CN101432010A - 刺激或增强骨形成和细胞自我更新的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于骨病、骨折、骨损失和其它骨异常的组合物和方法，涉及使用Dkk蛋白、Wnt拮抗剂、Wnt抑制剂或任何其它相关蛋白，用于刺激或增强矿化作用和用于刺激细胞更新。一种Dkk蛋白即Dickkopf－2(Dkk－2)不依赖于Wnt蛋白而能刺激骨形成，其中Wnt蛋白可以被Dkk－2抑制和/或拮抗。在刺激或增强矿化作用方面，Dkk－2显示出增强的特异性靶向能力和增强的生物学活性。Dkk－2在造血干细胞和间充质干细胞的分化和自我更新中也起作用，特别是在成骨作用和破骨作用中。

Description

刺激或增强骨形成和细胞自我更新的组合物和方法
相关专利申请的参考
本申请与由吴丹等人于2004年5月19日提交的题为“Compositions and Methods for Bone Formation and BoneRemodeling”的专利申请有关，其整体内容在此作为参考文献引用。
发明领域
本发明涉及的组合物和方法，包含拮抗和/或抑制Wnt蛋白的叫Dickkopf-2(Dkk2)的蛋白，用于刺激或增强矿化作用，并刺激细胞更新。Dkk2可刺激骨形成，并且它的此种作用是独立于Wnt蛋白，Wnt蛋白能被Dkk2抑制和/或拮抗。更具体地说，Dkk2刺激成骨细胞分化及因此而发生的矿化作用。Dkk2还在造血干细胞和间充质干细胞的分化和自我更新中，特别是在成骨作用(osterblastogenesis)和破骨作用(osterclastogenesis)过程中起作用。
在此申请中引用或提到的所有专利，专利申请，专利出版物，科学文章，及类似物在此以其全部内容一并归入本申请的参考文献，以便更全面地讲述本发明所属领域的状况。
发明背景
人与小鼠遗传学方面的证据表明，作为Wnt共同受体的低密度脂蛋白受体蛋白5(LRP)1，2在骨重建中起重要作用3-6。此外，经典(canonical)Wnt蛋白和活化了的β-连环蛋白刺激成骨细胞样细胞的碱性磷酸酶(AP)的活性3，7。然而经典Wnt蛋白及其拮抗物Dickkopf(Dkk)分子在骨发生中的确切作用至今仍不清楚。通常认为，Dkk蛋白在骨发生过程中起负调节因子的作用。Dkk蛋白是一组富含半胱氨酸的分泌型蛋白。这些Dkk蛋白在Wnt的信号传导中显示负调节因子作用。已有四种Dkk蛋白在人体中被确认。它们分别被称为Dkk1，Dkk2，Dkk3，及Dkk4。
根据对人的研究，LRP-5的突变与骨量具有相关性，说明LRP-5在调节骨发育中起关键性作用3-6。这个结论在对LRP-5基因遭到破坏的小鼠的研究以及在对带有以骨组织为目标的造成骨量增强的LRP-5的突变体的小鼠的研究中得到了证实8，9。另有证据指出经典Wnts的分类是根据它们稳定β-连环蛋白进而激活LEF-1/TCF转录的能力10，或者根据它们稳定β-连环蛋白进而刺激成骨细胞样细胞的AP活性的能力而决定的3，7。以上所有这些发现都提示经典Wnt蛋白的信号传导参与调节骨发生。然而其机制却仍不清楚。
除了别的细胞以外，人的骨髓还含有造血干细胞(HSCs)和间充质干细胞(MSCs)。在体内，干细胞具有自我再生的特点，这使得它们可以无止境地更新。这种更新的特性在体外生长的细胞却并不常见。MSCs分化成诸如成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞等之类的间充质组织细胞谱系。而造血干细胞则是包括血细胞在内的多种细胞谱系的前体细胞。单核细胞前体来自早期造血干细胞。破骨细胞是由单核细胞前体融合而来的。作为T淋巴细胞一个亚类的自然杀伤T(NKT)细胞来自造血干细胞。当通过它们的T细胞受体(TCR)受到刺激时，NKT细胞会产生高水平的免疫调节细胞因子，这些细胞因子进而可以调控免疫反应，比如抑制自体免疫，排斥肿瘤及与组织移植有关的反应。
MSCs亦称为骨髓基质细胞，骨原细胞及成骨细胞干细胞。它们作为饲养层调节着微环境，使造血干细胞得以维持，扩充和更新。成骨细胞已显示是那些可以在骨内膜表面产生造血生长因子的基质细胞，因而它在造血干细胞的发育中起重要作用。已有实验证实增加成骨细胞的数目可以提高造血干细胞的总数。1＊，2＊
还有研究指出，经典Wnt蛋白之一，即Wnt3a对干细胞生长，特别是造血干细胞的生长起直接调节作用。Wnt3a参与很多包括干细胞的增殖及自我更新在内的发育事件。3＊4＊Wnt3a还通过基质细胞间接地调节造血干细胞系的发育。(Yamane，et al，“Wnt SignalingRegulates Hemopoiesis Through Stromal Cells”)。已有实验表明，外源的Wnt的拮抗剂Dickkopf-1(Dkk-1)可以增强培养的间充质干细胞的增殖。加入Dkk1的抗体则使间充质干细胞的增殖减低。Dkk1对培养的MG-63骨肉瘤细胞也有同样的效果。5＊，7＊然而对Dkk蛋白在体内及体外对造血干细胞，NKT细胞，和其它干细胞的作用仍不清楚。本发明阐述了Dkk蛋白对各种各样的干细胞的作用。
发明概述
本发明涉及解决几个像骨质疏松等骨病那样的与骨重建有关的问题的方法和组合物。本发明还提供协助治愈骨折及其它损伤和病变的组合物的应用。特别是，本发明还涉及在哺乳动物受试者中刺激或增强成骨细胞矿化作用的方法，包括给所述受试者施用有效量的Dkk蛋白，Wnt的抑制剂，或Wnt的拮抗剂。
本发明更进一步地提供对临床病症的基因疗法，所述临床病症的特点为矿化作用不够，该方法包括包括施用有效量的Dkk蛋白，Wnt抑制剂，或Wnt拮抗剂或通过增加Dkk蛋白，Wnt抑制剂，或Wnt拮抗剂的表达。
在本发明的另一方面，Dkk、Wnt抑制剂、Wnt拮抗剂或其它相关蛋白的基因表达、检测和定量都可能成为诊断多种骨病的方法。
另一方面，本发明还提供Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的突变体或改变的形式，包括那些可以选择性地刺激骨细胞分化但却缺少抑制Wnt信号传导的能力的突变体或改变的形式。
此发明还提供其它修饰，例如Dkk的融合蛋白，其显示在刺激矿化作用方面具有增强的特异性靶向和生物活性。
本发明更进一步地涉及开发与Dkk有关的转基因小鼠或Dkk2超量表达的实验动物。这些动物可用来作为在体内评估和鉴定Dkk的突变种或改变的Dkk及相关的融合蛋白的模型。
本发明还涉及方法和组合物，其解决了Wnt、Dkk、Wnt抑制剂、Wnt拮抗剂或相关蛋白对造血干细胞，NKT细胞，和其它可以自我更新的干细胞在体内外自我更新的效能。
再有另一方面，本发明还涉及开发用于治疗的Dkk，比如骨髓移植和在体内外扩增造血干细胞、NKT细胞及其它干细胞。
附图简述
图1说明经典Wnt对成骨细胞的增殖和分化的刺激作用。图1A：显示的是从带有由2.3Kb CollA1启动子控制的GFP转基因的三个月大的小鼠中提取出的骨髓基质(BMS)，其中这些小鼠已用对照腺病毒或Wnt1腺病毒感染，或经过Wnt3a CM处理。在5天后，细胞被染色以显示AP活性，或在所标明的时间将其固定，而后染色以检测矿化作用[b，Von Kossa银染；c，Alizarrin Red染色]；图1B是成骨标记OC和BSP在不同分化阶段的表达的Northern分析。
图2展示了Dkk1，Dkk2，和Wnt7b在成骨细胞中的表达。图2A是实时RT-PCR的结果，它显示了在BMS细胞分化过程中Dkk1和Dkk2表达增加而Wnt7b的表达却呈先增加后降低的状况。图2B，图2C和图2D是小鼠长骨切片原位杂交的照片。图2B显示Dkk1主要在骨细胞表达。图2C显示Dkk2主要在成骨细胞表达。图2D显示Wnt7b也在成骨细胞中表达。
图3用实时RT-PCR说明了Wnt5a和Wnt5b在BMS细胞分化过程中的表达。图3A和图3B显示在成骨细胞分化过程中，Wnt5a与Wnt5b表达都呈先增加后降低状况。
图4表明Dkk1可以在前期阶段抑制成骨细胞分化。来自2.3CollA1小鼠的BMS培养物用重组的Dkk1蛋白(1μM)或对照缓冲液处理。在所示的时间测定GFP的表达。图4A显示GFP在Dkk1处理过的培养物表达得比用对照处理过的培养物(图4B)要少的多。这些结果表明Dkk1在所示的时间抑制成骨细胞分化(图4C)。
图5证明经典Wnt并不影响成骨细胞分化的后期。图5A显示Wnt1腺病毒转导的BMS培养物与对照腺病毒(图5B)转导的BMS培养物相比其矿化程度在所示的时间(图5C)是没有变化的。
图6说明经典Wnt在成骨细胞对Dkk2有上调作用。图6A是Northern印迹的结果，该结果显示Dkk2mRNA水平在由对照腺病毒转导的培养的MC3T3细胞培养物中检测不到，而在由Wnt1腺病毒转导的MC3T3细胞培养物中却明显增高。图6B显示来自2.3Col-GFP小鼠的BMS细胞在加入Wnt3a后24小时内即可开始表达GFP。这个结果说明经典Wnt可以刺激成骨细胞的分化。图6C是来自2.3Col-GFP小鼠的BMS细胞培养物经抗Dkk2抗体免疫染色后的照片。从照片可见表达的Dkk2与成骨细胞分化标志2.3Col-GFP定位相同。
图7显示Dkk2刺激矿化作用：图7A显示在MC3T3细胞被SupDkk2或对照载体转导之后，用实时RT-PCR测定了在分化的不同时间Dkk2表达的相对水平。图7B显示SupDkk2转导的MC3T3细胞矿化的情况。图7C显示了对照载体转导的MC3T3细胞矿化的情况。这些结果指出Dkk2的表达与矿化有很强的相关性。图7D显示了经表达Dkk2的腺病毒转导的BMS培养物在所示的时间用二甲酚橙染色的情况(图7F)。图7E显示了经对照腺病毒转导的BMS培养物在所示的时间用二甲酚橙染色的情况(图7F)。在Dkk2转导的细胞可见一种独特的钙化模式。
图8表明一种称为sFRP3的Wnt抑制剂不能刺激矿化。BMS培养物经表达sFRP3的腺病毒或对照腺病毒处理，我们看不到那种图7E中所见到的那种独特的钙化模式。
图9说明Dkk2是矿化所必需的。诱导来自小鼠颅盖骨的成骨细胞培养物分化。15天之后用二甲酚橙染色以示矿化。来自野生型(图9a和图9d)和杂合型(图9b和图9e)小鼠的培养物都表现出强矿化作用，而那些来自Dkk2敲除小鼠(图9c和图9f)的培养物却看不到任何矿化迹象。图9d，图9e和图9f是在显微镜下用透射光照的照片。
图10显示Dkk2是前成骨细胞(pre-osteoblast)形成的正调节因子。在第5天用染AP的方法来监测来自野生型小鼠，Dkk2敲除小鼠和杂合型小鼠的细胞培养物的成骨细胞集落形成，可以发现Dkk2敲除小鼠(图10A)形成集落的数目比野生型小鼠(图10B)及杂合型小鼠(图10C)形成集落的数目明显减少。
图11说明了Dkk2对破骨细胞形成的作用。在小鼠的骨髓培养液中加入M-CSF和RANKL以诱导其分化。6天后用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)对破骨细胞染色并在显微镜下观察多核细胞的形态。破骨细胞的数目在Dkk2敲除小鼠(图11C)的骨髓培养物中比来自野生型小鼠(图11A)或杂合型小鼠(图11B)的骨髓培养物明显减少。
图12的草图出示了经典Wnt和Dkk蛋白是如何对骨发生起调节作用的模型。在前成骨细胞阶段，经典Wnt(比如Wnt7b)的表达会增加，经典Wnt刺激前成骨细胞增殖并分化为成骨细胞。在这分化过程中，Dkk2的表达上调，其又进一步刺激了分化。Dkk2的这种作用是独立于其在成骨细胞成熟的生长期所呈现的对Wnt信号传导的拮抗作用的。
发明详细
本发明提供了治疗骨病，骨折，骨损伤及其它骨异常的方法和组合物。这种治疗是通过给哺乳动物受试者施用有效量的Dkk蛋白，Wnt抑制剂，Wnt拮抗剂或任何其它相关蛋白，使其矿化作用得到刺激或增强而完成的。
Dkk可以包含Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4，或它们之间的任意组合。Dkk蛋白还包含独立于任何可以被任何Dkk蛋白抑制或拮抗的Wnt的蛋白，独立调节经典Wnt信号传导的蛋白，或酶的同源物，具有类似功能的不相关蛋白，或Dkk的同源物。Wnt拮抗剂包含Dkk、蛋白质、糖类、化学制品、脂类、糖蛋白、糖脂、多肽、核酸、小分子、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt14、Wnt15、Wnt16或至少以下蛋白质之一，或至少以下蛋白质的一个片段：Dkk蛋白，新月(crescent)蛋白，cerebrus蛋白，轴(Axin)蛋白，Frzb蛋白，糖原合酶激酶蛋白，T细胞因子蛋白，蓬乱(dishevelled)蛋白，或sFRP3蛋白。Wnt抑制剂可以包含Dkk、蛋白质、糖类、化学制品、脂类、糖蛋白、糖脂、多肽、核酸、小分子、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt14、Wnt15、Wnt16或至少以下蛋白质之一，或至少以下蛋白质的一个片段：Dkk蛋白，新月(crescent)蛋白，cerebrus蛋白，轴(Axin)蛋白，Frzb蛋白，糖原合酶激酶蛋白，T细胞因子蛋白，蓬乱(dishevelled)蛋白，或sFRP3蛋白。蛋白质或其片段可以用生物手段来自自然，也可用重组DNA方法获得。如以人为治疗对象，这些蛋白质及蛋白质片段优选来自非人来源。可能发生的免疫反应可以通过给受试者施用免疫抑制剂或应用一种试剂特异的免疫操作法减弱或消除，此技术在Rabbani，E.et al在1999年7月16日提交的题为“Novel Selective Immune DownRegulation(SIDR)Mediated Translation Process for Preventing orTreating Disease in a Subject，and Compositions of MatterComprising Trained or Programmed Cells，Tissues or Organs Usefulfor SIDR Establishment”的专利申请(申请号：09/356,294)中有所说明。
在本发明的优选实施方案中，用一种特定的Dkk蛋白即Dkk2蛋白治疗骨病、骨折、骨损伤及异常。在刺激或增强矿化作用方面，Dkk2已显示出增强的特异性靶向能力和增强的生物活性。在现有技术中，我们知道Dkk1和Dkk2可以充当Wnt抑制剂，进而造成其抑制骨形成，刺激，增强或重建。特别是如果在前成骨细胞期加入Dkk1(一种强抑制剂)或Dkk2(一种弱抑制剂)，则对骨生成没有刺激或增强作用。本发明显示：如果加入Dkk2(一种强刺激剂)或Dkk1(一种弱刺激剂)，骨形成会受到刺激或增强。Dkk2是通过一条独立于其作为Wnt信号传导拮抗剂的途径来刺激培养的成骨细胞矿化的。可以相信Dkk2所实施的这一功能是通过一条非Wnt的途径，因为Dkk1(一种更强的Wnt拮抗剂)，或Axin(一种胞内Wnt抑制剂)，或Frzb都没有观察到这种刺激矿化作用的功能。成骨细胞的分化伴有Dkk2表达的上调。除了刺激成骨细胞分化以外，Dkk2还抑制已产生的Wnt。
从实验可以观察到Wnt蛋白可刺激骨原细胞(osteoblastprogenitor)的自我更新。包括Wnt7b，Wnt3a和Wnt1在内的Wnt蛋白已显示出它们不但可以刺激骨原细胞的更新，还可以通过激活成骨细胞特异的2.3kb CollAl启动子来刺激成骨细胞的分化。本发明提出经典Wnts，包括Wnt7b，Wnt3a及Wnt1，在成骨细胞分化中起重要作用。如果给前成骨细胞加入Wnt，前成骨细胞就会分化为成骨细胞。如果在Dkk2可以刺激或增加矿化的阶段，给体外成熟的成骨细胞加Wnt，Wnt则不会刺激或提高矿化。
成骨细胞位于龛，在那里我们还可发现干细胞。在这个龛内，造血干细胞在不断地更新自己。由于成骨细胞产生Wnt，特别是Wnt7b，且Wnt7b已显示可在体内使干细胞增多25，26，所以成骨细胞可以刺激造血干细胞的自我更新27，28。如果把Wnt或可以产生Wnt的成骨细胞加到在体外培养的造血干细胞中，这些干细胞就会表现出自我更新。由于Dkk2可以抑制Wnt，所以当把Dkk2加入这些细胞时，这些细胞就会终止更新而开始分化。
本发明还指出Dkk2可以在体内增加成骨细胞的数目。由于成骨细胞可以刺激造血干细胞的自我更新27，28，因而Dkk2也应通过另一个不同机制或途径造成干细胞更新。
基因工程，基因操作或其它基因治疗方法可以用来治疗以矿化不足为特征的临床病症。这些方法包括引入新的基因，除去体内已有的基因或引入更多拷贝的体内已有的基因以增加或减少其表达。比如如果理想的结果是提高或超量表达Dkk、Wnt抑制剂、Wnt拮抗剂或相关蛋白，矿化作用就会得到刺激或增强。这种现象我们在Dkk2-超表达的转基因小鼠中已经见到。本发明使这种变异小鼠成为在体内评价和鉴定Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂及相关的融合蛋白的突变体和改变的形式的模型。这些融合蛋白在刺激或提高矿化方面具有增强的特异性靶向和生物活性。这些突变体、改变的形式和融合蛋白还包括那些可以选择性地刺激骨细胞分化或增生但缺乏抑制Wnt信号传导的能力的蛋白。
基因操作可以通过瞬时表达或永久性地引入新的遗传性状而实施。操作可在离体细胞上进行，而后再将其引入体内。相反的，操作也可在体内进行。离体施行瞬时表达的方法包括在体外的细胞培养中加入寡核苷酸或多聚核苷酸，或用常用于瞬时表达的载体感染，比如腺病毒。在体外施行永久表达的方法包括配体介导的摄入(详见Rabbani E.于1995年12月15日提交的题为“Novel Property Effectingand/or Property Exhibiting Compositions for Therapeutic andDiagnostic Uses”专利，专利申请号为08/574,443)，用带有选择性标志的表达载体转化培养的细胞，或用病毒载体感染细胞。实例为基于逆转录病毒和腺伴随病毒(AAV)的载体。用现有技术可以在体内或体外改变引入物的向性以便把它们引入恰当的靶细胞。
在已开发出的造成Dkk2表达降低或消失的转基因小鼠模型中发现其最后结果是骨密度降低。因此无论在细胞培养的体外模型还是在转基因小鼠的体内模型，都发现Dkk2对骨发生起重要的调节作用。
进一步说，在Dkk2基因敲除的小鼠，成骨细胞和破骨细胞都有所减少。这种降低又造成而后的Dkk2细胞的减少。这说明Dkk2对成骨作用和破骨作用都是必需的。因为破骨细胞和成骨细胞分别来自造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)，而且造血干细胞的数目与成骨细胞数目是平行的，减少成骨细胞或破骨细胞就会造成造血干细胞或间充质干细胞减少。已有实验证实Dkk对来自骨髓的人类成体干细胞的增殖和重新进入细胞周期是必需的。由于Dkk2蛋白在来自造血及间充质干细胞的谱系的分化和增殖中显示了其重要作用，Dkk2似乎也参与造血及间充质干细胞的增殖、分化和自我更新。由于实验证实在成骨细胞分化过程中Wnt7b呈上调状态，Wnt7b对细胞的分化和增殖也有作用。新近研究表明，在某种情况下，可在体外激活人的NKT Vα24细胞使其进入分化或增殖8＊，9＊。因此Dkk蛋白、Dkk衍生物、Wnt抑制剂、Wnt拮抗剂和其它相关蛋白可以被开发为造血干细胞、NKT细胞、和其它种细胞更新的治疗剂。
这些治疗剂可以通过被直接引入疾病的、骨折的或病变的部位的方法使其在像骨髓移植这样的情况得到应用。这些治疗剂也可通过把它们在体外与从受试者体内取出的细胞混合使这些细胞增殖，而后将原来取出的及后来增殖的细胞一并重新输回该受试者体内的方法得以间接使用。具体地说，可以从有病的受试者中取出想要的细胞，把它们与饲养层细胞一起培养，并加入有效量的Dkk、Wnt抑制剂、Wnt拮抗剂或相关蛋白以刺激想要的细胞更新。饲养层细胞可包括间充质干细胞，基质细胞或其它种可以促使细胞生长或分化的细胞。而后把已更新了的细胞重新输入该受试者。细胞也可从另一受试者取出，更新后再输入有病的受试者。
本发明还描述了治疗感染性疾病的方法及组合物。这些疾病包括任何由病毒或免疫药物介导的肝炎、细菌感染、病毒感染、真菌感染或寄生虫感染。病毒感染可以是HBV、HCV或HIV的感染。治疗包括在体外更新已转导了的细胞。转导细胞是为了引入至少一个可以治疗这种疾病的抗病基因。
一个优选的实施方案包括从被病毒感染的受试者身上取出CD34+细胞，然后在体外通过转导向这些细胞引入可以抗这种疾病的基因，继而将这些转导了的细胞与饲养层及足以使这些细胞更新的量的Dkk、或Wnt抑制剂、或Wnt拮抗剂或相关蛋白在一起做体外培养。当这些细胞增殖后，将它们重新输回感染的受试者。
本发明还提供了在体外筛选酶同源体、具有类似功能的无关蛋白、或Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的同源物的方法。优选的实施方案在第一个试管中备有Dkk2表达逆转录病毒转导的MC3T3细胞；在第二个试管中备有对照载体转导的MC3T3细胞；在第三个试管中备有由Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物转导的MC3T3细胞。然后测定各试管内矿化量。如果第一个试管内矿化的量大于第二个试管，且第三个试管内矿化的量与第一个试管内矿化的量大致相同，则这种Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物也具有提高或刺激矿化的功能。
另一种优选实施方案也提供体外筛选Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物的方法。即在第一个试管中备有Dkk2表达腺病毒转导的BMS培养细胞；在第二个试管中备有对照载体转导的BMS培养细胞；在第三个试管中备有由Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物转导的BMS培养细胞。然后测定每一个试管内矿化的量。如果第一个试管内矿化的量大于第二个试管，且第三个试管内矿化的量与第一个试管内矿化的量大致相同，则这种Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物也具有提高或刺激矿化的功能。
还有一种实施方案为在体外筛选那些给哺乳动物治疗某种疾病的Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物的方法。这种方法是将调节性的、或免疫调节性的、或NKT细胞放入带有饲养层细胞的第一个试管；将调节性的、或免疫调节性的、或NKT细胞加上Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物放入第二个试管；将调节性的、或免疫调节性的、或NKT细胞及Dkk蛋白放入带有饲养层细胞的第三个试管。而后测定各试管内细胞更新或增殖的量。如果第二试管内的细胞量多于第一试管内的细胞量，并与第三试管内的细胞数目大致相同，则这种Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物也具有造成细胞更新或增殖的功能。
还有一个筛选Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物的实施方案，包括：(1)用对照载体转导MC3T3细胞；和(2)用包含Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物的逆转录病毒转导MC3T3细胞。用Alizarrin Red将这些被转导了的细胞染色以检测矿化的情况。如果对照(1)没有显示矿化，而(2)显示了矿化，则这种Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物也具有提高或刺激矿化的功能。
另一种体外筛选的优选实施方案包括用BMS培养细胞替代前面所述步骤中用的MC3T3细胞，而后在染色时用二甲酚橙替代Alizarrin Red。
本发明还提供了一种体外检测法，其中将Dkk、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有类似功能的无关蛋白、或同源物加入Dkk2基因敲除小鼠，从而提高或刺激矿化。
材料和方法
BMS细胞培养及骨分化的诱导
从3个月大的小鼠用过去已描述过的方法建立BMS细胞培养物11。这些BMS细胞以10×106细胞/孔的密度短暂地培养在含有100单位/毫升青霉素、100单位/毫升链霉素及10％胎牛血清的α-培养基中。五天后，用4％多聚甲醛将此细胞培养物在4℃固定10分钟。成骨细胞集落可通过用AP(Sigma Diagnostics)染色来观察。当细胞铺满时便可在10nM地塞米松、8mM β-磷酸甘油、50微克/毫升抗坏血酸存在的情况下诱导成骨分化。其培养液每两天更换一次。用Von Kossa硝酸银或Alizarrin Red染色可观察矿化的情况。
骨髓细胞及破骨细胞分化的诱导
将从小鼠骨髓中提取出的细胞以5×105细胞/孔的密度接种在含有抗生素、10％胎牛血清、10纳克/毫升MCSF和60纳克/毫升RANKL的α-培养基的48孔培养板中。其培养基每两天更换一次。第六天时，成骨细胞经4％多聚甲醛在4℃固定10分钟，并用TRAP染色后可视化(Sigma Diagnostics)。
来自小鼠颅盖骨的成骨细胞的培养
自5-8天大的小鼠获取颅盖骨，用PBS洗涤两次并用含有0.05％胰蛋白酶、0.2mM EDTA、0.5毫克/毫升胶原酶P的PBS进行消化以释放成骨细胞。经离心收集成骨细胞并以2×105细胞/孔的密度接种在含有100单位/毫升青霉素、100单位/毫升链霉素、10％胎牛血清和1％非必需氨基酸的DMEM的6孔培养板中。待七天后，细胞铺满。将培养液更换成含有抗生素、10％胎牛血清、5mM β-磷酸甘油及25微克/毫升抗坏血酸的α-培养基。培养液每天更换一次。其矿化的情况可通过用20nM二甲酚橙染活细胞培养物而观察。
免疫染色
将BMS细胞接种在6-孔板内的盖玻片上。在不同的时间点将盖玻片固定，并用Vector Laboratories的Blocking Reagent封闭。细胞经透化后，先用抗-Dkk2单克隆抗体，而后用罗丹明缀合的第二抗体染色。
QPCR和Northern分析
用Trizol试剂(Invitrogen)按厂商说明书提取总RNA。为进行QPCR，首先用实时RT-PCR的SuperScriptTM First Strand SynthesisSystem(Invitrogen)将RNA逆转录。QPCR是用QuantiTectTM SYBRGreen PCR试剂盒(Qiagen)在DNA Engine OPTICONTM(MJResearch Inc)上进行。每个样品都用β-肌动蛋白作为内部参照。应用过去已描述过的公式24，可参照β-肌动蛋白mRNA的水平将mRNA的相对变化标准化。为了做Northern分析，先要将RNA(10μg)在琼脂糖凝胶上分离。待将RNA转移至尼龙膜上后，用[32P]标记的探针检测。
SiRNA及Dkk的表达
将以H1启动子为基础的SiRNA生产单位插入到逆转录病毒载体上，用此载体生产出逆转录病毒，并用其感染MC3T3细胞。被此载体稳定转录的细胞经潮霉素(Calbiochem-Novabiochem Co.)筛选出来。此后将那些抗潮霉素的细胞合并进行研究。
为了使Wnt1，Dkk1，Dkk2和sFRP3在BMS细胞中超量表达，先建立了含有Wnt1，mDkk1，mDkk2，或sFRP3表达盒的腺病毒。用此腺病毒转导BMS细胞培养物，可用20nM二甲酚橙染活细胞培养物以观察其矿化的情况。
原位杂交
用Dkk1，Dkk2和Wnt7b的全长编码区合成反义和有义的探针。探针用RNA labelling Kit(Roche，Indianapolis，IN.USA)标记上洋地黄毒苷。来自三周大的小鼠胫骨的切片经脱蜡、再水化后，用4％多聚甲醛固定。切片再经2％甘氨酸、蛋白酶K处理，用乙酸酐/TEA溶液乙酰化后，与洋地黄毒苷标记的探针杂交。经50％的甲酰胺、5xSSC和5％SDS在70℃洗涤30分钟两次后，再用50％的甲酰胺、2xSSC在65℃洗涤30分钟。在此之后，切片先与抗-洋地黄毒苷-碱性磷酸酶的抗体温育，后与氮蓝四唑/4-溴-5-氯-吲哚磷酸(Nitro B1ueTetrazolium/4-bromo-5-chloro indolylphosphate)一起温育使之呈紫蓝色。另外，切片还经过甲基绿(核)及橘黄G(细胞质)的复染。
BMD测量
首先建立了一个Dkk2基因敲除的小鼠模型。当小鼠两个月大时，在PIXImus小动物DEXA系统(GE-Lunar，Madison，WI)上用双能X-线吸收测量法(double-energy X-ray absorptionometry，DXA)检测这些小鼠骨矿化密度。
实施例
1.用经典Wnt刺激成骨细胞矿化
骨髓基质(BMS)细胞是从三个月大的小鼠分离出来的，带有2.3Kb CollA1启动子控制的绿色荧光蛋白(GFP)转基因(2.3Col-GFP)11。2.3Col-GFP转基因只在成骨细胞和骨细胞表达，因此可把GFP当成成骨细胞的标志。在BMS培养的第十天，可用表达荧光素酶的对照腺病毒，或表达Wnt1的腺病毒将其感染。在培养的第二十天，将培养物固定并用Von Kossa银染或Alizarrin Red染色以检测矿化情况。并通过Northern分析的方法检测两个被广泛用于鉴定成骨细胞分化的标志：骨唾液酸蛋白(bone sailioprotein，BSP)及骨钙蛋白(OC)。
在成骨诱导因子地塞米松，抗坏血酸和β-磷酸甘油存在的条件下，经Wnt1表达腺病毒转导或经过Wnt3a条件培养基处理，使原代BMS培养物矿化增强(图1A)。这种矿化增强是由于骨细胞增多而造成的，这也可作为终末分化的标志。BSC和OC标记的表达在用Wnt1腺病毒感染的细胞中也有所增加(图1B)。
2.经典Wnt刺激骨原细胞的AP活性
骨髓基质(BMS)细胞是从三个月大的带有2.3Col-GFP转基因的小鼠分离出来的。在BMS培养的第十天，可用表达荧光素酶的对照腺病毒，或用表达Wnt1的腺病毒将其感染。在培养的第十五天将细胞染色以检测AP的活性。
正如图1A-a所见，经表达Wnt1的腺病毒感染的BMS培养物似乎比那些用对照腺病毒感染的BMS培养物显示了更多的AP染色。计算集落数目证明，Wnt-1感染提高了集落的大小但没有提高集落的数目。此结果与过去关于经典Wnts可以刺激AP活性3，7(可能是通过刺激成骨细胞母细胞的增殖)及LRP-5缺陷会降低成骨细胞母细胞增殖的发现是一致的8。
3.BMS培养物中内源性经典Wnt的鉴定
为了鉴定Wnt在BMS培养物中的表达模式，我们用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定了19种Wnt mRNA在原代BMS培养物中的表达。在不同的时间从小鼠的BMS培养物中提取RNA，然后用实时RT-PCR测定这19种Wnts的mRNA水平。用实时RT-PCR还测定了Dkk1和Dkk2在BMS培养物中的表达。
实时RT-PCR的方法还被用于克隆Wnt7b cDNA，并通过LEF-1荧光素酶报道基因试验证明它是一个经典Wnt。为了鉴定Wnt7b，Dkk1和Dkk2在体内的表达，用小鼠长骨的切片做了以Wnt7b，Dkk1和Dkk2的cDNA为探针的原位杂交。
试验结果显示，在经典Wnts中，只有Wnt1和Wnt7b的RNA在原代BMS培养物中检测得到。Wnt1的表达很微量，其表达量在整个分化过程中不改变。相反，Wnt7b的表达水平在分化过程中变化很大。在第五天加入分化培养基之后，第八天，Wnt7b mRNA的水平最高。在这之后，它的水平降低(见图2A)。Dkk2 mRNA水平在分化过程中显著增高，而Dkk1 mRNA只在分化末期才升高(图2A)。
原位杂交的结果显示，Dkk1在骨细胞中表达(图2B)，而Dkk2和Wnt7b则在成骨细胞中表达。在骨原细胞的分化过程中，Wnt5a和Wnt5b明显增高(见图3A和图3B)。
4.骨原细胞内Dkk1对Wnt功能的拮抗作用
BMS细胞是从三个月大的带有2.3Col-GFP转基因的小鼠分离出来的。第六天，将重组Dkk1蛋白(1μM)或对照缓冲液加至BMS培养物中。而后用荧光显微镜术检测GFP的表达。GFP的表达在那些经Dkk1蛋白处理过的细胞(图4A)比对照细胞有所降低(图4B)。另外可见的是GFP的表达与在带有由2.3kb CollA1启动子控制的GFP转基因的小鼠中的矿化有很强的相关性11。由Dkk1造成的GFP表达的降低意味着由经典Wnt介导的骨原细胞的前期分化可能被Dkk1蛋白阻断了。1，12，13
5.经典Wnt对成骨细胞分化后期的矿化没有刺激作用
BMS细胞是从三个月大的带有2.3Col-GFP转基因的小鼠分离出来的。在第十五天，BMS培养物被带有Wnt1的腺病毒或对照腺病毒感染。在第十七天，对BMS培养物进行二甲酚橙染色以观察矿化的情况。
试验结果指出在BMS培养物后期加入经典Wnt对矿化作用没有任何作用(见图5)。
6.经典Wnt在骨原细胞分化过程中对Dkk2表达有上调作用
最初由颅盖骨培养物而来的MC3T3细胞可以被诱导而进入骨分化。虽然MC3T3的矿化不像BMS培养物那样强，但许多成骨细胞分化的标志，包括OC，BSP及胶原蛋白I，的表达都与原代培养的表达模式相似。MC3T3细胞经Wnt1-腺病毒或对照腺病毒转导。在分化的不同时间点提取其细胞mRNA，而后用Northern印迹分析方法检测Dkk2的表达。
从2.3Col-GFP小鼠而来的BMS培养物，在其第十天用Wnt3aCM或对照CM处理，然后在第十一天检查GFP的表达。把需检测的BMS细胞接种在盖玻片上。当GFP表达时，就用抗-Dkk2的单克隆抗体和罗丹明(Red)标记的抗小鼠的第二抗体做免疫染色。GFP和罗丹明可通过共聚焦显微术来检测。
Wnt1转导的MC3T3细胞内Dkk2mRNA的水平比对照细胞的明显增高(图6A)。图6B显示经典Wnt可启动2.3Col-GFP。Dkk2的表达与2.3Col-GFP的表达定位相同(图6C)。
7.Dkk2在培养的骨原细胞后期刺激矿化
为了检测Dkk2在成骨细胞早期生长和分化中所起的作用，用siRNA减低(knock down)Dkk2的表达14。这里采用一种在体内生产siRNA的策略，其中H1RNA聚合酶III启动子驱动特异性地靶向Dkk215(SupDkk2)的发夹双链体siRNA的合成。用Dkk2 siRNA稳定地转导MC3T3细胞(产生逆转录病毒及对照逆转录病毒)，然后诱导其分化。在不同的时间点用实时RT-PCR的方法检测Dkk2的表达，并用Von Kossa银染法检测矿化作用。
经第八天诱导分化之后，在第十三天，BMS培养物被Dkk2表达腺病毒或对照腺病毒转导，其后在第十七天用二甲酚橙将BMS培养物染色以显示矿化。
用SupDkk2稳定转导的MC3T3细胞(SupDkk2细胞)直到被诱导分化后的第六天都显示了较低水平的Dkk2mRNA(大约是对照细胞的三分之一，图7A)。出乎意料的是，Dkk2mRNA的水平从第九天开始在SupDkk2细胞中增高。到第十二天，SupDkk2细胞Dkk2mRNA的水平比仅用对照siRNA载体稳定转染的MC3T3细胞高5倍(图7A)。相反，Dkk2表达水平在对照MC3T3细胞的分化过程中并没有明显变化(图7A)。SupDkk2细胞在近第20天开始显示出矿化。在其后几天内矿化的程度大大增加(图7B)。未被转导和仅被对照载体转导的MC3T3细胞只显示出背景水平的矿化，甚至在三十五天之后测定也是如此(图7C)。SupDkk2 MC3T3细胞在Dkk2表达模式及矿化能力方面比对照MC3T3细胞更接近原代BMS培养物。此结果可以被这样解释：在MC3T3细胞，siRNA对Dkk2表达的抑制可增强经典Wnt的信号传导活性，这种信号传导活性在正常情况下是被Dkk所抑制的。此种Wnt的信号传导的增加上调Dkk2的表达，使之最终逃脱了siRNA的抑制。这种高水平的Dkk2又造成MC3T3细胞进一步地分化。
受腺病毒转导的BMS细胞中Dkk2的超表达使得矿化得到刺激(图7D)。对比之下，那些被对照腺病毒转导的BMS细胞却没有显出矿化(图7E)。
8.Wnt抑制剂sFRP3对成骨细胞矿化的作用
sFRP3充当的是可溶性的Wnt结合蛋白，它可拮抗Wnt的信号传导。这里它的使用可以帮助观测它对矿化的作用35，36。在BMS培养的第十三天，将其用表达sFRP3的腺病毒或对照腺病毒转导，然后在第十七天用二甲酚橙染色以显示矿化。
结果表明：比较用表达sFRP3的腺病毒或对照腺病毒转导的BMS培养物，二者在矿化程度方面没有区别。sFRP3似乎对在BMS培养物的某些成骨细胞阶段的矿化没有任何作用，尽管Dkk2在此阶段可以刺激矿化。这说明在此阶段抑制Wnt对矿化没有影响(图8)。
9.Dkk2基因敲除小鼠的骨密度降低
野生型及Dkk2敲除型的雄性小鼠在第五十五天大时接受了在PIXImus小动物DEXA系统(GE-Lunar，Madison，WI)中进行的以双能X-线吸光测定法为方法的总骨矿物密度的测量。
表1显示Dkk2敲除型小鼠的总骨密度比野生型小鼠小7.286％。此结果说明Dkk2在发育过程中对骨形成起重要作用。
表1  雄性小鼠总骨矿物密度(BMD)
 
野生型(+/+)(g/cm2) Dkk2敲除型(-/-)(g/cm2) ％ P值
0.05046(N＝17) 0.4678(N＝17) 7.286 0.00056
10.来自Dkk2基因敲除的成骨细胞培养物的矿化降低
成骨细胞培养物来自小鼠(野生型及Dkk2敲除型)的颅盖骨。第六天，在培养基中加入1mM抗坏血酸和5mM β-磷酸甘油以诱导其分化。第十五天用二甲酚橙染色以示矿化。
到第十五天时，虽然在来自野生型小鼠(图9a和9d)或杂合型小鼠(图9b和9e)的细胞培养物中已可见明显的矿化，但在来自Dkk2敲除型小鼠(图9c和9f)的细胞培养物中却检测不到矿化。图9d、图9e和图9f显示的是在显微镜下用透射光所摄的矿化图像。
11.在Dkk2敲除型小鼠中成骨细胞和破骨细胞形成都有所降低
来自野生型、Dkk2敲除型及杂合型小鼠的BMS培养物在第五天染其AP活性以监测成骨细胞集落形成。为了监测破骨细胞的形成，骨髓细胞培养物需在其培养基中加入30纳克/毫升巨嗜细胞集落刺激因子(M-CSF)和60纳克/毫升核因子KB(NF-KB)配体的受体激活剂(RANKL)。第六天用TRAP染破骨细胞，而后在显微镜下观察多核细胞的形态。
来自Dkk2敲除型小鼠的细胞培养物中成骨细胞集落的数目(图10C)比来自野生型小鼠(图10A)或杂合型小鼠(图10B)的培养物明显减少。
类似的是，来自Dkk2敲除型小鼠的细胞培养物中破骨细胞的数目(图11C)比野生型小鼠(图11A)或杂合型小鼠(图11B)也明显减少。破骨细胞和成骨细胞的来源不同。前者来自造血干细胞，而后者来自间充质干细胞。

Claims (168)

1.一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白。
2.一种刺激或增强矿化的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白。
3.一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白。
4.一种调节骨原细胞的增殖的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白。
5.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中施用包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部、直肠或皮下施用的方式施用或通过这些方式的任何组合施用。
7.权利要求1-5任一项的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
8.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Dkk蛋白。
9.权利要求8的方法，其中所述组合物还包含在制药学上可以接受的载体。
10.权利要求8的方法，其中所述组合物配制成片剂、丸剂、糖锭、液体、凝胶胶囊、糖浆、浆液或悬浮液。
11.权利要求8的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
12.一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用至少一种Wnt抑制剂。
13.一种刺激或增强矿化的方法，包括施用至少一种Wnt抑制剂。
14.一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用至少一种Wnt抑制剂。
15.一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用至少一种Wnt抑制剂。
16.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用Wnt抑制剂。
17.权利要求的方法，其中施用包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部、直肠或皮下的方式施用或通过这些方式的任何组合施用。
18.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Wnt抑制剂。
19.权利要求18的方法，其中所述组合物还包含在制药学上可以接受的载体。
20.权利要求18的方法，其中所述组合物配制成片剂、丸剂、糖锭、液体、凝胶胶囊、糖浆、浆液或悬浮液。
21.权利要求12-16和18中任一项的方法，其中所述Wnt抑制剂包括小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品、或者小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白或化学制品的片段。
22.权利要求12-16和18中任一项的方法，其中所述Wnt抑制剂包括以下蛋白质的至少一种或所述蛋白质的至少一个片段：Dkk蛋白、新月蛋白、cerebrus蛋白、轴蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、T细胞因子蛋白、蓬乱蛋白或sFRP3蛋白。
23.权利要求12-16和18中任一项的方法，其中所述Wnt抑制剂包括Wnt1，Wnt2，Wnt3，Wnt3a，Wnt4a，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt7c，Wnt8，Wnt8a，Wnt8b，Wnt8c，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11，Wnt14，Wnt15或Wnt16。
24.权利要求12-16和18中任一项的方法，其中所述Wnt抑制剂包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
25.一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用至少一种Wnt拮抗剂。
26.一种刺激或增强矿化的方法，包括施用至少一种Wnt拮抗剂。
27.一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用至少一种Wnt拮抗剂。
28.一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用至少一种Wnt拮抗剂。
29.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用至少一种Wnt拮抗剂。
30.权利要求25-29中任一项的方法，其中施用包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部、直肠或皮下的方式施用或通过这些方式的任何组合施用。
31.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Wnt拮抗剂。
32.权利要求31的方法，其中所述组合物还包含在制药学上可以接受的载体。
33.权利要求31的方法，其中所述组合物配制成片剂、丸剂、糖锭、液体、凝胶胶囊、糖浆、浆液或悬浮液。
34.权利要求25-29和31中任一项的方法，其中所述Wnt拮抗剂包括小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品、或者小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白或化学制品的片段。
35.权利要求25-29和31中任一项的方法，其中所述Wnt拮抗剂包括以下蛋白质的至少一种或所述蛋白质的至少一个片段：Dkk蛋白、新月蛋白、cerebrus蛋白、轴蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、T细胞因子蛋白、蓬乱蛋白或sFRP3蛋白。
36.权利要求25-29和31中任一项的方法，其中所述Wnt拮抗剂包括Wnt1，Wnt2，Wnt3，Wnt3a，Wnt4a，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt7c，Wnt8，Wnt8a，Wnt8b，Wnt8c，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11，Wnt14，Wnt15或Wnt16。
37.权利要求25-29和31中任一项的方法，其中所述Wnt拮抗剂包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
38.一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用至少一种Dkk2蛋白。
39.一种刺激或增强矿化的方法，包括施用至少一种Dkk2蛋白。
40.一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用至少一种Dkk2蛋白。
41.一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用至少一种Dkk2蛋白。
42.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用至少一种Dkk2蛋白。
43.权利要求38-42中任一项的方法，其中施用包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部、直肠或皮下的方式施用或通过这些方式的任何组合施用。
44.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Dkk2蛋白。
45.权利要求44的方法，其中所述组合物还包含在制药学上可以接受的载体。
46.权利要求44的方法，其中所述组合物配制成片剂、丸剂、糖锭、液体、凝胶胶囊、糖浆、浆液或悬浮液。
47.一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
48.一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
49.一种刺激或增强矿化的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
50.一种刺激或增强矿化的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
51.一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
52.一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
53.一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
54.一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
55.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
56.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用至少一种Dkk蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
57.权利要求47-56中任一项的方法，其中施用包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部、直肠或皮下的方式施用或通过这些方式的任何组合施用。
58.权利要求47-56中任一项的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
59.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Dkk蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
60.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Dkk蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
61.权利要求59和60中任一项的方法，其中所述组合物还包含在制药学上可以接受的载体。
62.权利要求59和60中任一项的方法，其中所述组合物配制成片剂、丸剂、糖锭、液体、凝胶胶囊、糖浆、浆液或悬浮液。
63.权利要求59和60中任一项的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
64.一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用至少一种Wnt抑制剂，所述抑制剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
65.一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用至少一种Wnt抑制剂，所述抑制剂独立于任何可以被Dkk抑制的Wnt。
66.一种刺激或增强矿化的方法，包括施用至少一种Wnt抑制剂，所述抑制剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
67.一种刺激或增强矿化的方法，包括施用至少一种Wnt抑制剂，所述抑制剂独立于任何可以被Dkk抑制的Wnt。
68.一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用Wnt抑制剂，所述抑制剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
69.一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用Wnt抑制剂，所述抑制剂独立于任何可以被Dkk抑制的Wnt。
70.一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用Wnt抑制剂，所述抑制剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
71.一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用Wnt抑制剂，所述抑制剂独立于任何可以被Dkk抑制的Wnt。
72.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用Wnt抑制剂，所述抑制剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
73.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用Wnt抑制剂，所述抑制剂独立于任何可以被Dkk抑制的Wnt。
74.权利要求64-73中任一项的方法，其中施用包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部、直肠或皮下的方式施用或通过这些方式的任何组合施用。
75.权利要求64-73中任一项的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
76.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Wnt抑制剂，所述抑制剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
77.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Wnt抑制剂，所述抑制剂独立于任何可以被Dkk抑制的Wnt。
78.权利要求76和77中任一项的方法，其中所述组合物还包含在制药学上可以接受的载体。
79.权利要求76和77中任一项的方法，其中所述组合物配制成片剂、丸剂、糖锭、液体、凝胶胶囊、糖浆、浆液或悬浮液。
80.权利要求64-73，76和77中任一项的方法，其中所述Wnt抑制剂包括小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品、或者小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白或化学制品的片段。
81.权利要求64-73，76和77中任一项的方法，其中所述Wnt抑制剂包括以下蛋白质的至少一种或所述蛋白质的至少一个片段：Dkk蛋白、新月蛋白、cerebrus蛋白、轴蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、T细胞因子蛋白、蓬乱蛋白或sFRP3蛋白。
82.权利要求64-73，76和77中任一项的方法，其中所述Wnt抑制剂包括Wnt1，Wnt2，Wnt3，Wnt3a，Wnt4a，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt7c，Wnt8，Wnt8a，Wnt8b，Wnt8c，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11，Wnt14，Wnt15或Wnt16。
83.权利要求64-73，76和77中任一项的方法，其中所述Wnt抑制剂包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
84.一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用Wnt拮抗剂，所述拮抗剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
85.一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用Wnt拮抗剂，所述拮抗剂独立于任何可以被Dkk拮抗的Wnt。
86.一种刺激或增强矿化的方法，包括施用Wnt拮抗剂，所述拮抗剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
87.一种刺激或增强矿化的方法，包括施用Wnt拮抗剂，所述拮抗剂独立于任何可以被Dkk拮抗的Wnt。
88.一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用Wnt拮抗剂，所述拮抗剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
89.一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用Wnt拮抗剂，所述拮抗剂独立于任何可以被Dkk拮抗的Wnt。
90.一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用Wnt拮抗剂，所述拮抗剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
91.一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用Wnt拮抗剂，所述拮抗剂独立于任何可以被Dkk拮抗的Wnt。
92.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用Wnt拮抗剂，所述拮抗剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导功能的。
93.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用Wnt拮抗剂，所述拮抗剂独立于任何可以被Dkk拮抗的Wnt。
94.权利要求84-93中任一项的方法，其中施用包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部、直肠或皮下的方式施用或通过这些方式的任何组合施用。
95.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Wnt拮抗剂，所述拮抗剂起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
96.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Wnt拮抗剂，所述拮抗剂独立于任何可以被Dkk拮抗的Wnt。
97.权利要求95和96中任一项的方法，其中所述组合物还包含在制药学上可以接受的载体。
98.权利要求95和96中任一项的方法，其中所述组合物配制成片剂、丸剂、糖锭、液体、凝胶胶囊、糖浆、浆液或悬浮液。
99.权利要求84-93，95和96中任一项的方法，其中所述Wnt拮抗剂包括小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品、或者小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白或化学制品的片段。
100.权利要求84-93，95和96中任一项的方法，其中所述Wnt拮抗剂包括以下蛋白质的至少一种或所述蛋白质的至少一个片段：Dkk蛋白、新月蛋白、cerebrus蛋白、轴蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、T细胞因子蛋白、蓬乱蛋白或sFRP3蛋白。
权利要求84-93，95和96中任一项的方法，其中所述Wnt拮抗剂包括Wnt1，Wnt2，Wnt3，Wnt3a，Wnt4a，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt7c，Wnt8，Wnt8a，Wnt8b，Wnt8c，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11，Wnt14，Wnt15或Wnt16。
权利要求84-93，95和96中任一项的方法，其中所述Wnt拮抗剂包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
一种刺激或增强骨形成的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
一种刺激或增强矿化的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
一种刺激或增强矿化的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
一种刺激或增强成骨细胞矿化的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
110.一种调节骨原细胞增殖的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
111.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
112.一种直接加速成骨细胞分化的方法，包括施用Dkk2蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制或拮抗的Wnt。
113.权利要求103-112中任一项的方法，其中施用包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部、直肠或皮下的方式施用或通过这些方式的任何组合施用。
114.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Dkk2蛋白，所述蛋白起此作用是独立于其调控经典Wnt信号传导作用的。
115.一种用于治疗骨病、骨折、骨损伤或骨异常的治疗组合物，包含至少一种Dkk2蛋白，所述蛋白独立于任何可以被Dkk抑制的Wnt。
116.权利要求114和115中任一项的方法，其中所述组合物还包含在制药学上可以接受的载体。
117.权利要求114和115中任一项的方法，其中所述组合物配制成片剂、丸剂、糖锭、液体、凝胶胶囊、糖浆、浆液或悬浮液。
118.一种增进细胞自我更新的体外方法，包括：
a)从受试者获取细胞；和
b)在体外提供：
(i)饲养层，和
(ii)足以刺激所述细胞更新的量的Dkk蛋白，Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂。
119.权利要求118的方法，其中所述饲养层包括间充质干细胞，基质细胞或可以增进细胞生长或分化的其它细胞类型。
120.权利要求118的方法，其中所述细胞包括造血干细胞。
121.权利要求118的方法，其中所述细胞包括调节的、免疫调节的或NKT细胞。
122.权利要求118的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
123.权利要求118的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品、或者小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白或化学制品的片段，或其任何组合。
124.权利要求118的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括以下蛋白质的至少一种或所述蛋白质的至少一个片段：Dkk蛋白、新月蛋白、cerebrus蛋白、轴蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、T细胞因子蛋白、蓬乱蛋白、sFRP3蛋白或其任何组合。
125.权利要求118的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括Wnt1，Wnt2，Wnt3，Wnt3a，Wnt4a，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt7c，Wnt8，Wnt8a，Wnt8b，Wnt8c，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11，Wnt14，Wnt15，Wnt16或其任何组合。
126.一种治疗哺乳动物受试者的疾病的方法，包括：
a)从所述受试者或其他受试者获取细胞；
b)在下述物质的存在下体外更新所述细胞：
(i)饲养层，和
(ii)足以刺激所述细胞更新的量的Dkk蛋白，Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂；
c)把所述更新的细胞重新施用给所述受试者。
127.权利要求126的方法，其中所述饲养层包括间充质干细胞，基质细胞或可以增进细胞生长或分化的其它细胞类型。
128.权利要求126的方法，其中所述细胞包括造血干细胞。
129.权利要求126的方法，其中所述细胞包括调节的，免疫调节的或NKT细胞。
130.权利要求126的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
131.权利要求126的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品、或者小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品的片段，或其任何组合。
132.权利要求126的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括以下蛋白质的至少一种或所述蛋白质的至少一个片段：Dkk蛋白、新月蛋白、cerebrus蛋白、轴蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、T细胞因子蛋白、蓬乱蛋白、sFRP3蛋白或其任何组合。
133.权利要求133的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括Wnt1，Wnt2，Wnt3，Wnt3a，Wnt4a，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt7c，Wnt8，Wnt8a，Wnt8b，Wnt8c，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11，Wnt14，Wnt15，Wnt16或其任何组合。
134.一种治疗哺乳动物受试者的疾病的方法，包括：
a)从所述受试者获取细胞；
b)在体外转导所述细胞以引入至少一个抗特定疾病的基因；
c)在下列物质存在下使所述被转导的细胞体外更新：
(i)饲养层，和
(ii)足以刺激所述转导的细胞更新的量的Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂。
d)把所述更新的细胞重新施用给所述受试者。
135.权利要求134的方法，其中所述饲养层包括间充质干细胞，基质细胞或可以增进细胞生长或分化的其它细胞类型。
136.权利要求134的方法，其中所述细胞包括造血干细胞。
137.权利要求134的方法，其中所述细胞包括调节的，免疫调节的或NKT细胞。
138.权利要求134的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
139.权利要求134的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品、或者小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品的片段，或其任何组合。
140.权利要求134的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括以下蛋白质的至少一种或所述蛋白质的至少一个片段：Dkk蛋白、新月蛋白、cerebrus蛋白、轴蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、T细胞因子蛋白、蓬乱蛋白、sFRP3蛋白或其任何组合。
141.权利要求134的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括Wnt1，Wnt2，Wnt3，Wnt3a，Wnt4a，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt7c，Wnt8，Wnt8a，Wnt8b，Wnt8c，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11，Wnt14，Wnt15或Wnt16。
142.一种治疗哺乳动物受试者的病毒感染的方法，包括：
a)从被病毒感染的受试者获取CD34+细胞；
b)在体外转导所述细胞以引入抗所述病毒的基因；
c)在下列物质存在的情况下使所述被转导的细胞体外更新：
(i)饲养层，和
(ii)足以刺激所述细胞更新的量的Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂；
d)把所述更新的被转导的细胞重新施用给所述受试者。
143.权利要求142的方法，其中所述饲养层包括间充质干细胞，基质细胞或可以促进细胞生长或分化的其它细胞类型。
144.权利要求142的方法，其中所述细胞包括造血干细胞。
145.权利要求142的方法，其中所述细胞包括调节的，免疫调节的或NKT细胞。
146.权利要求142的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
147.权利要求142的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品、或者小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂类、带电的脂类、极性脂类、非极性脂类、糖类、糖蛋白、糖脂类、脂蛋白、化学制品的片段，或其任何组合。
148.权利要求142的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括以下蛋白质的至少一种或所述蛋白质的至少一个片段：Dkk蛋白、新月蛋白、cerebrus蛋白、轴蛋白、Frzb蛋白、糖原合酶激酶蛋白、T细胞因子蛋白、蓬乱蛋白、sFRP3蛋白或其任何组合。
149.权利要求142的方法，其中所述Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂包括Wnt1，Wnt2，Wnt3，Wnt3a，Wnt4a，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt7c，Wnt8，Wnt8a，Wnt8b，Wnt8c，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11，Wnt14，Wnt15，Wnt16或其任何组合。
150.权利要求142的方法，其中所述病毒感染包括HBV感染、HCV感染或HIV感染。
151.权利要求126，134和142中任一项的方法，其中施用包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部、直肠或皮下的方式施用或通过这些方式的任何组合施用。
152.权利要求118，126，134和142中任一项的方法，其中所述疾病包括任何类型的病毒介导的或免疫药物介导的肝炎、细菌感染、病毒感染、真菌感染或寄生虫感染。
153.权利要求152的方法，其中所述病毒感染包括HBV感染、HCV感染或HIV感染。
154.权利要求118，126，134，142和152中任一项的方法，其中所述疾病包括结肠炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、系统性红斑狼疮、骨质疏松、非酒精性脂肪肝、糖尿病、葡萄糖耐受不良、肥胖症、代谢综合征、移植物抗宿主疾病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、眼病、葡萄膜炎(uvitis)、皮肤疾病、肾脏疾病、血液疾病、ITP、PA、自身免疫性肝病、其它风湿病(other rheumatologic disease)、内分泌疾病、脉管炎、硬皮病、CREST、神经疾病、肺病、肌炎、耳病、重症肌无力、非HIV AIDS、全身性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、硬皮病、混合型结缔组织疾病(mixed connective tissue disorder)、腹腔疾病、CREST综合征(皮内钙质沉着、雷诺现象、食管功能不良、指端硬化和毛细血管扩张)或任何其他免疫相关或免疫介导的障碍或疾病。
155.一种体外筛选方法，用于筛选施用给哺乳动物受试者以治疗疾病的以下蛋白的酶同源物、具有相似功能的无关或相关蛋白，或同源物：Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂，所述方法包括：
a)在体外：
(i)在第一个试管中提供调节的，免疫调节的或NKT细胞和饲养层；
(ii)在第二个试管中提供调节的，免疫调节的或NKT细胞和Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有相似功能的无关或相关蛋白，或同源物及饲养层；和
(iii)在第三个试管中提供调节的，免疫调节的或NKT细胞、Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂及饲养层；
b)测定每个试管中的细胞更新量；和
c)证实所述第二试管中的细胞量比第一试管中的细胞量大，并与所述第三试管中细胞量大致相同。
156.一种体外筛选方法，用于筛选当施用给哺乳动物受试者时能增强矿化作用的Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有相似功能的无关或相关蛋白质，或同源物，所述方法包括：
a)在体外：
(i)在第一个试管中提供由表达Dkk2的逆转录病毒转导的MC3T3细胞；
(ii)在第二个试管中提供由对照载体转导的MC3T3细胞；和
(iii)在第三个试管中提供由Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有相似功能的无关或相关蛋白质，或同源物转导的MC3T3细胞；
b)测定每个试管中的矿化量；和
c)证实第一试管中的矿化量比第二试管中的矿化量大，并与第三试管中的矿化量大致相同。
157.一种体外筛选方法，用于筛选当施用给哺乳动物受试者时能增强矿化作用的Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有相似功能的无关或相关蛋白质，或同源物，所述方法包括：
a)在体外：
(i)在第一个试管中提供由表达Dkk2的腺病毒转导的BMS培养物；
(ii)在第二个试管中提供由对照腺病毒转导的BMS培养物；和
(iii)在第三个试管中提供由Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有相似功能的无关或相关蛋白质，或同源物转导的BMS培养物；
b)测定每个试管中的矿化量；和
c)证实第一试管中的矿化量比第二试管中的矿化量大，并与第三试管中的矿化量大致相同。
158.权利要求157的方法，其中所述BMS培养物包括分离自携带有GFP转基因的三个月大的小鼠的BMS细胞，所述GFP转基因受2.3Kb Coil A1启动子的控制。
159.一种体外筛选方法，用于筛选当施用给哺乳动物受试者时能增强矿化作用的Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有相似功能的无关或相关蛋白质，或同源物，所述方法包括：
a)在体外：
(i)在第一个试管中提供由表达Dkk2的能增强矿化作用的腺病毒转导的细胞；
(ii)在第二个试管中提供由不能增强矿化作用的对照腺病毒转导的细胞；和
(iii)在第三个试管中提供由Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有相似功能的无关或相关蛋白质，或同源物转导的细胞；
b)测定每个试管中的矿化量；和
c)证实第一试管中的矿化量比第二试管中的矿化量大，并与第三试管中的矿化量大致相同。
160.用于治疗哺乳动物受试者中的疾病的治疗组合物，包含：
a)更新的干细胞；
b)Dkk蛋白；和
c)饲养层。
161.用于治疗哺乳动物受试者中的疾病的治疗组合物，包含：
a)Dkk蛋白；和
b)饲养层。
162.用于治疗哺乳动物受试者中的疾病的治疗组合物，包含：
a)Dkk蛋白、Wnt抑制剂或Wnt拮抗剂的酶同源物、具有相似功能的无关或相关蛋白质，或同源物；和
b)饲养层。
163.权利要求160-162的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
164.权利要求160-162的方法，其中所述组合物还包含在制药学上可以接受的载体。
165.权利要求160-162的方法，其中所述组合物配制成片剂、丸剂、糖锭、液体、凝胶胶囊、糖浆、浆液或悬浮液。
166.一种治疗哺乳动物受试者的疾病的方法，包括：
a)从所述受试者或其它受试者获取细胞，所述细胞包括调节的，免疫调节的或NKT细胞；
b)在下列物质的存在下使所述细胞体外更新：
(i)饲养层，和
(ii)足以刺激所述细胞更新的量的Dkk蛋白；
c)把所述更新的细胞重新施用给所述受试者；和
d)给所述受试者施用足以刺激细胞在所述受试者内的更新的额外量的Dkk蛋白。
167.权利要求166的方法，其中施用包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜、舌下、局部、直肠或皮下的方式施用或通过这些方式的任何组合施用。
168.权利要求166的方法，其中所述Dkk蛋白包括Dkk1，Dkk2，Dkk3，Dkk4或其任何组合。
CN200580024499.9A 2004-05-19 2005-05-18 刺激或增强骨形成和细胞自我更新的组合物和方法 Active CN101432010B (zh)

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