CN101671666A - 用于恶性肿瘤基因治疗的增殖和肿瘤细胞特异性基因操纵系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了：一种高度增殖特异性重组真核细胞启动子PCNATAI；一种以PCNATAI为核心转录启动元件、以LoxP－stop－LoxP为转录阻遏元件的真核细胞操纵系统PCNATAI－LoxP－stop－LoxP；一套通过以肿瘤细胞特异性依赖模式反式提供的Cre重组酶解除LoxP－stop－LoxP对PCNATAI启动的转录过程的阻遏效应，使下游外源性抑瘤基因或自杀基因在恶性肿瘤细胞中以肿瘤细胞特异性及增殖特异性双重特异性模式高效、特异性表达的整体方案。该方案既可显著提高恶性肿瘤基因治疗过程中抑瘤或自杀基因在恶性肿瘤细胞中的表达效率，又可确保基因治疗的安全性。

Description

用于恶性肿瘤基因治疗的增殖和肿瘤细胞特异性基因操纵系统

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高度增殖特异性重组真核细胞启动子(PCNATAI)；一套以PCNATAI作为基因转录的启动子，由肿瘤细胞特异性启动子启动表达的Cre重组酶激活，以高度增殖特异性和肿瘤细胞特异性双重依赖模式，启动外源性治疗基因在恶性肿瘤细胞中高效特异性表达的真核细胞操纵系统；以及用该操纵系统各组成部分构建的相应真核细胞表达质粒载体、重组腺病毒穿梭质粒载体和重组腺病毒表达载体。

【背景技术】

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病，在全世界人口死亡原因中位居第三，自2006年起恶性肿瘤已经成为我国城乡居民死亡的首要原因。目前恶性肿瘤的治疗仍采用手术切除为主，放、化疗为辅的综合治疗方法。因恶性肿瘤呈浸润性生长，手术不易全切；放、化疗不仅难以达到满意的疗效，还会给患者带来难以耐受的全身性毒、副作用；故寻求有效的治疗新途径势在必行。近来的研究显示，基因治疗有可能成为未来恶性肿瘤治疗的有效手段，并展示出诱人的光明前景，但高效表达和可靠的安全性是决定基因治疗成功的先决条件。然而，现有基因治疗载体不但表达效率低，且特异性差；既不能在肿瘤细胞中高效表达，又不能将治疗基因的表达严格限定于肿瘤细胞中；因而不但治疗效果不理想，还会造成肿瘤周围组织中乃至全身多种正常细胞的损伤，这是制约恶性肿瘤基因治疗的瓶颈。因此，构建安全、高效的肿瘤细胞特异性治疗基因表达载体是恶性肿瘤基因治疗亟待解决的问题^[1]。

高度增殖是所有恶性肿瘤细胞的共同特征，而肿瘤周围组织的正常细胞绝大多数处于非增殖状态。人增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)为全增殖期细胞特异性高表达的标志物，在所有恶性肿瘤中的阳性表达率均为100％，其表达水平与肿瘤的恶性程度呈正比，而肿瘤周围组织中处于非增殖状态的正常细胞不表达PCNA^[2]。说明恶性肿瘤细胞中有高效激活PCNA基因启动子的微环境；肿瘤周围组织中处于非增殖状态的正常细胞内不具备激活PCNA基因启动子的条件；PCNA基因的启动子为严格的增殖特异性启动子，其转录水平与细胞的增殖活性及肿瘤的恶性程度成正相关，符合肿瘤特异性基因治疗对增殖特异性的要求。故利用PCNA基因启动子启动外源性治疗基因的表达，不但可使外源性治疗基因在恶性肿瘤细胞内高效表达，还可将外源性治疗基因的表达限定在处于高度增殖状态的恶性肿瘤细胞内。通过这种增殖特异性的限制，既可使外源性治疗基因的表达能有效杀伤恶性肿瘤细胞，又可防止外源性治疗基因损伤处于非增殖状态的正常细胞。

目前已明确PCNA基因启动子属于典型的看家基因启动子，其核苷酸序列的-900～+60区段中(启动子区DNA序列编号以转录起始位点的核苷酸编号为+1，起始位点上游邻近核苷酸编号为-1，并向5’方向编号绝对值依次递增；起始位点下游邻近核苷酸编号为+2，并向3’方向编号依次递增)存在多种反式作用因子的结合位点。我们用增强绿荧光蛋白(EGFP)报导系统，对PCNA基因启动子核苷酸序列-900～+64区段在多种人恶性肿瘤细胞系及体外培养大鼠星形胶质细胞中的转录效率和增殖特异性进行了检测。初步证实，用携带PCNA基因启动子-900～+64区段核苷酸序列及受其调控的下游EGFP报道基因的真核细胞表达质粒转染人恶性肿瘤细胞系后，可高效启动报道蛋白EGFP的表达；而转染该真核细胞表达质粒的体外培养大鼠星形胶质细胞几乎不表达EGFP。以上结果说明PCNA基因启动子核苷酸序列的-900～+64区段具备了必要的增殖特异性和转录活性。对其进行合理的优化改造将有可能制备出一个适用于多种恶性肿瘤基因治疗的广谱增殖特异性启动子。我们经过分段筛选，进一步确定其核苷酸序列的-778～+61区段不但增殖特异性最好，且对下游受其调控基因的转录启动活性最强，可作为以增殖特异性模式启动外源性治疗基因表达的核心启动子。

体内具有自我细胞更新能力的正常组织内都含有一定数量的特定干细胞(如骨髓造血干细胞、表皮基底层细胞、毛囊的生发细胞等)，在组织更新过程中作为种子细胞，不断通过分裂增殖及定向分化形成新的成熟细胞，用以替补衰老凋亡的细胞，在维持组织中各种正常细胞数量的动态平衡方面具有不可替代的作用^[3]。如上所述，虽然PCNA基因启动子在处于非增殖状态的正常细胞内不能启动外源性治疗基因表达，但因所有正常干细胞也都处于增殖活跃状态，用该启动子启动外源性治疗基因表达仍有可能会对这些正常干细胞产生不良影响。故单纯解决了外源性治疗基因在恶性肿瘤细胞中表达的增殖特异性，还不能保障基因治疗的绝对安全。

已知某些恶性肿瘤细胞可高表达其特有的蛋白标志物，如乳腺癌细胞特异性表达Her-2蛋白^[4]，肝细胞癌细胞特异性表达HIP/PAP1和甲胎蛋白(AFP)^[5，6]，大肠癌细胞特异性表达癌胚抗原(CEA)等^[7]。而另外一些恶性肿瘤细胞可高表达其起源组织细胞特有的蛋白标志物，如B细胞性恶性淋巴瘤细胞高表达正常B淋巴细胞特有的蛋白标志物CD20^[8]，星形胶质细胞起源肿瘤高表达正常星形胶质细胞特有的蛋白标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)^[9]，前列腺癌细胞高表达正常前列腺上皮细胞特有的蛋白标志物前列腺特异性膜抗原(PSMA)等^[10]。以上事实说明上述肿瘤细胞有激活各自特异性蛋白标志物编码基因启动子的能力，也即这些启动子是不同恶性肿瘤细胞的特异性启动子。因此，如能构建一个用PCNA基因启动子启动目的基因表达，用肿瘤细胞特异性启动子启动反式调控因子表达，由反式调控因子调控PCNA基因启动子转录活性的目的基因表达操纵系统，既可使外源性治疗基因在恶性肿瘤细胞中高效表达，又可通过PCNA基因启动子增殖特异性和肿瘤细胞特异性启动子细胞特异性的双重限制，使外源性治疗基因的表达被严格限制在恶性肿瘤细胞内，就可有效防止外源性治疗基因对全身增殖期和非增殖期正常细胞产生非特异性杀伤作用，以确保恶性肿瘤基因治疗的安全性。

Cre重组酶(Cre recombinase，Cre)是来源于P1噬菌体的I型拓扑异构酶，可通过其特异性识别元件LoxP催化DNA的位点特异性同源重组。该酶催化效率高，短时间内即可达到底物和产物的动态平衡，且催化过程不需要任何能量辅助因子。LoxP元件为一长34bp的DNA序列，其两端为13bp的反转重复序列，中间为8bp的间隔序列，该序列决定了LoxP元件的方向性，并进一步决定了Cre介导DNA重组的方式。当两个LoxP元件的方向相同时，两个LoxP元件之间的序列在Cre的催化下被环状切除，使其上下游核苷酸序列对接重组^[11]。Cre-LoxP系统的高效、特异和稳定性使其成为基因和染色体修饰的有力工具，可以通过特异性反式提供Cre重组酶删除LoxP位点间的DNA序列，故可作为核心启动子的辅助调控系统。已知在人类基因组中无内源性LoxP元件的核苷酸序列，将Cre-LoxP系统导入人组织细胞不会造成其基因组结构和核苷酸序列改变，所以将Cre-LoxP辅助调控系统应用于人恶性肿瘤基因治疗是安全的。

【发明内容】

本发明目的之一是提供一种高度增殖特异性真核细胞启动子“PCNATAI”；本发明目的之二是提供一种由Cre重组酶激活、以高度增殖特异性模式调控下游抑瘤或自杀基因表达的真核细胞基因操纵系统“PCNATAI-LoxP-stop-LoxP”；本发明目的之三是提供一套利用PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵系统操纵外源性基因以肿瘤细胞特异性和增殖特异性双重特异性模式在恶性肿瘤细胞中高效表达的整体方案。同时本发明还以恶性胶质瘤为例提供了使用方法和实例。

本发明的具体发明内容包括：

发明1、一种高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI，其核苷酸序列如序列表1或序列表2所示。

发明2、一种如发明1所述的高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI的获得方法，其特点是以人野生型增殖细胞核抗原PCNA启动子全长或-778～+61位*核苷酸序列为原型，并对其进行下列两个片段的改造得到：

第一、用腺病毒E1B TATA盒核苷酸序列AGGGTATATAATG取代野生型PCNA启动子区原-29～-21位核苷酸序列；

第二、用多数基因共有的典型转录起始元件Inr核苷酸序列CCATTCC取代PCNA启动子区原有的-2～+5位核苷酸序列，同时在其下游形成一个限制性内切酶SacII的识别位点。

发明3、一种含有发明1所述的启动子PCNATAI、并由Cre重组酶激活、以高度增殖特异性模式调控下游外源性治疗基因表达的真核细胞基因操纵系统PCNATAI-LoxP-stop-LoxP，其核苷酸序列如序列表3或序列表4所示。

发明4、一种如发明3所述的真核细胞基因操纵系统PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的获得方法，该方法包括：

第一、以权利要求1所述的启动子PCNATAI作为该操纵系统启动外源性治疗基因转录的核心启动元件；

第二、在启动子PCNATAI下游端插入pBS302质粒的“LoxP-Stop-LoxP”序列作为该操纵系统的转录阻遏元件，其中Stop为转录终止序列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列。

发明5、一种利用发明3所述的真核细胞基因操纵系统PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP在恶性肿瘤细胞中以增殖和肿瘤细胞双重特异性模式高效操纵外源性抑瘤或自杀基因表达的方法。即在恶性肿瘤细胞中通过肿瘤细胞特异性依赖模式反式提供Cre重组酶，使之通过同源重组机制删除其特异性识别位点之间的转录终止序列Stop，从而解除Stop序列对PCNATAI启动的转录过程的阻遏作用，最终使下游外源性抑瘤基因或自杀基因在PCNATAI的启动下在恶性肿瘤细胞中以肿瘤细胞特异性及增殖特异性双重特异性模式高效、特异性表达。

注：*启动子区DNA序列编号以转录起始位点的核苷酸编号为+1。起始位点上游邻近核苷酸编号为-1，并向5’方向编号绝对值依次递增；起始位点下游邻近核苷酸编号为+2，并向3’方向编号依次递增。

本发明的优点和积极效果：

本发明提供了一个指导外源性治疗基因在恶性肿瘤细胞中高效、特异性表达的整体方案，其中包括：一个优化重组的增殖特异性启动子，一个基于该重组启动子的调节外源性抑瘤或自杀基因表达真核细胞操纵系统，以及利用该系统启动外源性抑瘤或自然基因在恶性肿瘤细胞中高效、特异性表达的整体方案。

本发明的技术方案是以增殖特异性启动子PCNATAI作为启动外源性治疗基因表达的核心元件，通过Cre-LoxP同源重组机制将肿瘤细胞特异性启动子的肿瘤细胞特异性和PCNATAI的增殖特异性有机结合，共同实现外源性抑瘤或自杀基因在恶性肿瘤细胞中的高效、特异性表达。

与现有技术相比，本发明的优点是：

(1)对外源性治疗基因表达的调控具有严格的增殖特异性。本发明以重组增殖特异性启动子PCNATAI作为核心启动元件，以增殖依赖模式启动外源性基因在处于高度增殖状态的恶性肿瘤细胞和肿瘤干细胞中高效、特异性表达。PCNATAI改建于PCNA基因启动子全长或其-778～+61区段，在改建重组过程中引入了对转录效率具有正性调节作用的腺病毒E1B启动子的TATA盒及典型的转录起始元件Inr序列，定性定量检测结果显示PCNATAI不仅保留了野生型PCNA基因启动子的增殖特异性，而且使转录效率显著提高，可满足恶性肿瘤基因治疗对启动子增殖特异性及转录效率的要求(详见实施例1及2)。

(2)实现了肿瘤细胞特异性与增殖特异性的有机整合，使外源性治疗基因在恶性肿瘤细胞内高效特异性表达。在以PCNATAI为核心启动元件的同时，PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵系统尚以两侧装备同向LoxP位点的转录终止序列(stop)作为阻遏下游基因转录的阻遏元件，并通过以肿瘤细胞特异性启动子介导Cre重组酶的表达将肿瘤细胞特异性与增殖特异性有机结合，不但显著增加了外源性治疗基因的表达效率，还使外源性治疗基因的表达被严格限定在恶性肿瘤细胞内，既可显著提高恶性肿瘤基因治疗的疗效，又可保障基因治疗的安全性。

(3)适用范围广、实用性强、应用前景广阔。活跃增殖是所有恶性肿瘤细胞共有的生物学行为特征，故只需选择适当的肿瘤细胞特异性启动子启动Cre表达及选择性插入适当的外源性治疗基因，即可将本套操纵系统应用于不同恶性肿瘤的基因治疗，因此具有很好的普适性和实用价值，应用前景广阔。

【附图说明】

图1是真核细胞操纵系统PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP物理图谱。

图2是肿瘤细胞特异性和增殖特异性基因表达操纵系统的工作原理。

【具体实施方式】

本发明的原理和具体理论依据：

(1)PCNATAI的改造策略：野生型PCNA基因启动子即为一严格的增殖特异性启动子，但定性和定量检测分析显示该启动子的启动效率较低，尚不能完全满足对治疗基因转录强度的需要。核苷酸序列分析显示，野生型PCNA基因启动子的结构类似于看家基因启动子，无典型的TATA盒，但其-33～-21区核苷酸序列AGGGTGAGAGCGC与腺病毒E1B基因启动子的TATA盒AGGGTATATAATG有一定的序列同源性；此外，其转录起始位点周围的核苷酸序列

也与典型的Inr核苷酸序列PyPyA+1NTPyPy不完全相符(A+1表示转录起始位点的腺嘌呤碱基，Py表示嘧啶碱基G或C，N表示任意碱基，标方框者为与Inr典型序列不相符的碱基)。TATA盒和Inr是真核细胞转录的关键元件，对提高转录水平和稳定转录起始位点均有重要作用^[12]。因此，在启动子改造中我们引入了腺病毒E1B基因启动子的TATA盒，并利用DNA定点诱变技术将转录起始位点周围核苷酸序列改造为典型的Inr核苷酸序列CCATTCC，同时在改造过程中引入了限制性内切酶SacII的识别位点，以方便DPE的删除和下游外源性治疗基因的插入。用增强型绿色荧光蛋白和双荧光素酶检测系统进行的定性、定量检测结果显示，PCNATAI不仅保留了野生型PCNA基因启动子的增殖特异性，且其在TJ905恶性人胶质瘤细胞系中的转录活性明显高于野生型PCNA基因启动子-778～+61区，为后者的1.6倍。同时PCNATAI与SV40增强子有很好的功能配适性，后者可在保持PCNATAI增殖特异性的同时，使PCNATAI的启动活性提高6倍。

(2)本操作系统的工作原理：PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP操纵系统由两个基本元件构成，一为启动子PCNATAI，为该操纵系统中启动下游基因转录的核心启动元件；一为LoxP-Stop-LoxP序列，其来自于美国Invitrogen公司的商业化质粒pBS302，其中的Stop序列为转录终止序列，能有效终止PCNATAI启动的转录过程，故为该操纵系统的转录阻遏元件。故PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP操纵系统的激活需要两个方面的条件：①宿主细胞处于高度增殖状态，使PCNATAI启动子具有转录活性；②宿主细胞可反式提供Cre重组酶。鉴于恶性肿瘤细胞及肿瘤干细胞均处于活跃增殖状态，PCNATAI启动子具有较高的转录活性，故只需采用肿瘤细胞特异性启动子，如肝细胞癌中的AFP启动子、结肠癌细胞中的CEA启动子、前列腺癌细胞中的PSMA启动子、B细胞淋巴瘤细胞中的CD20启动子、恶性胶质瘤细胞中的GFAP启动子等启动Cre重组酶的表达，使宿主细胞可以反式提供Cre重组酶，后者即可识别操纵系统中的LoxP位点，并通过同源重组机制删除LoxP位点间转录终止序列Stop，解除其对PCNATAI启动的转录过程的阻遏过程，使该操纵系统下游的外源性抑瘤或自杀基因以肿瘤细胞特异性及增殖特异性双重特异性表达(图2)。而在处于增殖状态的正常细胞，由于肿瘤细胞特异性启动子转录活性较低，不能介导Cre重组酶的有效表达，故Stop序列对PCNATAI启动的转录过程的阻遏作用无法解除，故PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP操纵系统调节的外源性抑瘤或自杀基因不能表达；而在肿瘤起源组织的正常细胞，虽肿瘤细胞特异性启动子可能介导Cre重组酶的表达，但由于正常细胞多处于非增殖状态，故PCNATAI启动子活性较低，亦无法有效介导下游抑瘤或自杀基因的表达。因这种设计使所有处于增殖状态和非增殖状态的正常细胞，均无同时激活增殖特异性启动子和肿瘤细胞特异性启动子的可能性；从而使外源性治疗基因仅能在处于高度增殖状态的恶性肿瘤细胞内高效、特异性表达，并在有效杀伤恶性肿瘤细胞的同时使正常细胞免遭外源性治疗基因的非特异性杀伤。

用于本发明的原始生物材料：

(1)PCNA基因启动子-778～+61区核苷酸序列：利用PCR扩增技术从人基因组DNA获得；

(2)LoxP-stop-LoxP核酸序列：由DNA合成技术直接合成，参照美国Invitrogen公司的商业化质粒pBS302中LoxP-stop-LoxP设计，具体序列见核苷酸序列表3。

实施例1：

高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI的获得方法：以人基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增人野生型PCNA启动子的-778～+61区，并亚克隆至天根生化科技有限公司的商业化T载体pBS-T中，构建成含有野生型PCNA启动子的-778～+61区的重组质粒pBS-PCNAP。以限制性内切酶AatII及KpnI联合酶切pBS-PCNAP释放出野生型PCNA启动子的-57～+61区。通过DNA合成技术合成PCNATAI启动子的-57～+61区，其-33～-21区含腺病毒E1B基因启动子的TATA盒结构，-2～+5区包含典型的Inr结构，其余序列则与野生型PCNA启动子的对应序列相同，同时在其5’端及3’端分别引入AatII及KpnI的识别序列。利用AatII及KpnI消化PCNATAI启动子的-57～+61区后将其插入pBS-PCNAPAatII及KpnI消化产物，构建成功含高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI的重组质粒pBS-PCNATAI，并经DNA测序证实其序列的正确性。

实施例2：

操纵系统PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的获得方法：利用DNA合成技术合成美国Invitrogen公司商业化质粒pBS302中的LoxP-stop-LoxP核酸序列，并在其5’端及3’端分别引入限制性内切酶SpeI及NotI的识别位点。以SpeI及NotI线性化含高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI的重组质粒pBS-PCNATAI，并将SpeI及NotI消化的LoxP-stop-LoxP核酸序列插入线性化质粒中，构建成含PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的重组质粒pBS-PCNATAI-loxP-stop-loxP，并经测序证实其序列的正确性。

实施例3：

在不同体外培养细胞及细胞系中定性检测PCNATAI的转录效率

以增强的绿色荧光蛋白EGFP基因为报导基因，在不同体外培养细胞及细胞系中对PCNATAI、野生型PCNA启动子的-300～+61区(P300)、-600～+61区(P600)及PCNATAI改造原型PCNA启动子-788～+61区的转录效率进行定性观察。分别将PCNA启动子-300～+61区、-600～+61区、-788～+61区及PCNATAI启动子插入质粒载体pEGFP-1(美国Clontech公司)，构建重组质粒p300-EGFP、p600-EGFP、pPCNA-EGFP及pPCNATAI-EGFP。用四个重组质粒分别转染体外原代培养大鼠星形胶质细胞、人胚肾永生化HEK293细胞系、恶性胶质瘤细胞系TJ905及U251，继续培养72小时后在荧光倒置显微镜下观察EGFP的表达情况。结果显示：PCNA启动子300～+61区及-600～+61区在各细胞系中转录效率均较低。在不同体外培养细胞及细胞系中PCNATAI启动子及PCNA启动子-788～+61区启动报导基因EGFP表达的效率并不相同，在增殖不活跃的体外原代培养大鼠星形胶质细胞中PCNATAI及PCNA启动子-788～+61区对EGFP的启动效率均较低，而在增殖异常活跃的恶性胶质瘤细胞系TJ905及U251中，PCNATAI及PCNA启动子-788～+61区对EGFP的启动效率均较高，而在增殖活性较活跃的永生化细胞系HEK293中，PCNATAI及PCNA启动子-788～+61区对EGFP的启动效率低于其在U251及TJ905细胞系中对EGFP的启动效率，但高于其在体外培养大鼠原代星形胶质细胞中对EGFP的启动效率，证实PCNATAI启动子保留了PCNA启动子-788～+61区转录启动的增殖特异性(部分实验结果见附件图1)。

实施例4：

在不同体外培养细胞及细胞系中定量检测PCNATAI的转录效率

利用美国Promega公司开发的荧光素酶报导系统在不同体外培养细胞及细胞系中对PCNATAI及其改造原型PCNA启动子-788～+61区检测的转录活性进行定量检测。分别将PCNATAI及PCNA启动子-788～+61区插入质粒载体pGL3-Basic及pGL3-enhancer，构建成重组质粒pGL3-PCNATAI-Basic、pGL3-PCNA-Basic、pGL3-PCNATAI-enhancer及pGL3-PCNA-enhancer。将上述重组质粒分别转染体外原代培养大鼠星形胶质细胞、人胚肾永生化HEK293细胞系及恶性胶质瘤细胞系U251，并以双荧光素酶检测试剂盒定量检测PCNATAI及PCNA启动子-788～+61区的转录活性及SV40增强子对上述两启动子增殖特异性的影响和转录活性的增强作用。结果显示：在U251恶性胶质瘤细胞中PCNATAI对报导基因的启动效率为PCNA启动子-788～+61区的1.6倍，提示PCNATAI的改造过程有效提高了启动子对报导基因表达的启动效率；在U251恶性胶质瘤细胞中PCNATAI及PCNA启动子-788～+61区对报导基因的启动效率分别是其在HEK293细胞中对报导基因启动效率的2.85倍和2.17倍，而在体外培养大鼠星形胶质细胞中，PCNATAI及PCNA启动子-788～+61区的转录效率均远远低于其在胶质瘤细胞系U251及HEK293细胞中的转录效率，提示经改造后，PCNATAI启动子不仅保留了PCNA启动子-788～+61区的增殖特异性，且其增殖特异性有了进一步提高。此外，在SV40增强子的作用下，无论PCNA启动子-788～+61区还是PCNATAI，其转录效率在U251及HEK293细胞中均大幅提高，但在体外培养大鼠星形胶质细胞中无明显变化，提示SV40可与PCNATAI启动子有效协同，既提高了其在增殖细胞中的转录效率，又可保持其增殖特异性(部分实验结果见附件图1)。

实施例5：

利用PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP操纵系统介导报导基因EGFP在恶性胶质瘤细胞中的特异性表达

将PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP操纵系统插入EGFP真核表达质粒pEGFP-1，构建成重组真核表达质粒pPCNATAI-LoxP-Stop-LoxP-EGFP。将GFAP启动子与Cre重组酶全长编码区串联后插入删除EGFP编码区的真核表达质粒pEGFP-1，构建成由GFAP介导Cre重组酶表达的真核表达质粒pGFAP-Cre。利用pPCNATAI-LoxP-Stop-LoxP-EGFP转染HEK293、TJ905及U87MG细胞系和体外原代培养大鼠星形胶质细胞，转染后72小时在荧光倒置显微镜下观察无绿色荧光蛋白表达。利用pPCNATAI-LoxP-Stop-LoxP-EGFP和pGFAP-Cre联合转染上述三个细胞系和体外培养大鼠星形胶质细胞，转染后72小时发现在U87MG及TJ905恶性胶质瘤细胞系中有EGFP较高水平的表达，而在HEK293细胞系及体外原代培养大鼠星形胶质细胞中EGFP无表达。证实利用胶质细胞及恶性胶质瘤细胞特异性启动子GFAP启动Cre重组酶的表达即可在恶性胶质瘤细胞中实现外源性报导基因的细胞和增殖特异性表达(部分实验结果见附件图2)。

实施例6：

在不同体外培养细胞及细胞系中定量检测PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的转录效率

利用荧光素酶报导系统在不同体外培养细胞及细胞系中对PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的转录效率进行定量检测。将PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵系统分别插入质粒载体pGL3-Basic及pGL3-enhancer，构建成重组质粒pGL3-PCNATAI-LoxP-stop-LoxP-Basic及pGL3-PCNATAI-LoxP-stop-LoxP-enhancer。将上述重组质粒分别单独或与重组GFAP-Cre质粒联合转染体外原代培养大鼠星形胶质细胞、人胚肾永生化HEK293细胞系及恶性胶质瘤细胞系U251，并以双荧光素酶检测试剂盒定量检测PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵系统对报导基因的转录效率及SV40增强子对转录的增强作用。结果显示：无论有无SV40增强子的增强作用，在HEK293细胞及体外培养大鼠星形胶质细胞中，PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵系统的转录效率均极低(仅有漏出性表达)。在U251恶性胶质瘤细胞系中，在无GFAP-Cre以肿瘤细胞特异性反式提供的Cre重组酶的作用下，PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵系统对报导基因的转录效率亦极低，接近其在体外培养大鼠星形胶质细胞及HEK293细胞系中的转录水平；而当GFAP-Cre以肿瘤细胞特异性方式反式提供Cre重组酶时，PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵系统在U251亚性胶质瘤细胞系中的转录效率明显提高至无Cre重组酶时的约4.5倍，同时，SV40增强子可进一步提高其转录水平至无Cre重组酶时的约30倍，提示PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵系统对报导基因的转录具有预期的增殖和肿瘤细胞双重特异性，而SV40增强子可在不改变PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操纵系统转录特异性的前提下进一步提高其转录效率(部分实验结果见附件图2)。

以上实验结果充分说明：该套基因表达操纵系统已达到恶性肿瘤基因治疗所要求的启动效率高、特异性安全性好的要求。

参考文献

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[8]Walshe CA，Beers SA，French RR，et al.Induction of cytosolic calcium flux by CD20 is dependent upon B Cellantigen receptor signaling.J Biol Chem，2008，283：16971-16984.

[9]Lee Y，Messing A，Su M，et al.GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.Glia，2008，56：481-493.

[10]Antunes AA，Leite KR，Sousa-Canavez JM，et al.The role of prostate specific membrane antigen and pepsinogen Ctissue expression as an adjunctive method to prostate cancer diagnosis.J Urol，2009，181：594-600.

[11]Zhang DJ，Wang Q，Wei J，et al.Selective expression of the Cre recombinase in late-stage thymocytes using the distalpromoter of the Lck gene.J Immunol，2005，174：6725-6731.

[12]Carely S and Smale ST.Transcriptional regulation in eukaryotes：concepts，strategies and techniques.北京：清华大学出版社，2002.

序列表  SEQUENCE LISTING

<110>天津医科大学总医院

<120>用于恶性肿瘤基因治疗的增殖和肿瘤细胞特异性基因操纵系统

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>839

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>改造自人增殖细胞核抗原PCNA启动子-778至+61区，用腺病毒ElB TATA盒核苷酸序列AGGGTATATAATG取代原有的-29～-21位核苷酸序列，用典型转录起始元件Inr核苷酸序列CCATTCC取代原有的-2～+5位核苷酸序列。

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(839)

<220>

<221>CAAT_signal

<222>(634)..(638)

<220>

<221>GC_signal

<222>(651)..(656)

<220>

<221>TATA_signal

<222>(752)..(757)

<400>1

attgcctaag tgctcaaagg tgtttgtagt taaacaacag gagattgata aattatgtta     60

tatacatgtg atgctatgtt ttaaagaggt actgatatga taaaagatgt acgtggcata    120

aaattaaatg tactttatta agtacttttc caagtgttta cggaatgagt gcatttttga    180

aaaaaaaaaa gtgtattcga acttttaaaa aagctttaaa agctttatac aatgaacgat    240

tgagtgatta taagagctgg cgggggaatg ttaagaggat gatagggagc taagtttaac    300

agaacaatta cctctttatc ttgtgacacc tacgagcgca tcaattctgt aattgaaaaa    360

taaagtgcat atttgcagca gctgtactct cttcaggctg caaggaggct tttcctcccg    420

gtaggcttga tttgcatttc actttcactt tcgtggctgg aaactttcta cccacgtagt    480

gggaggctga ggagccacca taaagctggg gcttgacgag ccgggaccgg gacccgatct    540

ccacatatgc ccggacttgt tctgcggccg ggttcaggag tcaaagaggc ggggagacct    600

gcgcgacgct gccccgccct gcgcccgctt cctccaatgt atgctctagg gggcgggcct    660

cgcggggagc atggacacga ttggccctaa agtcttcccc gcaaggccgt gggctggaca    720

gcgtggtgac gtcgcaacgc ggcgcagggt atataatggc gcttgcggac gcggcgccat    780

tccgcggttg caggcgtagc agagtggtcg ttgtctttct aggtctcagc cggtcgtcg     839

<210>2

<211>1323

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>改造自人增殖细胞核抗原PCNA启动子-778至+61区，用腺病毒ElBTATA盒核苷酸序列AGGGTATATAATG取代原有的-29～-21位核苷酸序列，用典型转录起始元件Inr核苷酸序列CCATTCC取代原有的-2～+5位核苷酸序列。

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1323)

<220>

<221>CAAT_signal

<222>(1118)..(1122)

<220>

<221>GC_signal

<222>(1135)..(1140)

<220>

<221>TATA_signal

<222>(1236)..(1241)

<400>2

tgctgaccaa ggtattaaaa gtaactaaag agaagtggtg tgaagaaagc aagagagaaa     60

caacaaatcc tgtccatcct gtaacaattg aaaatttctg gctgggcgtg gtggctcacg    120

cctgtaatcc cagcactttg agaggccgag gcaggtggat cacctcaggt caggtgttca    180

agaccagcct ggccaacatg gtgaaacccc gtctctacta aaaaaaaata ataataataa    240

tacaaaaatt agccgggggt ggtggtaggc acctgtaatc ccagatactc gggaggctga    300

ggcaggagac tcacttgaac ctgggaggcg gaggttgcaa tgagctgaga tcgcgccact    360

gtactccagc ctggatgaca gagcaggact ccatctcaaa aagaaaggaa aagaaaagaa     420

aaaatattaa atgtgtacgc tctttgactc agctgtatta cttcaaggag ttgatatcac     480

caaaattgcc taagtgctca aaggtgtttg tagttaaaca acaggagatt gataaattat     540

gttatataca tgtgatgcta tgttttaaag aggtactgat atgataaaag atgtacgtgg     600

cataaaatta aatgtacttt attaagtact tttccaagtg tttacggaat gagtgcattt     660

ttgaaaaaaa aaaagtgtat tcgaactttt aaaaaagctt taaaagcttt atacaatgaa     720

cgattgagtg attataagag ctggcggggg aatgttaaga ggatgatagg gagctaagtt     780

taacagaaca attacctctt tatcttgtga cacctacgag cgcatcaatt ctgtaattga     840

aaaataaagt gcatatttgc agcagctgta ctctcttcag gctgcaagga ggcttttcct     900

cccggtaggc ttgatttgca tttcactttc actttcgtgg ctggaaactt tctacccacg     960

tagtgggagg ctgaggagcc accataaagc tggggcttga cgagccggga ccgggacccg    1020

atctccacat atgcccggac ttgttctgcg gccgggttca ggagtcaaag aggcggggag    1080

acctgcgcga cgctgccccg ccctgcgccc gcttcctcca atgtatgctc tagggggcgg    1140

gcctcgcggg gagcatggac acgattggcc ctaaagtctt ccccgcaagg ccgtgggctg    1200

gacagcgtgg tgacgtcgca acgcggcgca gggtatataa tggcgcttgc ggacgcggcg    1260

ccattccgcg gttgcaggcg tagcagagtg gtcgttgtct ttctaggtct cagccggtcg    1320

tcg                                                                  1323

<210>3

<211>2280

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>由改造自人增殖细胞核抗原PCNA启动子-778至+61区的PCNATAI启动子、来自P1噬菌体的Cre重组酶的两个识别位点LoxP及两个识别位点间的转录终止序列Stop组成。

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(839)

<223>改造自人增殖细胞核抗原PCNA启动子的增殖特异性启动子PCNATAI。

<220>

<221>CAAT_signal

<222>(634)..(638)

<220>

<221>GC_signal

<222>(651)..(656)

<220>

<221>TATA_signal

<222>(752)..(757)

<220>

<221>misc_feature

<222>(858)..(891)

<223>P1噬菌体的I型拓扑异构酶Cre重组酶的特异性识别位点。

<220>

<221>misc_feature

<222>(892)..(2240)

<223>转录终止序列。

<220>

<221>polyA_signal

<222>(1056)..(1061)

<220>

<221>misc_feature

<222>(2241)..(2274)

<223>P1噬菌体的I型拓扑异构酶Cre重组酶的特异性识别位点。

<400>3

attgcctaag tgctcaaagg tgtttgtagt taaacaacag gagattgata aattatgtta     60

tatacatgtg atgctatgtt ttaaagaggt actgatatga taaaagatgt acgtggcata    120

aaattaaatg tactttatta agtacttttc caagtgttta cggaatgagt gcatttttga    180

aaaaaaaaaa gtgtattcga acttttaaaa aagctttaaa agctttatac aatgaacgat    240

tgagtgatta taagagctgg cgggggaatg ttaagaggat gatagggagc taagtttaac    300

agaacaatta cctctttatc ttgtgacacc tacgagcgca tcaattctgt aattgaaaaa    360

taaagtgcat atttgcagca gctgtactct cttcaggctg caaggaggct tttcctcccg    420

gtaggcttga tttgcatttc actttcactt tcgtggctgg aaactttcta cccacgtagt    480

gggaggctga ggagccacca taaagctggg gcttgacgag ccgggaccgg gacccgatct    540

ccacatatgc ccggacttgt tctgcggccg ggttcaggag tcaaagaggc ggggagacct    600

gcgcgacgct gccccgccct gcgcccgctt cctccaatgt atgctctagg gggcgggcct    660

cgcggggagc atggacacga ttggccctaa agtcttcccc gcaaggccgt gggctggaca    720

gcgtggtgac gtcgcaacgc ggcgcagggt atataatggc gcttgcggac gcggcgccat    780

tccgcggttg caggcgtagc agagtggtcg ttgtctttct aggtctcagc cggtcgtcgg     840

gatccactag tccgcggata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta ttaggtccct     900

cgacctgcag cccaagctta cttaccatgt cagatccaga catgataaga tacattgatg     960

agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg    1020

atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt    1080

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ttccttatta acccctttac aaattaaaaa gctaaaggta cacaattttt gagcatagtt    1260

attaatagca gacactctat gcctgtgtgg agtaagaaaa aacagtatgt tatgattata    1320

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tgcagctttt tcctttgtgg tgtaaatagc aaagcaagca agagttctat tactaaacac    1440

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cttctttttt ggaggagtag aatgttgaga gtcagcagta gcctcatcat cactagatgg    1560

catttcttct gagcaaaaca ggttttcctc attaaaggca ttccaccact gctcccattc    1620

atcagttcca taggttggaa tctaaaatac acaaacaatt agaatcagta gtttaacaca    1680

ttatacactt aaaaatttta tatttacctt agagctttaa atctctgtag gtagtttgtc    1740

caattatgtc acaccacaga agtaaggttc cttcacaaag atccctcgag aaaaaaaata    1800

taaaagagat ggaggaacgg gaaaaagtta gttgtggtga taggtggcaa gtggtattcc    1860

gtaagaacaa caagaaaagc atttcatatt atggctgaac tgagcgaaca agtgcaaaat    1920

ttaagcatca acgacaacaa cgagaatggt tatgttcctc ctcacttaag aggaaaacca    1980

agaagtgcca gaaataacat gagcaactac aataacaaca acggcggcta caacggtggc    2040

cgtggcggtg gcagcttctt tagcaacaac cgtcgtggtg gttacggcaa cggtggtttc    2100

ttcggtggaa acaacggtgg cagcagatctaacggccgtt  ctggtggtag atggatcgat    2160

ggcaaacatg tcccagctcc aagaaacgaa aaggccgaga tcgccatatt tggtgtcccc    2220

gaggatccgg aacccttaat ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttataccggt    2280

<210>4

<211>2758

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>由改造自全长人增殖细胞核抗原PCNA启动子的PCNATAI启动子、来自P1噬菌体的Cre重组酶的两个识别位点LoxP及两个识别位点间的转录终止序列Stop组成。

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1321)

<220>

<221>CAAT_signal

<222>(1118)..(1122)

<220>

<221>GC_signal

<222>(1135)..(1140)

<220>

<221>TATA_signal

<222>(1236)..(1241)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1342)..(1375)

<223>P1噬菌体的I型拓扑异构酶Cre重组酶的特异性识别位点。

<220>

<221>misc_feature

<222>(1376)..(2724)

<223>转录终止序列。

<220>

<221>polyA_signal

<222>(1540)..(1545)

<220>

<221>misc_feature

<222>(2725)..(2758)

<223>P1噬菌体的I型拓扑异构酶Cre重组酶的特异性识别位点。

<400>4

tgctgaccaa ggtattaaaa gtaactaaag agaagtggtg tgaagaaagc aagagagaaa     60

caacaaatcc tgtccatcct gtaacaattg aaaatttctg gctgggcgtg gtggctcacg    120

cctgtaatcc cagcactttg agaggccgag gcaggtggat cacctcaggt caggtgttca    180

agaccagcct ggccaacatg gtgaaacccc gtctctacta aaaaaaaata ataataataa    240

tacaaaaatt agccgggggt ggtggtaggc acctgtaatc ccagatactc gggaggctga    300

ggcaggagac tcacttgaac ctgggaggcg gaggttgcaa tgagctgaga tcgcgccact    360

gtactccagc ctggatgaca gagcaggact ccatctcaaa aagaaaggaa aagaaaagaa     420

aaaatattaa atgtgtacgc tctttgactc agctgtatta cttcaaggag ttgatatcac     480

caaaattgcc taagtgctca aaggtgtttg tagttaaaca acaggagatt gataaattat     540

gttatataca tgtgatgcta tgttttaaag aggtactgat atgataaaag atgtacgtgg     600

cataaaatta aatgtacttt attaagtact tttccaagtg tttacggaat gagtgcattt     660

ttgaaaaaaa aaaagtgtat tcgaactttt aaaaaagctt taaaagcttt atacaatgaa     720

cgattgagtg attataagag ctggcggggg aatgttaaga ggatgatagg gagctaagtt     780

taacagaaca attacctctt tatcttgtga cacctacgag cgcatcaatt ctgtaattga     840

aaaataaagt gcatatttgc agcagctgta ctctcttcag gctgcaagga ggcttttcct     900

cccggtaggc ttgatttgca tttcactttc actttcgtgg ctggaaactt tctacccacg     960

tagtgggagg ctgaggagcc accataaagc tggggcttga cgagccggga ccgggacccg    1020

atctccacat atgcccggac ttgttctgcg gccgggttca ggagtcaaag aggcggggag    1080

acctgcgcga cgctgccccg ccctgcgccc gcttcctcca atgtatgctc tagggggcgg    1140

gcctcgcggg gagcatggac acgattggcc ctaaagtctt ccccgcaagg ccgtgggctg    1200

gacagcgtgg tgacgtcgca acgcggcgca gggtatataa tggcgcttgc ggacgcggcg    1260

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tcgggatcca ctagtccgcg gataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattaggt    1380

ccctcgacct gcagcccaag cttacttacc atgtcagatc cagacatgat aagatacatt    1440

gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt    1500

tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac    1560

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aatattcctt attaacccct ttacaaatta aaaagctaaa ggtacacaat ttttgagcat    1740

agttattaat agcagacact ctatgcctgt gtggagtaag aaaaaacagt atgttatgat    1800

tataactgtt atgcctactt ataaaggtta cagaatattt ttccataatt ttcttgtata    1860

gcagtgcagc tttttccttt gtggtgtaaa tagcaaagca agcaagagtt ctattactaa    1920

acacagcatg actcaaaaaa cttagcaatt ctgaaggaaa gtccttgggg tcttctacct    1980

ttctcttctt ttttggagga gtagaatgtt gagagtcagc agtagcctca tcatcactag    2040

atggcatttc ttctgagcaa aacaggtttt cctcattaaa ggcattccac cactgctccc    2100

attcatcagt tccataggtt ggaatctaaa atacacaaac aattagaatc agtagtttaa    2160

cacattatac acttaaaaat tttatattta ccttagagct ttaaatctct gtaggtagtt    2220

tgtccaatta tgtcacacca cagaagtaag gttccttcac aaagatccct cgagaaaaaa    2280

aatataaaag agatggagga acgggaaaaa gttagttgtg gtgataggtg gcaagtggta    2340

ttccgtaaga acaacaagaa aagcatttca tattatggct gaactgagcg aacaagtgca    2400

aaatttaagc atcaacgaca acaacgagaa tggttatgtt cctcctcact taagaggaaa    2460

accaagaagt gccagaaata acatgagcaa ctacaataac aacaacggcg gctacaacgg    2520

tggccgtggc ggtggcagct tctttagcaa caaccgtcgt ggtggttacg gcaacggtgg    2580

tttcttcggt ggaaacaacg gtggcagcag atctaacggc cgttctggtg gtagatggat    2640

cgatggcaaa catgtcccag ctccaagaaa cgaaaaggcc gagatcgcca tatttggtgt    2700

ccccgaggat ccggaaccct taatataact tcgtataatg tatgctatac gaagttat      2758

Claims (5)

1、一种高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI，其核苷酸序列如序列表1或序列表2所示。

2、一种权利要求1所述的高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI的获得方法，其特征在于所述的启动子PCNATAI是以人野生型增殖细胞核抗原PCNA启动子区全长或其-778～+61位*核苷酸序列为原型，并对其进行下列两个片段的改造得到：

第一、用腺病毒E1B TATA盒核苷酸序列AGGGTATATAATG取代PCNA启动子区原有的-29～21位核苷酸序列；

第二、用典型转录起始元件Inr核苷酸序列CCATTCC取代PCNA启动子区原有的-2～+5位核苷酸序列，同时在其下游形成一个限制性内切酶SacII的识别位点。

3、一种含有权利要求1所述的启动子PCNATAI，并由Cre重组酶激活、以高度增殖特异性模式调控下游抑瘤或自杀基因表达的真核细胞基因操纵系统PCNATAI-LoxP-stop-LoxP，其核苷酸序列如序列表3或序列表4所示。

4、一种权利要求3所述的真核细胞基因操纵系统PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的获得方法，其特征在于该方法包括：

第一、以权利要求1所述的启动子PCNATAI作为该操纵系统启动外源性治疗基因转录的核心启动元件；

第二、在启动子PCNATAI下游端插入pBS302质粒的“LoxP-Stop-LoxP”序列作为该操纵系统的转录阻遏元件，其中Stop为转录终止序列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列。

5、一种权利要求3所述的真核细胞基因操纵系统PCNATAI-LoxP-stop-LoxP应用于操纵外源性抑瘤或自杀基因在恶性肿瘤细胞中的高效特异性表达，即在恶性肿瘤细胞中通过肿瘤细胞特异性依赖模式反式提供Cre重组酶，使之通过同源重组机制删除其特异性识别位点之间的转录终止序列Stop，从而解除Stop序列对PCNATAI启动的转录过程的阻遏作用，最终使下游外源性抑瘤或自杀基因在PCNATAI的启动下在恶性肿瘤细胞中以肿瘤细胞特异性及增殖特异性双重特异性模式高效表达。

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