CN104178513B - 一种自我清除型腺病毒载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种自我清除型腺病毒，基于AdEasyTM腺病毒载体系统进行改造，所用穿梭质粒为pShuttle‑CMV，其特征在于：所述改造是指在穿梭质粒pShuttle‑CMV插入rtetR‑VP16基因序列、TRE‑PminCMV‑Cre基因序列及两个同向的LoxP位点。本发明可随时诱导腺病毒降解死亡，在组织工程所需种子细胞应用于体内前消除外源基因和腺病毒载体本身；可大幅度降低腺病毒进入机体的数量，从而减轻载体本身对机体的影响，为组织工程产品提供更为安全可靠的载体。

Description

一种自我清除型腺病毒载体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种自我清除型腺病毒及其制备方法。

背景技术

外源基因导入技术是组织工程领域里的常用技术。研究者们常使用该技术将编码骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)2、4、7等的基因导入骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stem Cells，BMCs)、脂肪干细胞，用于修复骨缺损；将编码血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)的基因导入骨髓间充质干细胞，用于血管重建；以及携带siRNA以敲低宿主细胞自身基因的表达等。这些研究均取得了不错的效果。

腺病毒载体是外源基因导入过程中使用的主要载体之一，但是，腺病毒载体本身也会带来许多问题，这些问题迄今为止还未得到很好的解决，其中最难于解决的是：在感染293细胞或其他体细胞后，能重新获得E1区编码基因而产生复制型腺病毒(Replicationcompetent adenovirus，RCAs)。该问题在第一代腺病毒上最为突出；第二代腺病毒虽然在第一代的基础上去除了E2a和/或E4区编码基因，也仅仅是使该问题得到了一定的改善，但仍未能彻底解决；第三代腺病毒则仅保留了腺病毒基因组两端的未端重复序列ITRs和5’端的包装序列，理论上来说，第三代腺病毒的这一改进可彻底杜绝RCAs的产生；但在实际应用中，第三代腺病毒的制备流程非常复杂，且必须借助于辅助病毒才能够完成，由此引出了令人头疼的辅助病毒污染问题。

最近发展起来的外源基因表达精确调控技术，由于能使腺病毒的用量得以降低，故在一定程度上缓解了RCAs问题。这些技术包括：在腺病毒上插入药物诱导性启动子，以实现时间上的可控；插入脏器特异性启动子，以实现空间上的可控；或将两种方法相结合，以实现时间、空间上的双重可控；在E1a编码区前面插入脏器特异性microRNA配体，以实现脏器特异性不复制等。这一类研究的主要目的是精确调控外源基因的表达，并没有着眼于解决载体本身的问题，只是使这些问题得到一定程度的缓解。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以实现自我清除的新型腺病毒载体。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种自我清除型腺病毒，基于AdEasy^TM腺病毒载体系统进行改造，所用穿梭质粒为pShuttle-CMV，其特征在于：所述改造是指在穿梭质粒pShuttle-CMV插入rtetR-VP16基因序列、TRE-PminCMV-Cre基因序列及两个同向的LoxP位点。其中，rtetR-VP16由反式四环素阻遏蛋白(reverse TetR，rTetR)和单纯疱疹病毒VP16蛋白的基因组成，rtetR-VP16的表达产物为融合蛋白rtTA，rtTA在四环素(或其衍生物，如Doxycycline，Dox)存在的情况下，能与响应元件TRE结合；TRE-PminCMV-Cre由TRE、PminCMV和Cre酶基因三部分组成，TRE是四环素响应元件(Tetracyclin response element)，PminCMV是最小巨细胞病毒启动子，TRE被激活后，能启动Cre酶的表达，而Cre酶则能识别、结合LoxP序列；LoxP由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列组成，当两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同时，Cre重组酶能切除两个LoxP位点间的序列。

本发明所述自我清除型腺病毒具有以下特性：在无诱导剂条件下，虽表达反式作用因子rtTA，但rtTA不能与TRE结合，Cre酶基因不转录；当在培养基中加入诱导剂四环素或Dox后，rtTA与TRE结合，启动Cre的转录表达，Cre酶特异性地识别预先植入在穿梭质粒pShuttle中的两个LoxP序列，使得两个Loxp之间的分隔区发生联会重组，位点间的DNA片断被环化切除；腺病毒因其基因组的完整性受到破坏而死亡。此时，原来作为腺病毒标记的绿色荧光蛋白的表达也将终止，在荧光显微镜下可以观察到诱导前表达荧光的细胞失去荧光。

上述rtetR-VP16序列、TRE-PminCMV-Cre序列及两个LoxP位点分别插入穿梭质粒pShuttle的kpnI、XhoI及PemI和EcoRV位点。所述两个LoxP序列分别植入穿梭质粒pShuttle的982bp的EcoRV位点和3516bp的PemI位点，二者之间的序列共长2534bp，并包含了穿梭质粒的右臂基因组(1243bp-3497bp)，该部分为腺病毒存活的关键基因组，删除该部分基因组后，腺病毒不能存活。

在本发明中，LoxP位点的选择相当关键：1、两个LoxP位点相隔太远则删除效率过低，相隔太近则不能删除足够长的基因，均不能令腺病毒死亡，而对于具体删除片段位置及长度，既没有经验可借鉴，也没有文献可参考；2、插入LoxP的酶切位点必须是单酶切位点，且为粘头末端以保证两个LoxP序列同向；3、插入LoxP后，腺病毒的存活、复制和装载外源基因的能力不受影响。本发明所述的腺病毒不仅解决了上述关键技术问题，而且在酶切时能得到确定的片段，还有效避免了在同源重组、包装及感染HEK293细胞后，不能表达绿色荧光蛋白的问题。

上述pShuttle-CMV序列如SEQ ID NO.1所示，rtetR-VP16序列如SEQ ID NO.2所示，TRE-PminCMV-Cre序列如SEQ ID NO.3所示，两个LoxP位点序列如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示。

上述腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

(1)在pShuttle穿梭质粒上插入Tet-On系统的rtetR-VP16和TRE-PminCMV-Cre基因；并在其上的PemI和EcoRI位点插入Cre-Loxp系统的两个LoxP位点；得到重组穿梭质粒pShuttleN；

(2)骨架质粒和重组穿梭质粒同源重组，包装，收集腺病毒颗粒。

采用上述腺病毒进行自我清除的方法，包括以下步骤：在组织工程所需种子细胞感染上述自我清除型腺病毒48h后，一次性加入诱导剂Dox，使培养基内Dox终浓度为10umol/L。在Dox作用下，新型腺病毒载体可自我清除，5天后外源蛋白的mRNA和蛋白水平降至诱导前的10％至20％(据外源蛋白不同，降解效率不同)，可进行移植。

有益效果

(1)本发明可随时诱导腺病毒降解死亡，在组织工程所需种子细胞应用于体内前消除外源基因和腺病毒载体本身；可大幅度降低腺病毒进入机体的数量，从而减轻载体本身对机体的影响，为组织工程产品提供更为安全可靠的载体。

(2)本发明的关键技术指标：①外源基因插入及表达对于AdEasy^TM腺病毒载体系统及其应用的稳定性无影响，且插入及表达外源基因时操作同AdEasy^TM腺病毒载体系统原有的操作；②腺病毒载体的感染效率约为80％；③感染后，实测外源基因mRNA拷贝数和培养基中蛋白浓度与AdEasy^TM腺病毒载体系统无统计学差异；④加入诱导剂Dox后，新型腺病毒的降解率及外源基因的表达强度的降低幅度均达到80％左右，从而大幅度降低复制型腺病毒的产生和基因整合的风险。

附图说明

图1本发明自我清除型腺病毒载体工作原理

图2重组穿梭质粒(pShuttleN)结构图

图3重组腺病毒的初步验证

A、条带0：DL15000Marker，条带7：重组腺病毒PacI酶切后；

B、HEK293细胞在普通倒置显微镜下的表现；

C、HEK293细胞在激发荧光时的表现

图4含BMP-4和VEGF基因的重组自我清除型腺病毒和传统腺病毒构建成功A、两类重组腺病毒PCR电泳验证：条带0、DL2000Marker

条带1、AdEasyN-BMP-4 条带2、AdEasy-BMP-4

条带3、AdEasyN-VEGF 条带4、AdEasy-VEGF；

B、AdEasy-BMP-4感染大鼠骨髓间充质干细胞后表达绿色荧光；

C、AdEasy-VEGF感染大鼠骨髓间充质干细胞后表达绿色荧光；

D、AdEasyN-BMP-4感染大鼠骨髓间充质干细胞后表达绿色荧光；

E、AdEasyN-VEGF感染大鼠骨髓间充质干细胞后表达绿色荧光

图5重组腺病毒工作效能的验证

A1、AdEasyN-BMP-4组诱导前；A2、AdEasyN-BMP-4组诱导后；

B1、AdEasyN-VEGF组诱导前；B1、AdEasyN-VEGF组诱导后；

C1、AdEasy-BMP-4组诱导前；C1、AdEasy-BMP-4组诱导后；

D1、AdEasy-VEGF组诱导前；D1、AdEasy-VEGF组诱导后；

E、各组细胞培养基中加入诱导剂Dox后，BMP-4与VEGF蛋白表达强度变化曲线；

F、各组细胞培养基中加入诱导剂Dox后，BMP-4与VEG FmRNA拷贝数(/10^6β-actinmRNA拷贝数)

图6穿梭质粒pShuttleN多克隆位点区域

图7骨架质粒pAdEasy-1结构图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但发明并不局限于本实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

本发明所述自我清除型腺病毒的构建及体外验证：选择AdEasy^TM腺病毒载体系统作为基础，对其进行改建。

1)以PCR法，分别从携带rtetR-VP16和TRE-Pmin CMV-Cre基因的pBR322原核表达质粒上克隆相应的基因。rtetR-VP16上游引物：5’-GGG GTA CCA TGT CTA GAC TGG ACA A-3’，下游引物：5’-GGG GTA CCC TAT AGT TCT AGA GGC T-3’；TRE-PminCMV-Cre基因上游引物：5’-CCC TCG AGC TCG AGT TTA CCA-3’，下游引物：5’-CCC TCG AGC TAA TCG CCA T-3’。PCR反应程式：预热后，rtetR-VP16的PCR反应主循环为57℃1min，70℃30sec；TRE-PminCMV-Cre基因的PCR反应主循环为56℃1min，70℃30sec，主循环完成后均予以70℃5min延伸；

2)以kpnI单酶切pShuttle穿梭质粒(kpnI酶1ul，pShuttle10ul，10×Buffer5ul，BSA2.5ul，加水至50ul，37℃酶切1h)，电泳验证获得线性质粒后，使用T4DNA连接酶将rtetR-VP16的PCR产物与线性pShuttle连接(T4DNA连接酶14ul，穿梭质粒pShuttle8ul，PCR产物6ul，16℃水浴中过夜)；

3)以XhoI单酶切含有rtetR-VP16的重组穿梭质粒pShuttle(XhoI酶1ul，余条件同2))，电泳验证获得线性质粒后，使用T4DNA连接酶将TRE-PminCMV-Cre基因与线性pShuttle连接(T4DNA连接酶12ul，重组穿梭质粒pShuttle9ul，PCR产物7ul，16℃水浴中过夜)；

4)合成含酶切位点的LoxP序列；

①拟插入PemI位点的LoxP序列：

5′-GTTTAAAC-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-GTTTAAAC-3′

3′-CAAATTTG-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-CAAATTTG-5′

②拟插入EcoRV位点的LoxP序列：

5′-GATATC-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-GATATC-3′

3′-CTATAG-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-CTATAG-5′

5)以PemI单酶切含rtetR-VP16和TRE-PminCMV-Cre基因的重组pShuttle穿梭质粒(PemI酶1ul，pShuttle10ul，10×Buffer5ul，BSA2.5ul，加水至50ul，37℃酶切1.5h)，电泳验证后，回收DNA条带；使用T4DNA连接酶将LoxP序列与重组pShuttle连接(T4DNA连接酶12ul，重组穿梭质粒pShuttle9ul，PCR产物7ul，16℃水浴中过夜)；

6)以EcoRV单酶切含rtetR-VP16和TRE-PminCMV-Cre基因及一个LoxP序列的重组穿梭质粒pShuttle，验证后，使用T4DNA连接酶将LoxP序列与重组pShuttle连接(同5))，连接产物重命名为pShuttleN；

7)取E.coli BJ5183感受态细菌；电穿孔法(250V，25μFD，200Ohms)共转化线性化的重组穿梭质粒pShuttleN(含rtetR-VP16和TRE-PminCMV-Cre基因、两个LoxP序列)和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1，同源重组产物重命名为pAdEasyN；

8)按质粒抽提试剂盒说明书，抽提重组腺病毒DNA，对该重组腺病毒质粒进行PacI酶切(Pac I酶2ul，pAdEasyN20ul，10×Buffer10ul，BSA5ul，加水至100ul，37℃酶切2h)、电泳及测序鉴定；

9)取Pac I酶切产物，按重组腺病毒载体转染试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司，GMS60036)说明书转染QBI-293A细胞，待细胞约1/3漂浮时，收集细胞，反复冻融后，离心收集重组腺病毒颗粒悬液。

重组腺病毒质粒构建完成后，经PacI酶切后可得到一条与7Kbp和一条22Kbp的条带(图3A条带7)。转染到HEK293细胞内，得到具有感染活性的腺病毒颗粒。由于该重组腺病毒携带绿色荧光蛋白，故可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达(图3B、C)，该荧光蛋白的表达也说明腺病毒存活，并表达所携带的基因。

实施例2

构建表达BMP-4和VEGF的自我清除型重组腺病毒和AdEasy^TM重组腺病毒，并感染大鼠骨髓间充质干细胞：

1)分别从含有骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein4，BMP-4)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因的pBR322原核表达质粒上克隆相应的基因。其中BMP-4上游引物：5′-TGA TTC CTG GTA ACC GAA TGC T-3′，下游引物：5′-GGC ACC CAC ATC CCT CTA CTA-3′；PCR反应主循环为56℃1min，71℃30sec；VEGF上游引物5′-CCA AGC TTA TGA ACT TTC TGC TG-3′，下游引物5′-CCA AGC TTT CAC CGC CT-3′，PCR反应主循环为54℃1min，71℃30sec，主循环完成后均予以71℃5min延伸。BMP-4的序列如SEQ ID NO.4所示，VEGF的序列如SEQ ID NO.5所示。

2)以HindIII酶切重组穿梭质粒pShuttleN和原始穿梭质粒pShuttle。反应条件相同：HindIII酶1ul，pShuttleN(或pShuttle)10ul，10×Buffer5ul，BSA2.5ul，加水至50ul，37℃酶切1h。电泳验证获得线性质粒后，使用T4DNA连接酶将BMP-4和VEGF基因全长PCR产物与线性化的pShuttleN和原始穿梭质粒pShuttle连接，连接反应条件相同：T4DNA连接酶14ul，pShuttleN(或pShuttle)8ul，PCR产物6ul，16℃水浴中过夜；

3)取E.coli BJ5183感受态细菌；电穿孔法(250V，25μFD，200Ohms)共转化线性化的重组穿梭质粒pShuttleN或原始穿梭质粒pShuttle(均含BMP-4或VEGF基因序列)和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1，扩增；

4)按质粒抽提试剂盒说明书，抽提重组腺病毒DNA，对该重组腺病毒质粒进行PacI酶切线性化、电泳，及基于BMP-4和VEGF引物的PCR和测序鉴定；

5)取Pac I酶切线性化重组腺病毒质粒DNA，按重组腺病毒载体转染试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司，GMS60036)说明书转染QBI-293A细胞，同前方法收集病毒悬液。

6)按2.5×10⁷pFU/ml的滴度，向大鼠骨髓间充质干细胞培养基中加入上述含BMP-4和VEGF全长基因序列的两类重组腺病毒颗粒悬液。

含有BMP-4和VEGF全长基因的重组自我清除型腺病毒和重组传统腺病毒构建成功，PCR扩增后电泳分析分别可见与BMP-4和VEGF基因吻合的片段(图4A)，收集DNA送基因公司测序与NCBI收录序列一致。这两类四种重组自我清除型腺病毒分别命名为AdEasyN-BMP-4、AdEasyN-VEGF和AdEasy-BMP-4、AdEasy-VEGF。重组自我清除型腺病毒AdEasyN-BMP-4和AdEasyN-VEGF可顺利感染大鼠骨髓间充质干细胞；感染48h后可观察到绿色荧光的表达，其表达强度与AdEasy-BMP-4和AdEasy-VEGF无明显区别(图4B、C、D、E)。而重组自我清除型腺病毒的构建过程与基于AdEasyTM系统的重组传统腺病毒没有区别。

实施例3

重组腺病毒工作效能的验证：

①取上述重组自我清除型腺病毒AdEasyN-BMP-4和AdEasyN-VEGF及基于传统AdEasy^TM构建的AdEasy-BMP-4和AdEasy-VEGF，感染大鼠BMSCs；48h后，加入Dox，使Dox在培养基内的终浓度为10umol/L；

②5天后，观察加入Dox的重组自我清除型腺病毒AdEasyN-BMP-4和AdEasyN-VEGF及基于传统AdEasy^TM构建的AdEasy-BMP-4和AdEasy-VEGF的绿色荧光表达情况，评估自我清除型重组腺病毒的降解效率；

③按ELISA试剂盒说明书所述方法步骤，检测4组细胞培养基中细胞因子BMP-4和VEGF的水平；

④按实时定量RT-PCR试剂盒说明书所述方法步骤，检测4组细胞中BMP-4和VEGF的mRNA的水平。

加入诱导剂Dox后，AdEasyN-BMP-4和AdEasyN-VEGF感染组绿色荧光强度、BMP-4和VEGF mRNA水平、蛋白水平均迅速降低至诱导降解前的20％左右，而AdEasy-BMP-4和AdEasy-VEGF感染组则无明显改变(图5)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 李元朝

<120>一种自我清除型腺病毒载体及其制备方法

<160> <210> 1 <211> 7469

<212> pShuttle-CMV全基因组序列

<213> Artificial(人工序列)

<220>

<221>

<222> （1）..（103）

<223> left Ad5 inverted terminal repeat(ITR)

<222> （183）..（331）

<223> encapsidation signal(ES)

<222> （341）..（933）

<223> CMV promoter

<222> （888）..（907）

<223> forward primer bingding site

<222> （940）..（987）

<223> multiple cloning site

<222> （1009）..（1031）

<223> reverse primer binding site

<222> （1011）..（1238）

<223> SV40 polyA signal

<222> （1243）..（3497）

<223> Ad5 right arm homology

<222> （3545）..（34428）

<223> Ad5 left arm homology

<222> （4429）..（4531）

<223> right Ad5 inverted terminal repeat(ITR)

<222> （4735）..（5402）

<223> pBR322 origin of replication

<222> （6211）..（7002）

<223> kanamycin resistance ORF

<220>

<221>

<222> （940）..（945）

<223> kpnI酶切位点

<222> （946）..（950）

<223> SalI酶切位点

<222> （952）..（959）

<223> NotI酶切位点

<222> （959）..（954）

<223> XhoI酶切位点

<222> （968）..（973）

<223> HindⅢ酶切位点

<222> （982）..（987）

<223> EcoR V酶切位点

<222> （3516）..（3523）

<223> PmeI酶切位点

<400> 1

catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60

ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120

gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180

gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240

taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300

agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tactgtaata gtaatcaatt 360

acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 420

ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 480

cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 540

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aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 660

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tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 780

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ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 1200

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ggtcgttgag ggtcctgtgt attttttcca ggacgtggta aaggtgactc tggatgttca 1920

gatacatggg cataagcccg tctctggggt ggaggtagca ccactgcaga gcttcatgct 1980

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cagtgtatcc ggtgcacttg ggaaatttgt catgtagctt agaaggaaat gcgtggaaga 2280

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gcggtataat ggttccatcc ggcccagggg cgtagttacc ctcacagatt tgcatttccc 2520

acgctttgag ttcagatggg gggatcatgt ctacctgcgg ggcgatgaag aaaacggttt 2580

ccggggtagg ggagatcagc tgggaagaaa gcaggttcct gagcagctgc gacttaccgc 2640

agccggtggg cccgtaaatc acacctatta ccggctgcaa ctggtagtta agagagctgc 2700

agctgccgtc atccctgagc aggggggcca cttcgttaag catgtccctg actcgcatgt 2760

tttccctgac caaatccgcc agaaggcgct cgccgcccag cgatagcagt tcttgcaagg 2820

aagcaaagtt tttcaacggt ttgagaccgt ccgccgtagg catgcttttg agcgtttgac 2880

caagcagttc caggcggtcc cacagctcgg tcacctgctc tacggcatct cgatccagca 2940

tatctcctcg tttcgcgggt tggggcggct ttcgctgtac ggcagtagtc ggtgctcgtc 3000

cagacgggcc agggtcatgt ctttccacgg gcgcagggtc ctcgtcagcg tagtctgggt 3060

cacggtgaag gggtgcgctc cgggctgcgc gctggccagg gtgcgcttga ggctggtcct 3120

gctggtgctg aagcgctgcc ggtcttcgcc ctgcgcgtcg gccaggtagc atttgaccat 3180

ggtgtcatag tccagcccct ccgcggcgtg gcccttggcg cgcagcttgc ccttggagga 3240

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cgattccggg gagtaggcat ccgcgccgca ggccccgcag acggtctcgc attccacgag 3360

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gcacatcgta gtcatgctca tgcagataaa ggcaggtaag ctccggaacc accacagaaa 3660

aagacaccat ttttctctca aacatgtctg cgggtttctg cataaacaca aaataaaata 3720

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cataagacgg actacggcca tgccggcgtg accgtaaaaa aactggtcac cgtgattaaa 3840

aagcaccacc gacagctcct cggtcatgtc cggagtcata atgtaagact cggtaaacac 3900

atcaggttga ttcacatcgg tcagtgctaa aaagcgaccg aaatagcccg ggggaataca 3960

tacccgcagg cgtagagaca acattacagc ccccatagga ggtataacaa aattaatagg 4020

agagaaaaac acataaacac ctgaaaaacc ctcctgccta ggcaaaatag caccctcccg 4080

ctccagaaca acatacagcg cttccacagc ggcagccata acagtcagcc ttaccagtaa 4140

aaaagaaaac ctattaaaaa aacaccactc gacacggcac cagctcaatc agtcacagtg 4200

taaaaaaggg ccaagtgcag agcgagtata tataggacta aaaaatgacg taacggttaa 4260

agtccacaaa aaacacccag aaaaccgcac gcgaacctac gcccagaaac gaaagccaaa 4320

aaacccacaa cttcctcaaa tcgtcacttc cgttttccca cgttacgtca cttcccattt 4380

taagaaaact acaattccca acacatacaa gttactccgc cctaaaacct acgtcacccg 4440

ccccgttccc acgccccgcg ccacgtcaca aactccaccc cctcattatc atattggctt 4500

caatccaaaa taaggtatat tattgatgat gttaattaac atgcatggat ccatatgcgg 4560

tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 4620

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 4680

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 4740

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 4800

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 4860

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 4920

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 4980

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 5040

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 5100

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 5160

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 5220

tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 5280

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 5340

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 5400

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 5460

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 5520

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 5580

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 5640

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 5700

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 5760

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 5820

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagc catgagatta 5880

tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttc acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc 5940

tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag 6000

agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg 6060

acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc 6120

aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagctct 6180

gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt 6240

tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc 6300

tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag 6360

accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg 6420

gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac 6480

tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc 6540

gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc 6600

tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc 6660

ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg 6720

ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat 6780

gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc 6840

cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa 6900

gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat 6960

tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaatttt gttaaaattt 7020

ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaccatcc cttataaatc 7080

aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt 7140

aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact 7200

acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt gtggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg 7260

gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag 7320

aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac 7380

gctgcgcgta accaccacac ccgcgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtccattcgc 7440

cattcaggat cgaattaatt cttaattaa 7469

<210> 2 <211> 765 <212> rtetR-VP16基因序列 <213> Artificial(人工序列)

<400> 2

atgtctagac tggacaagag caaagtcata aacggcgctc tggaattact caatggagtc 60

ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc tgggagttga gcagcctacc 120

ctgtactggc acgtgaagaa caagcgggcc ctgctcgatg ccctgccaat cgagatgctg 180

gacaggcatc atacccactt ctgccccctg gaaggcgagt catggcaaga ctttctgcgg 240

aacaacgcca agtcattccg ctgtgctctc ctctcacatc gcgacggggc taaagtgcat 300

ctcggcaccc gcccaacaga gaaacagtac gaaaccctgg aaaatcagct cgcgttcctg 360

tgtcagcaag gcttctccct ggagaacgca ctgtacgctc tgtccgccgt gggccacttt 420

acactgggct gcgtattgga ggaacaggag catcaagtag caaaagagga aagagagaca 480

cctaccaccg attctatgcc cccacttctg agacaagcaa ttgagctgtt cgaccggcag 540

ggagccgaac ctgccttcct tttcggcctg gaactaatca tatgtggcct ggagaaacag 600

ctaaagtgcg aaagcggcgg gccggccgac gcccttgacg attttgactt agacatgctc 660

ccagccgatg cccttgacga ctttgacctt gatatgctgc ctgctgacgc tcttgacgat 720

tttgaccttg acatgctccc ccctctcgag cctctagaac tatag 765

<210> 3 <211> 1620 <212> TRE-PminCMV-Cre基因序列 <213> Artificial(人工序列)

<400> 3

ctcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc 60

tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa 120

gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc 180

actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag 240

agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag 300

ctcggtaccc gggtcgagta ggcgtgtacg gtgggaggcc tatataagca gagctcgttt 360

agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 420

ccgggaccga tccagcctcc gcggccccga attcgagctc ggtacccggg gatccgccac 480

catggggaaa tccaacagca agttgaagcc tgaagttgtg gaggagctga ccagaaaaac 540

ctacttcact gaaaaggaag tacagcagtg gtacaagggt ttcattaaat gtccaattta 600

ctgaccgtac accaaaattt gcctgcatta ccggtcgatg caacgagtga tgaggttcgc 660

aagaacctga tggacatgtt cagggatcgc caggcgtttt ctgagcatac ctggaaaatg 720

cttctgtccg tttgccggtc gtgggcggca tggtgcaagt tgaataaccg gaaatggttt 780

cccgcagaac ctgaagatgt tcgcgattat cttctatatc ttcaggcgcg cggtctggca 840

gtaaaaacta tccagcaaca tttgggccag ctaaacatgc ttcatcgtcg gtccgggctg 900

ccacgaccaa gtgacagcaa tgctgtttca ctggttatgc ggcggatccg aaaagaaaac 960

gttgatgccg gtgaacgtgc aaaacaggct ctagcgttcg aacgcactga tttcgaccag 1020

gttcgttcac tcatggaaaa tagcgatcgc tgccaggata tacgtaatct ggcatttctg 1080

gggattgctt ataacaccct gttacgtata gccgaaattg ccaggatcag ggttaaagat 1140

atctcacgta ctgacggtgg gagaatgtta atccatattg gcagaacgaa aacgctggtt 1200

agcaccgcag gtgtagagaa ggcacttagc ctgggggtaa ctaaactggt cgagcgatgg 1260

atttccgtct ctggtgtagc tgatgatccg aataactacc tgttttgccg ggtcagaaaa 1320

aatggtgttg ccgcgccatc tgccaccagc cagctatcaa ctcgcgccct ggaagggatt 1380

tttgaagcaa ctcatcgatt gatttacggc gctaaggatg actctggtca gagatacctg 1440

gcctggtctg gacacagtgc ccgtgtcgga gccgcgcgag atatggcccg cgctggagtt 1500

tcaataccgg agatcatgca agctggtggc tggaccaatg taaatattgt catgaactat 1560

atccgtaacc tggatagtga aacaggggca atggtgcgcc tgctggaaga tggcgattag 1620

<210> 4 <211> 1226 <212> BMP-4 基因序列 <213> Artificial(人工序列)

<400> 4

tgattcctgg taaccgaatg ctgatggtcg ttttattatg ccaagtcctg ctaggaggcg 60

cgagccatgc tagtttgata cctgagacgg ggaagaaaaa agtcgccgag attcagggcc 120

acgcgggagg acgccgctca gggcagagcc atgagctcct gcgggacttc gaggcgacac 180

ttctgcagat gtttgggctg cgccgccgcc cgcagcctag caagagtgcc gtcattccgg 240

actacatgcg ggatctttac cggcttcagt ctggggagga ggaggaagag cagatccaca 300

gcactggtct tgagtatcct gagcgcccgg ccagccgggc caacaccgtg aggagcttcc 360

accacgaaga acatctggag aacatcccag ggaccagtga aaactctgct tttcgtttcc 420

tctttaacct cagcagcatc cctgagaacg aggtgatctc ctctgcagag cttcggctct 480

tccgggagca ggtggaccag ggccctgatt gggaaagggg cttccaccgt ataaacattt 540

atgaggttat gaagccccca gcagaagtgg tgcctgggca cctcatcaca cgactactgg 600

acacgagact ggtccaccac aatgtgacac ggtgggaaac ttttgatgtg agccctgcgg 660

tccttcgctg gacccgggag aagcagccaa actatgggct agccattgag gtgactcacc 720

tccatcagac tcggacccac cagggccagc atgtcaggat tagccgatcg ttacctcaag 780

ggagtgggaa ttgggcccag ctccggcccc tcctggtcac ctttggccat gatggccggg 840

gccatgcctt gacccgacgc cggagggcca agcgtagccc taagcatcac tcacagcggg 900

ccaggaagaa gaataagaac tgccggcgcc actcgctcta tgtggacttc agcgatgtgg 960

gctggaatga ctggattgtg gccccaccag gctaccaggc cttctactgc catggggact 1020

gcccctttcc actggctgac cacctcaact caaccaacca tgccattgtg cagaccctgg 1080

tcaattctgt caattccagt atccccaaag cctgttgtgt gcccactgaa ctgagtgcca 1140

tctccatgct gtacctggat gagtatgata aggtggtact gaaaaattat caggagatgg 1200

tagtagaggg atgtgggtgc cgctga 1226

<210> 5 <211> 576 <212> VEGF基因序列

<213> Artificial(人工序列)

<400> 5

atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60

gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggagggg ggcagaatca tcacgaagtg 120

gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180

atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240

atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300

aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360

agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420

aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480

tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540

gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga 576

<210> 6 <211> 50 <212>插入PemI位点的LoxP序列5'→3'

<213> Artificial(人工序列)

<400> 6

gtttaaacat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atgtttaaac 50

<210> 7 <211> 46 <212>插入EcoRV位点的LoxP序列5'→3'

<213> Artificial(人工序列)

<400> 7

gatatcataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat gatatc 46

Claims (2)

1.一种自我清除型腺病毒，基于AdEasy^TM腺病毒载体系统进行改造，所用穿梭质粒为pShuttle-CMV，其特征在于：所述改造是指在穿梭质粒pShuttle-CMV插入rtetR-VP16基因序列、TRE-PminCMV-Cre基因序列及两个同向的LoxP位点；

rtetR-VP16序列插入穿梭质粒pShuttle-CMV的多克隆位点中的kpnI酶切位点，TRE-PminCMV-Cre序列插入穿梭质粒pShuttle-CMV的多克隆位点中的XhoI酶切位点，rtetR-VP16序列如SEQ ID NO.2所示，TRE-PminCMV-Cre序列如SEQ ID NO.3所示，两个LoxP位点序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示, SEQ ID NO.6插入PemI酶切位点,SEQ ID NO.7插入多克隆位点中的EcoRV酶切位点；

所述腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

（1）在pShuttle-CMV穿梭质粒上插入Tet-On系统的rtetR-VP16和TRE-PminCMV-Cre基因，并在PemI和EcoRV酶切位点插入Cre-Loxp系统的两个LoxP位点，得到重组穿梭质粒pShuttleN；

（2）骨架质粒和重组穿梭质粒同源重组，包装，收集腺病毒颗粒。

2.采用权利要求1所述自我清除型腺病毒进行自我清除的方法，包括以下步骤：在组织工程所需种子细胞感染所述自我清除型腺病毒48h后，一次性加入诱导剂Dox，使培养基内Dox终浓度为10μmol/L；在Dox作用下，腺病毒载体自我清除，5天后外源蛋白的mRNA和蛋白水平降至诱导前的10%～20%，进行移植。