CN109758470A - miR-18a-5p激动剂在制备抗视网膜新生血管药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种miR‑18a‑5p激动剂在制备抗视网膜新生血管药物中的应用，miR‑18a‑5p激动剂通过上调miR‑18a‑5p的表达，抑制FGF1基因的表达，进而实现抗视网膜新生血管的目的。

Description

miR-18a-5p激动剂在制备抗视网膜新生血管药物中的应用

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及到miR-18a-5p激动剂在制备抗视网膜新生血管药物中的应用。

背景技术

视网膜新生血管性疾病是致盲的重要原因，主要包括糖尿病视网膜病变(DR)、早产儿视网膜病变(ROP)和视网膜中央静脉阻塞(CRVO)等。其特点表现为血管通透性增加、血管渗出和血管完整性缺失，继而导致视网膜出血以及纤维增生，最终引起严重的视力损害甚至视力丧失。视网膜血管病变的发病原因复杂，其机制尚不够清楚。视网膜的炎症和缺血缺氧，均可导致血管基底膜降解，血管内皮细胞游走并穿出基底膜，向损伤部位迁移，同时增强血管内皮细胞的增殖和分化能力，导致血管出芽，异常的血管腔s形成，最终形成新的血管网。其次，视网膜新生血管的形成可引起一系列并发症，如玻璃体腔出血、视网膜脱离以及新生血管性青光眼等，都可以不同程度地造成患者视力损害。

传统的治疗方式包括激光光凝和玻璃体腔切除术，其弊端为视网膜损伤以及视野缺损。目前已发现多种因子参与视网膜新生血管的发病过程，细胞生长因子和细胞基质蛋白为其中的两大类。抗血管内皮生长因子(VEGF)类单克隆抗体药物已广泛应用于临床治疗中，并取得了良好的疗效，成为眼科界的一项重要成果。但抗VEGF药物只能控制疾病的发展，不能从根本上解决问题，仍有部分患者使用后视力未提高。最近有研究表明，抗VEGF药物的长期使用会导致视网膜神经节细胞层变薄，揭示对神经视网膜具有一定的毒性作用；另外，玻璃体内注射抗VEGF药物，促进了干性年龄相关性黄斑变性(AMD)地图样萎缩的发展。

MicroRNA是一类内源性的小分子非编码RNA，在转录后水平调节基因表达的过程中扮演关键的作用。miRNA来源于细胞核内，由RNA聚合酶II型转录产生pri-miRNA。之后在核酸酶Drosha及DiGeorge syndrome chromosomal region 8(DGCR8)复合体的作用下，pri-miRNA被剪切成短链茎环结构的pre-miRNA，然后由Exportin5等转运至细胞质。此时，核酸内切酶Dicer将pre-miRNA切割成双链miRNA，其中一条链(成熟链)与Argonaute2蛋白组装形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)发挥生物学功能，另一条链(随从链)随即被降解。RISC特异地结合mRNA的3’非翻译区域(3’-UTR)，从而抑制翻译过程或者直接降解mRNA。miRNA参与调节组织的发育和分化、免疫反应、心血管疾病和癌症等多种生理病理过程。

miR-18a属于miR-17-92基因簇，定位在染色体13q31.3区域。研究发现，miR-18a参与了肿瘤的发生发展过程，起到一定的调控作用。miR-18a通过抑制结肠直肠癌中的ATM基因(共济失调—毛细血管扩张突变基因)的表达，减弱DNA的损伤修复。在基底乳腺癌中，miR-18a通过抑制HIF1α的活性，从而抑制了基底乳腺癌的肺转移。在非小细胞肺癌的治疗过程中，下调miR-18a可以增加放射治疗的敏感性，此研究结果有助于开发一种通过靶向调控miR-18a来致敏放射抗性肺癌细胞的新方法。并且，有研究认为miR-18a在血清中的含量有望作为肝脏肿瘤性疾病的诊断指标之一。

目前，关于miR-18a的研究主要集中在肿瘤的增殖与标志物方面，其在视网膜血管发育和血管新生中的作用尚无报道。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供miR-18a-5p的新用途，miR-18a-5p激动剂在制备抗视网膜新生血管药物中的应用，以治疗视网膜新生血管的形成引起的一系列并发症，如玻璃体腔出血、视网膜脱离以及新生血管性青光眼等。

为实现上述目的，本发明提供一种miR-18a-5p激动剂在制备抗视网膜新生血管药物中的应用，miR-18a-5p激动剂为增加miR-18a-5p表达的物质。

作为本发明的进一步改进，miR-18a-5p激动剂通过上调miR-18a-5p的表达，抑制hypoxia-inducible factor 1(HIF1α)和fibroblast growth factor 1(FGF1)基因的表达，进而实现抗视网膜新生血管的目的。

作为本发明的进一步改进，其应用为制备抑制人视网膜微血管内皮细胞形成管腔药物中的应用。

作为本发明的进一步改进，所述miR-18a-5p激动剂含有基因片段如序列SEQ IDNO.1所示：5’-uaaggugcaucuagugcagauag-3’。

作为本发明的进一步改进，所述miR-18a-5p激动剂为包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的质粒或转化体。

作为本发明的进一步改进，所述转化体为腺病毒、慢病毒或噬菌体。

本发明使用野生型C57BL/6J小鼠建立氧诱导视网膜病变模型，以下简称OIR模型。对不同发育时期以及OIR模型小鼠的总RNA进行二代转录组学测序，发现miR-18a-5p在小鼠发育时期表达明显下调，但在病理模型中表达量却明显上调。为了进一步验证，使用荧光实时定量PCR技术检测发育时期以及OIR模型小鼠中的miR-18a-5p的表达变化，所得检测结果与测序结果一致。进一步研究发现，在OIR模型小鼠的玻璃体中注射2μg miR-18a-5p激动剂，通过荧光显微镜可以观察发现注射miR-18a-5p激动剂实验组的视网膜新生血管明显减少。

本发明将miR-18a-5p激动剂转染入HRMEC，通过管腔形成实验判断miR-18a-5p对HRMEC形成血管的影响。研究发现，转染miR-18a-5p激动剂实验组的管腔形成能力明显下降，说明miR-18a-5p激动剂可以抑制HRMEC形成血管。

本发明将miR-18a-5p激动剂转染入HUVEC，通过RT-qPCR检测FGF1mRNA变化量，通过western blot检测FGF1蛋白水平变化。结果发现，miR-18a-5p可以抑制FGF1的表达。

本发明的有益效果在于：本发明采用C57BL/6J小鼠建立OIR模型，通过二代转录组学测序发现miR-18a-5p在正常小鼠发育期的表达量明显下调，但在OIR模型中明显上调，qPCR技术验证结果一致。将miR-8a-5p激动剂转染入HRMEC，通过管腔形成实验判断miR-18a-5p对HRMEC形成血管能力的影响，结果发现转染miR-18a-5p激动剂实验组的管腔形成能力明显下降，这表明miR-18a-5p可以抑制HRMEC形成血管。本发明进一步将miR-18a-5p激动剂注射入OIR模型小鼠玻璃体中，通过荧光显微镜观察发现注射miR-18a-5p激动剂实验组的视网膜新生血管明显减少，这表明miR-18a-5p可以抑制视网膜新生血管，进而一定程度防治新生血管性视网膜病变。miR-18a-5p通过抑制FGF1的表达来发挥作用。因此，本发明为防治新生血管性视网膜病变提供了新的研究方向。

附图说明

图1：RT-qPCR检测发育期(出生后第1、7以及16天)及OIR模型(出生后第17天)miR-18a-5p表达情况，normal为正常小鼠出生后第17天；

图2：转染miR-18a-5p激动剂对于HRMEC形成管腔的影响；A图为两组管腔的形态，B图为管腔个数与管腔长度定量统计结果，其中，agomir-18a-5p表示转染miR-18a-5p激动剂组，NC表示其对照组(无影响的碱基序列)；

图3：玻璃体内注射miR-18a-5p激动剂对于视网膜新生血管的影响；A图为两组视网膜血管染色，白色斑点为Adobe Photoshop标注的新生血管，B图为定量统计结果，其中，agomir-18a-5p表示转染miR-18a-5p激动剂组，Ctrl表示其对照组(PBS)；

图4：玻璃体内注射miR-18a-5p激动剂对于视网膜血管闭塞的影响；A图白色区域为两组血管闭塞区域，B图为定量统计结果。

图5：A图为miR-18a-5p抑制FGF1mRNA的表达量；B图为miR-18a-5p抑制FGF1蛋白的表达。

具体实施方式

下面将结合附图以及实施例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明。

miR-18a-5p是一种已发现与肿瘤相关的小核糖核酸。其在体内多种细胞内均有分布。

本发明人发现，miR-18a-5p可通过调节FGF1，HIF1α基因表达量，显示出抗新生血管的作用，可以得出miR-18a-5p是一个与血管生长密切相关的药物靶点。miR-18a-5p激动剂及其用途基于本发明人的上述新发现。

miR-18a-5p激动剂也可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平的，也可以是增加miR-18a-5p表达的病毒产品。所述的miR-18a-5p激动剂是指任何可提高miR-18a-5p的活性、提高miR-18a-5p的稳定性、上调miR-18a-5pa的表达增加miR-18a-5p有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调miR-18a-5p有用的物质，从而可用于抑制血管的生长。例如：核酸抑制物，蛋白抑制剂，核酸酶，核酸结合分子。

作为本发明的一种优选方式，所述miR-18a-5p激动剂为特异性针对成熟miRNA序列，通过化学合成方法制备，其核苷酸序列片段为5’-uaaggugcaucuagugcagauag-3’。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-2wt％；较佳的0.00001-2wt％；更佳的，0.0001-2wt％)的所述miR-18a-5p激动剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制血管生长。任何前述的miR-18a-5p激动剂可用于组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。其较佳的给药方式是局部部位的注射给药。

实施例1小鼠发育阶段及OIR模型中miR-18a-5p表达水平检测

首先使用野生型C57BL/6J小鼠建立OIR模型是一种经典的研究视网膜新生血管的动物模型。使用Omega公司的miRNA Kit试剂盒提取发育时期(胚胎(E)14.5天、出生后(P)1、7、16天)及OIR模型小鼠视网膜的总RNA，主要步骤如下：首先将提取的视网膜置于1.5ml离心管中，加入1ml RNA-solve Reagent,室温放置3分钟，使用组织匀浆器裂解；再加入0.2ml氯仿，用力混匀15s，放置冰上10min；然后4℃、12000g离心15分钟，转移不超过总体积80％的无色上层液体至新的1.5ml离心管中；加入1.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后加入至过滤柱(试剂盒内提供)，室温10000g离心1分钟，弃去过滤液；最后在过滤柱上加入30μl DEPC水溶解，室温15000g离心1分钟，所得总RNA放于-80℃保存或直接使用。

RNA提取完成后用于二代转录组学测序以检测miRNA的表达情况，检测由锐博生物完成。检测数据中，p值小于0.05，且倍数改变大于等于2倍的被认为是显著变化的miRNA，这其中便包括miR-18a-5p。

使用锐博公司的miDETECT A Track^TM miRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒验证测序结果，根据使用说明的标准操作流程，包括miRNA多聚腺苷酸加尾、逆转录和qPCR，主要步骤如下：取总RNA 1μg,加入5×Poly(A)Polymerase Buffer 2μl、Poly(A)Polymerase 1μl以及DEPC水至10μl总反应体积，37℃反应1h；取Poly(A)加尾产物10μl，加入RTase mix 4μl、5×RTase Buffer 4μl以及miDETECT A Track^TM Uni-RT Primer 2μl，42℃反应1h，然后72℃反应10min；取cDNA 2μl，加入2×SYBR Green Mix 10μl、miDETECT ATrack^TM miRNAForward Primer(10μM)0.5μl、miDETECT A Track^TM Uni-Reverse Primer(10μM)0.5μl以及DEPC水7μl，反应程序为：95℃10min；95℃2s、60℃20s、70℃10s循环40次。使用ABIQuantStudio^TM 5实时荧光定量PCR系统检测扩增循环数(CT)，减去U6的CT值得到标准化的CT(ΔCT)值。使用GraphPad Prism软件绘制miR-18a-5p表达变化图，如图1所示，结果说明miR-18a-5p在小鼠发育时期表达明显下调，但在OIR模型中表达量却明显上调。

实施例2miR-18a-5p对HRMEC形成血管的影响

首先使用miR-18a-5p激动剂进行细胞转染，激动剂由锐博提供。接种细胞之前先使用Bovine Plasma Fibronectin(BPF)包被孔板。转染前24小时将HRMEC接种于24孔板，贴壁细胞长满底面积60％时进行转染。所用培养液为Endothelial Cell Medium(ECM)，添加5％小牛血清、20ng/ml Endothelial Cell Growth Supplement(ECGS)及1％P/S。转染前吸取细胞原培养液，加入新鲜无血清培养液，放置培养箱(37℃、5％CO₂)孵育半小时。将miR-18a-5p激动剂(40nM)溶于无血清培养液，同时将Lipofectamine RNAiMAX Reagent混匀于等体积无血清培养液，两液相混，放置15分钟。将此转染液缓慢加至细胞培养液中，置于培养箱8小时。最后弃去转染液，加入完全培养液继续培养。

开始管腔形成实验之前，将Matrigel以50μl/孔均匀加入48孔板，放入培养箱半小时。然后将转染后的细胞以4×10⁴个/孔接种于48孔板，放入培养箱培养8小时，取出后用光学显微镜拍照，最后用image J软件定量分析。由图2结果可知，转染miR-18a-5p激动剂组管腔个数和长度均明显减少，说明miR-18a-5p能够抑制HRMEC形成管腔。

实施例3miR-18a-5p抑制FGF1的表达量

将agomir-18a-5p转染入HUVEC，同实施例2中步骤，提取总RNA。取0.5μg总RNA，加入1μl Random Primer以及1μl Oligo(dT)。充分混匀，放入PCR仪70℃反应5min，反应后置于冰上。配置反应体系，分别取6.1μl DEPC水、GoScript 5x Reaction Buffer 4μl、MgCl₂2.4μl、PCR Nucleotide Mix 1μl、Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5μl以及GoScript Reverse Transcriptase 1μl。取15μl反应体系与5μl总RNA，充分混匀后，放入PCR仪中扩增，反应条件为：25℃5min；42℃1h；70℃15min。取cDNA100ng、iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix buffer 5μl、Forward and Reverse primer 1.5μl以及DEPC水补体积至10μl。充分混匀后，放置于QuantStudio^TM 5Real-Time PCR Systems，按照标准程序运行，其结果如图A所示。

将转染miR-18a-5p激动剂及NC 72h的细胞消化收集，PBS洗一遍，加入RIPA裂解液(含1％蛋白酶抑制剂)，4℃裂解10min，15000g离心10min，取上清即为蛋白；BCA法测定蛋白浓度，100℃变性10min，迅速冷却；对蛋白样本SDS-PAGE凝胶电泳，每泳道加入50μg蛋白样本和marker；蛋白分离后在300mA电流下转移至PVDF膜，置于含5％牛奶的TBST溶液中室温封闭2h；加入1：1000稀释的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗脱三次，每次10分钟；加入辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1小时，TBST洗脱三次，每次10分钟；加入ECL化学发光试剂显色，于成像分析仪上进行检测，其结果如图5B所示。

上述实验结果发现，miR-18a-5p可以抑制FGF1表达。

实施例4miR-18a-5p对OIR小鼠视网膜新生血管的影响

首先制作OIR病理模型，将P7幼鼠和哺乳母鼠放入75％的氧舱，P12从氧舱中取出。此时大气氧浓度为相对低氧状态，会诱发视网膜新生血管的形成。将miR-18a-5p激动剂(5nmol)用20μl PBS溶解，然后加入20μl Lipofectamine RNAiMAX Reagent，放置半小时，终浓度为2μg/μl。幼鼠出舱时，立即进行玻璃体腔注射，在角巩膜缘位置进针，右眼注射1μlmiR-18a-5p激动剂，左眼注射等体积PBS。在正常氧气浓度中饲养至P17，提取视网膜并铺片，使用Isolectin B₄对血管组织染色，荧光显微镜下观察并拍照，最后使用AdobePhotoshop软件进行定量分析。结果如图3-4所示，注射miR-18a-5p激动剂组的新生血管数量明显减少，血管闭塞区域无显著差异，这说明miR-18a-5p能够抑制视网膜新生血管的形成。

上述研究表明，miR-18a-5p能够通过抑制视网膜血管内皮细胞形成血管，从而抑制视网膜新生血管的形成。因此，miR-18a-5p激动剂可用于制备抑制视网膜新生血管的药物。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> miR-18a-5p 激动剂在制备抗视网膜新生血管药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

uaaggugcau cuagugcaga uag 23

Claims (5)

1.miR-18a-5p激动剂在制备抗视网膜新生血管药物中的应用，该miR-18a-5p激动剂为增加miR-18a-5p表达的物质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其应用为制备抑制人视网膜微血管内皮细胞形成管腔药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述miR-18a-5p激动剂含有基因片段如序列SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述miR-18a-5p激动剂为包含如SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的质粒或转化体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转化体为腺病毒、慢病毒或噬菌体。