CN112301002B - 一种减毒型狂犬病毒的制备方法与应用 - Google Patents

一种减毒型狂犬病毒的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种减毒型狂犬病毒的制备方法与应用，首先构建稳定表达核定位绿色荧光和EnvARVG蛋白的细胞系BHK‑EnvARVG，用B7GG细胞系快速拯救和制备CVS‑N2c‑ΔG‑tdTomato病毒，然后感染BHK‑EnvARVG细胞系制备高滴度的EnvARVG假型的CVS‑N2c‑ΔG‑tdTomato病毒。与现有技术相比，本发明解决了CVS‑N2c‑ΔG病毒难以生产的问题，通过CVS‑N2c‑ΔG‑tdTomato/oG系统可以进一步提高跨突触效率，其跨突触效率是SAD‑B19‑ΔG‑DsRed/oG系统的3‑4倍。

Description

一种减毒型狂犬病毒的制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种减毒型狂犬病毒的制备方法与应用。
背景技术
神经环路示踪与功能研究需要顺行的和逆行的病毒示踪剂。利用反向遗传学技术，Wickersham等基于RV疫苗株SAD-B19获得重组狂犬病毒感染性克隆，缺失了编码包膜糖蛋白的RVG基因，并插入多克隆位点，可携带各种荧光基因等外源基因，并在神经元中实现高丰度表达，从而清晰地标记神经元的精细形态。利用禽类肉瘤病毒(avian sarcoma-leukosis virus，ASLV)囊膜糖蛋白(EnvA)特异识别其受体蛋白TVA的原理，将EnvA的膜外区与跨膜区和RVG胞内区融合，构建表达嵌合的EnvARVG膜蛋白的慢病毒或逆转录病毒载体，建立稳定细胞系并用于包装SAD-B19-ΔG病毒，形成的假型病毒只能特异性识别和感染TVA阳性的起始神经元。结合Cre转基因鼠和AAV辅助病毒反向补偿Cre控制表达的RVG和TVA，EnvARVG假型的SAD-B19-ΔG病毒可以实现可控地逆向跨单突触标记特异类型神经元的输入网络。国内外科研工作者用这套系统解决了大量了神经科学问题，但其只能标记少量的上游神经细胞，可能导致有关联的输入网络连接被忽略，且毒性较大，不利于长时间搭载功能基因用于神经活动检测或功能操控，如何提高它的跨突触效率和减小毒性也是神经科学界努力的方向。利用密码子优化的嵌合型糖蛋白(oG)可以辅助SAD-B19-ΔG跨突触示踪效率提高20倍，此后多个实验室都采用表达oG的腺相关病毒作为辅助载体来追踪神经网络上游输入。在SAD-B19-ΔG基础上改造的自身失活的狂犬病毒(Self-inactivatingrabies virus，SiR)，通过快速降解病毒复制相关的N蛋白，可携带cre或flp重组酶结合表达功能探针的腺相关病毒等用于功能网络的研究，但也存在制备工艺复杂，自身表达弱，不能搭载功能探针等缺陷。Chatterjee等报道了无毒的G跟L蛋白双缺失的SAD-B19-ΔGL，但其只有极弱的表达能力，只能通过搭载cre或flp重组酶结合表达功能探针的AAV病毒或转基因动物等用于功能网络的活动监测与操控，同时，由于L基因比较大，需要采用合适的辅助病毒载体策略或制作表达L的转基因动物来实现跨单突触，不过此方法目前还没有被实现，且效率也未知。Reardon等建立了CVS-N2c株狂犬病毒改造的逆行跨单突触系统，在基因组缺失了自身糖蛋白N2cG后，通过反向补偿N2cG，与SAD-B19疫苗株相比其逆行跨突触能力明显增强且对神经元的毒性进一步减小，可表达钙离子探针和光遗传探针等功能探针用于功能环路的解析，因而在神经环路示踪中更有优势，但也存在制备非常困难、滴度低等缺点，因而后续还未见其用于环路示踪的相关报道，同时oG能否结合CVS-N2c-ΔG提高跨突触效率也未知。
发明内容
为了解决在神经环路示踪中更有优势的减毒型狂犬病毒CVS-N2c-ΔG存在的问题，本发明公开了一种减毒型狂犬病毒CVS-N2c-ΔG-tdTomato的制备方法，并将其用于逆行跨单突触标记，CVS-N2c-ΔG-tdTomato/oG系统可以进一步提高跨突触效率，为SAD-B19-ΔG-DsRed/oG系统的3-4倍。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种减毒型狂犬病毒CVS-N2c-ΔG-tdTomato，其制备方法如下：
(1)将SEQ ID NO.3所示的H2B-GFP-P2A-EnvARVG片段与慢病毒载体(比如FUGW载体、pCDH-CMV载体等)连接，获得的慢病毒转移载体与慢病毒包装载体共转染293T细胞，收集慢病毒并感染BHK细胞，得到稳定表达核定位绿色荧光和EnvARVG蛋白的细胞系BHK-EnvARVG；
(2)B7GG细胞拯救和制备CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒；
(3)用CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒感染BHK-EnvARVG细胞制备EnvARVG假型的CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒。
减毒型狂犬病毒CVS-N2c-ΔG-tdTomato结合表达嵌合型糖蛋白oG的AAV辅助病毒用于逆行跨单突触标记：在本发明的实施例中将携带CRE重组酶控制表达的AAV-Ef1a-DIO-H2B-GFP-2A-oG-WPRE-hGH和AAV-Ef1a-DIO-TVA-WPRE-hGH的辅助病毒混合注射到Thy1-cre转基因小鼠的腹侧海马区，3周后在同一位点分别注射EnvARVG包裹的CVS-N2c-ΔG-tdTomato和SAD-B19-ΔG-DsRed病毒，通过统计比较发现CVS-N2c-ΔG-tdTomato/oG系统跨突触效率为SAD-B19-ΔG-DsRed系统的3-4倍。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、提供了一种减毒型狂犬病毒CVS-N2c-ΔG-tdTomato的快速制备方法，即用易于培养并且表达其他狂犬病毒株(SAD-B19)的外膜糖蛋白(B19G)的细胞系(B7GG细胞系)来快速拯救和制备CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒，然后感染建立的BHK-EnvARVG细胞系制备高滴度的EnvARVG假型的CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒，解决了CVS-N2c-ΔG病毒难以生产的问题。
2、建立了CVS-N2c-ΔG-tdTomato/oG逆行跨单突触系统，可以进一步提高跨突触效率，为SAD-B19-ΔG-DsRed/oG系统的3-4倍，在神经科学领域具有广泛的应用价值和市场前景。
附图说明
图1 CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒的拯救与扩增：(A)稳定表达核定位绿色荧光和B19G的B7GG细胞系；(B)CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒的拯救，红色信号表示病毒拯救成功；(C)CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒的扩增；(D)B19G包裹的SAD-B19-ΔG-DsRed和CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒上清滴度比较(B19G包裹的SAD-B19-△G-DsRed的上清滴度为1.04±0.26ⅹ106IU/ml；B19G包裹的CVS-N2c-ΔG-tdTomato的上清滴度为0.88±0.30ⅹ106IU/ml；P＝0.6978)，统计数值用平均值±SEM表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns，没有显著性差异，比例尺为100μm，图中“SAD-B19”为“SAD-B19-ΔG-DsRed”简称，“CVS-N2c”为“CVS-N2c-ΔG-tdTomato”简称。
图2稳定细胞系BHK-EnvARVG的建立。稳定表达核定位绿色荧光和EnvARVG的细胞系，可以用于EnvARVG假型病毒的生产。比例尺为100μm。
图3 EnvARVG假型的CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒的制备：(A)BHK-EnvARVG细胞系；(B)CVS-N2c-ΔG-tdTomato(B19G)感染BHK-EnvARVG细胞系制备EnvARVG假型的CVS-N2c-ΔG-tdTomato，感染比例较高；(C)EnvARVG包装的SAD-B19-ΔG-DsRed和CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒的上清滴度比较(EnvARVG包装的SAD-B19-ΔG-DsRed的上清滴度为7.46±1.15ⅹ105IU/ml；EnvARVG包装的CVS-N2c-ΔG-tdTomato的上清滴度为4.88±0.97ⅹ105IU/ml；P＝0.1242)，统计数值用平均值±SEM表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns，没有显著性差异，比例尺为100μm，图中“SAD-B19”为“SAD-B19-ΔG-DsRed”简称，“CVS-N2c”为“CVS-N2c-ΔG-tdTomato”简称。
图4 CVS-N2c-ΔG-tdTomato与SAD-B19-ΔG-DsRed结合oG跨突触效率比较：(A)跨单突触病毒注射示意图，将携带Cre重组酶控制表达的oG和TVA的腺相关病毒混合注射到Thy1-Cre转基因小鼠的腹侧海马区(vHPC)，3周后在同一位点分别注射EnvARVG包裹的CVS-N2c-ΔG-tdTomato和SAD-B19-ΔG-DsRed，7天后处理脑片和利用玻片扫描仪成像；(B)注射位点起始细胞信号，oG的绿色荧光信号与RV的红色荧光信号可以共标；(C)oG辅助SAD-B19-ΔG-DsRed跨突触到对侧腹侧海马，c1为C图的局部放大图；(D)oG辅助CVS-N2c-ΔG-tdTomato跨突触到对侧腹侧海马，d1为D图的局部放大图；(E)跨突触到对侧腹侧海马的细胞数与起始细胞数的比值统计，发现CVS-N2c-ΔG-tdTomato/oG系统跨突触效率为SAD-B19-ΔG-DsRed/oG系统的3-4倍(CVS-N2c-ΔG-tdTomato/oG：1.87±0.16；SAD-B19-ΔG-DsRed/oG：0.60±0.06；P＝0.0014)，统计数值用平均值±SEM表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns，没有显著性差异。比例尺：图B/c1/d1为100μm，图C/D为500μm。图中“SAD-B19”为“SAD-B19-ΔG-DsRed”简称，“CVS-N2c”为“CVS-N2c-ΔG-tdTomato”简称。
具体实施方式
实施例1减毒型狂犬病毒CVS-N2c-ΔG的制备方法
一、BHK-EnvARVG稳定细胞系建立
以DIO-EF1a-FLEX-H2B-GFP-P2A-N2cG质粒(addgene编号#73476)为模板，用引物H2B-GFP-P2A-F和H2B-GFP-P2A-R扩增获得H2B-GFP-P2A片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；以PMD-19T-EnvARVG质粒(武汉枢密脑科学技术有限公司提供)为模版，用引物2A-EnvARVG-F和2A-EnvARVG-R扩增获得2A-EnvARVG片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；以获得的前两个片段为模版，用引物H2B-GFP-P2A-F和2A-EnvARVG-R进行融合PCR扩增获得H2B-GFP-P2A-EnvARVG片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；利用试剂盒One StepCloning Kit(Vazyme公司)重组克隆将H2B-GFP-P2A-EnvARVG连入经BamHI和EcoRI线性化的FUGW载体(addgene编号#14883)获得FUGW-H2B-GFP-P2A-EnvARVG慢病毒转移载体。测序验证正确的慢病毒核心质粒FUGW-H2B-GFP-P2A-EnvARVG与骨架质粒pMDLg/pRRE(addgene#12251)、pRSV-Rev(addgene#12253)、pMD2.G(addgene#12259)共转染293T细胞，24h和48h后观察荧光情况，并在48h和72h收集上清，用0.22μm滤膜过滤，得到FUGW-H2B-GFP-P2A-EnvARVG慢病毒。将收集到的FUGW-H2B-GFP-P2A-EnvARVG慢病毒测定感染滴度后感染BHK细胞(按感染复数MOI＝5)，置于35℃，3％CO2细胞培养箱中继续培养24h小时后换新鲜的培养基，72h后观察细胞状态与荧光比例并进行传代，荧光比例达到90％以上，传代5次后进行保种。将得到的带核定位绿色荧光的稳定细胞系命名为BHK-EnvARVG。所涉及到的PCR扩增引物序列如下：
H2B-GFP-P2A-F:TTGTTAGACAGGATCCATGCCAGAGCCAGCGAAG
H2B-GFP-P2A-R:CTTTATGACGGCTTCCATTGGGCCAGGATTCTCCTCGA
2A-EnvARVG-F:GAGGAGAATCCTGGCCCAATGGAAGCCGTCATAAAGGC
2A-EnvARVG-R:GCTTGATATCGAATTCTCACAGTCTGGTCTCACC
所有PCR使用引物和测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
二、病毒拯救与制备
1、病毒拯救
(1)培养B7GG细胞(该细胞已在“Nat Protoc.2013Aug；8(8):1583-601.”中报道，中国科学院精密测量科学与技术创新研究院徐富强研究员实验室保存有该细胞，如公众需要，申请人承诺从申请日起二十年内向公众发放该生物材料)，待细胞传代稳定且生长状态好后，用0.25％胰酶消化1.5-2分钟，按照一定比例进行传代，并铺6孔板，每孔添加2ml含10％FBS和1％双抗的DMEM培养基，置于37℃，5％CO2培养箱内培养过夜。
(2)20h后，6孔板孔内细胞密度达70％-80％时，将孔内培养基吸除，补加1mL减血清培养基opti-MEM(Gibco)，37℃，5％CO2培养箱内继续培养待用。
(3)将用质粒大提试剂盒提取的核心质粒CVS-N2c-ΔG-tdTomato(addgene编号#73462)与骨架质粒(pCAG-B19P、pCAG-B19N、pCAG-B19L、pCAG-B19G，Osakada etal.Neuron.2011 Aug 25；71(4):617-31.)共转染B7GG细胞，置于35℃，3％CO2培养箱内继续培养。
(4)5-6h后，将孔内培养基吸除，补加2mL含3％FBS和1％双抗的DMEM培养基，置于35℃，3％CO2培养箱内继续培养。
(5)转染72-120h，在倒置荧光显微镜下进行观察，出现红色荧光信号，说明病毒拯救成功。
2、病毒扩增
(1)将病毒拯救成功的细胞用0.25％胰酶消化1.5-2min，用含5％FBS和1％双抗的培养基将细胞进行重悬后按1:3铺到6孔板继续培养，48h后消化并将两个孔合并转移至T75培养瓶内，35℃，3％CO2培养箱内培养过夜。
(2)48h后，待荧光比例达70％以上，可收集上清用于浓缩，如果需要较大量病毒，可用0.25％胰酶消化2min，按照一定比例对细胞进行传代扩增，35℃，3％CO2培养箱内继续培养，48和72小时后各收集一次上清，中间补加12ml新鲜的3％FBS、1％双抗的DMEM培养基，将病毒液上清离心(6000g，10min)去细胞碎片沉淀后用0.22微米滤器过滤，放于-80℃超低温冰箱内保存。并用10×梯度稀释法对病毒上清滴度进行测定，测定细胞为293T细胞。注意：用B19G生产病毒主要是用于制备EnvARVG假型的病毒，不需要很多量，应减少传代次数。病毒拯救与扩增周期为10-14天。
3、EnvARVG假型病毒的制备
(1)复苏BHK-EnvARVG细胞。细胞传代比例为1:2或1:2.5。传代周期为1-2天。
(2)第二天观察细胞生长状态，汇合度达到70％-80％左右时感染RV病毒。即弃去原来的培养基后再加入12ml过滤后的B19G包裹的RV病毒液(分别包括CVS-N2c-ΔG-tdTomato和SAD-B19-ΔG-DsRed病毒，SAD-B19-ΔG-DsRed病毒由武汉枢密脑科学技术有限公司提供，每个T75培养瓶)。一小时后轻轻晃动一次。
(3)48小时后，弃去病毒液。用PBS清洗细胞3遍后用胰酶消化。T75培养瓶使用1.5-2.0ml 0.25％胰酶，消化2-3min，一般按1:1传到一个新的培养瓶中，使用10％FBS培养基。
(4)24小时后，去掉培养基，用PBS清洗细胞3遍后用胰酶再次消化，同上。一般按1:4传到新的T75培养瓶中，使用10％FBS培养基。置于37℃，5％CO2培养箱内培养过夜。然后置于35℃，3％CO2培养箱内继续培养。每隔24小时收集一次上清，中间补加12ml新鲜的3％FBS、1％双抗的DMEM培养基。病毒生产周期为5-7天。
4、病毒浓缩
(1)将病毒液上清置于高速离心管内，每管病毒体积约40mL。50000g，4℃条件下离心2.5h。
(2)第一次离心后，弃去上清，用适量PBS将沉淀进行重悬，并进行低速离心，6000g，3min。
(3)低速离心结束后，小心吸取上清，去掉沉淀。取上清300-400μL置于事先装有0.8mL 20％蔗糖溶液的EP管中。用分析天平(ME104E)称重配平，50000g，2.5h，4℃条件下进行第二次高速离心。
(4)第二次离心后，弃去上清，用适量体积PBS溶液将沉淀进行重悬，并进行低速离心，6000g，3min。
(5)低速离心后，将上清进行分装，分装体积为3微升/管。将病毒放于-80℃超低温冰箱内保存。
5、滴度测定
(1)第一天，消化293T细胞(EnvARVG假型的病毒则使用293T-TVA800(Osakada etal.Nat Protoc.2013Aug 25；8(8):1583-1601.)进行滴度测定)，按照一定比例铺24孔板，确保第二天细胞密度达90％以上。37℃，5％CO2培养箱内培养过夜。
(2)从-80℃超低温内取浓缩后病毒1管，按照梯度稀释法对病毒进行梯度稀释。一般稀释比例从100到10-6，涡旋混匀。
(3)吸除24孔板内培养基，将病毒液加入对应的孔内。每个样品共两个平行样。35℃，3％CO2培养箱内继续培养。感染48h，在倒置荧光显微镜下观察稀释孔内对应荧光比例，并对孔内荧光细胞数在10-100个数的孔进行计数。取平均值乘以稀释倍数得到病毒滴度。
三、CVS-N2c-ΔG快速制备系统的建立
之前报道的CVS-N2c-ΔG病毒的制备工艺主要采用的是Neuro2A建立的用于病毒包装与拯救的细胞系，同时采用的是自身的外膜糖蛋白做成的细胞系进行病毒的拯救与生产，需要花费很长的时间，且Neuro2A细胞本身不容易培养，往往导致病毒生产效率低下，周期长，滴度低等问题。本发明尝试用易于培养的细胞以及其他狂犬病毒株的外膜糖蛋白建立的细胞系B7GG来快速拯救和制备CVS-N2c-ΔG病毒。首先，利用B7GG细胞系对CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒进行拯救，发现在拯救第五天就能观察到明显的荧光信号，如图1A和图1B所示，且能够快速扩增，如图1C所示。收集上清进行滴度测定，发现其与SAD-B19-ΔG-DsRed上清滴度没有显著性差异(SAD-B19-ΔG-DsRed：1.04±0.26ⅹ106IU/ml；CVS-N2c-ΔG-tdTomato：0.88±0.30ⅹ106IU/ml；P＝0.6978)，如图1D所示。这些结果表明B7GG细胞系可以快速拯救和制备CVS-N2c-ΔG病毒。为了制备EnvARVG假型的CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒，构建了稳定表达核定位绿色荧光和EnvARVG蛋白的细胞系EnvARVG，如图2所示。利用B7GG细胞系生产的CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒感染BHK-EnvARVG细胞系，感染比例较高，如图3A和图3B所示，测定上清滴度并与EnvARVG假型的SAD-B19-ΔG-DsRed病毒进行比较，发现没有显著性差异(SAD-B19-ΔG-DsRed：7.46±1.15ⅹ105IU/ml；CVS-N2c-ΔG-tdTomato：4.88±0.97ⅹ105IU/ml；P＝0.1242)，表明BHK-EnvARVG细胞系能够制备高滴度的EnvARVG假型的CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒。
实施例2 CVS-N2c-ΔG-tdTomato与SAD-B19-ΔG-DsRed结合oG跨突触效率比较
将不同来源病毒株结合不同来源的外膜糖蛋白可能具有不同的跨突触效率。利用密码子优化的狂犬病毒Pasteur株来源的嵌合型糖蛋白(oG)可以辅助SAD-B19-ΔG-DsRed跨突触示踪效率大大提高，此后SAD-B19-ΔG-DsRed/oG跨单突触系统被广泛用于追踪神经网络的上游输入。而oG是否能够辅助CVS-N2c-ΔG跨突触且效率如何尚未见报道。因此，有必要对不同的逆行跨单突触系统进行比较，将携带CRE重组酶控制表达的AAV-Ef1a-DIO-H2B-GFP-2A-oG-WPRE-hGH和AAV-Ef1a-DIO-TVA-WPRE-hGH的辅助病毒(武汉枢密脑科学技术有限公司提供)混合注射到Thy1-cre转基因小鼠(The Jackson Laboratory)的腹侧海马区，3周后在同一位点分别注射EnvARVG包裹的CVS-N2c-ΔG-tdTomato和SAD-B19-ΔG-DsRed病毒，七天后处理脑片和利用玻片扫描仪成像，如图4A所示，发现注射位点有大量oG与RV信号共标的细胞被标记(图4B)，同时可以高效跨突触到对侧腹侧海马区域(图4C)，通过统计比较发现CVS-N2c-ΔG-tdTomato/oG系统跨突触效率为SAD-B19-ΔG-DsRed系统的3-4倍。因此CVS-N2c-ΔG-tdTomato/oG可以作为重要的逆行跨单突触系统，有望用于解析特定脑区特异类型神经元的更多的上游输入连接网络。
序列表
<110> 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院
<120> 一种减毒型狂犬病毒的制备方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgttagaca ggatccatgc cagagccagc gaagtctgct cccgccccga aaaagggctc 60
caagaaggcg gtgactaagg cgcagaagaa aggcggcaag aagcgcaagc gcagccgcaa 120
ggagagctat tccatctatg tgtacaaggt tctgaagcag gtccaccctg acaccggcat 180
ttcgtccaag gccatgggca tcatgaattc gtttgtgaac gacattttcg agcgcatcgc 240
aggtgaggct tcccgcctgg cgcattacaa caagcgctcg accatcacct ccagggagat 300
ccagacggcc gtgcgcctgc tgctgcctgg ggagttggcc aagcacgccg tgtccgaggg 360
tactaaggcc atcaccaagt acaccagcgc taaggatcca ccggtcgcca ccatggtgag 420
caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 480
aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 540
gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 600
caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 660
cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 720
cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 780
catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 840
gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 900
ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 960
ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 1020
cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 1080
gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagg agggcagagg 1140
aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc ccaatggaag ccgtcataaa 1200
g 1201
<210> 2
<211> 1878
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgaggagaa tcctggccca atggaagccg tcataaaggc atttctgact ggataccctg 60
ggaagacgag caagaaggac tccaaggaga aaccgctagc aacaagcaag aaagacccgg 120
agaagacacc cttgctgcca acgagagtta attatattct cattattggt gtcctggtct 180
tgtgtgaggt tacgggggta agagctgatg tccacttact cgagcagcca gggaaccttt 240
ggattacatg ggccaaccgt acaggccaaa cggatttttg cctctctaca cagtcagcca 300
cctccccttt tcaaacatgt ttgataggta tcccgtcccc tatttccgag ggtgatttta 360
agggatatgt ttctgataca aattgcacca ccttgggaac tgatcggtta gtctcgtcag 420
ccgactttac tggcggacct gacaacagta ccaccctcac ttatcggaag gtctcatgct 480
tgttgttaaa gctgaatgtc tctatgtggg atgagccacc tgaactacag ctgttaggtt 540
cccagtctct ccctaacatt actaatattg ctcagatttc cggtataacc gggggatgcg 600
taggcttcag accacaaggg gttccttggt atctaggttg gtctagacag gaggccacgc 660
ggtttctcct tagacacccc tctttctcta aatccacgga accgtttacg gtggtgacag 720
cggataggca caatcttttt atggggagtg agtactgcgg tgcatatggc tacagatttt 780
ggaacatgta taactgctca caggtggggc ggcagtaccg ctgtggtaat gcgcgcagcc 840
cccgcccggg tcttcctgaa atccagtgta caaggagagg aggcaaatgg gttaatcaat 900
cacaggaaat taatgagtcg gagccgttca gctttacggt gaactgtaca gctagtagtt 960
tgggtaatgc cagtgggtgt tgcggaaaag caggcacgat tctcccggga aagtgggtcg 1020
acagcacaca aggtagtttc accaaaccaa aagcgctacc acccgcaatt ttcctcattt 1080
gtggggatcg cgcatggcaa ggaattccca gtcgtccggt agggggcccc tgctatttag 1140
gcaagcttac catgttagca cctaagcata cagatattct caaggtgctt gtcaattcat 1200
cgcggacagg tataagacgt aaacgaagca cctcacacct ggatgataca tgctcagatg 1260
aagtgcagct ttggggtcct acagcaagaa tctttgcatc tatcctagcc ccgggggtag 1320
cagctgcgca agccttaaga gaaattgaga gactagcctg ttggtccgtt aaacaggcta 1380
acttgacaac atcactcctc ggggacttat tggatgatgt cacgagtatt cgacacgcgg 1440
tcctgcagaa ccgagcggct attgacttct tgctcctagc tcacggccat ggctgtgagg 1500
acgttgccgg aatgtgctgt ttcaatttga gtgatcagag tgagtctata cagaagaagt 1560
tccagctaat gaaggaacat gtcaataaga tcggcgtgga tagcgaccta attggaagtt 1620
ggctgcgagg actattcggg ggaataggag aatgggccgt tcatttgctg aaaggactgc 1680
ttttggggct tgtagttatt ttgttgctag tagtgtgcct gccttgcaga agagtcaatc 1740
gatcagaacc tacgcaacac aatctcagag ggacagggag ggaggtgtca gtcactcccc 1800
aaagcgggaa gatcatatct tcatgggaat cacacaagag tgggggtgag accagactgt 1860
gagaattcga tatcaagc 1878
<210> 3
<211> 3041
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgttagaca ggatccatgc cagagccagc gaagtctgct cccgccccga aaaagggctc 60
caagaaggcg gtgactaagg cgcagaagaa aggcggcaag aagcgcaagc gcagccgcaa 120
ggagagctat tccatctatg tgtacaaggt tctgaagcag gtccaccctg acaccggcat 180
ttcgtccaag gccatgggca tcatgaattc gtttgtgaac gacattttcg agcgcatcgc 240
aggtgaggct tcccgcctgg cgcattacaa caagcgctcg accatcacct ccagggagat 300
ccagacggcc gtgcgcctgc tgctgcctgg ggagttggcc aagcacgccg tgtccgaggg 360
tactaaggcc atcaccaagt acaccagcgc taaggatcca ccggtcgcca ccatggtgag 420
caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 480
aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 540
gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 600
caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 660
cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 720
cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 780
catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 840
gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 900
ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 960
ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 1020
cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 1080
gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagg agggcagagg 1140
aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc ccaatggaag ccgtcataaa 1200
ggcatttctg actggatacc ctgggaagac gagcaagaag gactccaagg agaaaccgct 1260
agcaacaagc aagaaagacc cggagaagac acccttgctg ccaacgagag ttaattatat 1320
tctcattatt ggtgtcctgg tcttgtgtga ggttacgggg gtaagagctg atgtccactt 1380
actcgagcag ccagggaacc tttggattac atgggccaac cgtacaggcc aaacggattt 1440
ttgcctctct acacagtcag ccacctcccc ttttcaaaca tgtttgatag gtatcccgtc 1500
ccctatttcc gagggtgatt ttaagggata tgtttctgat acaaattgca ccaccttggg 1560
aactgatcgg ttagtctcgt cagccgactt tactggcgga cctgacaaca gtaccaccct 1620
cacttatcgg aaggtctcat gcttgttgtt aaagctgaat gtctctatgt gggatgagcc 1680
acctgaacta cagctgttag gttcccagtc tctccctaac attactaata ttgctcagat 1740
ttccggtata accgggggat gcgtaggctt cagaccacaa ggggttcctt ggtatctagg 1800
ttggtctaga caggaggcca cgcggtttct ccttagacac ccctctttct ctaaatccac 1860
ggaaccgttt acggtggtga cagcggatag gcacaatctt tttatgggga gtgagtactg 1920
cggtgcatat ggctacagat tttggaacat gtataactgc tcacaggtgg ggcggcagta 1980
ccgctgtggt aatgcgcgca gcccccgccc gggtcttcct gaaatccagt gtacaaggag 2040
aggaggcaaa tgggttaatc aatcacagga aattaatgag tcggagccgt tcagctttac 2100
ggtgaactgt acagctagta gtttgggtaa tgccagtggg tgttgcggaa aagcaggcac 2160
gattctcccg ggaaagtggg tcgacagcac acaaggtagt ttcaccaaac caaaagcgct 2220
accacccgca attttcctca tttgtgggga tcgcgcatgg caaggaattc ccagtcgtcc 2280
ggtagggggc ccctgctatt taggcaagct taccatgtta gcacctaagc atacagatat 2340
tctcaaggtg cttgtcaatt catcgcggac aggtataaga cgtaaacgaa gcacctcaca 2400
cctggatgat acatgctcag atgaagtgca gctttggggt cctacagcaa gaatctttgc 2460
atctatccta gccccggggg tagcagctgc gcaagcctta agagaaattg agagactagc 2520
ctgttggtcc gttaaacagg ctaacttgac aacatcactc ctcggggact tattggatga 2580
tgtcacgagt attcgacacg cggtcctgca gaaccgagcg gctattgact tcttgctcct 2640
agctcacggc catggctgtg aggacgttgc cggaatgtgc tgtttcaatt tgagtgatca 2700
gagtgagtct atacagaaga agttccagct aatgaaggaa catgtcaata agatcggcgt 2760
ggatagcgac ctaattggaa gttggctgcg aggactattc gggggaatag gagaatgggc 2820
cgttcatttg ctgaaaggac tgcttttggg gcttgtagtt attttgttgc tagtagtgtg 2880
cctgccttgc agaagagtca atcgatcaga acctacgcaa cacaatctca gagggacagg 2940
gagggaggtg tcagtcactc cccaaagcgg gaagatcata tcttcatggg aatcacacaa 3000
gagtgggggt gagaccagac tgtgagaatt cgatatcaag c 3041

Claims (5)

1.一种减毒型狂犬病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将SEQ ID NO.3所示的H2B-GFP-P2A-EnvARVG片段与慢病毒载体连接，获得的慢病毒转移载体与慢病毒包装载体共转染293T细胞，收集慢病毒并感染BHK细胞，得到稳定表达核定位绿色荧光和EnvARVG蛋白的细胞系BHK-EnvARVG；
（2）B7GG细胞拯救和制备CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒；
（3）用CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒感染BHK-EnvARVG细胞制备EnvARVG假型的CVS-N2c-ΔG-tdTomato病毒。
2.权利要求1所述的方法制备的减毒型狂犬病毒。
3.逆行跨单突触系统，其特征在于，包括权利要求2所述的减毒型狂犬病毒和表达嵌合型糖蛋白oG的AAV辅助病毒。
4.权利要求2所述的减毒型狂犬病毒在制备逆行跨单突触标记药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，表达嵌合型糖蛋白oG的AAV辅助病毒辅助减毒型狂犬病毒跨单突触标记。
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