CN108220336A

CN108220336A - 基于细胞内NF-κB活性激活效应基因在NF-κB过度活化细胞内的基因表达及应用

Info

Publication number: CN108220336A
Application number: CN201711335257.2A
Authority: CN
Inventors: 王进科; 王丹阳; 戴薇
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-06-29
Also published as: WO2019114791A1

Abstract

本发明公开了一种NF‑κB特异性激活基因表达载体及其应用。该基因表达技术由一种NF‑κB特异性激活基因表达载体实现。该基因表达载体包含调控基因表达的启动子序列和启动子下游效应基因编码序列两个元件，其中启动子序列由一段NF‑κB应答序列和最小启动子序列组成。该基因表达载体导入NF‑κB过度活化细胞后，在序列特异性转录因子NF‑κB的激活下表达载体上的效应基因，由效应基因产生对细胞生理的影响，如细胞生长抑制、凋亡、死亡等。本发明提出的基因表达技术可用于治疗NF‑κB过度活化相关疾病，如炎症、癌症。本发明构建的基因表达载体可用于制备治疗NF‑κB过度活化相关疾病的基因治疗试剂及药物。

Description

基于细胞内NF-κB活性激活效应基因在NF-κB过度活化细胞内的基因表达及应用

技术领域

本发明涉及一种基于细胞内NF-κB活性激活效应基因在NF-κB过度活化细胞内的基因表达技术及应用，属于医学生物技术领域。

背景技术

NF-κB是在B淋巴细胞中发现的一种转录因子，因其参与免疫球蛋白κ轻链的转录调控而得名。后来发现NF-κB是一种广泛分布于各种细胞中的真核细胞转录因子，是先天性免疫、炎症、细胞生存、增殖、凋亡的重要调节者。NF-κB家族有RelA(p65)、RelB、c- Rel,p50/p105(NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)五个成员，其N端都含有一个高度保守的 Rel同源区(RHD)，负责结合DNA、二聚化、核定位，以及结合NF-κB抑制蛋白(如I κB)。RelA/p50是最常见的NF-κB靶基因调控者，其中只有RelA具有转录激活结构域 (AD)。RelA/p50二聚体一般与其抑制蛋白IκBα结合，滞留在细胞质中。当细胞受刺激时，IκB激酶IKK活化，使IκBα经磷酸化和泛素化后降解，RelA/p50得以释放并进入细胞核。在核内RelA/p50结合其DNA靶点(有时称为κB)，调节靶基因的表达。NF-κB是一种可诱导型转录因子，已知肿瘤坏死因子-α(TNFα)、脂多糖(LPS)、佛波酯(PMA)、紫外线、细菌和病毒等许多物理化学因素可诱导激活NF-κB信号通路。因其重要性，NF- κB自发现以来一直被剧烈研究。目前Pubmed数据库中NF-κB相关文献达7万多篇， 2015年该数据库收录了6152篇NF-κB相关论文，充分说明其在科学研究中受到的关注程度，也反映其研究具有重要价值。

大量研究表明，NF-κB与炎症与癌症的发生发展密切相关。几乎在所有炎症、癌症疾病中，NF-κB常过度活化。因此，NF-κB成为炎症及癌症治疗的重要靶点，筛选和发展 NF-κB抑制剂也成为新药发展的重要途径，由此产生了形形色色的大量的NF-κB抑制剂。但实践表明，这些NF-κB抑制剂往往由于过度抑制细胞内的NF-κB活性，而损伤了正常细胞内必须的NF-κB基础活性，从而出现难以克服的副作用。因此，直至目前，仍没有一种NF-κB抑制剂成为临床药物。但由于NF-κB过度活化与炎症与癌症发生发展的密切关系，针对NF-κB过度活化这一病理现象仍有发展新的炎症与癌症治疗方法的可行性。

癌症是目前人类尚未完全攻克的重大疾病，严重地困扰着人类的健康与生活。NF-κ B与癌症的发生发展密切相关。以我国最广泛的肝炎肝癌为例，说明一下NF-κB在癌症发生发展中的重要作用。原发性肝癌是全球第二致命的癌症。在肝炎肝癌的大量研究中，发现NF-κB总是被过度激活。炎症反应在肿瘤中所起的重大作用目前已众所皆知，肝细胞癌(HCC)就是一种典型的炎症相关癌症。慢性炎症与HCC的关系极为密切，以致HCC被作为洞察炎症相关癌症发生过程的良好模型。研究发现，在全球所有地区，任何原因所导致的慢性肝病都可能在肝癌的发生和进展过程中起到重要的作用。因此，在HCC的发生过程中，慢性肝炎是最重要的致病因素之一。NF-κB是一种重要的炎症相关转录因子，大量的研究已表明在HCC发生发展中NF-κB呈高表达和过度活化状态。在人肝癌组织及癌旁组织中均能定量检测到NF-κB活性，且癌组织明显高于癌旁组织。

激活的NF-κB参与癌症的启动、发生及发展过程，在肝细胞炎症与癌变间起桥梁作用。研究已表明，在慢性肝炎致癌的过程中，与慢性肝炎关系最密切的乙肝及丙肝病毒(HBV、BCV)都可以通过机体内介导炎症反应的重要信号通路——NF-κB信号通路而激活NF-κB。不仅病毒，NF-κB在几乎所有的慢性肝病中都存在激活状态，包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝及肝内胆道疾病等。NF-κB的过度活化是炎症介质如 TNF-a、IL-1、IL-6等产生的关键环节。肝细胞长期漫性炎症导致肝硬化，最终发展为肝癌。因此，NF-κB的过度活化及与肝癌的发生有着密切的关系。HBV表达的HBx蛋白可通过 ras-raf-map激酶通路激活NF-κB，促使病毒复制、肝细胞增生、细胞癌变、癌细胞转移及凋亡抑制。因此，NF-κB的激活不仅造成诱发细胞癌变的炎性环境，而且通过抑制细胞凋亡而促进肝癌细胞增殖。可以说过度激活的NF-κB参与了肝细胞变性、癌变发生的全过程。正因如此，NF-κB被作为肝癌治疗的靶点。很多研究表明，使用NF-κB抑制剂可有效抑制肝癌细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。研究表明，在肝炎肝癌发生发展中发挥重要作用的很多基因都是NF-κB的靶基因。例如，TNFα、IL1、Bcl-2、GADD45β、IAPs都是近实验确证的NF-κB的直接靶基因。NEMO途径显示了生理状态下NF-κB的作用及NEMO 敲除后的结局。其他与肝炎肝癌关系密切的细胞因子如IL6、IL8、CCL2(MCP-1)、ICAM、 COX2也是NF-κB的直接靶基因；促进肝癌细胞侵袭与转移的uPA也是NF-κB的直接靶基因。

NF-κB是一类重要的调控性转录因子，在许多生理和病理过程中起关键作用，如免疫、细胞增殖、凋亡、炎症、尤其是肿瘤发生。一些研究表明许多疾病与NF-κB及其信号通路的异常活化有关。例如，NF-κB在许多人类癌症中异常激活，通过上调抗细胞凋亡基因来促进生存和恶性肿瘤。已经发现，NF-κB的核聚集和高NF-κB靶基因特征导致大多数多发性骨髓瘤细胞系的NF-κB通路富集，并对细胞凋亡敏感。因此，许多制药公司和科学家一直致力于开发可用于癌症治疗的NF-κB抑制剂。但是，遗憾的是这些化学药物的特异性低，在发挥抑制NF-κB活性的同时，产生严重的副作用。

目前，针对NF-κB的抑制剂药物研究和开发主要集中在通过抑制细胞内的NF-κB活性进而实现NF-κB过度活化相关疾病的治疗，但是由于细胞内NF-κB激活通路的多样性、复杂性，一种通路的关闭很难彻底抑制NF-κB活性；此外，切断了一种通路，可能造成该通路负责的其他生理过程的干扰，产生副作用。

发明内容

发明目的：针对现有NF-κB过度活化相关疾病治疗技术存在的问题，本发明提出一种NF-κB激活基因表达技术，该基因表达技术由一种NF-κB特异性激活基因表达载体实现。载体可以感知细胞内的NF-κB活性，可温和而有效地表达载体上携带的效应基因，导致效应基因在NF-κB过度活化细胞中的特异表达。本发明采用与现有技术中NF-κB抑制剂完全不同的策略，通过利用NF-κB过度活化这一看似不利的病理现象，发展了一种不同于现有技术的NF-κB过度活化相关疾病治疗策略。本发明发展了一种针对NF-κB过度活化相关疾病的基因治疗技术。

技术方案：为了实现上述目的，本发明提出一种基于细胞内NF-κB活性激活效应基因在NF-κB过度活化细胞内的基因表达技术及其在NF-κB过度活化疾病的治疗药物或试剂中的应用，该基因表达技术由一种NF-κB特异性激活基因表达载体实现。其中基于细胞内NF-κB活性激活效应基因在NF-κB过度活化细胞内的基因表达技术原理如图1所示。

其中，所述的NF-κB特异性激活基因表达载体，包含两个序列元件，具体为调控基因表达的启动子序列和启动子下游效应基因编码序列。

其中，所述启动子序列由一段NF-κB应答序列和最小启动子序列组成。

更进一步地，所述NF-κB应答序列包括各种序列的NF-κB应答序列；所述NF-κ B应答序列为一段可与NF-κB蛋白特异性结合的DNA序列，例如5'-GGG AAT TTC CGG GGA CTTTCC GGG AAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC C-3'(SEQ ID NO.1)； NF-κB应答序列的主要序列特征为含有数量不同的各种NF-κB结合靶点，如 GGGACTTTCC(SEQ ID NO.2)。NF-κB应答序列包括包括各种序列的NF-κB应答序列，包括天然及人工筛选的序列。

更进一步地，所述最小启动子包括各种来源的最小启动子序列，包括天然及人工筛选的最小启动子序列；优选单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidinekinase， HSV-TK)启动子最小启动子；其主要作用是与基础转录因子及RNA聚合酶II结合，形成通用转录机器，构成基因表达的基本条件。

其中，所述效应基因包括各种类型、序列和功能的效应基因；包括天然基因及人工突变及合成的基因。优选效应基因为在细胞内表达后其表达产物可引起细胞生理发生改变的基因，如引起细胞生长抑制、凋亡、死亡的基因。

其中，所述基因表达载体为一线性(linear)或环状(circular)核酸分子。

更进一步地，所述核酸分子为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子，包括双链DNA(如腺病毒DNA分子)、单链DNA(腺相关病毒分子)或单链RNA分子(如慢病毒RNA分子)等。

更进一步地，所述线性核酸分子包括普通线性DNA分子(如PCR扩增片段、酶切片段)、病毒DNA分子(如腺病毒DNA分子、腺相关病毒分子)或病毒RNA分子(如慢病毒RNA分子)等；所述环状核酸分子包括质粒DNA等。

其中，所述NF-κB特异性激活基因表达载体导入NF-κB活性过度活化的细胞内时，细胞内的序列特异性转录因子NF-κB就会激活该载体，使其表达载体上的效应基因；效应基因产物可引发细胞生理的改变，如细胞生长抑制、凋亡或死亡。

其中，所述导入NF-κB活性过度活化的细胞内的导入方法包括各种类型的核酸细胞导入方法；优选通过病毒载体、纳米载体、脂质体、电转移、基因枪等导入方式。

作为优选，细胞导入方法为病毒载体；更进一步地，优选腺相关病毒(AAV)。

其中，所述效应基因产物包括RNA和蛋白质；所述RNA包括各种功能类型的RNA (如microRNA等)；所述蛋白质包括各种功能类型的蛋白质及多肽等。

一种NF-κB特异性激活基因表达载体在NF-κB过度活化疾病治疗药物中的应用；一种NF-κB特异性激活基因表达载体在制备用于NF-κB过度活化密切相关疾病基因治疗的试剂或药物中的应用，尤其是在炎症、肿瘤和自身免疫性疾病治疗药物中的应用。

大量针对NF-κB的抑制剂药物研究和开发实践已经表明，通过抑制NF-κB活性实现NF-κB过度活化相关疾病的治疗并不是一个容易行得通的策略。反其道而行之，与其难以通过简单抑制NF-κB活性达到治疗NF-κB过度活化相关疾病(特别是炎症和肿瘤)，不如思考如何利用NF-κB过度活化这一病理现象，开发一种对NF-κB过度活化采用因势利导的疾病治疗新策略。

NF-κB是一种序列特异性DNA结合转录因子。NF-κB发挥其生理和病理作用的分子机制为：NF-κB被激活后可进入细胞核，结合其DNA结合靶点(如经典的结合位点GGGACTTTCC，SEQ ID NO.2)，由此改变其靶基因的表达水平，发挥其生理和病理作用。大量与炎症相关的基因如细胞因子/趋化因子(MCP-1/JE、CCL17、IL-2)、细胞粘附因子 (NCAM、VCAM-1、ELAM-1)、肿瘤坏死因子TNFα等，都是NF-κB的靶基因。利用 NF-κB与其DNA结合靶点的特异性结合，可使其发挥效应基因的表达调控作用。例如，构建一种基因表达载体，其启动子为仅由NF-κB DNA结合位点构成的NF-κB应答序列，则该启动子下游的效应基因的表达仅受细胞内NF-κB的调控。从而使这种基因表达载体成为一种NF-κB特异性激活基因表达载体。例如含有这类NF-κB应答序列的报告基因表达载体被发展为检测细胞内NF-κB活性的一种手段。但这类载体能否用于NF-κB过度活化疾病的治疗，还没有被充分研究和开发。

其中关键的问题是这类NF-κB特异性激活基因表达载体是否只对过度活化的NF-κB做出应答，即表达出载体上的效应基因，而对正常细胞中生理水平(也可以称为基础水平)的NF-κB活性不做出应答，即不表达出载体上的效应基因。如果这类NF-κB特异的基因表达载体是只对过度活化的NF-κB做出应答，而对正常细胞中生理水平的NF-κB活性不做出应答，这类载体就可以作为NF-κB过度活化相关疾病的治疗试剂，用于这类疾病的治疗。炎症(如动脉粥样硬化、慢性肝炎等)和癌症是典型的NF-κB过度活化相关疾病，因此这类NF-κB特异的基因表达载体或将成为治疗这两类目前严重困扰人类健康的重大疾病的新的治疗策略。

此外，利用NF-κB特异性激活基因表达载体去治疗NF-κB过度活化相关疾病，是一种基因治疗方法，完全不同于目前发展的形形色色的NF-κB抑制剂；NF-κB抑制剂是直接或间接地区抑制细胞内的NF-κB活性，但由于细胞内NF-κB激活通路的多样性、复杂性，一种通路的关闭很难彻底抑制NF-κB活性；此外，切断了一种通路，可能造成该通路负责的其他生理过程的干扰，产生副作用。最严重的问题是，外源导入NF-κB抑制剂很难控制一个恰当的度，使其既灭活了过度的NF-κB活性，又避免伤及生理水平的NF-κB 活性。与之相反，NF-κB特异性激活基因表达载体不是去抑制NF-κB活性，而是利用 NF-κB活性。显然这是一种因势利导，类似大禹治水的策略。

本发明构建了一种NF-κB特异性激活基因表达载体，通过大量实验实例，不仅论证了NF-κB RelA(NF-κB基因表达调控作用的主要实现者)在肿瘤细胞内的特异表达，还论证了所构建的NF-κB特异性激活基因表达载体在NF-κB过度活化肿瘤细胞内的表达特性；发现该种NF-κB特异基因表达载体可在在NF-κB过度活化肿瘤细胞内表达效应基因 (如绿色荧光蛋白、microRNA、Cas9蛋白等)，而在正常细胞内不能表达效应基因。本发明由此发展了一种基于NF-κB特异性激活基因表达载体进行NF-κB过度活化相关疾病治疗的新策略。

本发明发展了一种NF-κB激活基因表达技术，设计论证了一种NF-κB特异性激活基因表达载体。该载体包含一种由NF-κB应答序列和最小启动子构成的NF-κB应答启动子(DMP)，利用该启动子可以控制下游效应基因在NF-κB过度活化细胞中的特异性表达，效应基因表达产物可以产生对细胞生理的影响，产生诸如细胞生长抑制、凋亡、死亡等效应。本发明设计和论证的基因表达载体可以用于制备NF-κB过度活化相关疾病的基因治疗药物，作为一种新的基因治疗试剂，用于炎症、肿瘤的治疗。本发明设计和论证的NF-κB特异性激活基因表达载体可包装在腺相关病毒(AAV)中，利用AAV病毒作为基因治疗优良载体的特性，用于人体内炎症、肿瘤这类NF-κB过度活化疾病的成像及治疗。目前AAV病毒载体可单针一次性注射进行疾病的基因治疗，因此，腺相关病毒(AAV)搭载了本发明设计和论证的NF-κB特异性激活基因表达载体后，有望成为治疗NF-κB过度活化疾病的简单、无创(一次性静脉注射)、高效的新型生物药物。本发明设计和论证的NF-κB特异性激活基因表达载体因利用NF-κB活性而不同于目前大量的NF-κB活性抑制分子，不会对正常细胞内的生理NF-κB活性产生损伤，因此避免了传统NF-κB抑制剂的副作用。

虽然本发明中NF-κB特异性激活基因表达载体的构建方法为现有的常规手段，但本发明最主要创新之处是NF-κB特异性激活基因表达载体的组成形式，并通过设计实验论证了所构建的载体具有NF-κB过度活化细胞内的特异性表达特性，如本发明实验发现，NF-κB在肿瘤细胞内特异表达，即NF-κB可检测的(本发明中使用了荧光定量PCR技术进行检测)活性仅在肿瘤细胞内出现，而在正常细胞中没有可检测的活性(附图2)。基于这一发现，本发明推测使用NF-κB特异性激活基因表达载体可以实现某种效应基因在NF-κB 过度活化细胞(如炎性细胞和肿瘤细胞)内的特异性表达，而避免在正常细胞内的表达。本发明的实验充分证明了这一推测，表明采用NF-κB特异性激活基因表达载体完全可以控制某种效应基因(如本发明中使用的zsGreen、SBP、miRNA、Cas9)仅仅在NF-κB过度活化细胞(如本发明中使用的各种肿瘤细胞)内表达。这种人工控制基因在NF-κB过度活化细胞内的特异表达，具有重要的应用价值，例如肿瘤治疗。

附图说明

图1为本发明基于细胞内NF-κB活性激活效应基因在NF-κB过度活化细胞内的基因表达技术原理示意图；其中gene expression vector为基因表达载体；NF-κB responsivesequence(NF-κB binding sequences)为NF-κB应答序列(NF-κB结合序列)；minimalpromoter为最小启动子；effective gene为效应基因；transfection为转染；overactivated transcription factor NF-κB为过度活化的转录因子NF-κB；NF-κB bindingand gene expression activation为NF-κB结合及基因表达激活；effective geneexpression为效应基因表达；effective gene products为效应基因产物；cell growtharrest/apoptosis/dead为细胞生长抑制 /凋亡/死亡；NF-κB over-activated cell为NF-κB过度活化的细胞。

图2为NF-κB在不同细胞中表达的荧光定量PCR检测结果。可见NF-κB在肿瘤细胞中有表达，但在正常细胞中无表达。

图3为DMP-zsGreen表达载体转染各种细胞后，细胞中绿色荧光蛋白的流式细胞仪测定结果。可见DMP控制的zsGreen仅在肿瘤细胞中有表达，在正常细胞中无表达。

图4为DMP-zsGreen表达载体转染293T、HeLa、HepG2、PANC-1、MDA-MB-453、 HT-29、A549、SKOV-3细胞后，细胞在白场(phase)和绿色荧光(FITC)通道下的显微拍照。可见DMP控制的zsGreen在这些肿瘤细胞中的表达。

图5为DMP-zsGreen表达载体转染Hepa1-6、RAW264.7、MRC-5、HL7702细胞后，细胞在白场(phase)和绿色荧光(FITC)通道下的显微拍照。可见DMP控制的zsGreen仅在肿瘤细胞(Hepa1-6、RAW264.7)中有表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达。

图6为DMP-Display-SBP表达载体转染Hepa1-6、HepG2、MRC-5、HL7702、293T 细胞后，对细胞进行FITC标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在白场(bright field)和绿色荧光(FITC)通道下对细胞显微拍照；再将白场和绿色荧光通道图像的叠加。可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(Hepa1-6、HepG2、293T)中有表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达。

图7为DMP-Display-SBP表达载体转染HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB- 453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10、MRC-5、HL7702细胞后，对细胞进行IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像；再对各孔荧光强度进行量化。可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、 Hepa1-6、RAW264.7、B16F10)中表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达。

图8为DMP-Display-SBP表达载体转染HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB- 453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10、MRC-5、HL7702细胞后，对细胞进行胰酶消化收集，再用IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色；之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像并在白场拍照。可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP 仅在肿瘤细胞(HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10)中表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达。

图9为将DMP-Display-SBP包装成腺相关病毒(AAV)表达载体(AAV-SBP)后，用AAV-SBP转染293T、HepG2、Hepa1-6、MRC-5、HL7702细胞。对细胞进行 IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像(A图)；对细胞进行胰酶消化收集，再用IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像并在白场拍照(B图)。可见包装成AAV病毒载体(AAV-SBP)， DMP控制的细胞表面展示表达的SBP可以高效地展示在肿瘤细胞(HepG2、293T、Hepa1-6) 表面，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达。

图10为DMP-miR533_RelA表达载体转染细胞的检测分析。A图为DMP-miR533_RelA表达载体转染用TNFα处理的HepG2细胞后，用定量定量PCR检测细胞中NF-κB RelA/p65 的表达。B图为HepG2及HL7702细胞后，对细胞进行凋亡检测处理，再用流式细胞仪测定细胞凋亡。可见DMP-miR533_RelA的转染引起肿瘤细胞(HepG2)凋亡，而正常细胞 (HL7702)无凋亡。

图11为U6-TsgRNA-DMP-Cas9表达载体转染细胞后，对细胞进行吖啶橙染色，再在绿色荧光通道下对细胞进行显微拍照。可见U6-TsgRNA-DMP-Cas9转染后，引起肿瘤细胞(HepG2、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6)的死亡，而正常细胞(MRC-5、HL7702)的生长不受影响。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1 NF-κB RelA不同细胞表达

实验方法：

细胞培养：HEK-293T(人胎肾细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、HT-29(人结肠癌细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)、SKOV3(人卵巢癌细胞)、PANC-1(胰腺癌细胞)、MDA-MB-453(人乳腺癌)、Hepa1-6(小鼠肝癌细胞)、小鼠巨噬细胞(RAW264.7)、小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)、HL7702(人正常肝细胞)及MRC5(人胚胎成纤维细胞)细胞培养。细胞培养使用DEME(Hepa1-6、HEK-293T、HepG2、HeLa、PANC-1、MDA-MB- 453、RAW264.7、B16F10、MRC-5)或RPMI 1640培养基(A549、HT-29、SKOV-3、 HL7702)、10％胎牛血清(HyClone)、100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素培养；培养环境为含有5％(v/v)CO₂的加湿培养箱中37℃培养。细胞复苏后，按同等密度接种到24 孔微孔板(1×10⁵/孔)或12孔微孔板(2×10⁵/孔)中，培养过夜贴壁后，进行转染。

基因表达检测：收集细胞，用Trizol提取总RNA，逆转录合成互补DNA(cDNA)。 cDNA制备反应及程序为：10μL反转录反应组分包含2μL 5×PrimeScript RT Master Mix(Takara)、50ng总RNA，用RNase Free ddH₂O将反应总体积补至10μL；37℃反应15 分钟，升温至85℃反应5秒使反转录酶失活，反应液4℃保存。通过qPCR定量分析RelA 表达。用于qPCR的上下引物为5′-CCT GGA GCA GGC TAT CAG TC-3′(F)与5′-ATG GGA TGA GAA AGGACA GG-3′(R)。PCR模板为cDNA。通过qPCR定量分析RelA表达。 10μL qPCR反应含有5μLFast SYBR Green Master Mix(ABI)，0.2μL 10μM F，0.2 μL 10μM R和1μL cDNA,用ddH₂O将反应总体积补至10μL。将配制好的反应体系放于荧光定量PCR仪(StepOne plus，ABI)上进行扩增，设置的扩增程序为：95℃预变性 10分钟、45个扩增循环(95℃变性15s，在各退火温度下扩增1分钟)。荧光定量PCR扩增的特异性用溶解曲线来分析确定，用比较CT值法来计算基因表达的相对定量(RQ)，数据最后表示为平均值±标准偏差(SD)，统计显著性用t检验来确定。

实验结果：

为了考察NF-κB RelA/p65基因在各种肿瘤细胞及正常细胞中的表达，用荧光定量PCR检测了NF-κB RelA/p65在11种肿瘤细胞及正常细胞(HL7702及MRC5)中的表达(图2)。结果表明在所有肿瘤细胞株中NF-κB RelA/p65均有表达，而在正常细胞(HL7702及 MRC5)中，检测不得到NF-κB表达。说明用本发明提出的NF-κB激活基因表达载体是一种NF-κB过度活化细胞特异的基因表达载体，如肿瘤细胞中NF-κB激活基因表达载体的表达。

实施例2 DMP-zsGreen(效应基因胞内表达)

实验方法：

载体构建：构建一表达载体DMP-zsGreen；该载体含有DMP序列及其下游受其控制的可在细胞内表达的绿色荧光蛋白zsGreen的编码序列。其中DMP含有NF-κB应答序列(5'- GGGAAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC C-3'， SEQ IDNO.1)以及最小启动子序列(5'-TAG AGG GTATAT AAT GGA AGC TCG ACT TCC AG-3'，SEQID NO.3)。

细胞培养：HEK-293T(人胎肾细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、 HT-29(人结肠癌细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)、SKOV3(人卵巢癌细胞)、PANC-1(胰腺癌细胞)、MDA-MB-453(人乳腺癌)、Hepa1-6(小鼠肝癌细胞)、小鼠巨噬细胞 (RAW264.7)、HL7702(人正常肝细胞)及MRC5(人胚胎成纤维细胞)细胞培养。细胞培养使用DEME(Hepa1-6、HEK-293T、HepG2、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、 RAW264.7、MRC-5)或RPMI 1640培养基(A549、HT-29、SKOV-3、HL7702)、10％胎牛血清(HyClone)、100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素培养；培养环境为含有5％ (v/v)CO₂的加湿培养箱中37℃培养。细胞复苏后，按同等密度接种到24孔微孔板(0.5 ×10⁵/孔)中，培养过夜贴壁后，进行转染。

细胞转染：细胞培养液换为无血清培养基培养1h。用DMP-zsGreen转染上述细胞。空脂质体转染的细胞作为转染对照。每孔细胞的总DNA用量及脂质体用量参考脂质体产品说明书进行。DNA-脂质体加入无血清培养基培养4h。换为含血清新鲜培养基，继续培养24h。

细胞成像：用倒置荧光显微镜(Olympus IX51-DPI71)观测拍照各种处理的细胞，主要观察细胞是否产生绿色荧光；同时观察细胞生长情况，如生长旺盛、贴壁良好、无污染等。对各种处理的细胞进行多视野明场及绿色荧光观察通道的照相拍摄。

流式分析：用胰酶消化收集细胞，用流式细胞仪(ACEA NovoCyte公司)检测分析细胞的绿色荧光。

实验结果：

为了验证NF-κB激活的基因表达载体，构建一个含有DMP序列及其下游绿色荧光蛋白zsGreen的编码序列的表达载体，该载体中zsGreen的编码序列的表达受DMP序列的控制，可将zsGreen蛋白在表达在细胞内。将该载体转染不同的细胞，结果发现在HEK-293T细胞、所有肿瘤细胞(Hepa1-6、HepG2、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、RAW264.7、A549、 HT-29、SKOV-3)内均表达zsGreen，而在正常细胞(HL7702及MRC5)内，不表达 zsGreen(图3、图4)。进一步的流式细胞分析表明，zsGreen仅在所有肿瘤细胞内表达，而在正常细胞(HL7702及MRC5)内不表达(图5)。本实例转染实验说明，本发明提出的 NF-κB激活基因表达载体是一种肿瘤细胞特异的基因表达载体。肿瘤细胞是典型的NF-κB 过度活化细胞。NF-κB与肿瘤的发生发展存在密切关系。

实施例3 DMP-Display-SBP(效应基因细胞表面展示表达)

实验方法：

载体构建：构建一表达载体DMP-Display-SBP；该载体含有DMP序列及可细胞表达展示链亲和素结合肽(SBP)的编码序列。其中DMP含有NF-κB应答序列(5'-GGG AAT TTC CGGGGACTT TCC GGG AAT TTC CGG GGACTT TCC GGG AAT TTC C-3'，SEQ ID NO.1) 以及最小启动子序列(5'-TAG AGG GTATAT AAT GGAAGC TCG ACT TCC AG-3'，SEQ ID NO.3)。SBP编码序列为：ATG GAC GAG AAG ACC ACC GGG TGG CGG GGC GGC CAC GTT GTG GAG GGT CTCGCT GGC GAG CTG GAG CAG CTC AGG GCC CGC TTG GAG CAC CAT CCC CAG GGG CAACGCGAG CCT ATC GAT TAA(SEQ ID NO.4)。展示表达的骨架序列克隆自载体pDisplay^TM(Invitrogen)；pDisplay^TM将要展示在细胞膜表面的蛋白或多肽融合在大鼠Igκ-链引导序列(Igκ-chain leader sequence)的N端,该引导序列可指引蛋白的分母途径；pDisplay表达蛋白的C末端为血小板衍生生长因子受体(platelet derived growth factorreceptor，PDGFR)跨膜区，该跨膜区将蛋白锚定在细胞膜上，从而将展示蛋白展示在细胞外侧。这种膜蛋白可以和细胞培养液中的蛋白发生互作，如本实验中的链霉亲和素与展示在细胞膜表面的链霉亲和素结合肽(SBP间的互作)。

细胞培养：HEK-293T(人胎肾细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、 HT-29(人结肠癌细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)、SKOV3(人卵巢癌细胞)、PANC-1(胰腺癌细胞)、MDA-MB-453(人乳腺癌)、Hepa1-6(小鼠肝癌细胞)、小鼠巨噬细胞 (RAW264.7)、小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)、HL7702(人正常肝细胞)及MRC5(人胚胎成纤维细胞)细胞培养。细胞培养使用DEME(Hepa1-6、HEK-293T、HepG2、HeLa、 PANC-1、MDA-MB-453、RAW264.7、B16F10、MRC-5)或RPMI 1640培养基(A549、 HT-29、SKOV-3、HL7702)、10％胎牛血清(HyClone)、100units/mL青霉素和100μg/mL 链霉素培养；培养环境为含有5％(v/v)CO₂的加湿培养箱中37℃培养。细胞复苏后，按同等密度接种到24孔微孔板(1×10⁵/孔)或12孔微孔板(2×10⁵/孔)中，培养过夜贴壁后，进行转染。

细胞转染：细胞培养液换为无血清培养基培养1h。分别用DMP-Display-SBP转染上述细胞。空脂质体转染的细胞作为转染对照。每孔细胞的总DNA用量及脂质体用量参考脂质体产品(Lipofectamine 2000；ThermoFisher Scientific)说明书进行。DNA-脂质体加入无血清培养基培养4h。换为含血清新鲜培养基，继续培养20h。

细胞染色：用FITC标记的链亲和素及其IRDye800CW(一种近红外荧光分子； LiCor公司)标记的链亲和素(LiCor)对细胞染色。细胞转染后再新鲜培养基中直接加入用 FITC标记的链亲和素或IRDye800CW标记的链亲和素(终浓度均为1μg/mL)。细胞继续培养20h，去除培养基，PBS洗涤细胞2次。细胞用荧光显微镜或近红外荧光扫描仪 (Oddysey，LiCor)扫描成像。细胞观察：用倒置荧光显微镜(Olympus IX51-DPI71)观测拍照各种处理的细胞，主要观察细胞表面是否产生绿色荧光；同时观察细胞生长情况，如生长旺盛、贴壁良好、无污染等。对各种处理的细胞进行多视野明场及绿色荧光观察通道的照相拍摄。

实验结果：

用DMP-Display-SBP表达载体转染Hepa1-6、HepG2、MRC-5、HL7702、293T细胞；对细胞进行FITC标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在白场(bright field)和绿色荧光(FITC) 通道下对细胞显微拍照；再将白场和绿色荧光通道图像的叠加(图6)。可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(Hepa1-6、HepG2、293T)中有表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达(图6)。

用DMP-Display-SBP表达载体转染HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、 HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10、MRC-5、HL7702细胞后，对细胞进行IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像；再对各孔荧光强度进行量化。可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、 RAW264.7、B16F10)中表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达(图7)。

用DMP-Display-SBP表达载体转染HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、 HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10、MRC-5、HL7702细胞后，对细胞进行胰酶消化收集，再用IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色；之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像并在白场拍照。可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1- 6、RAW264.7、B16F10)中表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达(图8)。

用将DMP-Display-SBP包装成腺相关病毒(AAV)表达载体(AAV-SBP)后，用 AAV-SBP转染293T、HepG2、Hepa1-6、MRC-5、HL7702细胞。对细胞进行IRDye800CW 标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像(图9A)；对细胞进行胰酶消化收集，再用IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像并在白场拍照(图9B)。可见包装成AAV病毒载体(AAV-SBP)，DMP控制的细胞表面展示表达的SBP可以高效地展示在肿瘤细胞(HepG2、293T、Hepa1-6)表面，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达(图9)。

实施例4 DMP-miRNA_RelA转染实验(miRNA为效应基因)

实验方法：

载体构建：构建一质粒表达载体，该载体上克隆DMP片段及其下游的一种靶向NF-κBRelA mRNA的人工设计microRNA编码序列，即miR533，其序列为5′-CAA AGA TGG GAT GAGAAA GGA-3′(SEQ ID NO.5)；其RelAmRNA靶序列为5′-TCC TTT CTC ATC CCA TCT TTG-3′(SEQ ID NO.6)。其靶序列坐落于RelA基因编码序列内。

细胞培养：人肝癌细胞HepG2与人正常肝细胞HL7702用含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(HyClone公司)，100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM在含有5％ (v/v)CO₂的加湿培养箱中37℃培养。将细胞以5×10⁵个细胞/cm²的密度接种在6孔板，孵育24小时(汇合度约80％)。

细胞转染及诱导：用EndoFree质粒试剂盒(CWBio)分离用于转染的DMP-miR533 载体。在转染前，小心地取出培养基，用500μL PBS冲洗细胞。然后，向每个孔中加入 500μLOPTI-MEM培养基并孵育2小时。通过使用基于脂质的转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)将4μg的DMP-miR533载体转染到细胞中。6小时后，除去混合物，加入完全培养基，继续培养细胞48h。培养48h后，细胞用TNF-α(10ng/mL)刺激1小时。

基因表达检测：收集细胞，用Trizol提取总RNA，逆转录合成互补DNA(cDNA)。 cDNA制备反应及程序为：10μL反转录反应组分包含2μL 5×PrimeScript RT Master Mix、 50ngtotal RNA，用RNase Free ddH₂O将反应总体积补至10μL；37℃反应15分钟，升温至85℃反应5秒使反转录酶失活，反应液4℃保存。通过qPCR定量分析RelA表达。用于 qPCR的上下引物为5′-CCT GGA GCA GGC TAT CAG TC-3′(F)(SEQ ID NO.7)与5′-ATG GGA TGA GAA AGGACA GG-3′(R)(SEQ ID NO.8)。PCR模板为cDNA。通过qPCR定量分析RelA表达。10μL qPCR反应含有5μL Fast SYBR Green Master Mix(ABI)，0.2 μL 10μM F，0.2μL 10μM R和1μLcDNA,用ddH₂O将反应总体积补至10μL。将配制好的反应体系放于荧光定量PCR仪(StepOneplus，ABI)上进行扩增，设置的扩增程序为：95℃预变性10分钟、45个扩增循环(95℃变性15s，在各退火温度下扩增1分钟)。荧光定量PCR扩增的特异性用溶解曲线来分析确定，用比较CT值法来计算基因表达的相对定量(RQ)，数据最后表示为平均值±标准偏差(SD)，统计显著性用t检验来确定。

细胞凋亡测定：转染前一天选取状态良好的HepG2及HL7702细胞用0.25％的胰蛋白酶溶液消化、计数并以1×10⁵细胞/孔接种于24孔细胞培养板过夜培养，在细胞融合度为80％左右时进行转染实验。取800ng的DMP-miR533质粒分别转染HepG2及HL7702细胞。将培养24h后的HepG2及HL7702细胞用不含EDTA的胰蛋白酶溶液消化离心得到细胞沉淀，用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(凯基公司)处理细胞后，用流式细胞仪 (ACEANovoCyte公司)中检测细胞凋亡情况。

实验结果：

为了NF-κB激活RelA miRNA表达载体是否可导致细胞内NF-κB RelA表达下调，用 DMP-miR533载体转染人肝癌细胞。用荧光定量PCR检测细胞内NF-κB RelA表达。结果表明靶向NF-κB RelA mRNA的miR533的导入，成功敲低细胞内NF-κB RelA表达水平 (图10A)。由于NF-κB经常通过抑制细胞凋亡的靶基因发挥抗凋亡作用。用RelA miRNA 敲低NF-κB RelA表达水平，可能引起肿瘤细胞的生长抑制或凋亡。为了验证这一推断，我们检测了DMP-miR533转染对人类肝癌细胞HepG2以及人正常肝细胞HL7702凋亡的影响。

用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒操作说明处理细胞后，用流式细胞仪检测了DMP-miR533对细胞凋亡的影响。结果显示，DMP-miR533导致人肝癌细胞发生凋亡 (图10B)。与人类肝癌细胞HepG2进行对比，人正常肝细胞HL7702作为NF-κB过度活化的阴性对照，DMP-miR533未能诱导HL7702细胞凋亡(图10B)。这些数据表明，DMP- amiR533具有NF-κB特异性。DMP-amiR533对正常人肝细胞HL7702活性没有影响，这意味着这种新的NF-κB抑制剂可以消除NF-κB过度激活的细胞(如癌症或炎性细胞)中 NF-κB的过度活化，但不会对正常细胞产生影响。

实施例5 DMP-Cas9转染实验(Cas9为效应基因)

实验方法：

载体构建：构建U6-TsgRNA-DMP-Cas9表达载体，其中有U6启动子控制的靶向人端粒DNA序列的sgRNA表达序列。U6启动子序列为：GAT CCG ACG CCG CCA TCT CTA GGC CCG CGCCGG CCC CCT CGC ACA GAC TTG TGG GAG AAG CTC GGC TAC TCC CCT GCC CCG GTT AATTTG CAT ATA ATA TTT CCT AGT AAC TAT AGA GGC TTA ATG TGC GAT AAA AGA CAG ATAATC TGT TCT TTT TAA TAC TAG CTA CAT TTT ACA TGA TAG GCT TGG ATT TCT ATA AGAGAT ACA AAT ACT AAA TTA TTA TTT TAA AAA ACA GCA CAA AAG GAA ACT CAC CCT AACTGT AAA GTA ATT GTG TGT TTT GAG ACT ATA AAT ATC CCT TGG AGA AAA GCC TTG TTT(SEQ ID NO.9)；TsgRNA靶序列为：5′-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TA-3′(SEQ ID NO.10)；sgRNA序列为：5′-TAG GGT TAG GGT TAG GGT TA-3′(SEQ ID NO.11)。DMP序列含有NF-κB应答序列(5'-GGG AAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTCC-3'，SEQ ID NO.1)以及最小启动子序列(5'-TAG AGG GTA TAT AAT GGA AGC TCG ACTTCC AG-3'， SEQ ID NO.2)；以及Cas9蛋白编码基因。

细胞培养：HepG2(人肝癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、HT-29(人结肠癌细胞)、 HeLa(人宫颈癌细胞)、SKOV3(人卵巢癌细胞)、PANC-1(胰腺癌细胞)、MDA-MB-453 (人乳腺癌)、Hepa1-6(小鼠肝癌细胞)、HL7702(人正常肝细胞)及MRC5(人胚胎成纤维细胞)细胞培养。细胞培养使用DEME(Hepa1-6、HEK-293T、HepG2、HeLa,PANC-1、 MDA-MB-453)或RPMI 1640培养基(A549、HT-29、SKOV-3、MRC-5、HL7702)、10％胎牛血清(HyClone)、100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素培养；培养环境为含有5％ (v/v)CO₂的加湿培养箱中37℃培养。细胞复苏后，按同等密度(0.5×10⁵/孔)接种到24 孔微孔板中，培养过夜贴壁后，进行转染。

细胞转染：细胞培养液换为无血清培养基培养1h。分别用U6-TsgRNA-DMP-Cas9转染上述细胞。空脂质体转染的细胞作为转染对照。每孔细胞的总DNA用量及脂质体用量参考脂质体产品(Lipofectamine 2000；ThermoFisher Scientific)说明书进行。DNA-脂质体加入无血清培养基培养4h。换为含血清新鲜培养基，继续培养24h。

细胞染色：吖啶橙(acridine orange，AO))染色按吖啶橙产品说明(索莱宝；北京)进行(室温染色10分钟)。程序为：用100μg/mL吖啶橙室温染色10分钟。染色后细胞用PBS洗涤。

细胞观察：用倒置荧光显微镜(Olympus IX51-DPI71)观测拍照各种处理的细胞；对各种处理的细胞进行多视野绿色荧光通道观察及拍照。

实验结果：

通过上述转染及吖啶橙染色操作后，对各种处理的细胞进行多视野绿色荧光通道观察及拍照，获得的代表性实验结果如图11所示。结果表明，转染了U6-TsgRNA-DMP-Cas9表达载体的肿瘤细胞均发生不同程度的死亡，部分癌症种类的肿瘤细胞株发生大量死亡(如HepG2、 SKOV3、PANC-1)。而转染U6-TsgRNA-DMP-Cas9表达载体是正常细胞(HL7702、MRC5)为发生死亡。可见，由于上述实施例1、2、3证明的NF-κB在肿瘤细胞中的特异表达，以及NF-κB特异激活基因表达载体(DMP-效应基因)在肿瘤细胞内的表达，U6-TsgRNA- DMP-Cas9表达载体在具有NF-κB过度活化水平的肿瘤细胞中发生表达；

在本实验中，我们在上述DMP载体的基础上，将Cas9基因作为效应基因，构建了U6-TsgRNA-DMP-Cas9载体。当将U6-TsgRNA-DMP-Cas9载体分子转染细胞后，载体表达产生的sgRNA与Cas9结合形成靶向端粒DNA的sgRNA-dCas9复合物。该复合物与细胞端粒 DNA解结合可导致端粒DNA的切割，造成端粒DNA损伤，从而引发细胞死亡。

本实验结果表明，转染U6-TsgRNA-DMP-Cas9载体的细胞中，作为NF-κB阳性细胞的肿瘤细胞株，包括HepG2、PANC-1、A549、HT-29、HeLa、SKOV3、MDA-MB-453、 Hepa1-6，均发生不同程度的显著死亡，部分癌症种类的肿瘤细胞株发生大量死亡(如 HepG2、SKOV3、PANC-1)。而作为NF-κB阴性细胞的MRC-5及HL7702未发生死亡(图11)。实验结果符合预期，即NF-κB活性特异的基因转录表达系统可用于杀灭肿瘤细胞。

序列表

<110> 东南大学

<120> 基于细胞内NF-κB活性激活效应基因在NF-κB过度活化细胞内的基因表达及应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggaatttcc ggggactttc cgggaatttc cggggacttt ccgggaattt cc 52

<210> 2

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggactttcc 10

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagagggtat ataatggaag ctcgacttcc ag 32

<210> 4

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggacgaga agaccaccgg gtggcggggc ggccacgttg tggagggtct cgctggcgag 60

ctggagcagc tcagggcccg cttggagcac catccccagg ggcaacgcga gcctatcgat 120

taa 123

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caaagatggg atgagaaagg a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcctttctca tcccatcttt g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctggagcag gctatcagtc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggatgag aaaggacagg 20

<210> 9

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatccgacgc cgccatctct aggcccgcgc cggccccctc gcacagactt gtgggagaag 60

ctcggctact cccctgcccc ggttaatttg catataatat ttcctagtaa ctatagaggc 120

ttaatgtgcg ataaaagaca gataatctgt tctttttaat actagctaca ttttacatga 180

taggcttgga tttctataag agatacaaat actaaattat tattttaaaa aacagcacaa 240

aaggaaactc accctaactg taaagtaatt gtgtgttttg agactataaa tatcccttgg 300

agaaaagcct tgttt 315

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taaccctaac cctaacccta 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tagggttagg gttagggtta 20

Claims

1.一种基于细胞内NF-κB活性激活效应基因在NF-κB过度活化细胞内的基因表达技术及其在NF-κB过度活化疾病的治疗药物或试剂中的应用，该基因表达技术由一种NF-κB特异性激活基因表达载体实现。

2.根据权利要求1所述的基因表达技术及其应用，其特征在于，所述NF-κB特异性激活基因表达载体包含两个序列元件，具体为调控基因表达的启动子序列和启动子下游效应基因编码序列。

3.根据权利要求2所述的基因表达技术及其应用，其特征在于，所述启动子序列由一段NF-κB应答序列和最小启动子序列组成。

4.根据权利要求3所述的基因表达技术及其应用，其特征在于，所述NF-κB应答序列为可与NF-κB蛋白特异性结合的DNA序列，其主要序列特征为含有NF-κB结合靶点；该NF-κB应答序列包括各种序列的NF-κB应答序列。

5.根据权利要求3所述的基因表达技术及其应用，其特征在于，所述最小启动子包括各种来源的最小启动子序列，具体包括天然及人工筛选的最小启动子序列。

6.根据权利要求2所述的基因表达技术及其应用，其特征在于，所述效应基因包括各种类型、序列和功能的效应基因；包括天然基因序列及人工突变及合成的效应基因。

7.根据权利要求1所述的基因表达技术及其应用，其特征在于，所述NF-κB特异性激活基因表达载体为一线性核酸分子或环状核酸分子。

8.根据权利要求7所述的基因表达技术及其应用，其特征在于，所述线性核酸分子包括普通线性DNA分子、病毒DNA分子或病毒RNA分子；所述环状核酸分子包括质粒DNA。

9.根据权利要求2所述的基因表达技术及其应用，其特征在于，所述NF-κB特异性激活基因表达载体导入NF-κB活性过度活化的细胞内时，细胞内的序列特异性转录因子NF-κB就会激活该载体，使其表达该载体上的效应基因，效应基因产物可引发细胞生理的改变，包括细胞生长抑制、凋亡或死亡。

10.根据权利要求7所述的基因表达技术及其应用，其特征在于，所述NF-κB特异性激活基因表达载体导入NF-κB活性过度活化的细胞内的导入方法包括各种类型的核酸细胞导入方法，包括病毒载体、纳米载体、脂质体、电转移或基因枪的导入方式。

11.根据权利要求9所述的基因表达技术及其应用，其特征在于，所述效应基因产物包括RNA和蛋白质；所述RNA包括各种功能类型的RNA；所述蛋白质包括各种功能类型的蛋白质及多肽等。

12.权利要求1中所述的NF-κB特异性激活基因表达载体在NF-κB过度活化疾病治疗药物中的应用或NF-κB过度活化密切相关疾病基因治疗的试剂或药物中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的NF-κB过度活化疾病包括各种与NF-κB过度活化密切相关的疾病，尤其是炎症和肿瘤。