JP6970106B2 - Ｖｃｎエンハンサー組成物およびその使用方法 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／４２９，５１４号、２０１６年１１月３日に出願された同第６２／４１７，０８５号、２０１６年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／３１３，５７１号、２０１６年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／２９４，６１５号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での優先権を主張し、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、概して、一部分において、改善された遺伝子治療組成物およびその作製方法に関する。
遺伝子治療は、ヒト医薬品における新しい時代の非常に大きな可能性を持つ。遺伝子治療法は、標準的な医療業務によって対処可能でなかった病態の治療を可能にするであろう。しかしながら、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、販売のためのいかなるヒト遺伝子治療製品もまだ承認していない。現行の遺伝子治療は実験的なものであり、臨床試験において結果はまちまちであった。Ｇｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２０１３およびＮａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ ２０１５。
１９９９年に、１８歳のＪｅｓｓｅ Ｇｅｌｓｉｎｇｅｒが死亡して、遺伝子治療は重大な妨げに直面した。Ｊｅｓｓｅは、オルニチントランスカルボキシラーゼ欠損症（ＯＴＣＤ）に対する遺伝子治療試験に参加していた。彼は、処置を開始してから４日後に多臓器不全により死亡した。彼の死亡は、アデノウイルス担体に対する重度の免疫応答によって誘導されたものと考えられている。Ｓｉｂｂａｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＣＭＡＪ ２００１。
別の重大な打撃が２００３年１月にあり、その時、ＦＤＡは血液幹細胞にレトロウイルスベクターを使用する遺伝子治療試験を全て一時的に停止させた。ＦＤＡは、フランスの遺伝子治療試験において処置された２人目の小児で白血病のような病態を発症したことを知った後に、この措置を講じた。Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３。２００２年８月に、「バブルボーイ症候群」としても既知であるＸ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ−ＳＣＩＤ）に対して遺伝子治療によって首尾よく処置されていたこの小児および別の小児の両方において同様の病態が発症した。２００３年２月末、ＦＤＡの生物学的反応修飾物質諮問委員会（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＢＲＭＡＣ）が開催され、生命を脅かす疾患を処置するためのいくつかのレトロウイルス遺伝子治療試験が適切な保護手段を伴って進行させることを可能にする、可能性のある施策について検討した。２００３年４月に、ＦＤＡは、血液幹細胞にレトロウイルスベクターを用いる遺伝子治療試験に対する禁止令を緩和した。
しかしながら、最近、いくつかのグループが、いくつかの疾患との闘いにおいてある程度成功した遺伝子治療試験を導いた。２００８年に、ＵＫのＵＣＬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｏｒｆｉｅｌｄｓ Ｅｙｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＮＩＨＲ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅの研究者により、遺伝性失明の一種であるレーバー先天性黒内障を処置するための遺伝子治療の臨床試験の成功が発表された。その結果は、この実験的処置が安全であり、視力を改善できることを示した（Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３５８（２１）：２２４０（２００８））。
２００９年に、フランスの科学者グループにより、造血幹細胞媒介性遺伝子治療を用いることによるＸ連鎖副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）の処置の成功が報告された。Ｃａｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９。自己幹細胞を、患者から取り除き、エクスビボで遺伝的に調整し、次いで、患者が骨髄破壊的処置を受けた後に該患者に再注入した。２４〜３０カ月間の追跡調査の期間にわたって、顆粒球、単球、Ｔリンパ球、およびＢリンパ球の９〜１４％でＡＬＤタンパク質を発現するポリクローナル再構成が検出された。これらの結果により、患者に造血幹細胞が形質導入していることが強力に示唆される。遺伝的に調整された細胞を注入した１４〜１６カ月後に始まって、２人の患者の進行性大脳脱髄が停止した。
２０１１年に、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｘ，Ｉｎｃ．により、進行性パーキンソン病（ＰＤ）に対する治験遺伝子治療であるＮＬＸ−Ｐ１０１の第２相試験における肯定的な結果が発表された。ＮＬＸ−Ｐ１０１を受けた試験参加者において、偽手術を受けた対照の対象と比較して、非薬物療法（ｏｆｆ−ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）における運動スコアの統計的に有意であり、臨床的に意味のある改善が生じた。この試験では、この利益は１カ月目に見られ、６カ月の盲検試験期間全体を通して実質的に変化せずに継続された。この結果はまた、ＮＬＸ−Ｐ１０１についての肯定的な安全性プロファイルも実証し、遺伝子治療または外科手技に関連する重篤な有害事象は報告されていない。この試験に登録された患者らは、中程度から進行したＰＤを有し、現行の療法には適切に応答しなかった。
遺伝子治療の分野における最近の進歩により、βサラセミアおよび鎌状赤血球貧血等の異常ヘモグロビン症を患っている患者が新規の治療的手法から恩恵を受けることになるという期待が高まっている。Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１０。β−グロビン遺伝子を保有するレンチウイルスベクターを用いて改変した造血細胞（ＨＳＣ）を移植することにより、ヘモグロビン障害のいくつかのマウスモデルの長期にわたる調整（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）をもたらされた。例えば、Ｉｍｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００２；９９（２２）：１４３８０−１４３８５、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２００５；１０５４：２３８−２４９、Ｍａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０６（６７９１）：８２−８６、Ｐａｗｌｉｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１；２９４（５５５０）：２３６８−２３７１）。
遺伝子改変された自己細胞を注入することの主要な利点は、ＧＶＨＤおよび免疫抑制性移植前処置のリスクを回避すること、ならびに適合するドナーの不足に対処することであるが、現行の療法では、少なくとも３つの実質的な警告：毒性の骨髄破壊が必要条件であること（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ，．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８；９（１７）：２６２９−２６４０）、現行の遺伝子移入方法では造血幹細胞（ＨＳＣ）をほんの一部しか形質導入することができないこと（Ｓａｎｔｏｎｉ ｄｅ Ｓｉｏ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５０６：５９−７０）、形質導入したＨＳＣのベクターコピー数が治療効果の下限であることが多いこと、ならびに、利用可能な種々のインビボ選択戦略の有効性および安全性が最適以下になること（Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１０；１２０（７）：２３４５−２３５４、Ｃｏｒｎｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００６；１３（９）：８８６−８９５、Ｍｉｌｓｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８；６８（１５）：６１７１−６１８０）に直面している。
現在、レトロウイルス遺伝子治療ベクターを標的細胞に導入するための研究および臨床グループの間で使用されている膨大な数のプロトコルが存在する。歴史的に、高効率の遺伝子導入が、異なる戦略を用いた様々な細胞型において達成されている。しかしながら、これらの戦略のほとんど、例えば、ポリカチオン性、カチオン性リポソーム、ポリブレンは、細胞にとって毒性であるアジュバント治療の使用を含み、造血幹および前駆細胞のような初代起源の感受性標的細胞でのそれらの使用を制限する。
造血幹および前駆細胞は、効率的に形質導入されるのが難しいことで有名であることが知られており、したがって、非効率的な形質導入は、ＨＳＣに基づいた遺伝子治療が診療所に入ることを妨げる主要な限定因子のうちの１つである。効率的な形質導入はまた、多量のベクターが必要量の形質導入した細胞を作製するために必要であるため、遺伝子治療の開発費用を増加させる。したがって、造血幹および前駆細胞の形質導入効率を増加させるだけでなく、量子臨床的利点を提供するが、薬物生成物を作製するために必要であるウイルスの量を低減させ、そのため、臨床試験の費用を低減させ得る。
Ｇｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２０１３ Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ ２０１５ Ｓｉｂｂａｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＣＭＡＪ ２００１ Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３ Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３５８（２１）：２２４０（２００８） Ｃａｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９ Ｉｍｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００２；９９（２２）：１４３８０−１４３８５ Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２００５；１０５４：２３８−２４９ Ｍａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０６（６７９１）：８２−８６ Ｐａｗｌｉｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１；２９４（５５５０）：２３６８−２３７１） Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ，．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８；９（１７）：２６２９−２６４０ Ｓａｎｔｏｎｉ ｄｅ Ｓｉｏ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５０６：５９−７０ Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１０；１２０（７）：２３４５−２３５４ Ｃｏｒｎｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００６；１３（９）：８８６−８９５ Ｍｉｌｓｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８；６８（１５）：６１７１−６１８０
改善された遺伝子治療が、本明細書で企図される。特定の実施形態では、遺伝子治療は、増加した治療効果を有する造血幹および前駆細胞組成物ならびにその作製および使用方法を含む。他の特定の実施形態では、本発明は、改善された遺伝子治療組成物を得るために、形質導入効率ならびにヒト造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）のＶＣＮを増加させるための組成物および方法を企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、レトロウイルスベクターで形質導入した造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む造血細胞集団を企図し、ＨＳＰＣのうちの少なくとも５０％が形質導入され、ＨＳＰＣが、約０．５〜５の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有する。
特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約３０の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＳＰＣを形質導入する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２５の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＳＰＣを形質導入する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２０の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＳＰＣを形質導入する。
特定の実施形態では、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１３３＋細胞を含む。
ある特定の実施形態では、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞を含む。
さらなる実施形態では、細胞のうちの少なくとも７５％は、形質導入されている。
さらなる実施形態では、細胞のうちの少なくとも９０％は、形質導入されている。
特定の実施形態では、平均ＶＣＮは、少なくとも１．０である。
特定の実施形態では、平均ＶＣＮは、少なくとも１．５である。
特定の実施形態では、平均ＶＣＮは、少なくとも２．０である。
特定の実施形態では、平均ＶＣＮは、少なくとも２．５である。
ある特定の実施形態では、細胞集団の生存率は、少なくとも７５％である。
さらなる実施形態では、細胞集団の生存率は、少なくとも８５％である。
さらなる実施形態では、細胞集団の生存率は、少なくとも９５％である。
さらなる実施形態では、造血細胞集団の内毒素レベルは、高くとも５．０ＥＵ／ｍＬである。
ある特定の実施形態では、造血細胞集団の内毒素レベルは、最も高くて０．５ＥＵ／ｍＬである。
さらなる実施形態では、細胞集団は、少なくとも１×１０６個のＨＳＰＣ細胞を含む。
特定の実施形態では、細胞集団は、少なくとも１×１０７個のＨＳＰＣ細胞を含む。
特定の実施形態では、細胞集団は、少なくとも１×１０８個のＨＳＰＣ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも１×１０９個のＨＳＰＣ細胞を含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする。
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトβ−グロビンＬＣＲの１つ以上の要素を含む、プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ヒトβ−グロビンＬＣＲは、ヒトβ−グロビンＬＣＲからのＤＮａｓｅＩ超感受性部位２、３、および４を含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトβ−グロビン３’エンハンサー要素をさらに含む。
さらなる実施形態では、対象となる遺伝子は、抗鎌状タンパク質またはグロビン遺伝子をコードする。
特定の実施形態では、対象となる遺伝子は、ヒトβ−グロビンタンパク質、ヒトδ−グロビンタンパク質、ヒトγ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、またはヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ−グロビンタンパク質をコードする。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、およびＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、レトロウイルスで形質導入した造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む造血細胞集団を企図し、造血細胞集団は、少なくとも８５％のＨＳＰＣを含み、ＨＳＰＣのうちの少なくとも５０％が形質導入され、ＨＳＰＣは、約０．５〜約５．０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有し、細胞集団の生存率は、少なくとも７５％であり、造血細胞集団の内毒素レベルは、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬであり、造血細胞集団は、少なくとも１×１０６個のＨＳＰＣを含む。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、レトロウイルスで形質導入したＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞を含む造血細胞集団を企図し、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞のうちの少なくとも５０％が形質導入され、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞は、約０．５〜約５．０の平均ＶＣＮを有し、造血細胞集団の生存率は、少なくとも７５％であり、造血細胞集団の内毒素レベルは、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬであり、造血細胞集団は、少なくとも１×１０６個のＣＤ３４＋細胞を含む。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、レトロウイルスで形質導入したＣＤ３４＋細胞を含む造血細胞集団を企図し、ＣＤ３４＋のうちの少なくとも５０％が形質導入され、ＣＤ３４＋細胞は、約０．５〜約５．０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有し、造血細胞集団の生存率は、少なくとも７５％であり、造血細胞集団の内毒素レベルは、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬであり、この集団は、少なくとも２×１０６個のＣＤ３４＋細胞を含む。
特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約３０の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＳＰＣまたはＣＤ３４＋細胞を形質導入する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２５の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＳＰＣまたはＣＤ３４＋細胞を形質導入する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２０の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＳＰＣまたはＣＤ３４＋細胞を形質導入する。
いくつかの実施形態では、ＭＯＩは、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０である。
ある特定の実施形態では、細胞のうちの少なくとも７５％は、形質導入されている。
さらなる実施形態では、細胞のうちの少なくとも９０％は、形質導入されている。
特定の実施形態では、平均ＶＣＮは、少なくとも１．０である。
特定の実施形態では、平均ＶＣＮは、少なくとも１．５である。
特定の実施形態では、平均ＶＣＮは、少なくとも２．０である。
特定の実施形態では、平均ＶＣＮは、少なくとも２．５である。
いくつかの実施形態では、細胞集団の生存率は、少なくとも８５％である。
ある特定の実施形態では、細胞集団の生存率は、少なくとも９５％である。
さらなる実施形態では、造血細胞集団の内毒素レベルは、高くとも５．０ＥＵ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、造血細胞集団の内毒素レベルは、最も高くて０．５ＥＵ／ｍＬである。
さらなる実施形態では、細胞集団は、少なくとも１×１０７個のＨＳＰＣ細胞を含む。
さらなる実施形態では、細胞集団は、少なくとも１×１０８個のＨＳＰＣ細胞を含む。
ある特定の実施形態では、細胞集団は、少なくとも１×１０９個のＨＳＰＣ細胞を含む。
ある特定の実施形態では、細胞源は、臍帯血、骨髄、または動員末梢血である。
いくつかの実施形態では、細胞源は、動員末梢血である。
さらなる実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスに由来する。
ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶレンチウイルスに由来する。
さらなる実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶ−１レンチウイルスに由来する。
ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、ａ）５’長末端（ＬＴＲ）、ｂ）ＲＮＡ輸送要素、ｃ）レンチウイルス中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）、ｄ）対象となる遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、およびｅ）ＳＩＮ ３’ＬＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、修飾５’ＬＴＲは、野生型５’ＬＴＲと比較して欠失をさらに含む。
特定の実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターからなる群から選択される異種プロモーターと置き換えられる
さらなる実施形態では、ＲＮＡ輸送要素は、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＰＲＥ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含む。
ある特定の実施形態では、３’ＬＴＲは、ポリアデニル化配列を含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする。
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトβ−グロビンＬＣＲの１つ以上の要素を含む。
いくつかの実施形態では、ヒトβ−グロビンＬＣＲは、ヒトβ−グロビンＬＣＲからのＤＮａｓｅＩ超感受性部位２、３、および４を含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトβ−グロビン３’エンハンサー要素をさらに含む。
さらなる実施形態では、対象となる遺伝子は、抗鎌状タンパク質またはグロビン遺伝子をコードする。
特定の実施形態では、対象となる遺伝子は、ヒトβ−グロビンタンパク質、ヒトδ−グロビンタンパク質、ヒトγ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、またはヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ−グロビンタンパク質をコードする。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、およびＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクターで形質導入した細胞および組成物は、β−グロビン対立遺伝子：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクターで形質導入した細胞および組成物は、β−グロビン対立遺伝子：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋を含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクターで形質導入した細胞および組成物は、β−グロビン対立遺伝子：βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳを含む。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、本明細書で企図される造血細胞集団を含む組成物を企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、本明細書で企図される造血細胞集団と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、造血幹または前駆細胞と、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターと、約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーとを含む組成物を企図し、任意に、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、造血幹または前駆細胞と、培養培地と、レトロウイルスベクターと、約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーとを含む培養物を企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、造血幹または前駆細胞と、培養培地と、レトロウイルスベクターと、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤と、約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーとを含む培養物を企図する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約４０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、造血幹または前駆細胞と、培養培地と、レトロウイルスベクターと、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤と、少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーとを含む、培養物を企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、ＣＤ３４＋造血幹または前駆細胞と、培養培地と、レンチウイルスベクターと、ポロキサマー３３８とを含む、培養物を企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、ＣＤ３４＋造血幹または前駆細胞と、培養培地と、レンチウイルスベクターと、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤と、ポロキサマー３３８とを含む、培養物を企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、ＣＤ３４＋造血幹または前駆細胞と、培養培地と、レンチウイルスベクターと、ポロキサマー４０７とを含む、培養物を企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、ＣＤ３４＋造血幹または前駆細胞と、培養培地と、レンチウイルスベクターと、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤と、ポロキサマー４０７とを含む、培養物を企図する。
ある特定の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、ＰＧＡ２、ＰＧＢ２、ＰＧＤ２、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２、ＰＧＩ２、ＰＧＨ２、ＰＧＪ２、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される。
特定の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、１５ｄ−ＰＧＪ２、デルタ１２−ＰＧＪ２、２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）、トロンボキサンＡ２、トロンボキサンＢ２、イロプロスト、トレプロスチニル、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン、スーパーファン、ミソプロストール、ブタプロスト、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、ＰＧＥ２受容体アゴニスト、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、スルプロストン、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、および１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、または１６，１６−ジメチルＰＧＥ２からなる群から選択される。
特定の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、ＰＧＥ２である。
特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１３３＋細胞である。
ある特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞は、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択されるポロキサマーの存在下で形質導入されている。
特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞は、ポロキサマー２８８の存在下で形質導入されている。
いくつかの実施形態では、造血幹または前駆細胞は、ポロキサマー３３５の存在下で形質導入されている。
さらなる実施形態では、造血幹または前駆細胞は、ポロキサマー３３８の存在下で形質導入されている。
さらなる実施形態では、造血幹または前駆細胞は、ポロキサマー４０７の存在下で形質導入されている。
いくつかの実施形態では、造血幹または前駆細胞は、ポリカチオン性ポリマーの存在下で形質導入されている。
さらなる実施形態では、ポリカチオン性ポリマーは、ポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、またはポリエチレングリコール／ポリ−Ｌ−リジンブロックコポリマーである。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスに由来する。
ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶレンチウイルスに由来する。
特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶ−１レンチウイルスに由来する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約３０のＭＯＩで存在する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２５のＭＯＩで存在する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２０のＭＯＩで存在する。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０のＭＯＩで存在する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする。
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトβ−グロビンＬＣＲの１つ以上の要素を含む、プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ヒトβ−グロビンＬＣＲは、ヒトβ−グロビンＬＣＲからのＤＮａｓｅＩ超感受性部位２、３、および４を含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトβ−グロビン３’エンハンサー要素をさらに含む。
さらなる実施形態では、対象となる遺伝子は、抗鎌状タンパク質またはグロビン遺伝子をコードする。
特定の実施形態では、対象となる遺伝子は、ヒトβ−グロビンタンパク質、ヒトδ−グロビンタンパク質、ヒトγ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、またはヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ−グロビンタンパク質をコードする。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、およびＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、造血幹または前駆細胞と、培養培地と、スタウロスポリンと、レトロウイルスベクターと、少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーとを含む培養物を企図し、任意に、細胞を、レトロウイルスベクターおよびポロキサマーとの接触前に、スタウロスポリンと接触させる。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、造血幹または前駆細胞と、培養培地と、スタウロスポリンと、レトロウイルスベクターと、約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーとを含む、培養物を企図する。
いくつかの実施形態では、造血幹または前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１３３＋細胞である。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞は、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択されるポロキサマーの存在下で形質導入されている。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８である。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３５である。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３８である。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー４０７である。
いくつかの実施形態では、造血幹または前駆細胞は、ポリカチオン性ポリマーの存在下で形質導入されている。
さらなる実施形態では、ポリカチオン性ポリマーは、ポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、またはポリエチレングリコール／ポリ−Ｌ−リジンブロックコポリマーである。
さらなる実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
さらなる実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスに由来する。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶレンチウイルスに由来する。
特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶ−１レンチウイルスに由来する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約３０のＭＯＩで存在する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２５のＭＯＩで存在する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２０のＭＯＩで存在する。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０のＭＯＩで存在する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする。
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトβ−グロビンＬＣＲの１つ以上の要素を含む、プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ヒトβ−グロビンＬＣＲは、ヒトβ−グロビンＬＣＲからのＤＮａｓｅＩ超感受性部位２、３、および４を含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトβ−グロビン３’エンハンサー要素をさらに含む。
さらなる実施形態では、対象となる遺伝子は、抗鎌状タンパク質またはグロビン遺伝子をコードする。
特定の実施形態では、対象となる遺伝子は、ヒトβ−グロビンタンパク質、ヒトδ−グロビンタンパク質、ヒトγ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、またはヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ−グロビンタンパク質をコードする。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、およびＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、造血細胞集団を形質導入する方法を企図し、本方法は、培養培地中、レンチウイルスおよびポロキサマー３３８の存在下で細胞を培養することを含み、任意に、スタウロスポリンが存在する場合、細胞を、レトロウイルスベクターおよびポロキサマーとの接触前に、スタウロスポリンと接触させる。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、造血細胞集団を形質導入する方法を企図し、本方法は、培養培地中、レンチウイルス、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤、またはスタウロスポリン、および少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーの存在下で細胞を培養することを含み、任意に、スタウロスポリンが存在する場合、細胞を、レトロウイルスベクターおよびポロキサマーとの接触前に、スタウロスポリンと接触させる。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、造血細胞集団を形質導入する方法を企図し、本方法は、培養培地中、レンチウイルスおよびポロキサマー４０７の存在下で細胞を培養することを含み、任意に、スタウロスポリンが存在する場合、細胞を、レトロウイルスベクターおよびポロキサマーとの接触前に、スタウロスポリンと接触させる。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、造血細胞集団を形質導入する方法を企図し、本方法は、培養培地中、レンチウイルスの存在下で、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤、またはスタウロスポリン、ならびに約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーの存在下で細胞を培養することを含み、任意に、スタウロスポリンが存在する場合、細胞を、レトロウイルスベクターおよびポロキサマーとの接触前に、スタウロスポリンと接触させる。
ある特定の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、ＰＧＡ２、ＰＧＢ２、ＰＧＤ２、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２、ＰＧＩ２、ＰＧＨ２、ＰＧＪ２、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、１５ｄ−ＰＧＪ２、デルタ１２−ＰＧＪ２、２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）、トロンボキサンＡ２、トロンボキサンＢ２、イロプロスト、トレプロスチニル、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン、スーパーファン、ミソプロストール、ブタプロスト、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、ＰＧＥ２受容体アゴニスト、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、スルプロストン、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、および１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２からなる群から選択される。
特定の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、または１６，１６−ジメチルＰＧＥ２からなる群から選択される。
特定の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、ＰＧＥ２である。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
いくつかの実施形態では、造血細胞集団は、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択されるポロキサマーの存在下で形質導入されている。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８である。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３５である。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３８である。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー４０７である。
いくつかの実施形態では、造血細胞集団は、ポリカチオン性ポリマーの存在下で形質導入されている。
特定の実施形態では、ポリカチオン性ポリマーは、ポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、またはポリエチレングリコール／ポリ−Ｌ−リジンブロックコポリマーである。
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスに由来する。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶレンチウイルスに由来する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１レンチウイルスに由来する。
さらなる実施形態では、レトロウイルスベクターは、ａ）５’長末端（ＬＴＲ）、ｂ）プシー（Ψ）パッキングシグナル、ｃ）ＲＮＡ輸送要素、ｄ）レンチウイルス中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）、ｅ）対象となる遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、およびｆ）ＳＩＮ ３’ＬＴＲを含むレトロウイルスベクターである。
ある特定の実施形態では、修飾５’ＬＴＲは、野生型５’ＬＴＲと比較して欠失をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターからなる群から選択される異種プロモーターと置き換えられる
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ輸送要素は、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＰＲＥ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含む。
ある特定の実施形態では、３’ＬＴＲは、ポリアデニル化配列を含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約３０のＭＯＩで存在する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２５のＭＯＩで存在する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２０のＭＯＩで存在する。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０のＭＯＩで存在する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする。
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトβ−グロビンＬＣＲの１つ以上の要素を含む、プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、ヒトβ−グロビンＬＣＲは、ヒトβ−グロビンＬＣＲからのＤＮａｓｅＩ超感受性部位２、３、および４を含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトβ−グロビン３’エンハンサー要素をさらに含む。
さらなる実施形態では、対象となる遺伝子は、抗鎌状タンパク質またはグロビン遺伝子をコードする。
特定の実施形態では、対象となる遺伝子は、ヒトβ−グロビンタンパク質、ヒトδ−グロビンタンパク質、ヒトγ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、またはヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ−グロビンタンパク質をコードする。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、およびＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである。
いくつかの実施形態では、造血細胞集団は、少なくとも約２時間形質導入される。
ある特定の実施形態では、造血細胞集団は、少なくとも約２４時間形質導入される。
いくつかの実施形態では、造血細胞集団は、約２時間〜約２４時間形質導入される。
さらなる実施形態では、造血細胞は、造血幹または前駆細胞を含む。
特定の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１３３＋細胞を含む。
いくつかの実施形態では、造血細胞集団は、形質導入前に、ＣＤ３４＋またはＣＤ１３３＋発現のために選択される。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、対象における異常ヘモグロビン症を治療する方法を企図し、本方法は、対象に、本明細書で企図される細胞集団を投与することを含む。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、対象における異常ヘモグロビン症の少なくとも１つの症状を改善する方法を企図し、本方法は、対象に、本明細書で企図される細胞集団、または本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
特定の実施形態では、対象のβ−グロビン対立遺伝子は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳである。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、対象におけるサラセミアを治療する方法を企図し、本方法は、対象に、有効量の、本明細書で企図される造血細胞集団、または本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
ある特定の実施形態では、サラセミアは、α−サラセミアである。
さらなる実施形態では、サラセミアは、β−サラセミアである。
特定の実施形態では、対象のβ−グロビン対立遺伝子は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋である。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、対象における鎌状赤血球病を治療する方法を企図し、本方法は、対象に、有効量の、本明細書で企図される造血細胞集団、または本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
さらなる実施形態では、対象のβ−グロビン対立遺伝子は、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳである。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、対象におけるβ−サラセミアを治療する方法を企図し、本方法は、対象に、有効量の、本明細書で企図される造血細胞集団、または本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
さらなる実施形態では、対象のβ−グロビン対立遺伝子は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋である。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、対象における副腎白質ジストロフィーまたは副腎脊髄ニューロパシーを治療する方法を企図し、本方法は、対象に、一定量の、本明細書で企図される造血細胞集団、または本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
特定の実施形態では、本発明は、一部分において、対象におけるＡＤＡ−ＳＣＩＤを治療する方法を企図し、本方法は、対象に、有効量の、本明細書で企図される造血細胞集団、または本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
ある特定の実施形態では、本発明は、一部分において、対象におけるＸ−ＳＣＩＤを治療する方法を企図し、本方法は、対象に、有効量の、本明細書で企図される造血細胞集団、または本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、一部分において、対象におけるバッテン病を治療する方法を企図し、本方法は、対象に、有効量の、本明細書で企図される造血細胞集団、または本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
さらなる実施形態では、本発明は、一部分において、対象におけるＭＰＳ Ｉを治療する方法を企図し、本方法は、対象に、有効量の、本明細書で企図される造血細胞集団、または本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
さらなる実施形態では、本発明は、一部分において、対象におけるＭＰＳ ＩＩを治療する方法を企図し、本方法は、対象に、有効量の、本明細書で企図される造血細胞集団、または本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
ある特定の実施形態では、造血幹細胞集団は、静脈内経路、髄内経路、または骨内経路に投与される。
特定の実施形態では、造血幹細胞集団は、静脈内に投与される。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤またはスタウロスポリンと、ポロキサマーとを含む、キットを企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤またはスタウロスポリンと、少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーとを含む、キットを企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤またはスタウロスポリンと、約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーとを含む、キットを企図する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約４０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
ある特定の実施形態では、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む、ポロキサマー。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
ある特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８である。
いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３５である。
さらなる実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３８である。
さらなる実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー４０７である。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤と、ポロキサマー３３８とを含む、キットを企図する。
様々な実施形態では、本発明は、一部分において、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤と、ポロキサマー４０７とを含む、キットを企図する。
さらなる実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、ＰＧＡ２、ＰＧＢ２、ＰＧＤ２、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２、ＰＧＩ２、ＰＧＨ２、ＰＧＪ２、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、１５ｄ−ＰＧＪ２、デルタ１２−ＰＧＪ２、２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）、トロンボキサンＡ２、トロンボキサンＢ２、イロプロスト、トレプロスチニル、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン、スーパーファン、ミソプロストール、ブタプロスト、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、ＰＧＥ２受容体アゴニスト、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、スルプロストン、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、および１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、または１６，１６−ジメチルＰＧＥ２からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤は、ＰＧＥ２である。
ある特定の実施形態では、キットは、ポリカチオン性ポリマーをさらに含む。
特定の実施形態では、ポリカチオン性ポリマーは、ポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、またはポリエチレングリコール／ポリ−Ｌ−リジンブロックコポリマーである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
レトロウイルスベクターで形質導入した造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む造血細胞の集団であって、前記ＨＳＰＣのうちの少なくとも５０％が形質導入され、前記ＨＳＰＣが、約０．５〜５の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有する、集団。
(項目２)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約３０の感染多重度（ＭＯＩ）で前記ＨＳＰＣを形質導入している、項目１に記載の集団。
(項目３)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約２５の感染多重度（ＭＯＩ）で前記ＨＳＰＣを形質導入している、項目１に記載の集団。
(項目４)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約２０の感染多重度（ＭＯＩ）で前記ＨＳＰＣを形質導入している、項目１に記載の集団。
(項目５)
前記レトロウイルスベクターが、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０のＭＯＩで前記ＨＳＰＣを形質導入している、項目１に記載の集団。
(項目６)
前記ＨＳＰＣが、ＣＤ３４ ＋ 細胞またはＣＤ１３３ ＋ 細胞を含む、項目１に記載の造血細胞集団。
(項目７)
前記ＨＳＰＣが、ＣＤ３４ ＋ ＣＤ３８ Ｌｏ ＣＤ９０ ＋ ＣＤ４５ＲＡ − 細胞を含む、項目１または項目２に記載の造血細胞集団。
(項目８)
前記細胞のうちの少なくとも７５％が形質導入されている、項目１〜３のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目９)
前記細胞のうちの少なくとも９０％が形質導入されている、項目１〜４のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目１０)
前記平均ＶＣＮが、少なくとも１．０である、項目１〜５のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目１１)
前記平均ＶＣＮが、少なくとも１．５である、項目１〜６のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目１２)
前記平均ＶＣＮが、少なくとも２．０である、項目１〜７のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目１３)
前記平均ＶＣＮが、少なくとも２．５である、項目１〜８のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目１４)
前記細胞集団の生存率が、少なくとも７５％である、項目１〜９のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目１５)
前記細胞集団の生存率が、少なくとも８５％である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目１６)
前記細胞集団の生存率が、少なくとも９５％である、項目１〜１１のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目１７)
前記造血細胞集団の内毒素レベルが、高くとも５．０ＥＵ／ｍＬである、項目１〜１２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目１８)
前記造血細胞集団の内毒素レベルが、最も高くて０．５ＥＵ／ｍＬである、項目１〜１３のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目１９)
前記細胞集団が、少なくとも１×１０ ６ 個のＨＳＰＣ細胞を含む、項目１〜１４のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目２０)
前記細胞集団が、少なくとも１×１０ ７ 個のＨＳＰＣ細胞を含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目２１)
前記細胞集団が、少なくとも１×１０ ８ 個のＨＳＰＣ細胞を含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目２２)
前記細胞集団が、少なくとも１×１０ ９ 個のＨＳＰＣ細胞を含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目２３)
前記レトロウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目２４)
前記レトロウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む、項目１〜２３のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目２５)
前記レトロウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードする、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目２６)
前記レトロウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目２７)
前記レトロウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードする、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目２８)
前記レトロウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目２９)
前記レトロウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目３０)
前記レトロウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目３１)
前記レトロウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目３２)
前記レトロウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目３３)
前記レンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目３４)
前記レンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードする、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目３５)
前記レンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目３６)
前記レンチウイルスベクターが、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、またはＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである、項目１〜２２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目３７)
前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、項目１〜３６のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目３８)
レトロウイルスで形質導入した造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む造血細胞集団であって、前記造血細胞集団が、少なくとも８５％のＨＳＰＣを含み、前記ＨＳＰＣのうちの少なくとも５０％が形質導入され、前記ＨＳＰＣが、約０．５〜約５．０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有し、前記細胞集団の生存率が、少なくとも７５％であり、前記造血細胞集団の内毒素レベルが、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬであり、前記造血細胞集団が、少なくとも１×１０ ６ 個のＨＳＰＣを含む、造血細胞集団。
(項目３９)
レトロウイルスで形質導入したＣＤ３４ ＋ ＣＤ３８ Ｌｏ ＣＤ９０ ＋ ＣＤ４５ ＲＡ− 細胞を含む造血細胞集団であって、前記ＣＤ３４ ＋ ＣＤ３８ Ｌｏ ＣＤ９０ ＋ ＣＤ４５ ＲＡ− 細胞のうちの少なくとも５０％が形質導入され、前記ＣＤ３４ ＋ ＣＤ３８ Ｌｏ ＣＤ９０ ＋ ＣＤ４５ ＲＡ− 細胞が、約０．５〜約５．０の平均ＶＣＮを有し、前記造血細胞集団の生存率が、少なくとも７５％であり、前記造血細胞集団の内毒素レベルが、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬであり、前記造血細胞集団が、少なくとも１×１０ ６ 個のＣＤ３４ ＋ 細胞を含む、造血細胞集団。
(項目４０)
レトロウイルスで形質導入したＣＤ３４ ＋ 細胞を含む造血細胞集団であって、前記ＣＤ３４ ＋ のうちの少なくとも５０％が形質導入され、前記ＣＤ３４ ＋ 細胞が、約０．５〜約５．０の平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）を有し、前記造血細胞集団の生存率が、少なくとも７５％であり、前記造血細胞集団の内毒素レベルが、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬであり、前記集団が、少なくとも２×１０ ６ 個のＣＤ３４ ＋ 細胞を含む、造血細胞集団。
(項目４１)
前記レンチウイルスベクターが、約１０〜約３０の感染多重度（ＭＯＩ）で前記ＨＳＰＣを形質導入している、項目３８〜４０のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目４２)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約２５の感染多重度（ＭＯＩ）で前記ＨＳＰＣを形質導入している、項目３８〜４０のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目４３)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約２０の感染多重度（ＭＯＩ）で前記ＨＳＰＣを形質導入している、項目３８〜４０のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目４４)
前記レトロウイルスベクターが、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０の感染多重度（ＭＯＩ）で前記ＨＳＰＣを形質導入している、項目３８〜４０のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目４５)
前記細胞のうちの少なくとも７５％が、形質導入されている、項目３８〜４４のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目４６)
前記細胞のうちの少なくとも９０％が、形質導入されている、項目３８〜４５のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目４７)
前記平均ＶＣＮが、少なくとも１．０である、項目３８〜４６のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目４８)
前記平均ＶＣＮが、少なくとも１．５である、項目３８〜４７のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目４９)
前記平均ＶＣＮが、少なくとも２．０である、項目３８〜４８のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目５０)
前記平均ＶＣＮが、少なくとも２．５である、項目３８〜４９のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目５１)
前記細胞集団の生存率が、少なくとも８５％である、項目３８〜５０のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目５２)
前記細胞集団の生存率が、少なくとも９５％である、項目３８〜５１のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目５３)
前記造血細胞集団の内毒素レベルが、高くとも５．０ＥＵ／ｍＬである、項目３８〜５２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目５４)
前記造血細胞集団の内毒素レベルが、最も高くて０．５ＥＵ／ｍＬである、項目３８〜５３のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目５５)
前記細胞集団が、少なくとも１×１０ ７ 個のＨＳＰＣ細胞を含む、項目３８〜５４のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目５６)
前記細胞集団が、少なくとも１×１０ ８ 個のＨＳＰＣ細胞を含む、項目３８〜５５のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目５７)
前記細胞集団が、少なくとも１×１０ ９ 個のＨＳＰＣ細胞を含む、項目３８〜５６のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目５８)
前記細胞源が、臍帯血、骨髄、または動員末梢血である、項目３８〜５７のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目５９)
前記細胞源が、動員末梢血である、項目３８〜５８のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目６０)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスに由来する、項目３８〜５９のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目６１)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶレンチウイルスに由来する、項目３８〜６０のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目６２)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ−１レンチウイルスに由来する、項目３８〜６１のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目６３)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目６４)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目６５)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードする、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目６６)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目６７)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードする、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目６８)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目６９)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目７０)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目７１)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目７２)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目７３)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードする、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目７４)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目７５)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、またはＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである、項目３８〜６２のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目７６)
前記レトロウイルスベクターが、
ａ）５’長末端（ＬＴＲ）、
ｂ）ＲＮＡ輸送要素、
ｃ）レンチウイルス中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）、
ｄ）対象となる遺伝子に作動可能に連結した、プロモーター、および
ｅ）ＳＩＮ ３’ＬＴＲ、を含む、レンチウイルスベクターである、項目３８〜７５のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目７７)
前記５’ＬＴＲが、修飾５’ＬＴＲである、項目７６に記載の造血細胞集団。
(項目７８)
前記修飾５’ＬＴＲが、野生型５’ＬＴＲと比較して欠失をさらに含む、項目７７に記載の造血細胞集団。
(項目７９)
前記５’ＬＴＲのプロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターからなる群から選択される異種プロモーターと置き換えられる、項目７６〜７８のいずれか一項に記載の造血細胞集団
(項目８０)
前記ＲＮＡ輸送要素が、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＰＲＥ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含む、項目７６〜７９のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目８１)
前記３’ＬＴＲが、ポリアデニル化配列を含む、項目７６〜８０のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目８２)
前記プロモーターが、ヒトβ−グロビンＬＣＲの１つ以上の要素を含む、項目７６〜８１のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目８３)
前記ヒトβ−グロビンＬＣＲが、前記ヒトβ−グロビンＬＣＲからのＤＮａｓｅＩ超感受性部位２、３、および４を含む、項目８２に記載の造血細胞集団。
(項目８４)
前記レンチウイルスベクターが、ヒトβ−グロビン３’エンハンサー要素をさらに含む、項目７６〜８３のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目８５)
対象となる遺伝子が、抗鎌状タンパク質またはグロビン遺伝子をコードする、項目７６〜８４のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目８６)
対象となる遺伝子が、ヒトβ−グロビンタンパク質、ヒトδ−グロビンタンパク質、ヒトγ−グロビンタンパク質、ヒトβ Ａ−Ｔ８７Ｑ −グロビンタンパク質、ヒトβ Ａ−Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ −グロビンタンパク質、またはヒトβ Ａ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ −グロビンタンパク質をコードする、項目８５に記載の造血細胞集団。
(項目８７)
前記細胞のβ−グロビン対立遺伝子が、β Ｅ ／β ０ 、β Ｃ ／β ０ 、β ０ ／β ０ 、β Ｅ ／β Ｅ 、β Ｃ ／β ＋ 、β Ｅ ／β ＋ 、β ０ ／β ＋ 、β ＋ ／β ＋ 、β Ｃ ／β Ｃ 、β Ｅ ／β Ｓ 、β ０ ／β Ｓ 、β Ｃ ／β Ｓ 、β ＋ ／β Ｓ 、またはβ Ｓ ／β Ｓ である、項目１〜８６のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目８８)
前記細胞のβ−グロビン対立遺伝子が、β Ｅ ／β ０ 、β Ｃ ／β ０ 、β ０ ／β ０ 、β Ｃ ／β Ｃ 、β Ｅ ／β Ｅ 、β Ｅ ／β ＋ 、β Ｃ ／β Ｅ 、β Ｃ ／β ＋ 、β ０ ／β ＋ 、またはβ ＋ ／β ＋ である、項目１〜８６のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目８９)
前記細胞のβ−グロビン対立遺伝子が、β Ｅ ／β Ｓ 、β ０ ／β Ｓ 、β Ｃ ／β Ｓ 、β ＋ ／β Ｓ 、またはβ Ｓ ／β Ｓ である、項目１〜８６のいずれか一項に記載の造血細胞集団。
(項目９０)
項目１〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団を含む、組成物。
(項目９１)
項目１〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
(項目９２)
造血幹または前駆細胞、培養培地、レトロウイルスベクター、および少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーを含む、培養物。
(項目９３)
造血幹または前駆細胞、培養培地、レトロウイルスベクター、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤、および少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーを含む、培養物。
(項目９４)
造血幹または前駆細胞、培養培地、レトロウイルスベクター、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤、ならびに約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量および約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーを含む、培養物。
(項目９５)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約３０のＭＯＩで存在する、項目９２〜９４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目９６)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約２５のＭＯＩで存在する、項目９２〜９４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目９７)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約２０のＭＯＩで存在する、項目９２〜９４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目９８)
前記レトロウイルスベクターが、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０のＭＯＩで存在する、項目９２〜９４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目９９)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目９２〜９８のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１００)
前記ポロキサマーが、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目９２〜９８のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１０１)
前記ポロキサマーが、少なくとも約４０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目９９〜１０１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１０２)
前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目９９〜１０１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１０３)
前記ポロキサマーが、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む、項目９９〜１０１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１０４)
前記ポロキサマーが、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む、項目９９〜１０１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１０５)
前記ポロキサマーが、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む、項目９９〜１０１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１０６)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む、項目９９〜１０５のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１０７)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目９９〜１０５のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１０８)
前記ポロキサマーが、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目９９〜１０５のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１０９)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される、項目９２〜１０８のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１１０)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８である、項目９２〜１０９のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１１１)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー３３５である、項目９２〜１０９のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１１２)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー３３８である、項目９２〜１０９のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１１３)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー４０７である、項目９２〜１０９のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１１４)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、ＰＧＡ ２ 、ＰＧＢ ２ 、ＰＧＤ ２ 、ＰＧＥ １ 、ＰＧＥ ２ 、ＰＧＦ ２ 、ＰＧＩ ２ 、ＰＧＨ ２ 、ＰＧＪ ２ 、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される、項目９３〜１１３のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１１５)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、１５ｄ−ＰＧＪ ２ 、デルタ１２−ＰＧＪ ２ 、２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）、トロンボキサンＡ２、トロンボキサンＢ２、イロプロスト、トレプロスチニル、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン、スーパーファン、ミソプロストール、ブタプロスト、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、ＰＧＥ ２ 受容体アゴニスト、１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ ２ 、１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ ２ 、スルプロストン、ＰＧＥ ２ セリノールアミド、ＰＧＥ ２ メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ ２ 、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ ２ 、および１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ ２ からなる群から選択される、項目９３〜１１４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１１６)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、プロスタグランジンＥ ２ （ＰＧＥ ２ ）、または１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ からなる群から選択される、項目９３〜１１５のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１１７)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、ＰＧＥ ２ である、項目９３〜１１６のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１１８)
前記造血幹または前駆細胞が、ＣＤ３４ ＋ 細胞またはＣＤ１３３ ＋ 細胞である、項目９２〜１１７のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１１９)
前記造血幹または前駆細胞が、ポリカチオン性ポリマーの存在下で形質導入される、項目９２〜１１８のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１２０)
前記ポリカチオン性ポリマーが、ポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、またはポリエチレングリコール／ポリ−Ｌ−リジンブロックコポリマーである、項目１１９に記載の培養物。
(項目１２１)
前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、項目９２〜１２０のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１２２)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスに由来する、項目９２〜１２１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１２３)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶレンチウイルスに由来する、項目９２〜１２２のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１２４)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ−１レンチウイルスに由来する、項目９２〜１２２のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１２５)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１２６)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１２７)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードする、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１２８)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１２９)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードする、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１３０)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１３１)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１３２)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１３３)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１３４)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１３５)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードする、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１３６)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１３７)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、またはＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである、項目９２〜１２４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１３８)
造血幹または前駆細胞、培養培地、スタウロスポリン、レトロウイルスベクター、および少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーを含む、培養物であって、任意に、前記細胞を、前記レトロウイルスベクターおよびポロキサマーとの接触前に、スタウロスポリンと接触させる、培養物。
(項目１３９)
造血幹または前駆細胞、培養培地、スタウロスポリン、レトロウイルスベクター、および約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有するポロキサマーを含む、培養物であって、約４０％超のポリエチレンオキシドを含み、任意に、前記細胞を、前記レトロウイルスベクターおよびポロキサマーとの接触前に、スタウロスポリンと接触させる、培養物。
(項目１４０)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目１３８または項目１３９に記載の培養物。
(項目１４１)
前記ポロキサマーが、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目１３８または項目１３９に記載の培養物。
(項目１４２)
前記ポロキサマーが、少なくとも約４０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目１３８または項目１３９に記載の培養物。
(項目１４３)
前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１４０〜１４２のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１４４)
前記ポロキサマーが、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１４０〜１４２のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１４５)
前記ポロキサマーが、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１４０〜１４２のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１４６)
前記ポロキサマーが、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１４０〜１４２のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１４７)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１４０〜１４６のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１４８)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１４０〜１４６のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１４９)
前記ポロキサマーが、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１４０〜１４６のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１５０)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される、項目１４０〜１４９のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１５１)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８である、項目１４０〜１５０のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１５２)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー３３５である、項目１４０〜１５０のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１５３)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー３３８である、項目１４０〜１５０のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１５４)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー４０７である、項目１４０〜１５０のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１５５)
前記造血幹または前駆細胞が、ＣＤ３４ ＋ 細胞またはＣＤ１３３ ＋ 細胞である、項目１３８〜１５４のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１５６)
前記造血幹または前駆細胞が、ポリカチオン性ポリマーの存在下で形質導入される、項目１３８〜１５５のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１５７)
前記ポリカチオン性ポリマーが、ポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、またはポリエチレングリコール／ポリ−Ｌ−リジンブロックコポリマーである、項目１５６に記載の培養物。
(項目１５８)
前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、項目１３８〜１５７のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１５９)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスに由来する、項目１３８〜１５８のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１６０)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶレンチウイルスに由来する、項目１３８〜１５９のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１６１)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ−１レンチウイルスに由来する、項目１３８〜１６０のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１６２)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１６３)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１６４)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードする、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１６５)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１６６)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードする、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１６７)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１６８)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１６９)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１７０)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１７１)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１７２)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードする、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１７３)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１７４)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、またはＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである、項目１３８〜１６１のいずれか一項に記載の培養物。
(項目１７５)
造血細胞集団を形質導入する方法であって、培養培地中、レトロウイルスおよび少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーの存在下で前記細胞を培養することを含む、方法。
(項目１７６)
造血細胞集団を形質導入する方法であって、培養培地中、レトロウイルスおよび約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーの存在下で前記細胞を培養することを含む、方法。
(項目１７７)
造血細胞集団を形質導入する方法であって、培養培地中、レトロウイルス、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤またはスタウロスポリン、および少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーの存在下で前記細胞を培養することを含み、任意に、スタウロスポリンが存在する場合、前記細胞を、前記レトロウイルスベクターおよびポロキサマーとの接触前に、スタウロスポリンと接触させる、方法。
(項目１７８)
造血細胞集団を形質導入する方法であって、培養培地中、レトロウイルスの存在下で前記細胞を培養することを含む、方法
(項目１７９)
前記レンチウイルスベクターが、約１０〜約３０のＭＯＩまたは約１０〜約２５のＭＯＩで存在する、項目１７５〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８０)
前記レンチウイルスベクターが、約１０〜約２０のＭＯＩで存在する、項目１７５〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８１)
前記レンチウイルスベクターが、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０のＭＯＩで存在する、項目１７５〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８２)
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤またはスタウロスポリン、および約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマー、任意に、スタウロスポリンが存在する場合、前記細胞を、前記レトロウイルスベクターおよびポロキサマーとの接触前に、スタウロスポリンと接触させる、項目１７５〜１８１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８３)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目１７５〜１８２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８４)
前記ポロキサマーが、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目１７５〜１８２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８５)
前記ポロキサマーが、少なくとも約４０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目１７５〜１８２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８６)
前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１８３〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８７)
前記ポロキサマーが、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１８３〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８８)
前記ポロキサマーが、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１８３〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８９)
前記ポロキサマーが、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１８３〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９０)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１７５〜１８９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９１)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１７５〜１８９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９２)
前記ポロキサマーが、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目１７５〜１８９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９３)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、ＰＧＡ ２ 、ＰＧＢ ２ 、ＰＧＤ ２ 、ＰＧＥ １ 、ＰＧＥ ２ 、ＰＧＦ ２ 、ＰＧＩ ２ 、ＰＧＨ ２ 、ＰＧＪ ２ 、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される、項目１７５〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９４)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、１５ｄ−ＰＧＪ ２ 、デルタ１２−ＰＧＪ ２ 、２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）、トロンボキサンＡ２、トロンボキサンＢ２、イロプロスト、トレプロスチニル、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン、スーパーファン、ミソプロストール、ブタプロスト、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、ＰＧＥ ２ 受容体アゴニスト、１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ ２ 、１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ ２ 、スルプロストン、ＰＧＥ ２ セリノールアミド、ＰＧＥ ２ メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ ２ 、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、および１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ ２ からなる群から選択される、項目１７５〜１９３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９５)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、プロスタグランジンＥ ２ （ＰＧＥ ２ ）、または１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ からなる群から選択される、項目１７５〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９６)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、ＰＧＥ ２ である、項目１７５〜１９５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９７)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される、項目１７５〜１９６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９８)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８である、項目１７５〜１９７のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９９)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー３３５である、項目１７５〜１９７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２００)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー３３８である、項目１７５〜１９７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０１)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー４０７である、項目１７５〜１９７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０２)
前記造血細胞集団が、ポリカチオン性ポリマーの存在下で形質導入される、項目１７５〜２０１のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０３)
前記ポリカチオン性ポリマーが、ポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、またはポリエチレングリコール／ポリ−Ｌ−リジンブロックコポリマーである、項目２０２に記載の方法。
(項目２０４)
前記レンチウイルスベクターが、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスに由来する、項目１７５〜２０３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０５)
前記レンチウイルスベクターが、ＨＩＶレンチウイルスに由来する、項目１７５〜２０４のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０６)
前記レンチウイルスベクターが、ＨＩＶ−１レンチウイルスに由来する、項目１７５〜２０５のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０７)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０８)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０９)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードする、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１０)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１１)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードする、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１２)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１３)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１４)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１５)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１６)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１７)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードする、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１８)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１９)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、またはＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである、項目１７５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２０)
前記レトロウイルスベクターが、
ａ）５’長末端（ＬＴＲ）、
ｂ）プシー（Ψ）パッケージングシグナル、
ｃ）ＲＮＡ輸送要素、
ｄ）レンチウイルス中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）、
ｅ）対象となるポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター、および
ｆ）ＳＩＮ ３’ＬＴＲを含む、レンチウイルスベクターである、項目９２〜１７４のいずれか一項に記載の培養物、または項目１７５〜２１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２１)
前記５’ＬＴＲが、野生型５’ＬＴＲと比較して欠失をさらに含む修飾５’ＬＴＲである、項目２２０に記載の培養物または方法。
(項目２２２)
前記５’ＬＴＲのプロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターからなる群から選択される異種プロモーターと置き換えられる、項目２２０または項目２２１に記載の培養物または方法
(項目２２３)
前記ＲＮＡ輸送要素が、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＰＲＥ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含む、項目２２０〜２２２のいずれか一項に記載の培養物または方法。
(項目２２４)
前記３’ＬＴＲが、ポリアデニル化配列を含む、項目２２０〜２２３のいずれか一項に記載の培養物または方法。
(項目２２５)
前記プロモーターが、ヒトβ−グロビンＬＣＲの１つ以上の要素を含む、項目２２０〜２２４のいずれか一項に記載の培養物または方法。
(項目２２６)
前記ヒトβ−グロビンＬＣＲが、前記ヒトβ−グロビンＬＣＲからのＤＮａｓｅＩ超感受性部位２、３、および４を含む、項目２２０〜２２５のいずれか一項に記載の培養物または方法。
(項目２２７)
前記レンチウイルスベクターが、ヒトβ−グロビン３’エンハンサー要素をさらに含む、項目２２０〜２２６のいずれか一項に記載の培養物または方法。
(項目２２８)
前記対象となるポリヌクレオチドが、抗鎌状タンパク質またはグロビン遺伝子をコードする、項目２２〜２２７のいずれか一項に記載の培養物または方法。
(項目２２９)
前記対象となる遺伝子が、ヒトβ−グロビンタンパク質、ヒトδ−グロビンタンパク質、ヒトγ−グロビンタンパク質、ヒトβ Ａ−Ｔ８７Ｑ −グロビンタンパク質、ヒトβ Ａ−Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ −グロビンタンパク質、またはヒトβ Ａ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ −グロビンタンパク質をコードする、項目２２８に記載の培養物または方法。
(項目２３０)
前記造血細胞集団が、少なくとも約２時間形質導入される、項目１７５〜２２９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３１)
前記造血細胞集団が、少なくとも約２４時間形質導入される、項目１７５〜２３０のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３２)
前記造血細胞集団が、約２時間〜約２４時間形質導入される、項目１７５〜２２９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３３)
前記造血細胞が、造血幹または前駆細胞を含む、項目１７５〜２３２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３４)
前記造血細胞が、ＣＤ３４ ＋ 細胞またはＣＤ１３３ ＋ 細胞を含む、項目１７５〜２３３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３５)
前記造血細胞集団が、形質導入前に、ＣＤ３４ ＋ またはＣＤ１３３ ＋ 発現のために選択される、項目１７５〜２３４のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３６)
対象における異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、前記対象に、項目１〜６２および７５〜８９のいずれか一項に記載の細胞集団を投与することを含む、方法。
(項目２３７)
対象における異常ヘモグロビン症の少なくとも１つの症状を改善する方法であって、前記対象に、項目１〜６２および７５〜８９のいずれか一項に記載の細胞集団、または項目９０または９１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目２３８)
前記対象のβ−グロビン対立遺伝子が、β Ｅ ／β ０ 、β Ｃ ／β ０ 、β ０ ／β ０ 、β Ｅ ／β Ｅ 、β Ｃ ／β ＋ 、β Ｅ ／β ＋ 、β ０ ／β ＋ 、β ＋ ／β ＋ 、β Ｃ ／β Ｃ 、β Ｅ ／β Ｓ 、β ０ ／β Ｓ 、β Ｃ ／β Ｓ 、β ＋ ／β Ｓ 、またはβ Ｓ ／β Ｓ である、項目２３６または２３７に記載の方法。
(項目２３９)
対象におけるサラセミアを治療する方法であって、前記対象に、有効量の、項目１〜６２および７５〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団、または項目９０または９１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目２４０)
前記サラセミアが、α−サラセミアである、項目２３９に記載の方法。
(項目２４１)
前記サラセミアが、β−サラセミアである、項目２３９に記載の方法。
(項目２４２)
前記対象のβ−グロビン対立遺伝子が、β Ｅ ／β ０ 、β Ｃ ／β ０ 、β ０ ／β ０ 、β Ｃ ／β Ｃ 、β Ｅ ／β Ｅ 、β Ｅ ／β ＋ 、β Ｃ ／β Ｅ 、β Ｃ ／β ＋ 、β ０ ／β ＋ 、またはβ ＋ ／β ＋ である、項目２３９に記載の方法。
(項目２４３)
対象における鎌状赤血球病を治療する方法であって、前記対象に、有効量の、項目１〜６２および７５〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団、または項目９０または９１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目２４４)
前記対象のβ−グロビン対立遺伝子が、β Ｅ ／β Ｓ 、β ０ ／β Ｓ 、β Ｃ ／β Ｓ 、β ＋ ／β Ｓ 、またはβ Ｓ ／β Ｓ である、項目２４３に記載の方法。
(項目２４５)
対象におけるβ−サラセミアを治療する方法であって、前記対象に、有効量の、項目１〜６２および７５〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団、または項目９０または９１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目２４６)
前記対象のβ−グロビン対立遺伝子が、β Ｅ ／β ０ 、β Ｃ ／β ０ 、β ０ ／β ０ 、β Ｃ ／β Ｃ 、β Ｅ ／β Ｅ 、β Ｅ ／β ＋ 、β Ｃ ／β Ｅ 、β Ｃ ／β ＋ 、β ０ ／β ＋ 、またはβ ＋ ／β ＋ である、項目２４５に記載の方法。
(項目２４７)
対象における副腎白質ジストロフィーまたは副腎脊髄ニューロパシーを治療する方法であって、前記対象に、有効量の、項目１〜６４および７５〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団、または項目９０または９１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目２４８)
対象におけるＡＤＡ−ＳＣＩＤを治療する方法であって、前記対象に、有効量の、項目１〜６２、６５、６６、および７５〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団、または項目９０または９１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目２４９)
対象におけるＸ−ＳＣＩＤを治療する方法であって、前記対象に、有効量の、項目１〜６２、６７、６８、および７５〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団、または項目９０または９１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目２５０)
対象におけるバッテン病を治療する方法であって、前記対象に、有効量の、項目１〜６２、６９、７０、および７５〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団、または項目９０または９１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目２５１)
対象におけるＭＰＳ Ｉを治療する方法であって、前記対象に、有効量の、項目１〜６２、７１、７２、および７５〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団、または項目９０または９１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目２５２)
対象におけるＭＰＳ ＩＩを治療する方法であって、前記対象に、有効量の、項目１〜６２、７３、７４、および７５〜８９のいずれか一項に記載の造血細胞集団、または項目９０または９１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目２５３)
前記造血幹細胞集団が、静脈内経路、髄内経路、または骨内経路に投与される、項目２３６〜２５２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５４)
前記造血幹細胞集団が、静脈内に投与される、項目２３６〜２５３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５５)
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤と、少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーとを含む、キット。
(項目２５６)
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤薬剤と、約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーとを含む、キット。
(項目２５７)
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤またはスタウロスポリンと、少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーとを含む、キット。
(項目２５８)
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤薬剤またはスタウロスポリンと、約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーとを含む、キット。
(項目２５９)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目２５５〜２５８のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６０)
前記ポロキサマーが、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目２５５〜２５８のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６１)
前記ポロキサマーが、少なくとも約４０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目２５５〜２５８のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６２)
前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２５９〜２６１のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６３)
前記ポロキサマーが、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２５９〜２６１のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６４)
前記ポロキサマーが、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２５９〜２６１のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６５)
前記ポロキサマーが、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２５９〜２６１のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６６)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２５９〜２６５のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６７)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２５９〜２６５のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６８)
前記ポロキサマーが、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２５９〜２６５のいずれか一項に記載のキット。
(項目２６９)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、ＰＧＡ ２ 、ＰＧＢ ２ 、ＰＧＤ ２ 、ＰＧＥ １ 、ＰＧＥ ２ 、ＰＧＦ ２ 、ＰＧＩ ２ 、ＰＧＨ ２ 、ＰＧＪ ２ 、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される、項目２５９〜２６８のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７０)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、１５ｄ−ＰＧＪ ２ 、デルタ１２−ＰＧＪ ２ 、２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）、トロンボキサンＡ２、トロンボキサンＢ２、イロプロスト、トレプロスチニル、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン、スーパーファン、ミソプロストール、ブタプロスト、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、ＰＧＥ ２ 受容体アゴニスト、１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ ２ 、１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ ２ 、スルプロストン、ＰＧＥ ２ セリノールアミド、ＰＧＥ ２ メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ ２ 、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、および１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ ２ からなる群から選択される、項目２５９〜２６９のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７１)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、プロスタグランジンＥ ２ （ＰＧＥ ２ ）、または１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ からなる群から選択される、項目２５９〜２７０のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７２)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、ＰＧＥ ２ である、項目２５９〜２７１のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７３)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される、項目２５９〜２７２のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７４)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８である、項目２５９〜２７３のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７５)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー３３５である、項目２５９〜２７３のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７６)
前記ポロキサマーに、ポロキサマー３３８が選択される、項目２５９〜２７３のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７７)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー４０７である、項目２５９〜２７３のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７８)
前記造血細胞集団が、ポリカチオン性ポリマーの存在下で形質導入される、項目２５９〜２７７のいずれか一項に記載のキット。
(項目２７９)
前記ポリカチオン性ポリマーが、ポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、またはポリエチレングリコール／ポリ−Ｌ−リジンブロックコポリマーである、項目２７８に記載のキット。
(項目２８０)
造血幹または前駆細胞と、レトロウイルスベクターと、少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーとを含む、組成物。
(項目２８１)
造血幹または前駆細胞と、レトロウイルスベクターと、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤と、少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するポロキサマーとを含む、組成物。
(項目２８２)
造血幹または前駆細胞と、レトロウイルスベクターと、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤と、約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量および約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーとを含む、組成物。
(項目２８３)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約３０のＭＯＩで存在する、項目２８０〜２８２のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２８４)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約２５のＭＯＩで存在する、項目２８０〜２８２のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２８５)
前記レトロウイルスベクターが、約１０〜約２０のＭＯＩで存在する、項目２８０〜２８２のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２８６)
前記レトロウイルスベクターが、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０のＭＯＩで存在する、項目２８０〜２８２のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２８７)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目２８０〜２８６のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２８８)
前記ポロキサマーが、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目２８０〜２８６のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２８９)
前記ポロキサマーが、少なくとも約４０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する、項目２８０〜２８６のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２９０)
前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２８０〜２８９のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２９１)
前記ポロキサマーが、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２８０〜２８９のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２９２)
前記ポロキサマーが、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２８０〜２８９のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２９３)
前記ポロキサマーが、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２８０〜２８９のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２９４)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２８０〜２９３のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２９５)
前記ポロキサマーが、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２８０〜２９３のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２９６)
前記ポロキサマーが、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、前記ポロキサマーが、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む、項目２８０〜２９３のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２９７)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される、項目２８０〜２９６のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２９８)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８である、項目２８０〜２９７のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２９９)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー３３５である、項目２８０〜２９７のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３００)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー３３８である、項目２８０〜２９７のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３０１)
前記ポロキサマーが、ポロキサマー４０７である、項目２８０〜２９７のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３０２)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、ＰＧＡ ２ 、ＰＧＢ ２ 、ＰＧＤ ２ 、ＰＧＥ １ 、ＰＧＥ ２ 、ＰＧＦ ２ 、ＰＧＩ ２ 、ＰＧＨ ２ 、ＰＧＪ ２ 、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される、項目２８１〜３０１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３０３)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、１５ｄ−ＰＧＪ ２ 、デルタ１２−ＰＧＪ ２ 、２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）、トロンボキサンＡ２、トロンボキサンＢ２、イロプロスト、トレプロスチニル、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン、スーパーファン、ミソプロストール、ブタプロスト、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、ＰＧＥ ２ 受容体アゴニスト、１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ ２ 、１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ ２ 、スルプロストン、ＰＧＥ ２ セリノールアミド、ＰＧＥ ２ メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ ２ 、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ ２ 、および１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ ２ からなる群から選択される、項目２８１〜３０２のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３０４)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、プロスタグランジンＥ ２ （ＰＧＥ ２ ）、または１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ からなる群から選択される、項目２８１〜３０３のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３０５)
前記プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤が、ＰＧＥ ２ である、項目２８１〜３０４のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３０６)
前記造血幹または前駆細胞が、ＣＤ３４ ＋ 細胞またはＣＤ１３３ ＋ 細胞である、項目２８０〜３０５のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３０７)
ポリカチオン性ポリマーをさらに含む、項目２８０〜３０６のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３０８)
前記ポリカチオン性ポリマーが、ポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、またはポリエチレングリコール／ポリ−Ｌ−リジンブロックコポリマーである、項目３０７に記載の組成物。
(項目３０９)
前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、項目２８０〜３０８のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３１０)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスに由来する、項目２８０〜３０９のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３１１)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶレンチウイルスに由来する、項目２８０〜３１０のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３１２)
前記レトロウイルスベクターが、ＨＩＶ−１レンチウイルスに由来する、項目２８０〜３１０のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３１３)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３１４)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３１５)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードする、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３１６)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３１７)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードする、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３１８)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３１９)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３２０)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３２１)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３２２)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３２３)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードする、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３２４)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３２５)
前記レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、またはＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである、項目２８０〜３１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目３２６)
培養培地をさらに含む、項目２８０〜３２５のいずれか一項に記載の組成物。
ＰＧＥ２で処理したｈＣＤ３４＋細胞のインビボ分析を示す。（Ａ）抗ｈＣＤ４５で陽性染色することによって測定された、ｈＣＤ３４＋細胞の生着。（Ｂ）マウスＢＭにおける生着ヒト細胞のＶＣＮ分析。 増加する濃度のＦ１０８の存在下で形質導入したｈＣＤ３４＋細胞が、（Ａ）ウイルスの侵入および（Ｂ）ＶＣＮの用量依存性の増加を示すことを示す。 増加する濃度のＦ１０８の存在下で形質導入したｈＣＤ３４＋細胞が、（Ａ）ウイルスの侵入および（Ｂ）ＶＣＮの用量依存性の増加を示すことを示す。 Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入したｈＣＤ３４＋細胞が、対照処理細胞と比較して、細胞生存率の低下を示さないことを示す。 増加する濃度のＦ６８の存在下で形質導入したｈＣＤ３４＋細胞が、（Ａ）ウイルスの侵入および（Ｂ）ＶＣＮの用量依存性の増加を示さないことを示す。 増加する濃度のＦ６８の存在下で形質導入したｈＣＤ３４＋細胞が、（Ａ）ウイルスの侵入および（Ｂ）ＶＣＮの用量依存性の増加を示さないことを示す。 Ｆ１０８単独または対照の存在下で形質導入した細胞と比較して、ＶＣＮの増加およびｈＣＤ３４＋細胞中の形質導入効率がＦ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入したことを示す。 Ｆ１０８単独または対照の存在下で形質導入した細胞と比較して、ＶＣＮの増加およびｈＣＤ３４＋細胞中の形質導入効率がＦ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入したことを示す。 ２つの独立した実験からの個々のコロニー分析が、Ｆ１０８およびＰＧＥ２の組み合わせ治療を用いた増加した平均ＶＣＮ、ならびに形質導入しない前駆体数の実質的な減少を示すことを示す。 ２つの独立した実験からの個々のコロニー分析が、Ｆ１０８およびＰＧＥ２の組み合わせ治療を用いた増加した平均ＶＣＮ、ならびに形質導入しない前駆体数の実質的な減少を示すことを示す。 増加する濃度のＰＧＥ２および静的Ｆ１０８濃度の存在下で形質導入したｈＣＤ３４＋細胞が、ＶＣＮの用量依存性増加を示さないことを示す。 ＰＧＥ２およびＦ１０８処置の存在下で形質導入した、バルク造血細胞集団および表現型幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−）の両方が、硫酸プロタミンを用いた標準的な形質導入条件と比較して、増加した形質導入効率を示すことを示す。 Ｆ１０８またはＦ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入したｈＣＤ３４＋細胞が、対照と比較して、増加したＶＣＮを示すことを示す。 ＶＣＮ分析、およびＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはこれらの組み合わせで処置したｈＣＤ３４＋細胞の形質導入効率を示す。（Ａ）Ｆ１０８は、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、低い形質導入する細胞ロットのＶＣＮを増強する。（Ｂ）Ｆ１０８は、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、低い形質導入する細胞ロットの形質導入効率を増強する。（Ｃ）移植から２カ月後のＶＣＮ分析は、Ｆ１０８が、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、生着ｈＣＤ３４＋細胞のインビボＶＣＮを増強することを示す。（Ｄ）移植から４カ月後のＶＣＮ分析は、Ｆ１０８が、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、生着ｈＣＤ３４＋細胞のインビボＶＣＮを増強することを示す。 ＶＣＮ分析、およびＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはこれらの組み合わせで処置したｈＣＤ３４＋細胞の形質導入効率を示す。（Ａ）Ｆ１０８は、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、低い形質導入する細胞ロットのＶＣＮを増強する。（Ｂ）Ｆ１０８は、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、低い形質導入する細胞ロットの形質導入効率を増強する。（Ｃ）移植から２カ月後のＶＣＮ分析は、Ｆ１０８が、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、生着ｈＣＤ３４＋細胞のインビボＶＣＮを増強することを示す。（Ｄ）移植から４カ月後のＶＣＮ分析は、Ｆ１０８が、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、生着ｈＣＤ３４＋細胞のインビボＶＣＮを増強することを示す。 ＶＣＮ分析、およびＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはこれらの組み合わせで処置したｈＣＤ３４＋細胞の形質導入効率を示す。（Ａ）Ｆ１０８は、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、低い形質導入する細胞ロットのＶＣＮを増強する。（Ｂ）Ｆ１０８は、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、低い形質導入する細胞ロットの形質導入効率を増強する。（Ｃ）移植から２カ月後のＶＣＮ分析は、Ｆ１０８が、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、生着ｈＣＤ３４＋細胞のインビボＶＣＮを増強することを示す。（Ｄ）移植から４カ月後のＶＣＮ分析は、Ｆ１０８が、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、生着ｈＣＤ３４＋細胞のインビボＶＣＮを増強することを示す。 ＶＣＮ分析、およびＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはこれらの組み合わせで処置したｈＣＤ３４＋細胞の形質導入効率を示す。（Ａ）Ｆ１０８は、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、低い形質導入する細胞ロットのＶＣＮを増強する。（Ｂ）Ｆ１０８は、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、低い形質導入する細胞ロットの形質導入効率を増強する。（Ｃ）移植から２カ月後のＶＣＮ分析は、Ｆ１０８が、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、生着ｈＣＤ３４＋細胞のインビボＶＣＮを増強することを示す。（Ｄ）移植から４カ月後のＶＣＮ分析は、Ｆ１０８が、単独でまたはＰＧＥ２と組み合わせて、生着ｈＣＤ３４＋細胞のインビボＶＣＮを増強することを示す。 移植から２カ月および４カ月後のＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはこれらの組み合わせで処置したｈＣＤ３４＋細胞の生着レベルおよび分化能を示す。（Ａ）Ｆ１０８、ＰＧＥ２、または組み合わせのいずれも、異種移植設定中の形質導入したｈＣＤ３４＋細胞の生着レベルに影響を及ぼさない。（Ｂ）生着細胞の骨髄性分化能が、維持される。（ＣおよびＤ）生着細胞のリンパ分化能が、維持される。 移植から２カ月および４カ月後のＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはこれらの組み合わせで処置したｈＣＤ３４＋細胞の生着レベルおよび分化能を示す。（Ａ）Ｆ１０８、ＰＧＥ２、または組み合わせのいずれも、異種移植設定中の形質導入したｈＣＤ３４＋細胞の生着レベルに影響を及ぼさない。（Ｂ）生着細胞の骨髄性分化能が、維持される。（ＣおよびＤ）生着細胞のリンパ分化能が、維持される。 移植から２カ月および４カ月後のＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはこれらの組み合わせで処置したｈＣＤ３４＋細胞の生着レベルおよび分化能を示す。（Ａ）Ｆ１０８、ＰＧＥ２、または組み合わせのいずれも、異種移植設定中の形質導入したｈＣＤ３４＋細胞の生着レベルに影響を及ぼさない。（Ｂ）生着細胞の骨髄性分化能が、維持される。（ＣおよびＤ）生着細胞のリンパ分化能が、維持される。 移植から２カ月および４カ月後のＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはこれらの組み合わせで処置したｈＣＤ３４＋細胞の生着レベルおよび分化能を示す。（Ａ）Ｆ１０８、ＰＧＥ２、または組み合わせのいずれも、異種移植設定中の形質導入したｈＣＤ３４＋細胞の生着レベルに影響を及ぼさない。（Ｂ）生着細胞の骨髄性分化能が、維持される。（ＣおよびＤ）生着細胞のリンパ分化能が、維持される。 移植から２カ月および４カ月後のＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはこれらの組み合わせで処置したｈＣＤ３４＋細胞の生着レベルおよび分化能を示す。（Ａ）Ｆ１０８、ＰＧＥ２、または組み合わせのいずれも、異種移植設定中の形質導入したｈＣＤ３４＋細胞の生着レベルに影響を及ぼさない。（Ｂ）生着細胞の骨髄性分化能が、維持される。（ＣおよびＤ）生着細胞のリンパ分化能が、維持される。 スタウロスポリン、Ｆ１０８、またはＦ１０８およびスタウロスポリンの存在下で形質導入したｈＣＤ３４＋細胞が、対照と比較して増加したＶＣＮを示すことを示す。 Ｆ１０８およびＦ１２７の両方が、硫酸プロタミンを用いた標準的な形質導入を上回るｈＣＤ３４＋細胞中のＶＣＮを増加することを示す。ＶＣＮは、Ｆ１０８およびＦ１２７の両方の形質導入へのＰＧＥ２の添加によりさらに増強される。 Ｆ１０８およびＰ１０５の両方が、硫酸プロタミンを用いた標準的な形質導入を上回るｈＣＤ３４＋細胞中のＶＣＮを増加させることを示す。ＶＣＮは、Ｐ１０５およびＦ１０８の形質導入へのＰＧＥ２の添加によりさらに増強される。 Ｐ１０５（図１４からのデータ）、Ｆ１２７（図１３からのデータ）、Ｆ１０８、およびＦ９８が、硫酸プロタミンを用いた標準的な形質導入を上回るｈＣＤ３４＋細胞中のＶＣＮを増加させることを示す。ＶＣＮは、ＰＧＥ２の添加によりさらに増強される。図１５はまた、Ｐ１０５、Ｆ１２７、Ｆ１０８、またはＦ９８、および任意に、ＰＧＥ２の存在下でｈＣＤ３４＋細胞の形質導入が、細胞増殖に影響を及ぼさなかったことも示す。 Ｐ１２３、Ｐ１０４、Ｌ１０１、およびＦ１０８が、硫酸プロタミンを用いた標準的な形質導入を上回るｈＣＤ３４＋細胞中のＶＣＮを増加させるが、Ｐ１２３、Ｐ１０４、およびＬ１０１はまた、細胞増殖を減少させることを示す。ＶＣＮは、Ｐ１２３およびＰＧＥ２の添加によりさらに増強される。 Ｐ１２３、Ｐ１０４、Ｌ１０１、およびＦ１０８が、硫酸プロタミンを用いた標準的な形質導入を上回るｈＣＤ３４＋細胞中のＶＣＮを増加させるが、Ｐ１２３、Ｐ１０４、およびＬ１０１はまた、細胞増殖を減少させることを示す。ＶＣＮは、Ｐ１２３およびＰＧＥ２の添加によりさらに増強される。 Ｆ８７、Ｆ８８、およびＦ６８が、硫酸プロタミンを用いた標準的な形質導入を上回るｈＣＤ３４＋細胞のＶＣＮを増加せず、細胞増殖に影響を及ぼさないことを示す。 Ｆ８７、Ｆ８８、およびＦ６８が、硫酸プロタミンを用いた標準的な形質導入を上回るｈＣＤ３４＋細胞のＶＣＮを増加せず、細胞増殖に影響を及ぼさないことを示す。 ＰＧＥ２およびＦ１０８の存在下で形質導入したβ０／β０ｈＣＤ３４＋細胞が、対照形質導入細胞と比較して、ＶＣＮの約３倍の増加および形質導入した細胞の割合（％ＬＶＶ＋）を有することを示す。 ＰＧＥ２およびＦ１０８の存在下で形質導入したβ０／β０ｈＣＤ３４＋細胞から分化した除核赤血球系細胞の数が、健常なドナーから得られたｈＣＤ３４＋細胞から分化した除核赤血球系細胞の数に匹敵することを示す。 ＰＧＥ２およびＦ１０８の存在下で形質導入したβ０／β０ｈＣＤ３４＋細胞から分化した除核赤血球系細胞によって生成されたＨｂＡの量が、健常なドナーから得られたｈＣＤ３４＋細胞から分化した除核赤血球系細胞によって生成されたＨｂＡの量に匹敵することを示す。 ８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（Ｆ１０８Ｈｉ／ＰＳ）と組み合わせて、８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（ＰＳ）、１０μｇ／ｍＬのＦ１０８（Ｆ１０８Ｌｏ）、１０００μｇ／ｍＬのＦ１０８（Ｆ１０８Ｈｉ）、または１０００μｇ／ｍＬのＦ１０８で形質導入したヒト造血前駆細胞に対するコロニー形成分析を示す。コロニー形成は、治療によってあまり影響を及ぼさなかった。 Ｆ１０８が、ＧＦＰレンチウイルスベクターを用いた表現型長期ＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋）の形質導入効率を増加させることを示す。 ３つの異なる細胞ロット（６２９、７０３、０１０）が２つのＭＯＩでＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５で形質導入した低い、中等度、および高いトランスデューサーを代表することを示す。形質導入したコロニーを、プールし、ＶＣＮについて分析した。（ＰＳ＝８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン、Ｆ１０８Ｈｉ／ＰＧＥ２＝１０００μｇ／ｍＬのＦ１０８および１０μＭのＰＧＥ２）Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、全ての細胞ロットにおいてＶＣＮを増加した。 ヒトＣＤ３４＋細胞が、ＩＬ２Ｒγをコードするレンチウイルスベクターおよび硫酸プロタミン（上の列）またはＦ１０８およびＰＧＥ２（下の列）のいずれかで形質導入したことを示し、レンチウイルスベクターが、一過性トランスフェクションまたは産生細胞クローン（ＰｒＣＬ１、ＰｒＣＬ２）によって生成されたことを示す。プールしたメチルセルロースコロニーからのＤ１４ ＶＣＮを最左のパネルに示し、選び出されたコロニーおよび％ＬＶＶ＋コロニーからの個々のコロニーＶＣＮを中央のパネルに示し、コロニー計数を最右のパネルに示す。 Ｆ１０８およびＰＧＥ２が、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）をコードするレンチウイルスベクターによる形質導入を増加させることを示す。ヒトＣＤ３４＋細胞を、Ｆ１０８およびＰＧＥ２を有するおよび有しない、５または１５のＭＯＩで、ＥＦ１α−ＴＰＰ１またはＭＮＤ−ＴＰＰ１のいずれかをコードするＬＶＶで形質導入した。１４日目にプールしたメチルセルロースコロニーＶＣＮを、左上パネルに示す。７日目のサイトカイン培養物からのＴＰＰ−１酵素活性を、中央上パネル（細胞ペレット）および右上パネル（細胞上清）に示す。マウス系統陰性（Ｌｉｎ−）骨髄細胞を、Ｆ１０８およびＰＧＥ２を有するおよび有しない、５、１５、または３０のＭＯＩで、ＭＮＤ−ＴＰＰ１ ＬＶＶで形質導入した。Ｄ７液体培養ＶＣＮを左下パネルに示し、ｑＰＣＲによる個々のコロニーＶＣＮを中央下パネルに示し、％ＬＶＶ＋コロニーを右下パネルに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ〜Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶ、ならびに硫酸プロタミン、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかで形質導入した。ＡＬＤＰタンパク質発現を、パネルＡ、Ｅ、およびＩに示し、プールしたコロニーＶＣＮを、パネルＢ、Ｆ、およびＪに示し、個々のコロニーＶＣＮを、パネルＣ、Ｇ、およびＫに示し、コロニー形成分析を、パネルＤ、Ｈ、およびＬに示す。 Ｆ１０８およびＰＧＥ２を有するおよび有しない、１０または２５のＭＯＩで形質導入したｈＣＤ３４＋細胞からのプールしたコロニーＶＣＮ（左パネル）、コロニー形成分析（中央パネル）、および個々のコロニーＶＣＮおよび％ＬＶＶ＋細胞（右パネル）を示す。
Ａ．概要
本発明の様々な例示的な実施形態は、治療効果の増加ならびにその作製および使用方法を用いた造血幹および前駆細胞組成物を含む遺伝子治療を企図する。
遺伝子治療は、一部分において、治療遺伝子および対応するタンパク質の十分な発現に依存する。遺伝子発現に影響を及ぼす要因のうちの１つは、コピー数であるか、またはいかに多くの治療遺伝子のコピー数が細胞中に存在する。ウイルス、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスのようなレトロウイルス等は、しばしば、治療遺伝子を細胞に導入するための遺伝子治療ベクター、形質導入として既知のプロセスを使用する。造血幹および前駆細胞の非効率的なウイルス形質導入は、造血系に由来する遺伝子改変された細胞が有効であり得る多くの疾患および障害のための遺伝子治療の範囲および適用性を制限するより重要な要因のうちの１つである。不良なウイルス形質導入は、低いベクターコピー数（ＶＣＮ）および／または形質導入した細胞の低率を示す。それ故に、造血幹および前駆細胞への治療用導入遺伝子を送達するためにウイルスベクターを使用する遺伝子治療による重大な問題は、非効率的なウイルス形質導入であり、治療量以下の製剤を生じ得る。非効率的な形質導入はまた、より高い商品原価をもたらし、例えば、より非効率的な形質導入であるほど、より多くのレンチウイルスが必要とされるため、レンチウイルス産生の費用を増加させる。
本明細書で企図される造血幹および前駆細胞に基づいた遺伝子治療、ならびにその作製および使用方法は、当該技術分野を悩ましているこれらおよび他の問題を解決する。
特定の例示的な実施形態は、レトロウイルスベクターで形質導入した造血細胞集団を企図し、細胞集団は、当該技術分野において既存の方法および組成物で形質導入した細胞集団と比較して、形質導入した造血幹および前駆細胞の増加した数または割合を含む。別の実施形態では、レトロウイルスベクターで形質導入した造血細胞集団は、当該技術分野において既存の方法および組成物で形質導入した細胞集団のＶＣＮと比較して、増加したＶＣＮを含む。
他の例示的な実施形態は、組成物、薬学的組成物、および形質導入した造血細胞を含む細胞培養物を企図する。
ある特定の実施形態は、造血細胞集団、レトロウイルス、およびポロキサマーを含む細胞培養物を企図する。
ある特定の実施形態は、造血細胞集団、レトロウイルス、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤、およびポロキサマーを含む細胞培養物を企図する。
特定の実施形態では、造血細胞をレトロウイルスと接触させることと、ポロキサマーの存在下で造血細胞およびレトロウイルスを培養することと、を含む、造血細胞を形質導入するための方法が、企図される。
特定の実施形態では、造血細胞をレトロウイルスと接触させることと、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる薬剤、およびポロキサマーの存在下で造血細胞およびレトロウイルスを培養することと、を含む、造血細胞を形質導入するための方法が、企図される。
特定の実施形態では、対象に、本明細書で企図される造血細胞に基づいた遺伝子治療のうちのいずれかを投与することを含む、単一遺伝子障害を有する対象を治療するための方法が、企図される。
本明細書で企図される様々な実施形態は、それとは反対に具体的に示されない限り、当該分野の技術の範囲内である、化学、生物化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を使用し、これらの多くは、例示の目的のために以下に記載されている。このような技術は、参照文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、免疫学に関する年度ごとの見直し、ならびに免疫学の進歩等の定期刊行物におけるモノグラフを参照のこと。
Ｂ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似する、または等価の任意の方法および材料が本発明の実施または試験に使用され得るが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書において記載されている。本発明の目的のために、次の用語が以下に定義される。
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という冠詞は、本明細書において１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）の冠詞の文法的目的語を指すように使用される。例として、「要素」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
選択肢（例えば、「または」）の使用は、その選択肢のいずれか一方、両方、またはそのあらゆる組み合わせを意味するものと理解されるべきである。
「および／または」という用語は、その選択肢のいずれか一方、両方を意味するものと理解されるべきである。
本明細書で使用する、「約」または「およそ」という用語は、参照する量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量、または長さに照らして最大で３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％変化する、量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量、または長さを指す。特定の実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、数値の前に記載される場合、その値±１５％、１０％、５％、または１％の範囲を示唆する。
本明細書で使用する、「実質的に」という用語は、参照する量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量、または長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上高い量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」は、参照する量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量、または長さとほぼ同じである、効果、例えば、生物学的効果をもたらす量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量、または長さを指す。
本明細書を通して、別途文脈が必要である限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、言明されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を含意し、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外を含意しないことが理解されるであろう。本明細書で使用する、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同義に使用される。「からなる」とは、「からなる」という語句に後続するいかなるものを含み、これに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であり、他のいかなる要素も存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、語句の後に列挙され、列挙された要素について開示で指定された活動または作用に干渉しないかまたはこれに寄与する他の要素に限定される、いかなる要素も含むことを意味する。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であり、列挙された要素の活動または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素が存在しないことを示す。
本明細書を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連の実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはこれらの組み合わせに対する言及は、実施形態に関連して記載される特定の特性、構造、または特徴は、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通した様々な箇所における前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特性、構造、または特徴は、１つ以上の実施形態において、任意の好適な様式で組み合わせることができる。一実施形態において特性の肯定的な表現が、特定の実施形態において特性を除外するための基礎として機能を果たすことも理解されたい。
「トランスフェクション」とは、非ウイルス方法によって裸のＤＮＡを細胞に導入するプロセスを指す。
「感染」とは、ウイルスベクターを用いて、外来ＤＮＡを細胞に導入するプロセスを指す。
「形質導入」とは、ウイルスベクターを用いて、細胞のゲノムへの外来ＤＮＡの導入を指す。
「ベクターコピー数」または「ＶＣＮ」とは、細胞のゲノムにおけるベクター、またはその一部のコピー数を指す。平均ＶＣＮは、細胞の集団または個々の細胞コロニーから決定され得る。ＶＣＮを決定するための例示的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびフローサイトメトリーを含む。
「形質導入効率」とは、ベクターの少なくとも１つのコピーで形質導入した細胞の割合を指す。例えば、１×１０６個の細胞がウイルスにさらされ、０．５×１０６個の細胞がそれらのゲノム中のウイルスの少なくとも１つのコピーを有すると判定される場合、形質導入効率は、５０％である。形質導入効率を決定するための例示的な方法は、ＰＣＲおよびフローサイトメトリーを含む。様々な実施形態では、「レンチウイルスベクター陽性細胞の数」または「レンチウイルスベクター陽性細胞の割合」という語句は、形質導入効率を示すために使用される。
本明細書で使用する、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合により組み込むＲＮＡウイルスを指す。レトロウイルスは、遺伝子を送達するための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５−４６０）。ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれたら、そのウイルスは「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型としての機能を果たし、ウイルスによってコードされるＲＮＡ分子の発現を導く。
例示的なレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列要素）が好ましい。
レトロウイルスベクター、より具体的には、レンチウイルスベクターは、本発明の実施において使用することができる。したがって、本明細書で使用される、「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、それぞれ、「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」を含むことが意図される。
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移入または運搬することができる核酸分子を指すために本明細書で使用される。移入される核酸は、一般に、ベクター核酸分子と連結している、例えば、それに挿入されている。ベクターは、細胞における自己複製を導く配列を含んでもよいか、または宿主細胞のＤＮＡへの組み込みを可能にするために十分な配列を含んでもよい。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌性人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損性のレトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
当業者には明らかになる通り、「ウイルスベクター」という用語は、一般には核酸分子の移入または細胞のゲノムへの組み込みを容易にするウイルス由来の核酸要素を含む核酸分子（例えば、移入プラスミド）、または核酸の移入を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用されている。ウイルス粒子は、一般には、種々のウイルスの構成成分を含み、時には核酸（複数可）に加えて宿主細胞の構成成分も含むであろう。
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に移入することができるウイルスもしくはウイルス粒子、または移入された核酸自体のいずれかを指す場合がある。ウイルスベクターおよび移入プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的および／または機能的遺伝要素を含有する。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的および機能的遺伝要素またはそれらの部分を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含む、構造的および機能的遺伝要素またはそれらの部分を含有するレトロウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッド」という用語は、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列と非レンチウイルスのウイルス配列の両方を含有するベクター、ＬＴＲ、または他の核酸を指す。一実施形態では、ハイブリッドベクターとは、逆転写、複製、組み込み、および／またはパッケージングのためのレトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列を含むベクターまたは移入プラスミドを指す。
特定の実施形態では、「レンチウイルスベクター」および「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス移入プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用することができる。本明細書において、クローニング部位、プロモーター、調節要素、異種核酸等の要素に言及している場合、これらの要素の配列は、本発明のレンチウイルス粒子ではＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミドではＤＮＡ形態で存在することが理解されるべきである。
プロウイルスの各末端は「長末端反復」または「ＬＴＲ」と呼ばれる構造である。「長末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列の状況では、直接反復であり、Ｕ３領域、Ｒ領域、およびＵ５領域を含有する、レトロウイルスのＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。ＬＴＲにより、一般に、レトロウイルスの遺伝子の発現（例えば、促進、開始、および遺伝子転写物のポリアデニル化）およびウイルス複製の基礎となる機能がもたらされる。ＬＴＲは、転写制御要素、ポリアデニル化シグナル、およびウイルスのゲノムの複製および組み込みのために必要とされる配列を含む、多数の調節シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサー要素およびプロモーター要素を含有する。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域には、Ｕ３領域およびＵ５領域が隣接する。ＬＴＲは、Ｕ３領域、Ｒ領域、およびＵ５領域で構成され、ウイルスのゲノムの５’末端および３’末端の両方に出現する。５’ＬＴＲにはゲノムの逆転写のために必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージングのために必要な配列（プシー部位）が近接している。
本明細書で使用する、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子内へのウイルスＲＮＡの挿入のために必要とされる、レトロウイルスのゲノム内に位置する配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照のこと。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスのゲノムのキャプシド形成のために必要とされる最小のパッケージングシグナル（プシー［Ψ］または［Ψ＋］配列とも称される）を使用する。したがって、本明細書で使用される、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プシー」という用語および「Ψ」という符号は、ウイルス粒子形成の間のレトロウイルスのＲＮＡ鎖のキャプシド形成のために必要とされる非コード配列への言及に使用される。
様々な実施形態では、ベクターは、改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、ウイルスを複製欠損性にすることによってレンチウイルス系またはレトロウイルス系の安全性を改善するために行われる。当業者は、ＬＴＲが参照ＬＴＲとの比較によって改変されるかどうかを判定することが可能であり得る。本明細書で使用する、「複製欠損性」という用語は、完全な、有効な複製ができず、したがって、感染性ビリオンが産生されない（例えば、複製欠損性レンチウイルス後代）ウイルスを指す。「複製コンピテント」という用語は、複製することができ、したがって、ウイルスのウイルス複製により感染性ビリオン（例えば、複製コンピテントレンチウイルス後代）を産生することができる野生型ウイルスまたは変異ウイルスを指す。
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、１回目のウイルス複製を越えてウイルスが転写されることを防ぐために、Ｕ３領域として公知の右側の（３’）ＬＴＲのエンハンサー−プロモーター領域が改変された（例えば、欠失および／または置換によって）複製欠損性ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、ウイルス複製の間に右側の（３’）ＬＴＲのＵ３領域が左側の（５’）ＬＴＲのＵ３領域の鋳型として使用され、したがって、ウイルスの転写物はＵ３エンハンサー−プロモーターなしでは生じ得ないことに起因する。本発明のさらなる実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、異種もしくは合成ポリ（Ａ）配列、１つ以上のインスレーター要素、および／または誘導性プロモーターに置き換わるように改変されている。ＬＴＲに対する改変、例えば、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’ＬＴＲと５’ＬＴＲの両方に対する改変等も、本発明に包含されることに留意するべきである。
５’ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生の間にウイルスのゲノムの転写を駆動するための異種プロモーターで置き換えることによって、さらなる安全性の増強がもたらされる。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性のサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔに依存しない様式で高レベルの転写を駆動することができる。この置き換えにより、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しないので、複製コンピテントウイルスが生成される組換えの可能性が低下する。ある特定の実施形態では、異種プロモーターは、誘導性であり得、したがって、１つ以上の誘導因子が存在する場合にのみウイルスのゲノムの全部または一部の転写が起こるであろう。誘導因子としては、１つ以上の化合物または生理学的条件、例えば、宿主細胞が培養される温度もしくはｐＨ等の生理的条件が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＴＡＲ要素を含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）のＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化反応」遺伝子要素を指す。この要素は、レンチウイルスのトランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝要素と相互作用して、ウイルス複製を増強する。しかしながら、この要素は、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターで置き換えられている実施形態では必要ない。
「Ｒ領域」とは、レトロウイルスＬＴＲ内の、キャップ形成基の開始点（すなわち、転写の開始点）で始まり、ポリＡトラクトの開始点の直前で終わる領域を指す。Ｒ領域はまた、Ｕ３領域およびＵ５領域と隣接しているとも定義される。Ｒ領域は、逆転写の間に新生ＤＮＡをゲノムの一方の末端から他方の末端まで移入させることにおいて役割を果たす。
本明細書で使用する、「ＦＬＡＰ要素」という用語は、その配列がレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中央ポリプリン区域および中央終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。いくつかの実施形態では、「ＦＬＡＰ要素」および「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、上述のＦＬＡＰ要素を指すのに同義に使用される。好適なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。ＨＩＶ−１の逆転写の間、中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）にあるプラス鎖ＤＮＡの中心開始点および中央終結配列（ＣＴＳ）にある中央終結点により、３本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中央ＤＮＡフラップの形成が導かれる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスのゲノム核内への輸送のシス活性決定因子として働く可能性があり、かつ／またはウイルスの力価を増大させる可能性がある。特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内の、対象となる異種遺伝子の上流または下流の１つ以上のＦＬＡＰ要素を含む。例えば、特定の実施形態では、ベクターは、ＦＬＡＰ要素を含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰ要素を含む。
一実施形態では、レトロウイルス移入ベクターまたはレンチウイルス移入ベクターは、１つ以上の輸送要素を含む。「輸送要素」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節要素を指す。ＲＮＡ輸送要素の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参照のこと）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、ＲＮＡ輸送要素は、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは多数のコピーとして挿入することができる。
特定の実施形態では、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節要素、効率的なポリアデニル化部位、および任意に、転写終結シグナルをベクターに組み入れることによって増大する。様々な転写後調節要素、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節要素（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｙｅｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、および同様のもの（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１７６６）により、タンパク質における異種核酸の発現が増大し得る。特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＷＰＲＥもしくはＨＰＲＥ等の転写後調節要素を欠くまたはそれらを含まない、そのため、場合によっては、これらの要素が細胞形質転換のリスクが増大し、かつ／またはｍＲＮＡ転写物の量が実質的にもしくは有意に増大しない、またはｍＲＮＡの安定性が増大しない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、追加的な安全対策としてＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くまたはそれらを含まない。
特定の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される、「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を指す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の添加によりｍＲＮＡの安定性を促進し、それ故に、転写効率の増加に寄与し得る。切断およびポリアデニル化は、ＲＮＡ内のポリ（Ａ）配列によって導かれる。哺乳動物のプレｍＲＮＡのコアなポリ（Ａ）配列は、切断−ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識要素を有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡ六量体は、Ｕ残基またはＧＵ残基に富んだより可変の要素の２０〜５０のヌクレオチド上流に位置する。新生転写物の切断がこれら２つの要素間で起こり、５’切断生成物への最大２５０個のアデノシンの付加に連関する。特定の実施形態では、コアなポリ（Ａ）配列は、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で既知の別の好適な異種もしくは内因性ポリＡ配列である。
ある特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、１つ以上のインスレーター要素をさらに含む。インスレーター要素は、ゲノムＤＮＡに存在するシス作用性要素によって媒介され、移入された配列の調節解除された発現をもたらし得る組み込み部位効果（すなわち、位置効果、例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３、およびＺｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照のこと）からの、レンチウイルスに発現される配列、例えば治療用ポリペプチドの保護に寄与することができる。いくつかの実施形態では、移入ベクターは、３’ＬＴＲに１つ以上のインスレーター要素を含み、宿主ゲノムへのプロウイルスの組み込む際に、プロウイルスは、３’ＬＴＲの重複によって、５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲに１つ以上のインスレーターを含む。本発明で用いるのに好適なインスレーターとしては、ニワトリβ−グロビンインスレーター（Ｃｈｕｎｇら、１９９３．Ｃｅｌｌ ７４：５０５、Ｃｈｕｎｇら、１９９７．ＰＮＡＳ ９４：５７５、およびＢｅｌｌら、１９９９．Ｃｅｌｌ ９８：３８７を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。インスレーター要素の例としては、ニワトリＨＳ４等のヒトβ−グロビン遺伝子座からのインスレーターが挙げられるが、これに限定されない。
ある特定の実施形態によると、ウイルスベクターの骨格配列の大部分または全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レンチウイルス配列の多くの異なる供給源を使用することができ、レンチウイルス配列のいくつかにおける多数の置換および変更は、本明細書に記載されている機能を実行する移入ベクターの能力を損なうことなく順応させることができることを理解されたい。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野で公知であり、Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６ａ，１９９６ｂ，ａｎｄ １９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）、Ｄｕｌｌら（１９９８）、米国特許第６，０１３，５１６号、および同第５，９９４，１３６号を参照されたく、その多くは、本発明のウイルスベクターまたは移入プラスミドを産生するように適応させることができる。
本明細書で使用する、「薬剤」という用語は、ポロキサマー、ポリカチオン性ポリマー、スタウロスポリン、小有機分子、プロスタグランジン、ｃＡＭＰエンハンサー、Ｗｎｔ経路アゴニスト、ｃＡＭＰ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路アゴニスト、Ｃａ２＋二次メッセンジャー経路アゴニスト、一酸化窒素（ＮＯ）／アンジオテンシンシグナル伝達アゴニスト、および無機化学物質を包含し、これは、それらの類似体および誘導体の全てを含むが、これらに限定されない。
「小分子」、「小有機分子」、または「小分子化合物」とは、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．５ｋＤ未満の分子量を有する低分子量の化合物を指す。特定の実施形態では、小分子は、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、および他の小さな有機化合物または薬物等を含むことができる。真菌抽出物、細菌抽出物、または藻類抽出物等の化学的および／または生物学的混合物のライブラリーは、当該技術分野で既知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングすることができる。分子ライブラリーを合成するための方法の例は、（Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４ａ、Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４ｂ、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に見出すことができる。
有機分子等の薬剤に関して、「類似体」または「誘導体」とは、構造および機能において別の化学的物質と類似しており、多くの場合は単一のエレメントまたは基によって構造的に異なるが、親化学物質と同じ機能を保持する場合には１つを超える基（例えば、２つ、３つ、または４つの基）の改変によって異なってよい分子に関する。このような改変は、当業者には常套的なものであり、それらとして、例えば、酸のエステルまたはアミドなどの付加した化学的部分または置換された化学的部分、保護基、例えば、アルコールまたはチオールに対するベンジル基およびアミンに対するｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｂｕｔｏｘｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）基が挙げられる。アルキル側鎖に対する改変、例えば、アルキル置換（例えば、メチル、ジメチル、エチル等）、側鎖の飽和または不飽和のレベルに対する改変、および置換されたフェニルおよびフェノキシ等の改変された基の付加も包含される。誘導体はまた、ビオチン部分またはアビジン部分等のコンジュゲート、および西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素等も含んでよく、放射性標識部分、生物発光部分、化学発光部分、または蛍光部分を含んでよい。また、本明細書に記載の薬剤に部分を付加して、それらの薬物動態的特性を変更すること、例えば、他の望ましい特性の中でも、インビボまたはエクスビボにおける半減期を増加させること、またはそれらの細胞への浸透性を増加させることができる。医薬品の多数の望ましい品質（例えば、溶解性、生物学的利用能、製造等）を増強することが既知であるプロドラッグも包含される（例えば、例示的なＥＰアゴニストプロドラッグについては、ＷＯ／２００６／０４７４７６を参照されたく、このようなアゴニストのその開示に関して参照により組み込まれる）。
本明細書で使用する、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドには、組換え、合成、または単離された、一本鎖、および二本鎖ポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））を指す。本明細書で使用される、「ポリリボヌクレオチド」または「リボ核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、および阻害ＲＮＡを指し、これには、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡの骨格に埋め込まれたｓｈＲＮＡ（ｓｈｍｉｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の参照配列（例えば、配列表を参照のこと）のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたは変異体を含み、一般には、変異体は、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。様々な例示的な実施形態では、ウイルスベクターおよび移入プラスミドポリヌクレオチド配列およびそれらを含む組成物が企図される。特定の実施形態では、本明細書の別の箇所で考察されるように、グロビンポリペプチド、抗鎌状グロビンポリペプチド、アデノシンデアミナーゼポリペプチド、インターロイキン２受容体ガンマポリペプチド、トリペプチジルペプチダーゼ１ポリペプチド、アルファ−Ｌイズロニダーゼポリペプチド、イズロン酸２−スルファターゼポリペプチド、またはＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ（ＡＬＤ）、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。
本明細書で使用する、以下に定義される「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」等の用語は、参照ポリヌクレオチド配列、または参照配列と以下に定義されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して１つ以上のヌクレオチドが付加もしくは欠失している、または異なるヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドを含む。この点について、参照ポリヌクレオチドに、変更されたポリヌクレオチドに参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性が保持される変異、付加、欠失、および置換を含めたある特定の変更を行うことができることが当技術分野ではよく理解されている。
本明細書で使用する、「単離された」という用語は、そのネイティブな状態では通常それに付随する構成成分を実質的にまたは基本的に含まない材料、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞を意味する。特定の実施形態では、「得られた」または「由来する」という用語は、単離されたと同義に使用される。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常はその断片に近接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。
ポリヌクレオチドの方向を説明する用語としては、５’（通常、ポリヌクレオチドの遊離ホスフェート基を有する末端）および３’（通常、ポリヌクレオチドの遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有する末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向または３’から５’の方向にアノテートされ得る。
「相補的な」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ ３’の相補鎖は３’Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ５’である。後者の配列は多くの場合、逆相補体として左側に５’末端、右側に３’末端の５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’と書かれる。その逆相補体と等しい配列は、パリンドローム配列であると言える。相補性は、塩基対合規則に従って核酸の塩基の一部のみがマッチする場合、「部分的」であり得る。または、核酸間には「完全な」または「全体的な」相補性があり得る。
本明細書で使用される「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡ、その後、ポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態では、核酸カセットは、対象となる遺伝子（複数可）、例えば、対象となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。別の実施形態では、核酸カセットは、１つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および対象となる遺伝子（複数可）、例えば、対象となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。ベクターは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの核酸カセットを含んでよい。核酸カセットは、ベクター内で位置的におよび逐次的に向けられ、したがって、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要な適切な翻訳後改変を受け、適切な細胞内区画にターゲティングされるまたは細胞外区画に分泌されることによって生物学的活性について適した区画に転座され得る。好ましくは、カセットは、ベクターへの迅速な挿入に適した３’末端および５’末端を有し、例えば、カセットは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態では、核酸カセットは、遺伝的障害を処置する、予防する、または軽減するために使用する治療用遺伝子の配列を含有する。カセットは、単一の単位としてプラスミドまたはウイルスベクターから除去することおよびそれに挿入することができる。
本明細書で使用する、「対象となるポリヌクレオチド（複数可）」という用語は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、発現することが望まれる発現ベクターに挿入された、ポリペプチド（すなわち、対象となるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。好ましい実施形態では、ベクターおよび／またはプラスミドは、１つ以上の対象となるポリヌクレオチド、例えば、グロビンポリペプチド、抗鎌状グロビンポリペプチド、アデノシンデアミナーゼポリペプチド、インターロイキン２受容体ガンマポリペプチド、トリペプチジルペプチダーゼ１ポリペプチド、アルファ−Ｌイズロニダーゼポリペプチド、イズロン酸２−スルファターゼポリペプチド、またはＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ（ＡＬＤ）、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、対象となるポリヌクレオチドは、造血性の疾患または障害の処置、予防、または軽減において治療効果をもたらすポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは、「治療用ポリペプチド」、例えば、グロビン遺伝子と称することができる。例えば、米国特許第６，０５１，４０２号および同第７，９０１，６７１号を参照されたく、これらの完全な開示および特許請求の範囲が参照により本明細書に特に組み込まれる。
ある特定の他の実施形態では、対象となるポリヌクレオチドは、副腎白質ジストロフィーまたは副腎脊髄ニューロパシーの処置、予防、または軽減において治療効果をもたらすポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは、「治療用ポリペプチド」、例えば、ＡＢＣＤ１遺伝子と称することができる。例えば、米国特許第５，８６９，０３９号および同第６，０１３，７６９号を参照されたく、これらの完全な開示および特許請求の範囲が参照により本明細書に特に組み込まれる。
本明細書で使用される「グロビン」という用語は、ヘム部分と共有結合または非共有結合することができ、したがって、酸素を輸送または貯蔵することができるタンパク質またはタンパク質サブユニットを指す。脊椎動物および無脊椎動物のヘモグロビンのサブユニット、脊椎動物および無脊椎動物のミオグロビンまたはその突然変異体はグロビンという用語に含まれる。この用語は、ヘモシアニンを含まない。グロビンの例には、α−グロビンもしくはその変異体、β−グロビンもしくはその変異体、γ−グロビンもしくはその変異体、およびδ−グロビンもしくはその変異体が含まれる。
一実施形態では、対象となるポリヌクレオチドは、異常ヘモグロビン症の治療のための治療効果を提供するポリペプチド、例えば、α−グロビン、γ−グロビン、β−グロビンもしくは抗鎌状β−グロビン、例えば、β−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑをコードするトランス遺伝子である。対象となるポリヌクレオチドおよびそこからコードされるポリペプチドは、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその機能的な変異体およびその断片を含む。特定の実施形態では、機能的な変異体は、対応する野生型参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、機能的な変異体または断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも１１０％もしくはそれより多くを有する。例示的な実施形態で用いるために好適な代表的なポリヌクレオチド配列としては、α−グロビン、β−グロビン、β−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑ、抗鎌状グロビン、γ−グロビン、およびδ グロビンが挙げられるが、これらに限定されない。
コード配列自体の長さにかかわらず、ポリヌクレオチドは、他のＤＮＡ配列、例えば、本明細書の他の箇所で開示されているまたは当技術分野で既知のプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、およびＡｔｔ部位）、終結コドン、転写終結シグナル、および自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグ等と組み合わせることができ、したがって、それらの全体の長さは相当に変動してよい。したがって、ほぼどんな長さのポリヌクレオチド断片も用いることができ、全長は調製の容易さおよび意図された組換えＤＮＡプロトコルにおける使用によって限定されることが好ましいことが企図されている。
「発現制御配列」という用語は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写または発現を導くこと、増大させること、調節すること、または制御することができる１つ以上のプロモーター、エンハンサー、または他の転写制御要素またはそれらの組み合わせを含むポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、本発明のベクターは、特定の細胞、細胞型、または細胞系列、例えば、標的細胞に特異的な１つ以上の発現制御配列を含む、すなわち、特定の細胞、細胞型、または細胞系列に特異的な発現制御配列に作動可能に連結したポリヌクレオチドの発現は、標的細胞では発現され、他の非標的細胞では発現されない。細胞特異的である、ベクターにおける１つ以上の発現制御配列の一つ一つは、所望の療法に応じて、同じまたは異なる細胞型において発現し得る。好ましい実施形態では、ベクターは、造血幹または造血前駆細胞等の造血細胞に特異的な１つ以上の発現制御配列を含む。他の好ましい実施形態では、ベクターは、造血および／または赤血球系細胞に特異的な１つ以上の発現制御配列を含む。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことができる配列を含有し、場合によっては別の制御配列に対するその方向とは独立して機能することができるＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサー要素と協働的または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサー機能の両方をもたらすことができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
特定の実施形態では、ベクターは、外因性、内在性、または異種性の制御配列、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。「内因性の」制御配列は、ゲノムにおける所与の遺伝子と天然に連結している制御配列である。「外因性の」制御配列とは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子の近位に配置され、したがって、その遺伝子の転写が、連結したエンハンサー／プロモーターによって導かれるような制御配列である。「異種性の」制御配列は、遺伝的に操作される細胞とは異なる種からの外因性の配列である。「合成」制御配列は、１つ以上の内在性配列および／もしくは外因性配列、ならびに／またはインビトロまたはシリコン内において特定の遺伝子治療のための最適なプロモーターおよび／またはエンハンサー活性をもたらすことが決定された配列の要素を含んでよい。
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成成分が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、および／またはエンハンサー、または他の発現制御配列）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、対象となるポリヌクレオチドとの間の機能的な連結を指し、ここで、該発現制御配列により、第２の配列に対応する核酸の転写が導かれる。
本明細書で使用する、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよく、制限された様々な種類の細胞および組織型の発現をそれぞれ可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。例示的な遍在する発現制御配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性のサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスからのＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２００７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７−１４８２）、遍在性Ｃプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、およびβ−アクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、系列特異的、または組織特異的な発現を達成する（例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸を細胞型、細胞系列、もしくは組織のあるサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階に発現させる）ために、細胞、細胞型、細胞系列、または組織特異的な発現制御配列を使用することが望ましい場合がある。
組織特異的プロモーターの例示的な例としては、Ｂ２９プロモーター（Ｂ細胞での発現）、子馬転写因子（ＣＢＦａ２）プロモーター（幹細胞特異的発現）、ＣＤ１４プロモーター（単球性細胞発現）、ＣＤ４３プロモーター（白血球および血小板での発現）、ＣＤ４５プロモーター（造血細胞での発現）、ＣＤ６８プロモーター（マクロファージでの発現）、ＣＹＰ４５０ ３Ａ４プロモーター（肝細胞での発現）、デスミンプロモーター（筋肉での発現）、エラスターゼ１プロモーター（膵腺房細胞発現、エンドグリンプロモーター（内皮細胞での発現）、線維芽細胞特異的タンパク質１プロモーター（ＦＳＰ１）プロモーター（線維芽細胞発現）、フィブロネクチンプロモーター（線維芽細胞での発現）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）プロモーター（内皮細胞での発現）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（星状膠細胞での発現）、インスリンプロモーター（膵ベータ細胞での発現）、インテグリン、アルファ２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモーター（巨核球）、細胞内接着分子２（ＩＣＡＭ−２）プロモーター（内皮細胞）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）プロモーター（造血細胞）、ケラチン５プロモーター（ケラチノサイトでの発現）、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター（筋肉での発現）、筋性分化１（ＭＹＯＤ１）プロモーター（筋肉での発現）、ネフリンプロモーター（有足突起での発現）、骨ガンマ−カルボキシグルタミン酸タンパク質２（ＯＧ−２）プロモーター（骨芽細胞での発現）、３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ２Ｂ（Ｏｘｃｔ２Ｂ）プロモーター、（一倍体−精子細胞での発現）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）プロモーター（肺での発現）、シナプシンプロモーター（ニューロンでの発現）、ウィスコット−アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）プロモーター（造血細胞での発現）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ベクターは、グロビンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、ヒトβ−グロビンプロモーター、ヒトβ−グロビンＬＣＲ、ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される、１つ以上の造血細胞もしくは組織特異的なプロモーター、ならびに／またはエンハンサーを含む。
別の実施形態では、本発明のベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小グリア細胞中で活性なプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む。
本明細書で使用する、「条件付き発現」とは、誘導性発現、抑圧可能な発現、特定の生理的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現等が含まれるが、これらに限定されない、任意の種類の条件付き発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的な発現を除外することを意図しない。本発明のある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物体等を、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす、または対象となるポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現の増大または減少を引き起こす処理または条件に供することによって発現が制御される、対象となるポリヌクレオチドの条件付き発現を提供する。
誘導性プロモーター／系の例示的な例としては、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドもしくはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンで処理することによって誘導される）、メタロチオネインプロモーター（様々な重金属で処理することによって誘導される）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導される）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３） Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系等が挙げられるが、これらに限定されない。
条件付き発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。ある特定の実施形態によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのために少なくとも１つ（一般には２つ）の部位（複数可）を含み得る。本明細書で使用する、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，（１９９３） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７を参照のこと）、またはその変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、および変異体またはその突然変異体、誘導体であってよい、１つ以上の組換え部位（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、７つ、１０、１２、１５、２０、３０、５０等）が関与する組換え反応に関与する切除的または統合的なタンパク質、酵素、補因子、または関連するタンパク質を含む。本発明の特定の実施形態で用いるために好適なリコンビナーゼの例示的な例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１つ以上の組換え部位を含んでよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みのために必要な任意の部位（複数可）に加えたものであることが理解されるべきである。本明細書で使用する、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的な組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの組換え部位は、８塩基対のコア配列（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，（１９９４） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７の図１を参照のこと）と隣接した２つの１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす）を含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）が挙げられるが、これらに限定されない。
ＦＬＰリコンビナーゼのために好適な認識部位としては、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配列、ａｔｔＬ配列、およびａｔｔＲ配列であり、これらはリコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えばフィーｃ３１によって認識される。φＣ３１ ＳＳＲは、ヘテロタイプの部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）の間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈら、２０００）。ａｔｔＢおよびａｔｔＰは、それぞれ、細菌ゲノムおよびファージゲノムに対するファージインテグラーゼの付着部位に対して名付けられ、どちらも、φＣ３１ホモ二量体が結合する可能性がある不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈら、２０００）。産物の部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対して有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３）、それにより反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムの部位へのａｔｔＢを有するＤＮＡの挿入が、ゲノムのａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位の挿入よりも容易であることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、２００１、Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３）。したがって、典型的な戦略では、相同組換えによってａｔｔＰを有する「ドッキング部位」を定義済みの遺伝子座に位置付け、次いでそれを挿入のために、ａｔｔＢを有する入って来る配列とパートナーにする。
本明細書で使用する、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、ＡＴＧ等の開始コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接内部リボソーム侵入を促進し、それにより、キャップに依存しない遺伝子の翻訳を導く要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、（１９９０） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．（１９９５） ＲＮＡ １（１０）：９８５−１０００を参照のこと。特定の実施形態では、ベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の対象となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列を１つ以上のＩＲＥＳ配列または自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離することができる。
本明細書で使用する、「コザック配列」という用語は、ｍＲＮＡのリボソームの小サブユニットへの最初の結合を著しく容易にし、翻訳を増大させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧであり、式中、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，（１９８６） Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２、およびＫｏｚａｋ，（１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。特定の実施形態では、本発明によって企図されるベクターは、コンセンサスコザック配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、ベクターは、選択可能なマーカーとも称される、選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、メトトレキセート、ゼオシン、ブラストサイジン、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地からは入手不可能な重大な栄養分を供給するタンパク質をコードする（例えば、ＢａｃｉｌｌｉのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することができる。これらとしては、それぞれ、ｔｋ細胞またはａｐｒｔ細胞において使用することができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２）遺伝子およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態では、ベクターは、１つ以上のポリペプチドの発現を増大させる、確立するおよび／または維持するために使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーならびにその変異体および合成類似体を指す。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーに当てはまる。ポリペプチドの例示的な例としては、特定の実施形態の組成物および方法で用いるために好適なグロビンポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。また、例えば、米国特許第６，０５１，４０２号、同第７，９０１，６７１号、および同第９，０６８，１９９号を参照されたく、これらの完全な開示および特許請求の範囲がそれらの全体が参照により本明細書に特に組み込まれる。
ポリペプチドの例示的な例としてはまた、ＡＢＣＤ１ポリペプチドも含む。また、例えば、米国特許第５，８６９，０３９号、同第６，０１３，７６９号、同第８，８５８，９２８号、および同第９，０６１，０３１号を参照されたく、これらの完全な開示および特許請求の範囲がそれらの全体が参照により本明細書に特に組み込まれる。
ポリペプチドのさらに例示的な例としては、グロビンポリペプチド、抗鎌状グロビンポリペプチド、アデノシンデアミナーゼポリペプチド、インターロイキン２受容体ガンマポリペプチド、トリペプチジルペプチダーゼ１ポリペプチド、アルファ−Ｌイズロニダーゼポリペプチド、イズロン酸２−スルファターゼポリペプチド、またはＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ（ＡＬＤ）、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で企図される特定の実施形態はまた、ポリペプチド「変異体」も含む。ポリペプチド「変異体」という記述は、参照ポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、切断、および／または置換によって区別され、生物学的活性を保持するポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチド変異体は、当該技術分野で既知であるように、参照ポリペプチドと、保存されていても保存されていなくてもよい１つ以上の置換によって区別される。
ある特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドの対応する配列に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸の付加または欠失は、参照ポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端において起こる。
上記の通り、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断、および挿入を含めた種々のやり方で変更することができる。このような操作のための方法は、当該技術分野で一般に既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡの突然変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列の変更のための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．、およびそこに引用されている参考文献を参照のこと。対象となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８） Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅのモデルにおいて見出すことができる（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。
「宿主細胞」とは、インビボ、エクスビボ、またはインビトロにおいて、本明細書で企図される組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトする、感染させる、または形質導入する細胞を含む。宿主細胞は、パッケージング細胞、産生細胞、およびウイルスベクターを感染させた細胞を含んでよい。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターを感染させた宿主細胞を、治療を必要とする対象に投与する。ある特定の実施形態では、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と同義に使用され、トランスフェクトする、感染させる、または形質導入する、所望の細胞型の細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞は、幹細胞または前駆細胞である。ある特定の好ましい実施形態では、標的細胞は、体細胞、例えば、成体幹細胞、前駆細胞、または分化細胞である。特定の好ましい実施形態では、標的細胞は、造血細胞、例えば、造血幹または前駆細胞である。さらなる治療標的細胞は、以下で考察されている。
特定の実施形態では、標的細胞は、初代細胞である。本明細書で使用される、「初代細胞」という用語は、組織から単離され、インビトロまたはエクスビボで成長に確立されている細胞を指す。対応する細胞は、ほとんどの処理を受けておらず、もしあっても集団倍加程度であり、それゆえ、連続細胞株に由来するものと比較して組織の主な機能成分をより代表し、したがって、インビボ状態でより代表的なモデルを代表する。様々な組織からサンプルを入手するための方法および初代細胞株を確立するための方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｗｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９７を参照のこと）。本発明の方法で用いるための初代細胞は、例えば、血液、リンパ腫、および上皮腫瘍に由来する。一実施形態では、初代細胞は、造血幹または前駆細胞である。
「幹細胞」という用語は、（１）長期にわたって自己再生できる、または元の細胞の少なくとも１つの同一のコピーを生成することができる、（２）単一細胞レベルで、多数の、およびいくつかの例ではただ１つの特殊化した細胞型に分化することができる、および（３）インビボで組織の機能的再生をすることができる、未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、それらの発生の潜在性に従って、全能性、多能性、多分化能、および少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）／単能性に細分類される。「自己再生」とは、変更されていない娘細胞を産生する独特の能力および特殊化した細胞型を生成する独特の能力（分化能（ｐｏｔｅｎｃｙ））を有する細胞を指す。自己再生は、２つのやり方で達成することができる。非対称細胞分裂により、親の細胞と同一である娘細胞が１つと、親の細胞とは異なり、前駆細胞または分化細胞である娘細胞が１つ産生される。対称細胞分裂により、２つの同一の娘細胞が産生される。細胞の「増殖」または「増大」とは、細胞が対称的に分割されることを示す。
本明細書で使用する、「前駆体」または「前駆細胞」という用語は、自己再生する能力、およびより成熟した細胞に分化する能力を有する細胞を指す。多くの前駆細胞は、単一の系列に沿って分化するが、かなり大規模な増殖能力を有する可能性がある。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生物体の生存期間にわたって成熟血液細胞のレパートリー全体を生成することができる拘束された造血前駆細胞（ＨＰＣ）を生じさせる。「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、骨髄系列（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系列（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、および当該技術分野で既知のその他の系列を含めた、生物体の血液細胞の種類の全てを生じさせる多分化能幹細胞を指す（Ｆｅｉ，Ｒ．らの米国特許第５，６３５，３８７号、ＭｃＧｌａｖｅらの米国特許第５，４６０，９６４号、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．らの米国特許第５，６７７，１３６号、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらの米国特許第５，７５０，３９７号、Ｓｃｈｗａｒｔｚらの米国特許第５，７５９，７９３号、ＤｉＧｕｉｓｔｏらの米国特許第５，６８１，５９９号、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらの米国特許第５，７１６，８２７号を参照のこと）。致死的に放射線照射した動物またはヒトに移植するとき、造血幹および造血前駆細胞は、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、およびリンパ系の造血細胞プールを再配置させる（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）ことができる。
妥当なウイルス力価を達成するためには、多くの場合、大規模なウイルス粒子産生が必要である。ウイルス粒子は、移入ベクターをウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｔａｔ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子、ｖｐｕ遺伝子、ｖｐｘ遺伝子、またはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルスの遺伝子を含むパッケージング細胞株にトランスフェクトすることによって産生される。
本明細書で使用する、「パッケージベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くのウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。一般には、パッケージングベクターは、パッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入、または感染によって細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入、または感染のための方法は、当業者に既知である。特定の実施形態で企図されるレトロウイルス／レンチウイルス移入ベクターは、産生細胞または細胞株を生成するために、トランスフェクション、形質導入、または感染によってパッケージング細胞株に導入することができる。のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含めた標準の方法によってヒト細胞または細胞系に導入することができる。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターを、優性選択マーカー、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎ合成酵素、またはＡＤＡ等と一緒に細胞に導入し、その後、適切な薬物の存在下でクローンを選択し、単離することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、パッケージングベクターによって、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断性ウイルスペプチドによってコードする遺伝子に物理的に連結させることができる。
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）により、細胞系から生成される組換えレトロウイルスによって最終的に感染させ、形質転換することができる宿主細胞の範囲が決定される。レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＶ等の場合では、ｅｎｖタンパク質としてはｇｐ４１およびｇｐ１２０が挙げられる。好ましくは、以前に記載されている通り、本発明のパッケージング細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、ウイルスのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子とは別のベクター上にコードされる。
本発明において使用することができるレトロウイルス由来の遺伝子の例示的な例としては、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、Ｅｂｏｌａ、Ｓｅｎｄａｉ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、およびインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、ＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのＲＮＡウイルスファミリー）からのエンベロープならびにＤＮＡウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ、およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅのファミリー）からのエンベロープをコードする遺伝子を利用することができる。代表例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、およびＥＩＡＶが挙げられる。
他の実施形態では、本発明のウイルスをシュードタイピングするためのエンベロープタンパク質としては、以下のウイルスのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない：Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、およびＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）等のＡ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）、狂犬病ウイルス等のリッサウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス１および２ならびにオーストラリアコウモリウイルス、エフェメロウイルス、ベシクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１型および２型等のヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型および８型、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス等のアレナウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ、例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候群を伴う出血熱を引き起こすウイルス、リフトバレー熱ウイルス、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含めたＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（フィロウイルス）、キャサヌール森林病（Ｋａｙｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎を引き起こすウイルスを含めたＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、ならびにＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、例えば、ヘンドラウイルスおよびニバーウイルス、大痘瘡および小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、任意の脳炎を引き起こすウイルス。
一実施形態では、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質でシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞が、企図される。
本明細書で使用される、「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を保有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に標的化するので、ＨＩＶを水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングし、それにより、ＨＩＶをより広い範囲の細胞に感染することが可能にすることができる。好ましい実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質をＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングする。一実施形態では、パッケージング細胞は、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質でシュードタイピングした、レンチウイルスを産生する。
本明細書で使用する、「パッケージング細胞株」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要であるウイルスの構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現する細胞系への言及において使用される。特定の実施形態では、好適な細胞株は、本発明のパッケージング細胞を調製するために、使用することができる。一般に、細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞株を産生するために使用される細胞は、ヒト細胞である。使用することができる好適な細胞株としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、２９３Ｆ細胞、またはＡ５４９細胞である。
本明細書で使用する、「産生細胞」という用語は、パッケージング細胞株およびパッケージングシグナルを含む移入ベクター構築物を含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞株を指す。感染性ウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を使用して行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６２８−６３３、およびＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０−５１１３によって例示されている。感染性ウイルス粒子は、従来の技法を使用してパッケージング細胞から収集することができる。例えば、感染性粒子は、当該技術分野で公知の通り、細胞溶解、または細胞培養物の上清の収集により収集することができる。任意に、収集されたウイルス粒子は、所望であれば精製することができる。好適な精製技法は、当業者に既知であり、例えば、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２。
「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「促進する（ｐｒｏｍｏｔｅ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増大させる（ｅｘｐａｎｄ）」とは、一般に、本明細書で企図される組成物および／または方法により、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって形質導入した細胞の数と比較してより多数の形質導入した細胞を引き出す、引き起こす、または産生することができることを指す。一実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法で形質導入した造血幹または前駆細胞は、現行の形質導入組成物および方法と比較して形質導入した細胞の数の増加を含む。細胞への形質導入の増加は、とりわけ、レポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、および細胞表面タンパク質発現等の当該技術分野で既知の方法を用いて確認することができる。「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」形質導入の量とは、一般には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物、または他の形質導入方法によって形質導入した細胞の数の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍またはそれを超える倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（１との間および１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）である増加を含んでよい。
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低減する（ｌｏｗｅｒ）」または「減る（ｌｅｓｓｅｎ）」または「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「弱める（ａｂａｔｅ）」とは、一般に、本発明による組成物および／または方法で形質導入した細胞と比較して比較的より少ない形質導入した細胞をもたらす組成物または方法を指す。「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」形質導入した細胞の量とは、一般には「統計的に有意な」量であり、本発明による組成物および／または方法によって生成される形質導入した細胞の数（参照応答）の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍またはそれを超える倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（１との間および１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）である減少を含んでよい。
「維持する（ｍａｉｎｔａｉｎ）」または「保全する（ｐｒｅｓｅｒｖｅ）」または「維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）」または「変化なし（ｎｏ ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な変化なし（ｎｏ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｃｈａｎｇｅ）」または「実質的な減少なし（ｎｏ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｄｅｃｒｅａｓｅ）」とは、一般に、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞における応答に匹敵する生理学的応答を指す。匹敵する応答とは、参照応答と有意差がないまたは測定可能には異ならない応答である。
以下の説明において、ある特定の具体的詳細は、本明細書で企図される本発明の様々な例示的な実施形態の完全な理解を提供するために記載されている。しかしながら、当業者には、これらの詳細なしで特定の例示的な実施形態を実施することができることが理解されよう。加えて、本明細書に記載の構造および置換基の種々の組み合わせに由来する個々のベクター、またはベクターの群が、各ベクターまたはベクターの群が個別に記載されているのと同じ程度に本出願により開示されていることが理解されるべきである。したがって、特定のベクター構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲内である。
Ｃ．薬剤
本明細書で企図される様々な実施形態は、形質導入効率および／またはＶＣＮが、細胞を、レトロウイルスおよび本明細書で企図される形質導入効率またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤とインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることによって有意に増加させることを予期せぬ所見から生じる。様々な実施形態では、形質導入効率は、細胞を、レトロウイルスおよびポロキサマーとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることによって有意に増加させる。様々な実施形態では、形質導入効率は、細胞を、レトロウイルスおよびポロキサマーと、任意に、１つ以上のポリカチオン性ポリマーまたはペプチドと組み合わせて、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることによって有意に増加させる。様々な実施形態では、形質導入効率は、細胞を、レトロウイルス、ポロキサマー、ならびにプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤、および／またはスタウロスポリン、任意に、１つ以上のポリカチオン性ポリマーまたはペプチドと組み合わせて、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることによって有意に増加させる。
１．プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路アゴニスト
驚いたことには、本発明者らは、造血幹および前駆細胞を含む細胞集団の形質導入効率および／またはＶＣＮが、レトロウイルス、ポロキサマー、およびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤、ならびにその類似体および誘導体の存在下で、細胞を培養することによって増加させ得ることが発見した。
特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞を含む細胞集団は、細胞を、レトロウイルスの存在下、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤、すなわち、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路アゴニストおよびポロキサマーの存在下で培養することによって形質導入される。
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を刺激する薬剤としては、ＷＯ２００７／１１２０８４およびＷＯ２０１０／１０８０２８（これらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている、小分子またはこれらの化合物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する、「プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を刺激する」、「プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を活性化する」、または「プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる」という用語は、一般に、１つ以上の薬剤と接触した細胞におけるプロスタグランジンＥＰ受容体の下流の細胞シグナル伝達の活性を、１つ以上の薬剤の不在下のプロスタグランジンＥＰ受容体の下流の細胞シグナル伝達の活性と比較して増加させる、薬剤の能力を指す。プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路の活性化または刺激を測定するために使用することができるアッセイは、当該技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ２０１０／１０８０２８（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤の例示的な例としては、メベベリン、フルランドレノリド、アテノロール、ピンドロール、ガボキサドール、キヌレン酸、ヒドララジン、チアベンダゾール、ビククリン、ベサミコール、ペルボシド、イミプラミン、クロルプロパミド、１，５−ペンタメチレンテトラゾール、４−アミノピリジン、ジアゾキシド、ベンフォチアミン、１２−メトキシドデセン酸、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、ガラミン、ＩＡＡ９４、クロロトリアニセンからなる群から選択される、小分子、例えば、小有機分子、プロスタグランジン、Ｗｎｔ経路アゴニスト、ｃＡＭＰ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路アゴニスト、Ｃａ２＋二次メッセンジャー経路アゴニスト、一酸化窒素（ＮＯ）／アンジオテンシンシグナル伝達アゴニスト、およびプロスタグランジンシグナル伝達経路を刺激することが公知の他の化合物、およびこれらの化合物の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤は、ＥＰ受容体に結合し、かつ／またはＥＰ受容体と相互作用して、一般には、プロスタグランジンＥＰ受容体に関連する下流シグナル伝達経路の１つ以上を活性化するまたは増加させる、天然に存在する分子もしくはポリペプチドまたは合成化学分子もしくはポリペプチドである。
一実施形態では、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤は、ＰＧＡ２、ＰＧＢ２、ＰＧＤ２、ＰＧＥ１（アルプロスタジル）、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２、ＰＧＩ２（エポプロステノール）、ＰＧＨ２、ＰＧＪ２、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される。
プロスタグランジン経路を刺激するさらなる例示的な薬剤としては、１５ｄ−ＰＧＪ２、デルタ１２−ＰＧＪ２、２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）、トロンボキサン（ＴＸＡ２およびＴＸＢ２）、ＰＧＩ２類似体、例えば、イロプロストおよびトレプロスチニル、ＰＧＦ２類似体、例えば、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン、およびスーパーファン、ＰＧＥ１類似体、例えば、１１−デオキシＰＧＥ１、ミソプロストール、およびブタプロスト、ならびにＣｏｒｅｙアルコール−Ａ［［３ａα，４α，５β，６ａα］−（−）−［ヘキサヒドロ−４−（ヒドロキシメチル）−２−オキソ−２Ｈ−シクロペンタ／ｂ／フラン−５−イル］［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキシレート］、Ｃｏｒｅｙアルコール−Ｂ［２Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−２−オン、５−（ベンゾイルオキシ）ヘキサヒドロ−４−（ヒドロキシメチル）［３ａＲ−（３ａα，４α，５β，６ａα）］］、およびＣｏｒｅｙジオール（（３ａＲ，４Ｓ，５Ｒ，６ａＳ）−ヘキサヒドロ−５−ヒドロキシ−４−（ヒドロキシメチル）−２Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−２−オン）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、この薬剤は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ならびにその「類似体」または「誘導体」が挙げられるが、これらに限定されない、プロスタグランジンＥＰ受容体リガンドである。プロスタグランジンは、本明細書に記載されており、当該技術分野で既知の通り、概して、５炭素環を含めた２０個の炭素原子を含有する脂肪酸に由来するホルモン様分子に関する。
ＰＧＥ２「類似体」または「誘導体」の例示的な例としては、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１６−１６ ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−オメガ−トリノルＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、ノクロプロスト、スルプロストン、ブタプロスト、１５−ケトＰＧＥ２、および１９（Ｒ）ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｘｙｙ）ＰＧＥ２が挙げられるが、これらに限定されない。
９位においてハロゲンで置換された、ＰＧＥ２と同様の構造を有するプロスタグランジン類似体または誘導体（例えば、ＷＯ２００１／１２５９６（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ならびに米国特許出願公開第２００６／０２４７２１４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））に記載されるもの等の２−デカルボキシ−２−ホスフィニコプロスタグランジン誘導体もまた、本明細書で企図される。
いくつかの実施形態では、化合物は、ＰＧＥ２に基づかないリガンドである。ある特定の実施形態では、ＰＧＥ２に基づかないリガンドは、ＥＰ１アゴニスト、ＥＰ２アゴニスト、ＥＰ３アゴニスト、およびＥＰ４アゴニストからなる群から選択される。
特定の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体は、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、およびＥＰ４から選択される。
ＰＧＥ２に基づかないＥＰ１アゴニストの例示的な例としては、ＯＮＯ−ＤＩ−００４およびＯＮＯ−８７１３が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＧＥ２に基づかないＥＰ２アゴニストの例示的な例としては、ＣＡＹ１０３９９、ＯＮＯ＿８８１５Ｌｙ、ＯＮＯ−ＡＥ１−２５９、およびＣＰ−５３３，５３６が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＧＥ２に基づかないＥＰ２アゴニストのさらなる例としては、ＷＯ２００７／０７１４５６（そのような薬剤に関するその開示について参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているカルバゾールおよびフルオレンが挙げられる。ＰＧＥ２に基づかないＥＰ３アゴニストの例示的な例としては、ＡＥ５−５９９、ＭＢ２８７６７、ＧＲ６３７９９Ｘ、ＯＮＯ−ＮＴ０１２、およびＯＮＯ−ＡＥ−２４８が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＧＥ２に基づかないＥＰ４アゴニストの例示的な例としては、ＯＮＯ−４８１９、ＡＰＳ−９９９ Ｎａ、ＡＨ２３８４８、およびＯＮＯ−ＡＥ１−３２９が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＧＥ２に基づかないＥＰ４アゴニストのさらなる例としては、ＷＯ２０００／０３８６６３、米国特許第６，７４７，０３７号、および米国特許第６，６１０，７１９号（これらのそれぞれは、そのような薬剤に関するその開示について参照により組み込まれる）に見出され得る。
一実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤は、Ｗｎｔアゴニストである。Ｗｎｔアゴニストの例示的な例としては、Ｗｎｔポリペプチドおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する化合物として用いるのに好適なｗｎｔポリペプチドの例示的な例としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１５、およびその生物学的に活性な断片が挙げられるが、これらに限定されない。
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤として用いるのに好適なＧＳＫ３阻害剤は、ＧＳＫ３αまたはＧＳＫ３βに結合し、その活性を減少させる。ＧＳＫ３阻害剤の例示的な例としては、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＬｉＣｌ、または米国特許第６，０５７，１１７号および同第６，６０８，０６３号、ならびに米国特許出願第２００４／００９２５３５号および同第２００４／０２０９８７８号において例証されている他のＧＳＫ−３阻害剤、ＡＴＰ−競合的選択的ＧＳＫ−３阻害剤であるＣＨＩＲ−９１１およびＣＨｌＲ−８３７（それぞれＣＴ−９９０２１およびＣＴ−９８０２３とも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）。
別の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤は、ｃＡＭＰ／Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴの二次メッセンジャー経路を通じてシグナル伝達を増加させ、ジブチリルｃＡＭＰ（ＤＢｃＡＭＰ）、ホルボールエステル、ホルスコリン、スクラレリン、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、コレラ毒素（ＣＴｘ）、アミノフィリン、２，４ ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ノルエピネフリン、エピネフリン、イソプロテレノール、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、カフェイン、テオフィリン（ジメチルキサンチン）、ドーパミン、ロリプラム、イロプロスト、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、および血管活性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ、およびこれらの薬剤の誘導体からなる群から選択される。
さらに別の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤は、Ｃａ２＋二次メッセンジャー経路を通じてシグナル伝達を増加させ、Ｂａｐｔａ−ＡＭ、フェンジリン、ニカルジピン、およびこれらの薬剤の誘導体からなる群から選択される。
別の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤は、ＮＯ／アンジオテンシンシグナル伝達経路を通じてシグナル伝達を増加させ、Ｌ−Ａｒｇ、ニトロプルシドナトリウム、バナジン酸ナトリウム、ブラジキニン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される。
一実施形態では、形質導入効率を改善する方法が提供され、本方法は、細胞集団を、レトロウイルスおよびポロキサマー、ならびにプロスタグランジン、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２、ＰＧＩ２、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、ＰＧＥ２受容体アゴニスト、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、ブタプロスト、スルプロストン、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、ＢＩＯ、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ホルスコリン、Ｂａｐｔａ−ＡＭ、フェンジリン、ニカルジピン、ニフェジピン、ピモジド、ストロファンチジン、ラナトシド、Ｌ−Ａｒｇ、ニトロプルシドナトリウム、バナジン酸ナトリウム、ブラジキニン、メベベリン、フルランドレノリド、アテノロール、ピンドロール、ガボキサドール、キヌレン酸、ヒドララジン、チアベンダゾール、ビククリン、ベサミコール、ペルボシド、イミプラミン、クロルプロパミド、１，５−ペンタメチレンテトラゾール、４−アミノピリジン、ジアゾキシド、ベンフォチアミン、１２−メトキシドデセン酸、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、ガラミン、ＩＡＡ９４、およびクロロトリアニセンからなる群から選択されるプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる１つ以上の薬剤で培養することを含む。
特定の実施形態では、形質導入効率を改善する方法は、細胞集団を、レトロウイルスおよびポロキサマー、ならびにＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１６−１６ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−オメガ−トリノルＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、ノクロプロスト、スルプロストン、ブタプロスト、１５−ケトＰＧＥ２、および１９（Ｒ）ヒドロキシＰＧＥ２からなる群から選択されるプロスタグランジンＥＰ受容体のリガンドである１つ以上の薬剤で培養することを含む。
特定の実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体経路を刺激する薬剤は、ＰＧＥ２または１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である。
一実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体経路を刺激する薬剤は、ＰＧＥ２である。
様々な実施形態では、細胞集団は、レトロウイルス、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤および約１０，０００ダルトンの平均分子量を有するポロキサマーの存在下で培養される。
様々な実施形態では、細胞集団は、レトロウイルス、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤、約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーの存在下で培養される。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約４０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
ある特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８である。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３５である。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３８である。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー４０７である。
２．スタウロスポリン
スタウロスポリン、アルカロイドは、元来は、１９７７年に抗真菌剤としてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｅｓにおいて産生された。スタウロスポリンは、キナーゼ、例えば、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）、ホスホリラーゼキナーゼ、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）キナーゼ、およびＣａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（Ｃａ／ＣａＭ ＰＫＩＩ）を阻害する、広範囲のタンパク質キナーゼ阻害剤である。阻害効力は、ＰＫＣ（ＩＣ５０＝２．７ｎＭ）に対して最も強いが、他のタンパク質キナーゼに対して数倍低い。スタウロスポリンは、いくつかの哺乳動物腫瘍細胞株に対して強い細胞毒性を呈し、細胞アポトーシスを誘導し、細胞分裂直後の段階で特異的に分裂酵母細胞伸長を停止する。
驚いたことには、本発明者らはまた、造血幹および前駆細胞を含む細胞集団の形質導入効率および／またはＶＣＮが、レトロウイルス、ポロキサマー、ならびにその類似体および誘導体の存在下で、細胞を培養することによって増加させ得ることも発見した。
様々な実施形態では、細胞集団は、レトロウイルス、スタウロスポリン、および約１０，０００ダルトンの平均分子量を有するポロキサマーの存在下で培養される。
様々な実施形態では、細胞集団は、レトロウイルス、スタウロスポリン、および約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、約４０％超のポリエチレンオキシドを含むポロキサマーの存在下で培養される。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約４０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
ある特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８である。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３５である。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３８である。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー４０７である。
３．ポロキサマーおよびポリカチオン性ポリマー
特定の実施形態では、形質導入効率は、レトロウイルスおよびポロキサマーの存在下で細胞を培養することによって、造血幹または前駆細胞を含む細胞集団において増加される。
特定の実施形態では、形質導入効率は、細胞を、レトロウイルスの存在下、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤またはスタウロスポリン、およびポロキサマーの存在下で培養することによって、造血幹または前駆細胞を含む細胞集団において増加される。
特定の実施形態では、ＶＣＮは、造血幹または前駆細胞を含む細胞集団において増加され、細胞を、レトロウイルスの存在下、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤またはスタウロスポリン、およびポロキサマーの存在下で培養することによって有効に形質導入される。
「ポロキサマー」とは、ポリオキシエチレンの２つの親水性鎖によって隣接されるポリオキシプロピレンの中央疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマーを指す。ポロキサマーはまた、「Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ」または「Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃｓ」（ＢＡＳＦ）の商標名によって既知である。ブロックコポリマーは、式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｘ（Ｃ３Ｈ６０）ｙ（Ｃ２Ｈ４０）ｚＨによって表され得る。
このポリマーブロックの長さは、特注され得、結果として多くのポロキサマーが存在する。特定の実施形態において用いられるのに好適なポロキサマーは、少なくとも約１０ｋＤａ、少なくとも約１１．４ｋＤａ、少なくとも約１２．６ｋＤａ、少なくとも約１３ｋＤａ、少なくとも約１４．６ｋＤａ、または少なくとも約１５ｋＤａの平均分子量を有する。特定の実施形態では、ｙは、約３９〜約７０の範囲であり得る。
特定の実施形態では、ｙは、少なくとも約３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０もしくはそれ以上である。
特定の実施形態では、ｘ＋ｚは、約７０〜約２７５の範囲であり得る。
特定の実施形態では、ｘ＋ｚは、約２００〜約２７５の範囲であり得る。
特定の実施形態では、ｘ＋ｚは、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、または２７５である。
特定の実施形態では、ｘ＋ｚは、少なくとも約２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６ ２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、または２７５もしくはそれ以上である。
特定の実施形態では、特定の実施形態で用いるために好適なポロキサマーは、約２２５０ダルトン超、少なくとも約２３００ダルトン、少なくとも約２３５０ダルトン、少なくとも約２４００ダルトン、少なくとも約２４５０ダルトン、少なくとも約２５００ダルトン、少なくとも約２５５０ダルトン、少なくとも約２６００ダルトン、少なくとも約２６５０ダルトン、少なくとも約２７００ダルトン、少なくとも約２７５０ダルトン、少なくとも約２８００ダルトン、少なくとも約２８５０ダルトン、少なくとも約２９００ダルトン、少なくとも約２９５０ダルトン、少なくとも約３０００ダルトン、少なくとも約３０５０ダルトン、少なくとも約３１００ダルトン、少なくとも約３１５０ダルトン、少なくとも約３２００ダルトン、少なくとも約３２５０ダルトン、少なくとも約３３００ダルトン、少なくとも約３３５０ダルトン、少なくとも約３４００ダルトン、少なくとも約３４５０ダルトン、少なくとも約３５００ダルトン、少なくとも約３５５０ダルトン、少なくとも約３６００ダルトン、少なくとも約３６５０ダルトン、少なくとも約３７００ダルトン、少なくとも約３７５０ダルトン、少なくとも約３８００ダルトン、少なくとも約３８５０ダルトン、少なくとも約３９００ダルトン、少なくとも約３９５０ダルトン、少なくとも約４０００ダルトン、少なくとも約４０５０ダルトン、または少なくとも約４１００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、特定の実施形態で用いるために好適なポロキサマーは、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約８０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、特定の実施形態で用いるために好適なポロキサマーは、約２２５０ダルトン超、少なくとも約２３００ダルトン、少なくとも約２３５０ダルトン、少なくとも約２４００ダルトン、少なくとも約２４５０ダルトン、少なくとも約２５００ダルトン、少なくとも約２５５０ダルトン、少なくとも約２６００ダルトン、少なくとも約２６５０ダルトン、少なくとも約２７００ダルトン、少なくとも約２７５０ダルトン、少なくとも約２８００ダルトン、少なくとも約２８５０ダルトン、少なくとも約２９００ダルトン、少なくとも約２９５０ダルトン、少なくとも約３０００ダルトン、少なくとも約３０５０ダルトン、少なくとも約３１００ダルトン、少なくとも約３１５０ダルトン、少なくとも約３２００ダルトン、少なくとも約３２５０ダルトン、少なくとも約３３００ダルトン、少なくとも約３３５０ダルトン、少なくとも約３４００ダルトン、少なくとも約３４５０ダルトン、少なくとも約３５００ダルトン、少なくとも約３５５０ダルトン、少なくとも約３６００ダルトン、少なくとも約３６５０ダルトン、少なくとも約３７００ダルトン、少なくとも約３７５０ダルトン、少なくとも約３８００ダルトン、少なくとも約３８５０ダルトン、少なくとも約３９００ダルトン、少なくとも約３９５０ダルトン、少なくとも約４０００ダルトン、少なくとも約４０５０ダルトン、または少なくとも約４１００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む。
一実施形態では、特定の実施形態で用いるために好適なポロキサマーは、少なくとも約３２００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
ブロックコポリマーの合成が正確であり得ないため、上記の所与の値は、合成時に必ずしも達成可能ではない場合があり、平均値は、ある特定の範囲まで異なるであろう。したがって、本明細書で使用される「ポロキサマー」という用語は、別途明確に述べられない場合、「ポロキサマー」という用語（いくつかのポロキサマーの実体を表す、ポロキサマーの混合物とも称される）と同義に使用することができる。（ａ）本明細書で使用されるポロキサマー（複数可）のモノマー単位または分子量の数に関して「平均」という用語は、全て同一の組成を有するポロキサマーを、したがって、同一の分子量を有するポロキサマーを製造する技術能力がない結果である。当該技術分野の方法の状態に従って製造されるポロキサマーは、それぞれ、その分子量に関しては多様性を示すポロキサマーの混合物として存在するが、その混合物は、全体として、本明細書で特定される平均化された分子量を有するであろう。ＢＡＳＦおよびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈは、本明細書で企図される特定の実施形態で用いるために好適なポロキサマー源である。
本発明者らは、驚くべきことには、本明細書に定義されるポロキサマーが、単独でまたはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤またはスタウロスポリンと組み合わせて、本質的にそれらの生存率に影響を与えることなく、付着した懸濁した標的細胞におけるレトロウイルスベクターの形質導入率および／またはＶＣＮを顕著に高めることが見出されている。
一実施形態では、本明細書で企図される特定の実施形態で用いるために好適なポロキサマーは、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される。
一実施形態では、本明細書で企図される特定の実施形態で用いるために好適なポロキサマーは、ポロキサマー２８８である。
一実施形態では、本明細書で企図される特定の実施形態で用いるために好適なポロキサマーは、ポロキサマー３３５である。
一実施形態では、本明細書で企図される特定の実施形態で用いるために好適なポロキサマーは、ポロキサマー３３８である。
一実施形態では、本明細書で企図される特定の実施形態で用いるために好適なポロキサマーは、ポロキサマー４０７である。
一実施形態では、ポロキサマー２８８（Ｆ９８、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｘ（Ｃ３Ｈ６０）ｙ（Ｃ２Ｈ４０）ｚＨ、ｘ＋ｙ＝２３６．３６、ｚ＝４４．８３、１３ｋＤａの平均分子量）は、造血幹または前駆細胞を含む造血細胞集団中の形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために使用される。Ｆ９８は、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために、単独でまたはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤もしくはスタウロスポリンと組み合わせて使用することができる。
一実施形態では、ポロキサマー３３５（Ｐ１０５、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｘ（Ｃ３Ｈ６０）ｙ（Ｃ２Ｈ４０）ｚＨ、ｘ＋ｙ＝７３．８６、ｚ＝５６．０３、６．５ｋＤａの平均分子量）は、造血幹または前駆細胞を含む造血細胞集団中の形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために使用される。Ｐ１０５は、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために、単独でまたはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤もしくはスタウロスポリンと組み合わせて使用することができる。
一実施形態では、ポロキサマー３３８（Ｆ１０８、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｘ（Ｃ３Ｈ６０）ｙ（Ｃ２Ｈ４０）ｚＨ、ｘ＋ｙ＝２６５．４５、ｚ＝５０．３４、１４．６ｋＤａの平均分子量）は、造血幹または前駆細胞を含む造血細胞集団中の形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために使用される。Ｆ１０８は、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために、単独でまたはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤もしくはスタウロスポリンと組み合わせて使用することができる。
一実施形態では、ポロキサマー４０７（Ｆ１２７、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｘ（Ｃ３Ｈ６０）ｙ（Ｃ２Ｈ４０）ｚＨ、ｘ＋ｙ＝２００．４５、ｚ＝６５．１７、１２．６ｋＤａの平均分子量）は、造血幹または前駆細胞を含む造血細胞集団中の形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために使用される。Ｆ１２７は、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために、単独でまたはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤もしくはスタウロスポリンと組み合わせて使用することができる。
特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞を含む造血細胞集団は、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために、レトロウイルスおよびポロキサマーの存在下で培養される。
特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞を含む造血細胞集団は、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために、レトロウイルス、ポロキサマー、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤またはスタウロスポリン、およびポリカチオン性ポリマーの存在下で培養される。
「ポリカチオン性ポリマー」とは、繰り返し単位が正電荷を有し、繰り返し単位の正電荷がプロトン化された窒素部分に起因する、荷電したポリマーを指す。本明細書で企図される特定の実施形態での使用に好適なポリカチオン性ポリマーの例示的な例としては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（Ｌ−リジン）ブロックコポリマー（ＰＥＧ−ＰＬＬ）、１，５−ジメチル−、５−ジアザ−ウンデカ−メチル−ポリメトブロミド（ポリブレン）、ポリカチオン性ペプチド、例えば、ポリ−Ｌ−リジン、および硫酸プロタミンが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｄ．ウイルスベクター
レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは試験され、広範囲の標的細胞のゲノムへの、例えば、治療用ポリペプチドをコードする、対象となる遺伝子の安定した導入のために、好適な送達ビヒクルであることを見出された。本明細書で企図される特定の実施形態は、遺伝子治療を提供するために対象に投与される細胞集団への遺伝子治療ベクターの改善された形質導入効率および／またはＶＣＮを提供する。
一実施形態では、ベクターは、移入ベクターである。当業者は、このような移入ベクターが様々な異なるウイルスベクターを用いて産生され得ることを理解されるが、特定の実施形態では、レンチウイルスベクターがインビトロおよびインビボの両方で非分裂細胞への導入遺伝子の効率的な送達、組み込みおよび長期発現をもたらすことができることに一部起因して、移入ベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野で公知であり、Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）、Ｄｕｌｌら、１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、および同第５，９９４，１３６号を参照されたく、これらのいずれも本明細書で企図される移入ベクターを産生するために適合させることができる。
全般に、これらのベクターは、プラスミドに基づくかウイルスに基づき、治療用ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞内に移入させるために必須な配列を有するように構成されている。
例示的な実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。したがって、ベクターは、ヒト免疫不全１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）等に由来し得る。ＨＩＶに基づくベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列要素およびＨＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子）は、概して、ＨＩＶに基づく構築物がヒト細胞の形質導入において最も効率的であるという点において、本発明のほとんどの態様に関連して好ましい。
特定の例示的な実施形態は、造血障害、例えば、異常ヘモグロビン症を補正するために使用されるベクター、組成物、および方法のより詳細な記載を含むが、本明細書で企図される実施形態は、本開示によって限定されるものと見なされるべきではない。本明細書で例示された原理は、他の系、例えば、眼、中枢神経系、および末梢神経系を含めた神経系；循環系；筋肉系；骨格系；および皮膚、心臓、肺、膵臓、肝臓、腎臓、腸等を含めた器官における遺伝子治療に適用することができることは当業者には容易に理解されよう。
一実施形態では、レトロウイルスベクターは、特定の細胞型または細胞系列における、対象となるポリヌクレオチド、例えば、グロビン遺伝子の発現を導く発現制御配列を含む。細胞型または細胞系列の発現制御配列を使用することにより、ポリヌクレオチドの発現を単一の系列における細胞分化の所望の段階に制限することにおいて安全性の利点がもたらされ、したがって、本発明のベクターにより、望ましくない細胞型におけるポリペプチドの異所性発現に対処する懸念が緩和される。
１つの非限定的な例では、発現制御配列は、本明細書の他の箇所で開示されている遍在する発現制御配列であってよい。
別の非限定的な例では、発現制御配列は、胚性幹細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、心臓幹細胞、腎幹細胞、または造血幹細胞における対象となるポリヌクレオチドの幹細胞特異的発現を導く幹細胞特異的な発現制御配列であってよい。
さらに別の非限定的な例では、発現制御配列は、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄性細胞、リンパ系細胞、血小板新生系列、肥満細胞、赤血球生成系列細胞、顆粒球形成系列細胞、および単核球形成系列細胞における対象となるポリヌクレオチドの発現を導く、細胞型または細胞系列に特異的な発現制御配列であってよい。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクターは、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄性前駆体、リンパ系前駆体、血小板新生前駆体、赤血球前駆体、顆粒球形成前駆体、単核球形成前駆体、巨核芽球、前巨核球、巨核球、栓球／血小板、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染赤芽球、正染性赤芽球、多染性赤血球、赤血球（ＲＢＣ）、好塩基性前骨髄球、好塩基性骨髄球、好塩基性後骨髄球、好塩基球、好中性前骨髄球、好中性骨髄球、好中性後骨髄球、好中球、好酸性前骨髄球、好酸性骨髄球、マクロファージ、樹状細胞、リンパ芽球、前リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、形質細胞、およびリンパ系樹状細胞が挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上または全ての造血細胞において、ポリヌクレオチド、例えば、対象となる遺伝子を発現する。
好ましい実施形態では、ベクターは、１つ以上の赤血球系細胞、例えば、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、多染性赤血球、および赤血球（ＲＢＣ）において、ポリヌクレオチド、例えば、対象となる遺伝子を発現する。
一実施形態では、ベクターは、対象となる遺伝子、例えば、グロビンに作動可能に連結した、造血細胞プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを含む。
好適な細胞型または細胞系列に特異的な発現制御配列としては、造血細胞の発現制御配列、例えば、造血幹細胞プロモーター、および造血前駆細胞プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。対象となる遺伝子の発現が１つ以上の赤血球系細胞が望ましい実施形態では、好適な造血細胞発現制御配列は、赤血球系細胞特異的プロモーターおよび任意に、赤血球系細胞特異的エンハンサー、ヒトβ−グロビンプロモーター、ヒトβ−グロビンＬＣＲ、またはヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサー、およびアンキリン−１プロモーターを挙げることができるが、これらに限定されない。
一実施形態では、好適な細胞型または細胞系列に特異的な発現制御配列としては、小膠細胞において活性なプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、プロモーターは、対象となる遺伝子、例えば、ＡＢＣＤ１に作動可能に連結した、ＭＮＤプロモーターまたはその転写的に活性な断片を含む。
細胞型または細胞系列発現制御配列を使用することにより、ポリヌクレオチドの発現を単一の系列における細胞分化の所望の段階に制限することにおいて安全性の利点がもたらされ、したがって、本明細書で企図されるベクターにより、望ましくない細胞型におけるポリペプチドの異所性発現に対処する懸念が緩和される。一実施形態では、ベクターは、１つ以上のＬＴＲと、対象となる遺伝子に作動可能に連結した発現制御配列とを含む。関連の実施形態では、発現制御配列は、ヒトβ−グロビンプロモーター、ヒトβ−グロビンＬＣＲ、ならびにヒトα−グロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される。
様々な実施形態では、ベクターの設計は、特定の造血疾患、障害、または状態を処置する、予防する、または軽減する目的で行われるであろう。例えば、本発明は、ヒトα−グロビン、ヒトβ−グロビン、ヒトδ−グロビン、およびヒトγ−グロビン、またはその生物学的に活性な変異体もしくは断片からなる群から選択される対象となる遺伝子を含む、異常ヘモグロビン症の遺伝子治療のためのベクターを企図する。一実施形態では、グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子、イントロン配列の１つ以上の欠失を含む欠失ヒトβ−グロビン遺伝子、および少なくとも１つの抗鎌状アミノ酸残基をコードする変異ヒトβ−グロビン遺伝子からなる群から選択される。
特定の実施形態では、処置されている状態が異常ヘモグロビン症、例えば、サラセミアまたは鎌状赤血球病である場合、対象となる遺伝子は、抗鎌状タンパク質であり得る。本明細書で使用する、「抗鎌状タンパク質」とは、鎌状細胞の状態における赤血球の鎌状化を導く病理学的事象を予防または逆転させるポリペプチドを指す。本発明の一実施形態では、本発明の形質導入した細胞を使用して、抗鎌状タンパク質を異常ヘモグロビン症の状態を有する対象に送達する。抗鎌状タンパク質はまた、抗鎌状アミノ酸残基を含む変異β−グロビン遺伝子も含む。
好ましい実施形態では、１つのこのようなグロビン変異体は、コドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードするヒトβＡ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である（成熟型のグロビンポリペプチドがＮ末端メチオニンの切断によってプロセシングされており、成熟グロビンポリペプチドのコドン８７はトレオニンであり、全長の、切断されていないグロビンポリペプチドのコドン８８はトレオニンである）。他の抗鎌状アミノ酸残基が、当該技術分野で既知であり、本発明において有用であり得る。例えば、米国特許第６，０５１，４０２号、米国特許第５，８６１，４８８号、米国特許第６，６７０，３２３号、米国特許第５，８６４，０２９号、米国特許第５，８７７，２８８号、およびＬｅｖａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０２：４３１２−４３１９（２００３）を参照されたく、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、赤血球特異的発現制御配列を含むベクターを使用して、異常ヘモグロビン症を優に超える膨大な数の障害を処置する、予防する、または軽減する。赤血球前駆体は、循環中に分泌させ、したがって、全身に送達することができるポリペプチドを発現させるために有用な細胞集団である。このようなインビボにおけるタンパク質の送達の例は、Ｂ型血友病患者において欠けている凝固因子であるヒト第ＩＸ因子である。例えば、Ａ．Ｈ．Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）を参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本発明のベクターで形質導入した細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて、タンパク質を分泌させるための「工場」として使用することができる。例えば、赤血球系細胞特異的発現制御配列を含むベクターを使用して、ＨＳＣから分化した赤血球系細胞から、または胚幹細胞からタンパク質を大規模にインビトロで生成することができる。
このように発現させることができる対象となるポリヌクレオチドとしては、リソソーム蓄積症に影響を及ぼす酵素であるアデノシンデアミナーゼ、アポリポタンパク質Ｅ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ−６）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、ＣＤ２２、ＣＤ４０、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＣＣＬ１−ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１−ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ドーパミン、エリスロポエチン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エストロゲン、ＦＡＳ−リガンド、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ−４）、線維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ−５）、線維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ−６）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−７）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１０）、Ｆｌｔ−３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長ホルモン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−ａ）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−ｂ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）、インスリン、グルカゴン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン１９（ＩＬ−１９）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質３ａ（ＭＩＰ−３ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質３ｂ（ＭＩＰ−３ｂ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、副甲状腺ホルモン、血小板由来増殖因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、血小板由来増殖因子ＣＣ（ＰＤＧＦ−ＣＣ）、血小板由来増殖因子ＤＤ（ＰＤＧＦ−ＤＤ）、ＲＡＮＴＥＳ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、テストステロン、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−ａ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−ａ）、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１６、ソニックヘッジホッグ、デザートヘッジホッグ、およびインディアンヘッジホッグが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本発明のベクターは、少なくとも１つの改変されたまたは改変されていないレトロウイルスＬＴＲ、例えば、レンチウイルスＬＴＲと、対象となるポリヌクレオチドに作動可能に連結した、例えば、グロビンポリペプチドをコードするβ−グロビンプロモーターおよびβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）とを含む。ＬＴＲの好適な改変としては、５’ＬＴＲを、異種プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターで置き換えること、および本明細書の他の箇所で考察されている３’ＬＴＲの１つ以上の改変、付加、および／または欠失が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドの赤血球での特異的発現は、ヒトβ−グロビンプロモーター、ヒトβ−グロビンＬＣＲからのＤＮＡアーゼＩ高感受性部位２、３、および４のうちの１つ以上を含むβ−グロビンＬＣＲ、および／またはヒトβ−グロビン３’エンハンサー要素を使用して達成される。
様々な実施形態では、本明細書で企図されるベクターは、本明細書の他の箇所で考察されている通り、プシーパッキング配列（Ψ＋）、中央ポリプリン区域／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送要素、転写後調節要素、１つ以上のインスレーター要素、ポリアデニル化配列、選択可能なマーカー、および細胞自殺遺伝子からなる群から選択される１つ以上の要素を含む。
様々な実施形態では、本明細書で企図されるベクターは、異常ヘモグロビン症に対する治療をもたらすポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結した、造血細胞において作動可能なプロモーターを含む。ベクターは、１つ以上のＬＴＲを有してよく、いずれのＬＴＲも、１つ以上の改変、例えば、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を含む。ベクターは、形質導入効率を増加させるための１つ以上のアクセサリー要素（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、および／または治療遺伝子発現を増加させる他の要素（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含み得る。
一実施形態では、ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、プシーパッケージング配列（Ψ＋）と、中央ポリプリン区域／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送要素と、β−グロビンプロモーターと、β−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、任意に、対象となるポリヌクレオチドに作動可能に連結した３’β−グロビンエンハンサーと、１つ以上のインスレーター要素、またはポリアデニル化配列を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含む。
特定の実施形態では、ベクターは、左側の（５’）ＨＩＶ−１ ＬＴＲと、プシーパッケージング配列（Ψ＋）と、ＨＩＶ−１中央区域／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）と、β−グロビンプロモーターと、β−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）と、任意に、対象となるポリヌクレオチドに作動可能に連結した３’β−グロビンエンハンサーと、１つ以上のインスレーター要素およびウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含む、レンチウイルスベクターである。
様々な実施形態では、本明細書で企図されるベクターは、副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄神経障害に対する治療をもたらすポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結した、小膠細胞において作動可能なプロモーターを含む。ベクターは、１つ以上のＬＴＲを有してよく、いずれのＬＴＲも、１つ以上の改変、例えば、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を含む。ベクターは、形質導入効率を増加させるための１つ以上のアクセサリー要素（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、および／または治療遺伝子発現を増加させる他の要素（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含み得る。
特定の実施形態では、本明細書で企図される移入ベクターは、左側（５’）レトロウイルスＬＴＲ、中央ポリプリン区域／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送要素、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小グリア細胞中で活性なプロモーター、および右側（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、左側の（５’）ＨＩＶ−１ ＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、右側の（３’）自己不活性化（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１ ＬＴＲと、ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列とを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードする。
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードする。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトβ−グロビンＬＣＲの１つ以上の要素を含む。
いくつかの実施形態では、ヒトβ−グロビンＬＣＲは、ヒトβ−グロビンＬＣＲからのＤＮａｓｅＩ超感受性部位２、３、および４を含む。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトβ−グロビン３’エンハンサー要素をさらに含む。
さらなる実施形態では、対象となる遺伝子は、抗鎌状タンパク質またはグロビン遺伝子をコードする。
特定の実施形態では、対象となる遺伝子は、ヒトβ−グロビンタンパク質、ヒトδ−グロビンタンパク質、ヒトγ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、またはヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ−グロビンタンパク質をコードする。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、およびＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである。例えば、米国特許第２０１５０３０７８６７号、Ａｒｕｍｕｇａｍ ａｎｄ Ｍａｌｉｋ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｅｄｕｃ Ｐｒｏｇｒａｍ．２０１０；２０１０（１）：４４５−５０、Ｈｏｂａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１６ １２７：８３９−８４８、Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，６００−６０７（２０１６）、Ｆｉｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５：６ ６９−８５、Ｐｅｓｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００９；１７（２）：２４５−２５２を参照されたく、これらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、特定の実施形態では、ベクターが、それらに詳述に開示され、参照される。
多くの他の異なる実施形態を本発明の現行の実施形態から適合させ得、したがって、治療用導入遺伝子または対象となる遺伝子を、造血系列以外の標的細胞型または細胞系列、例えば、神経細胞系列において発現させることが当業者には理解されよう。
Ｅ．組成物および製剤
本明細書で企図される製剤および組成物は、単独で、または１つ以上の他の治療のモダリティと組み合わせて、細胞、組織、器官、または動物に投与するための、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化された、本明細書に記載される、任意の数の形質導入した細胞または形質導入されていない細胞またはそれらの組み合わせ、ウイルスベクター、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ならびに形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤、例えば、ポロキサマー、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤、スタウロスポリン、ポリカチオン性ポリマー、およびポリカチオン性ペプチドの組み合わせを含んでよい。組成物としては、本明細書で企図される培地が挙げられるが、これに限定されず、特定の実施形態では、組成物および培地という用語は、同義語として使用され得る。
本明細書で企図される、特定のエクスビボおよびインビトロ製剤ならびに組成物は、単独で、または１つ以上の他の治療のモダリティと組み合わせて、細胞、組織、器官、または動物に投与するための、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化された、本明細書に記載される、形質導入した細胞または形質導入されていない細胞またはそれらの組み合わせ、ウイルスベクター、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤、例えば、ポロキサマー、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤、スタウロスポリン、ポリカチオン性ポリマー、およびポリカチオン性ペプチドの組み合わせを含んでよい。
本明細書で企図される特定のインビボ製剤および組成物は、単独で、または１つ以上の他の治療のモダリティと組み合わせて、細胞、組織、器官、または動物に投与するための、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化された、本明細書に記載される、ウイルスベクター、ならびに形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤、例えば、ポロキサマー、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤、スタウロスポリン、ポリカチオン性ポリマー、およびポリカチオン性ペプチドの組み合わせを含んでよい。
ある特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加物）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化された、本明細書に記載される、治療有効量の形質導入した細胞を含む、細胞集団を含む。
ある特定の他の実施形態では、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化された、本明細書に記載される、レトロウイルスベクター、ならびに形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤、例えば、ポロキサマー、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤、スタウロスポリン、ポリカチオン性ポリマー、およびポリカチオン性ペプチドを含む、組成物を提供する。
ある特定の他の実施形態では、本発明は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化された、レトロウイルスベクターおよび１つ以上のポロキサマー、例えば、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０７を含む、組成物を提供する。
特定の実施形態では、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化された、本明細書に記載される、幹または前駆細胞を含む細胞集団、レトロウイルスベクター、ならびに形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤、例えば、ポロキサマー、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤、スタウロスポリン、ポリカチオン性ポリマー、およびポリカチオン性ペプチドを含む。関連の実施形態では、細胞集団は、造血幹および前駆細胞を含む。一実施形態では、細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞を含む。一実施形態では、細胞集団は、ＣＤ３４＋選択細胞である。
好ましい実施形態では、細胞集団は、以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳのうちの１つを有するＣＤ３４＋細胞を含む。
好ましい実施形態では、細胞集団は、以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋のうちの１つを有するＣＤ３４＋細胞を含む。
好ましい実施形態では、細胞集団は、以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳのうちの１つを有するＣＤ３４＋細胞を含む。
本明細書で企図される薬学的組成物は、本明細書に記載される方法に従って生成される形質導入した細胞および薬学的に許容される担体を含む。
他の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載される、レトロウイルスベクター、ならびに形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる薬剤、ポロキサマーおよびプロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤、またはスタウロスポリン、および任意に、ポリカチオン性ポリマー、およびポリカチオン性ペプチドを含む。
一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載される、レトロウイルスベクターおよびポロキサマーおよびプロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤、ならびに任意に、ポリカチオン性ポリマー、およびポリカチオン性ペプチドを含む。
一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載される、レトロウイルスベクターおよびポロキサマーおよびスタウロスポリン、ならびに任意に、ポリカチオン性ポリマー、およびポリカチオン性ペプチドを含む。
一実施形態では、薬学的組成物は、レトロウイルスベクターおよびポロキサマーを含む。好ましい実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、またはポロキサマー４０７である。
「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与されたときにアレルギー性または同様の不都合な反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の管理機関による承認、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた動物用の薬局方、より詳細には、ヒト用の薬局方に記載されているものを含む。
「担体」という用語は、治療用細胞と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体の例示的な例は、細胞培養培地、水および油（石油、動物、植物または合成起源の油を含む、例えば、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等）のような滅菌液体であり得る。食塩溶液、ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液はまた、特に注射溶液用の液体担体として用いることができる。特定の実施形態では、好適な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。いかなる従来の媒体および薬剤でも活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物中でのその使用を企図している。補助的な活性化合物もまた、組成物中に組み込むことが可能である。
一実施形態では、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内、または筋肉内投与に適している。薬学的に許容される担体としては、滅菌水溶液、細胞培養培地、または分散剤を含む。薬学的に活性な物質へのそのような培地および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。いかなる従来の培地および薬剤でも形質導入した細胞と不適合である場合を除いて、薬学的組成物中のその使用が企図される。
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、遺伝子改変された造血幹および／または前駆細胞、薬学的に許容される担体、例えば、薬学的に許容される細胞培養培地を含む。本明細書で企図される細胞に基づいた組成物を含む組成物は、腸内または非経口投与方法によって別々に、または所望の治療目的に影響を及ぼすように他の好適な化合物と組み合わせて投与され得る。
薬学的に許容される担体は、処置されるヒト対象への投与に適したものとするために、十分に高い純度と十分に低い毒性のものである必要がある。それは、さらに、組成物の安定性を維持するか、または増加させなければならない。薬学的に許容される担体は、液体または固体であり得、計画された投与法を考慮して、組成物の他の成分と組み合わせたときに、所望の嵩、コンシステンシー等を提供するように選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、限定されないが、結合剤（例えば、糊化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウム等）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）であり得る。本明細書で企図される組成物のために他の好適な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これに限定されない。
そのような担体溶液はまた、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤を含み得る。本明細書で使用される「緩衝液」という用語は、化学組成がｐＨの著しい変化することなく、酸または塩基を中和する、溶液または液体を指す。本明細書で企図される緩衝液の例としては、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンガー液、５％ ブドウ糖液（Ｄ５Ｗ）、正常／生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、約７の治療組成物のｐＨを維持するのに十分な量で存在し得る。あるいは、治療組成物は、約６．８〜約７．４の範囲内、例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、および７．４のｐＨを有する。さらに別に実施形態では、治療組成物は、約７．４のｐＨを有する。
本明細書で企図される組成物は、非毒性の薬学的に許容される培地を含み得る。組成物は、懸濁液であり得る。本明細書で使用される「懸濁液」という用語は、細胞が、固体支持体に結合されない非接着性状態を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、撹拌または振とうされ得、培養皿等の支持体に接着されない。
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、懸濁液中に製剤化され、造血幹および／または前駆細胞は、許容される液体培地または溶液、例えば、静脈内（ＩＶ）バッグ等の生理食塩水または無血清培地内で分散される。許容される希釈剤としては、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム（生理食塩水）溶液、無血清細胞培養培地、ならびに極低温記憶装置に好適な培地、例えば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、薬学的に許容される担体は、実質的には、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質がなく、細胞集団、例えば、造血幹および前駆細胞を含む組成物を保存するのに好適である。治療組成物は、ヒト患者への投与されることが意図され、それ故に、実質的に、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、およびウシ胎仔血清等の細胞培養構成要素がない。
いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地中で製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清培地である。
無血清培地は、簡素かつより良く定義された組成物、減少した汚染物質の程度、潜在源の感染性因子の除去、およびコストの低下を含んだ、血清含有培地を上回るいくつかの利点を有する。様々な実施形態では、無血清培地は、動物質を含まず、任意に、タンパク質を含まない場合がある。任意に、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含んでもよい。「動物質を含まない」培地は、構成成分が非動物源から由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質を置換し、栄養素は、合成源、植物源、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質が実質的にないと定義される。
特定の組成物に使用される無血清培地の例示的な例としては、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ−ＶＩＶＯ １０が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、造血幹および／または前駆細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅに製剤化される。
様々な実施形態では、造血幹および／または前駆細胞を含む組成物は、凍結保存培地に製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地は、解凍後の高い細胞生存率の結果を維持するために使用され得る。特定の組成物に使用される凍結保存培地の例示的な例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ対ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む溶液中で製剤化される。
特定の実施形態では、組成物は、マイコプラズマ、内毒素、および微生物の汚染が実質的にない。内毒素が「実質的にない」とは、１日当たり体重１ｋｇ当たり５ＥＵの全内毒素、平均的な７０ｋｇのヒトの場合、細胞の全用量当たり３５０ＥＵである、生物製剤についてＦＤＡにより認可されているものより少ない、細胞の１用量当たりの内毒素が存在することを意味する。特定の実施形態では、本明細書で企図されるレトロウイルスベクターで形質導入した造血幹または前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ、または５．０ＥＵ／ｍＬを含有する。
ある特定の実施形態では、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターが挙げられるが、これに限定されない、ウイルスベクター系の送達（すなわち、ウイルス媒介性形質導入）に好適な組成物および製剤が、企図される。
エクスビボ送達のための例示的な製剤は、当該技術分野で既知の様々なトランスフェクション薬剤、例えば、リン酸カルシウム、電気穿孔、熱ショック、および種々のリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介性トランスフェクション）等の使用も含んでよい。以下でより詳細に説明されている通り、リポソームは、水性流体の画分が閉じ込められた脂質二重層である。ＤＮＡは、自発的にカチオン性リポソームの外面と会合し（その電荷によって）、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用するであろう。
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、単独で、または１つ以上の他の治療のモダリティと組み合わせて、細胞または動物に投与するための、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に製剤化された、本明細書に記載される、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる薬剤、形質導入した細胞等を含んでよい。必要に応じて、組成物は、例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、小分子、または様々な薬学的に活性な薬剤等の他の薬剤と組み合わせて投与され得ることも理解されよう。特定の実施形態では、組成物に含まれ得る他の構成成分に対する限定は、追加的な薬剤が、意図された遺伝子治療を送達する組成物の能力に悪影響を及ぼさないのであれば、実質的に存在しない。
特定の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は、本明細書に記載される特定の組成物を、例えば、腸内および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、および髄内への投与および製剤を含めた種々の治療レジメンにおいて使用するための好適な投薬および治療レジメンの開発と同様に当業者に周知である。本明細書で企図される特定の実施形態は、他の製剤、例えば、製薬技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されることが当業者によって理解され得る。
Ｆ．細胞培養組成物
全体にわたって本明細書で論じられるように、本明細書で企図される組成物および方法は、エクスビボおよびインビボでの細胞に基づいた遺伝子治療において有用である。特定の実施形態では、組成物は、培養中の細胞、すなわち、細胞培養組成物を含み得る。細胞培養組成物は、造血幹または前駆細胞を含む細胞集団、好適な細胞培養培地、および１つ以上のポロキサマーを含み得る。細胞培養組成物は、造血幹または前駆細胞を含む細胞集団、好適な細胞培養培地、１つ以上のポロキサマー、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる１つ以上の薬剤、またはスタウロスポリン、および任意に、１つ以上のポリカチオン性ポリマーを含み得る。
特定の実施形態では、培養細胞は、造血幹もしくは前駆細胞またはＣＤ３４＋細胞である。
特定の実施形態では、培養細胞は、造血幹もしくは前駆細胞、または以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳを有するＣＤ３４＋細胞である。
特定の実施形態では、培養細胞は、造血幹もしくは前駆細胞、または以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋を有するＣＤ３４＋細胞である。
特定の実施形態では、培養細胞は、造血幹もしくは前駆細胞、または以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳを有するＣＤ３４＋細胞である。
一実施形態では、細胞培養組成物は、造血幹または前駆細胞を含む細胞集団、ヒト投与に好適な細胞培養培地、およびポロキサマーを含む。一実施形態では、細胞培養組成物は、造血幹または前駆細胞を含む細胞集団、ヒト投与に好適な細胞培養培地、ポロキサマー、およびプロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤、ならびに任意に、１つ以上のポリカチオン性ポリマーを含む。
一実施形態では、細胞培養組成物は、遺伝子改変された造血幹または前駆細胞を含む細胞集団、ヒト投与に好適な細胞培養培地、およびポロキサマーを含む。
一実施形態では、細胞培養組成物は、遺伝子改変された造血幹または前駆細胞を含む細胞集団、ヒト投与に好適な細胞培養培地、ポロキサマー、およびスタウロスポリン、ならびに任意に、１つ以上のポリカチオン性ポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、薬学的に許容される細胞培養培地である。
形質導入した造血幹または前駆細胞を含む本明細書で企図される細胞培養培地は、所望の遺伝子治療に影響を及ぼすために、それを必要とする対象への全身的にまたは直接注入によって投与され得る。
Ｇ．形質導入方法
本明細書で企図される方法および組成物は、標的細胞の形質導入効率（ＴＥ）およびベクターコピー数（ＶＣＮ）を著しく増加させる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法を用いて、ＶＣＮを増加させ、有意に少ないウイルスを用いて有意に多くの細胞に形質導入し、それにより、治療細胞のゲノムにおけるゲノムの変質（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）および／または癌原遺伝子の挿入活性化のリスクを最小化することができ、一方、生成される薬物生成物の治療効果を同時に増加することができることが企図される。それ故に、本明細書で企図される組成物および方法は、より安全な遺伝子治療の生成をもたらすだけでなく、よりロバストな、治療的に有効な薬物生成物をもたらす。加えて、より効率的な形質導入は、形質導入当たりより少ないウイルスを使用することができ、それ故に、レンチウイルス遺伝子治療に対する商品原価を低下させる。
トランスフェクションによるものではなく、ウイルス感染によるレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを用いた遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列の送達は、形質導入と称される。一実施形態では、レトロウイルスベクターは、感染およびプロウイルス組み込みを通して細胞内に形質導入される。ある特定の実施形態では、細胞、例えば、標的細胞は、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用して感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合に形質導入される。特定の実施形態では、形質導入細胞は、細胞のゲノム内に、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターによって送達された１つ以上の遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、ウイルスベクターで形質導入した宿主細胞または標的細胞は、治療ポリペプチドを発現し、疾患、障害、または病態を処置および／または予防するために対象に投与される。
感染性ウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を使用して行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６２８−６３３、およびＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０−５１１３によって例示されている。
特定の実施形態では、ＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）に基づいたウイルス粒子は、産生細胞においてビリオンパッケージ要素と移入ベクターを共発現させることによって生成することができる。これらの細胞には、いくつかのプラスミドを一過性にトランスフェクトすることができる。一般には３〜５つのプラスミドが使用されるが、この数はレンチウイルス構成成分を別々の単位に分ける程度に応じてこれよりも大きくてよい。例えば、１つのプラスミドは、ＨＩＶ−１に由来するビリオンのコア構成成分および酵素構成成分をコードし得る。このプラスミドは、パッケージングプラスミドと称される。別のプラスミドは、一般には、エンベロープタンパク質（複数可）、最も一般的には、安定性が高く、トロピズムが広範にわたることに起因して水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ Ｇ）をコードする。このプラスミドは、エンベロープ発現プラスミドと称することができる。さらに別のプラスミドは、標的細胞に移入されるゲノム、すなわち、移入ベクターと呼ばれるベクター自体をコードする。パッケージングプラスミドは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含めた公知の技法によってヒト細胞系に導入することができる。この技法およびその変形により、１ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）の力価が数百万の組換えウイルスを生成することができる。超遠心分離後に、約１０８ＴＵ／ｍＬ、１０９ＴＵ／ｍＬ、１０１０ＴＵ／ｍＬ、１０１１ＴＵ／ｍＬ、１０１２ＴＵ／ｍＬ、または約１０１３ＴＵ／ｍＬの濃縮ストックを得ることができる。
感染性ウイルス粒子は、従来の技法を使用してパッケージング細胞から収集することができる。例えば、感染性粒子は、当該技術分野で公知の通り、細胞溶解、または細胞培養物の上清の収集により収集することができる。任意に、収集されたウイルス粒子は、所望であれば精製することができる。好適な精製技法は、当業者に既知であり、例えば、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２。
ウイルスを使用して、当該技術分野で周知の技法を用いてインビボ、エクスビボ、またはインビトロにおいて細胞を感染させることができる。例えば、細胞、例えば、動員末梢血細胞、骨髄細胞、ＣＤ３４＋細胞、または造血幹もしくは前駆細胞にエクスビボで形質導入するとき、ベクター粒子を細胞と一緒に、一般に、細胞１０５個当たり１×１０５〜５０×１０５形質導入単位のウイルスベクターにも対応する、１〜５０の感染多重度（ＭＯＩ）の桁の用量を用いてインキュベートすることができる。これは、当然のことながら、１ＭＯＩ、２ＭＯＩ、３ＭＯＩ、４ＭＯＩ、５ＭＯＩ、６ＭＯＩ、７ＭＯＩ、８ＭＯＩ、９ＭＯＩ、１０ＭＯＩ、１５ＭＯＩ、２０ＭＯＩ、２５ＭＯＩ、３０ＭＯＩ、３５ＭＯＩ、４０ＭＯＩ、４５ＭＯＩ、および５０ＭＯＩに対応するベクター量、およびその間の全ての整数値を包含する。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、細胞集団を形質導入するために、約１０〜約２５のＭＯＩで使用される。
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、細胞集団を形質導入するために、約１０〜約２０のＭＯＩで使用される。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、細胞集団を形質導入するために、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０のＭＯＩで使用される。
ウイルスはまた、治療を必要とする細胞、組織、または器官に直接注射することによってインビボで対象に送達することができる。直接注射には、細胞１０５個当たり１×１０５〜１００×１０５形質導入単位のウイルスベクターにも対応する、約１〜１００の感染多重度（ＭＯＩ）が必要である。これは、当然のことながら、１ＭＯＩ、２ＭＯＩ、３ＭＯＩ、４ＭＯＩ、５ＭＯＩ、６ＭＯＩ、７ＭＯＩ、８ＭＯＩ、９ＭＯＩ、１０ＭＯＩ、１５ＭＯＩ、２０ＭＯＩ、２５ＭＯＩ、３０ＭＯＩ、３５ＭＯＩ、４０ＭＯＩ、４５ＭＯＩ、５０ＭＯＩ、５５ＭＯＩ、５０ＭＯＩ、６５ＭＯＩ、７０ＭＯＩ、７５ＭＯＩ、８０ＭＯＩ、８５ＭＯＩ、９０ＭＯＩ、９５ＭＯＩ、および１００ＭＯＩに対応するベクター量、およびその間の全ての整数値を包含する。
ウイルスはまた、例えば、ｐ２４ウイルスコートタンパク質に対するＥＬＩＳＡである市販のｐ２４力価アッセイを使用することによって測定することができるウイルス力価（ＴＵ／ｍＬ）に従って送達することもできる。以下の式を用いて、ｐ２４のｐｇ／ｍＬを算出することができる：レンチウイルスの物理的粒子（ＰＰ）当たり約２０００モルのｐ２４が存在する：（２×１０３）×（ＰＰ当たり２４×１０３Ｄａのｐ２４）、４８×１０６／アボガドロ＝（４８×１０６）／（６×１０２３）＝ＰＰ当たり８×１０−１７ｇのｐ２４、１×１０−１６ｇのｐ２４当たり１ＰＰ、１ｐｇのｐ２４当たり１×１０４ＰＰ。合理的に首尾よくパッケージングされ、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされたレンチウイルスベクターは、１０００物理的粒子（ＰＰ）当たり１ＴＵ〜１００ＰＰ当たり１ＴＵ（またはそれ未満）の範囲の感染指数を有するであろう。したがって、範囲は、約１０〜１００ＴＵ／ｐｇのｐ２４である。この変換により、ＴＵ／ｍＬが得られる。
以前の経験に基づいて、直接注射するレンチウイルスの量は、総ＴＵによって決定され、部位に実施可能に注射することができる体積および注射を受ける組織の種類の両方に基づいて変動し得る。例えば、骨髄の注射部位は、非常に小さな体積のウイルスのみを注射することが可能であり、したがって、力価の高い調製物が好ましく、注射当たり約１×１０６〜１×１０７、約１×１０６〜１×１０８、１×１０６〜１×１０９、約１×１０７〜１×１０１０、１×１０８〜１×１０１１、約１×１０８〜１×１０１２、または約１×１０１０〜１×１０１２またはそれを超えるＴＵを使用することができる。しかしながら、全身送達ははるかに大きなＴＵに適応させることができ、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、または１×１０１５の負荷量を送達することができる。
本明細書で企図される組成物および方法は、本明細書に提供される組成物および方法の不在下で匹敵する形質導入効率を達成するために、上で開示されるものよりも低いウイルス力価を用いてインビトロ、エクスビボ、およびインビボで造血細胞の高い形質導入効率およびＶＣＮを提供する。
本明細書で企図されるある特定の実施形態は、形質導入効率および／またはＶＣＮが、造血細胞を、レトロウイルスおよびポロキサマーまたはポロキサマーおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤（例えば、ＷＯ２００７／１１２０８４およびＷＯ２０１０／１０８０２８を参照のこと）、ならびに任意に、ポリカチオン性ポリマーとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることによって有意に増加するという予想外の知見から生じた。
様々な実施形態では、ポロキサマーは、約２２５０ダルトン超のポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約４０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有する。
様々な実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
特定の実施形態では、ポロキサマーは、少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットの平均分子量を有し、ポロキサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
ある特定の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８である。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３５である。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー３３８である。
一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー４０７である。
形質導入した造血細胞に使用される例示的なポロキサマーの最終濃度としては、約１０μｇ／ｍＬ〜約５０００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約２５００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ、約１０００μｇ／ｍＬ、約１２５０μｇ／ｍＬ、約１５００μｇ／ｍＬ、約１７５０μｇ／ｍＬ、約２０００μｇ／ｍＬ、約２５００μｇ／ｍＬ、または約５０００μｇ／ｍＬもしくはそれ以上、およびその任意の介在濃度が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、薬剤は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ならびにその「類似体」または「誘導体」が挙げられるが、これらに限定されない、プロスタグランジンＥＰ受容体である。
一実施形態では、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤は、ＰＧＥ２である。
造血細胞を形質導入するために使用される例示的なプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路アゴニスト最終濃度としては、約１０μＭ〜約２００μＭ、約１０μＭ〜約１００μＭ、約５０μＭ〜約１００μＭ、または約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、または約１００μＭもしくはそれ以上、およびその任意の介在濃度が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ポリカチオン性ポリマーは、硫酸プロタミンまたはポリブレンである。
一実施形態では、ポリカチオン性ポリマーは、硫酸プロタミンである。硫酸プロタミンまたはポリブレンは、約５μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、または約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ、または約１５μｇ／ｍＬもしくはそれ以上の最終濃度で使用することができる。
別の実施形態では、形質導入効率および／またはＶＣＮは、細胞を、レトロウイルスおよびポロキサマーおよびスタウロスポリン、ならびに任意に、ポリカチオン性ポリマーとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させることによって有意に増加させる。
造血細胞を形質導入するために使用される例示的なスタウロスポリン最終濃度としては、約１００ｎＭ〜約１０００ｎＭ、約１１０ｎＭ〜約８００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約８００ｎＭ、約４００ｎＭ〜約８００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約４００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約５００ｎＭ、または約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、約６００ｎＭ、約７００ｎＭ、約８００ｎＭ、約９００ｎＭ、または約１０００ｎＭもしくはそれ以上、およびその任意の介在濃度が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、レトロウイルスの存在下で培養され得る造血細胞は、ポロキサマーおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤またはスタウロスポリン、ならびに任意に、ポリカチオン性ポリマーに、約１０分〜約７２時間、約３０分〜約７２時間、約３０分〜約４８時間、約３０分〜約２４時間、約３０分〜約１２時間、約３０分〜約８時間、約３０分〜約６時間、約３０分〜約４時間、約３０分〜約２時間、または約１時間〜約２時間の期間にわたって曝露させる（接触させる）ことができる。
特定の実施形態では、レトロウイルスの存在下で培養され得る造血細胞は、ポロキサマーまたはポロキサマーおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤またはスタウロスポリン、ならびに任意に、ポリカチオン性ポリマーに、約１０分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約４８時間、または約７２時間、または任意の介在時間の期間にわたって曝露させる（接触させる）ことができる。
別の実施形態では、造血細胞は、本明細書で開示される前述のいずれかの期間にわたって、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤と培養する前に、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤と培養する間に、または形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤と培養した後に、レトロウイルスと培養することができる。
ある特定の実施形態では、造血細胞が、レトロウイルスと培養する前に、レトロウイルスと培養する間に、またはレトロウイルスと培養した後に、またはそれらの任意の組み合わせで、本明細書で開示されている前述のいずれかの期間にわたって、ポロキサマーまたはポロキサマーおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤またはスタウロスポリン、ならびに任意に、ポリカチオン性ポリマーと培養することができる。
一実施形態では、造血細胞は、レトロウイルスと培養し、同時に、本明細書で開示されている前述のいずれかの期間にわたって、ポロキサマーまたはポロキサマーおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤またはスタウロスポリン、ならびに任意に、ポリカチオン性ポリマーと培養する。
さらに、当業者は、特定の実施形態では、形質導入効率およびＶＣＮが、形質導入の最初の６時間、形質導入の最初の１２時間、形質導入の最初の２４時間、形質導入の最初の４８時間、または形質導入の最初の７２時間、または形質導入のいずれかの介在期間にわたって、造血細胞を、レトロウイルスおよびポロキサマーまたはポロキサマーおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤またはスタウロスポリン、ならびに任意に、ポリカチオン性ポリマーと培養することによって増加させることが理解されよう。
ある特定の実施形態では、造血細胞が、本明細書に開示されている前述のいずれかの期間にわたって、レトロウイルスと培養する前にスタウロスポリンと培養され、洗浄し、レトロウイルスと、同時に、ポロキサマー、および任意に、ポリカチオン性ポリマーと接触することができることが企図される。
特定の実施形態では、造血細胞は、容器、バッグ、例えば、血液バッグに形質導入され、形質導入中に撹拌される。
全体にわたって開示されるように、本明細書で企図される組成物および方法は、造血細胞の形質導入効率およびＶＣＮの予想外の増加を提供し、形質導入し、典型的には、低いＶＣＮを有するのが難しいことで有名である。
様々な実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、任意の介在する割合を含んだ、形質導入効率を少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％増加させる。
様々な実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、平均ＶＣＮを、少なくとも約０．５〜少なくとも約５．０、少なくとも約０．５〜少なくとも約３、少なくとも約０．５〜少なくとも約１．０、少なくとも約１．０〜少なくとも約５．０、少なくとも約１．０〜少なくとも約３．０、または少なくとも約０．５、少なくとも約１．０、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３．０、少なくとも約３．５、少なくとも約４．０、少なくとも約４．５、または少なくとも約５．０増加させる。
様々な実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法で形質導入した造血細胞は、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の形質導入効率、および少なくとも約０．５、少なくとも約１．０、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、または少なくとも約２．５の平均ＶＣＮを有する。
特定の実施形態では、形質導入効率の増加は、ベクター単独で形質導入した造血細胞と比較して、本明細書で企図される組成物および方法で形質導入した造血細胞の少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍もしくはそれ以上の倍数富化されたことを表す。
特定の実施形態では、平均ＶＣＮの増加は、ベクター単独で形質導入した造血細胞と比較して、本明細書で企図される組成物および方法で形質導入した造血細胞のＶＣＮの少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍もしくはそれ以上の倍数富化されたことを表す。
形質導入の後に、形質導入した細胞を、細胞の維持、成長、または増殖に適した条件下で培養することができる。特定の実施形態では、形質導入した細胞を、移植前に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間培養される。
形質導入の前、形質導入の間、および／または形質導入の後に、細胞を、幹細胞または前駆細胞の増大を促進する条件下で培養することができる。当該技術分野で既知の任意の方法は、使用することができる。ある特定の実施形態では、形質導入の前、形質導入の間、または形質導入の後に、細胞を、幹細胞または前駆細胞の増大を促進する１つ以上の増殖因子の存在下で培養される。幹細胞または前駆細胞の増大を促進する増殖因子の例としては、マウス造血幹細胞の自己再生を促進することが実証されている胎児肝臓チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ３）リガンド、幹細胞因子、ならびにインターロイキン６および１１が挙げられるが、これらに限定されない。他のものとしては、骨形成タンパク質４を活性化することによって初期の造血前駆体の増殖を誘導するソニックヘッジホッグ、ＨＳＣの自己再生を刺激するＷｎｔ３ａ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＦ）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、例えば、塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８ｂ、ＦＧＦ−８ｃ、ＦＧＦ−９）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、例えば、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＡＢ、ＰＤＧＦＢＢ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ストロマ細胞由来因子（ＳＣＤＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）が挙げられる。特定の実施形態では、形質導入の前、形質導入の間、または形質導入の後に、細胞を、幹細胞または前駆細胞の増大を促進する１つ以上の増殖因子の存在下で培養する。
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、任意の細胞型の形質導入に適用できる。本明細書で企図される組成物および方法での使用に好適な細胞は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類またはヒト、およびより好ましくはヒトから得ることができ、それらは、任意の動物、好ましくは哺乳動物、およびより好ましくはヒトに移植することができる。
ある特定の実施形態は、細胞集団の単離および形質導入を企図する。本明細書で使用する、「細胞集団」という用語は、任意の数および／または組み合わせの、本明細書の他の箇所に記載の同種細胞型または異種細胞型で構成されていてよい複数の細胞を指す。例えば、造血幹または前駆細胞に形質導入するために、細胞集団を、臍帯血、胎盤血、骨髄、または末梢血から単離するまたは得ることができる。細胞集団は、形質導入される標的細胞型を約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％含んでよい。ある特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞は、異種細胞の集団から当該技術分野で既知の方法を用いて単離または精製することができる。
本明細書で企図される組成物および方法で形質導入した好ましい標的細胞型は、造血細胞、例えば、ヒト造血細胞を含む。
好ましい実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、造血幹または前駆細胞の形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために使用される。
本明細書で企図される方法および組成物で形質導入した造血細胞を得るために例示的な源としては、臍帯血、骨髄、または動員末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で企図される方法および組成物での形質導入に好適な造血細胞の例示的な例は、ＣＤ３４＋細胞を含む。本明細書で使用される、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、細胞表面上のＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される、「ＣＤ３４」は、しばしば、細胞間接着因子の役割を果たす、細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋は、造血幹細胞および前駆細胞の両方の細胞表面マーカーである。
本明細書で企図される方法および組成物での形質導入に好適な造血幹または前駆細胞のさらなる例示的な例は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−である造血細胞、ＣＤ３４＋，ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８Ｌｏ／−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、およびＬｉｎ（−）である造血細胞、およびＣＤ１３３＋である造血細胞を含む。
様々な方法が、造血階層を特徴付けるために存在する。特徴付けのある方法は、ＳＬＡＭコードである。ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）ファミリーは、遺伝子が、第１染色体（マウス）上の単一の遺伝子座に大部分がタンデムに位置し、全てが免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのサブセットに属し、最初はＴ細胞刺激に関与すると考えられていた＞１０分子の群である。このファミリーは、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４等を含み、ＣＤ１５０は創始メンバー（ｆｏｕｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ）であり、したがって、ｓｌａｍＦ１、すなわち、ＳＬＡＭファミリーメンバー１とも称される。造血階層についてのサインＳＬＡＭコードは、造血幹細胞（ＨＳＣ）−ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ２４４−、多分化能性前駆細胞（ＭＰＰ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８−ＣＤ２４４＋、系列制限前駆細胞（ＬＲＰ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８＋ＣＤ２４４＋、一般的な骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｍｉｄ、顆粒球−マクロファージ前駆体（ＧＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｈｉ、および巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４−ＣＤ１６／３２ｌｏｗである。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクターおよび組成物で形質導入するＣＤ３４＋細胞は、以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳを有する。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクターおよび組成物で形質導入するＣＤ３４＋細胞は、以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋を有する。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクターおよび組成物で形質導入するＣＤ３４＋細胞は、以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳを有する。
Ｈ．遺伝子治療法
より高い割合の形質導入細胞を含み、各細胞中の治療遺伝子のコピー数もまた高い薬物産物は、より治療的に有効な遺伝子治療を提供する。本明細書で使用する、「薬物産物」という用語は、本明細書で企図される組成物および方法を用いて産生される遺伝子改変された細胞を指す。特定の実施形態では、薬物産物は、遺伝子改変された造血幹または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞を含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、薬物産物中の治療遺伝子の量を増加させることは、インビボでの対応する遺伝子の発現がない、または最小の発現を有する、対象の治療を可能にし、それにより、対象への遺伝子治療をもたらす機会を著しく増大することができ、遺伝子治療は、以前に実行可能な治療法の選択肢ではなかった。
本明細書で企図される形質導入した細胞および対応するレトロウイルスベクターは、遺伝子治療の改善された方法を提供する。本明細書で使用する、「遺伝子治療」という用語は、細胞のゲノムへの遺伝子の導入を指す。様々な実施形態では、本発明のウイルスベクターは、造血幹細胞治療に適した単一遺伝子の疾患、障害、もしくは病態または疾患、障害、もしくは病態を有すると診断された対象またはそれを有する疑いがある対象に治癒的、予防的、または軽減的利益をもたらすポリペプチドをコードする治療用導入遺伝子を発現する造血発現制御配列を含む。
１つの好ましい実施形態では、形質導入した細胞は、脳小膠細胞（マクロファージ）に発達する可能性を含む。特定の実施形態では、造血幹細胞は、本明細書で企図されるベクターで形質導入し、リソソーム貯蔵障害、副腎白質ジストロフィー、または副腎脊髄ニューロパシーのための治療を必要とする個人に投与される。造血幹細胞は、脳小膠細胞の起源であり、それ故に、このような実施形態では、好ましい。
特定の実施形態では、形質導入した造血幹または前駆細胞は、造血系の単一遺伝子の疾患、障害、もしくは病態または疾患、障害、もしくは病態を有すると診断された対象またはそれを有する疑いがある対象に治癒的、予防的、または軽減的利益をもたらすポリペプチドをコードする治療用導入遺伝子を発現する造血発現制御配列を有するウイルスベクターを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクター、ウイルス粒子、および／または形質導入した細胞を、対象における造血系の単一遺伝子の疾患、障害、もしくは病態または疾患、障害、もしくは病態、または例えば、異常ヘモグロビン症を処置する、予防する、および／または軽減するために使用される。
本明細書で企図される特定の実施形態で用いるのに好適である単一遺伝子病およびそれらの対応する治療遺伝子（複数可）の例示的な例としては、Ｘ−ＳＣＩＤ（ＩＬ２Ｒγ）、ＡＤＡ−ＳＣＩＤ（アデノシンデアミナーゼ）、バッテン病（トリペプチジルペプチダーゼ１）、ムコ多糖症１型−フルラー症候群（アルファ−Ｌイズロニダーゼ）、ムコ多糖症２型−ハンター症候群（イズロン酸２−スルファターゼ）、ムコ多糖症３型−サンフィリポ症候群（Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ）、ムコ多糖症４Ａ型−モルキオＡ症候群（ガラクトサミン−６ スルファターゼ）、ムコ多糖症４Ｂ型−モルキオＢ症候群（ベータ−ガラクトシダーゼ）、ムコ多糖症６型−マロトー・ラミー症候群（Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ）、ゴーチェ病（グルコセレブロシダーゼ）、異染性白質萎縮症（アリールスルファターゼＡ）、慢性肉芽腫症（シトクロムｂ−２４５アルファ鎖、シトクロムｂ−２４５ベータ鎖、好中球サイトゾル因子１、好中球サイトゾル因子２、好中球サイトゾル因子４）、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質）、パーフォリン欠損（ＰＲＦ１）、ファンコニ貧血（ＦＡＮＣ遺伝子、例えば、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ）、Ｘ連鎖リンパ球増殖性症候群（ＳＨ２Ｄ１Ａ）、ＲＡＧ欠損（ＲＡＧ１／２）、アルテミスタンパク質欠損（ＤＣＬＲＥ１Ｃ）、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、および白血球接着欠損（ＣＤ１８）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する、「造血」とは、前駆細胞からの血液細胞の形成および発達、ならびに幹細胞からの前駆細胞の形成を指す。血液細胞としては、赤血球または赤血球細胞（ＲＢＣ）、網状赤血球、単球、好中球、巨核球、好酸球、好塩基球、Ｂ砂防、マクロファージ、顆粒球、マスト細胞、栓球、および白血球が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する、「異常ヘモグロビン症」または「異常ヘモグロビン症の病態」という用語は、ヘモグロビンの構造および／または合成における変化から生じる異常なヘモグロビン分子の存在下で関与する様々な遺伝性血液障害を指す。通常は、ヘモグロビンは、４つのサブユニットタンパク質：β−グロビンの２つのサブユニットおよびα−グロビンの２つのサブユニットからなる。これらのサブユニットタンパク質のそれぞれは、ヘムと呼ばれる鉄含有分子に付着（結合）し、各ヘムが、１つの酸素分子と結合することができるその中央に鉄分子を含有する。赤血球細胞内のヘモグロビンは、肺内の酸素分子と結合することができる。次いで、これらの細胞は、血流を通して移動し、体全体を通して酸素を組織に送達する。
ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）は、出生後に存在する正常なヘモグロビンの指定である。ヘモグロビンＡは、２つのアルファ鎖および２つのベータ鎖（α２β２）を有する四量体である。ヘモグロビンＡ２は、出生後に赤血球に見られるヘモグロビンの副構成成分であり、２つのアルファ鎖および２つのベータ鎖（α２δ２）からなる。ヘモグロビンＡ２は、一般に、３％未満の全赤血球ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンＦは、胎児発達中に主なヘモグロビンである。分子は、２つのアルファ鎖および２つのガンマ鎖（α２γ２）の四量体である。
最も一般的な異常ヘモグロビン症は、鎌状細胞疾患、β−サラセミア、およびα−サラセミアを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、鎌状赤血球病に罹患している対象のための遺伝子治療を提供する。「鎌状赤血球貧血」または「鎌状赤血球病」という用語は、赤血球細胞の鎌状化に起因する任意の症候性の貧血性の状態を包含すると定義される。鎌状赤血球貧血βＳ／βＳ、一般的な形態の鎌状赤血球病（ＳＣＤ）は、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）によって引き起こされる。ＨｂＳは、Ｇｌｕ６ＶａｌまたはＥ６Ｖとして知られている、β−グロビン中の６位で、バリン（Ｖ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置き換えによって生成される。グルタミン酸のバリンによる置き換えは、異常なＨｂＳサブユニットが互いにくっついて、赤血球細胞を鎌形（三日月形）の形状に曲げる長く堅い分子を形成する。鎌形状の細胞は、早期に死に、赤血球細胞の不足をもたらし得る（貧血）。加えて、鎌形状の細胞は、堅く、微小血管を遮断し、重度の痛みおよび器官損傷を引き起こす可能性がある。
β−グロビン遺伝子のさらなる突然変異はまた、β−グロビンの他の異常も引き起こし、他の種類の鎌状赤血球病をもたらし得る。β−グロビンのこれらの異常な形態は、しばしばアルファベット文字で、また時には名称で表される。これらの他の種類の鎌状赤血球病において、１つのβ−グロビンサブユニットは、ＨｂＳで置き換えられ、他のβ−グロビンサブユニットは、異なる異常変異体、例えば、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ、βＣとして記載されるβ−グロビン対立遺伝子）またはヘモグロビンＥ（ＨｂＥ、βＥとして記載されるβ−グロビン対立遺伝子）で置き換えられる。
ヘモグロビンＳＣ（ＨｂＳＣ）疾患において、β−グロビンサブユニットは、ＨｂＳおよびＨｂＣで置き換えられる。ＨｂＣは、β−グロビン遺伝子の突然変異をもたらし、ＨｂＣ疾患を有する人々に見られる優勢なヘモグロビン（α２βＣ ２）である。ＨｂＣは、アミノ酸のリジンが、β−グロビンの６位でアミノ酸のグルタミン酸を置き換えるときに生じ、Ｇｌｕ６ＬｙｓまたはＥ６Ｋとして記載される。ＨｂＣ疾患は、比較的良性であり、軽度の溶血性貧血および脾腫をもたらす。ＨｂＳＣ疾患の重症度は可変であるが、鎌状赤血球貧血と同じくらい重度であり得る。
ＨｂＥは、β−グロビンの２６位でアミノ酸のグルタミン酸をアミノ酸のリジンと置き換えるときに生じ、Ｇｌｕ２６ＬｙｓまたはＥ２６Ｋとして記載される。ＨｂＥ疾患を有する人々は、軽度の溶血性貧血および軽度の脾腫を有する。ＨｂＥは、東南アジアで極めて一般的であり、地域によっては、頻度においてヘモグロビンＡに等しい。場合によっては、ＨｂＥの突然変異は、ＨｂＳを示す。これらの場合によっては、人々は、疼痛、貧血、および異常な脾臓機能のエピソード等の鎌状赤血球貧血に関連するより重度の兆候および症状を有し得る。
ヘモグロビン鎌状−β−サラセミア（ＨｂＳＢｅｔａＴｈａｌ）として知られている他の状態は、ヘモグロビンＳおよびβ−サラセミアを生成する突然変異が一緒に生じるときに生じる。鎌状赤血球病を、ベータ−ゼロ（β０、β−グロビン生成を防ぐ遺伝子突然変異）サラセミアと組み合わせる突然変異は、重度の疾患をもたらすが、ベータ−プラス（β＋、β−グロビン生成を減少する遺伝子突然変異）サラセミアと組み合わせる鎌状赤血球病は、より軽度である。
本明細書で使用する、「サラセミア」は、ヘモグロビンの産生不全によって特徴付けられる遺伝性障害を指す。サラセミアの例は、α−およびβ−サラセミアを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、β−サラセミアを有する対象に対する遺伝子治療を提供する。β−サラセミアは、β−グロビン鎖中の突然変異によって引き起こされ、重症型または軽症型で起こり得る。β−グロビン遺伝子においてほぼ４００の突然変異は、β−サラセミアを引き起こすために見出された。突然変異のほとんどは、β−グロビン遺伝子内またはその付近で単一のＤＮＡ構築ブロック（ヌクレオチド）の変化を伴う。他の突然変異は、β−グロビン遺伝子において少数のヌクレオチドを挿入または欠失する。上述のように、β−グロビン生成を減少させるβ−グロビン遺伝子の突然変異は、ベータ−プラス（β＋）サラセミアと呼ばれる一種の状態をもたらす。細胞が任意のベータ−グロビンを生成することを防ぐ突然変異は、ベータ−ゼロ（β０） サラセミアをもたらす。β−サラセミアの重症型では、子供は出生時に正常であるが、生後１年で貧血を発症する。β−サラセミアの軽症型は、少量の赤血球細胞を生成する。サラセミアマイナーは、片親のみから遺伝子の欠損を受ける場合に生じる。障害のこの形態を有する者が、疾患の担体であり、通常、症状を有しない。
ＨｂＥ／β−サラセミアは、ＨｂＥとβ−サラセミアの組み合わせ（βＥ／β０、βＥ／β＋）から生じ、ＨｂＥ形質またはβ−サラセミア形質のいずれかで見られるよりもさらに重度な状態を引き起こす。障害は、サラセミア媒介物に分類される中等度のサラセミアを示す。ＨｂＥ／β−サラセミアは、東南アジア背景の人々において最も一般的である。
特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、α−サラセミアを有する対象に対して遺伝子治療を提供する。α−サラセミアは、世界的にかなり一般的な血液障害である。Ｈｂバート症候群およびＨｂＨ症に罹患している数千人の乳児は、毎年、特に東南アジアにおいて出生する。Α−サラセミアはまた、地中海諸国、北アフリカ、中東、インド、および中央アジアからの人々において頻繁に生じる。α−サラセミアは、典型的には、ＨＢＡ１およびＨＢＡ２遺伝子を伴う欠失から生じる。これらの遺伝子の両方は、ヘモグロビンの構成成分（サブユニット）である、α−グロビンと呼ばれるタンパク質を作製するための指示を提供する。人々は、各細胞においてＨＢＡ１遺伝子の２つのコピーおよびＨＢＡ２遺伝子の２つのコピーを有する。異なる種類のα−サラセミアは、ＨＢＡ１およびＨＢＡ２対立遺伝子のいくつかまたは全ての損失から生じる。
Ｈｂバート症候群、α−サラセミアの最も重度の形態は、４つ全てのアルファ−グロビン対立遺伝子の損失から生じる。ＨｂＨ症は、４つのα−グロビン対立遺伝子のうちの３つの損失によって引き起こされる。これらの２つの条件では、α−グロビンの不足は、細胞が正常なヘモグロビンを作製することを防ぐ。その代わりに、細胞は、ヘモグロビンバート（Ｈｂバート）またはヘモグロビンＨ（ＨｂＨ）と呼ばれる異常な形態のヘモグロビンを生成する。これらの異常なヘモグロビン分子は、体の組織に細胞を有効に運搬することができない。正常なヘモグロビンに対するＨｂバートまたはＨｂＨの置換は、貧血およびα−サラセミアに関連する他の重篤な健康問題を引き起こす。
α−サラセミアの２つのさらなる変異体は、低減された量のα−グロビンに関連する。細胞は依然として、いくつかの正常なヘモグロビンを生成するため、これらの変異体は、ほとんどまたは全く健康問題を引き起こさない傾向がある。４つのα−グロビン対立遺伝子のうちの２つの損失は、α−サラセミア形質をもたらす。α−サラセミア形質を有する人々は、異常に小さい、淡赤血球細胞および軽度の貧血を有し得る。１つのα−グロビン対立遺伝子の損失は、α−サラセミア無症状の担体において見出される。これらの個体は、典型的には、サラセミア関連兆候または症状を有しない。
好ましい実施形態では、本明細書で企図される遺伝子治療法は、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＥ症、鎌状赤血球貧血、鎌状赤血球病（ＳＣＤ）、サラセミア、β−サラセミア、サラセミアメジャー、サラセミア中間体、α−サラセミア、ヘモグロビンバート症候群、およびヘモグロビンＨ症からなる群から選択される異常ヘモグロビン症を処置する、予防する、または軽減するために使用される。
好ましい実施形態では、本明細書で企図される遺伝子治療法は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する対象における異常ヘモグロビン症を処置する、予防する、または軽減するために使用される。
様々な実施形態では、レトロウイルスベクターは、遺伝子治療を必要とする対象の細胞、組織、または器官に直接注射することによってインビボで投与される。様々な他の実施形態では、細胞は、本明細書で企図されるベクターで、インビトロまたはエクスビボで形質導入され、任意に、エクスビボで増大される。次いで、形質導入した細胞は、遺伝子治療を必要とする対象に投与される。
本明細書で企図される遺伝子治療法における形質導入および投与に好適な細胞としては、本明細書に他の箇所に記載される、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、形質導入した細胞は、本明細書に他の箇所に記載される、造血幹または前駆細胞である。
本明細書で企図される組成物および方法で用いるために好ましい細胞は、自己／自家（「自家受粉」）細胞を含む。
特定の実施形態では、遺伝子治療のための源として使用される細胞は、以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳを有する。
特定の実施形態では、遺伝子治療のための源として使用される細胞は、以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋を有する。
特定の実施形態では、遺伝子治療のための源として使用される細胞は、以下のβ−グロビン対立遺伝子：βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳを有する。
本明細書で使用される、「対象」は、遺伝子治療ベクター、細胞系治療薬、および本明細書の他の箇所で開示されている方法で治療することができる、単一遺伝子疾患、障害、または病態の症状を示す、任意の動物を含む。好ましい実施形態では、対象は、遺伝子治療ベクター、細胞系治療薬、および本明細書の他の箇所で開示されている方法で治療することができる、造血系の疾患、障害、または病態、例えば、異常ヘモグロビン症の症状を示す、任意の動物を含む。好適な対象（例えば、患者）は、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット等）、農場動物、および家畜動物またはペット（ネコまたはイヌ等）を含む。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対象には、遺伝子治療によって調節され得る、異常な量（「正常な」または「健常な」対象よりも低い量または高い量）の１つ以上の生理学的活性を呈示する動物が含まれる。
本明細書で使用する、「処置」または「処置すること」には、疾患または病状の症状または病理に対する任意の有益なまたは所望の効果を含み、治療されている疾患または病態の１つ以上の測定可能なマーカーの最小の減少を含み得る。処置は、任意に、疾患もしくは病状の症状の減少もしくは緩和、または疾患もしくは病状の進行の遅延のいずれかを含み得る。「処置」は、必ずしも疾患もしくは病状またはその関連する症状の完全な根絶または治癒を示すわけではない。
本明細書で使用する、「予防」および「予防される」、「予防している」等の類似の語句は、疾患もしくは病状の、発生または再発の可能性を予防する、阻害する、または低くするためのアプローチを示す。それはまた、疾患もしくは病状の発症または再発を遅延する、または疾患もしくは病状の症状の発生または再発を遅延することを指す。本明細書で使用する、「予防」および類似する用語もまた、疾患もしくは病状の発症または再発前に、疾患もしくは病状の強度、効果、症状、および／または負荷を減少させることも含む。
本明細書で使用する、「量」という用語は、臨床結果を含んだ、有益なまたは所望の予防または治療結果を達成するために、ウイルスまたは形質導入した治療細胞の「有効な量」または「有効な量」を指す。
「予防的に有効な量」とは、所望の予防結果を達成するために有効なウイルスまたは形質導入した治療細胞の量を指す。必ずしもそうではないが一般には、疾患の前に、または疾患のより早い段階で対象において使用されるため、予防的に有効な量は、治療的に有効な量より少ない。
ウイルスまたは形質導入した細胞の「治療的に有効な量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに、幹および前駆細胞の個体における所望の応答を引き出す能力等の要因に応じて変動してよい。治療的に有効な量はまた、ウイルスまたは形質導入した治療細胞のいかなる毒性または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「治療的に有効な量」という用語は、対象（例えば、患者）を「処置する」ために有効な量を包含する。
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むことなく、本発明のベクター、組成物、および方法によってもたらされる重要な利点は、既存の方法と比較して高い百分率の形質導入した細胞を含む細胞の集団を投与することによって達成することができる、遺伝子治療の高効率である。
形質導入した細胞は、骨髄切除療法を受けた個体または受けていない個体において骨髄移植または臍帯血移植の一部として投与することができる。一実施形態では、本発明の形質導入した細胞を、化学的切除または放射線切除骨髄療法を受けた個体に骨髄移植において投与する。
一実施形態では、ある用量の形質導入した細胞を、対象に静脈内送達する。好ましい実施形態では、形質導入した造血幹細胞を、対象に静脈内投与する。
例示的な一実施形態では、有効量の、対象に提供される形質導入した細胞は、全ての介在する用量の細胞を含んだ、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ，少なくとも６×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６細胞／ｋｇ、または少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇもしくはそれ以上の細胞／ｋｇである。
別の例示的な実施形態では、有効量の、対象に提供される形質導入した細胞は、全ての介在する用量の細胞を含んだ、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、または約１０×１０６細胞／ｋｇ、もしくはそれ以上の細胞／ｋｇである。
別の例示的な実施形態では有効量の、対象に提供される形質導入した細胞は、全ての介在する用量の細胞を含んだ、約２×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、または６×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇである。
投与量のいくつかの変動は、処置されている対象の状態に応じて必ず生じるであろう。投与に関与する者は、いずれにしても、個々の対象に対して適切な用量を決定するであろう。
様々な実施形態では、本明細書で企図されるベクター、組成物、および方法は、エクスビボで遺伝子治療および自家移植を用いた改善された遺伝子治療方法を提供する。好ましい一実施形態では、形質導入した細胞、例えば、幹または前駆細胞、例えば、造血幹または前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞。特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞を、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス形質導入効率およびＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤の存在下で、本明細書で企図されるベクターで形質導入し、形質導入した細胞を、異常ヘモグロビン症のための治療を必要とする個体に投与する。
特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞を、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス形質導入効率およびＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤の存在下で、本明細書で企図されるベクターで形質導入し、形質導入した細胞を、副腎白質ジストロフィーまたは副腎脊髄ニューロパシーのための治療を必要とする個体に投与する。
特定の実施形態では、造血幹または前駆細胞を、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス形質導入効率およびＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤の存在下で、本明細書で企図されるベクターで形質導入し、形質導入した細胞を、ＡＤＡ−ＳＣＩＤ、Ｘ−ＳＣＩＤ、バッテン病、ＭＰＳＩ、またはＭＰＳＩＩのための治療を必要とする個体に投与する。
好ましい一実施形態では、ウイルスベクター系を、赤血球系細胞または赤血球前駆体細胞中の１つ以上の治療タンパク質を高いレベルで発現するために、造血幹または前駆細胞に導入する。本明細書で企図されるレンチウイルスベクターを含んだ、レトロウイルスベクターは、例えば、グロビン遺伝子または抗鎌状タンパク質をコードする遺伝子を含んだ、対象とするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、本発明のレトロウイルスベクターで発現させるグロビン遺伝子は、β−グロビン、δ−グロビン、またはγ−グロビンである。別の実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である。別の実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子は、イントロン配列の１つ以上の欠失を含むか、または少なくとも１つの抗鎌状アミノ酸残基をコードする突然変異ヒトβ−グロビン遺伝子である。抗鎌状アミノ酸は、ヒトδ−グロビンまたはヒトγ−グロビンに由来され得る。別の実施形態では、突然変異ヒトβ−グロビン遺伝子は、コドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの突然変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）をコードする。
別の実施形態では、突然変異ヒトβ−グロビン遺伝子は、以下の突然変異の１つ以上またはその全てをコードする：コドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの突然変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）、コドン１２０におけるリジンからグルタミン酸塩への突然変異（βＡ−Ｋ１２０Ｅ）、およびコドン９５におけるリジンからグルタミン酸塩への突然変異（βＡ−Ｋ９５Ｅ）。
別の実施形態では、突然変異ヒトβ−グロビン遺伝子は、以下の突然変異の１つ以上またはその全てをコードする：コドン８７におけるトレオニンからグルタミンへの突然変異（βＡ−Ｔ８７Ｑ）、コドン１６におけるグリシンからアスパラギン酸塩への突然変異（βＡ−Ｇ１６Ｄ）、およびコドン２２におけるグルタミンからアラニンへの突然変異（βＡ−Ｅ２２Ａ）。
別の好ましい実施形態では、造血幹または前駆細胞は、本明細書で企図される方法および組成物で形質導入して、異常ヘモグロビン症の治療のための遺伝子治療を含んだ、遺伝子治療に使用された薬物生成物を得た。特定の実施形態では、作製された薬物生成物は、例えば、赤血球特異的疾患を治療するために、赤血球系細胞中の遺伝子発現の十分に安定したレベルを生成する。特定の実施形態では、薬物生成物は、例えば、鎌状赤血球病（ＳＣＤ）を含んだ、異常ヘモグロビン症を治療するために使用される。別の好ましい実施形態では、薬物生成物は、β−サラセミアが含まれるが、これに限定されない、サラセミアの治療のために使用される。
別の好ましい実施形態では、造血幹または前駆細胞は、本明細書で企図される方法および組成物で形質導入して、副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄ニューロパシーの治療のために、十分に安定したレベルのＡＢＣＤ１を発現する薬物生成物を得た。
別の実施形態では、造血幹または前駆細胞は、本明細書で企図される方法および組成物で形質導入して、ＡＤＡ−ＳＣＩＤを治療するために十分に安定したレベルのアデノシンデアミナーゼ、Ｘ−ＳＣＩＤを治療するために十分に安定したレベルのインターロイキン２受容体ガンマ、バッテン病を治療するために十分に安定したレベルのトリペプチジルペプチダーゼ１、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）を治療するために十分に安定したレベルのアルファ−Ｌイズロニダーゼ、またはムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）を治療するために十分に安定したレベルのイズロン酸２−スルファターゼを発現する薬物生成物を得た。
当業者は、有効量の、形質導入した細胞および／または本明細書で企図される形質導入効率またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤を含む組成物の適切な投与経路および適切な投与量を決定するために常套的な方法を用いることができる。ある特定の治療法では、治療をもたらすために本発明の薬学的組成物を複数回投与することが必要になることが理解されることも当業者に公知であるであろう。
造血幹および前駆細胞に基づいた遺伝子治療による治療に適した対象を治療するために使用される主な方法のうちの１つは、輸血である。したがって、本明細書で企図される組成物および方法の主要目標のうちの１つは、輸血の数を減少させるか、またはその必要性を排除することである。
特定の実施形態では、医薬品を、１回投与する。
ある特定の実施形態では、医薬品を、１年間、２年間、５年間、１０年間にわたって、またはそれを超えて、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回またはそれより多くの回数投与する。
本明細書中で引用された全ての刊行物、特許出願、および発行特許は、個々の刊行物、特許出願、または発行特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
理解を明確にする目的で図面および実施例によっていくらか詳細に上記発明を記載しているが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲を逸脱することなく、ある特定の変更および修正がなされ得ることが容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、単に例示のために提供され、限定のために提供されるものではない。当業者は、本質的に類似する結果をもたらすように変更または修正され得る、様々な重要ではないパラメータを容易に認識するだろう。
実施例１
検証アッセイ
ベクターコピー数（ＶＣＮ）および形質導入効率
洗浄した細胞を２ｍＬの幹細胞成長培地（ＳＣＧＭ）＋サイトカイン中に再懸濁し、標準的な１２ウェル非接着性組織培養プレートに移した。細胞をさらに６日間、標準の加湿組織培養インキュベーター（５％ ＣＯ２）内で維持し、次いで、ベクターコピー数（ＶＣＮ）の分析または単一細胞入れ子ＰＣＲに供して、形質導入効率を決定した。ＶＣＮおよび単一細胞入れ子ＰＣＲアッセイの両方は、ベクターおよび内因性対照遺伝子の両方に特異的なプライマーおよびプローブを用いてｑＰＣＲによって行われた。ＶＣＮは、ベクターシグナルの量を内因性対照遺伝子の量で除算することによって決定した。単一細胞入れ子ＰＣＲアッセイについて、内因性対照遺伝子に対して陽性の細胞を含んだウェルならびにベクターおよび内因性対照遺伝子の両方に対して陽性が表示された細胞を含んだウェルが計数され、表示された細胞の割合または形質導入効率を計算した。
メチルセルロースアッセイ
洗浄した細胞を２００μＬのＳＣＧＭに再懸濁し、次いで、３ｍＬのアリコートのサイトカイン補充メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｍ４４３４ Ｃｌａｓｓｉｃ）に移した。次いで、１．１ｍＬを、先の丸い１６ゲージ針を用いて並列３５ｍｍ組織培養皿に移した。皿を、標準加湿組織培養インキュベーター内で１２〜１６日間維持し、コロニーをサイズ、形態、および細胞組成物でスコア化した。次いで、個々のコロニーを、その後のＶＣＮ分析について選択するか、または３５ｍｍ皿全体の内容物をプールし、ＶＣＮ分析に供した。
ウイルス侵入の評価のためのＢｌａＭアッセイ
細胞を、Ｆ１０８、ＰＧＥ２、およびβ−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ融合タンパク質をコードするウイルスの存在下で２時間形質導入した。形質導入した後、細胞を洗浄し、蛍光β−ラクタマーゼ基質で３０〜６０分間インキュベートした。β−ラクタマーゼ切断を、フローサイトメトリーによって分析した：切断されていない基質は、ＧＦＰ＋であり、蛍光β−ラクタマーゼの切断は、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ＋シグナルをもたらす。β−ラクタマーゼ切断は、細胞へのレンチウイルス侵入を示す。Ｃａｖｒｏｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００２も参照のこと。
長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）の形質導入
レンチウイルスで形質導入したＨＳＣを、ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスに移植し、ヒト長期造血幹細胞のウイルス形質導入における候補化合物の効果を評価した。形質導入した細胞を洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、最小残留毒性を有する、副骨髄切除成体ＮＳＧマウスの尾静脈に移植した。マウスを、標準のＩＡＣＵＣ動物管理ガイドラインに従って病原体を含まない環境に収容した。４カ月後に、移植後の骨髄（ＢＭ）を、大腿骨の両方から採取し、抗ｈＣＤ４５抗体（ＢＤ＃５６１８６４）で染色することによってＶＣＮおよびヒト細胞の生着の両方について分析し、続いて、フローサイトメトリー分析について分析した。
実施例２
ＰＧＥ２で処理したヒトＣＤ３４＋細胞のインビボ分析
健常なドナー（ｎ＝３）からのＰＧＥ２で処理したレンチウイルスで形質導入したｈＣＤ３４＋細胞によるＮＳＧ移植片のメタ分析。ヒトＣＤ３４＋細胞を、部分的に骨髄除去した雌ＮＳＧマウスに移植し、移植から４カ月後の骨髄（ＢＭ）を分析した。ＢＭを、ＮＳＧマウスの両方の大腿骨から採取し、試料の半分を、４℃で、約３０分間抗ｈＣＤ４５で染色した。インキュベーション後、試料を洗浄し、抗ｈＣＤ４５抗体（ＢＤ＃５６１８６４）を用いたフロー分析を介してヒトＣＤ４５＋細胞について分析した。マウスＢＭ中のｈＣＤ４５＋細胞の割合の統計的に有意な差は、対照処理試料とＰＧＥ２処理試料との間で検出されなかった。これらの結果は、ｈＣＤ３４＋細胞のＰＧＥ２による処理がＨＳＣの生着を著しく増加しなかったことを示す。図１Ａ。生着したＰＧＥ２で処理したｈＣＤ３４＋細胞の平均ＶＣＮは、移植から４カ月後に対照細胞の平均ＶＣＮよりも約２倍高かった。図１Ｂ。
実施例３
Ｆ１０８の濃度の増加の存在下で形質導入したＨＣＤ３４＋細胞は、ウイルス侵入およびＶＣＮの用量依存的増加を示す
ｈＣＤ３４＋細胞を、硫酸プロタミンまたはＦ１０８の濃度の増加の存在下でレンチウイルスを用いて２または２４時間形質導入した。ヒトＣＤ３４＋細胞へのレンチウイルス侵入におけるＦ１０８の効果を、ＢｌａＭアッセイを用いて分析した。細胞を、β−ラクタマーゼ−Ｖｐｒ融合タンパク質をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。２時間の形質導入後、細胞を洗浄し、β−ラクタマーゼの蛍光基質でインキュベートした。次いで、細胞を、ＣＤ３４＋細胞中のレンチウイルス侵入と相関するβ−ラクタマーゼ基質切断についてフローサイトメトリーを介して分析した。フローサイトメトリー分析は、形質導入中のＦ１０８の濃度の増加が、ｈＣＤ３４＋細胞へのＬＶＶ侵入を増加させ、切断したＢｌａＭ基質を有する細胞の割合の増加として観察されたことを示した。増加したレンチウイルス侵入の効果は、Ｆ１０８が６２．５〜２００μｇ／ｍＬで平坦であると思われる。図２Ａ。ＣＤ３４＋細胞を、β−グロビンをコードするＬＶＶで形質導入した。２４時間後、細胞を洗浄し、１４日間培養するためにＭｅｔｈｏＣｕｌｔに播種した。１４日後、プールしたコロニーをＶＣＮについて分析した。形質導入中のＦ１０８の濃度の増加は、対照処理細胞と比較して、ＶＣＮを増加させた。図２Ｂ。
実施例４
Ｆ１０８の存在下で形質導入したＣＤ３４＋細胞は、細胞生存率の低下を示さない
ｈＣＤ３４＋細胞を、ベクター、Ｆ１０８、およびＰＧＥ２で２４時間形質導入し、続いて、１４日間のＭｅｔｈｏＣｕｌｔで培養した。ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中のコロニーを、ＳＴＥＭｖｉｓｉｏｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて計数した。Ｆ１０８単独、ＰＧＥ２単独、ならびにＦ１０８およびＰＧＥ２の組み合わせの存在下で形質導入したＣＤ３４＋細胞は、形質導入した細胞のコロニー形成能力は、変化せず、細胞生存率または分化能力に対する実質的な効果を示さない。図３。
実施例５
ブロックコポリマーによる形質導入
ｈＣＤ３４＋細胞を、硫酸プロタミンまたはプルロニックＦ６８の濃度の増加の存在下で、ＬＶＶで２または２４時間形質導入した。２時間の形質導入後、細胞を洗浄し、ＢｌａＭ侵入アッセイのために処理した。フロー分析は、形質導入中のｈＣＤ３４＋細胞へのＦ６８の添加は、ＬＶＶ侵入に悪影響を及ぼすことを示した。図４Ａ。
２４時間の形質導入後、細胞を洗浄し、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔで１４日間培養した。プールしたコロニーを収集し、ＶＣＮについて分析した。形質導入中のＦ６８の存在は、ｈＣＤ３４＋細胞のＶＣＮに影響を及ぼさない。したがって、ウイルス侵入およびＶＣＮを増加させるＦ１０８の能力は、全てのポロキサマーブロックコポリマーの特性ではない。図４Ｂ。
実施例６
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、ＬＶＶで形質導入したＨＣＤ３４＋細胞中のＶＣＮおよび形質導入効率を増加させる
ｈＣＤ３４＋細胞を、硫酸プロタミン、ＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはＦ１０８とＰＧＥ２の組み合わせの存在下で、ＬＶＶで２４時間形質導入した。形質導入後、細胞を洗浄し、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔで１４日間またはサイトカイン含有培地で７日間培養した。
１４日間のＭｅｔｈｏＣｕｌｔで培養した後、プールしたコロニーを収集し、ＶＣＮについて分析した。平均ＶＣＮデータを、形質導入培地中で硫酸プロタミンを使用する標準的な形質導入手順と比較して、ＶＣＮの倍数増加として示す。図５Ａ。形質導入へのＰＧＥ２の添加は、ＶＣＮの２倍の増加をもたらす。Ｆ１０８の添加は、ＰＧＥ２の添加より効率が良く、Ｆ１０８とＰＧＥ２の組み合わせは、ＶＣＮの予想外の増加をもたらす。さらに、Ｆ１０８とＰＧＥ２の組み合わせは、Ｆ１０８の濃度が、６２．５μｇ／ｍＬまたは１０００μｇ／ｍＬのいずれかであるときに有効である。
７日間の液体培養後、細胞を収集し、単一細胞を９６ウェルプレートに分類した。細胞を溶解し、入れ子ＰＣＲに供して、単一細胞中のＬＶＶの存在を決定した。ＬＶＶおよび内因性対照遺伝子の両方を含有する細胞の割合は、内因性対照遺伝子を含有する細胞数から決定された。ＬＶＶの形質導入効率は、Ｆ１０８単独で形質導入した細胞または対照処理細胞と比較して、Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入したｈＣＤ３４＋細胞において増加した。図５Ｂ。
実施例７
Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入したＨＣＤ３４＋細胞の個々のコロニー分析は、形質導入効率およびＶＣＮの増加を示す
ｈＣＤ３４＋細胞を、ＰＧＥ２、Ｆ１０８、またはＰＧＥ２とＦ１０８の組み合わせの存在下で、ＬＶＶで２４時間形質導入した。次いで、形質導入した細胞を、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で１４日間培養した。培養後、個々のコロニーを選択し、ＶＣＮについて分析した。ＰＧＥ２とＦ１０８の組み合わせは、平均ＶＣＮの増加、およびＶＣＮ＝０でコロニー数の実質的な減少ももたらす。図６Ａおよび６Ｂ。これらのデータは、ｈＣＤ３４＋細胞の形質導入効率が、形質導入中の併用療法により増加したことをさらに支持する。
実施例８
固定されたＦ１０８濃度と組み合わせて、ＰＧＥ２の濃度の増加の存在下で形質導入したＨＣＤ３４＋細胞は、ＶＣＮを増加させない
ｈＣＤ３４＋細胞を、硫酸プロタミンまたはＦ１０８のいずれかおよびＰＧＥ２の濃度の増加の存在下で、ＬＶＶで２４時間形質導入した。２４時間後、細胞を洗浄し、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で１４日間播種した。次いで、プールしたコロニーを収集し、ＶＣＮについて分析した。硫酸プロタミンの存在下で、ＰＧＥ２の濃度の増加は、ＶＣＮの用量依存性増加をもたらした。しかしながら、Ｆ１０８の存在下で、ＰＧＥ２の濃度の少なくとも１０倍の増加は、ＶＣＮの用量依存性増加をもたらさない。図７。
実施例９
Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入したＨＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬＯＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ細胞は、形質導入効率の増加を示す
バルク細胞調製物を、ベクターまたはベクター、Ｆ１０８、およびＰＧＥ２の存在下で、２４時間形質導入した。形質導入後、細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ細胞）に対して抗体で染色した。次いで、染色した細胞を、Ｓｏｎｙ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒを用いて分類した。各バルク細胞試料について、約２０，０００個の細胞を、前方散乱および側方散乱ゲートから分類した。さらに、１０，０００〜１６，０００個の細胞を、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ細胞（表現型ＨＳＣ）した各試料から分類した。次いで、分類した細胞を、分類からの偽の形質導入を含まないように、さらに４日間サイトカイン含有培地中で培養した。培養後、細胞を９６ウェルプレートに分類した単一細胞であり、単一細胞ＰＣＲアッセイを介して分類して、形質導入効率を評価した。標準的な形質導入手順で形質導入したバルク細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ細胞の形質導入効率（ｎ＝２）は、等価であった。Ｆ１０８およびＰＧＥ２で形質導入したバルク細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ細胞の形質導入効率（ｎ＝２）もまた、等価であった。さらに、Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入したバルク細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ細胞の両方の形質導入効率は、標準的な形質導入条件下でこれらの細胞試料の形質導入効率よりも約３〜４倍高かった。図８。
実施例１０
Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入したＨＣＤ３４＋細胞は、懸濁培養から調製されたレンチウイルスで形質導入効率の増加を示す
実施例２〜９は、接着細胞培養から調製されたレンチウイルスを用いて行われた。この例では、レンチウイルスを、懸濁培養から生成した。レンチウイルス精製スキームは、懸濁培養と比較して接着細胞培養から調製されたレンチウイルスの間で異なるが、生成および精製の違いは、Ｆ１０８とＰＧＥ２の組み合わせが１４日目のＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培養細胞中のＶＣＮを増加させる能力に影響を及ぼさなかった。Ｆ１０８単独でＶＣＮの約２倍増加であり、Ｆ１０８とＰＧＥ２の組み合わせが、標準的な形質導入方法にわたって約５倍増加をもたらす。図９。
実施例１１
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、インビボでＨＣＤ３４＋細胞の形質導入を増加させる
ｈＣＤ３４＋細胞（標準条件下で０．３のＶＣＮ）の低い形質導入細胞ロットを、硫酸プロタミン、ＰＧＥ２、Ｆ１０８（２００μｇ／ｍＬまたは１０００μｇ／ｍＬ）、またはＰＧＥ２とＦ１０８の組み合わせの存在下で、レンチウイルスベクターで２４時間形質導入した。形質導入した後、細胞を洗浄し、ブスルファンで処理したＮＳＧマウスに直ちに注入した。
移植片からの細胞のアリコートを、ＶＣＮおよび形質導入効率分析のために保持した。ＰＧＥ２およびＦ１０８で処理したｈＣＤ３４＋細胞は、硫酸プロタミンで処理した対照細胞と比較して、平均ＶＣＮを約３倍増加した。図１０Ａ。ＶＣＮは、ＰＧＥ２およびＦ１０８を組み合わせて使用したときにさらに増加した。図１０Ａ。個々のコロニーｑＰＣＲ分析を使用して、様々な薬剤で処理したｈＣＤ３４＋細胞の形質導入効率を測定した。ｈＣＤ３４＋細胞の形質導入効率は、約２０％（対照、硫酸プロタミン）〜約４０％（ＰＧＥ２またはＦ１０８で処理した細胞）、または約６５〜８０％（ＰＧＥ２およびＦ１０８で処理した細胞）を増加した。図１０Ｂ。
移植から２カ月後、５匹のマウス／群を殺処分し、ＢＭを採取し、分析して、インビボでのＶＣＮを評価した。硫酸プロタミンの存在下で形質導入した生着した細胞のインビボでのＶＣＮは、移植片ＶＣＮ（約０．３）と非常に類似していた。インビボでのＶＣＮは、ＰＧＥ２で処理した細胞中で約２倍増加した。単独でまたはＰＧＥ２の組み合わせのいずれかでＦ１０８で処理した細胞は、約１．２のインビボでのＶＣＮの同等の増加、標準的な形質導入条件（硫酸プロタミン）下での４倍の改善を示した。図１０Ｃ。インビボでのＶＣＮの相対的増加は、移植片の相対的形質導入効率に相当する。
移植から４カ月後、５匹のマウス／群を殺処分し、ＢＭを採取し、分析して、インビボでのＶＣＮを評価した。硫酸プロタミンの存在下で形質導入した生着した細胞のインビボでのＶＣＮは、移植片ＶＣＮ（約０．３）と非常に類似していた。インビボでのＶＣＮは、ＰＧＥ２で処理した細胞中で約１．６倍増加した。単独でまたはＰＧＥ２の組み合わせのいずれかでＦ１０８で処理した細胞は、約１．０〜１．２のインビボでのＶＣＮの同等の増加、標準的な形質導入条件（硫酸プロタミン）下での約２．６〜約３倍の改善を示した。図１０Ｄ。
移植から４カ月後に測定したインビボでのＶＣＮの相対的増加は、移植片の相対的形質導入効率に相当する。
実施例１２
Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下で処理されたＨＣＤ３４＋細胞の生着および分化能
移植から２カ月および４カ月後、ＢＭを、実施例１１において考察された移植マウスから採取した。ＢＭを、ｈＣＤ３４＋細胞の生着について分析した。細胞を、様々な細胞表面マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＣＤ３、ＣＤ１９）を認識する抗体カクテルで染色し、フローサイトメトリーを介して分析した。全ての群は、高レベル（約８０％）のｈＣＤ３４＋生着を示し、Ｆ１０８またはＰＧＥ２の統計学的に有意な効果はなかった。図１１Ａ〜Ｅ。さらに、処理（Ｆ１０８、ＰＧＥ２、または組み合わせ）にもかかわらず、骨髄性（ＣＤ３３＋）またはリンパ球様（ＣＤ３＋もしくはＣＤ１９＋）細胞の割合の有意差がなかった。これらのデータは、ＶＣＮエンハンサー、例えば、Ｆ１０８、ＰＧＥ２が、形質導入したｈＣＤ３４＋細胞の生着する能力に影響を及ぼさないか、または生着細胞の分化の可能性を非対称にしなかった。
実施例１３
Ｆ１０８およびスタウロスポリンは、ＬＶＶで形質導入したＨＣＤ３４＋細胞中のＶＣＮを増加させる
ｈＣＤ３４＋細胞を、硫酸プロタミン（標準）、スタウロスポリン、Ｆ１０８、またはＦ１０８とスタウロスポリンの組み合わせの存在下で、ＬＶＶで２４時間形質導入した。形質導入した後、細胞を洗浄し、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で１４日間培養した。
１４日間のＭｅｔｈｏＣｕｌｔで培養した後、プールしたコロニーを収集し、ＶＣＮについて分析した。ＶＣＮデータを、形質導入培地中で硫酸プロタミンを使用する標準的な形質導入手順と比較して、ＶＣＮの倍数増加として示す。形質導入へのＦ１０８の添加は、ＶＣＮの２倍増加をもたらし、スタウロスポリンの添加は、Ｆ１０８の添加より効率が良く、Ｆ１０８とスタウロスポリンの組み合わせは、Ｆ１０８またはスタウロスポリン単独での処理と比較して、ＶＣＮの予想外の増加をもたらす。図１２。
実施例１４
Ｆ１２７単独でまたはＰＧＥ２の組み合わせの存在下で形質導入したＨＣＤ３４＋細胞は、ＶＣＮを増加させる
ｈＣＤ３４＋細胞を、ＰＧＥ２を有するまたは有しない、硫酸プロタミンまたは２つのポロキサマー、Ｆ１０８またはＦ１２７の１つの存在下で、ＬＶＶで２４時間形質導入した。Ｆ１２７は、Ｆ１０８よりも高い分子量を有する。
２４時間後、細胞を洗浄し、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で１４日間播種した。次いで、プールしたコロニーを収集し、ＶＣＮについて分析した。Ｆ１０８は、硫酸プロタミンと比較してＶＣＮを約２倍増加させ、ＰＧＥ２の存在下でＶＣＮをさらに増加させる。別のポロキサマーであるＦ１２７は、硫酸プロタミンと比較して、２つの試験した濃度である１００μｇ／ｍＬおよび１０００μｇ／ｍＬでＶＣＮを約２倍増加した。さらに、ＰＧＥ２と組み合わせたＦ１２７は、Ｆ１０８とＰＧＥ２の組み合わせと同様にＶＣＮを増加した。図１３。対照的に、Ｆ１０８のほぼ半分の分子量を有するＦ６８（実施例５を参照のこと）は、ｈＣＤ３４＋細胞のＶＣＮまたは形質導入効率を増加しない。
実施例１５
Ｐ１０５単独でまたはＰＧＥ２の組み合わせの存在下で形質導入したＨＣＤ３４＋細胞は、ＶＣＮを増加させる
ｈＣＤ３４＋細胞を、ＰＧＥ２を有する、硫酸プロタミンまたは２つのポロキサマーであるＦ１０５またはＦ１０８の１つのいずれか、およびＦ１０５の存在下で、ＬＶＶで２４時間形質導入した。Ｆ１２７は、Ｆ１０８よりも高い分子量を有する。
２４時間後、細胞を洗浄し、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で１４日間播種した。次いで、プールしたコロニーを収集し、ＶＣＮについて分析した。Ｐ１０５は、硫酸プロタミン（標準）と比較して濃度試験の両方でＶＣＮを約３倍増加し、ＰＧＥ２の存在下でＶＣＮをさらに増加させる。図１４。対照的に、Ｆ６８（実施例５を参照のこと）は、ｈＣＤ３４＋細胞のＶＣＮまたは形質導入効率を増加しない。
実施例１６
ＨＣＤ３４＋細胞中でＶＣＮを増加させるポロキサマー
ｈＣＤ３４＋細胞を、動員末梢血から濃縮し、ＰＧＥ２の添加を有するおよびそれを有しない、硫酸プロタミン、またはＰ１０５、Ｆ１２７、Ｆ１０８、もしくはＦ９８のいずれかの存在下で、ＬＶＶで２４時間形質導入した。次いで、細胞をＳＣＧＭ中で培養して、細胞成長をモニタリングし、コロニー形成およびＶＣＮ分析においてＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で播種した。Ｐ１０５、Ｆ１２７、Ｆ１０８、およびＦ９８は、細胞が成長する能力に影響を与えない。Ｐ１０５、Ｆ１２７、Ｆ１０８、またはＦ９８による硫酸プロタミンの置換は、ＶＣＮを増加させ、ＰＧＥ２の添加でさらに増加させた。図１５。
実施例１７
ＨＣＤ３４＋細胞のＶＣＮを増加させ、細胞生存率を減少させるポロキサマー
ｈＣＤ３４＋細胞を、動員末梢血から濃縮し、ＰＧＥ２の添加を有するおよびそれを有しない、硫酸プロタミン、またはＰ１２３、Ｐ１０４、Ｌ１０１、もしくはＦ１０８のいずれかの存在下で、ＬＶＶで２４時間形質導入した。次いで、細胞をＳＣＧＭ中で培養して、細胞成長をモニタリングし、コロニー形成およびＶＣＮ分析においてＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で播種した。Ｐ１２３、Ｐ１０４、またはＬ１０１による硫酸プロタミンの置換は、ＶＣＮを増加させるが、細胞成長も減少した。ＰＧＥ２は、Ｐ１２３と組み合わせてＶＣＮをさらに増加した。ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ試料中の不十分なコロニー形成のため、ＶＣＮを、Ｐ１２３およびＬ１０１に対して、７日目に、ＳＣＧＭ培地から計算した。図１６。
実施例１８
ＶＣＮを増加させない、またはＨＣＤ３４＋細胞の細胞生存率に影響を及ぼさないポロキサマー
ｈＣＤ３４＋細胞を、動員末梢血から濃縮し、ＰＧＥ２の添加を有するおよびそれを有しない、硫酸プロタミン、またはＦ８７、Ｆ８８、Ｆ６８、もしくはＦ１０８のいずれかの存在下で、ＬＶＶで２４時間形質導入した。次いで、細胞をＳＣＧＭ中で培養して、細胞成長をモニタリングし、コロニー形成およびＶＣＮ分析においてＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で播種した。Ｆ８７、Ｆ８８、およびＦ６８は、細胞成長に影響を及ぼさない、またはＶＣＮを増加しない。図１７。
実施例１９
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、β０／β０ＨＣＤ３４＋細胞のＶＣＮを増加させる
ｈＣＤ３４＋細胞を、β０／β０遺伝子型を有する患者の動員末梢血から濃縮し、２００μｇ／ｍＬのＦ１０８および１０μＭのジノプロストン（ＰＧＥ２）の存在下で、２０のＭＯＩでヒトβＡ−Ｔ８７ＱをコードするＢＢ３０５の臨床的ＬＶＶで２４時間形質導入した。形質導入したｈＣＤ３４＋細胞のアリコートを、サイトカイン補充ＳＣＧＭ中で、７日間エクスビボで培養して、％ＬＶＶ＋細胞を決定するために非統合ＬＶＶ配列を取り除くか、または細胞を、コロニー形成およびＶＣＮ分析のためにＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で１４日間培養した。
％ＬＶＶ＋：単一細胞を、ＦＡＣＳによって単離し、溶解緩衝液を含有する９６ウェルプレート中で沈殿した。溶解後、β−グロビン変異体をコードするレンチウイルスベクターからのウイルス特異的配列を、ベクターに存在しない対照ゲノム配列と一緒にＰＣＲによって増幅した。次いで、各単一細胞からのＰＣＲ生成物を、ゲノム配列の存在についてｑＰＣＲにより分析し、首尾よく捕捉した細胞を示した。各捕捉した細胞について、ｑＰＣＲを使用して、ウイルス配列もまた、存在するかどうか特定し、細胞がレンチウイルスベクターで形質導入したことを示した。次いで、ベクター陽性細胞の画分を、標本化細胞の全体を通して計算した。β０／β０ ｈＣＤ３４＋細胞の％ＬＶＶ＋は、約７７％であった。図１８、右パネル。
ＶＣＮ：１４日目で、コロニーを選択し、単一細胞入れ子ＰＣＲアッセイに供されて、ＶＣＮを決定した。ｈＣＤ３４＋細胞のＶＣＮは、二倍体ゲノム当たり約２．９コピーであった。図１８、左パネル。
実施例２０
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、赤血球分化したβ０／β０ＨＣＤ３４＋細胞の除核を増加させる
ｈＣＤ３４＋細胞を、動員末梢血から濃縮し、ＰＧＥ２を有する、硫酸プロタミンまたはＦ１０８のいずれかの存在下、２０のＭＯＩで、ＬＶＶを用いて２４時間形質導入した。形質導入したｈＣＤ３４＋細胞を、赤血球の増大培地中で７日間播種し、続いて、赤血球分化培地を１０日間播種した。次いで、分化した細胞を遠心分離によって採取し、ＤＲＡＱ５ ＤＮＡ色素で染色し、ＦＡＣＳによって分析して、ＤＮＡ陰性核細胞の画分を定量化した。Ｆ１０８とＰＧＥ２との組み合わせは、β０／β０ドナーからの除核した赤血球系細胞の数を、健常なドナーから除核した赤血球系細胞を正常に近い数まで復元した。図１９。
実施例２１
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、赤血球分化したβ０／β０ＨＣＤ３４＋細胞中で％ＨＢＡを増加させる
ｈＣＤ３４＋細胞を、動員末梢血から濃縮し、ＰＧＥ２を有する、硫酸プロタミンまたはＦ１０８のいずれかの存在下、２０のＭＯＩでＬＶＶを用いて２４時間形質導入した。形質導入したｈＣＤ３４＋細胞を、赤血球の増大培地中で７日間播種し、続いて、赤血球分化培地を１０日間播種した。次いで、分化した細胞を遠心分離によって採取し、ＤＲＡＱ５ ＤＮＡ色素で染色し、ＦＡＣＳによって分析して、ＤＮＡ陰性核細胞の画分を定量化した。また、分化した細胞をＡＣＫ緩衝液中で溶解し、溶解物を、イオン交換ＨＰＬＣによって分析して、ヘモグロビンＡタンパク質（ＨｂＡ）の画分を定量化した。Ｆ１０８とＰＧＥ２との組み合わせは、β０／β０ドナーからのＨｂＡのレベルを、健常なドナーにおける正常に近いＨｂＡレベルに復元した。図２０。
実施例２２
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、ＳＣＤ患者のＨＣＤ３４＋細胞のＶＣＮを増加させる
ｈＣＤ３４＋細胞を、ＳＣＤ患者の骨髄から採取した。細胞を、２００μｇ／ｍＬのＦ１０８および１０μＭのジノプロストン（ＰＧＥ２）の存在下で、３０のＭＯＩでヒトβＡ−Ｔ８７ＱをコードするＢＢ３０５の臨床的ＬＶＶで２４時間形質導入した。形質導入したｈＣＤ３４＋細胞のアリコートを、サイトカイン補充ＳＣＧＭ中、７日間エクスビボで培養して、％ＬＶＶ＋細胞を決定するために非統合ＬＶＶ配列を取り除くか、または細胞を、コロニー形成およびＶＣＮ分析のためにＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中で１４日間培養した。
％ＬＶＶ＋：単一細胞を、ＦＡＣＳによって単離し、溶解緩衝液を含有する９６ウェルプレート中で沈殿した。溶解後、β−グロビン変異体をコードするレンチウイルスベクターからのウイルス特異的配列を、ベクターに存在しない対照ゲノム配列と一緒にＰＣＲによって増幅した。次いで、各単一細胞からのＰＣＲ生成物を、ゲノム配列の存在についてｑＰＣＲにより分析し、首尾よく捕捉した細胞を示した。各捕捉した細胞について、ｑＰＣＲを使用して、ウイルス配列もまた、存在するかどうか特定し、細胞がレンチウイルスベクターで形質導入したことを示した。次いで、ベクター陽性細胞の画分を、標本化細胞の全体を通して計算した。ＳＣＤ ｈＣＤ３４＋細胞の％ＬＶＶ＋は、約８３％であった。
ＶＣＮ：１４日目で、コロニーを選択し、単一細胞入れ子ＰＣＲアッセイに供されて、ＶＣＮを決定した。ｈＣＤ３４＋細胞のＶＣＮは、二倍体ゲノム当たり約３．３コピーであった。
実施例２３
Ｆ１０８は、コロニー分化を大幅に変化しない
ヒトＣＤ３４＋細胞を、８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（Ｆ１０８Ｈｉ／ＰＳ）と組み合わせて、８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（ＰＳ）、１０μｇ／ｍＬのＦ１０８（Ｆ１０８Ｌｏ）、１０００μｇ／ｍＬのＦ１０８（Ｆ１０８Ｈｉ）、または１０００μｇ／ｍＬのＦ１０８で形質導入した。コロニーを計数し、赤血球または骨髄系統であると判定された。ＰＳまたはＦ１０８は、造血前駆体がコロニーを形成する能力を著しく影響しなかった。図２１。
実施例２４
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、表現型ＨＳＣＳにおけるレンチウイルス形質導入を増加させる。
ヒトＣＤ３４＋細胞を、ＧＦＰレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）で形質導入し、続いて、サイトカイン含有培地中で培養した。培養の４日後、これらの細胞を、長期ＨＳＣを表現型的に特徴付ける細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋）に対して染色した。形質導入した細胞のフローサイトメトリー分析は、ＧＦＰを発現する細胞の割合が、硫酸プロタミンを用いた標準的な形質導入条件で形質導入したとき、約３０％であり、ＰＧＥ２の添加により４５％まで増加したことを示した。形質導入した表現型長期ＨＳＣの割合は、ＰＧＥ２の補充を有するまたは有しない、Ｆ１０８の存在下で形質導入した細胞中の＞９０％まで増加した。図２２。
実施例２５
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、異なる形質導入度を有するＨＳＣロットにわたってＶＣＮを増加させる
ヒトＣＤ３４＋細胞ロットは、硫酸プロタミン（ＰＳ）の存在下で、レンチウイルスで形質導入することによって低度、中等度、または高度のトランスデューサーとして分類された。低度のトランスデューサー細胞ロットは、０．５コピー／二倍体ゲノム（ｃ／ｄｇ）以下のＶＣＮを有し、中等度のトランスデューサー細胞ロットは、０．５ｃ／ｄｇ〜１．０ｃ／ｄｇのＶＣＮを有し、高度のトランスデューサー細胞ロットは、１ｃ／ｄｇ以上のＶＣＮを有した。
低度、中等度、または高度のトランスデューサーを表す、３つの細胞ロット（６２９、７０２、および０１０）は、それぞれ、２５または５０のＭＯＩでＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５ベクターで形質導入した。細胞を、標準的な形質導入条件（ＰＳ）を用いて、またはＦ１０８およびＰＧＥ２で形質導入した。ＶＣＮの増加は、細胞をＰＳの存在下で形質導入したとき、細胞ロットの形質導入度の増加と相関していたが、細胞をＦ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入したとき、相関していなかった。データは、より低い形質導入している細胞ロットが、Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下でより高い形質導入している細胞ロットよりも高いＶＣＮの増大を受けることを示し、ＶＣＮの増大効果が頭打ちになり、薬物生成物ＶＣＮの近くの正規化をもたらしたことを示唆している。図２３。
実施例２６
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、Ｘ−ＳＣＩＤレンチウイルスベクターで形質導入したＨＣＤ３４＋細胞中の形質導入効率およびＶＣＮを増加させる
ヒトＣＤ３４＋細胞を、ＩＬ２Ｒγをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、ＥＦ１αプロモーターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）で形質導入した。ＬＶＶを、一過性トランスフェクション（一過性）によって調製したか、または産生細胞株（ＰｒＣＬ１およびＰｒＣＬ２）によって産生した。細胞を、サイトカイン含有培地中で４８時間予備刺激し、８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（ＰＳ）または２００μｇ／ｍＬのＦ１０８および１０μＭのＰＧＥ２のいずれかの標準的な形質導入条件を用いて、１０または３０のＭＯＩで２４時間形質導入した。形質導入した後、細胞をメチルセルロース中に播種し、約１４日間培養して、造血前駆体コロニー形成を可能にした。計数のためにコロニーを画像化し、ＶＣＮ分析のためにプールしたか、または個々のコロニーを、個々のコロニーｑＰＣＲのために選び出して、平均ＶＣＮおよび形質導入したコロニーの割合（％ＬＶＶ＋）を決定した。
硫酸プロタミン中の形質導入は、１．５未満のＶＣＮをもたらし、ＶＣＮは、ＰｒＣＬ１から生成された一時的に調製されたＬＶＶまたはＬＶＶに対するＭＯＩの増加に伴って増加したが、ＬＶＶをＰｒＣＬ２から生成したときには増加しなかった（図２４、左上パネル）。硫酸プロタミンの形質導入は、一時的に調製されたＬＶＶに対する約５０〜６０％のＬＶＶ＋コロニーをもたらし、ＰｒＣＬ１またはＰｒＣＬ２からのＬＶＶを使用したとき、約２０〜３０％のＬＶＶ＋コロニーをもたらした（図２４、上中央パネル）。硫酸プロタミンは、コロニー形成に著しく影響を与えなかった（図２４、右上パネル）。Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下での形質導入は、一時的に調製されたＬＶＶに対して１０のＭＯＩで２倍超のＶＣＮを増加し、一時的に調製されたＬＶＶ、およびＰｒＣＬ１またはＰｒＣＬ２から生成されたＬＶＶに対して３０のＭＯＩで４倍超のＶＣＮを増加した（図２４、左下パネル）。加えて、Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下で３０のＭＯＩでの形質導入は、一時的に調製されたＬＶＶ、およびＰｒＣＬ１から生成されたＬＶＶに対して９５％超のＬＶＶ＋コロニーを得た（図２４、下中央パネル）。Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、コロニー形成に著しく影響を与えなかった（図２４、右下パネル）。
実施例２７
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、トリペプチジルペプチダーゼ（ＴＰＰ１）レンチウイルスベクターで形質導入したＨＳＣＳ中の形質導入効率およびＶＣＮを増加させる
ヒトＣＤ３４＋細胞を、ＴＰＰ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、ＥＦ１αプロモーターまたはＭＮＤプロモーターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）で形質導入した。細胞を、サイトカイン含有培地中で４８時間予備刺激し、８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（ＰＳ）または２００μｇ／ｍＬのＦ１０８および１０μＭのＰＧＥ２のいずれかの標準的な形質導入条件を用いて、５または１５のＭＯＩで２４時間形質導入した。形質導入した後、細胞をメチルセルロース中に播種し、約１４日間培養して、造血前駆体コロニー形成を可能にした。コロニーを、ＶＣＮ分析のためにプールした。
硫酸プロタミンの形質導入は、１．５未満のＶＣＮを得、ＶＣＮはＭＯＩの増加に伴って増加した。ＶＣＮの実質的増加が、いずれかのＭＯＩでＦ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入した細胞において観察された（図２５、左上パネル）。形質導入した細胞をサイトカイン中で７日間培養した後、細胞ペレットおよび上清をＴＰＰ−１活性についてアッセイした。ＴＰＰ−１活性は、より高いＶＣＮを有する細胞、すなわち、Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下で形質導入した細胞中でより高かった（図２５、上中央および右上パネル）。
マウス系統枯渇骨髄を、ＰＳまたはＦ１０８およびＰＧＥ２の存在下で、５、１５、または３０のＭＯＩでＭＮＤ−ＴＰＰ１ ＬＶＶで形質導入した。ＶＣＮを、５、１５、または３０の全てのＭＯＩで７日目にサイトカインで培養した細胞中で増加した（図２５、左下パネル）。個々のコロニーを選び出し、マウス造血前駆体からのＶＣＮに対するｑＰＣＲによって分析し、Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、これらの細胞中のＶＣＮを増加させた（図２５、下中央パネル）。Ｆ１０８およびＰＧＥ２はまた、形質導入効率を実質的に増加させた（図２５、右下パネル）。
実施例２８
Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）レンチウイルスベクターで形質導入したＨＣＤ３４＋細胞中の形質導入効率およびＶＣＮを増加させる
ＡＭＮ患者（図２６、パネルＡ〜Ｄ）、ＡＬＤ患者（図２６、パネルＥ〜Ｈ）、および健常なドナー（ＨＤ、図２６、パネルＩ−Ｌ）からのヒトＣＤ３４＋細胞を、ＷＰＲＥを欠いており、ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）で形質導入した。細胞を、サイトカイン含有培地中で４８時間予備刺激し、８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（ＰＳ）または２００μｇ／ｍＬのＦ１０８、１０μＭのＰＧＥ２、またはＦ１０８およびＰＧＥ２のいずれかの標準的な形質導入条件を用いて、２４時間形質導入した。形質導入した後、細胞をメチルセルロース中に播種し、約１４日間培養して、造血前駆体コロニー形成を可能にするか、またはサイトカイン含有培地中で７日間培養した。培養した細胞を、４または５日目にＡＬＤＰ発現に対して細胞内に染色し、フローサイトメトリーによって分析した。Ｆ１０８、ＰＧＥ２、ならびにＦ１０８およびＰＧＥ２は、ＡＬＤＰを発現する細胞数を増加させ、これはまた、ＭＯＩを増加させることによって増大した（図２６、パネルＡ、Ｅ、Ｉ）。Ｆ１０８、ＰＧＥ２、ならびにＦ１０８およびＰＧＥ２は、サイトカインで培養した細胞中のＤ７でＶＣＮを増加させ（図２６、パネルＢ、Ｆ、Ｊ）、Ｄ１４が、メチルセルロースコロニーをプールした（図２６、パネルＣ、Ｇ、Ｋ）。より高いＶＣＮは、コロニー計数の減少と相関するＭＮＤ−ＡＢＣＤ１ ＬＶＶを用いて生成した（図２６、パネルＤ、Ｈ、Ｌ）。図２６、パネルＨおよびＬは、Ｆ１０８単独が、コロニー計数への効果が少なく、特に、より低いＭＯＩで、ＶＣＮを増加させたことを示す。したがって、ある特定の状況では、例えば、特定のＬＶＶの高いＶＣＮがコロニー計数の減少と共に関連付けられるとき、ポロキサマー単独は、コロニー形成に影響を与えることなく、低いＭＯＩでＶＣＮを増加させるために使用することができ、それにより、より少ないＬＶＶを用いる利点を有するタンパク質発現を増加させる。
実施例２９
Ｆ１０８およびＰＧＥ２で特定のＶＣＮを標的化する
ヒトＣＤ３４＋細胞を、硫酸プロタミンの存在下で、２５のＭＯＩで、または最終生成物中の類似のＶＣＮを標的化する目的で、Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下で、１０のＭＯＩで、ＬＶＶで形質導入した。ＶＣＮが７日目のサイトカインで培養した細胞または１４日目のメチルセルロースで培養した細胞から分析したとき、治療条件間の有意差はなかった（図２７、左パネル）。また、治療条件間のコロニー形成の有意差はなかった（図２７、中央パネル）。
個々のコロニーｑＰＣＲを使用して、組成物においてあらゆる差を評価した。生成物の平均ＶＣＮは、同様であった。Ｆ１０８およびＰＧＥ２で、１０のＭＯＩで形質導入した細胞は、硫酸プロタミンで、２５のＭＯＩで形質導入した細胞と比較して、より高い％ＬＶＶ＋を有し、個々のコロニーＶＣＮの分布は、Ｆ１０８およびＰＧＥ２で、１０のＭＯＩで形質導入した細胞に対して０〜４であり、硫酸プロタミンで、２５のＭＯＩで形質導入した細胞中で０〜６であった（図２７、右パネル）。したがって、Ｆ１０８およびＰＧＥ２は、商品原価を減少するために使用するが、減少したリスクプロファイルおよび他の望ましい特徴を有する薬物生成物を生成することができる。
実施例３０
Ｆ１２７で処理したヒトＣＤ３４＋細胞のインビボ分析
形質導入のための出発物質として、正常なヒトＣＤ３４＋細胞を、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ ＣＳＦ）による動員後に、単一の健常なボランティアドナーからの白血球除去輸血によって単離する。細胞を異なるアリコートに分割し、８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミンまたは２００μｇ／ｍＬのＦ１２７および１０μＭのＰＧＥ２を用いて、約２５〜約５０の感染多重度（ＭＯＩ）の値でＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５ ＬＶＶで大規模の形質導入に供した。ＨＳＣを、形質導入後に凍結保存し、その後、解凍後、ＮＳＧマウスに投与し、１つの形質導入後の凍結／解凍サイクルをもたらす。
形質導入後、対照および試験薬物生成物は、完全に特徴付けられる。ＣＦＣ培地は、複合ＶＣＮ値、個々のコロニーＶＣＮ値、および％ＬＶＶ＋コロニーを決定するためにアッセイされる。赤血球培地は、生成された％βＡ Ｔ８７Ｑグロビンを決定するために分析される。Ｆ１２７による形質導入は、硫酸プロタミンで形質導入した細胞と比較して、複合ＶＣＮ、個々のコロニーＶＣＮ、および％ＬＶＶ＋コロニーを増加させるであろう。骨髄は、短期および長期の再増殖ＨＳＣにおいて、ＶＣＮおよび％ＬＶＶ＋を評価するために２カ月および４カ月で特徴付けられるであろう。
実施例３１
Ｐ１０５で治療したヒトＣＤ３４＋細胞のインビボ分析
形質導入のための出発物質として、正常なヒトＣＤ３４＋細胞を、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ ＣＳＦ）による動員後に、単一の健常なボランティアドナーからの白血球除去輸血によって単離する。細胞を異なるアリコートに分割し、８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミンまたは２００μｇ／ｍＬのＰ１０５および１０μＭのＰＧＥ２を用いて、約２５〜約５０の感染多重度（ＭＯＩ）の値でＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５ ＬＶＶで大規模の形質導入に供した。ＨＳＣを、形質導入後に凍結保存し、その後、解凍後、ＮＳＧマウスに投与し、１つの形質導入後の凍結／解凍サイクルをもたらす。
形質導入後、対照および試験薬物生成物は、完全に特徴付けられる。ＣＦＣ培地は、複合ＶＣＮ値、個々のコロニーＶＣＮ値、および％ＬＶＶ＋コロニーを決定するためにアッセイされる。赤血球培地は、生成された％βＡ Ｔ８７Ｑグロビンを決定するために分析される。Ｐ１０５による形質導入は、硫酸プロタミンで形質導入した細胞と比較して、複合ＶＣＮ、個々のコロニーＶＣＮ、および％ＬＶＶ＋コロニーを増加させるであろう。骨髄は、短期および長期の再増殖ＨＳＣにおいて、ＶＣＮおよび％ＬＶＶ＋を評価するために２カ月および４カ月で特徴付けられるであろう。
実施例３２
Ｆ９８で治療したヒトＣＤ３４＋細胞のインビボ分析
形質導入のための出発物質として、正常なヒトＣＤ３４＋細胞を、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ ＣＳＦ）による動員後に、単一の健常なボランティアドナーからの白血球除去輸血によって単離する。細胞を異なるアリコートに分割し、８μｇ／ｍＬの硫酸プロタミンまたは２００μｇ／ｍＬのＦ９８および１０μＭのＰＧＥ２を用いて、約２５〜約５０の感染多重度（ＭＯＩ）の値でＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５ ＬＶＶで大規模の形質導入に供した。ＨＳＣを、形質導入後に凍結保存し、その後、解凍後、ＮＳＧマウスに投与し、１つの形質導入後の凍結／解凍サイクルをもたらす。
形質導入後、対照および試験薬物生成物は、完全に特徴付けられる。ＣＦＣ培地は、複合ＶＣＮ値、個々のコロニーＶＣＮ値、および％ＬＶＶ＋コロニーを決定するためにアッセイされる。赤血球培地は、生成された％βＡ Ｔ８７Ｑグロビンを決定するために分析される。Ｆ９８による形質導入は、硫酸プロタミンで形質導入した細胞と比較して、複合ＶＣＮ、個々のコロニーＶＣＮ、および％ＬＶＶ＋コロニーを増加させるであろう。骨髄は、短期および長期の再増殖ＨＳＣにおいて、ＶＣＮおよび％ＬＶＶ＋を評価するために２カ月および４カ月で特徴付けられるであろう。
全般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に対して特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の完全な範囲と共に全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

Claims (16)

  1. ＣＤ３４＋の造血幹細胞または前駆細胞の集団を形質導入するインビトロまたはエクスビボの方法であって、培養培地中、レンチウイルスベクター、プロスタグランジンＥ ２ （ＰＧＥ ２ ）または１６，１６−ジメチルＰＧＥ ２ 、および、ポロキサマー３３８の存在下で前記細胞を培養することを含む、方法。
  2. （ａ）前記レンチウイルスベクターが、１０〜３０のＭＯＩもしくは１０〜２５のＭＯＩで存在するか、
    （ｂ）前記レンチウイルスベクターが、１０〜２５のＭＯＩで存在するか、
    （ｃ）前記レンチウイルスベクターが、１０〜２０のＭＯＩで存在するか、または
    （ｄ）前記レンチウイルスベクターが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０のＭＯＩで存在する、
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＣＤ３４＋の造血幹細胞または前駆細胞の集団が、ポリカチオン性ポリマーまたはポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、もしくはポリエチレングリコール／ポリ−Ｌ−リジンブロックコポリマーからなる群から選択されるポリカチオン性ポリマーの存在下で形質導入される、請求項１または２に記載の方法。
  4. （ａ）前記レンチウイルスベクターが、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む、ヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスに由来するか、
    （ｂ）前記レンチウイルスベクターが、ＨＩＶレンチウイルスに由来するか、または
    （ｃ）前記レンチウイルスベクターが、ＨＩＶ−１レンチウイルスに由来する、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. （ａ）前記レンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするか、または
    （ｂ）前記レンチウイルスベクターが、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、またはその転写的に活性な断片を含む、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （ａ）前記レンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、または
    （ｂ）前記レンチウイルスベクターが、アデノシンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  7. （ａ）前記レンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードするか、または
    （ｂ）前記レンチウイルスベクターが、インターロイキン２受容体ガンマをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含む、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  8. （ａ）前記レンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするか、または
    （ｂ）前記レンチウイルスベクターが、トリペプチジルペプチダーゼ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  9. （ａ）前記レンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするか、または
    （ｂ）前記レンチウイルスベクターが、アルファ−Ｌイズロニダーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  10. （ａ）前記レンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードするか、
    （ｂ）前記レンチウイルスベクターが、イズロン酸２−スルファターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、伸長因子１アルファプロモーターを含むか、または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含むか、あるいは
    （ｃ）前記レンチウイルスベクターが、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ−１ベクター、ＢＧＭ−１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ−ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３−ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３−４００ベクター、Ｇ９ベクター、またはＢＣＬ１１Ａ ｓｈｍｉｒベクターである、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記レンチウイルスベクターが、
    ａ）５’長末端（ＬＴＲ）、
    ｂ）プシー（Ψ）パッケージングシグナル、
    ｃ）ＲＮＡ輸送要素、
    ｄ）レンチウイルス中央ポリプリン区域（ｃＰＰＴ）、
    ｅ）対象となるポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター、および
    ｆ）ＳＩＮ ３’ＬＴＲを含む、
    請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. （ａ）前記５’ＬＴＲが、野生型５’ＬＴＲと比較して欠失をさらに含む修飾５’ＬＴＲであるか、
    （ｂ）前記５’ＬＴＲのプロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターからなる群から選択される異種プロモーターと置き換えられるか、
    （ｃ）前記ＲＮＡ輸送要素が、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＰＲＥ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含むか、
    （ｄ）前記３’ＬＴＲが、ポリアデニル化配列を含むか、
    （ｅ）前記プロモーターが、ヒトβ−グロビンＬＣＲの１つ以上の要素を含むか、
    （ｆ）前記プロモーターが、前記ヒトβ−グロビンＬＣＲからのＤＮａｓｅＩ超感受性部位２、３、および４を含むか、あるいは
    （ｇ）前記レンチウイルスベクターが、ヒトβ−グロビン３’エンハンサー要素をさらに含む、
    請求項１１に記載の方法。
  13. （ａ）前記対象となるポリヌクレオチドが、抗鎌状タンパク質またはグロビン遺伝子をコードするか、あるいは
    （ｂ）前記対象となる遺伝子が、ヒトβ−グロビンタンパク質、ヒトδ−グロビンタンパク質、ヒトγ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、ヒトβＡ−Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ−グロビンタンパク質、およびヒトβＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ−グロビンタンパク質からなる群から選択される抗鎌状タンパク質またはグロビン遺伝子をコードする、
    請求項１１または請求項１２に記載の方法。
  14. （ａ）前記ＣＤ３４＋の造血幹細胞または前駆細胞の集団が、少なくとも２時間形質導入されるか、または
    （ｂ）前記ＣＤ３４＋の造血幹細胞または前駆細胞の集団が、少なくとも２４時間形質導入されるか、または
    （ｃ）前記ＣＤ３４＋の造血幹細胞または前駆細胞の集団が、２時間〜２４時間形質導入される、
    請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ＣＤ３４＋の造血幹細胞または前駆細胞が、形質導入前に、ＣＤ３４＋発現のために選択される、
    請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ＣＤ３４ ＋ の造血幹細胞または前駆細胞は、少なくとも１．０、１．５、２．０または２．５の平均ＶＣＮを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
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