CN106995824B

CN106995824B - 一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用

Info

Publication number: CN106995824B
Application number: CN201710323114.3A
Authority: CN
Inventors: 贾凡; 徐富强; 徐小琴; 缪欢
Original assignee: Wuhan Institute of Physics and Mathematics of CAS
Current assignee: Aoao Biotechnology (Wuhan) Co.,Ltd.
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2017-05-09
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2037-05-09
Also published as: CN106995824A

Abstract

本发明公开了一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用，包括（1）制备高灵敏表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒；（2）在标记神经环路中的应用，该平台成功制备高灵敏表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒。本发明成功获得高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒，在神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

Description

一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用。

背景技术

人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础。神经网络的正常连接，使得人体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，如：阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等，但是还没有有效的手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。我国政府高度重视脑科学的研究，《国家中长期科学和技术发展规划》将“脑科学与认知科学”列为八大前沿科学问题之一,有一批科学家已投身于该领域的研究，并取得了一系列的成果。2012年，中国科学院启动了战略性先导科技专项“脑功能联结图谱研究”，并在2014年成立了“脑科学卓越创新中心”。2013年，美国和欧盟已经开始实施人脑图谱研究计划。脑科学研究计划是继人类基因组计划后又一个具有挑战的伟大计划，该计划的研究成果将会和人类基因组计划的成果一样造福人类。性能优良的神经环路示踪工具对于顺利开展该项目具有十分重要的作用。

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科成员，基因组为线状双链DNA分子，约150kb，成熟病毒粒子含有约50种蛋白质，PRV除了具有疱疹病毒科成员的优点外，其不感染人，因而成为研究神经环路的重要工具。然而，野生型PRV毒力强，感染大鼠后3天左右即引起死亡，同时具有双向运动的特点，因此，限制了其在神经环路研究中的应用。而由野生型PRV衍生而来的疫苗株(PRV-Bartha)的毒性大大减弱，感染大鼠后10天才引起动物死亡，而且具有严格逆向传播的特点，大大提高了其在神经环路研究中的应用价值。目前为止，研究人员以PRV为对象，构建了一系列的带有荧光蛋白标签的重组PRV，并成功应用于神经网络结构和功能的研究。尽管如此，其表达荧光蛋白的效率较低，因此，建立高敏感度表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒具有十分重要的意义。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了一种减毒且带有荧光蛋白基因的伪狂犬病毒。将在解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种高灵敏表达绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein，EGFP)的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供了一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的应用，该重组病毒可应用于脑科学研究和药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制病毒作用机制的分析、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：

1)具备高效表达绿色荧光蛋白能力的克隆：以pCDNA3.1(+)为载体，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5顺次插入到载体，获得克隆命名为pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA。

2)构建高灵敏度表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒：将SEQ ID NO.16插入到经过MluI和ClaI双切的pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA；将SEQ ID NO.19插入到经过AscI单切的pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA-right arm。将所得的质粒转染BHK21细胞后感染伪狂犬病毒Bartha株，收集细胞培养基上清；纯化后即获得高灵敏度表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒。

高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在研究脑神经环路平台中的应用，包括利用本发明提供的重组伪狂犬病毒建立伪狂犬病毒的药物筛选平台，研究药物抑制伪狂犬病毒作用机制、伪狂犬病毒病毒疫苗和诊断试剂的研发、伪狂犬病毒感染的动物模型的建立、伪狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析、或是对哺乳动物的脑神经环路进行示踪。

对哺乳动物的脑神经环路进行示踪，具体的，示踪包括下述步骤：

取0.1μl重组伪狂犬病毒定位注射到鼠海马，感染后2天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。

所述的应用对象不仅限于鼠，还能用于猪等动物的神经环路标记；本发明所用的绿色荧光蛋白基因只是作为一个范式，因此，还可用其他外源基因替代本发明的绿色荧光蛋白基因。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明制备了高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒，其表达绿色荧光蛋白的效率较高，能更好的实现对细胞的可视化，便于开展相关的研究。该重组病毒表达绿色荧光蛋白的效率比现有的表达绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒的效率高。

2.本发明对于开展伪狂犬病毒的基础性研究(如致病机制、复制机制等)和应用性研究(如神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值；

3.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。高灵敏的表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒能够感染鼠等动物的神经细胞，能作为神经环路标记工具。

附图说明

图1为一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的构建示意图。其中：A：高灵敏表达绿色荧光蛋白克隆的不同元件的顺序示意图；

B：伪狂犬病毒Bartha株的基因组示意图；

C：重组伪狂犬病毒重组示意图。

图2为一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒产生的细胞病变和表达荧光示意图。

其中：A：未感染病毒的细胞；

B：重组伪狂犬病毒感染BHK21细胞产生的细胞病变；

C：重组伪狂犬病毒感染BHK21细胞表达荧光蛋白。

图3为一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒高效表达绿色荧光蛋白的应用。

其中A：重组伪狂犬病毒PRV531体外感染BHK21细胞后的荧光表达，其中a为重组病毒PRV531感染细胞后200ms曝光成像；b为重组病毒PRV531感染细胞后产生的空斑后，在200ms曝光成像；c为对照病毒PRV152感染细胞后200ms曝光成像；d为对照病毒PRV152感染细胞后产生的空斑后，在200ms曝光成像。整体来看本发明的PRV531比对照病毒PRV152的荧光显著增强；

B：重组伪狂犬病毒PRV531表达绿色荧光蛋白的能力比对照病毒PRV152强，约是其水平的1.8倍。

图4为一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒稳定表达绿色荧光蛋白示意图；

其中：A：重组伪狂犬病毒PRV531的P1代病毒感染细胞后表达荧光示意图；

B：重组伪狂犬病毒PRV531的P5代病毒感染细胞后表达荧光示意图；

C：重组伪狂犬病毒PRV531的P10代病毒感染细胞后表达荧光示意图。

图5为一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒解析鼠脑神经环路示意图。

A：重组伪狂犬病毒标记鼠视觉皮层示意图；

B：重组伪狂犬病毒标记鼠海马示意图；

C：重组伪狂犬病毒标记鼠听觉皮层示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术

实施例1：一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：

(1)具备高效表达绿色荧光蛋白能力且含有同源臂的克隆：

①具备高效表达绿色荧光蛋白能力的克隆：首先采用全基因合成的方式合成EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP(序列见SEQ ID NO.1)，插入至pUC57，含有SEQ ID NO.1的合成质粒名称为pUC57-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP；然后分别采用PCR的方法扩增CAG启动子(序列见SEQ ID NO.2)、兔β-globin内含子(序列见SEQ ID NO.3)、WPRE(序列见SEQ ID NO.4)和BGHpA(序列见SEQ ID NO.5)，从而获得各自的PCR片段，并采用酶切重组的方式，按照图1的方式将CAG启动子、兔β-globin内含子、EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP、WPRE和BGHpA顺次拼接，使用的载体是pCDNA3.1(+)。

扩增相应序列的引物分别如下：DNA片段CAG启动子的引物：SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7，模板为pCAGGS；DNA片段兔β-globin内含子的引物：SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，模板为pDN-D2irC6kwh；DNA片段EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP的引物：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，模板为pUC57-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP；DNA片段WP RE的引物：SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:13，模板为pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA；DNA片段BGHpA的引物：SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，模板为pcDNA3.1(+)。本发明所有PCR所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

首先使用MluI和ApaI双切pCDNA3.1(+)，然后采用同源重组的方式将SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5顺次插入到载体，获得克隆命名为pCDNA3.1(+)-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA；然后采用同源重组的方式将片段SEQ ID NO.2插入经过ClaI和AsiSI双切的上述质粒，从而获得新的质粒，命名为pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA。构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

②具备高效表达绿色荧光蛋白能力且含有同源臂的克隆：为了获得具备重组能力的克隆，需要将相应的同源臂分别插入到上述构建的质粒，具体如下：首先采用PCR的方法扩增左同源臂(序列见SEQ ID NO.16)，所用引物分别为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。将SEQ ID NO.16插入到经过MluI和ClaI双切的pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA；然后采用PCR的方法扩增右同源臂(序列见SEQ IDNO.19)，所用引物分别为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。将SEQ IDNO.19插入到经过AscI单切的pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA-right arm。本发明所有PCR所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，且构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

(2)构建高灵敏度表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒：

①病毒的重组：将上述构建的质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA-right arm采用脂质体转染的方法转染到BHK21细胞，4小时后更换含有2％FBS的DMEM，并加入伪狂犬病毒Bartha株。在不同时间观察荧光的表达和细胞的病变情况，感染2天后收集培养基上清(含有病毒液体)，病毒命名为PRV531；

②病毒的纯化：采用双层plaque assay的方法，结合荧光显微镜产生的蚀斑(绿色)和产生的浅色斑点的对应特点，挑取含有绿色荧光斑点的浅色空斑到新鲜培养的BHK21细胞(含有2％FBS的DMEM)，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，分别在感染后观察荧光的表达和细胞产生的病变情况，待细胞病变明显且有可见绿色荧光时，将含有细胞的培养板放在-80℃，30min后置于37℃解冻，重复此过程3次；重复上述过程，直到所有的荧光斑和浅色的空斑完全一致，即表示病毒已经纯化；

③病毒的扩大培养和浓缩：将病毒感染BH2K1细胞后2天收集培养基上清，400g离心10min，然后使用0.45μm虑膜过滤，采用双层空斑的方法检测每种重组病毒的滴度；采用高速离心的方法对病毒进行浓缩(50000g，离心2.5小时)，(离心前的病毒滴度是1.2×10⁷PFU/ml，离心后的病毒滴度是7×10⁹PFU/ml)以便达到动物实验的要求。

实施例2：一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒高效表达绿色荧光蛋白：

为了表明本发明在表达外源蛋白的能力方面比现有的系统具备明显的优势，本实施例将在绿色荧光蛋白表达水平进行分析：一方面，取5μl实施例1制备的高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪重组伪狂犬病毒PRV531(病毒滴度是1.2×10⁷PFU/ml)感染BHK21细胞，另一方面，取5μl(对照的病毒滴度是1.5×10⁷PFU/ml)伪狂犬病毒PRV152(Smith BN et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2000,97(16):9264-9.)感染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，分别在感染后采用同样的曝光参数观察荧光的表达情况。

结果如图3所示：本发明制备的PRV531表达绿色荧光蛋白的效率比PRV152(SmithBN et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2000,97(16):9264-9.)高(图3)，图3中A：重组伪狂犬病毒PRV531体外感染BHK21细胞后的荧光表达，其中a为重组病毒PRV531感染细胞后200ms曝光成像；b为重组病毒PRV531感染细胞后产生的空斑后，在；200ms曝光成像；c为对照病毒PRV152感染细胞后200ms曝光成像；d为对照病毒PRV152感染细胞后产生的空斑后，在；200ms曝光成像。整体来看本发明的PRV531比对照病毒PRV152的荧光显著增强；图3中B：重组伪狂犬病毒PRV531表达绿色荧光蛋白的能力比对照病毒PRV152强，约是其水平的1.8倍。

实施例3：一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒稳定表达绿色荧光蛋白：

为了分析PRV携带绿色荧光蛋白基因的稳定性，取5μl实施例1制备的PRV531(病毒滴度是1.2×10⁷PFU/ml)(作为P0)感染BHK21细胞，感染2天后收集上清(作为P1)，按照上述方法在BHK21细胞上进行传10代，收集每代的病毒液，一方面进行plaque assay检测plaque的形态和均一性，另一方面分析EGFP在病毒传代过程中的稳定性以及该病毒体外感染BHK21细胞后表达荧光的能力。结果如图4所示，重组伪狂犬病毒PRV531在BHK21细胞上进行传10代，结果显示其在传代过程中能稳定表达绿色荧光蛋白，且产生的空斑大小和形态均一，未见明显差异。

实施例4：一种高灵敏度表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒在解析脑神经环路中的应用，其步骤是：

取0.1μl实施例1制备的高灵敏度表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒(病毒滴度是7×10⁹PFU/ml)定位注射到鼠腹侧海马，感染后2天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；挑取脑片使用荧光显微镜观察。

重组病毒注射到鼠脑后，可见绿色荧光蛋白信号，表明重组病毒能够在鼠脑内产生病毒，且该病毒具有表达绿色荧光蛋白的能力。如在视觉皮层(图5中A)，海马(图5中B)和听觉皮层(图5中C)均有绿色荧光蛋白的表达，表明重组的病毒能够在神经网络中运输，具有标记脑神经环路的能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所

<120> 一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用

<130> 一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用

<160> 21

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2265

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagatggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagcag 720

ctgttgaatt ttgaccttct caagctggcg ggagacgtcg agtccaaccc tgggccaatg 780

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 840

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 900

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 960

gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 1020

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 1080

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 1140

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 1200

atggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 1260

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 1320

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1380

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 1440

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caaggagggc 1500

agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc gaggagaatc ctggcccaat ggtgagcaag 1560

ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 1620

ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 1680

ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 1740

ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 1800

ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 1860

ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 1920

gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gatggagtac 1980

aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 2040

aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 2100

cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 2160

cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 2220

gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaag 2265

<210> 2

<211> 1668

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc 420

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tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacag 1668

<210> 3

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 60

ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat 120

ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 180

cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 240

atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 300

tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 360

ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 420

cttattggta gaaacaacta catcctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa 480

tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct 540

aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cag 573

<210> 4

<211> 589

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589

<210> 5

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccagatata cgcgtatcga tgacattgat tattgactag tt 42

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtccccaaa ctcacgcgat cgcctgtagg aaaaagaaga aggc 44

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtacgggcca gatatacgcg tatcgatgcg atcgcgtgag tttggggacc cttgat 56

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agggttctcc atggtgcgct gtaggaaaaa gaagaaggc 39

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agcgcaccat ggagaaccct ggacct 26

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttgtacata cgtgcattta aataccggtg ataagcttga tatcgaattc 50

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taaatgcacg tatgtacaag aatcaacctc tggattacaa a 41

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcgaggctga tcagcgggtt taaacgggcc ctgcggggag gcggcccaa 49

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag c 41

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcagcgggtt taaacgggcg cgccccatag agcccaccgc atccc 45

<210> 16

<211> 2007

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggcccgccgc cgccccgtga ggcgggcctc gccccgcgct gttcttccca ctcccccccc 60

cccccacccc accgtccgcc ccatcgtttg cccctctccc cttcccctct gttgtgccct 120

caataaacac ggcggcccgc cgctcgaacc tcaactctct cgtctctcgg gcgttttttc 180

cctcccggcc ctcgtgggga agggagatgg ggtgggggag agggggacgg tgggggagag 240

gggtggaggg agagaaagga cagaggccgg gcgcgtcggg ttcgagagcg agggcgttta 300

ttgttaaagt tgttggtggg ggggagtccg ggggagtccg ggggagtcag ggggagtcag 360

ggggagtccg ggggagtcag ggggagtcag ggggagtccg ggggagtccg ggggagtcct 420

cggcggctag gagatggtgc aaggagtggg ggggtgaggt cctcggcggc tattggtggg 480

aagggggagt gacgtcaggg cagcgggggg aaaggggggg gaaagggggg agagcgagtg 540

ggtggcggcg gcgagagtct gtcggatggc gccagggggg gcgggcgggc ggccgcgggg 600

agggaggacg ggcgcgcgtg aggcggcggc gccccgtcgc ggtcgagaac caccgccgcc 660

gtcaccgccg cctcccatcc gatgtgatat cgcggcacgc cggccgtccc ggcgttcatt 720

cacaccgcac ccgttcgccc acgtccccgc gggcaagcac gcacacaccc ggtcgcgcat 780

catgctggcg atgtggagat gggtcaccaa gaggtcgcgg ctccgccgag gccacgccca 840

tcttggggga aataaaggag tccggggaat ttgttcctta taccttgccg ggctcagcag 900

ggggttgtcg cgcgtccacg cccagcgctc gcacgcagca acaatggccg acgccggaat 960

ccccgacgag atcctgtact cggacatcag cgacgacgag atcatcatcg acggcgacgg 1020

cgacagcagc ggggacgagg acgacgatga cggggggctg acgcggcagg ccgcggcgcg 1080

catcgtcacg gacctgggct tcgaggtgct gcagcccctg cagtcgggct cggagggccg 1140

cgtcttcgtg gcccgccggc cgggcgaggc ggacacggtg gtgctgaagg tgggccagaa 1200

gccctcgacg ctgatggagg gcatgctgct gcagcgcctg tcccacgata acgtcatgcg 1260

catgaaacag atgctcgccc ggggcccggc gacgtgcctg gtcctgccgc actttcggtg 1320

cgatctgtac agctacctga ccatgcggga cgggccgctg gacatgcgcg acgccgggtg 1380

cgtgatccgg gccgtgctcc gcgggctcgc ctacctgcac gggatgcgca tcatgcaccg 1440

cgacgtcaag gcggagaaca tcttcctcga ggacgtggac acggtgtgcc tgggggacct 1500

cggggccgcg cgctgcaacg tggcggcgcc caacttttac gggctcgccg ggaccatcga 1560

gaccaacgcc cccgaggtgc tcgcgcgcga ccgctacgac accaaggtcg acgtctgggg 1620

cgcgggggtg gtgctcttcg agacgctggc ctaccccaag acgatcaccg gcggggacga 1680

gcccgcgatc aacggggaga tgcacctgat cgacctcatc cgcgccctcg gggtgcaccc 1740

cgaggagttc ccgcccgaca cgcgcctccg gagcgagttc gtccggtacg ccgggaccca 1800

ccgccagccg tacacgcagt acgcgcgcgt ggctcgcctc gggctgcccg agacgggggc 1860

tttcctgatt tacaagatgt tgacgtttga tcccgtccgc cgcccttccg ctgatgagat 1920

actcaacttt ggaatgtgga ccgtataaaa cgggccggct ccgagcggta ggacacacac 1980

acctttgcgc atctccacag ctcaaca 2007

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gtacgggcca gatatacgcg ttgttaactt atgttgagct gtggagatgc gc 52

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tcaataatca atgtcatcga tggcccgccg ccgccccgtg ag 42

<210> 19

<211> 1999

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tgtacatcgt cgtgctcgtc tttggcgacg acgcctacct cggcaccgtc tccctgtcgg 60

tggaggccaa cctggactac ccctgcggca tgaagcacgg gctcacgatc acccgccccg 120

gggccaccct cccacccatc gcccccacgg ccggcgacca ccagcgctgg cgcgggtgct 180

tcccctcgac cgacgagggc gcctgggaga acgtgaccgc cgccgagaag ggcctgtccg 240

acgactacgc cgactactac gacgcgcaca tcttccgcct ggagtctgac gacgaggtcg 300

tccacggcga tgcccccgag gcccccgagg gcgaggaggt gaccgaggag gaggccgagc 360

tgacctccag cgacctcgac aacatcgaga tcgaggtcgt gggctctccc gccgctcccg 420

tcgagggcgc cggcgacggc gaggaggggc acagggacga ggaggacgag gagctgacct 480

ccagcgacct tgacaacatc gagatcgagg tcgtgggctc gcccgcggcc gcccgcttct 540

tcgccgcctc caccaccccc cgcgccccca cccgcgcggc cgagatcacg accatgacca 600

cggtcaccac cgtgcggacg accgaggacc ccagcggcat caccgactgc cgccggagcg 660

actttgtctc gccctctgac atcttcgtga cccccaccgg cagccccgct ctgctcctgg 720

gcttcctggg cagcgcgctc gcctcgcgcc ccctgcacct gacggccggg gagacggccc 780

agcacgtgcg cgaggcccag cagaagagcc gccacatccg ctccctcggc ggcctccagc 840

tctcggtcga gaccgagacc accaacacca ccaccaccca gacgggcctg tcgggcgaca 900

tccgcacctc gatctacatc tgcgtcgccc tcgccggcct ggtcgtcgtg ggcatcgtca 960

tcatgtgcct ccatatggcg atcaccaggg cccgggcccg gaacgacggc taccgccacg 1020

tggcctccgc ctgacccggc cccgcccgac tcccccgcga tcccccccct ctcaccgggt 1080

gtccatcttc aataaagtat gtctcaaaca cctaatttgc gtacggcctt gcttacgggg 1140

gtgcgcccca cgcccagcgg tccataaaat tgggttgggg ccccaggttc ccatacactc 1200

acccgccagc gccatgctgc tcgcagcgct attggcggcg ctggtcgccc ggacgacgct 1260

cggcgcggac gtggacgccg tgcccgcgcc gaccttcccc ccgcccgcgt acccgtacac 1320

cgagtcgtgg cagctgacgc tgacgacggt cccctcgccc ttcgtcggcc ccgcggacgt 1380

ctaccacacg cgcccgctgg aggacccgtg cggggtggcg gcgctgatct ccgacccgca 1440

ggtggaccgg ctgctgagcg aggcggtggc ccaccggcgg cccacgtacc gcgcccacgt 1500

ggcctggtac cgcatcgcgg acgggtgcgc gcacctgctg tactttatcg agtacgccga 1560

ctgcgacccc aggcagatct ttgggcgctg ccggcgccgc accacgccga tgtggtggac 1620

cccgtccgcg gactacatgt tccccacgga ggacgagctg gggctgctca tggtggctcc 1680

ggggcggttc aacgagggcc agtaccggcg cctggtgtcc gtcgacggcg tgaacatcct 1740

caccgacttc atggtggcgc tccccgaggg gcaagagtgc ccgttcgccc gcgtggacca 1800

gcaccgcacg tacaagttcg gcgcgtgctg gaacgacgag agcttcaggc ggggcgtgga 1860

cgtgatgcga ttcctgacgc cgttctacca gcagcccccg caccgggagg tggtgaacta 1920

ctggtaccgc aagaacggcc ggacgctccc gcgggcctac gccgccgcca cgccgtacgc 1980

catcgacccc gcgcggccc 1999

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cggtgggctc tatggggcgc gcctgtacat cgtcgtgctc gtctt 45

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cagcgggttt aaacgggcgc ggggccgcgc ggggtcgatg gc 42

Claims

1.一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：

1)具备高效表达绿色荧光蛋白能力的克隆：以pCDNA3.1(+)为载体，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5顺次插入到载体，获得克隆命名为pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA；

2)构建高灵敏度表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒：将SEQ ID NO.16插入到经过MluI和ClaI双切的pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA；将SEQ ID NO.19插入到经过AscI单切的pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-EGFP-F2A-EGFP-T2A-EGFP-WPRE-BGHpA-right arm；将所得的质粒转染BHK21细胞后感染伪狂犬病毒Bartha株，收集细胞培养基上清；纯化后即获得高灵敏度表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒。

2.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在建立伪狂犬病毒的药物筛选平台中的应用。

3.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在研究药物抑制伪狂犬病毒作用机制中的应用。

4.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒病毒疫苗的开发中的应用。

5.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒感染的动物模型的建立中的应用。

6.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析中的应用。

7.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在哺乳动物的脑神经环路进行示踪中的应用。