CN114058597A - 生物制导溶瘤病毒制剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物制导溶瘤病毒制剂及应用，所述病毒为包含重组NDV‑EPGPF质粒的重组新城疫溶瘤病毒，所述重组新城疫溶瘤病毒由重组NDV‑EPGPF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得。所述重组NDV‑EPGPF质粒是包含重组α1,3 GT、CD105 scFv、PD‑1scFv、PD‑L1 scFv和FAP scFv基因的NDV质粒；所述CD105 scFv基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述PD‑1scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α‑1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示；所述PD‑L1 scFv基因的序列如SEQ ID NO:4所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:5所示。本发明还公开了一种上述重组新城疫溶瘤病毒的制备方法及重组新城疫溶瘤病毒在静脉注射抗肿瘤、摧毁肿瘤骨架结构，激活T细胞功能中的应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种生物制导溶瘤病毒制剂及应用。
背景技术
内皮糖蛋白(CD105)是转化生长因子-β超家族的受体，被认为是血管生成的一个强有力的标记物。肿瘤新生血管内皮细胞表面高表达Endoglin，而其它正常血管内皮细胞几乎不表达，是血管性疾病发病机制和肿瘤进展的重要参与因素，是实体瘤治疗的靶标。
PD-1(programmed cell death protein 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子。癌细胞表面的PD-L1和T细胞表面的PD-1结合，会诱导T细胞凋亡瓦解、抑制T细胞的增殖。“溶瘤病毒+免疫检验点抗体”原位协同增效的治疗策略，在肿瘤内靶向递送免疫检验点抗体，具有逆转T细胞耗竭的优点。
成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein FAP)是基质中的一种表面抗原，多种恶性肿瘤都有表达。肿瘤组织需要通过新生血管与活化的成纤维细胞等基质形成来获取肿瘤细胞存活和生长所必需的营养物质。肿瘤相关成纤维细胞中FAP含量丰富,可以激活基质中的生长因子等，以利于血管生成，从而促进肿瘤生长、转移。在以肿瘤基质为靶点的抗肿瘤免疫治疗中发挥作用，显著诱导肿瘤相关成纤维细胞的凋亡。FAP在肿瘤的发生、发展及转移中发挥着重要作用，同时作为一种理想的抗肿瘤靶分子。将FAPscFv重组入NDV，溶解肿瘤细胞的同时，破坏了肿瘤生长的外基质，破坏了种子成长所需要的土壤，干扰肿瘤细胞的生长和侵袭。
超敏溶瘤病毒(oncolytic virus)是能特异性感染癌细胞并大量复制，最终裂解癌细胞后释放出来，再感染更多癌细胞的一类病毒，进入肿瘤组织引起局部的超敏反应。新城疫病毒NDV是一种天然的单股负链RNA非致病性溶瘤病毒，在癌细胞内具有很高的复制效率(是正常细胞中的10000倍)和一定的溶瘤能力。NDV通过与癌细胞表面所分布丰富的NDV受体—唾液酸残基结合而进入细胞内。由于癌细胞缺乏抗病毒、凋亡途径和Ⅰ型INF信号传导通路，NDV选择性地只能在癌细胞内复制而不感染正常细胞，因而能广泛杀伤癌细胞，而不会伤及人类正常组织。此外，新城疫病毒使肿瘤细胞裂解后释放肿瘤特异性抗原，一定程度上能刺激免疫细胞活化而诱导肿瘤免疫反应。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种生物制导溶瘤病毒制剂及应用(重组新城疫溶瘤病毒、制剂及应用)。
本发明提供了一种包含重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒的重组新城疫溶瘤病毒，所述重组新城疫溶瘤病毒由重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得。
本发明所述包含重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒的重组新城疫溶瘤病毒是指包含重组新城疫病毒NDV、CD105 scFv、PD-1scFv、α1,3 GT、PD-L1 scFv和FAP scFv基因(简称NDV-EPGPF)质粒的重组病毒。
所述辅助质粒选自N、P、L等。
所述N具体指表达NDV的NP蛋白的质粒。
所述P具体指表达NDV的P蛋白的质粒。
所述L具体指表达NDV的L蛋白的质粒。
所述野生型新城疫病毒NDV的序列如GenBank FJ766530.1公布。
所述包含重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒的重组新城疫溶瘤病毒的序列是在野生型新城疫病毒的序列(GenBank FJ766530.1)中插入CD105 scFv、PD-1scFv、α1,3 GT、PD-L1scFv和FAP scFv基因的序列。
所述重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒是在NDV上重组包含CD105 scFv、PD-1scFv、α1,3 GT、PD-L1 scFv和FAP scFv基因的重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒；
所述CD105 scFv基因的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述PD-1scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；
所述α1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示；
所述PD-L1 scFv基因的序列如SEQ ID NO:4所示；
所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明还提供了所述的重组新城疫溶瘤病毒在制备预防和/或治疗痘苗病毒和新城疫病毒疫苗中的应用。
其中，所述重组病毒用于抑制肿瘤的生长、增殖、迁徙、转移，或促进肿瘤的凋亡。
本发明还提供了一种重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒，其为在NDV上重组包含CD105 scFv、PD-1scFv、α1,3 GT、PD-L1 scFv和FAP scFv基因的重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒。
所述CD105scFv基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述PD-1scFv基因的序列如SEQID NO:2所示；所述α1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示；所述PD-L1 scFv基因的序列如SEQ ID NO:4所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:5所示。
所述野生型新城疫病毒NDV的序列如GenBank FJ766530.1公布。
本发明还提供了所述的重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒在构建重组新城疫溶瘤病毒中的应用。
本发明还提供了一种制备上述重组新城疫溶瘤病毒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一、构建所述重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒；
步骤二、提取包含测序正确的重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒；
步骤三、BSR细胞复苏、换液、传代和铺板；
步骤四、利用痘苗病毒感染BSR细胞，然后用步骤二中提取的重组质粒对BSR细胞进行转染；
步骤五、取转染后的细胞上清接种到鸡胚中，提高病毒滴度；
步骤六、从步骤五中的鸡胚中收毒，检测血凝效价，确认获得重组新城疫溶瘤病毒。
步骤一中，所述质粒的重组包括如下步骤：
(1)线性化超敏NDV载体：用Age I和SanD I双酶切超敏NDV骨架载体TVT/071204，回收大片段；
(2)扩增目的基因片段；所述目的基因的序列如SEQ ID NO.1-5所示；
所述扩增中引物序列如下所示：
PF：
CCCAAGGTCCAACTCTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGTGCCACCGACCCCCGGGTCCGCCCG
PR：AGGATTGCCGCTTGGGTTTAAACTCATTTGATTTCCACTTTGGTCC
所述扩增目的基因片段的PCR体系如下表3所示；所述扩增的条件如下表4所示。
(3)将所述步骤(1)回收的载体片段与所述步骤(2)的目的基因片段进行连接，连接产物转化至TransStbl3感受态细胞，抽提质粒，通过PCR和Age I、SanD I双酶切鉴定获得阳性重组NDV质粒，命名为重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒。
所述步骤二具体包括如下步骤：
(1)取250mL过夜培养的菌液，12000×g，离心2-5min，弃尽上清，收集菌体；所述菌液包括：LB培养基250mL+含测序正确的重组α1,3 GT、CD105 scFv、PD-1scFv、PD-L1 scFv和FAP scFv基因的NDV质粒的菌液500μL；
(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入10mL Buffer P1；所述Buffer P1中已加入RNase A，用涡旋振荡混匀；
(3)向步骤(2)中的菌悬液中加入10mL Buffer P2，上下颠倒混匀6-10次(优选8次)，室温放置5-10min；
(4)向步骤(3)中的菌悬液中加入10mL Buffer P4，立即上下颠倒6-10次(优选8次)让溶液彻底中和Buffer P2，11000×g，离心15min，小心吸取上清至新的50mL离心管中；
(5)加入2.0-2.5mL的内毒素清除剂到步骤(4)所得的上清，颠倒混匀，插入碎冰中放置5-10min直到溶液由浑浊变得清亮透明，中间混匀5次；
(6)室温放置10-15min，温度恢复室温后，继续将溶液颠倒混匀；
(7)室温下，12000×g，离心10-15min，在温度需大于25℃下分相；将含DNA的上层水相转移到新管，弃油状层；
(8)向上层水相中加入12mL异丙醇，充分颠倒混匀，分多次转入吸附柱中，12000×g，离心1-3min，倒掉吸附柱下方的收集管中的废液，直到所有混合溶液通过此吸附柱；
(9)加入10mL已加入无水乙醇的漂洗液PW，12000×g，离心1-3min，弃废液；将吸附柱重新放回收集管中，再加入15mL漂洗液PW，重复漂洗一次；
(10)将吸附柱放回空收集管中，12000×g，离心3-5min，打开盖子室温晾干3-5min；
(11)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1-1.5mLBuffer TB，室温放置3-5min，12000×g，离心3-5min，洗脱质粒；
(12)测定浓度后，-20℃保存备用。
所述步骤三具体包括如下步骤：
BSR细胞复苏：
(1)37℃预热含10％FBS的DMEM培养基；
(2)-80℃冰箱中取出冻存的BSR细胞在37℃水浴锅中快速融化；
(3)将融化后的BSR细胞加入到已预热的DMEM培养基中，1000rpm，离心3min；
(4)弃上清，用2mL预热的10％FBS的DMEM培养基重悬，再加入100mg/mL的G-418溶液50-100μL，混匀后加入到装有10mL10％FBS的DMEM培养基的培养皿中，37℃5％CO2培养箱中培养观察；
(5)12h后进行换液处理；
BSR细胞换液：
(1)BSR细胞复苏12-15h后观察细胞状态；
(2)吸弃细胞培养上清，加入5ml PBS晃动；
(3)弃去上清，再加入5mL PBS重复清洗一次，弃上清；
(4)向皿中加入10mL 10％FBS的DMEM培养基，37℃5％CO2培养箱中继续培养；
BSR细胞传代：
(1)BSR细胞长到90％左右进行传代；
(2)吸取细胞培养上清，加入5mL PBS清洗一次，弃上清；
(3)每皿加入1mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化酶，37℃5％CO2培养箱消化2-3分钟；
(4)每皿加入4mL 10％FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min；
(5)弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min；
(6)弃上清，用2mL的10％FBS的DMEM培养基重悬，同时加入100mg/mL的G-418溶液50μL，充分混匀；
(7)将上述的细胞悬液平均加入装有10-12mL 10％FBS的DMEM培养基的培养皿中，37℃5％CO2培养箱中培养；
BSR细胞铺板：
(1)吸取细胞培养上清，加入5ml PBS清洗一次，弃上清；
(2)每皿加入1mL胰酶，37℃5％CO2培养箱消化2-3分钟；
(3)每皿加入4mL 10％FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min；
(4)弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min；
(5)弃上清，加入5mL PBS重悬，吸取10μL细胞悬液计数；
(6)根据计数情况，按每孔2mL10％FBS的DMEM培养基、1×105个细胞进行稀释；
(7)将稀释后的细胞悬液均匀的铺入六孔板中，37℃5％CO2培养箱中培养观察。
所述步骤四具体包括如下步骤：
(1)待六孔板中的BSR细胞长到80％时进行转染；
(2)用无抗无血的DMEM按1:90-120(优选1:100)的比例稀释痘苗病毒，按每孔200μL的用量进行配置，4℃储存备用；
(3)吸取培养上清，用不含血清的DMEM洗2次；
(4)每孔加入200μL稀释好的痘苗病毒，37℃5％CO2培养箱中感染40-80min(优选60min)，每隔20min晃一次；
(5)配置转染A、B液；其中，所述A液为375μL Opti-MEM+30μL的转染试剂；所述B液为375μL Opti-MEM+8～14μg的质粒；其中，所述质粒包括重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒和辅助质粒，重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒与辅助质粒N、P、L的比例为4:2:2:1；
(6)将B液加入A液中，并混匀，室温静置5～10min；
(7)吸取痘苗病毒悬液，每孔加入无抗无血的DMEM 2mL、混合后的A、B液各260-270μL(具体的根据混合后的A、B液总量而定)；
(8)混匀后，37℃5％CO2培养箱中培养6-8h；
(9)6-8h后吸取上清，每孔加入2mL含5％FBS的DMEM、10μL 10mg/mL的阿糖胞苷，混匀后37℃5％CO2培养箱中继续培养；
(10)24h后吸取上清，每孔加入2mL无抗无血的DMEM、10μL 10mg/mL的阿糖胞苷、0.5～2μL(优选1μL)1mg/mL的TPCK，混匀后37℃5％CO2培养箱中继续培养；
(11)24-48h收集细胞及上清，装入15mL离心管，封口膜封口，-20℃保存。
所述步骤五具体包括如下步骤：
(1)将-20℃保存的转染上清在冷水中快速融化；
(2)融化后的上清，4℃暂存；
(3)取9-11日龄的鸡胚用手电筒照射，画出接种线；
(4)先用碘酊棉球擦拭消毒，再用75％的酒精棉球擦拭脱碘；
(5)用锥子在画线处轻轻的敲出一个小洞，直径约1mm。
(6)用1mL的注射器吸取300-400μL的转染上清，从小孔处接入鸡胚中；
(7)用蜡块将小孔封住，做好标记，37℃50％湿度孵育箱中孵育；
(8)孵育24h后用手电筒照射接种后的鸡胚，将死胚取出丢弃，其他的鸡胚继续孵育。
所述步骤六具体包括如下步骤：
(1)待接种转染上清的鸡胚孵化5天后，将其取出放置在4℃冰箱；
(2)4h后从4℃冰箱中取出鸡胚，用酒精棉球进行擦拭消毒；
(3)用消毒后的镊子沿鸡胚气室敲击，并将气室上方的蛋壳取下。
(4)用100μL的移液枪吸取50μL的尿囊液于每孔装有50μL PBS的血凝板中；
(5)将第一个孔中的尿囊液与PBS混匀后吸出50μL于第二个孔中，依次进行倍比稀释至第6个孔；
(6)每孔加入50μL 1％鸡红细胞悬液并混匀，室温静置15min；
(7)15min后观察每孔的血凝情况，若出现鸡红细胞凝集现象则为血凝实验阳性，病毒拯救成功，将其尿囊液全部收集在15mL离心管中，-20℃保存。
所述制备方法还包括了RT-PCR验证、重组病毒扩增、重组病毒TCID50测定等步骤。
本发明还提供了一种静脉注射制剂，所述静脉注射制剂包括如上所述的重组新城疫溶瘤病毒。
本发明还提供了所述的静脉注射制剂在制备预防和/或治疗痘苗病毒和新城疫病毒疫苗中的应用。
本发明的有益效果包括：本发明构建的超敏溶瘤NDV(重组新城疫溶瘤病毒)与以往的现有技术公开的产品相比，刺激机体的细胞免疫的同时，还能刺激机体的体液免疫；以往公开的产品的溶瘤能力比较差，只能溶解肿瘤细胞，本发明产品在溶解肿瘤细胞的同时，还能破坏肿瘤的骨架结构，肿瘤新生血管和肿瘤相关成纤维细胞，使肿瘤失去支撑、坏死。
附图说明
图1是本发明病毒构建示意图，在新城疫病毒的P、M蛋白的AgeI和SanD I酶切位点之间插入END scFv，PD1scFv，α1,3 GT，PD L1scFv和FAP scFv基因，其中，图中的M、F、HN、NP、L、P均表示NDV的蛋白。
图2是本发明重组病毒感染HepG2细胞后目的基因表达免疫荧光图，重组病毒组可见NDV和α1,3 GT蛋白的荧光，PBS组未见，证明重组病毒能感染HepG2细胞，并且能表达目的蛋白。
图3是本发明重组病毒体外杀伤实验验证图，重组溶瘤病毒作用肿瘤细胞后72小时，大量细胞死亡，细胞膜溶解，大量细胞脱落。
图4是本发明重组病毒体内抗肿瘤效果图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
实验所需试剂：
1、大提质粒试剂盒为Vazyme公司产品，货号为DC202。
2、DMEM为Solarbio公司产品，货号为12100-500ml。
3、G-418为Solarbio公司产品，货号为G8161。
4、Opti-MEM为Gibco公司产品，货号为31985088。
5、转染试剂为Vazyme公司产品，货号为T202-01。
6、阿糖胞苷为麦克林公司产品，货号为C805253-5g。
7、TPCK为美伦生物公司产品，货号为MB3477。
8、0日龄的鸡胚购自济南赛斯家禽科技有限公司。
9、RNA提取试剂盒为北京全式金公司产品，货号为AT411-02。
10、RT-PCR试剂盒为北京全式金公司产品，货号为AT411-02。
实验方法：
(一)重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒的构建：
(1)线性化超敏NDV载体：用AgeI和SanDI双酶切超敏NDV骨架载体TVT/071204(-80℃保存)，回收大片段；
(2)扩增目的基因片段，目的基因由上海生工合成；
(3)将这两个回收的片段进行连接，连接产物转化至TransStbl3感受态细胞，小提质粒，通过PCR和Age I、SanD I双酶切鉴定获得阳性重组质粒，命名为NDV-EPGPF。
重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒中引物序列如下表1所示：
表1
重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒主要使用的试剂如下表2：
表2
扩增目的基因片段的PCR体系如下表3所示：
表3
扩增条件如下表4所示：
表4
(二)重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒提取：
1、取250mL过夜培养的菌液(补充该菌液的成分：LB培养基250mL+含测序正确的重组α-1,3 GT、CD105 scFv、PD-1scFv、PD-L1 scFv和FAP scFv基因的NDV质粒的菌液500uL，来源：送测序前保留甘油菌)，12000×g，离心3min，弃尽上清，收集菌体。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入10mL Buffer P1(Buffer P1中已加入RNaseA)(Vazyme公司，货号DC202)，用涡旋振荡混匀。
3、向步骤2中的菌悬液中加入10mL Buffer P2(Vazyme公司，货号DC202)，温和地上下颠倒混匀8次，室温放置5min。
4、向步骤3中的菌悬液中加入10mL Buffer P4(Vazyme公司，货号DC202)，立即温和地上下颠倒8次让溶液彻底中和Buffer P2，11000×g，离心15min，小心吸取上清至新的50mL离心管中。
5、加入2.0mL的内毒素清除剂(Vazyme公司，货号DC202)到步骤4所得的上清，颠倒混匀，插入碎冰中放置8min直到溶液由浑浊变得清亮透明，中间混匀5次。
6、室温放置10min，温度恢复室温后溶液很快又变为浑浊，并颠倒混匀。
7、室温下，12000×g，离心15min分相(温度需大于25℃)。将含DNA的上层水相转移到新管，弃油状层。
8、向上层水相中加入12mL异丙醇，充分颠倒混匀，分多次转入吸附柱中，12000×g，离心3min，倒掉吸附柱下方的收集管中的废液,直到所有混合溶液通过此吸附柱。
9、加入10mL漂洗液PW(已加入无水乙醇)(Vazyme公司，货号DC202)，12000×g，离心3min，弃废液。将吸附柱重新放回收集管中，再加入15mL漂洗液PW，重复漂洗一次。
10、将吸附柱放回空收集管中，12000×g，离心5min，打开盖子室温晾干5min。
11、取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1mL BufferTB(Vazyme公司，货号DC202)，室温放置5min，12000×g，离心5min，洗脱质粒。
12、测定浓度后，-20℃保存备用。
(三)BSR细胞复苏：
1、37℃预热含10％FBS的DMEM培养基(DMEM为Solarbio公司产品，货号为12100-500ml)。
2、-80℃冰箱中取出冻存的BSR细胞(实验室保存)在37℃水浴锅中快速融化。
3、将融化后的BSR细胞加入到已预热的DMEM培养基中，1000rpm，离心3min。
4、弃上清，用2mL预热的10％FBS的DMEM培养基重悬，再加入100mg/mL的G-418溶液100μL，混匀后加入到装有10mL 10％FBS的DMEM培养基的培养皿中，37℃5％CO2培养箱中培养观察。
5、12h后进行换液处理。
(四)BSR细胞换液：
1、待所述BSR细胞复苏15h后观察细胞状态。
2、吸弃细胞培养上清，加入5ml PBS轻柔晃动。
3、弃去上清，再加入5mL PBS重复清洗一次，弃上清。
4、向皿中加入10mL 10％FBS的DMEM培养基，37℃5％CO2培养箱中继续培养。
(五)BSR细胞传代：
1、BSR细胞长到90％左右进行传代。
2、吸取细胞培养上清，加入5ml PBS清洗一次，弃上清。
3、每皿加入1mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化酶(Solarbio，货号T1320)，37℃5％CO2培养箱消化2分钟。
4、每皿加入4mL 10％FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min。
5、弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min。
6、弃上清，用2mL的10％FBS的DMEM培养基重悬，同时加入100mg/mL的G-418溶液50μL，充分混匀。
7、将上述的细胞悬液平均加入装有12mL 10％FBS的DMEM培养基的培养皿中，37℃5％CO2培养箱中培养。
(六)BSR细胞铺板：
1、吸取细胞培养上清，加入5ml PBS清洗一次，弃上清。
2、每皿加入1mL胰酶，37℃5％CO2培养箱消化2分钟。
3、每皿加入4mL10％FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min。
4、弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min。
5、弃上清，加入5mL PBS重悬，吸取10μL细胞悬液计数。
6、根据计数情况，按每孔2mL10％FBS的DMEM培养基、1×105个细胞进行稀释。
7、将稀释后的细胞悬液均匀的铺入六孔板中，37℃5％CO2培养箱中培养观察。
(七)重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒转染BSR细胞：
1、待六孔板中的BSR细胞长到80％左右时进行转染。
2、用无抗无血的DMEM按1:100的比例稀释痘苗病毒(实验室保存)，按每孔200μL的用量进行配置，4℃储存备用。
3、吸取培养上清，用不含血清的DMEM轻柔的洗2次。
4、每孔加入200μL稀释好的痘苗病毒，37℃5％CO2培养箱中感染60min，每隔20min轻柔的晃一次。
5、配置转染A、B液。A液：375μL Opti-MEM+30μL的转染试剂。B液：375μL Opti-MEM+14μg的质粒，重组质粒与辅助质粒N、P、L的比例为4:2:2:1)(补充重组质粒的来源：实验步骤的第一步、提取重组质粒、辅助质粒的来源：实验室保存)。
6、将B液轻柔的加入A液中，并轻轻的混匀，室温静置5～10min。
7、吸取痘苗病毒悬液，每孔加入无抗无血的DMEM 2mL、混合后的A、B液各265μL。
8、轻轻混匀后，37℃5％CO2培养箱中培养6-8h。
9、6-8h后吸取上清，每孔加入2mL含5％FBS的DMEM、10μL 10mg/mL的阿糖胞苷，轻轻混匀后37℃5％CO2培养箱中继续培养。
10、24h后吸取上清，每孔加入2mL无抗无血的DMEM、10μL 10mg/mL的阿糖胞苷、1μL1mg/mL的TPCK，轻轻混匀后37℃5％CO2培养箱中继续培养。
11、48h收集细胞及上清，装入15mL离心管，封口膜封口，-20℃保存。
(八)转染上清接种鸡胚：
1、将-20℃保存的转染上清在冷水中快速融化。
2、融化后的上清，4℃暂存。
3、取10日龄的鸡胚用手电筒照射，画出接种线。
4、先用碘酊棉球擦拭消毒，再用75％的酒精棉球擦拭脱碘。
5、用锥子在画线处轻轻的敲出一个小洞(针头大小即可)。
6、用1mL的注射器吸取300μL的转染上清，从小孔处接入鸡胚中。
7、用蜡块将小孔封住，做好标记，37℃50％湿度孵育箱中孵育。
8、孵育24h后用手电筒照射接种后的鸡胚，将死胚取出丢弃，其他的鸡胚继续孵育。
(九)鸡胚收毒并检测血凝效价：
1、待接种转染上清的鸡胚孵化5天后，将其取出放置在4℃冰箱。
2、4h后从4℃冰箱中取出鸡胚，用酒精棉球进行擦拭消毒。
3、用消毒后的镊子轻轻的沿鸡胚气室敲击，并将气室上方的蛋壳取下。
4、用100μL的移液枪吸取50μL的尿囊液于血凝板中(血凝板中每孔装有50μL的PBS)。
5、将第一个孔中的尿囊液与PBS混匀后吸出50μL于第二个孔中，依次进行倍比稀释至第6个孔。
6、每孔加入50μL 1％鸡红细胞悬液并混匀，室温静置15min。
7、15min后观察每孔的血凝情况，若出现鸡红细胞凝集现象则为血凝实验阳性，病毒拯救成功，将其尿囊液全部收集在15mL离心管中，-20℃保存。
(十)RT-PCR验证：
1、取高压灭菌的1.5mL EP管，向其中加入200μL上述保存的尿囊液、350μL的Buffer RLT(已含有β-巯基乙醇)、550μL的70％的乙醇，移液枪吹打混匀。
2、将混合液移入RNeasy红色离心柱中，11000rpm，离心30s，弃滤过液，直到将所有的混合液全部通过离心柱。
3、将700μL的Buffer RW1加入离心柱中，11000rpm，离心30s，弃滤过液。
4、将500μL的Buffer RPE加入离心柱中，11000rpm，离心30s，弃滤过液。
5、重复步骤4一次。
6、12000rpm，空离2min。
7、将过滤柱移入新的无菌EP管中，向其中加入35μL RNase water，室温静置2min，11000rpm，离心2min。
8、将洗脱后的液体再次加入过滤柱中，室温静置2min，11000rpm，离心2min。
9、配置40μL的RT-PCR体系
10、进行PCR，反应条件如下。
11、PCR产物-20℃保存，准备测序验证。
(十一)重组病毒的扩增：
1、用含双抗的PBS将第一代的重组病毒尿囊液进行1:10倍的稀释，4℃暂存。
2、取10日龄的鸡胚用手电筒照射，画出接种线。
3、先用碘酊棉球擦拭消毒，再用75％的酒精棉球擦拭脱碘。
4、用锥子在画线处轻轻的敲出一个小洞(针头大小即可)。
5、用1mL的注射器吸取100μL稀释后的重组病毒尿囊液，从小孔处接入鸡胚中。
6、用蜡块将小孔封住，做好标记，37℃50％湿度孵育箱中孵育。
7、孵育24h后用手电筒照射接种后的鸡胚，将死胚取出丢弃，其他的鸡胚继续孵育。
8、待鸡胚孵化5天后，将其取出放置在4℃冰箱。
9、4h后从4℃冰箱中取出鸡胚，用酒精棉球进行擦拭消毒。
10、用消毒后的镊子轻轻的沿鸡胚气室敲击，并将气室上方的蛋壳取下。
11、用100μL的移液枪吸取50μL的尿囊液于血凝板中，检测其血凝效价，其余的尿囊液收集入50mL离心管中，-80℃保存。
12、将重组病毒按上述扩增方法连续扩增5代以上，-80℃保存备用。
(十二)重组病毒TCID50测定：
1、取培养至3代的BSR细胞观察，待细胞生长到80％左右时，进行传代。
2、吸取培养上清，用PBS轻柔的洗2次，弃液。
3、向皿中加入1mL的胰酶，37℃5％CO2培养箱消化2-3分钟。
4、每皿加入4mL 10％FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min。
5、弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min。
6、弃上清，加入5mL PBS重悬，吸取10μL细胞悬液计数。
7、根据计数情况，按每孔1500个细胞的密度将BSR细胞均匀的铺入96孔板中(每孔都要铺)，37℃5％CO2培养箱中过夜培养。
8、将重组病毒进行倍比稀释。取无菌的1.5mL EP管10个，依次向管中加入900μL2％FBS的DMEM培养基，向第一个管中加入100μL的重组病毒尿囊液，混匀后吸出100μL加入第二个管中，依次进行10倍的稀释，直到稀释到1010倍。
9、将过夜培养的96孔板取出，吸去每孔的培养上清，每孔加入100μL步骤8倍比稀释到尿囊液，同时每个稀释倍数做7个重复孔，并设置正常细胞对照，正常细胞对照作16个孔。
10、36小时后免疫荧光检测。
11、按Reed-Muench两氏法计算TCID50，并更具TCID50的结果计算MOI＝1的重组病毒尿囊液的用量。
体外细胞杀伤实验：
1、取传至第三代的HepG-2细胞进行铺板，吸取培养上清，用PBS轻柔的洗2次，弃液。
2、向皿中加入1mL的胰酶，37℃5％CO2培养箱消化2分钟。
3、每皿加入4mL 10％FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min。
4、弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min。
5、弃上清，加入5mL PBS重悬，吸取10μL细胞悬液计数。
6、根据计数情况，按每孔1×105个细胞的密度将HepG-2细胞均匀的铺入6孔板中，37℃5％CO2培养箱中过夜培养。
7、过夜培养后将六孔板中的细胞培养上清吸出，用PBS洗两次，每孔加入2mL的2％FBS的DMEM培养基，并加入10μL的重组病毒尿囊液，混匀后37℃5％CO2培养箱中培养。
8、72小时后观察细胞形态和检测细胞的活力。
结果如图3所示：重组溶瘤病毒作用肿瘤细胞后72小时，大量细胞死亡，细胞膜溶解，大量细胞脱落。
重组新城疫病毒的体内抗癌效果
1*107个HepG2细胞注射于SCID/beige鼠上肢前外出皮下，构建免疫重建SCID/beige鼠(Hu-PBMC-SCID)荷人肝癌模型实验动物，随机分为3组，当小鼠肿瘤平均体积达到150mm3时每隔一天进行300ul PBS、1*107pfu/Kg NDV(未重组、天然NDV)、1*107pfu/Kg重组NDV静脉注射，共治疗5次。观察小鼠肿瘤生长情况，探究重组病毒对肿瘤的治疗效果(图4)。结果可以看出，小鼠分别经过PBS、NDV、重组NDV治疗后，随时间的延长，PBS组肿瘤体积不断增加，无治疗或抑制肿瘤的效果，重组病毒治疗组肿瘤体积均增长缓慢，明显高于PBS和NDV组。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 钟莉娉
<120> 生物制导溶瘤病毒制剂及应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggaagtgc agctgctgga aagcggcggt ggcctggtgc agccgggtgg ctctctgcgt 60
ctgtcttgcg cggctagcgg cttcaccttt agcagctatg ctatgagctg ggttcgccag 120
gcgcccggga aaggtctgga atgggtttct gctatttatg gtagcgatgg tgataccaca 180
tacgcggatt ccgtgaaagg ccgcttcacc atcagccgtg ataactctaa aaacaccctg 240
tatctgcaga tgaacagcct gcgcgccgaa gacaccgcgg tgtattactg cgcgcgcgtc 300
ttctatacag ctggcttcga ttattggggc cagggtaccc tggtcaccgt ctcgagcggt 360
agcgattcca acgcggggcg cgccagcgcc ggtaacacct ctgatatcga gctcacccag 420
tctccgtcct ccctgtctgc atctgttggc gatcgtgtga ccatcacctg ccgcgcatcc 480
cagagcatta gctcttcgct gaactggtac cagcagaaac cgggcaaagc cccgaaactg 540
ctgatctatg ctgcgtccag cttgcagagc ggcgtgccgt ctcgcttcag cggatccggt 600
tctggcaccg atttcaccct gaccatcagc agcctgcagc cggaagattt tgcaacttac 660
tattgtcaac aggctccggc taagccgccg acgttcggcc agggtaccaa actggaaatc 720
aaacgt 726
<210> 2
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggaagtgc agctggtcga gtctggggga gggctggtgc agcccggcgg gtcactgcga 60
ctgagctgcg cagcttccgg attcgccttt agctcctacg acatgtcctg ggtgcgacag 120
gcaccaggaa agggactgga ttgggtcgct actatctcag gaggcgggag atacacctac 180
tatcctgaca gcgtcaaggg ccggttcaca atctctagag ataacagtaa gaacaatctg 240
tatctgcaga tgaacagcct gagggctgag gacaccgcac tgtactattg tgccaaccgc 300
tacggggaag catggtttgc ctattggggg cagggaaccc tggtgacagt ctctagtggt 360
ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggaa tcgacattca gatgactcag 420
agcccctcct ccatgtccgc ctctgtgggc gacagggtca ccttcacatg ccgcgctagt 480
caggatatca acacctacct gagctggttt cagcagaagc cagggaaaag ccccaagaca 540
ctgatctacc gggctaatag actggtgtct ggagtcccaa gtcggttcag tggctcaggg 600
agcggacagg actacactct gaccatcagc tccctgcagc ctgaggacat ggcaacctac 660
tattgcctgc agtatgatga gttcccactg acctttggcg ccgggacaaa actggagctg 720
aag 723
<210> 3
<211> 1077
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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aacgaaaagg aacaaagaaa agaagacaac agaggagagc ttccgctagt ggactggttt 240
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ggcttgacgg tttttgctgt cggaagatac attgagcatt acttggagga gttcttaata 420
tctgcaaata catacttcat ggttggccac aaagtcatct tttacatcat ggtggatgat 480
atctccagga tgcctttgat agagctgggt cctctgcgtt cctttaaagt gtttgagatc 540
aagtccgaga agaggtggca agacatcagc atgatgcgca tgaagaccat cggggagcac 600
atcctggccc acatccagca cgaggtggac ttcctcttct gcatggacgt ggatcaggtc 660
ttccaaaaca actttggggt ggagaccctg ggccagtcgg tggctcagct acaggcctgg 720
tggtacaagg cacatcctga cgagttcacc tacgagaggc ggaaggagtc cgcagcctac 780
attccgtttg gccaggggga tttttattac cacgcagcca tttttggggg aacacccact 840
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aggattgtca agatagcttg gcagaaaaaa gagtataatt tggttagaaa taacatc 1077
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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tctccagact ccctggctgt gtctctgggc gagagggcca ccatccactg caagtctagc 480
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<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggaggtgc aattgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 60
ctctcctgtg cagcctccgg attcaccttt agcagttatg ccatgagctg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtgggtctca gctattagtg gtagtggtgg tagcacatac 180
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 240
tatctgcaga tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaaggg 300
tggctgggta attttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagtggcggc 360
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg aaatcgtgtt aacgcagtct 420
ccaggcaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcttgcag ggccagtcag 480
agtgttagcc gcagctactt agcctggtac cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc 540
ctcatcattg gggcctccac cagggccact ggcatcccag acaggttcag tggcagtgga 600
tccgggacgg acttcactct caccatcagc agactggagc ctgaagattt tgcagtgtat 660
tactgtcagc agggtcaggt tattccccct acgttcggcc aggggaccaa agtggaaatc 720
aaatga 726
<210> 6
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccaaggtcc aactctgttt aaacttagaa aaaatacggg tagaagtgcc accgaccccc 60
gggtccgccc g 71
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aggattgccg cttgggttta aactcatttg atttccactt tggtcc 46
Claims (11)
1.一种包含重组NDV-EPGPF质粒的重组新城疫溶瘤病毒，其特征在于，所述重组新城疫溶瘤病毒由重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得。
2.如权利要求1所述的重组新城疫溶瘤病毒，其特征在于，所述辅助质粒包括N、P、L。
3.如权利要求1所述的重组新城疫溶瘤病毒，其特征在于，所述重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒是在NDV上重组包含CD105 scFv、PD-1scFv、α1,3GT、PD-L1 scFv和FAP scFv基因的重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒；所述CD105 scFv基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述PD-1scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α1,3GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示；所述PD-L1 scFv基因的序列如SEQ ID NO:4所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:5所示。
4.重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒，其特征在于，其为在NDV上重组包含CD105 scFv、PD-1scFv、α1,3GT、PD-L1 scFv和FAP scFv基因的重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒。
5.如权利要求4所述的重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒，其特征在于，所述CD105 scFv基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述PD-1scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α1,3GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示；所述PD-L1 scFv基因的序列如SEQ ID NO:4所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:5所示。
6.如权利要求4或5所述的重组NDV-EPGPF质粒在构建重组新城疫溶瘤病毒中的应用。
7.一种制备如权利要求1-3之任一项所述的重组新城疫溶瘤病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一、构建所述的重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒；
步骤二、提取包含测序正确的重组α1,3GT、CD105 scFv、PD-1scFv、PD-L1 scFv和FAPscFv基因的重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒；
步骤三、BSR细胞复苏、换液、传代和铺板；
步骤四、利用痘苗病毒感染BSR细胞，然后用所述步骤二中提取的重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒对BSR细胞进行转染；
步骤五、取所述步骤四转染后的细胞上清接种到鸡胚中，拯救病毒；
步骤六、从所述步骤五中的鸡胚中收毒，检测血凝效价，确认获得重组新城疫溶瘤病毒。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤一中，所述的新城疫病毒NDV-EPGPF重组质粒的构建方法包括以下步骤：
(1)线性化超敏NDV载体：用Age I和SanD I双酶切超敏NDV骨架载体TVT/071204，回收载体大片段；
(2)扩增目的基因片段；
(3)将所述步骤(1)回收的载体片段与所述步骤(2)的目的基因片段进行连接，连接产物转化至TransStbl3感受态细胞，抽提质粒，通过PCR和Age I、SanD I双酶切鉴定获得阳性重组NDV质粒，命名为重组新城疫病毒NDV-EPGPF质粒。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述扩增中引物的序列如下所示：
PF：
CCCAAGGTCCAACTCTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGTGCCACCGACCCCCGGGTCCGCCCG
PR：AGGATTGCCGCTTGGGTTTAAACTCATTTGATTTCCACTTTGGTCC；
所述扩增目的基因片段的PCR体系如表3所示；所述扩增的条件如表4所示。
10.一种静脉注射制剂，其特征在于，所述静脉注射制剂包括如权利要求1-3之任一项所述的重组新城疫溶瘤病毒。
11.如权利要求1-3之任一项所述的重组新城疫溶瘤病毒、或如权利要求10所述的静脉注射制剂在制备预防和/或治疗新城疫病毒中的应用。
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