhamnose)이며,

F는 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)이고,

I는 포도당이며,

n은 1 이상의 정수임.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 다당체는 화학식 I에서 [-D-B-I-F-G-C-E-H-A-] 로 표시되는 반복 단위의 중합체 구조이다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 n이 2 이상인 경우, 상기 반복단위는 직접적인 공유결합 이외에도 다양한 방법으로 제한없이 연결될 수 있다. 예를 들어 상기 반복단위는 글리코시드 결합, 포스포디에스테르 결합과 같은 화학적 결합에 의해 연결될 수 있으며, 링커를 매개로 연결될 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 n이 2 이상인 경우, 반복 단위([-D-B-I-F-G-C-E-H-A-])는 A와 D의 글리코시드 결합(-O-)으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 n이 2 이상인 경우, 반복 단위([-D-B-I-F-G-C-E-H-A-])는 A와 D사이의 인산다이에스테르 결합 (phosphodiester linkage)으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 n이 2 이상인 경우, 반복 단위의 A의 1번 탄소와 다른 반복단위의 D의 6번 탄소가 인산다이에스테르 결합 (phosphodiester linkage)으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 A 및 D 중 어느 하나 이상이 인산화된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 A의 경우, 1번 탄소의 수산화기가 인산화된 것을 특징으로 할 수 있고, D의 경우, 6번 탄소의 수산화기가 인산화된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 갈락토오스(galactose)는 자연계에 일반적으로 존재하는 갈락토오스 또는 이의 유도체를 포함하는 의미로 사용된다. 예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 갈락토오스는 이성질체로서, α형(α configuration) 또는 β형(β configuration), D형(D configuration) 또는 L형(L configuration)일 수 있으며, 바람직하게는 α-갈락토오스 더욱 바람직하게는 α-D-갈락토오스 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 람노스(rhamnose)는 자연계에 일반적으로 존재하는 람노스 또는 이의 유도체를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 람노스는 이성질체로서, α형(α configuration) 또는 β형(β configuration), D형(D configuration) 또는 L형(L configuration)일 수 있으며, 바람직하게는 α-람노스, 더욱 바람직하게는 α-L-람노스 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 본 발명에 있어서, 상기 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)은 N-아세틸글루코사민 및 이의 유도체를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서, 상기 포도당(glucose)은 일반적인 포도당 또는 이의 유도체를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 포도당은 이성질체로서, α형 또는 β형, D형 또는 L형일 수 있으며, 바람직하게는 β형 배열을 갖는 -포도당, 더욱 바람직하게는 D-포도당 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, D와 B(D-B) 및 B와 I(B-I)는 α-1,3-글리코시드 결합으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 I와 F(I-F)는 β-1,6-글리코시드 결합으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 F와 G(F-G), G와 C(G-C), C와 E(C-E), 및 E와 H(E-H)는 α-1,2-글리코시드 결합으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 H와 A(H-A)는 α-1,6-글리코시드 결합으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 글리코시드 결합은 결합 배향에 따라 α 또는 β로 표시하였으며, 이어지는 숫자는 각각 두 개의 단당류에서, 글리코시드 결합(-O-)으로 연결된 탄소 번호를 의미한다. 예를 들어, 상기 “I와 F(I-F)는 β-1,6-글리코시드 결합으로 연결된”은 I의 1번 탄소와 F의 6번 탄소가 I를 기준으로 β-배열의 글리코시드 결합으로 연결된 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 협막 다당체는 n이 1 이상의 정수인 화학식 I의 다당체를 포함할 수 있으며, 다양한 n으로 중합된 다수의 화학식 I의 다당체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 화학식 I의 당체는 n이 1 내지 10인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 협막 다당체에 포함된 화학식 I의 다당체의 평균 중합도는 약 4였으며, 평균 분자량은 약 6.0kDa로 확인되었다. 각 반복 단위([-D-B-I-F-G-C-E-H-A-])는 약 1.5kDa의 분자량(MW)으로 확인되었다.

본 발명에 있어서, 상기 협막 다당체에 포함된 화학식 I의 다당체의 '평균중합도(average of n)'는 바람직하게는 1 내지 10, 가장 바람직하게는 약 4인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 협막 다당체에 포함된 화학식 I의 다당체의 평균분자량은 1.5 내지 15kDa, 바람직하게는 약 6.0kDa인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 협막 다당체에 포함된 화학식 I의 다당체는 L. plantarum IMB19 균주 유래의 협막 다당체(Capsular polysaccharides; CPS)를 약 100mM의 NaCl을 용리액으로 사용하여 이온 교환 크로마토그래피 방법을 통해 분리하였다. 상세한 분리 방법은 실시예에 상세히 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에 기재된 화학식 I의 다당체 구조 및 특징을 토대로 종래 알려진 다양한 정제 방법을 통해 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 협막 다당체는 테이코산(teichoic acid)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 확인된 것과 같이, 본 발명에 있어서, 상기 협막 다당체는 2개 이상의 테이코산을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 테이코산은 Gro-type 또는 Rbo-type일 수 있으며, 협막 다당체가 2개 이상의 테이코산을 추가로 포함하는 경우 단일 type의 형태로, 또는 두 가지 type이 혼합되어 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 협막 다당체는 화학식 I의 다당체 및/또는 테이코산 이외에도 다른 다당체 또는 지질과 같은 생체 분자를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서,

(a) 제1항의 균주를 배양하는 단계; 및

(b) 상기 배양된 균주로부터 협막 다당체를 수득하는 단계를 포함하는 면역 증진 활성을 갖는 다당체의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서,

(c) 수득된 협막 다당체에 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여, 면역 증진 활성을 갖는 유효 다당체 분획을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 협막 다당체 생산방법 및 면역 증진 활성을 갖는 유효 다당체 분획을 수득하는 단계는 일 예로서, 본 발명의 실시예에 상세히 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서는, L. plantarum IMB19 균주 유래의 협막 다당체(Capsular polysaccharides; CPS)를 다양한 농도의 NaCl 용리액을 사용한 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분획하였으며, 각 분획에 포함된 다당체의 구조를 NMR을 통해 분석하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는, L. plantarum IMB19 균주 유래의 협막 다당체(Capsular polysaccharides; CPS)의 다양한 분획 중 100mM의 NaCl을 사용하여 정제한 CPS-100에서만 현저한 수준의 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-12을 생성하고 및 무시할만한 수준의 IL-10, IL-17, IL1-β 생산을 나타낸 반면, 다른 분획(CPS-400(테이코산 포함) 등). 유의한 사이토카인 생산이 검출되지 않아, L. plantarum IMB19 균주의 면역 증진 활성을 나타내는 유효 분자가 CPS-100에 포함된 특정 반복 단위의 폴리머 구조를 갖는 다당체(화학식 I)임을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 하기 화학식 I로 표시되는 다당체에 관한 것이다.

[화학식 I]

-[-D-B-I-F-G-C-E-H-A-]_n-

상기 화학식 I에서,

A 및 D는 갈락토오스(Galactose)이고,

B, C, E, G 및 H는 람노스(Rhamnose)이며,

F는 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)이고,

I는 포도당이며,

n은 1 이상의 정수임.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 A 및 D 중 어느 하나 이상이 인산화 된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 A의 경우, 1번 탄소의 수산화기가 인산화 된 것을 특징으로 할 수 있고, D의 경우, 6번 탄소의 수산화기가 인산화 된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명에 있어서, 상기 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)은 자연계에 일반적으로 존재하는 N-아세틸글루코사민 또는 이의 유도체를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 용어 “유도체”는 화합물의 구조가 본원에 개시된 화합물의 구조와 충분히 유사하고 이의 유사성을 기준으로 청구된 화합물과 동일하거나 유사한 활성 및 용도를 나타내거나, 전구체로서, 청구된 화합물과 동일하거나 유사한 활성 및 용도를 유도할 것으로 예상되는 모 화합물(예: 본원에 기재된 화합물, 화학식 I의 다당체)의 구조로부터 유래된 구조를 갖는 화합물을 의미한다. 예를 들어, 상기 유도체는 모 화합물의 염, 이성질체, 에스테르, 아미드, 에스테르 또는 아미드의 염, N-산화물 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 D와 B(D-B) 및 B와 I(B-I)는 α-1,3-글리코시드 결합으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 I와 F(I-F)는 β글리코시드 결합으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 F와 G(F-G), G와 C(G-C), C와 E(C-E), 및 E와 H(E-H)는 α-1,2-글리코시드 결합으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 H와 A(H-A)는 α-1,6-글리코시드 결합으로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 연결은 결합 배향에 따라 α 또는 β로 표시하였으며, 이어지는 숫자는 두 개의 단당류의 (-O-) 결합된 탄소 번호를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 n은 1이상의 정수로, 바람직하게는 1 내지 10의 정수, 더욱 바람직하게는 n은 4인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 다당체는 하기 화학식 II의 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:

[화학식 II]

n은 1 이상의 정수임.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 II의 n은 바람직하게는 1 내지 10의 정수, 더욱 바람직하게는 n은 4인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 협막 다당체의 유효 분획인 CPS-100에 포함된 화학식 I의 다당체의 평균 중합도는 약 4였으며, 평균 분자량은 약 6.0kDa로 확인되었다. 각 반복 단위([-D-B-I-F-G-C-E-H-A-])는 약 1.5kDa의 분자량(MW)으로 확인되었다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 다당체는 중합도, 인산화 정도 등에 따라, 최소 약 1.5kDa, 바람직하게는 약 1.5kDa 내지 약 15kDa, 더욱 바람직하게는 약 4kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 다당체는 KCTC 14337BP의 기탁 번호를 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) IMB19 균주 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 다당체는 면역 증진 및/또는 항 종양 활성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 구체적인 예로, 상기 L. plantarum IMB19 균주는 i) 헬퍼 T 세포의 유도 및 Treg 세포의 분화 억제와 같은 염증성 방향으로의 T 세포 분화 유도, ii) CD8+T 세포의 자극, 활성 향상 및 종양 내 침윤 향상, iii) Treg 세포 활성 억제, iv) 종양 내 대식세포 침윤 증가, v) 대식세포의 염증성 세포로의 활성화 및 M2에서 M1 대식세포로의 재프로그래밍과 같은 다양한 면역 증진 및 항 종양 활성을 가질 수 있으나, 이러한 메커니즘에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I 다당체는 종양의 성장을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 통상의 기술자들은 상기 다당체를 본 발명의 균주를 사용하여 생산/분리할 수 있으며, 이외의 다른 화학적 또는 생물학적 방법을 통해 본 발명의 다당체를 유도 또는 합성할 수 있다.

나아가, 본 발명의 다당체의 약동학(pharmacokinetics) 및/또는 약력학적(pharmacodynamics) 특성의 개선 또는 임상적 제형화(예, 가용성)를 위한 CPS의 구조의 변형(modification)이 수행될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, i) 하나 이상의 작용기의 추가, ii) 탄소사슬의 변형, iii) 하나 이상의 수소 또는 수산화기의 첨가, iv) 말단 기의 변형(예, 염료 등과 같은 시그널 분자의 추가), v) 다른 알려진 당 분자와의 결합(예, 경구 또는 전신 전달을 위한 제형 등) 등이 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 다당체는 상기 화학식 I 또는 화학식 II의 다당체에 한정되는 것이 아니며, 본 발명의 면역 자극, 면역 증진 효과를 갖는 한, 상기 화학식 I 또는 화학식 II의 변형체, 유도체, 유사체 등을 모두 포함하는 개념으로 해석되어야 한다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 화학식 I의 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 조절용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 다당체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 조절방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 다당체의 면역 조절 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 면역 조절용 조성물을 제조하기 위한 다당체의 용도에 관한 것이다.

이하에서, 용어에 관한 특별한 정의가 없는 한 통상의 기술자에 의해 이해되는 의미 또는 본 발명의 다른 관점에서 정의한 의미와 동일하게 이해될 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 조절용 조성물은 면역 자극 또는 면역 증진 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 조절용 조성물은 종양, 감염성 질환뿐만 아니라, 면역 감소/억제를 원인 또는 증상으로 하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 목적으로, 약학 조성물 또는 식품 조성물 등의 형태로 제조 및 사용될 수 있으며, 이때 사용량 및 사용 형태는 목적에 따라 적절히 조절할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 다당체의 half maximal effective concentration (EC50)는 3.16 μM로 확인되었다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 면역 조절용 조성물은 적어도 3.16 μM이상의 다당체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 조절용 조성물은 다른 약학 조성물 또는 식품 조성물과 병용하여 또는 보조제(adjuvant)로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 다른 약학 조성물은 면역 요법과 관련된 면역 치료제, 면역 세포 치료제 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 다른 식품 조성물은 발효 식품, 영양제와 같은 건강기능식품 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 면역 조절용 조성물은 본 발명의 다당체 외에도 다른 프로바이오틱 균주, 화합물, 보조제, 첨가제, 담체, 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 화학식 I의 다당체를 유효성분으로 함유하는 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 다당체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 다당체의 종양 또는 감염성 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 상기 다당체의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 용어, “종양” 은 생체 조절기구에서 이탈하여 세포가 자율성을 지니고 과잉 증식하는 현상 또는 이로 인해 생성된 신생물, 또는 과형성물을 모두 포함한다. 상기 종양은 예를 들어, 양성, 전악성, 악성 종양을 모두 포함하며, 보다 구체적인 예로, 조직세포종, 신경교종, 성상세포종, 골종, 각종 암, 예를 들어, 폐암, 소세포 폐암, 위암, 위장관암, 장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 유방암, 피부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 간암, 신장암, 방광암, 췌장암, 뇌암, 육종, 골육종, 흑색종, 림프종(호지킨 림프종, FL, MCL, MZBL, CLL, T-ALL, AML, ALL 등), 혈액암, 백혈병, 건선, 골질환, 섬유증식성 장애, 죽상경화증 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 그 유효성분인 화학식 I의 다당체의 상술한 면역 증진 효과 및/또는 항 종양 효과를 통해 다양한 질환에 대한 예방 또는 치료 및 항염증 효과를 나타낸다.

상기 약학 조성물은 그 유효성분인 화학식 I의 다당체를 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구로, 국소 또는 전신으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 치료 요법 또는 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 종양의 예방 또는 치료용도로 사용되는 경우, 바람직하게는 상기 다른 치료 요법 또는 치료제는 면역 요법 또는 면역세포치료제 일 수 있으나, 이에 제한되는 것을 아니며, 임상의의 판단에 따라 다양하게 조합되어 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 I의 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 면역 증진용 식품 조성물을 제조하기 위한 상기 다당체의 용도에 관한 것이다.

또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 그 유효성분인 화학식 I의 다당체와 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 균주 및 균주 유래 다당체는 in vivo 및 in vitro를 불문하고 세포에서 IFN-γ의 발현을 유도하고, IL-10 발현 억제함으로써, 면역 반응을 자극하여 증진시키는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 균주 및 균주 유래 다당체는 DC를 매개하여 CD8+ T 세포를 활성화할 수 있음을 확인하였다. 또한, MyD88 신호 전달 체계가 결핍된 경우에도 CD+8 T 세포의 활성화가 현저히 감소하는 것을 확인 하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 균주 및 균주 유래 다당체로 프라이밍된 DC와 naive CD4+ T 세포의 공배양을 통해 Th17 세포를 유도할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서,

(a) 항원 제시 세포(antigen presenting cell)에 L. plantarum IMB19 균주 및/또는 상기 화학식 I의 다당체를 처리하여 프라이밍하는 단계; 및

(b) 프라이밍된 항원 제시 세포를 T 세포와 공배양(co-incubation)하는 단계를 포함하는 염증성 T 세포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 용어 “항원 제시 세포”란, 항원을 받아들여 처리한 후 항원 유래 조각을 MHC classⅡ분자와 같은 항원 제시 분자와 함께 T 세포에 제시하여 분화를 유도하는 세포를 의미한다. 예로써 상기 항원 제시 세포는 대식세포, B 세포, 수지상 세포(dendritic cell; DC), 랑게르한스 세포 등이 있으나, 이에 한정 되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 T 세포는 naive T 세포인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 naive CD8+ T 세포 또는 naive CD4+ T 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “염증성 T 세포”란 면역 반응에 직접적으로, 또는 염증 전 단계에서 면역 반응을 유도 또는 도움을 주는 T 세포를 의미한다. 바람직하게는 상기 염증성 T 세포는 세포독성 T 세포 또는 도움 T 세포(Th cell)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 IFN-γ+CD8+ T 세포 또는 CD4+ RORγ+ Th17 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 염증성 T 세포를 유효성분으로 함유하는 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 비장 대식세포 또는 M2 표현형 대식세포를 CPS에 노출하는 경우에 MHC I, MHC II, CD68, iNOS2 및 CD40가 현저히 상향 조절되어, 종양 미세환경에서 면역을 억제하는 M2 표현형 대식세포를 M1 표현형 대식세포로 재프로그래밍할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 대식세포에 L. plantarum IMB19 균주 및/또는 화학식 I의 다당체를 처리하여 M1 표현형 대식세포로 분화시키는 단계; 및 상기 활성화된 M1 표현형 대식세포를 수득하는 단계를 포함하는 M1 표현형 대식세포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 용어 대식세포는 백혈구의 한 유형으로, 병원체, 외부 물질, 미생물, 암세포, 비정상 단백질 등을 삼켜 분해하는 식작용을 하며, 이러한 선천적 면역반응이외에도 적응 면역의 항원 제시 세포로도 기능한다.

대식세포는 염증성 대식세포인 M1 표현형 대식세포, 또는 항염증성 대식세포인 M2 표현형 대식세포로 분류되며, 면역의 자극 및 억제의 균형에 관여한다. 특히 M2 표현형 대식세포는 종양의 성장에 기여하는 것으로 보고된 바 있다(Ann Oncol 28, xii18-xii32 (2017); Front Oncol 9, 421 (2019)). 상기 M1 표현형 대식세포는 NK세포 또는 Th1에 의해 분비되는 IFN-γ, TLR의 PAMPs 인식을 통한 MyD88 경로 등을 통해 활성화되어, 항원 제시, 염증유전자 및 염증성 케모카인 분비 유도 등과 같은 면역 반응을 자극 및 유도하는 대식세포를 총칭하며, M2 표현형 대식세포(면역억제성 대식세포)는 IL-4, IL-13등에 의해 분화된 대식세포로, 면역 억제능을 나타내며, 조직 재건 및 상처 치유에 관여한다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 대식세포는 미성숙 대식세포(naive macrophage) 또는 M2 표현형 대식세포일 수 있다.

본 발명에 있어서, M1 표현형 대식세포는 면역 반응을 자극 또는 유도하는 염증성 방향으로 활성화된 대식세포를 제한없이 포함한다. 상기 M1 표현형 대식세포는 유전자 발현 프로파일의 변화로 분류가 가능하며, 예를 들어, 상기 M1 표현형 대식세포는 MHC I, MHC II, CD68, iNOS2, 및 CD40으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현이 상향 조절된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, “대식세포의 분화”란 대식세포의 기존 유전자 발현 프로파일에서, 다른 유전자 발현 프로파일을 나타내는 표현형으로의 활성화 또는 전환되는 것을 의미한다. 상기 분화는 미성숙 대식세포의 활성화 또는 분극화뿐만 아니라, 이미 활성화 되어 특정 표현형(예를 들어, M1 표현형 또는 M2 표현형)을 나타내는 대식세포의 재프로그래밍(reprogramming)을 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 용어 상향 조절이란, 대식세포의 전환 전 표현형과 비교하여, 특정한 유전자 또는 단백질의 발현이 향상되었음을 의미한다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 염증성 대식세포를 유효성분으로 함유하는 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재료 및 방법

1. 박테리아 배양 및 동정

김치를 균질화하고 현탁액을 수집하였다. 그 뒤, 연속 희석하고, MRS 브로스 및 한천에 스트리킹하여 37℃에서 48시간 배양하여 콜로니를 분리하고 다양한 분석을 위해 추가 배양하였다.

L. plantarum IMB19(L. plantarum IMB19)는 일반적으로 24~36시간 동안 37℃에서 MRS 브로스에서 배양하였다. TEM(transmission electron microscope)을 위해, 박테리아를 배양한 후, MRS-1.5% 한천(Neogen Corp., USA)에 스트리킹하고 24~30시간동안 배양하였다. 박테리아 콜로니는 2000 메시 그래핀 코팅 구리 그리드에 드롭캐스팅하였다. TEM 이미징은 JEOL1220 및 Hitachi HT7700을 사용하여 80kV에서 수행하였다.

동정을 위해, 선별된 분리 균주의 세포의 형태를 현미경으로 조사하였으며, 유전적 특성 분석은 게놈 DNA를 사용하여 수행하였으며, Macrogen(한국)에서 16s rRNA 서열 분석을 수행하였다.

16S rRNA 유전자는 정방향 (27F 프라이머), 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 '및 역방향(1492R 프라이머), 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'의 범용 프라이머를 사용하여 직접 PCR에 의해 증폭되었다.

2. 1차 세포 기반 시험

2-1. in vitro 비장세포 자극

모든 동물 실험 및 절차는 포항공과대학 동물관리 및 사용위원회의 윤리 규정 및 승인에 따라 수행되었다. C57BL/6 마우스는 병원체가 없는 동물 장벽 시설에서 사육 및 시설 내 번식되었으며, 6-8주령에 사용되었다. 비장을 수확하고 부드럽게 분쇄하여 비장세포를 방출하였다. 세포 현탁액을 암모늄클로라이드 버퍼를 사용하여 RBC 용해시키고 10% FBS (Hy-Clone, Australia)를 함유하는 완전 RPMI 배지 (Welgene, S. Korea) 에 재현탁시켰다. 세포를 96 웰 플레이트에서 항-CD3 (Bio-Xcell, USA) 10 ng/mL 및 GM-CSF (Peprotech, USA) 2.5 ng/mL을 함유하는 200μL의 배지/웰에 200k/웰의 밀도로 플레이팅 하였다. 분획된 CPS-100, 분획되지 않은 전체 CPS(tCPS), LPS(E-coli 0111:B4 유래의 지당류, Invivogen, USA) 및 배지를 필요에 따라 첨가하고, 37℃5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 제조업체의 지침에 따라, 원심 분리 후 상등액을 수집하고 효소 연결 면역흡착 분석(Enzyme linked immunosorbent Assay(ELISA); e-Bioscience, Ready set go ELISA kits)을 통해 사이토카인 추정을 위해 냉동하였다.

2-2. 면역 세포 공동배양 시스템.

상기한 것과 같이 비장 세포의 분리를 수행하였다. CD11c+APC(Miltenyi biotec) 및 미성숙 CD4+ T-세포(naive CD4+ T-cells) (Stem Cell Technologies)는 제조업체의 프로토콜에 따라 분리되었다. APC는 37℃, 5% CO₂에서 18 내지 20시간동안 프로바이오틱스 균주와 함께 배양되었다. 그 뒤, 프로바이오틱스 균주를 세척하고 프라이밍된 APC 및 CD4+T-세포를 특정조건에서 함께 공동배양하였다.

3. 안전성 평가(Safety evaluation.)

3-1. 용혈 테스트(Hemolysis Test)

L. plantarum IMB19를 최적의 성장 조건에서 성장시킨 다음 5%의 양 혈액 한천(Hanil, Komed)에 스트리킹하고 48시간 동안 배양하였다. 알파(α) 2 용혈은 적혈구의 헤모글로빈의 부분 분해로 간주하고(실제 용혈을 나타내지는 않음), 한천 플레이트에서 투명 영역으로 관찰되는 베타(β용혈은 적혈구의 헤모글로빈의 완전한 분해로 간주하였으며, 감마 (γ용혈은 용혈 부족으로 간주하였다. Bacillus cereus ATCC 27348을 양성 대조군으로 사용하였다.

3-2. 젤라틴 분해 시험

기본 프로토콜은 ASM Science Recommendation (Dela Cru et al., 2012)에 따라 수했하였다. 최적의 성장 조건에서 성장한 L. plantarum IMB19를 젤라틴 배지에 접종 루프로 접종하고 30℃에서 최대 5일 동안 배양하고 젤라틴 액화 및 박테리아 성장을 매일 확인하였다. 젤라틴은 일반적으로 28℃이상에서 액화된다. 액화가 젤라틴 분해효소 활성에 의한 것인지 확인하기 위해 튜브를 냉장고에 30분 동안 보관하였다. 그 후 튜브를 기울여 젤라틴이 분해되었는지 관찰하였다. 젤라틴이 분해된 경우, 저온의 노출 후에도 액화 배지로 나타난다. Bacillus cereus ATCC 11778을 양성 대조군으로 사용하였다.

3-3. 생체 아민 생산 분석(biologenic amine analysis)

L. plantarum IMB19는 최적의 성장으로 성장하였고, Bover-Cid 및 Holzapfel (Bover-Cid et al, 1999)에 따라 히스타민(histamine), 카다베린(cadaverine), 티라민(tyramine) 및 푸트레신(putrescine)의 전구체가 포함된 특수 배지에 스트리킹하여 37℃, 30℃ 및 23℃에서 4일 동안 배양하였다. 그 후 배지 색상의 변화를 확인하여 양성 및 음성을 결정하였다. E. coli ATCC 25922 을 양성 대조군으로 사용하였다. 배양은 브로모 크레졸 퍼플 지시약(bromo cresol purple indicator)과 함께, 오르니틴, 리신, 티로신, 히스티딘 중 하나의 염기성 배양 배지를 사용하여 한천 위에서 수행하였다.

3-4. 항생제 내성 시험

기본 프로토콜은 ISO 권장사항(ISO-10932, 2010)을 기반으로 수행하였다. 항생제에 대한 균주의 최소 억제 농도(MIC)를 평가하기 위해 브로스 희석 방법을 사용하였다.

배양액 미세 희석에서 시험 유기체는 배양액 배지에서 순수하게 배양하였으며, 모든 유기체를 1X PBS로 세척하였다. PBS로 세척된 박테리아 용액을 0.01 - 0.02의 600nm 광학 밀도(OD) 단위로 조정하였다. 균주 10 μL (1-2 x 10⁵CFU)를 항생제와 함께 200μL의 LSM 브로스 배지를 포함하는 96 웰 플레이트에 접종하였다.

균주는 유럽 식품 안전청 (EFSA, 2018)에서 설정한 파라미터에 따라 설정된 컷-오프 값과 같거나 낮은 특정 항생제에 대한 농도에서 억제되었을 때 감수성으로 간주되었으며, 규정에 따라 설정된 컷-오프 값보다 높은 특정 항생제 농도에서 억제되지 않으면 내성이 있는 것으로 간주되었다.

4. 미정제 협막 다당체(capsular polysaccharide, CPS)의 분리

미정제 협막 다당체(CPS)의 분리는 이전에 기술된 방법을 변형하여 수행되었다 (Verma et al., 2018). 세균 배양액을 원심분리하고, 10% 진폭 및 10초의 펄스에서 15분동안 Branson 디지털 초음파 처리기로 초음파 처리하였다. 상층액은 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid (0.5 % w / v))으로 4℃에서 밤새 처리되었다. 샘플을 6000rpm에서 20분동안 원심분리하고, 100% 에탄올을 3:1의 비율로 상층액에 첨가하여 미정제 다당체를 -20℃에서 침전시켰다. 침전물을 내독소가 없는 증류수에 준비된 마그네슘 클로라이드(20 mM, Sigma Aldrich) 및 칼슘 클로라이드(20 mM, Sigma Aldrich)를 함유하는 트리스 버퍼 (100 mM, Sigma Aldrich, USA)에 재현탁하고 DNAse (0.1 mg/mL, Roche, Germany) 및 RNAse (0.4mg/mL, Sigma Aldrich, USA)로 37℃에서 4~6시간 처리했다. 단백질 오염물질을 분해하기 위해 Pronase(0.3 mg/mL, Sigma-Aldrich, USA)에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 샘플에 37℃에서 30분동안 트리클로로아세트산 (1-2% w/v)을 처리하여 첨가된 효소를 포함하는 총 단백질을 제거하였다. 단백질이 제거된 샘플의 총 다당체는 에탄올 침전에 의해 다시 침전되었다. 펠렛을 내독소가 없는 물에 재현탁하고 4℃에서 48시간동안 하루에 두 번 물을 바꾸면서 투석하였다(MW cut-off 12,000Da). 총 CPS 분획은 배양물 리터 당 20mg의 최종 수율로 동결건조하여 수득하였다.

5. GC-MS 분석 조건

모든 화학 유도체는 질량 선택 검출기 5973N 및 Zebron ZB-5 모세관 컬럼 (Phenomenex, 30 m x 0.25 mm i.d., 필름 두께 0,25 μm, 유속 1 mL/min, 캐리어 가스로 He)이 장착된 기체-액체 크로마토그래피 (GLC-MS) Agilent 7820A (Santa Clara, CA, USA)를 사용하여, 분석되었다. 전자 충격 질량 스펙트럼은 70eV의 이온화 에너지 및 0.2mA의 이온화 전류로 기록되었다. 사용된 온도 프로그램은 다음과 같다: 150 ℃ 에서 5분, 10 °C/min로 150℃에서 300℃까지, 300℃에서 12분.

6. NMR 수집 매개변수

분리된 다당체의 구조적 분석을 위해, Z 축을 따라 기울기가 형성된 역 크라이오-프로브(reverse cryo-probe)가 장착된 Bruker 600 MHz 분광기를 사용하여 NMR 스펙트럼을 D₂O에 기록하였다. 스펙트럼은 298K 또는 310K에서 측정하였으며, 내부 표준으로써 아세톤(¹H 2.225 ppm; ¹³C 31.45 ppm)으로 보정하고, Topspin 2.0 소프트웨어(Bruker)로 획득하고, Topspin 3.6으로 처리 및 연구하였다. ¹H-¹H DQ-COSY(이중 양자 COZY 스펙트럼, 이하 COSY), TOCSY 및 NOESY 스펙트럼은 2048 x 512 포인트의 데이터 세트(t1 x t2) 및 TOCSY 및 NOESY 스펙트럼의 경우 각각 100ms 및 200ms의 혼합 시간이 설정된 24번의 스캔으로 수집하였다. 이종핵 ¹H-¹³C HSQC, HMBC, 및 HSQC-TOCSY 스펙트럼은 2048 x 512 포인트의 데이터 세트를 사용한 ¹H-검출 모드에서 수행되었다. HSQC 및 HSQC-TOSCY는 “CH₂” 밀도를 다른 밀도와 구별하기 위해 선택 단계에서 다중 편집으로 수행되었다. HMBC는 일-결합 상관관계를 억제하기 위해 저역 통과 J 필토를 사용하여 장거리 커플링 상수에 최적화되었으며, 장거리 상관관계의 진화에는 60ms지연이 사용되었다. HSQC-TOCSY의 경우, 혼합시간을 100ms로 설정했다. 모든 2차원 시험에서 데이터 매트릭스는 4092 x 2048 포인트로 확장되었으며, qsine 또는 sine window 함수를 적용하여 변환하였다.

7. 동물 및 마우스 종양 모델

C57BL/6 & Balb/c 마우스는 포항공과대학교 동물시설에서 확보 및 유지하였다. Pmel-1 TCR 트랜스제닉, MyD88^-/- 및 IL-6^-/- 마우스는 Jackson Lab 에서 얻어 POSTECH 동물 시설에서 유지되었다. C57BL/6-유래 흑색종 세포주 B16.F10 및 Balb/c 유래 유방암 세포주 EMT-6은 ATCC에서 조달하여 제공된 프로토콜에 의해 유지되었다. 공통유전자 종양 모델(Syngeneic tumor models)은 20만개의 B16.F10 종양세포 또는 50만개의 EMT-6 세포를 피하주사하여 생성하였다. 종점까지 격일로 종양 크기를 측정하고 종양 부피를 길이 x 넓이²x 0.5로 계산하였다. 선천성 면역세포의 초기 침윤 분석을 위해 종양세포를 5 mill/마우스로 피하주사하고 40시간 뒤 종양세포를 분석했다. 모든 실험 동물 절차는 포항공과대학교 동물관리 및 사용위원회(IACUC)의 승인을 받아 수행되었다.

8. 세포 기반 in vitro 분석 방법

비장 및/또는 림프절에서 채취한 총 세포를 전체 비장 세포 배양에 사용하거나 또는 자성 비드 분리(Miltenyi Biotec)에 적용하여, CD11c+ 수지상세포, 미성숙 CD8+ T 세포(naive CD8+ T-cell) 또는 미성숙 CD4+ T-세포를 풍부하게 하였다. 총 비장 세포(20만개/웰)을 96플레이트에 박테리아와 1:1비율로 배양하고, 48시간째에 상등액을 수확하여, ELISA (eBioscience Ready set Go kits)에 사용하였다. CD11c+ 수지상 세포(20만개/웰)을 적절한 비율의 박테리아로 18 내지 20시간동안 프라이밍하고 세척한 뒤, T-세포(20만개/웰)를 첨가하여 72시간 동안 배양하였다. 지시된 것과 같이, CD8+T 세포의 자극을 위해 anti-CD3@0.01μg/ml (BioXCell), GM-CSF@2.5ng/ml (Peprotech)을 CD4+ T 세포의 자극을 위해 anti-CD3@0.1μg/ml, GM-CSF@10ng/ml, IL2@100U/ml 및 TGFß(Peprotech)를 첨가하였다.

복막 대식세포의 경우, 2% BIogel(Bio-Rad)을 복강 내 주사한 5일 뒤 세포를 수확하였으며, 제조합 뮤린 MCSF 10ng/ml (Peprotech)와 함께 in vitro 배양하였다. 선택적으로 활성화된 대식세포의 분극화(polarization)를 위해, IL-4 (Peprotech)를 24시간동안 첨가한 후, CPS, LPS (E-coli 0111:B4 유래 지질다당체, Invivogen) 또는 Pam3CSk4 (Sigma)로 처리하였다.

9. 메타유전체(Metagenomics) 분석 및 전체 유전자 서열분석(Whole genome sequencing)

종양을 보유한 SPF 마우스의 대변 펠릿을 메타유전체 분석을 위탁하였다 (Macrogen, S.Korea). 박테리아의 전체 유전자 서열분석은 일루미나 플랫폼(Illumina platform, Macrogen, S.Korea)에서 수행되었으며; 박테리아 배양 샘플을 분석을 위해 직접 송부하였다. 생물정보학적 분석도 Macrogen에 위탁 수행하였다.

10. 종양침윤 대식세포의 분류 및 유전자 발현 프로파일 분석

마우스에 500μg의 CPS를 24시간 간격으로 두 번 주입한 뒤, 5x10⁶ 개의 B16.F10 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양 이식 40시간 후, 침윤 면역 세포를 포함한 전체 종양을 Liberase에서 단일 세포 현탁액으로 소화시켰다. 동일한 처리 그룹에서 5 내지 10마리의 마우스 샘플을 모집하고, Fixable Viability-ef506 (eBioscience), CD45-AF488 (Bioloegend, 30-F11), CD3-ef450 (Ebioscience, 145-2C11), CD19-PB (Ebioscience, 1D3), I-A/I-E-PECy7 (Biolegend, M5/114.15.2), CD11c-PE (Ebioscience, N418) 및 CD11b-PerCpCy5.5 (BD, M1/70)로 염색하였다. 살아있는 CD45⁺CD3^-CD19^-MHCII^hiCD11c⁺ CD11b⁺ 대식세포를 FBS 보충된 배지로 분류하고 원심분리하여 트리졸(Trizol, Sigma)에 보관하였다. 샘플은 Macrogen에서 유전자 발현 프로파일을 분석하였으며, 처리 군간의 유전자 전사체 수주의 평균 폴드-체인지를 계산하고, 두 비교에서 폴드-체인지가 1.5이상인 유전자를 경로 분석을 위해 DAVID v6.7(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery v6.7)에 입력하였다. 면역 기능이 현저히 강화된 것으로 결정된 유전자를 히트맵에 표시하였다(p<0.05).

11. 리스테리아 모노사이토제니즈(Listeria monocytogenes) in vivo 세포독성 분석

종래 알려진 방법으로 분석을 수행하였다. 구체적으로, C57/Bl6 마우스에 OVA 펩타이드(LM-OVA)를 발현하는 리스테리아 모노사이토제니즈를 5000 CFU/mice로 주입하였다. 마우스에 격일로 L. plantarum IMB19 균주를 급여하였다. 6일 째에, naive C57/bl6 마우스의 비장세포를 OVA 펩타이드로 펄싱하고, 펩타이드 펄스되거나 되지 않은 세포를 CFSE 또는 CTV로 염색하고, 1:1비율로 혼합하여 감염된 마우스의 정맥 내로 투여하였다. LM-OVA에 감염된 마우스를 2시간 이후 희생시켜, 비장세포/림프절을 수확하고 유동 세포 분석을 사용하여 펩타이드 펄스된 비장세포의 세포 사멸률을 검출하였다.

12. 크로마토그래피를 사용한 정제

분리된 전체 협막 다당체(tCPS 28 mg)는 음이온 교환 Q-세파로오스 고속 플로우 방법을 통해 정제하였다(GE Healthcare; V = 4.4 mL, flow 16 mL/h). 수지는 패킹되어, 1M NaCl에서 세척하고, 10 부피의 NaCl 10mM로 평형화되었다. 그 뒤, 전체 협막 다당체(tCPS)를 10mM NaCl(5mL)에 용해시키고 수지에 흡착시켰다. 용출은 16mL의 NaCl(각, 10, 100, 200, 400, 700 및 1000mM)을 순차적으로 첨가하여 단계적으로 수행되었다. 각 농도의 NaCl에서 용출된 용출액을 수집하고, 투석(Cut-off 1kDa)에 의해 탈염 및 동결건조하였다. 각 농도의 NaCl에서 용출된 6개의 분획을 CPS-X(X는 용출에 사용된 NaCl 농도, mM)로 표지하였다.

분자량 측정은 용리제(eluent)로서 50 mM의 NH₄HCO₃로 평형화된 TSK G-5000 PWXL 크기 배제 컬럼 (30 cm x 7.8 mm)을 사용하는 HPLC system Agilent 1100을 사용하여 CPS-100에 대해 추론되었으며(flow=0.8mL/min), 용출액을 굴절률 검출기(refractive index detector)로 모니터링하였다. 컬럼은 알려진 분자량(각 12, 50, 150 및 670 kDa)의 덱스트란 표준(1mg/mL 용액 50μL)을 주입하여 보정하였다. 분자량의 로그는 용출 부피에 대해 플롯되었고, 설립된 선형 관계(linear relationship, LogPM=-0.811mL+11.7; R2=0.98)를 사용하여 다당체의 MW를 계산하였다.

13. 통계분석

종양 성장 곡선은 두 그룹의 비교를 위한 Sidak's 다중 비교 사후-검정, 여러 그룹과 대조군간의 비교를 위한 Dunnett's 다중 비교 사후-검정 또는 두 개 이상의 그룹의 각각의 비교를 위한 Tukey's 다중 비교 사후-검정을 이용한 양방향 ANOVA를 사용하여 분석하였다. 다른 비교의 경우, 두 그룹을 비교할 때 unpaired Student 's t-test를 사용하였으며, 두 그룹 이상을 비교할 때는 다중 검정을 위한 BonFerroni 보정과 일원 분산 분석이 사용되었습니다. P <0.05는 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다 (* P <0.05, **?* P <0.01, **?*?* P <0.001, **?*?*?* P <0.0001). GraphPad PRISM v8.0을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. Flow-jo 소프트웨어 v10.1을 사용하여 유동 세포 분석 데이터를 분석하였다.

실시예 2: L. plantarum IMB19의 분리 및 동정

L. plantarum IMB19 (L. plantarum IMB19)는 주로 원료 유래 미생물에 의해 발효된 가정용 김치로부터 분리되었다. 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.)의 콜로니를 유도하기 위해, 연속 희석한 김치 현탁액을 MRS 브로스(De Man, Rogosa and Sharpe broth, Becton-Dickinson, USA) 플레이트에 스트리킹하였다. 배양한 단일 콜로니를 분리하고, MRS 브로스에서 추가로 배양하였다. 콜로니의 형태가 각각의 개별 균주를 구분하기에 충분하지 않았기 때문에, 14개의 분리된 박테리아를 PCR 및 16s rRNA 서열 분석하고, NCBI의 BLAST를 사용하여 서열의 유사성을 확인하였다. 분리된 분리된 박테리아는 모두 젖산균(LAB)에 속하는 것으로 밝혀졌다. 분리된 박테리아 중 L. plantarum과 99% 이상의 유사성을 가진 균주를 동정하였으며, 그 외에도 많은 분리된 박테리한천 Weissellia koreensis와 99% 유사함을 확인하였다. 이러한 결과는 김치의 우점종이 L. plantarum과 Weissellia koreensis라는 기존의 보고와 일치한다.

분석된 L. plantarum IMB19의 16S rRNA 서열 정보는 다음과 같다.

- L. plantarum IMB19 16S rRNA(785 Foward) (서열번호 3)

AGCGCTGGGATGATGCTAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAGGGTAAAACCGTAAAGATGTTCAACCCGCCACATCTGTCGCGTCTCCGTCGTAGATATAAGAAAGCCAAAGGGCCTTTCTTCCATGGCTGGGTGTTCATGCAATAACATCGACCGGTTATCCACGACACAAGAAAGGATTACGTTGGTCCTGGTTGTGCGCTCAGGTTTTATAGTGACAGCGGGCCTATTTGTATGGTGTAAACCGGAGTGCTAACAATCTTCTACAAGAAACAGCCTGTACATAAATTTACGGCATATATATACCGGAACGTGGCTTGGCCACGTATGTTATTAACGCGGGCTGGCAGGAACTTACTAGGCCGTGCCATTCCGGTGTCAAATCCGACCGAATCCGGGGACTCGTCTCGCGGAAATGTGTTTCTTTTTAGAGACATGGATTCTTACAAACCGAGACCCTGTCATGCCCGGGATGAGGGTCTGCCACTAACAACTTTCCGAACATGATGGGAAGAACCCCCTAACGGGCGCCCACCTGGAGGAATTTGGGCCGGGGCACCACCGCCCGAGGTGGGGCGGAAAACCCCCTCCAGGGGTCCCATCCTCAATTTTTCCGGGGGGGACCCCCCTCCCCCCCAAAATGAGGGAAAACCCCCGGGGGGGCACCCCCAAAAGAAGGAGAGCCCCCCACCCTCACTCTTCCCGCCCGGCGTGCGGGGGCGGGTTTTTTTTTCTGTCAAAATAAATTTTGTGTTGTTTGTGTGTTCCTCCCCCCCCCGCCGCGGGGGCGGGGTTGTACTTTTTTCCCTCTCCATCCCCCCCCCACCACAAAAGAAAAGGAGGGGACGACACCCACAGTGGGTGTGTTTTT

- L. plantarum IMB19 16S rRNA(907 Reverse) (서열번호 4)

TTGACGGGGGGGTCTCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCCCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGACAGAGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCCGGGGGGATCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGAGGGGTTGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGTGTGGGGGGGGGGGGGTTGTTGTTTTTGTTTGGGGGGGGGGTTGTTTTTTGTGTGTGTTTTGTTGTTTGTTTGGGGGTGTGTTTTGTTGTGGGGTGGGGTGTTGGGGGGGTTGGGGGGGGGGTGTTGTTTGGGGGGGGTGGGGGGGGGGGTTTTTTTGTTGTTGTGTGGTTGTGTGTTGTGTGGTGGGTGGGGGGGGTGGTGTGTGTGTGGGGGTGGGGGGTGTTTGGTGGGGGGGGGGTTGTTGTGGGGGGGTGGTGTTTGTTTTTTGTTTTTTTTTGTGTGTGGGGGGGGGGGGTGGGGGGTGGTTTGTGGGGTGTTGTTTGTGTGTGGTTGGTGGTGGTGTGTGGGGGGGTTGGGGGGGGGGGGGTTGTCTTTTTTGTTGGTGTTGGGTGTTTGTTGGTGTTGGTGTGTGGTGGGGTGGTGTGGTGGGTGGGTGCTTGTTGTGTGTGTGGTGTGT

실시예 3: L. plantarum IMB19의 선별

분리된 박테리아의 면역 세포에 대한 면역 자극 효과를 확인하기 위해 박테리아 배양 분리물이 뮤린의 비장세포에 미치는 영향을 테스트하여, 면역 세포에 대한 자극 효과가 있는 박테리아를 확인하였다. 전체 비장세포를 분리된 박테리아와 48시간 동안 배양한 뒤, 배양 상등액에서 사이토카인의 수준을 측정하였다. 잘 알려진 염증 마커인 IFN-γ와 항 염증 사이토카인인 IL-10을 사용하여 상기 분리된 박테리아가 면역세포에 미치는 영향을 평가하였다. 모든 분리된 박테리아 중에서, 무시가능한 수준의 IL-10과 매우 높은 양의 IFN-γ를 유도하는 신규한 Lactobacillus plantarum 균주를 선별하고, L. plantarum IMB19라 명명하였다(도 1, colony 1).

실시예 4: L. plantarum IMB19의 미생물학적 및 생화학적 특성 분석

L. plantarum 의 콜로니 형태는 작고 매끄러운 원형이며 반투명한 모습을 나타낸다. Cryosection TEM을 통해 L. plantarum의 비편모(non-flagellated), 막대 모양의 미생물 콜로니를 확인하였다(도 2A). 개별 박테리아의 두꺼운 협막층이 일반적으로 분명하게 확인되었다. 양 혈액 한천(sheep blood agar)에서 배양하는 경우에는 투명하거나, 초록빛 영역이 없어, 해당 균주가 다른 락토바실러스와 유사하게 비용혈성(non-hemolytic) 또는 γ용혈성(γ-hemolytic)으로 확인하였다(도 2B). 양성 대조군으로 사용된 Bacillus cereus ATCC 11778에 대해 최대 5일까지 젤라티나아제 활성에 음성으로 나타났다(도 2C). 또한, 특화된 배지에서 상기 균주의 네 가지 생체 아민 생성을 테스트하였다(히스타민(histamine), 카다베린(cadaverine), 티라민(tyramine) 및 푸트레신(putrescine)). L. plantarum IMB19의 경우 E-coli ATCC 25922와는 달리, 생체 아민을 생성하지 않는 것으로 밝혀졌다(표 1).

L. plantarum IMB19 및 E. coli ATCC 25922의 생체 아민 생산 활성

균주	Histamine	Cadaverine	Tyramine	Putrescine
L. plantarum IMB19	Negative	Negative	Negative	Negative
E. coli ATCC 25922 (positive control)	Positive	Positive	Positive	Positive

항생제 감수성 테스트 결과는 하기 표 2와 같이, 대부분의 락토바실러스 종과 마찬가지로, 카나마이신(kanamycin)을 제외하고 대부분의 임상 관련 항생제에 감수성을 나타내는 것으로 확인되었다(Appl Environ Microbiol 85, (2019)).

*EFSA= 유럽 식품 안전처(European Food Safety Authority), Amp = Ampicillin, Ery = Erythromycin, Gen = Gentamicin, Tet = Tetracycline, Str = Streptomycin, Chl = Chloramphenicol, Cli = Clindamycin, Kan = Kanamycin, Van= Vancomycin, n.r= not required, Q.C= Quality Control.

실시예 5: L. plantarum IMB19의 유전학적 특성분석

16S rRNA 서열 분석에 기반한 서열 유사성 비교는 L. plantarum 종 간의 동일성을 확인하였다. 또한, PCR에 의한 recA 유전자 분석을 통해 L. pentosus 및 L. paraplantarum과 같은 유전적으로 밀접한 다른 종과 구분하였다(Appl Environ Microbiol 67, 3450-3454 (2001)).

DNA 분리, Pac-Bio & Illumina Hi-seq 서열분석 및 생물정보학에 기반한 분석이 수행되었다(Macrogen, 한국).

L. plantarum IMB19는 recA 유전자 유래 프라이머를 사용하여 recA 유전자를 증폭 및 밴드를 비교하여, 다른 유전적으로 밀접하게 관련된 종과 구별하였다. 몇몇 L. plantarum 균주는 전체 게놈에서 유사성을 갖는 것으로 알려져 있으므로, 평균 뉴클레오타이드 지수(OrthoANI)를 기반으로 계통 발생 분석을 수행하고, L. plantarum IMB19를 고유한 균주로 동정하였다(도 3). 4개의 알려진 균주에 대한 병원성 유전자 서열 상동성(virulent gene sequence homology)을 기반으로 Virulence Finder 2.0을 사용하여 추정되는 병원성 유전자의 존재를 확인하였다. 90% 뉴클레오타이드 컷-오프를 사용하여 병원성 유전자에 대한 어떠한 유의미한 히트가 나타나지 않았다. ResFinder(J Clin Microbiol 52, 1501-1510 (2014))에서 확인할 수 있는 바와 같이, L. plantarum IMB19의 전체 게놈에는 항생제 내성 유전자가 없는 것으로 확인되었다.

상기 실시예들에 개시된 바와 같이, L. plantarum IMB19는 기존에 보고된 L. plantarum 균주와 상이한 특징을 갖는 신규한 균주로서, 2020년 10월 21일 한국생명공학 연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC 14337BP로 기탁하였다.

실시예 6: L. plantarum IMB19의 뮤린 T 세포에 대한 면역 자극효과.

L. plantarum에 속하는 여러 균주의 숙주 면역 및 건강에 미치는 유익한 효과는 종래 보고된 바 있으며(Biomed Res Int 2018, 9361614 (2018)), 본 발명의 L. plantarum IMB19 의 뮤린 면역세포에 대한 직접적인 효과를 확인하였다. 본 발명자들은 항원 제시 세포(APC)에 의한 박테리아 항원의 흡수가 활성화 상태를 변경할 수 있으며, 이를 통해 다른 면역 세포를 프라이밍하고 결과적으로 면역 시스템의 조절이 가능할 것으로 예상하였다. 따라서, 각각 선천적 면역 시스템 및 적응 면역 시스템을 나타내는 APC 및 CD4+T 세포를 모두 포함하는 공동배양 시스템을 설계하였다. CD11c+APC를 박테리아에 20시간동안 노출시켰다(APC:박테리아 = 1:100). 이러한 APC는 면역 표현형을 왜곡하지 않고, 서브옵티멀한 외부 자극 아래에서 미성숙 CD4+T 세포(naive CD4+T cell)와 공동배양하였다. T-세포의 Th1, Th2, Th17 또는 조절 T 세포(Treg)로의 분화를 확인하기 위해, 다른 전사인자, Tbet, GATA3, RORγ및 Foxp3를 분석하였다. 특별한 외부의 영향 없이, L. plantarum IMB19는 다른 세가지 균주와 비교하여, CD4+ RORγ+ Th17 세포의 생성을 현저하게 유도하였다(도 4A). 다른 Th 세포의 서브타입의 유의미한 생성 여부는 명확하지 않았으며, 다른 L. plantarum 균주와 유사하게 나타났다(도 4B).

상기 결과의 검증을 위해, Th17 세포의 최소 생성 조건에서, L. plantarum IMB19에 의한 Th17 세포의 생성을 테스트하였다. L. plantarum IMB19는 상당한 양의 IL-17을 생산하는 CD4+ RORγ+ Th17의 생성을 현저히 증가시켰다 (도 5A).

반면, L. plantarum IMB19는 중성 조건에서 상당한 양의 Foxp3를 유도하지 않았으며(도 5B), 따라서, L. plantarum IMB19가 충분한 농도의 TGF-ß에서 naive CD4+T-세포로부터 Treg을 생성할 수 있는지 확인한 결과, TGF-ß의 농도 증가하에서 오히려 Treg의 생성을 현저히 억제하는 것으로 확인하였다.

실시예 7: L. plantarum IMB19의 생체 내에서 항 종양 면역 반응을 촉진효과 확인

L. plantarum IMB19 균주 및 대조군으로서 다양한 락토바실러스 균주(14종)를 비장 세포와 함께 배양하여 면역 세포에 의한 사이토카인 생산의 변경여부를 비교하였다. 그 결과, 다른 락토바실러스 균주에 비해 L. plantarum IMB19는 현저하게 높은 IFN-γ 수준 및 현저하게 낮은 IL-10 수준을 나타냈다 (도 6A). 참고로, 다른 균주인 Lactobacillus murinus는 가장 높은 IL-10 유도능을 나타냈으며, 낮은 IFN-γ생산을 보였다 (도 6A).

CD8+T-세포가 주요 항 종양 이펙터 세포기 때문에 분리된 상기 두 균주의 CD8+T 세포 자극능력을 확인하였다. 박테리아로 프라이밍된 수지상 세포(DC) 및 CD8+T-세포의 공동배양에서, L. plantarum IMB19를 처리하는 경우에 IFN-γ 수준의 증가를 확인하였으며, 특히, Lactobacillus murinus를 처리한 경우에 비해 현저히 증가하였다(도 1B). 비장 및 장간막 림프절 항원제시세포와 공동배양시에 CD8+T-세포의 활성화는 박테리아의 농도에 의존적으로 변화하였다 (도 7A 및 7B).

L. plantarum IMB19는 수지상 세포가 없는 경우에는 CD8+T-세포를 직접 자극하지 않았다. 마우스 흑색종 특이적 항원 Pmel-1에 대한 TCR 운반 CD8+T-세포의 활성화는 항원 gp-100의 존재하에 유사하게 활성화 되었다(도 7C). DC 외에도 대식세포는 종양의 성장 및 억제에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 APC이기 때문에, CD11b+ F4/80+ 복막 대식세포를 통한 CD8+T-세포 자극에 대한 L. plantarum IMB19의 효과를 확인하였다. 수지상 세포와 유사하게, L. plantarum IMB19는 대 식세포-CD8+T-세포 공동배양시에, IFN-γ세포의 비율을 크게 증가 시켰다(도 6C).

CD4+Foxp3+조절 T 세포 (Tregs)는 종양에 축적되며, CD8+T 세포 및 기타 면역 세포의 이펙터 기능을 억제하여 종양 진행을 증가시킨다. 또한 Treg 생성을 촉진하는 여러 박테리아가 보고된 바 있다(Nature 453, 620-625 (2008); Sci Immunol 3, (2018)). 따라서, 본 발명자들은 L. plantarum IMB19가 CD11c+DC 및 CD4+T-세포의 공동배양시에 Treg 유도에 영향을 미치는지 확인하였다. 고도의 Treg 왜곡 배양 조건에서 L. plantarum IMB19는 TGF-ß의 존재 아래에서 의한 Treg 생성의 상당한 억제를 나타내었다(도 6D). 이 효과는 더 낮은 수준의 TGF-ß에서도 지속되었으며 테스트 된 조건 모두에서 Treg 생성이 관찰되지 않았다(도 8A). 반면, 인터루킨-17A (IL-17A)는 증가하였으며(도 8B), 이는 T-helper-17 세포 (Th17)의 생성을 의미한다. 인터루킨-6 (IL-6)은 Th17 생성에 필수적이며 TGF-ß의 존재하에 Treg 생성을 억제한다(Eur J Immunol 40, 1830-1835 (2010)). 이에 따라, IL-6 결핍 DC는 CD4+ T 세포 공동배양은 Tregs를 생성하였다. 따라서, L. plantarum IMB19 프라이밍 DC에 의한 IL-6 생산은 Treg 왜곡 배양 조건 하에서 Treg 생성을 억제한다.

L. plantarum IMB19에 의해 활성화된 CD8+T 세포가 기능적으로 세포 독성인지 여부를 테스트하기 위해 OVA 항원 (LM-OVA)을 발현하는 급성 Listeria monocytogenes 감염 모델을 사용한 세포독성을 시험하였다(도 6E). L. plantarum IMB19를 급여한 LM-OVA 감염 마우스는 생체 내에서 OVA pulsed CFSE가 로딩된 표적 세포의 용해에서 현저한 증가를 나타냈다 (도 6F). 또한, SPF(specific pathogen free) 및 GF(Germ free) 마우스 모두에서 피하 이식된 B16.F10 흑색 종에 대한 L. plantarum IMB19의 효과를 평가하였다 (도 6G). L. plantarum IMB19는 L. murinus와 비교하여 SPF 및 GF 마우스 모두에서 흑색종 성장의 현저한 억제를 나타냈다 (도 6H, 6I). L. plantarum IMB19가 항 종양 효과를 초래하는 모든 군집붕괴(dysbiosis)를 유도하는지 여부를 평가하기 위해 L. plantarum IMB19를 급여한 종양 보유 동물의 대변 샘플에 대해 16s 리보솜 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 그러나, PBS 대조군과 비교하여 L. plantarum IMB19 급식 마우스의 대변에서 미생물 다양성에서 중요한 변화를 발견하지 못했다(도 9A 내지 9C). 이는, 항 종양 면역의 L. plantarum IMB19 매개 조절은 L. plantarum IMB19 특이적인 효과에 해당하며 군집 붕괴의 결과가 아님을 의미한다. 종합적으로, 본 실시예의 데이터는 L. plantarum IMB19가 생체 내에서 세포 독성 T 세포 매개 항 종양 면역 반응의 양성 조절자임을 나타낸다.

실시예 8: L. plantarum IMB19 유래 미정제 다당체 분획의 화학적 특성 분석

투과 전자 현미경(TEM)에 의한 분석 결과, L. plantarum IMB19의 세포는 람노스, 갈락토오스, 포도당 및 글루코사민으로 구성된 탄수화물 조성, 및 소량의 글리세롤 및 리비톨 함유하는 협막 물질의 층으로 둘러싸여 있는 것으로 확인되었다(도 10및 도 11A). 두 개의 폴리올은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 통해 상호 연결되는 테이코산(teichoic acids)의 존재와 관련이 있다(Tomita, Tanaka, & Okada, 2017). 일반적으로, 메탄올분해(methanolysis)는 포스포디에스테르 결합을 완전하게 절단할 수 없기 때문에 이러한 폴리올의 검출이 매우 어렵다. 따라서, 메탄올분해 및 아세틸화 전에 수성 HF로 시료를 탈인산화하여 GC-MS 분석을 반복하였으며, 두 폴리올의 양이 증가하는 것을 토대로 테이코산의 존재를 확인했다. 단당류의 경우, 람노스는 L 절대배열을, 글루코스와 갈락토오스는 D 배열(도 12)을 갖는다. 반면, 글루코사민의 경우, D 배열은 입체 이성질체의 독점적 존재에 기초하여 가정되었다.

실시예 9: 미정제 다당체의 정제

탄수화물 성분의 화학적 분석 결과는 CPS가 중합체의 혼합물일 수 있음을 시사했다. 이에 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 CPS를 정제하여 얻은 6개의 분획을 사용된 용출액의 농도(X)에 따라 CPS-X로 표시하였다. 정제를 통해 얻은 수율은 다음과 같다: CPS-10 11 %, CPS-100 13 %, CPS-200 9.0 %, CPS-400 51 %, CPS-700 7.0 %, 및 CPS-1000 7.9 %. 각 분획은 ¹H NMR 분석을 사용하여 원래의 혼합물(CPS)의 스펙트럼 프로파일과 비교하였다(도 13).

구체적으로, 각 분획은 아래와 같다(도 13).

CPS-100(도 13b): CPS-10은 다소 이질적인 스펙트럼을 나타내었다. CPS-10의 아노머 영역은 탄수화물과 상이한 물질과 관련된 4.2 및 1.3ppm의 강한 신호를 갖는 2개의 주요 신호를 포함한다.

CPS-100(도 13c): CPS-100의 아노머 영역(5.6-4.5 ppm)은 α-배열(³ J _H1,H2=3.4 Hz) 및 인산화 (³ J _H1,P=7.0 Hz)된 잔기를 나타내는 5.5ppm에서의 이중 더블릿(도 14)을 갖는 9개의 주요 신호를 포함한다. 또한, 각각 N-아세틸글루코사민 및 람노스 유닛의 존재와 일치하는 아세틸기(2.06 ppm에서의 메틸기) 및 디옥시잔기(1.3 ppm)의 여러 메틸기를 포함하는 강한 신호를 확인하였다.

CPS-200(도 13d): CPS-200은 CPS-100과 CPS-400의 혼합물로 나타났으며, 아노머 영역에서 4개의, 다소 넓은 신호를 나타내고, 1.6ppm(람노스의 메틸과 일치하지 않는 값)와 혼잡한 카미놀 영역(4.4-3.2 ppm)에서 강렬한 메틸신호를 나타냈다.

적분을 통해 아노머 양성자 및 카비놀 양성자 사이의 비율은 1.0:12로 나타났으며, 일반적으로 예상되는 비율은 1:6 또는 그 이하로, 이는 CPS-400이 다당체의 전형적인 구조를 가지고 있지 않음을 의미하며 비율의 증가는 화학적 분석에 의해 확인된 바와 같이 리비톨 및 글리세롤 유닛의 존재 때문이다(도 15). 또한, 글루코스는 가장 풍부한 단당류였으며, 그 다음으로 펩티도글리칸의 특징으로 소량의 글루코사민(GlcN) 및 무라민산(MurA)의 두 단당류가 풍부하게 나타났다.

이러한 관찰은 CPS-400이 테이코산(TA)임을 의미한다.

CPS-700 및 CPS-1000(도 13f 및 13g): 아노머 영역은 CPS-400에서 발견되는 신호의 일부만 포함되었으며, 두 분획 모두 아노머 양성자 및 카비놀 양성자 사이의 비율은 비정형적이었다. 비탄수화물 물질의 신호 또한 추가로 확인되었다.

CPS에서 CPS-10, CPS-700 및 CPS-1000의 양이 풍부하지 않아 소량만 획득되었다.

실시예 10: CPS-100의 NMR 분석

협막 다당체의 구조는 310K에서 기록된 ¹H-¹H 동종핵 (COSY, TOCSY, NOESY) 및 ¹H-¹³C 이종핵 (HSQC, HMBC, HSQC-TOCSY) 2D NMR 스펙트럼의 완전한 세트를 분석하여 결정되었다(표 3).

* C 및 E의 C-3은 오버랩되며, 이들의 정확한 화학적 이동은 확실하게 결정되지 않음.

** C, E, G 및 H의 C-5는 오버랩되며, 이들의 정확한 화학적 이동은 확실하게 결정되지 않음.

297K(도 13c)에서 310K(도 14)로의 온도 상승은 약 5.15 ppm에서의 3개의 아노머 신호 및 관련 잔기의 단순화된 NMR 속성 사이의 오버랩을 감소시켰다.

HSQC 스펙트럼(도 14)는 대문자 A-I, 도 14a, 표 3로 표시된 ¹H 5.6-4.5 에서 9개의 주요 아노머 밀도를 나타내었으며, 해당하는 양성자는 모두 유사한 비율을 가졌다. NMR 분석은 COSY 스펙트럼의 3.85ppm과 공통적으로, TOCSY 스펙트럼에서 3가지 상관관계를 나타내는 A의 H-1(5.51ppm)에서(도 16) 시작하였다. 따라서, 이 밀도는 H-2로 할당되었으며, 유사한 접근 방식으로 H-3 (3.91 ppm) 및 H-4 (4.04 ppm) 또한 할당되었다. H-1과의 추가적인 상관관계가 없기 때문에, A를 갈락토오스 유닛으로 확인하였다. H-5는 강한 H-4/H-5 상관관계로 인해 NOESY 스펙트럼에서 식별되었으며(도 17), 해당하는 COZY 상관관계를 통해 두 개의 H-6을 확인하였다(도 16 및 도 17).

HSQC 및 HSQC-TOCSY 스펙트럼 (도 18a)은 C-6 (67.1 ppm)의 높은 화학적 이동을 기반으로 O-6에 연결된 α-갈락토오스 유닛인 A (표 3) 모든 탄소 화학적 이동을 정의하였다. D의 H-1 (5.12ppm)에서 발생하는 TOCSY 스펙트럼의 상관관계는 A와 동일한 패턴을 가졌으므로, D는 갈락토오스며, α는 ³ J _{H1, H2} (3.9Hz) 값을 기반으로 구성되었고, H-6s/C-6 (4.04-4.02 / 65.6 ppm)의 화학적 이동은 이 위치의 이전 문헌의 데이터와 일치하여 인산화되었음을 의미한다 (Sechenkova et al., 2004). 따라서 D는 6P-α-Gal이었으며 다른 모든 탄소 화학 이동의 높은 필드 값을 기반으로 더 이상 분기되지 않았다.

B의 경우, H-1 (5.24ppm)은 H-2 (4.25ppm)에 가장 강한 두 가지 TOCSY 상관관계를 보였으며, 이는 COZY 밀도와 일치했다(도 16). 이 두 번째 양성자에서(도 16) TOCSY를 판독한 결과, 람노스 잔기의 패턴 전체 진단인 1.28ppm에서 메틸을 포함하는 유닛의 다른 모든 양성자를 확인하였다. 따라서, B는 이의 C-5 값(약 70.5 ppm)과 참조 글리코시드(α 또는 β메틸글리코시드의 경우 각각 69.4 또는 73.6 ppm, Bock & Pedersen, 1983)의 유사성을 기반으로 아노머 중심에서 α-배열된 람노스이며, 해당 탄소에서 경험한 글리코실화 이동으로부터 정의된 것과 같이 3-치환되었다. 잔기 C, E, G 및 H(각각 5.14, 5.10, 4.97, 4.88 ppm에서 H-1)의 TOCSY 패턴은 B의 것과 유사하여 α-람노스 유닛이었고, 참조 값(71.0ppm, Bock & Pedersen, 1983)과 비교하여 C-2(77.8-79.6 ppm)의 낮은 필드 값은 O-2에서 치환되었음을 의미한다.

F의 경우, H-1 (5.01 ppm)은 4개의 TOCSY 상관관계를 가졌으며(도 16), 이는 COSY 스펙트럼에서 H-2 내지 H-5에 기인한 것으로, 글루코 구성 잔기(gluco configurated residue)의 패턴이다. H-5의 HSQC-TOCSY 분석으로 69.5ppm에서의 밀도와 상관관계를 확인했으며, 이는 C-6에 기인하고 차례로 H-6s와 관련되었다 (4.14 및 3.96ppm). 따라서, F는 C-2(54.9 ppm) 및 H-2(3.93ppm) 값에 기반한 N-아세틸글루코사민이고 C-6(69.4 ppm)에서 치환되었다. α 배열은 아노머 시그널의 모양(broad singlet)과 C-3 값 (71.8ppm)에 의해 추론되었으며, 이는 참조 α-glycoside (72.0ppm, Bock & Pedersen, 1983)와 매우 유사하다. 마지막으로, I의 H-1 (4.50 ppm)은 유닛의 모든 양성자를 나타내는 TOCSY 패턴을 가졌다. 따라서, ¹³C 화학적 이동을 기반으로 I는 C-3(82.8 ppm)에서 치환되고, ³ J _{H1, H2} 값 (7.9Hz)을 기반으로 β배열된 포도당이다.

잔기 사이의 서열은 HMBC (도 5b)와 NOESY(도 4) 스펙트럼을 분석하여 추론했다. 첫째, B의 H-1과 I의 C-3이 연결된 HMBC의 상관 관계와 해당 밀도는 B₁I₃로 표시하였다(도 18b). 동일한 형식으로 C₁E₂, D₁B₃, F₁G₂, H₁A₆ 및 I₁F₆과 같은 다른 상관 관계가 발견되었다. 또한 E의 H-1과 G의 H-1은 C 및 H의 C-2와 유사한 값인 약 79 ppm에서의 탄소와 장거리 상관관계를 나타냈다. E₁H₂ 및 G₁C₂로의 이러한 밀도의 정확한 할당은 E의 H-1과 H의 H-2 및 G의 H-1과 C의 H-2가 관련된 NOESY 스펙트럼(도 17 )을 분석하여 추론하였다. 이러한 속성은 서로 다른 람노스 유닛의 H-2 양성자의 확장에 상세히 나타난 역상관 관계를 관찰하여 확인되었다 (도 19).

마지막으로, A와 D가 각각 O-1과 O-6에서 포스포디에스테르 결합을 통해 인산화되었다는 정보는 왜 A의 H-1과 D의 C-6, 또는 D의 H-6 및 A의 C-1에 대해 HMBC 연결이 나타나지 않았는지, 또는 왜 이 양성자들이 잔기간의 NOE 상관관계를 가지지 않는지 설명한다. HMBC 스펙트럼은 실제로 이 시퀀스의 한계(3개 연결)를 초과하는 A의 H-1 (또는 C-1)과 D의 C-6 (또는 H-6) 사이의 결합 수가 많기 때문에(5개 연결), 두 유닛 간의 어떠한 상관관계도 검출할 수 없었다. 유사하게, A와 D 사이의 인산염 부분의 밀도는 검출 가능한 NOE 효과를 제공하기 위해 이들 유닛의 양성자를 매우 멀리 떨어져 있도록 한다. 따라서, CPS-100의 반복 단위 구조는 도 20에 보고된 바와 같이 non-asaccharide이다.

또한 그 특성을 이해하기 위해 마이너한 NMR 신호를 조사하였다. HSQC 스펙트럼에서(도 14), Galα 및 Galβ(각각 ¹H/¹³C 5.26/93.5 및 4.57/97.8 ppm)로 표시된 밀도의 탄소 화학적 이동은 자유 환원 형태의 α 또는 β잔기를 나타낸다. H-1에서 TOCSY 스펙트럼(도 16)은 galacto 구성 당의 전형적인 패턴이 나타났다 (즉, Galα의 경우, 세 번째 밀도는 COZY 밀도와 거의 오버랩됨). 이러한 발견은 CPS의 분리를 위한 초음파 처리 및 트리클로로아세트산 처리가 포함되어 있으며, 상기 두 처리과정에서, 특히 갈락토오스 A의 아노머 인산염에서, 포스포디에스테르 결합의 극도의 유연성으로 인해 이들 결합 일부의 절단을 유도할 수 있다는 점에 의해 설명된다. 따라서, 강한 신호 옆의 마이너한 신호(도 14, “”로 표시)는 첫 번째 반복 잔기에 속하며, 자유 환원 형태로 갈락토오스에 연결되어 있는 것으로 예상되었다. 그러나, 이들의 낮은 강도와, 카르비놀 영역(carbinolic region)의 밀집은 정확한 속성의 파악을 방해했다. 마지막으로, HSQC 스펙트럼에서(도 14a), 아노머 밀도를 통합하면, 샘플의 평균 중합도는 4이고 평균 MW는 약 6kDa (반복 단위의 MW는 1500 Da)로, HPSEC에 의해 계산된 11kDa는 다소 과대 평가된 값과 유사한 값이다(도 21).

실시예 11: CPS-400의 NMR 분석

상기 실시예에서 설명된 것과 유사한 방식으로 CPS-400의 구조적 특징을 분석하였다(표 4).

첫째로, HSQC 스펙트럼의 아노머 영역(도 22a, 22b)은 몇몇 잔기를 나타내었는데, ¹H 5.3-5.1 ppm에서의 신호는 단당류 잔기에서 발생한 반면, ¹H/¹³C 5.39/75.5 ppm은 아노머 신호가 아닌, A로 표시된 글리세롤 유닛(Gro)의 C-2이며, 아실화에 의해 낮은 필드로의 이동하였다. O-2에서의 치환기는 알라닌(Ala)이었으며, 1H/13C 1.64/16.5 ppm에서 확인된 메틸 및 4.30/50.2 ppm에서의 Hα/Cα에 의해 확인되었다. 또한, A의 H-1/C-1 및 H-3/C-3은 동등했으며, 해당 HSQC-TOCSY (도 22a) 및 TOCSY (도 22g) 상관관계에 기반하여 4.11/ 65.0 ppm에서 확인되었다.

마지막으로, C-1(또는 C-3) 값은 Gro형 테이코산의 경우와 같이, A가 양쪽 말단에서 인산화되었음을 나타낸. Gerlach et al., 2018을 참조한 HSQC 분석에서 두번째 1,3-이인산화 Gro 유닛(B), 및 1,5-이인산화된 리비톨 유닛(Rbo, C)을 확인하였으며 이러한 마지막 잔기는 리비톨-포스페이트 백본에 기반한 또 다른 테이코산의 존재를 의미한다. 단당류 유닛의 경우, 분석은 TOCSY 스펙트럼의 아노머 신호에서 최대 H-6까지 자화(magnetization)의 효율적인 전파를 기반으로 α-glucose 유닛으로 확인된 가장 강한 신호(D, E, F' 및 F)에 집중되었다. 이러한 Glc 유닛은 ¹³C 화학적 이동의 유사성을 기반으로 더 이상 치환되지 않았다 (Bock & Pedersen, 1983).

이러한 유닛의 위치는 HMBC 스펙트럼 분석 및 참조문헌의 데이터와 비교를 통해 추론하였다. 실제로, E는 Gro 유닛(H)의 O-2에 연결된 반면 (Shashkov, Potekina, Senchenkova, & Kudryashova, 2009), F'은 Rbo 유닛(I)의 O-4에 연결되었다 (Streshinskaya et al., 2011). D의 경우, H-1은 양성자(4.30 ppm)가 HSQC-TOCSY 스펙트럼에서 69.9ppm에서 “CH₂”에 연결된 78.3 ppm 에서의 탄소(도 18b)와 장거리 상관관계를 가졌다(도 23). 이러한 새로운 유닛은 G로 표시되었고, ¹H/¹³C 4.30/78.3 및 4.14/66.9 ppm에서의 밀도는 G4 및 G5로 할당되었다(도 18c 및 도 23). G는 리비톨로 식별되었으며, HSQC-TOSCY 스펙트럼 분석에 의해 다른 신호를 찾았다. 실제로, 1H/13C 4.16/67.7 ppm에서 “CH₂” 밀도는 G4를 가리키는 신호와 3가지 상관관계를 가졌으며, 이 밀도는 G1로 표시하였다. 또한, G의 C-1(67.7 ppm)은 I에 대해 보고된 바와 같이, 인접 위치에서 글리코실화되지 않고 인산화된 탄소를 나타낸다. 이러한 정보는 나머지 두 개의 HSQC-TOSCY 상관관계를 C-2(70.5 ppm) 및 C-3(80.6 ppm)로 할당하도록 하였으며, HSQC 스펙트럼에서 차례로 이에 상응하는 H-2(4.15 ppm) 및 H-3(3.97 ppm)을 식별했다(도 18, 도 23, 표 4). 따라서, G는 부착된 두 유닛, F 및 D와 함께, O-3 및 O-4에서 글리코실화된 Rbo이다(도 22b의 HMBC).

이러한 유형의 치환은 다른 Lactobacillus plantarum 균주에서 확인된 바 있으나, 이의 NMR 데이터는 인산염이 없는 Rbo 유닛을 보고하고 있어, 이러한 화학적 이동과 본 발명의 데이터는 비교할 수 없다(Tomita et al., 2017). 그러나, 우리의 결과는 C-2 및 C-3에 연결된 글루코스 유닛을 갖는 리비톨의 역 치환 패턴을 제안한 비피도박테리움의 테이코산의 것(Valueva et al., 2013)과 유사했다. 흥미롭게도, Valueva et al. (2013)에 보고된 탈인산화 형태의 NMR 데이터는 Tomita et al. (2009)에서 보고된 3,4-이글루코실화 리비톨의 NMR 데이터와 일치했다. 따라서, 이러한 리비톨 유닛의 치환 패턴(2,3 또는 3,4)은 아직 명확하게 정의되지 않았다. 따라서, 본 발명의 NMR 데이터는 CPS-400이 Gro-및 rbo-형의 두 개의 테이코산의 혼합물임을 나타내며, 각각 비화학양론적 방식으로 몇몇 치환기의 존재를 나타내었다. Gro-형 TA의 경우, 비화학양론적 치환기는 알라닌 및 α-glucose였다. Rbo-형 TA의 경우, α-glucose는 리비톨의 O3 및 O4 모두, O4 단독 또는 어느 위치에서도 발생하지 않았다. 크기 배제 크로마토그래피에 의해 두 TA의 분리를 시도하였으나, CPS-400은 약 45kDa(도 21)의 대칭 피크로 나타나 더 이상 분리되지 않았다.

실시예12: CPS-100 및 CPS-400의 면역 자극 활성

상기 CPS-100 및 CPS-400의 면역 반응에 대한 활성을 확인하였다.

모든 면역 세포를 생리학적인 비율로 혼합한 비장 세포를 사용하여, 면역 시스템에 대한 CPS의 효과를 확인하였다. 종점 분석(Endpoint analysis)은 ELISA에 의해 상이한 사이토카인을 테스트하여 수행하였다. 사이토카인은 생체 내에서 염증성 또는 관용성 면역 반응을 매개하고 조절하는 세포 신호 전달에 관여하는 분비성 펩타이드/당단백질 그룹을 의미한다. 따라서, CPS에 노출될 때, 면역 세포 풀에서 사이토카인의 왜곡은 생체 내에서 유사한 역할을 함을 의미한다. CPS-100 및 CPS-400에 의해 생성된 면역 반응을 확인하기 위해 인터페론 감마(IFN-γ)를 염증성 마커로, 인터루킨-10(IL-10)을 조절성 사이토카인으로 하여 분석하였다. 연구 결과에 따르면, CPS-100은 높은 IFN-γ 및 무시할만한 수준의 IL-10 생산으로 나타난 것과 같이 면역 자극성임을 나타낸다(도 24a 및 24b). 반면, TA 분획인 CPS-400에서는 IFN-γ의 수준이 검출되지 않았다(도 24a). 유사한 조건에서, TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin 6), IL-12(interleukin 12), IL-17(interleukin 17) 및 IL1-β(interleukin 1β)을 포함하는 다른 사이토카인을 평가하였다.

CPS-100은 세포를 자극하여 현저히 높은 수준의 TNF-α, IL-6 및 IL-12의 생성을 나타낸 반면(도 24c 내지 24e), IL-17 및 IL1-β은 검출되지 않았다. 반면, CPS-400은 측정된 어떤 사이토카인에서도 뚜렷한 증가를 나타내지 않았다(도 24c 및 도 24e). IFN-γ는 다양한 유형의 면역세포에서 생성되는 1차 면역 자극 마커이기 때문에 CPS의 면역 자극 반응의 특이성을 확인하기 위해, IFN-γ의 생산이 CPS-100의 농도에 의존적인지 여부를 확인하였다. 48시간의 IFN-γ 유도에서 CPS-100의 half maximal effective concentration (EC50)는 3. 16 μM (도 24f)로, CPS-100이 효율적인 면역 자극제로 사용될 수 있음을 의미한다.

결과적으로 CPS-100은 L. plantarum IMB19 균주와 유사한 면역 자극 특성을 나타내며, 이는 L. Plantarum IMB19 균주의 면역 증진 활성을 나타내는 유효분자가 CPS-100임을 의미한다.

실시예 13: L. plantarum IMB19 및 CPS의 CD8+T 세포 기능의 향상 및 항 종양 면역 효과

in vitro에서의 면역 자극제로서의 CPS 활성이 생체 내에서 종양 억제 활성으로 이어질 수 있는지를 확인하였다. 경구 투여된 L. plantarum IMB19 및 복강 내 투여된 CPS 치료 그룹은 피하 흑색종의 성장이 현저하게 감소된 것으로 확인되었다(도 25A 및 25B). 두 그룹 모두에서 종양 성장의 지연은 CD8+T 세포의 침윤과 연관되었다(도 25C). 종양 침윤 CD8+T 세포에 의한 IFN-γ의 생성과 빈도의 증가는 상기 투여에 의해 CD8+T 세포의 세포 독성 활성이 현저히 향상되었음을 의미한다(도 25E, 25F). 종양 내 CD4+T 세포는 또한 두 투여 그룹 모두에서, IFN-γ 생산의 상향 조절을 나타냈다(도 25G, 25H). 반면, PBS 투여 그룹과 비교하여 종양 내 Treg 집단의 차이는 나타나지 않았다(도 26A, 26B). L. plantarum IMB19의 경구 투여는 EMT-6 유방암에서 종양 성장을 조절했다(도 27). 결과적으로 상기 데이터는 CPS 및 L. plantarum IMB19가 암 성장을 억제하는 항 종양 면역 활성을 향상시킨다는 것을 의미한다.

실시예 14: CPS의 종양 내 대식세포 침윤 증가

CPS는 종양에서 대식세포의 침윤을 증가시킨다. CD8+ T 세포 반응을 조절하는 특정 APC 유형을 확인하기 위해, CPS의 복막 내 투여와 함께, B16.F10 흑색종 세포를 이식하고 초기 종양에서 APC의 침윤을 평가하였다. CPS는 주로, CD11c+DC에 비해 종양에서 CD11c+CD11b+ 대식세포의 빈도를 증가시켰다(도 28A). 유동 세포 계측법에 의해 확인한 결과 대식세포의 수는 CPS 투여된 마우스에서 현저히 높게 나타났다(도 28A). 동일한 조건에서, CD11c+CD11b+ 대식세포와 CD11c+ 수지상 세포의 활성화 마커를 확인하였다. 놀랍게도, CPS 처리된 수지상 세포의 활성화 상태는 대조군과 유의미한 차이를 나타내지 않았다(도 28C). 그러나, 대식세포는 더욱 활성화 되었으며, CD11b, MHC I, MHC II, CD86 및 CD40의 더 높은 발현을 나타내었다(도 28B). 동일한 마우스에서 전신적인 적응 면역 시스템의 활성화를 확인하기 위해, 배수 림프절에서 CD8+T 세포 조기 활성화 마커인 CD69를 확인하였다. 대조군과 비교하여, CD69는 CPS 투여에 의해 명확하고 유의하게 상향 조절되었다(도 28D). 이러한 데이터는 CPS가 대식세포의 활성화에 중요한 역할을 수행하며, 종양성장을 제한할 수 있음을 의미한다.

실시예 15: CPS에 의한 대식세포의 염증성 대식세포로의 분화 및 M2 대식세포의 M1 표현형으로의 재프로그래밍

대식세포에 대한 CPS의 효과를 특성화하기 위해, 대식세포를 CPS에 노출하는 경우에 표현형의 변화를 확인하였다. 복막 CD11b+ F4/80+ 대식세포는 CPS를 처리한 경우에 활성화된 표현형을 나타내었으며, LPS 또는 Pam3CSK4 처리된 경우에 비해 CPS 처리된 대식세포에서 MHC I, MHC II, CD68, iNOS2, 및 CD40의 현저한 상향 조절을 나타내어(도 28E), M1 표현형 또는 대식세포의 염증성 표현형을 나타내었다. 특히, Pam3CSK4와 유사하게도 TLR2는 CPS 처리시에 상향 조절되었으며, CPS가 TLR2 리간드일 수 있음을 의미한다. 그러나, 생체 내 실험과는 대조적으로 CD80 및 CD86의 발현은 변경되지 않았다(도 28E).

대안적으로 활성화된 대식세포 또는 M2 표현형 대식세포는 면역 억제에 크게 기여하여 종양의 성장을 향상시킨다(Ann Oncol 28, xii18-xii32 (2017))(Front Oncol 9, 421 (2019)). 따라서, 상기 결과는 종양에서 CPS가 M2 대식세포를 M1 표현형으로 재프로그래밍 할 수 있음을 나타낸다. 실제로, IL-4 유도 M2 표현형 복막 대식세포는 LPS 및 Pam3CSK4와 비교하여 CPS를 처리하는 경우에 현저하게 증가하였다(도 28F). 또한, 염증성 대식세포 마커 iNOS2는 MHC I, MHC II, CD40 및 CD68과는 별도로 유의하게 상향 조절되었다(도 5F). 이러한 데이터는 CPS의 처리가 염증성 대식세포를 생성하고 면역 억제성 대식세포를 면역 자극성 표현형으로 재프로그래밍함을 의미한다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC14337BP

20201021

<110> immunobiome INC. <120> Novel Lactobacillus plantarum strain, the strain-derived polysaccharide and its use <130> P20-B344 <150> KR 2020-0003493 <151> 2020-01-10 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA Primer(Forward) <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA Primer(Reverse) <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1522 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L. plantarum IMB19 16S rRNA_785 Forward <400> 3 agcgctggga tgatgctagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat 60 taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 120 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc 180 ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg gatacaggtg 240 gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 300 acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa 360 ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 420 tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc 480 cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat 540 cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 600 catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt ttaggaacca gccgcctaag 660 gtgggacaga tgattagggt gaagtcgtaa cagggtaaaa ccgtaaagat gttcaacccg 720 ccacatctgt cgcgtctccg tcgtagatat aagaaagcca aagggccttt cttccatggc 780 tgggtgttca tgcaataaca tcgaccggtt atccacgaca caagaaagga ttacgttggt 840 cctggttgtg cgctcaggtt ttatagtgac agcgggccta tttgtatggt gtaaaccgga 900 gtgctaacaa tcttctacaa gaaacagcct gtacataaat ttacggcata tatataccgg 960 aacgtggctt ggccacgtat gttattaacg cgggctggca ggaacttact aggccgtgcc 1020 attccggtgt caaatccgac cgaatccggg gactcgtctc gcggaaatgt gtttcttttt 1080 agagacatgg attcttacaa accgagaccc tgtcatgccc gggatgaggg tctgccacta 1140 acaactttcc gaacatgatg ggaagaaccc cctaacgggc gcccacctgg aggaatttgg 1200 gccggggcac caccgcccga ggtggggcgg aaaaccccct ccaggggtcc catcctcaat 1260 ttttccgggg gggacccccc tcccccccaa aatgagggaa aacccccggg ggggcacccc 1320 caaaagaagg agagcccccc accctcactc ttcccgcccg gcgtgcgggg gcgggttttt 1380 ttttctgtca aaataaattt tgtgttgttt gtgtgttcct cccccccccg ccgcgggggc 1440 ggggttgtac ttttttccct ctccatcccc cccccaccac aaaagaaaag gaggggacga 1500 cacccacagt gggtgtgttt tt 1522 <210> 4 <211> 1554 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L. plantarum IMB19 16S rRNA_907 Reverse <400> 4 ttgacggggg ggtctccagg cggaatgctt aatgcgttag ctgcagcact gaagggcgga 60 aaccccccaa cacttagcat tcatcgttta cggtatggac taccagggta tctaatcctg 120 tttgctaccc atactttcga gcctcagcgt cagttacaga ccagacagcc gccttcgcca 180 ctggtgttct tccatatatc tacgcatttc accgctacac atggagttcc actgtcctct 240 tctgcactca agtttcccag tttccgatgc acttcttcgg ttgagccgaa ggctttcaca 300 tcagacttaa aaaaccgcct gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggac aacgcttgcc 360 acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ttaaataccg 420 tcaatacctg aacagttact ctcagatatg ttcttcttta acaacagagt tttacgagcc 480 gaaacccttc ttcactcacg cggcgttgct ccatcagact ttcgtccatt gtggaagatt 540 ccctactgct gcctcccgta ggagtttggg ccgtgtctca gtcccaatgt ggccgattac 600 cctctcaggt cggctacgta tcattgccat ggtgagccgt taccccacca tctagctaat 660 acgccgcggg accatccaaa agtgatagcc gaagccatct ttcaaactcg gaccatgcgg 720 tccaagttgt tatgcggtat tagcatctgt ttccaggtgt tatcccccgc ttctgggcag 780 gtttcccacg tgttactcac cagttcgcca ctcactcaaa tgtaaatcat gatgcaagca 840 ccaatcaata ccagagttcg ttcgacttgc atgtattagg cacgccgcca gcgttcgtcc 900 tgacagagag aaaaaaaaaa aaaaaaaagg gccgggggga tcgggggggg gggggggggg 960 ggtgaggggt tgaggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 1020 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 1080 gggggggggg ggggtgtgtg gggggggggg ggttgttgtt tttgtttggg gggggggttg 1140 ttttttgtgt gtgttttgtt gtttgtttgg gggtgtgttt tgttgtgggg tggggtgttg 1200 ggggggttgg ggggggggtg ttgtttgggg ggggtggggg ggggggtttt tttgttgttg 1260 tgtggttgtg tgttgtgtgg tgggtggggg gggtggtgtg tgtgtggggg tggggggtgt 1320 ttggtggggg gggggttgtt gtgggggggt ggtgtttgtt ttttgttttt ttttgtgtgt 1380 gggggggggg ggtggggggt ggtttgtggg gtgttgtttg tgtgtggttg gtggtggtgt 1440 gtgggggggt tggggggggg ggggttgtct tttttgttgg tgttgggtgt ttgttggtgt 1500 tggtgtgtgg tggggtggtg tggtgggtgg gtgcttgttg tgtgtgtggt gtgt 1554

Claims

KCTC 14337BP의 기탁번호를 갖는 락토바실러스 플란타룸 IMB19 균주 (Lactobacillus Plantarum)로, 하기 화학식 I을 포함하는 다당체를 생산하는 것을 특징으로 하는 균주:.
[화학식 I]
-[-D-B-I-F-G-C-E-H-A-]_n-
상기 화학식 I에서,
A 및 D는 갈락토오스(Galactose)이고,
B, C, E, G 및 H는 람노스(Rhamnose)이며,
F는 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)이고,
I는 포도당이며,
n은 1 이상의 정수임.
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물.
삭제
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 종양은 흑색종, 유방암, 신장암, 폐암, 방광암 및 직장암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 식품 조성물.
삭제
(a) 제1항의 균주를 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 균주로부터 하기 화학식 I을 포함하는 다당체를 수득하는 단계를 포함하는 화학식 I을 포함하는 다당체의 생산방법:
[화학식 I]
-[-D-B-I-F-G-C-E-H-A-]_n-
상기 화학식 I에서,
A 및 D는 갈락토오스(Galactose)이고,
B, C, E, G 및 H는 람노스(Rhamnose)이며,
F는 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)이고,
I는 포도당이며,
n은 1 이상의 정수임.
(a) 항원 제시 세포(antigen presenting cell)에 제1항의 균주를 처리하여 프라이밍하는 단계; 및
(b) 상기 프라이밍된 항원 제시 세포를 T 세포와 공배양(co-incubation)하는 단계를 포함하는 염증성 T 세포의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 항원 제시 세포는 대식 세포, B 세포, 수지상 세포(dendritic cell; DC), 랑게르한스 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 염증성 T 세포는 세포독성 T 세포 또는 도움 T 세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항의 방법으로 제조된 염증성 T 세포를 유효성분으로 함유하는 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제.
대식세포에 제1항의 균주를 처리하여 대식세포를 M1 표현형 대식세포로 분화하는 단계; 및
상기 분화된 M1 표현형 대식세포를 수득하는 단계를 포함하는 M1 표현형 대식세포의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 M1 표현형 대식세포는 MHC I, MHC II, CD68, iNOS2, 및 CD40으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현이 상향 조절된 것을 특징으로 하는 제조방법.
제13항의 방법으로 제조된 M1 표현형 대식세포를 유효성분으로 함유하는 종양 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제.