JP2017513526A - 細胞生産性を増強するｍｉＲＮＡ - Google Patents

Abstract

【解決手段】 本発明は、少なくとも２つの異なる領域を有する核酸コンストラクトに関し、前記領域は、生体分子の細胞生産を細胞中で刺激する少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする第一領域と、細胞死を抑制する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする第二領域と、細胞増殖を調節する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする第三領域とから選択される。本発明はさらに、それぞれの核酸コンストラクトを有する細胞に、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞により生産される生体分子の生産量を増加させるための方法であって、前記生体分子の細胞生産を刺激するステップと、細胞死を減少させるステップと、増殖を調節するステップとから選択される少なくとも２つのステップを有する方法に関する。【選択図】 図２

Description

本発明は、生体分子の細胞生産の刺激、細胞生存の調節、及び／または増殖の調節などの明確な機能を有する、少なくとも１つのｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤をそれぞれコードする少なくとも２つの異なる領域を有する、核酸コンストラクトに関する。本発明は、そのような核酸コンストラクトを有する細胞にさらに関する。更には、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞により生産される生体分子の生産量を増加させるための方法に関する。

インスリンなどの最初の製剤が生物工学的に、つまり生細胞中で、生産されて以来、生物学的製剤製造の分野は莫大に成長した。今日、多種の医薬化合物がバイオテクノロジーの方法を使用して生産されている。そのような化合物は、抗体、サイトカイン、ホルモン、並びに抗凝固剤を有する。殆どの化合物は細菌及び酵母などの下等生物中で生産されるが、哺乳類などの高次生物由来の細胞中で発現される必要がある、興味深い製剤、とくに大きく複雑なタンパク質の数が増えている。これは、所望の化合物の合成に関与する特定の酵素またはその他の分子の必要性ゆえであり、その酵素または分子は大部分が進化の後期に発達した。例えば、タンパク質の翻訳後修飾の殆どが酵素により媒介されており、その酵素は殆どの哺乳類細胞により発現しているが、細菌または酵母中には発現していない。従って、今日、生物学的製剤は、哺乳細胞工場中で広く生産されている。生物学的製剤、とくに組換えタンパク質の需要が急速に延びているため、産物の最大の質を維持しながらより高い産物力価を達成するために様々な戦略が追求された。しかしながら、原核生物の発現系と比較すると、バイオリアクターでの適度な産物力価及び低いストレス耐性は、なおも相当な難題である。哺乳類の製造細胞株の限界の克服は、生産効率を着実的に上昇させるための様々な細胞株工学操作的方法により、取り組まれてきた（例えば、Ｋｒａｍｅｒら、２０１０）。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼにより媒介される、またはより最近ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用することによる遺伝子ノックアウトはさておき、Ｂｃｌ−ＸＬまたはＡＶＥＮなどの有益な遺伝子の導入は、哺乳類細胞工場を工学操作するためにしばしば適用された。しかしながら、これらの技法の大多数が、複雑、労働集約的であり、または確立に相当な時間を要する。さらに、従来型の細胞工学操作的方法は、通常、１つまたは数個の分泌増強遺伝子の過剰発現に依存する。しかしながら、恒常的な過剰発現は、生産細胞にさらなる翻訳負担を追加し、ゆえに目的の生物学的製剤を生産する能力を低下させる。

従って、当技術分野においては、生物学的製剤製造における生産効率を高める、とくに、目的の化合物の生産には向けられないエネルギー及び栄養の細胞消費を維持し、または最小化さえしつつ、生産性を高める、ツール及び方法に対する需要がある。

１つ目の態様においては、本発明は、少なくとも２つの異なる領域を有する核酸コンストラクトに関する。ここで、その領域は、細胞中における生体分子の細胞生産を刺激する少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする第一領域であって、そのｍｉＲＮＡは群１から選択されるものである領域、細胞死を抑制する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする第二領域であって、そのｍｉＲＮＡは群２から選択され、またそのｍｉＲＮＡ阻害剤は群３から選択されるｍｉＲＮＡを阻害するものである領域、並びに、細胞増殖を調節する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする第三領域であって、そのｍｉＲＮＡは群４または５から選択され、またそのｍｉＲＮＡ阻害剤は群４または５から選択されるｍｉＲＮＡを阻害するものである領域から選択される。ここで、群１は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３４、３７、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、６２、６３、６６、６７、６９、７０、７５、７６、７７、８０、８１、８２、８３、８６、８８、９０、９１、９３、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４７、１５１、１５２、１５５、１５８、１６３、１６５、１７１、１７４、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、２０１、２０３、２０７、２１１、２１２、２１４、２１７、２２２、２２３、２２８、２３０、２３３、２３８、２３９、２４０、２５４、２５５、２６９、２７６、２７８、２７９、２８５、及び２９４からなる。群２は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、６、８、９、２０、５２、９８、５、７、２４、３１、３３、５０、５４、５９、６０、６１、６４、６８、７１、７３、７４、７９、８５、８７、８９、９２、９４、９５、９７、１４５、１５３、１５４、１５６、１５９、１６１、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７２、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８４、１９１、１９２、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２００、２０４、２０５、２０６、２０８、２０９、２１０、２１３、２１６、２１９、２２０、２２１、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３１、２３６、２３７、２４１、２４２、２４３、２４５、２４７、２４８、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６２、２６５、２６６、２６８、２７１、２７２、２７３、２７４、２７７、２８０、２８２、２８４、２８９、２９３、及び２９５からなる。群３は、配列ＩＤ番号：２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、６０５、６０７、６０８、及び６０９からなる。群４は、配列ＩＤ番号：５、７、６８、７９、９４、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２３、３０、３５、３６、３８、４３、６５、７２、７８、８４、９６、１０５、１０７、１０８、１１９、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３９、１４０、１４４、１４６、１４８、１４９、１５０、１６０、１６２、１６４、１７３、１７７、１８７、１８９、１９３、１９８、２０２、２１５、２１８、２３２、２３４、２３５、２４４、２４６、２４９、２５０、２６１、２６３、２６４、２６７、２７０、２７５、２８１、２８３、２８７、２８８、及び２９１からなる。また、群５は、配列ＩＤ番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、及び６０６からなる。

さらなる態様においては、本発明は、本発明の核酸コンストラクトを有する細胞に関する。

さらなる態様においては、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞により生産される生体分子の生産量を増加させるための方法に関する。その方法は、群１から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを細胞中で上昇させることによりその生体分子の細胞生産を刺激するステップ、群２から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを細胞中で上昇させること、及び／または群３から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを低下させることにより、細胞死を減少させるステップ、並びに、細胞中において群４もしくは５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを上昇させること、及び／または群４もしくは５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを低下させることにより、細胞増殖を調節するステップから選択される、少なくとも２つのステップを有する。ここで、群１は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３４、３７、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、６２、６３、６６、６７、６９、７０、７５、７６、７７、８０、８１、８２、８３、８６、８８、９０、９１、９３、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４７、１５１、１５２、１５５、１５８、１６３、１６５、１７１、１７４、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、２０１、２０３、２０７、２１１、２１２、２１４、２１７、２２２、２２３、２２８、２３０、２３３、２３８、２３９、２４０、２５４、２５５、２６９、２７６、２７８、２７９、２８５、及び２９４からなる。群２は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、６、８、９、２０、５２、９８、５、７、２４、３１、３３、５０、５４、５９、６０、６１、６４、６８、７１、７３、７４、７９、８５、８７、８９、９２、９４、９５、９７、１４５、１５３、１５４、１５６、１５９、１６１、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７２、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８４、１９１、１９２、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２００、２０４、２０５、２０６、２０８、２０９、２１０、２１３、２１６、２１９、２２０、２２１、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３１、２３６、２３７、２４１、２４２、２４３、２４５、２４７、２４８、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６２、２６５、２６６、２６８、２７１、２７２、２７３、２７４、２７７、２８０、２８２、２８４、２８９、２９３、及び２９５からなる。群３は、配列ＩＤ番号：２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、６０５、６０７、６０８、及び６０９からなる。群４は、配列ＩＤ番号：５、７、６８、７９、９４、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２３、３０、３５、３６、３８、４３、６５、７２、７８、８４、９６、１０５、１０７、１０８、１１９、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３９、１４０、１４４、１４６、１４８、１４９、１５０、１６０、１６２、１６４、１７３、１７７、１８７、１８９、１９３、１９８、２０２、２１５、２１８、２３２、２３４、２３５、２４４、２４６、２４９、２５０、２６１、２６３、２６４、２６７、２７０、２７５、２８１、２８３、２８７、２８８、及び２９１からなる。また、群５は、配列ＩＤ番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、及び６０６からなる。

さらなる態様においては、本発明は、細胞中で生体分子を生産するための方法であって、細胞培養物中で細胞を増殖させるステップ、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを上昇させるステップ、並びに細胞培養物から生体分子を単離するステップを有する方法に関する。

さらなる態様においては、本発明は、細胞中での生体分子の生産において、群１から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡと、群２から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、及び／または群３から選択されるｍｉＲＮＡを阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ阻害剤と、群４もしくは５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、及び／または群４もしくは５から選択されるｍｉＲＮＡを阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ阻害剤との組合せの使用に関する。ここで、群１は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３４、３７、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、６２、６３、６６、６７、６９、７０、７５、７６、７７、８０、８１、８２、８３、８６、８８、９０、９１、９３、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４７、１５１、１５２、１５５、１５８、１６３、１６５、１７１、１７４、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、２０１、２０３、２０７、２１１、２１２、２１４、２１７、２２２、２２３、２２８、２３０、２３３、２３８，２３９、２４０、２５４、２５５、２６９、２７６、２７８、２７９、２８５、及び２９４からなる。群２は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、６、８、９、２０、５２、９８、５、７、２４、３１、３３、５０、５４、５９、６０、６１、６４、６８、７１、７３、７４、７９、８５、８７、８９、９２、９４、９５、９７、１４５、１５３、１５４、１５６、１５９、１６１、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７２、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８４、１９１、１９２、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２００、２０４、２０５、２０６、２０８、２０９、２１０、２１３、２１６、２１９、２２０、２２１、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３１、２３６、２３７、２４１、２４２、２４３、２４５、２４７、２４８、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６２、２６５、２６６、２６８、２７１、２７２、２７３、２７４、２７７、２８０、２８２、２８４、２８９、２９３、及び２９５からなる。群３は、配列ＩＤ番号：２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、６０５、６０７、６０８、及び６０９からなる。群４は、配列ＩＤ番号：５、７、６８、７９、９４、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２３、３０、３５、３６、３８、４３、６５、７２、７８、８４、９６、１０５、１０７、１０８、１１９、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３９、１４０、１４４、１４６、１４８、１４９、１５０、１６０、１６２、１６４、１７３、１７７、１８７、１８９、１９３、１９８、２０２、２１５、２１８、２３２、２３４、２３５、２４４、２４６、２４９、２５０、２６１、２６３、２６４、２６７、２７０、２７５、２８１、２８３、２８７、２８８、及び２９１からなる。また、群５は、配列ＩＤ番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、及び６０６からなる。

図１は、機能的抗ＳＥＡＰコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＣＨＯ−ＳＥＡＰコントロール細胞の正規化された比ＳＥＡＰ生産性を、全７３のスクリーニングプレートについて示す。各柱は、示されるスクリーニングプレートの平均値を示す。データは、それぞれの非標的化コントロールｍｉＲＮＡの平均値に正規化された。エラーバーは、３つの独立のトランスフェクションの標準誤差（ＳＤ）を示す。 図２は、ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞における第一スクリーニングからの、有意な変化（ｐ<０．０５）を誘発したｍｉＲＮＡミミックの数の大要を、ｍｉＲＮＡライブラリーの率で示す。ケーキチャートは、考慮されたバイオプロセス関連パラメータそれぞれに対して与えられている。 図３は、全ｍｉＲ−３０ファミリーが、ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞の培養パフォーマンスの増強に貢献することを示す。（Ａ）第一ｍｉＲＮＡスクリーニングにおいて（Ａ）、または第二（検証）ｍｉＲＮＡスクリーニングにおいて（Ｂ）、ＳＥＡＰ生産性の上昇を示す全てのｍｉＲ−３０についての、正規化された容積ＳＥＡＰ生産性。攪拌培養条件下でＳＥＡＰ増大を示す全ｍｉＲ−３０ｍｉＲＮＡについての、正規化された生細胞密度（Ｃ）。攪拌培養条件下での、ｍｉＲ−３０ｍｉＲＮＡのアポトーシス及びネクローシスに対する影響。エラーバーは、３つの独立のトランスフェクションのＳＤを示す。統計解析については、対応がない両側ｔ検定が適用された（^＊＊ｐ<０．０１、^＊＊＊ｐ<０．００１）。比ＳＥＡＰ生産性（ｘ軸）に対する容積ＳＥＡＰ生産性（ｙ軸）の正規化された増加が、両パラメーターに有意に影響するｍｉＲＮＡについて示される。（Ｅ）ＳＥＡＰ比生産性の増加（ｘ軸）に対するアポトーシス（ｙ軸）の正規化された減少が、両パラメーターに有意に影響するｍｉＲＮＡについて示される（Ｆ）。それぞれのｍｉＲ−３０ファミリーメンバーが示される。 図４は、ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞でのスクリーニング検証のための、ｍｉＲ−３０ファミリーメンバーのスケールアップトランスフェクションの結果を示す。一過性トランスフェクション後７２時間の、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ及びｍｉＲ−３０ｃ−５ｐのミミック単独、または両ｍｉＲＮＡの組合せの導入後の、正規化された容積ＳＥＡＰ生産性（Ａ）並びに生細胞密度（ＶＣＤ）及び生存度（Ｂ）に対する影響。値はｍｉＲ−ＮＴコントロールに対して正規化され、エラーバーは３つの独立のトランスフェクションのＳＤを表わす。統計解析については、対応がない両側ｔ検定が適用された（^＊ｐ<０．０５、^＊＊ｐ<０．０１、^＊＊＊ｐ<０．００１）。 図５は、安定ｍｉＲ−３０過剰発現ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞プールの特性を示す。安定細胞プールにおけるｍｉＲＮＡ過剰発現（Ａ）。成熟ｍｉＲ−３０レベルが、Ｕ６ ｓｎｏＲＮＡとの比較で表現される。ｍｉＲＮＡ過剰発現は、ｐＥＧＰ−ＭＩＲ−Ｎｕｌｌコントロールプールにより表わされる内因性ｍｉＲＮＡレベルとの比較で、倍率変化値として表わされる。ＭＩＲ３０ａ、ＭＩＲ３０ｃ、及びＭＩＲ３０ｅ過剰発現細胞プールの培養の間の、ネガティブコントロール、及び親ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞との比較での、容積ＳＥＡＰ生産性（Ｂ）、生細胞密度／生存度（Ｃ）、及びＳＥＡＰ比生産性（Ｄ）の決定。エラーバーは３つレプリケートのＳＤを表わす。統計解析：ｍｉＲ−３０を過剰発現するプールを親ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞株と比較する、対応がない両側ｔ検定（^＊ｐ<０．０５、^＊＊ｐ<０．０１、^＊＊＊ｐ<０．００１）。 図６は、（Ａ）ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞のバッチ培養中の内因性ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ（ひし形）及びｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ（三角）の発現レベルの解析を示す。示される播種後日数において、ｍｉＲＮＡ発現レベル及び生細胞密度（点線）の解析が行われ、ｍｉＲＮＡ発現の変化が４８時間におけるレベルとの比較で計算された。（Ｂ）ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐミミック／アンタゴｍｉＲ（抗ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ）トランスフェクション後のＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞における、Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ染色によるアポトーシスの解析。トランスフェクションされた細胞のＤＮＡ含量がフローサイトメトリーを使用して測定され、２ｎより少ないＤＮＡ含量を示す細胞（Ｓｕｂ−Ｇ１／０）が、全細胞集団に対する割合として定量化された。エラーバーは、３つの独立のトランスフェクションのＳＤを示す。（Ｃ）ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐミミック／アンタゴｍｉＲ（抗ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ）トランスフェクション後のＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞における、成熟ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐの相対存在量。ｍｉＲＮＡ発現レベルは、ｍｉＲ−ＮＴがトランスフェクションされたコントロール細胞（黒柱）により表わされる内因性ｍｉＲＮＡレベルと比較した、倍率変化値として示される。全ＲＮＡがトランスフェクション後７２時間にて単離され、トリプリケートのトランスフェクションのＲＮＡ試料が逆転写のためにプールされた。成熟ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐレベルはＵ６ ｓｎｏＲＮＡとの比較で表現され、エラーバーは３つの技術的レプリケートのＳＤを表わす。ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐミミック／アンタゴｍｉＲ（抗ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ）導入後７２ｈのＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞の、正規化された（Ｄ）比ＳＥＡＰ生産性及び（Ｅ）生細胞密度。データはｍｉＲ−ＮＴがトランスフェクションされたコントロール細胞の値（黒柱）に正規化され、エラーバーは、３つの独立のトランスフェクションのＳＤを表わす。統計解析については、対応がない両側ｔ検定が適用された（^＊＊ｐ<０．０１、^＊＊＊ｐ<０．００１）。 図７から９は、比ＳＥＡＰ生産性（７）、容積ＳＥＡＰ生産性（８）、及び増殖（９）に関する、第二（検証）ｍｉＲＮＡスクリーニングの結果を示す。データはｍｉＲ−ＮＴがトランスフェクションされたコントロール細胞の値に正規化され、エラーバーは、３つの独立のトランスフェクションのＳＤを表わす。統計解析については、対応がない両側ｔ検定が適用された（^＊＊ｐ<０．０１、^＊＊＊ｐ<０．００１）。 図１０は、異なるヒト細胞株、つまりＳＫＯＶ３、Ｔ９８Ｇ、ＨＣＴ １１６、及びＳＧＢＳにおける、３つのアポトーシス促進性ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１３４−５ｐ、ｍｉＲ−３７８−５ｐ、及びｌｅｔ−７ｄ−３ｐの活性を示す（ｎ＝３＋／−ＳＤ、非標的化コントロールｍｉＲ−ＮＴに対して＋ｐ<０．０５、^＊＊ｐ<０．０１、^＊＊＊ｐ<０．００１）。 図１１は、ｍｉＲ−４８３のトランスフェクション後のＨｅＬａ細胞における、組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）の生産増加を示す。

１つ目の態様においては、本発明は、少なくとも２つの異なる領域を有する核酸コンストラクトに関する。その領域は、細胞中における生体分子の細胞生産を刺激する少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする第一領域であって、そのｍｉＲＮＡは群１から選択されるものである領域、細胞死を抑制する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする第二領域であって、そのｍｉＲＮＡは群２から選択され、またそのｍｉＲＮＡ阻害剤は群３から選択されるｍｉＲＮＡを阻害するものである領域、並びに、 細胞増殖を調節する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする第三領域であって、そのｍｉＲＮＡは群４または５から選択され、またそのｍｉＲＮＡ阻害剤は群４または５から選択されるｍｉＲＮＡを阻害するものである領域から選択される。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、真確細胞において全般的遺伝子発現を翻訳後に調節し、また種をまたいで非常によく保存されている、ヌクレオチド約２２個の内因性の小さい非コードＲＮＡ分子である。単一のｍｉＲＮＡは通常、最大で何百の異なるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調節し、また殆どのｍＲＮＡが複数のｍｉＲＮＡにより標的化されると予期されている。ｍｉＲＮＡ遺伝子はＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写され、次いで処理され、一本鎖成熟ｍｉＲＮＡを生じ、これがＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。ＲＩＳＣ複合体の中心部として、ｍｉＲＮＡはＲＩＳＣをそのｍＲＮＡ標的へと先導し、そこでｍｉＲＮＡは部分的相補塩基対合によりｍＲＮＡ転写物の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合する。遺伝子サイレンシングは、アルゴノート−２（ＡＧＯ２）媒介性ｍＲＮＡ切断、またはＡＧＯ１から４により促進される翻訳抑制のいずれかにより起こり、いずれの経路でも最終的に相当するタンパク質のレベルを低下させる（ｖａｎ Ｒｏｏｉｊ、２０１１）。小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とは対照的に、ｍｉＲＮＡは標的転写物の３’ＵＴＲ内の結合部位に対し部分的にしか相補的でなく、これにより特異性はより低くなり、従って潜在的標的遺伝子のプールを増加させる。完全なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合は、成熟ｍｉＲＮＡの５末端におけるヌクレオチド２〜７／８の間の配列をカバーするｍｉＲＮＡ「シード」領域においてのみ、混在している。ｍｉＲ−３０メンバーなどの同一の「シード」配列を有するｍｉＲＮＡは、ファミリーにグループ化される。生物情報学的標的予測ツールに従えば、同じファミリーのメンバーは、多数の標的ｍＲＮＡを共有することになっている。

発明者は、１つのｍｉＲＮＡの標的が多数であるにもかかわらず、いくつかのｍｉＲＮＡは一定の細胞プロセスに対し特異的な効果を示すことを発見した。組換えＣＨＯ−ＳＥＡＰ浮遊細胞株において、１１３９のｍｉＲＮＡを有する完全ネズミ科ミミックライブラリーを使用して機能的ハイコンテントｍｉＲＮＡスクリーニングを実施することにより、発明者は特定の細胞機能を向上させるのに適している別個のｍｉＲＮＡを明らかにした。とくに、群１（表１）のｍｉＲＮＡが、生体分子の細胞生産を刺激することが発見された。本明細書において使用される用語「生体分子の細胞生産」は、細胞あたりに生産される生体分子の量を意味する。細胞生産は、培養物から回収されうる生体分子の生産量を指す培養物全体の「容積生産性」に対し、「比生産性」とも呼ばれる。細胞生産のレベルは、１つの細胞により期間あたり合成される生体分子の量に、例えば、タンパク質翻訳速度に、また適用可能であれば細胞から生体分子が分泌される効率に、主に依存する。従って、群１のｍｉＲＮＡは、１つのまたは両方すらのプロセスに影響すると予期される。群１内では、配列ＩＤ番号：１、３、６、８、１０、２９、３９、４０、４７、４９、５１、５５、９１、１０３、１１５、１３２、１３７、１７１、２１１、及び２９４からなる群９のｍｉＲＮＡが、細胞生産に最も顕著な効果を示すことが発見された。従って、第一領域は、好ましくは、群９から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする。

群２（表２）及び３（表３）のｍｉＲＮＡは、細胞死を抑制することにより（群２）、またはアポトーシスもしくはネクローシスを促進することにより（群３）、細胞生存に影響を及ぼすことが発見された。培養物内の細胞死は、生産する細胞の数を減少させるだけでなく、全培養物に著しい負担をももたらす。死細胞は残骸として培養物内に残り、これが細胞ストレスを上昇させ、また高濃度では有毒にさえなりうる。従って、細胞の残骸は培養物から除去される必要があるが、これは培養条件を乱し、細胞に物理的ストレスを与え、これら全ては最終的には生産性の低下をもたらす。従って、細胞死を抑制するため、核酸コンストラクトは群２のｍｉＲＮＡをコードし、群２のｍｉＲＮＡはアポトーシスを直接的に阻害するのに適している。これらのｍｉＲＮＡのうち、配列ＩＤ番号：３、７、２０、５４、５９、７３、９４、１４５、１５９、１７５、１７６、１７８、１７９、１９９、２０６、２４８、２５１、２５２、２６６、及び２７２からなる群１０のｍｉＲＮＡは、細胞生存に最も顕著な効果を示すことが発見された。従って、第二領域は、好ましくは、群１０から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする。群３（表３）のｍｉＲＮＡは、細胞死を、とくにアポトーシス（群６、表６）またはネクローシス（群７、表７）を促進することが発見された。従って、これらのｍｉＲＮＡの阻害は細胞死を抑制するのに適切である。群３内では、配列ＩＤ番号：２９７、３０５、３０７、３１１、３１２、３１３、３２１、３３０、３３１、３３５、３３６、３４０、３４５、３５１、３５９、４０５、４１２、４５８、５１０、及び６０８からなる群１１のｍｉＲＮＡが、最も顕著な細胞死誘発効果を有することが発見された。これらのｍｉＲＮＡの阻害が最も好ましいように。従って、第二領域は、好ましくは、群１１から選択されるｍｉＲＮＡを阻害する、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする。

群４（表４）のｍｉＲＮＡは増殖を促進することが見いだされ、一方で群５（表５）のｍｉＲＮＡは細胞分裂を低下させた。従って、群４のｍｉＲＮＡの発現かつ群５のｍｉＲＮＡの阻害は、増殖を促進するのに適しており、群５のｍｉＲＮＡの発現かつ群４のｍｉＲＮＡの阻害は、増殖を阻害するのに適している。各単一細胞の細胞生産のほか、培養物中に存在する細胞数は、回収されうる生体分子の生産量を決定する。従って、生産する培養物のサイズを大きくするためには、とくに成長が遅い細胞が使用される、または細胞培養を始める場合には、細胞増殖を刺激することが望まれうる。他方で、いったん培養物が最適細胞密度に到達したら、細胞増殖を阻害することが望まれうる。分裂するためには、細胞は、膜、細胞核、及びさらなるオルガネラを含むほぼ全ての構成要素をざっと２倍にする必要がある。これはエネルギー及びタンパク質翻訳能力を消費し、するとエネルギー及びタンパク質翻訳能力は目的の生体分子の生産のためには提供されない。従って、とくにいったん最適培養サイズに到達したら、細胞増殖を阻害することが望まれうる。群４の ｍｉＲＮＡのうち、配列ＩＤ番号：５、７、２２、３０、３５、４３、６８、７２、７８、８４、９６、１４６、１４８、１６０、１７３、１７７、１９８、２０２、２３２、２３４、２４４、２６７、及び２８３からなる群１２のｍｉＲＮＡが、細胞増殖に対し最も顕著な効果を有した。また、増殖を抑制することが分かっているｍｉＲＮＡのうち、配列ＩＤ番号：５１７、５２３、５２６、５２９、５３１、５３３、５３７、５４８、５５０、５５８、５６０、５６１、５６３、５６６、５６７、５７１、５７５、５７７、５８３、５９１、６００、６０１、及び６０４からなる群１３のｍｉＲＮＡが、最も効果的であった。従って、細胞増殖を促進するためには、第三領域は、好ましくは、群１２から選択されるｍｉＲＮＡ、及び／または群１３から選択されるｍｉＲＮＡを阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする。細胞増殖を阻害するためには、第三領域は、好ましくは、群１３のｍｉＲＮＡ、及び／または群１２のｍｉＲＮＡを阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする。

細胞培養物から回収されうる生体分子の生産効率及び合計出力は、いくつかの細胞プロセスに依存する。そのうち最も重要なのは、生体分子のタンパク質細胞生産（翻訳／分泌）、細胞生存、及び細胞増殖であり、これらの調節は相互に関連しさえする。異なる細胞プロセスに影響する少なくとも２つのｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤を導入することにより、多数の細胞経路が最適化されうる。これが目的の生体分子の生産量の増加をもたらす。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ阻害剤のそれぞれが、相互に関連するいくつもの細胞経路のさまざまな標的遺伝子に影響し、これにより細胞内のタンパク質の組成に影響する。タンパク質合成を増強するための１つまたはいくつかの酵素の過剰発現と対比して、細胞の内因性タンパク質プール内のバランスを変えることは、望ましい生体分子の生産からエネルギーを引き出さない。ｍｉＲＮＡを発現することは実際には翻訳を減少させ、したがって生体分子の生産のためにエネルギー及びタンパク質翻訳能力を解放する。さらに、生産の制限要因は、生産される生体分子により異なるかもしれず、あるいは培養条件によっては培養中に変化さえしうる。ｍｉＲＮＡを制御することにより多種のタンパク質の組成に影響を及ぼすことにより、経路全体を調節することが可能である。これにより、単一の合成酵素を過剰発現させる、または単一のタンパク質分解酵素を阻害もしくはノックアウトすることによっては対処できないだろう、さまざまな制限を克服することが可能である。

本明細書で使用される用語「生体分子」は、細胞により生産され、また細胞から回収されることが適切である、あらゆる化合物を指す。好ましくは、生体分子は生物学的製剤、つまり治療薬、予防薬、診断薬を含む製剤であり、それは天然には本質的に生物学的でありバイオテクノロジーを使用して製造される。生物学的製剤は、とくに、抗体、酵素、ホルモン、ワクチンであるが、また、例えば腫瘍溶解性ウィルス及び遺伝子治療のために使用されるウィルスなどの、ウィルスでもありうる。従って、生物学的製剤は好ましくは組換え分子であり、より好ましくは組換えタンパク質または組換えウィルスである。

本明細書で使用される用語「ｍｉＲＮＡ阻害剤」は、細胞内で所与のｍｉＲＮＡの量を特異的に低下させるのに適するあらゆる化合物を指す。ｍｉＲＮＡ阻害剤は、例えば、目的のｍｉＲＮＡに特異的に結合しそれによりその標的ｍＲＮＡへの結合を防ぐ核酸分子である。そのような阻害剤は、アンタゴｍｉｒ、ｍｉＲＮＡスポンジ、及びｍｉＲＮＡデコイを含む。アンタゴｍｉｒは標的化されるｍｉＲＮＡに完全に相補的な小さいオリゴヌクレオチドであり、一方、ｍｉＲＮＡスポンジ及びｍｉＲＮＡデコイは、目的のｍｉＲＮＡに対する複数のタンデムな結合部位を有する核酸分子である。複数の結合部位ゆえ、その分子はｍｉＲＮＡの強力な競合阻害剤として働く（Ｅｂｅｒｔ及びＳｈａｒｐ、２０１０）。これに従い、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、アンタゴｍｉｒ、ｍｉＲＮＡスポンジ、及びｍｉＲＮＡデコイからなる群から好ましくは選択される。あるいは、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、例えばプロモーターまたはエンハンサーなどの、目的のｍｉＲＮＡの調節エレメンTを標的化しうる。

ある好ましい実施形態においては、核酸コンストラクトは、３つの異なる領域を有する。細胞生産、細胞死、及び細胞増殖のそれぞれに影響する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤を有することにより、生体分子の生産における細胞の効率が最適化されうる。

ある好ましい実施形態においては、少なくとも１つの領域、好ましくは各領域が、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの異なるｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする。あらゆる領域も、１つより多いｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードしうる。たとえば、同じファミリーに属し従って関連するｍｉＲＮＡを標的化する、いくつかのｍｉＲＮＡが有されうる。これにより、例えばｍｉＲ−３０ファミリーのいくつかのメンバーの組み合わせ導入により観察されるように、１つの特定の経路の調節を強化することが可能である。あるいは、より広くにわたる効果を生むためには、異なる経路を標的化するさまざまなｍｉＲＮＡが使用されうる。増殖、タンパク質合成、及び細胞死のような細胞プロセスは、通常１つより多いシグナル経路により調節されており、その経路の多くが相互に関連している。従って、どの細胞経路が生体分子生産のための制限要因を呈するか知られていない場合には、いくつかの経路を標的化することが特に有利である。ｍｉＲＮＡのどちらかと言えば小さいサイズゆえ、本発明の核酸コンストラクトは、２０のｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤、またはそれより多くをコードしうる。本明細書で使用される用語「領域」は、ｍｉＲＮＡ、または、例えばアンタゴｍｉｒもしくはｍｉＲＮＡデコイなどのｍｉＲＮＡ阻害剤へと転写される部分を有する、核酸コンストラクト上のセクションを指す。その領域は、プロモーター、オペレーター（例えば、エンハンサー、リプレッサー、及びイスレーター）、３‘ＵＴＲ調節エレメント（例えばｓｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲＮＡ結合部位）、またはスプライシングシグナルなどの、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤の転写を制御するための調節エレメントさらに有しうる。

ある好ましい実施形態においては、その少なくとも２つの異なる領域は、異なるプロモーターにより制御される。これはつまり、各領域がそれ自身の調節エレメントを、前記領域中に有されるｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤の転写がコンストラクトの他の領域に有されるｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤とは独立に調節されうるように、有するということである。これは、細胞増殖及び細胞生産が、細胞培養の間の異なる時点において調節されるべきである場合に、有利である。培養を引き起こす際には細胞増殖が促進されうる一方、いったん最適細胞濃度に達すれば、細胞生産性が増強されうる。培養の状態によっては、細胞死の調節がとくに誘発されうる。さらに、独立の調節エレメントの使用は、異なる細胞プロセスのためのｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤をさまざまな量で提供することを可能にする。例えば、細胞生産を刺激するｍｉＲＮＡは強力なプロモータ下に設置されうる一方、細胞死に影響するｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤はより弱いプロモーターにより調節されうる。

ある好ましい実施形態においては、少なくとも２つの異なる領域が１つの共通のプロモーターにより制御される。これは、核酸コンストラクトの迅速で容易な調製を可能にし、好ましくはどちらかといえば単純な調節がすでに十分な生体分子の生産量をもたらす場合に適用されうる。

ある好ましい実施形態においては、少なくとも１つのプロモーターが誘導性または阻害性である。誘導性／阻害性プロモーターは、その活性が、温度、光、酸素、または化学物質の存在などの外部環境に依存することが特徴である。誘導性または阻害性プロモーターを使用すると、細胞培養の間にコンストラクトの１つまたは全部の領域の翻訳が開始され、かつ／または停止される時点を、正確に決定することが可能である。誘導性調節エレメントは、例えばテトラサイクリン／ドキシサイクリン「Ｔｅｔ−Ｏｎ」システムを含み、阻害性調節エレメントは、例えば「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」システムまたは調節性光遺伝学的遺伝子発現システム、温度制御プロモーター、及びＴｒｓＲベースのシステム（クオラムセンシグベース）を含む。

ある好ましい実施形態においては、核酸コンストラクトは、発現ベクター、エピソームベクター、またはウィルスベクターである。細胞内でｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤を発現させるためには、核酸コンストラクトは細胞内に導入される必要がある。これはさまざまな方法で可能であり、例えばトンランスフェクション、つまり真確細胞中に核酸分子を移入する非ウィルス性の方法である。そのような適用に対しては、核酸コンストラクトは好ましくは、発現ベクターまたはエピソームベクターとして提供される。あるいは、核酸コンストラクトはトランスダクションにより、つまり細胞内への核酸のウィルス媒介性移入により、細胞内に導入されうる。そのような適用に対しては、核酸コンストラクトは、好ましくはウィルスベクターとして提供される。

さらなる態様においては、本発明は、本発明のコンストラクトを有する細胞に関する。そのような細胞は、生体分子を生産するのに適していて、その生産効率及び全生産量は、異なる細胞プロセスに関与する少なくとも２つのｍｉＲＮＡを調節することにより最適化される。そのような細胞は、好ましくは生物学的製剤製造において使用される。

ある好ましい実施形態においては、コンストラクトは細胞のゲノム中に組み込まれる。本発明に従うコンストラクトを細胞の内因性ゲノム中に導入することにより、生物学的製剤製造のための安定細胞株が提供されうる。そのような細胞株は、一定かつ確実量で生体分子を生産でき、また従って大規模生産のためにはとくに好ましい。大量生産は通常、確立された高需要の生物学的製剤を提供するために作動される。さらに、核酸コンストラクトをゲノムに組み込むことにより、継続的な細胞増殖の間にコンストラクトを失う可能性は低下し、核酸コンストラクトは培養の全存続期間を通じて存在する。従って、細胞は好ましくは安定細胞株細胞である。

ある好ましい実施形態においては、コンストラクトはトランスフェクションにより細胞に組み込まれる。一過性トランスフェクションは、新しい特性を有する所与の細胞を提供するための、容易かつ迅速な方法である。それは労働集約的でもコスト集約的でもなく、膨大な選択プロセスを必要としない。労働集約的な安定細胞株の確立が非効率的であろうような、生体分子が告知から短期間で生産される必要がある、または少量の生体分子のみ必要である場合、核酸コンストラクトのトランスフェクションによる導入がとくに好ましい。

ある好ましい実施形態においては、細胞のゲノムの群１、２、４、及び／または５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする領域が増幅され、かつ／あるいは、細胞のゲノムの群３、４、及び／または５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする領域が欠損させられまたはサイレンシングされる。細胞内に本発明の核酸コンストラクトを導入するほか、細胞のｍｉＲＮＡの内因性発現を阻害または変化させることにより、ｍｉＲＮＡが提供されうる。特定のｍｉＲＮＡのレベルを上昇させるためには、このｍｉＲＮＡをコードする細胞ゲノムの領域が増幅されうる。同様に、内因性ｍｉＲＮＡをコードする領域は、そのｍｉＲＮＡが細胞中に存在しなくなるように、欠損させられうる。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子を欠損させる代わりに、細胞内のｍｉＲＮＡレベルは、サイレンシングにより、例えば競合阻害剤を使用して、低下させられうる。

ある好ましい実施形態においては、細胞は哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、例えば、複雑な翻訳後修飾を有するタンパク質など、複雑な構造の生体分子を生産するのにとくに好ましい。哺乳類細胞は、複雑なタンパク質を生成し、折り畳み、また修飾するために必要な合成経路を内因的に有する。例えばハムスター、マウス、アヒル、またはヒトなどの異なる起源に由来する、さまざまな細胞システムが利用可能である。ｍｉＲＮＡは、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞を使用して同定されたが、異なる哺乳類種間での多くの遺伝子の顕著な配列相同性ゆえ、他種の細胞、とくに他の哺乳類細胞において、タンパク質発現、折り畳み、分泌、及び産物の質を決定する細胞パラメーターに影響を及ぼすのに適している。例えば、ＣＨＯ細胞においてアポトーシス促進効果を有することが分かっているｍｉＲＮＡは、ヒト腫瘍及び前脂肪細胞細胞株においてアポトーシスを誘発するのに適していた（図１０）。

ある好ましい実施形態においては、哺乳類細胞はＣｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞であり、好ましくは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＵＫＸ Ｂ１１細胞、ＣＨＯ ｄｈｆｒ細胞、またはＣＨＯ−Ｓ細胞である。

ある好ましい実施形態においては、細胞は、ヒト細胞、好ましくは腎細胞、肝細胞、胚網膜細胞、羊膜細胞、または間葉系幹細胞である。ヒト起源の生体分子の生産については、とくにそれがヒト医療において使用されることが意図される場合、ヒト細胞由来の細胞生産システムが好ましい。修飾の不正確な折り畳みによる生体分子のわずかな変化は、タンパク質の活性をより低くしうるし、あるいはタンパク質に有害作用を示させさえしうる。さらに、ＣＨＯ細胞を使用して同定されたｍｉＲＮＡは、ヒト細胞においても類似の効果を有することが見いだされた。

ある好ましい実施形態においては、細胞は昆虫細胞、好ましくはＳｆ９、Ｓｆ２１、ＴｒｉＥＸ^ＴＭ、またはＨｉ５細胞である。そのような細胞システムは、例えばタンパク質などの分子であって、その分子が不可欠な機能を果たす他のシステムから由来する分子の生産のためには、とくに好ましい。そのようなタンパク質をその天然の細胞環境中で発現することは、生産細胞の細胞プロセスを妨害するであろうし、あるいは細胞死さえもたらしうる。これは、生体分子の生産効率を著しく害するであろうし、実現されうる生産量を強く制限する。例えば、細胞経路に対し顕著に影響を有する一定のヒト受容体分子は、昆虫細胞から高生産量で生産されうる。それらの分子がこれらの細胞中では生物学的作用を果たさないからである。

さらなる態様においては、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞により生産される生体分子の生産量を増加させるための方法に関する。その方法は、群１から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを細胞中で上昇させることによりその生体分子の細胞生産を刺激するステップと、群２から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを細胞中で上昇させ、かつ／または群３から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを低下させることにより細胞死を低下させるステップと、群４もしくは５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを細胞中で上昇させ、かつ／または群４もしくは５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを低下させることにより細胞の増殖を調節するステップとから選択される、少なくとも２つのステップを有する。本明細書で使用される用語「生体分子の生産量」は、全培養物の容積生産量、つまり培養物から回収されうる目的の生体分子の合計量を指す。生体分子の生産のためには、好ましくは目的の生体分子を生産するのに適合させられた安定細胞株から、細胞培養が確立される。これは、生体分子がタンパク質の場合には、望まれるタンパク質をコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを導入することにより達成されうる。望ましい方法を使用することにより、細胞生産、増殖、及び細胞生存のうち少なくとも２つの細胞プロセスが、特定のｍｉＲＮＡのレベルを調節することにより影響を受ける。細胞生産能力、細胞増殖、及び細胞生存のバランスを取ることにより、細胞培養物のエネルギー及び栄養の消費を上昇させるであろう追加の翻訳負担を細胞に課すことなく、生体分子の出力を上昇させることが可能である。

ある好ましい実施形態においては、細胞中でｍｉＲＮＡを過剰発現させることにより、ｍｉＲＮＡ存在下で細胞に電気穿孔を施すことにより、またはｍｉＲＮＡ及びトランスフェクタントを細胞が培養されている培地に添加することにより、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが上昇させられる。あるいは、トランスフェクションのために細胞が移入される緩衝液に、ｍｉＲＮＡ及びトランスフェクタントが添加されてもよい。細胞内でのｍｉＲＮＡのレベルを上昇させるためには、２つの別個の取り組みが利用可能である。ｍｉＲＮＡをコードする核酸分子は、細胞転写機構がコンストラクトからのｍｉＲＮＡを発現するように、細胞へと導入されうる。これは、個々のエピソーム分子として細胞中で維持され、もしくは細胞のゲノムへと組み込まれる、発現ベクターもしくはウィルスベクターの使用により、または安定細胞株の使用により、達成されうる。あるいは、細胞内のｍｉＲＮＡのレベルは、ｍｉＲＮＡをＲＮＡ分子として、例えばｐｒｉ−もしくはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡミミックとして提供することにより、上昇させられうる。例えば、ＲＮＡ分子は、トランスフェクタント、つまりリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に培養物へと添加される。そのトランスフェクタントは、核酸またはｍｉＲＮＡを被包するリポソームを形成する脂質サブユニットを含有する。そのリポソームはそれから、核酸が細胞質へと導入されるように、細胞の膜と融合する。

ある好ましい実施形態においては、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが、そのｍｉＲＮＡをコードする細胞のゲノムの領域を欠損させる、または、細胞中でそのｍｉＲＮＡに対して向けられたｍｉＲＮＡ阻害剤を発現させることにより、そのｍｉＲＮＡ阻害剤の存在下で細胞に電気穿孔を施すことにより、もしくは細胞が培養される培地にｍｉＲＮＡ阻害剤及びトランスフェクタントを添加することによりそのｍｉＲＮＡの転写を調節することで、低下させられる。あるいは、トランスフェクションのために細胞が移入される緩衝液に、ｍｉＲＮＡ阻害剤及びトランスフェクタントが添加されうる。ｍｉＲＮＡのレベルの低下は、さまざまなアプローチにより達成されうる。例えば、ｍｉＲＮＡをコードしている内因性遺伝子が、細胞のゲノムから欠損させられうる。これは、生体分子が安定細胞株により生産されるべき場合に好ましい。ところが、このアプローチは、いくつかの場合においては非可逆的である。あるいは、ｍｉＲＮＡをコードする内因性の遺伝子が、ｍｉＲＮＡの転写が確定的に活性化または不活性化されるように、誘発性調節エレメント下に置かれてもよい。そのほか、内因性ｍｉＲＮＡは、例えばアンタゴｍｉｒまたはＲＮＡスポンジなどの競合的阻害剤を提供することにより阻害されてもまたよい。これらは、トラクスフェクションに際し、細胞内で発現させられてもよく、あるいは、トランスフェクタントと共に培養物にＲＮＡ分子として添加されてもよい。単一のアプローチの代わりに、異なるアプローチの組合せが適用されてもよい。

ある好ましい実施形態においては、細胞死は、群２から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを細胞中で上昇させ、かつ／または群６から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを低下させることにより、アポトーシスを減少させることで低下させられる。細胞死の２つの主なタイプが知られ、それは互いに明白に異なる。アポトーシスは、プログラム細胞死とも呼ばれ、通常は細胞プロセスの欠陥の結果惹起される細胞変換の、明確な帰結である。ネクローシスは、これに対しむしろ、通常例えば細胞傷害などの外部衝撃により惹起される、細胞の外傷性の溶解である。細胞種及び培養条件により、細胞死の１タイプが他方よりもより顕著でありうる。興味深いことに、発明者は、アポトーシスとネクローシスとの両者の調節に関与する、いくつものｍｉＲＮＡを発見した。さらに、アポトーシスに関しては、阻害性並びに促進性のｍｉＲＮＡ（それぞれ群２及び６）が同定された。これに対し、ネクローシスに関しては、専ら促進性のｍｉＲＮＡ（群７）が発見された。特定の細胞培養に及び培養条件によっては、アポトーシスまたはネクローシスが、生体分子生産の間により顕著となりうる。従って、好ましい実施形態においては、細胞死は、群７から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを低下させることによりネクローシスを減じることで、減少する。

さらなる態様においては、本発明は、細胞中で生体分子を生産するための方法に関する。その方法は、細胞培養物中で細胞を繁殖させるステップと、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを上昇させるステップと、細胞培養物から生体分子を単離するステップとを有する。細胞生産、増殖、及び細胞生存などの別個の細胞プロセスを特異的に調節するｍｉＲＮＡを解明するにあたり、発明者は、これらのプロセスのうち１つより多くに影響を与える、一定のｍｉＲＮＡをさらに発見した。ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ（配列ＩＤ番号：１）は、生体分子の細胞生産を増加させるだけでなく、抗アポトーシス効果をも示す。ｍｉＲ−７６７（配列ＩＤ番号：２）、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ（配列ＩＤ番号：３）、ｍｉＲ−３０６２−５ｐ（配列ＩＤ番号：４）、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ（配列ＩＤ番号：６）、ｍｉＲ−１３５ａ−１−３ｐ（配列ＩＤ番号：８）、ｍｉＲ−７４３ａ−５ｐ（配列ＩＤ番号：９）、及びｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ（配列ＩＤ番号：２０）についても、同様の組合せ効果が観察された。ｍｉＲ−２９１ｂ−３ｐ（配列ＩＤ番号：５）、及びｍｉＲ−１ａ−３ｐ（配列ＩＤ番号：７）は、細胞生存及び細胞増殖の両方を促進し、その結果、生産される生体分子の生産量を総体的に増加させることが発見された。さらに、ｍｉＲ−６９４（配列ＩＤ番号：１０）、ｍｉＲ−６７４−３ｐ（配列ＩＤ番号：１１）、ｍｉＲ−６６９ｄ−３ｐ（配列ＩＤ番号：１２）、ｍｉＲ−３０１ｂ−５ｐ（配列ＩＤ番号：１３）、ｍｉＲ−２１２−５ｐ（配列ＩＤ番号：１４）、ｍｉＲ−２０３−５ｐ（配列ＩＤ番号：１５）、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ（配列ＩＤ番号：１６）、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ（配列ＩＤ番号：１７）、ｍｉＲ−１９６８−５ｐ（配列ＩＤ番号：１８）、及びｍｉＲ−１５０−３ｐ（配列ＩＤ番号：１９）は、増殖及び細胞生産性の両方に影響を与えることが見いだされた。これらのｍｉＲＮＡの１つまたはそれより多くを増加させることは、生体分子の生産を最適化させるための容易かつ効率的なアプローチを提供する。ｍｉＲＮＡを細胞中に導入するためには、本明細書において言及されるあらゆる方法、またはその組合せが使用されうる。

さらなる態様においては、本発明は、細胞中での生体分子の生産における、群１から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、群２から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／または群３から選択されるｍｉＲＮＡを阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ阻害剤、並びに、群４もしくは５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／または群４もしくは５から選択されるｍｉＲＮＡを阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ阻害剤の組合せの使用に関する。細胞生産を促進するｍｉＲＮＡ、細胞死を抑制するｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤、及び／または細胞増殖を調節するｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ阻害剤は、さまざまな形態で提供されうる。例えば、ｍｉＲＮＡ／阻害剤は、単一の核酸コンストラクトとして提供されうる。あるいは、それぞれがｍｉＲＮＡのサブセットをコードする多数の核酸分子が提供されうる。例えば、少なくとも１つの群１のｍｉＲＮＡをコードする１つの発現ベクター、群２のｍｉＲＮＡをコードする第二の発現ベクター、及び群５のｍｉＲＮＡに対して向けられるｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする第三の発現ベクターである。同様に、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ阻害剤は、いくつものｐｒｉ−もしくはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡミミックの収集物として提供されうる。従って、ｍｉＲＮＡは、多様なｍｉＲＮＡ及び／または阻害剤を有するキットとして、単一の組成物中に、または別々に提供されうる。

さらなる態様においては、本発明は、配列ＩＤ番号１−２９５からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする領域、及び／または配列ＩＤ番号２９６−６０９からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して向けられる少なくとも１つの阻害剤をコードする領域を有する、核酸コンストラクトに関する。配列ＩＤ番号１−２９５のｍｉＲＮＡの全てが、これらのｍｉＲＮＡのいずれかを過剰発現する培養物から回収されうる生体分子の量が増加するように、総体的生体分子生産を促進することが見いだされた。殆どのｍｉＲＮＡについて、個別の経路（つまり細胞増殖、細胞死、及び細胞生産性）に対する効果が見いだされ、このことは、観察された総体的な生体分子生産の増加を少なくとも部分的には説明するはずである。従って、それぞれのｍｉＲＮＡが単独でまたは組合せで、生産細胞からの生体分子生産を増強させるのに適している。さらに、いくらかのｍｉＲＮＡは、より一般的に細胞のパフォーマンスに影響を与え、細胞生存、増殖、または細胞生産を顕著に変化させることなく、容積生産の総体的な増加をもたらすようである。これらのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−７２１（配列ＩＤ番号：１５７）、ｍｉＲ−１０７−３ｐ（配列ＩＤ番号：２８６）、ｍｉＲ−１８１ａ−１−３ｐ（配列ＩＤ番号：２９０）、及びｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ（配列ＩＤ番号：２９２）である。これらのｍｉＲＮＡは、前述のプロセスの１つまたは２つのを顕著に変化させる代わりに、むしろそれら全てに、また可能性としてはさらに細胞シグナル経路に影響することが示唆される。配列ＩＤ番号１−２９５の殆どのｍｉＲＮＡと同様に、配列ＩＤ番号２９６から６０９のそれぞれが、細胞増殖、及び／または細胞死に効果を引き起こすことが見いだされた。単一または複数のこれらのｍｉＲＮＡの阻害が、細胞生存、及び／または増殖を促進し、総体的な生体分子生産の増加をもたらすのに適している。

従って、さらなる態様においては、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞により生産される生体分子の生産量を増加するための方法に関する。その方法は、配列ＩＤ番号１−２９５からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを細胞中で上昇させるステップ、及び／または配列ＩＤ番号２９６−６０９からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを細胞中で低下させるステップを有する。

さらに、本発明は、細胞中で生体分子を生産する方法に関する。その方法は、細胞培養物中で細胞を繁殖させるステップと、配列ＩＤ番号１−２９５からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを細胞中で上昇させ、かつ／または配列ＩＤ番号２９６−６０９からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを細胞中で低下させるステップと、細胞培養物から生体分子を単離するステップとを有する。

ある好ましい実施形態においては、ｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤は、電気穿孔により、もしくはトランスフェクタントと共に細胞培養物中に添加され、またはウィルスベクターにより細胞へと導入される。

さらなる態様においては、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞により生産される生体分子の細胞生産を刺激するために、群１から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの使用に関する。群１のｍｉＲＮＡは、全て細胞生産の顕著な増加を示し、全培養物により生産される生体分子の量の増加をもたらした。

さらなる態様においては、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞の細胞死を抑制するための、群２から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、及び／または群３から選択されるｍｉＲＮＡに対して向けられるｍｉＲＮＡ阻害剤の使用に関する。群２のｍｉＲＮＡのいずれかを過剰発現し、かつ／または群３のｍｉＲＮＡのいずれかを阻害することにより、細胞生存が促進され、生産細胞の総数を増加させる。次いでこのことは、生産される生体分子の総量を増加させる。

さらなる態様においては、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞の増殖を調節するために、群４もしくは５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、及び／または群４もしくは５のｍｉＲＮＡに対して向けられるｍｉＲＮＡ阻害剤の使用に関する。細胞増殖は、培養の状態に依存して特異的に調節されうる。培養の初めでは、可能な限り迅速に最適細胞濃度に到達するように増殖が増強されうる。これは、群４のｍｉＲＮＡのいずれかを過剰発現し、かつ／または群５のｍｉＲＮＡのいずれかを阻害することにより実現しうる。これに対し、いったん培養が十分に確立したら、生体分子の生産のより高い能力を提供するためには、増殖の低下が有利でありうる。これは、群５のｍｉＲＮＡのいずれかを過剰発現し、かつ／または群４のｍｉＲＮＡのいずれかを阻害することにより実現しうる。

材料及び方法
細胞培養
ＣＨＯ細胞の培養
ＣＨＯ ＤＧ４４細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から確立した浮遊適合性ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞は、ＴｕｂｅＳｐｉｎ（登録商標）バイオリアクター５０ユーブ（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において、４ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）及び０．１％抗クランピング剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補足されたＰｒｏＣＨＯ５培養培地（Ｌｏｎｚａ）中で育成された。安定ｍｉＲＮＡ過剰発現ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞のための培養培地は、１０μｇ／ｍＬ ピューロマイシンジヒドロクロリド（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）が追加で補足された。一般に、培養前の細胞濃度は、指数関数的増殖を確実にするため、トランスフェクションの１日前においてｍＬあたり０．５×１０^６生細胞に調節され、細胞は、３７℃、５％ＣＯ２、及び湿度８５％にて、オービタルシェーカーインキュベーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、またはＫｕｅｈｎｅｒ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で、１４０ｒｐｍ（２５ｍｍオービット）での攪拌を伴って維持された。

ヒト細胞株の培養
Ｔ９８Ｇ、ＨＣＴ１１６、ＳＫＯＶ３、ＳＧＢＳは、Ｔ２５、Ｔ７５、Ｔ１７５組織培養フラスコ、または９６ウェル組織培養プレートにおいて、４ｍＭグルタミン、１００μＭピルビン酸、及び１０％ｖ／ｖウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ） Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ中で育成された。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２、及び湿度９５％にて維持された。

ＨｅＬａ細胞の細胞培養
接着増殖するＨｅＬａ ＤＪ細胞（ＭｅｄｉＧｅｎｅ ＡＧ、Ｐｌａｎｅｇｇ／Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、１０％熱非動化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）及び２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）が補足された、高グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ） （Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で育成された。細胞は、Ｔ７５またはＴ１７５組織培養フラスコ中で培養され、３７℃、５％ＣＯ_２、及び湿度９５％にて維持された。

ＣＨＯ浮遊細胞株のトランスフェクション
ｍｉＲＮＡミミックまたは小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の非ウィルス性送達は、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ（登録商標）Ａ（ＩｎＣｅｌｌａ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ−Ｌｅｏｐｏｌｄｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施された。第一及び第二スクリーニングのための小規模なトランスフェクションは、Ｕ形底の９６ウェル浮遊培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で行われた。第二スクリーニングについては、選択されたｍｉＲＮミミックが再度トランスフェクションされ、プレートは、３７℃、５％ＣＯ_２、及び湿度９０％にてＨｅｒａｅｕｓ（登録商標）ＢＢＤ ６２２０細胞培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に配置された、Ｍｉｎｉ−Ｏｒｂｉｔａｌデジタルシェーカー（Ｂｅｌｌｃｏ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＵＳＡ）上に、８００ｒｐｍでの攪拌で配置された。標的検証のためのスケールアップトランスフェクションは１２ウェル浮遊培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中で行われ、プレートは１４０ｒｐｍでの攪拌を伴うオービタルシェーカーインキュベーター中でインキュベートされた。トランスフェクションには、１１３９の異なるｍｉＲＮＡミミックを有する全ネズミ科ｍｉＲＮＡミミックライブラリー（Ｓａｎｇｅｒ ｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ １８．０に基づく）（ＱＩａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が使用され、全トランスフェクションは生物学的トリプリケートで行われた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７でラベルされた非標的化ｓｉＲＮＡ（ＡＦ６４７−ｓｉＲＮＡ）（Ｑｉａｇｅｎ）が、トランスフェクション効率の指標として、各エフェクター及びコントロールｍｉＲＮＡと共に同時トランスフェクションされた。機能的トランスフェクションコントロールとして、抗ＳＥＡＰ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＣＨＯ特異的抗増殖剤（第一スクリーニングのために使用）、並びに細胞死コントロールｓｉＲＮＡ（第二スクリーニング）が使用された。非標的化のスクランブルｍｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）は、ネガティブコントロール（ｍｉＲ−ＮＴ）として使用された。プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）トランスフェクションについては、ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞がＮＥＯＮ（登録商標）トランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用してヌクレオフェクションされた。１．０×１０^７生細胞がペレット化されて１１０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁され、次いでエンドトキシンフリーの２５μｇのｐＤＮＡが添加された。細胞は、１６５０ボルトにて一パルスで２０ミリ秒かけてヌクレオフェクションされ、新たな培養培地１０ｍＬ中に播種された。トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクション後４８時間に、１０ｇ／ｍＬピューロマイシンジヒドロクロリドを培養物に添加することにより、抗生物質選択にかけられた。

接着細胞株のトランスフェクション
細胞は、７．５００／ｃｍ^２（Ｔ９８Ｇ）、１０．０００／ｃｍ^２（ＨＣＴ１１６）、１３．０００／ｃｍ^２（ＳＫＯＶ３）、または６．０００／ｃｍ^２（ＳＧＢＳ）にて、９６ウェル組織培養プレート中に播種され、２４時間育成された。トランスフェクションの当日、０．４μｌ ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＡ、４．６μｌ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、５．０μｌ ｍｉＲＮＡ（１μＭ）、及び９０μｌ ＤＭＥＭを併せることによりトランスフェクション複合体が形成され、室温にて２０分間リポプレックス形成をさせた。培養培地が除去され、各ウェルに１００μｌのトランスフェクション複合体が添加された。６時間後、もう７５μｌのＤＭＥＭが添加された。

ｍｉＲＮＡのトランスフェクション、及び組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）の生産
トランスフェクションの１日前、ＨｅＬａ ＤＪ細胞（ＭｅｄｉＧｅｎｅ ＡＧ）が１２ウェルマイクロプレートにおいて、ｃｍ^２あたり３．０×１０^４細胞の細胞密度にて、１０％熱非動化ＦＢＳ、及び２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）が補足された高グルコースＤＭＥＭ中に播種された。トランスフェクションの当日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞にｒＡＡＶ生産プラスミドとｍｉＲミミックとが同時トランスフェクションされた。各ウェルにつき、１．８μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００が、１００μｌ ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で予め希釈された。ｒＡＡＶベクターを有する１．５μｇのプラスミドＤＮＡ、ＨＡｄＶヘルパープラスミド（Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡＲＮＡ １及び２）、並びにＨＡｄＶ５ Ｅ１ヘルパープラスミドが、モル比１：１：１にて１００μＬのＤＭＥＭ培地中で混合され、次いで５０ｎＭ ｍｉＲＮＡミミック（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が添加された。希釈されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００をＤＮＡ／ｍｉＲＮＡ溶液と併せることにより、リポプレックス形成がなされ、次いで室温にて１５分間インキュベーションされた。培養培地が除去され、１０％熱非動化ＦＢＳ、及び２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）が補足された８００μＬの高グルコースＤＭＥＭが、各ウェルに添加された。最後に、２００μＬのリポプレックス溶液が各ウェルに順次添加された。

ｍｉＲＮＡ発現ベクターのクローニング
Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ｃｇｒ）の天然型ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲ）配列である、ｃｇｒ−ＭＩＲ３０ａ、ｃｇｒ−ＭＩＲ３０ｃ−１、及びｃｇｒ−ＭＩＲ３０ｅが、ハムスターのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られた。従って、ｇＤＮＡはＣＨＯ−ＳＥＡＰ培養物から単離された。ｇＤＮＡからのＰＣＲは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）からの２つの異なるＤＮＡポリメラーゼの１：１混合物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｈｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｔ．Ｌｅｏｎ Ｒｏｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施された。およそ１００ｂｐの上流及び下流のゲノム隣接領域を含むｐｒｅ−ｍｉＲ配列を増幅するためには、以下のＰＣＲプライマーが使用された：ｃｇｒ−ＭＩＲ３０ａ（ＰＣＲ断片長３３２ｂｐ）、フォワード５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡ−３’（配列ＩＤ番号：６１０）、リバース５’−ＴＴＴＴＧＣＴＡＧＣＡＣＡＣＴＴＧＴＧＣＴＴＴＡＧＡＡＧＴＴＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：６１１）；ｃｇｒ−ＭＩＲ３０ｃ−１（ＰＣＲ断片長３４４ｂｐ）、フォワード５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＴＣＡＧＣＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：６１２）、リバース５’−ＴＴＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：６１３）；ｃｇｒ−ＭＩＲ３０ｅ（ＰＣＲ断片長３７７ｂｐ）、フォワード５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＴＣＧＧＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：６１４）、リバース５’−ＴＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴ−３’（配列ＩＤ番号：６１５）。増幅されたＰＣＲ産物は、それぞれの端において、ＰＣＲプライマーにより導入されたＢａｍＨＩ／Ｎｈｅｌ制限部位を含有した。消化されたＰＣＲ断片は、Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｄｅｐｈｏｓ & Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｎｏｓｔｉｃｓ）を利用して、ｍｉＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）ｐＥＧＰ−ｍｉＲ発現ベクター（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中に、ＢａｍＨＩ及びＮｈｅｌ制限部位間に、ライゲーションされた。ｐｒｅ−ｍｉＲ配列の正しい組み込みは、ＤＮＡシークエンシング（ＳＲＤ、Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、全てのｍｉＲＮＡについて確認された。いずれのｐｒｅ−ｍｉＲ配列も欠如するｍｉＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）ｐＥＧＰ−ｍｉＲ−Ｎｕｌｌベクター（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）が、ネガティブコントロールとして機能した。

定量的フローサイトメトリー
細胞解析のため、トランスフェクションされたＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞が、トランスフェクション後７２時間に、細胞濃度、生存度、ネクローシス、及びトランスフェクション効率について解析された。紫（４０５ｎｍ）、青（４８８ｎｍ）、及び赤（６３５ｎｍ）の励起レーザーが備えられているＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して、細胞はハイスループット定量的フローサイトメトリーにより解析された。４０μＬの３×染色溶液［１５μｇ／ｍＬ ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、６μｇ／ｍＬ Ｃａｌｃｅｉｎ−Ｖｉｏｌｅｔ４５０−ＡＭ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡが補足されたＰｒｏＣＨＯ５培地（Ｌｏｎｚａ）］が、８０μＬの細胞懸濁物に添加され、３７℃、５％ＣＯ_２、及び湿度８５％にて、２０分間インキュベートされた。次いで細胞が数えられ、生存度がＣａｌｃｅｉｎ−Ｖｉｏｌｅｔ４５０−ＡＭ染色により測定された。ネクローシス／アポトーシス後期の細胞はＰＩ排除により検出され、トランスフェクション効率は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７蛍光について生細胞を解析することにより決定された。

アポトーシスの解析
トランスフェクションされた細胞は、Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ染色手順を使用してアポトーシスについて解析された。この目標を達成するため、接着増殖細胞は、ＰＢＳで洗浄され、３５μｌトリプシン／ＥＤＴＡ溶液の添加により剥離され、反応は１０％ｖ／ｖ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ８０μＬの添加により停止された。洗浄ステップを含む全材料が、解析の対象とされた。浮遊細胞は、染色手順に直接用いられた。２ｎより少ないＤＮＡ含量を有する細胞（＝Ｓｕｂ−Ｇ_０／Ｇ_１細胞）は、アポトーシス性であると分類された。従って、トランスフェクションされた細胞の懸濁物５０μＬが、ウェルあたり培養培地１００μを含有する新たな９６ウェルマイクロプレートに移入され、５分間１５０×ｇにて遠心分離された。１００μＬの上清が、ＳＥＡＰタンパク質定量化に使用される別の９６ウェルマイクロプレートに移入された。細胞ペレットは、１００μＬのＮｉｃｏｌｅｔｔｉ染色溶液（０．１％クエン酸ナトリウム、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０μｇ／ｍＬ ＰＩ、及び１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ Ａが補足された１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））中に再懸濁させられ、４℃にて３０分間、暗所でインキュベートされた。処理された細胞は、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で定量的フローサイトメトリーにより解析された。

ＳＥＡＰ定量化
トランスフェクションされた細胞の培養上清中におけるＳＥＡＰタンパク質レベルが、白い９６ウェル非結合性マイクロプレートにおいてＳＥＡＰレポーター遺伝子アッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して定量化された。原理的には、化学発光基質ＣＳＰＤ（３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’（５’ −クロロ）−トリシクロ（３．３．１．１^３，７）デカン］−４−イル）フェニルフォスフェート）がＳＥＡＰにより脱リン酸化され、分解して最大波長４７７ｎｍにて発光する不安定なジオキセタンアニオンを生じる。内因性のアルカリフォスファターゼは、提供されるＩｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用する化学的不活性化の後に、試料を３０分間６５℃にてインキュベートすることにより、阻害された。ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞株の高いＳＥＡＰ発現レベルゆえ、培養上清は新たな培養培地で１：６０に予め希釈された。ＣＳＰＤ基質の添加後に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、化学発光が検出された。

ｑＲＴ−ＰＣＲ解析
全ＲＮＡ（小ＲＮＡ<２００ｂｐを含む）が、ｍｉＲＮｅａｓｙミニＫｉｔ（ＱＩａｇｅｎ）を、製造者により提供されるプロトコールに従って使用して単離された。ＲＮＡ濃度及び純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）スペクトロフォトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｈｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＵＶスペクトロメトリーにより決定された。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１μｇの全ＲＮＡから合成された。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）での成熟ｍｉＲＮの検出のため、２０^−１に希釈されたｃＤＮＡでｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲグリーンＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲが実施された。以下のｍｉＲＮＡ特異的プライマーが使用された：成熟ｍｉＲ−３０ａ−５ｐフォワード、５’−ＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＣＧＡＣＴＧＧＡＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：６１６）；ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐフォワード、５’−ＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：６１７）；ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐフォワード、５’−ＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＡＣＡＣＴＣＴＣＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：６１８）；ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐフォワード、５’−ＣＴＴＴＣＡＧＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：６１９）；ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐフォワード、５’−ＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＣＴＧＧＡＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：６２０）；ｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）が、各成熟ｍｉＲＮＡに対するリバースプライマーとして機能した；Ｕ６フォワード、５’−ＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡ−３’（配列ＩＤ番号：６２１）；Ｕ６リバース、５’−ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：６２２）。相対的な成熟ｍｉＲＮＡ発現差は、比較Ｃ（Ｔ）法を適用することにより計算された。

ｒＡＡＶベクター定量化
トランスフェクション後７２時間、ＨｅＬａ ＤＪ細胞は３回の凍結／融解サイクル（液体窒素／３７℃）にかけられ、細胞片は３７００×ｇでの１５分間の遠心分離により除去された。ＡＡＶゲノム粒子は、ＡＡＶ−２逆位末端反復（ＩＴＲ）の定量化に基づきｑＲＴ−ＰＣＲにより決定された。ホスト細胞及びパックされていないＤＮＡの除去のための粗試料の前処理は、Ｍａｙｇｉｎｎｅｓ及び同僚（Ｍａｙｇｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６）により開示された手順から適合され、以下の変更を伴った：ＤＮａｓｅＩ処理（Ｑｉａｇｅｎ）前に、試料はＤＮａｓｅ反応緩衝液（２２．２ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ２）で２００倍に希釈された。最終試料は、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏでさらに３倍希釈された。１×１０^６ ＡＡＶベクタープラスミドコピー、及び／またはＤＮａｓｅ Ｉを含有する緩衝液コントロールは、同等に処理された。反応は、ＣＦＸ９６ＴＭ器械（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， Ｃａｎａｄａ）にて、１２．５μＬ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）、２．５μＬ ＡＡＶ２ ＩＴＲプライマーミックス（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）、５μＬ水、及び５μＬテンプレート（処理済みサンプル／コントロール、非テンプレートコントロールのための水、または１０^２から１０^８プラスミドコピーの標準物質の系列希釈）を含む合計容量２５μＬ中で実施された。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９５℃にて５分間の予インキュベーション、次いで９５℃にて１０秒間にわたる変性の３９サイクル、それから６０℃での３０秒間のアニーリング／伸長である。データ解析は、ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）を使用して行われた。

結果
組換えＣＨＯ−ＳＥＡＰ浮遊細胞における一過性ハイコンテントｍｉＲＮＡスクリーニング
発明者は、細胞機能を向上させるｍｉＲＮＡを同定するため、組換えＣＨＯ−ＳＥＡＰ浮遊細胞において、１１３９の異なるｍｉＲＮＡミミックを使用して、ハイコンテントｍｉＲＮＡスクリーニングを行った。この関連で、全てのトランスフェクションされた細胞が、複数パラメーターのフローサイトメトリーベースの細胞解析を利用して、さまざまな細胞パラメーターについて解析された。９６ウェルフォーマットでの小二重鎖ＲＮＡに対するトランスフェクション条件が慎重に最適化され、非標的化コントロールｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−ＮＴ）、ＳＥＡＰ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（抗ＳＥＡＰ ｓｉＲＮＡ）、並びにＣＨＯ特異的抗増殖ｓｉＲＮＡを含む、いくつかの機能的コントロールが使用された。複雑な生産培地中で育成される細胞中に効率的かつ機能的にｍｉＲＮＡミミックを送達することが以前に示された（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、新規の非ウィルス性トランスフェクション試薬（ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ（登録商標）Ａ）を使用して、低い細胞傷害率にて、>９５％の高いトランスフェクション率が再現性を伴って達成された。送達コントロールとして、蛍光ラベルされた非標的化ｓｉＲＮＡ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７−ｓｉＲＮＡ）が、全エフェクター及びコントロールｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡとそれぞれ同時トランスフェクションされた。トランスフェクション後７２時間において、細胞濃度、生存度、ネクローシス、及びトランスフェクション効率が、ハイスループット定量的フローサイトメトリーにより測定された。ＳＥＡＰタンパク質濃度は、市販のＳＥＡＰレポーターアッセイを使用して決定された。ｍｉＲＮＡミミックの期間が限定的な一過性の効果と、細胞表現型の変化の出現との両者を考慮して、３日の培養期間が選択された。抗ＳＥＡＰ ｓｉＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のＳＥＡＰ生産性の顕著な低下、並びに抗増殖ｓｉＲＮＡがトランスフェクションされた細胞の生細胞密度（ＶＣＤ）の顕著な低下は、全スクリーニングプレートにおける機能的トランスフェクションの指標となる（図１）。さらに、スパイクインのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）（ＡＦ）６４７−ｓｉＲＮＡが、各ウェルにおけるｍｉＲＮＡミミックの取込みを確認した。

プレート間の比較を可能にするため、各試料の値それぞれのプレート上のコントロール（ｍｉＲ−ＮＴ）の平均値に正規化することにより、データの正規化が行われた。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定と組み合わせられた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を適用することにより、各読み出しパラメーターに関する有意な変化が決定された（プレート上のｍｉＲ−ＮＴコントロールに対し、ｐ<０．０５）。ＶＣＤ、アポトーシス、ネクローシス／アポトーシス後期、比及び容積ＳＥＡＰ生産性などの重要な細胞の特徴を考慮し、全１１３９のエフェクターｍｉＲＮＡについて、正規化された平均値が決定された。統計的に有意なヒットの数を、試験された全ミミックに対する割合として表わす、ケーキチャートが図２に示される。ＳＥＡＰ生産性に関しては、トランスフェクションされたｍｉＲＮＡの大部分である１６％が、７２後に上清中のＳＥＡＰ生産量を有意に増大させ、最善の候補は最大で２倍の向上を示した（図２Ａ）。ｍｉＲＮＡの２１％については、有意に上昇した細胞比生産性さえも検出された（図２Ｂ）。しかしながら、これは部分的には、細胞死の誘発を伴わない細胞濃度の低下に関連した。とくに平均比生産性を少なくとも２０％上昇させた３１４のｍｉＲＮＡは、細胞の生存度を低下させることなく、トランスフェクション後３日に、平均ＶＣＤを最大６９％低下させることも発見された。全ｍｉＲＮＡの５％については有意により高い生細胞密度が測定され、一方で全ｍｉＲＮＡの１３％はアポトーシス率を低下させた（図２Ｃ及びＤ）。細胞増殖を増強するｍｉＲＮＡのパーセンテージは、ｍｉＲＮＡライブラリーの４％がネクローシス細胞の数を減少させたという、 ｍｉＲＮＡ導入後のより高い生存度を示唆する事実に合致する（図２Ｅ）。

スクリーニング解析が、ｍｉＲ−３０ダミリーの機能性を同定した
第一スクリーニングにより得られた結果を検証するため、発明者は、攪拌培養物において、選択されたｍｉＲＮＡヒットのサブセットを一過性にトランスフェクションすることにより、第二スクリーニングを行った。マルチウェルプレートでの攪拌培養様式は、静置培養の推定される酸素制限が実質的に克服されている、標準的な振盪フラスコ培養と、はるかにより比較可能である。９６ウェルプレートの振盪速度、並びにｍｉＲＮＡミミック濃度は、懸濁物における強力な培養及び一過性トランスフェクションを可能にするために注意深く最適化された。第一ステップにおいては、第一細胞スクリーニング由来の２９７のｍｉＲＮＡヒットが、上で言及されたバイオプロセス関連性細胞パラメーターのうち少なくても１つに対する正の影響の再評価のために、選択された。このアプローチは、第一スクリーニングと比較して、殆どのｍｉＲＮＡについて表現型の効果を確認した（図７、８、及び９）。このことは、ハイコンテントスクリーニング法の高い再現性を支持する。

両スクリーニングの結果を解析することにより、全ｍｉＲ−３０ファミリー（ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅを有する）は、ＣＨＯ細胞におけるＳＥＡＰ生産の増強に明らかに貢献した。全ｍｉＲ−３０メンバーにおいて、ガイド鎖であると考えられる成熟５ｐ鎖は、観察された細胞表現型を誘発した。しかしながら、ｍｉＲ−３０ｃ−３ｐも、ｍｉＲ−３０ファミリーの中では唯一の３ｐ鎖として、ＳＥＡＰ生産性を大いに上昇させることが分かった。図３Ａは、第一スクリーニングにおける全６つの生産性向上性ｍｉＲ−３０ファミリーメンバーについて、容積ＳＥＡＰ生産量におけるそれぞれの倍率変化を示す。ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐにより媒介される上昇は生物学的トリプリケートの高い標準偏差ゆえに統計学的には有意ではなかったが、発明者は、そのより高い容積生産性に貢献する明らかな傾向につき、グラフにｍｉＲ−３０ｂ−５ｐを含めた。

さらに、ｍｉＲ−３０ファミリーは、検証スクリーニングにおいては、ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質発現の強力な駆動者として、確実に確認されることができた（図３Ｂ）。より大きい割合のｍｉＲＮＡミミックのトランスフェクションにより（５０ｎＭ）、静置培養中でのトランスフェクション（１５ｎＭ）と比較して、ＳＥＡＰ生産性の上昇は、濃度依存的なオフターゲット効果の誘発なく、さらにより顕著に表れた。ＳＥＡＰ生産の著しい上昇は、ｍｉＲ−３０がトランスフェクションされた培養物中においては、細胞密度の低下が伴った（図３Ｃ）。しかしながら、生存度は負の影響を受けず（図３Ｄ）、これは、細胞が、細胞成長及び増殖よりも、大きく増強されたタンパク質生産にそのエネルギー源の殆どを使用したという推測を促進する。

ｍｉＲＮＡファミリーの特徴的な特性は、成熟ｍｉＲＮＡ鎖が、そのｍｉＲＮＡ標的と完全に塩基が対になっている共通の「シード」配列を共有することである。全てのｍｉＲ−３０−５ｐの５’末端における７つのヌクレオチドを有する共通の「シード」のほか、全てのｍｉＲ−３０−５ｐは、位置９から１１（ＵＣＣ）及び１５から１７（ＡＣＵ）それぞれにおけるヌクレオチドをも共有する。ｍｉＲ−３０については２２−２３ヌクレオチドの全長を考慮すると、この発見は、このｍｉＲＮＡファミリーが、低くとも６０％の配列類似性を共有し、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、及びｍｉＲ−３０ｅ−５ｐは、>９０％の配列相同性すら共有する。

それぞれのｍｉＲＮＡによる複数の効果に対する識見を得るには、１つの細胞パラメーターが別の１つの細胞パラメーターに対してプロットされてもよく、これは細胞工学にとって非常に興味深い機能的ｍｉＲＮＡの候補の同定を可能にする。この目的を達成するため、タンパク質生産及び生細胞密度の上昇、またはアポトーシスの減少などの、バイオプロセスのパフォーマンスに有益な表現型の変化が調べられた。ｍｉＲ−３０ファミリーの詳細な解析は、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、及びｍｉＲ−３０ｄ−５ｐの３つのｍｉＲＮＡが容積及び比生産性の両者の上昇に対し組み合わせ効果を呈し（図３Ｅ）、またｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−３０ｄ−５ｐは両者ともアポトーシス細胞の数を追加で減少させ、細胞工学のための魅力的な標的としてその可能性を強調する（図３Ｆ）ことを明らかにした。

ｍｉＲ−３０ファミリーがＣＨＯ細胞におけるタンパク質生産を増強させる潜在性をさらに調べるため、発明者は、さまざまな度合いの組換えＳＥＡＰ生産増加を示すｍｉＲ−３０ファミリーのメンバー２つを選択し（ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ及びｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ）、増大した培養規模で、これらのｍｉＲＮＡを別々に、並びに両ｍｉＲＮＡの組合せをトランスフェクションすることにより、スケールアップ実験を行った。同様に、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ及びｍｉＲ−３０ｃ−５ｐは、２ｍＬバッチ培養において、一過性トランスフェクション後に容積及び比ＳＥＡＰ生産性を大いに上昇させた（図４Ｃ）。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ単独がトランスフェクションされたＣＨＯ−ＳＥＡＰ培養物は、７２時間後、より高い細胞密度を示し、一方でｍｉＲ−３０ｃ−５ｐの導入は、細胞密度の低下をもたらした（図４Ｂ）。しかしながら、生存度は負の影響を受けなかった。これは、細胞密度の低下は細胞比ＳＥＡＰ生産性の大いなる増大によるかもしれないことを示唆する。等しい濃度（それぞれ２５ｎＭ）での両ｍｉＲＮＡ種の同時トランスフェクションは、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐの成長阻害効果を逆戻りさせることができ、５０ｎＭのｍｉＲ−３０ｃ−５ｐミミックでトランスフェクションされた細胞と比較して、より高いＳＥＡＰ力価をもたらした。さらに、ｍｉＲ−３０ａ／ｍｉＲ−３０ｃ濃度を最大５０ｎＭ（合計ｍｉＲＮＡ濃度１００ｎＭ）まで増加させることにより、生細胞密度は、ｍｉＲ−ＮＴでトランスフェクションされたコントロール細胞と比較してさらに上昇し、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐミミック５０ｎＭでトランスフェクションされた細胞と類似の値を呈した。このことは、ｍｉＲ−３０ａとｍｉＲ−３０ｃとの相加、または相乗効果さえにも賛同するかもしれず、これはさまざまなｍｉＲＮＡの組合せでの安定発現に対する重要な暗示を有する。

ｍｉＲ−３０ファミリーメンバーの安定過剰発現
ｍｉＲＮＡミミックの一過性導入の結果が安定ｍｉＲＮＡ過剰発現に内挿されうることを確認するため、発明者はｍｉＲ−３０ファミリーメンバー３つを選択し、ＣＨＯ−ＳＥＡＰ親細胞株ベースの安定過剰発現細胞プールを確立させた。目的のｍｉＲＮＡの安定な長期発現には、各前駆配列がホスト細胞ゲノムへと組み込まれなければならない。正しい細胞内Ｄｒｏｓｈａ／ＤＧＣＲ８プロセシングは、適切な上流及び下流隣接領域を含む、内因性ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの天然型のゲノム配列環境を要する。従って発明者は、ゲノムＤＮＡからのおよそ１００ｂｐの上及び下流の両隣接領域を含む、ＭＩＲ３０ａ、ＭＩＲ３０ｃ、及びＭＩＲ３０ｅの内因性前駆ｍｉＲＮＡ配列をＰＣＲ増幅し、哺乳類発現ベクター中へとサブクローニングした。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、緑蛍光タンパク質−ピューロマイシン（ＧＦＰ−Ｐｕｒｏ）融合タンパク質の上流に、ヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターの制御下に挿入された（図５Ａ）。この特徴は２つの長所を与える。第一に、ＧＦＰ蛍光による正にトランスフェクションされた細胞の検出を可能にし（並びに蛍光活性化細胞選別を容易にし）、第二に、培養物に抗生物質圧力を加えることにより、安定的にトランスフェクションされた細胞の選択を可能にする。さらに、ＥＦ１αプロモーターは、強力な導入遺伝子並びにｍｉＲＮＡ発現を誘発し、また、ヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーターなどのウィルスプロモーターと比較して、ＣＨＯ細胞中でのエピジェニックな遺伝子サイレンシングに対する傾向は比較的低いことが報告されている。その結果、組換えＣＨＯ細胞における長期ｍｉＲＮＡ過剰発現は、人工的に作成されたキメラステムループに成熟ｍｉＲＮＡ−５ｐ及び−３ｐ鎖のみが組み込まれる、前に開示されたｍｉＲＮＡ発現アプローチと比較して、より安定的かつ効率的であることが予期される。

ｍｉＲ−３０ファミリーの各メンバーを過剰発現する安定細胞プールがピューロマイシン選択により順調に確立され、成熟ｍｉＲＮＡの過剰発現がｑＲＴ−ＰＣＲにより評価された（図５Ｂ）。とりわけ、ｍｉＲＮＡ過剰発現の倍率変化値は、各成熟ｍｉＲＮＡの内因性レベルに非常によく依存する。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析は、適度にしか発現していないｍｉＲ−３０ａ−５ｐまたはｍｉＲ−３０ｃ−５ｐと比較して、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐがＣＨＯ細胞中に非常に豊富にあることを明らかにした。このことは、可能性として、安定プール中でのｍｉＲ−３０過剰発現における観察された違いを説明しうる。

安定ＭＩＲ３０ａ、ＭＩＲ３０ｃ、及びＭＩＲ３０ｅ過剰発現プールは、７日間バッチ培養され、モックコントロール細胞（ｐＥＧＰ−ＭＩＲ−Ｎｕｌｌ）並びに親ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞株と比較された。上清中のＳＥＡＰタンパク質濃度の解析は、ＣＨＯ−ｐＥＧＰ−ＭＩＲ３０ａ、ＣＨＯ−ｐＥＧＰ−ＭＩＲ３０ｃ、及びＣＨＯ−ｐＥＧＰ−ＭＩＲ３０ｅが、コントロール細胞と比較して有意により多いＳＥＡＰ生産したことを確認した（図５Ｃ）。観察された容積生産性の上昇が細胞数または比生産性のいずれの上昇によるかを調べるため、発明者は細胞密度及び生存度を解析し、親ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞と比較として、ＭＩＲ３０ａ過剰発現細胞が、播種後３日からずっと高い細胞密度及び生存度に達したことを発見した（図５Ｄ）。代謝副産物の蓄積、並びに枯渇培養培地による栄養供給の低下は、ネガティブコントロール（ｐＥＧＰ−ＭＩＲ−Ｎｕｌｌ）及び親ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞の定常増殖フェーズの開始に見られるように、通常、増殖率の低下を伴う。ＭＩＲ３０ａ過剰発現細胞が播種後６日までより高い生存度で増殖し続けたことは、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐの一過性導入がアポトーシス率を低下させたという観察結果（図３Ｆ）と共に、ＭＩＲ３０ａの抗アポトーシス機能を示唆する。

これに対し、ＭＩＲ３０ｃ過剰発現プールはわずかな細胞濃度低下を示し、一方でＭＩＲ３０ｅ過剰発現は、バッチ培養の間に細胞濃度及び生存度に対して有意な効果を示さなかった。しかしながら、細胞比ＳＥＡＰ生産性は、ＭＩＲ３０ｃ及びＭＩＲ３０ｅ過剰発現細胞において、それぞれほぼ２倍近く大きく上昇した（図５Ｅ）。これに伴い、非常に増強された組換えタンパク質生産性は、ＣＨＯ−ｐＥＧＰ−ＭＩＲ３０ｃプールの細胞増殖の減少、並びにより早期における生存度の低下に対する１つの潜在的な理由であるかもしれず、これは、培地中の栄養物のより速い消費によるかもしれない。さらに、発明者は、同じｐｒｅ−ｍｉＲ−３０ｃ前駆体から派生する両ｍｉＲ−３０ｃ鎖（５ｐ及び３ｐ）が、一過性スクリーニングにおける組換えタンパク質発現を増強することを観察した（図３Ａ及びＢ）。従って、また別の潜在的な理由は、ＭＩＲ３０ｃ過剰発現の結果として両鎖がより豊富に存在するため、成熟ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ及びｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐが同時に作用し、より強い表現型効果をもたらすことでありうる。

驚くべきことに、これらの３つのｍｉＲＮＡが同じシード配列を共有し、また残りの配列は数個のヌクレオチドにおいてしか異ならないにもかかわらず、細胞表現型に対する効果は著しく多様である。このことは、所与のｍｉＲＮＡのその標的ｍＲＮＡに対する特異性、また従ってその生物学的機能が、シード配列単独によるのではなく、むしろｍｉＲＮＡ配列全体により決定されることを明らかにする。ｍｉＲ−３０ファミリーの多様な機能に対するもう１つの理由は、成熟配列はほぼ同一であるため、ｍｉＲＮＡ前駆配列が、ｍｉＲＮＡの運命に重要な役割を果たし、またｍｉＲＮＡの機能の決定に関与しているかもしれないと考えることができることだろう。まとめると、安定ｍｉＲ−３０過剰発現の結果は、一過性ｍｉＲＮＡミミックのトランスフェクション実験の効果が安定様式で再現されうることをついに証明した。より重要なことには、これは、ｍｉＲＮＡが、生物学的製剤生産細胞の培養パフォーマンスを向上させるための魅力的なツールであることを再度強調する。

定常増殖フェーズの間、成熟ｍｉＲ−３０発現レベルは上昇する
バッチ浮遊細胞培養生産プロセスは、異なるフェーズに大きく分けられ、定常増殖フェーズは主な生産期とみなされる。そのフェーズでは、細胞がその代謝を増殖からタンパク質発現上昇へと転換させ、これは流加培養において、並びに二フェーズ生産プロセスにおいて活用される特性である。ｍｉＲ−３０ファミリーは、異なるＣＨＯ株により、並びにさまざまな培養条件下で発現されることが以前に示された。発明者は、ｍｉＲ−３０ファミリーが実際にＣＨＯ細胞におけるタンパク質生産の増加に貢献するならば、成熟ｍｉＲ−３０分子の濃度は、指数関数的増殖の間よりも定常増殖フェーズにおいてより豊富に存在するかもしれないと仮説を立てた。この仮定を試験するため、発明者は、３つの独立のＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞のバッチ培養を行い、培養プロセスの間のｍｉＲ−３０ａ−５ｐ及びｍｉＲ−３０ｃ−５ｐの発現レベルをそれぞれ解析した。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析は、ＣＨＯバッチ培養の定常増殖期の間、成熟ｍｉＲ−３０ａ及びｍｉＲ−３０ｃが強く亢進したことを明らかにした（図６Ａ）。アポトーシス細胞死により主に駆動される最後のステージである衰退フェーズにおいて両ｍｉＲＮＡの発現レベルが亢進したままであったにもかかわらず、一過性（図６Ｂ）または安定ｍｉＲ−３０過剰発現（図５Ｄ）後のいかなる時もアポトーシスの増加が観察されなかったため、ｍｉＲ−３０ファミリーはアポトーシスに関与していないかもしれない。したがってむしろ、細胞は、より効果的なタンパク質発現へとその代謝転移を制御するための内因性の手段として、ｍｉＲ−３０を使用しうるようである。冗長に翻訳され、正しく折り畳まれ、並びに翻訳後修飾されなければならないタンパク質と比較して、小ＲＮＡとしてのマイクロＲＮＡは、遺伝子制御にすぐに利用可能になるためには、転写され処理されさえすればよい。このことは、ｍｉＲＮＡを、細胞表現型における迅速な変換を付与する小さな内因性ツールとして分類した、最近の研究を促進する。

異所的なｍｉＲ−３０過剰発現の後に観察された効果がｍｉＲ−３０ファミリーメンバーのノックダウンにより元に戻されうるかを決定するため、発明者は、内因性ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐを一過的に抑制し、次いでＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞のタンパク質生産性及び生細胞密度に与える結果を調べた。一般にアンタゴｍｉＲまたはｍｉＲＮＡ阻害剤と呼ばれる、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐに特異的なアンチセンス阻害剤を使用して、発明者は、内因性ｍｉＲ−３０ｃ発現が強く抑制されることを発見した（図６Ｃ）。しかしながら、比ＳＥＡＰ生産性も生細胞密度も、抗ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐアンタゴｍｉＲにより有意な影響を受けなかった。このことは、内因性ｍｉＲ−３０レベルを低下させることは、タンパク質生産に関して反対の効果をもたらさないかもしれないことを示唆する（図６Ｄ及びＥ）。

腫瘍細胞及び前脂肪細胞におけるアポトーシスの誘発
上で開示のスクリーニングにおいて同定されたｍｉＲＮＡが、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ以外の種由来の細胞においても、その特定の細胞機能を呈するかどうかを決定するため、ｍｉＲ−１３４−５ｐ、ｍｉＲ−３７８−５ｐ、及びｌｅｔ−７ｄ−３ｐがヒト細胞株中で一過的に過剰発現された。調べられた細胞株は、腫瘍細胞株、つまりＳＫＯＶ３（卵巣癌腫）、Ｔ９８Ｇ（膠芽腫）、ＨＣＴ １１６（大腸癌腫）、及びＳＧＢＳ前脂肪細胞細胞株を有した。ＣＨＯ−ＳＥＡＰ細胞に関しては、ｍｉＲ−１３４−５ｐ、ｍｉＲ−３７８−５ｐ、及びｌｅｔ−７ｄ−３ｐは、４つの細胞株全てにおいてアポトーシスを誘発し、前脂肪細胞において効果は最も顕著であった。これらの結果は、ＣＨＯ細胞において特定の細胞機能を有することが同定されたｍｉＲＮＡは、他の種由来の細胞においてもその特定の効果を誘発するのに十分に適していることを示す。

組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）の生産
ウィルス生産プラスミドがトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞は、さらなる感染のためのウィルス粒子を生産するために使用されうる。組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）の生産を増加させるため、ＨｅＬａ細胞はｒＡＡＶ生産プラスミド及びｍｉＲＮＡ４８３ミミックが同時トランスフェクションされる。これは、１．５から２倍のｒＡＡＶの細胞生産の増加をもたらした（図１１）。

参照文献
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Claims (15)

1. 少なくとも２つの異なる領域を有する核酸コンストラクトであって、前記領域が、
   細胞における生体分子の細胞生産を刺激する少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする第一領域であって、前記ｍｉＲＮＡは群１から選択される、第一領域と、
   細胞死を抑制する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする第二領域であって、前記ｍｉＲＮＡは群２から選択され、前記ｍｉＲＮＡ阻害剤は群３から選択されるｍｉＲＮＡを阻害する、第二領域と、
   細胞増殖を調節する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする第三領域であって、前記ｍｉＲＮＡは群４または５から選択され、前記ｍｉＲＮＡ阻害剤は群４または５から選択されるｍｉＲＮＡを阻害する、第三領域と
   から選択され、
   群１は、配列ＩＤ番号：６９、１、２、３、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３４、３７、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、６２、６３、６６、６７、７０、７５、７６、７７、８０、８１、８２、８３、８６、８８、９０、９１、９３、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４７、１５１、１５２、１５５、１５８、１６３、１６５、１７１、１７４、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、２０１、２０３、２０７、２１１、２１２、２１４、２１７、２２２、２２３、２２８、２３０、２３３、２３８、２３９、２４０、２５４、２５５、２６９、２７６、２７８、２７９、２８５、及び２９４からなり、
   群２は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、６、８、９、２０、５２、９８、５、７、２４、３１、３３、５０、５４、５９、６０、６１、６４、６８、７１、７３、７４、７９、８５、８７、８９、９２、９４、９５、９７、１４５、１５３、１５４、１５６、１５９、１６１、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７２、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８４、１９１、１９２、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２００、２０４、２０５、２０６、２０８、２０９、２１０、２１３、２１６、２１９、２２０、２２１、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３１、２３６、２３７、２４１、２４２、２４３、２４５、２４７、２４８、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６２、２６５、２６６、２６８、２７１、２７２、２７３、２７４、２７７、２８０、２８２、２８４、２８９、２９３、及び２９５からなり、
   群３は、配列ＩＤ番号：２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、６０５、６０７、６０８、及び６０９からなり、
   群４は、配列ＩＤ番号：５、７、６８、７９、９４、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２３、３０、３５、３６、３８、４３、６５、７２、７８、８４、９６、１０５、１０７、１０８、１１９、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３９、１４０、１４４、１４６、１４８、１４９、１５０、１６０、１６２、１６４、１７３、１７７、１８７、１８９、１９３、１９８、２０２、２１５、２１８、２３２、２３４、２３５、２４４、２４６、２４９、２５０、２６１、２６３、２６４、２６７、２７０、２７５、２８１、２８３、２８７、２８８、及び２９１からなり、かつ
   群５は、配列ＩＤ番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、及び６０６からなる、核酸コンストラクト。
2. 請求項１記載の核酸コンストラクトにおいて、
   前記第一領域は、群９から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードし、かつ／あるいは、
   前記第二領域は、群１０から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、及び／または群１１から選択されるｍｉＲＮＡを阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤をコードし、かつ／あるいは、
   前記第三領域は、群１２もしくは１３から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、及び／または群１２もしくは１３から選択されるｍｉＲＮＡを阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤をコードし、
   群９は、配列ＩＤ番号：１、３、６、８、１０、２９、３９、４０、４７、４９、５１、５５、９１、１０３、１１５、１３２、１３７、１７１、２１１、及び２９４からなり、
   群１０は、配列ＩＤ番号：３、７、２０、５４、５９、７３、９４、１４５、１５９、１７５、１７６、１７８、１７９、１９９、２０６、２４８、２５１、２５２、２６６、及び２７２からなり、
   群１１は、配列ＩＤ番号：２９７、３０５、３０７、３１１、３１２、３１３、３２１、３３０、３３１、３３５、３３６、３４０、３４５、３５１、３５９、４０５、４１２、４５８、５１０、及び６０８からなり、
   群１２は、配列ＩＤ番号：５、７、２２、３０、３５、４３、６８、７２、７８、８４、９６、１４６、１４８、１６０、１７３、１７７、１９８、２０２、２３２、２３４、２４４、２６７、及び２８３からなり、かつ
   群１３は、配列ＩＤ番号：５１７、５２３、５２６、５２９、５３１、５３３、５３７、５４８、５５０、５５８、５６０、５６１、５６３、５６６、５６７、５７１、５７５、５７７、５８３、５９１、６００、６０１、及び６０４からなる、核酸コンストラクト。
3. 請求項１または２記載の核酸コンストラクトにおいて、前記少なくとも２つの異なる領域は異なるプロモーターによって制御され、好ましくは少なくとも１つのプロモーターが誘発性または阻害性である、核酸コンストラクト。
4. 上記請求項のいずれか記載の核酸コンストラクトにおいて、前記ｍｉＲＮＡ阻害剤がアンタゴｍｉｒ、ｍｉＲＮＡスポンジ、またはｍｉＲＮＡデコイである、核酸コンストラクト。
5. 上記請求項のいずれか記載の核酸コンストラクトにおいて、前記生体分子が、生物学的製剤であり、好ましくは組換え分子であり、より好ましくは組換えタンパク質または組換えウィルスである、核酸コンストラクト。
6. 上記請求項のいずれか記載の核酸コンストラクトにおいて、前記核酸コンストラクトが、発現ベクター、エピソームベクター、またはウィルスベクターである、核酸コンストラクト。
7. 請求項１〜６のいずれか記載のコンストラクトを有する細胞。
8. 請求項７記載の細胞において、前記コンストラクトが前記細胞のゲノム中に組み込まれている、細胞。
9. 請求項７または８記載の細胞において、群１、２、または４から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする前記細胞のゲノムの領域が増幅され、かつ／または、群３または５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする前記細胞のゲノムの領域が欠損され、またはサイレンシングされている、細胞。
10. 請求項７〜９のいずれか記載の細胞において、前記細胞が安定細胞株細胞である、細胞。
11. ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞によって生産される生体分子の生産量を増加させる方法であって、
    群１から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを前記細胞中で上昇させることによって、前記生体分子の細胞生産を刺激する工程と、
    群２から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを前記細胞中で上昇させ、かつ／または群３から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを低下させることによって、細胞死を減少させる工程と、
    群４または５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを前記細胞中で上昇させ、かつ／または群４または５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを低下させることによって、前記細胞の増殖を調節する工程と
    から選択される少なくとも２つの工程を有し、
    群１は、配列ＩＤ番号：６９、１、２、３、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３４、３７、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、６２、６３、６６、６７、７０、７５、７６、７７、８０、８１、８２、８３、８６、８８、９０、９１、９３、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４７、１５１、１５２、１５５、１５８、１６３、１６５、１７１、１７４、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、２０１、２０３、２０７、２１１、２１２、２１４、２１７、２２２、２２３、２２８、２３０、２３３、２３８、２３９、２４０、２５４、２５５、２６９、２７６、２７８、２７９、２８５、及び２９４からなり、
    群２は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、６、８、９、２０、５２、９８、５、７、２４、３１、３３、５０、５４、５９、６０、６１、６４、６８、７１、７３、７４、７９、８５、８７、８９、９２、９４、９５、９７、１４５、１５３、１５４、１５６、１５９、１６１、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７２、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８４、１９１、１９２、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２００、２０４、２０５、２０６、２０８、２０９、２１０、２１３、２１６、２１９、２２０、２２１、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３１、２３６、２３７、２４１、２４２、２４３、２４５、２４７、２４８、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６２、２６５、２６６、２６８、２７１、２７２、２７３、２７４、２７７、２８０、２８２、２８４、２８９、２９３、及び２９５からなり、
    群３は、配列ＩＤ番号：２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、６０５、６０７、６０８、及び６０９からなり、
    群４は、配列ＩＤ番号：５、７、６８、７９、９４、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２３、３０、３５、３６、３８、４３、６５、７２、７８、８４、９６、１０５、１０７、１０８、１１９、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３９、１４０、１４４、１４６、１４８、１４９、１５０、１６０、１６２、１６４、１７３、１７７、１８７、１８９、１９３、１９８、２０２、２１５、２１８、２３２、２３４、２３５、２４４、２４６、２４９、２５０、２６１、２６３、２６４、２６７、２７０、２７５、２８１、２８３、２８７、２８８、及び２９１からなり、かつ
    群５は、配列ＩＤ番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、及び６０６からなる、方法。
12. 請求項１１記載の方法において、ｍｉＲＮＡのレベルが、前記細胞中において前記ｍｉＲＮＡを過剰発現することによって、前記ｍｉＲＮＡの存在下で前記細胞に電気穿孔を施すことによって、または前記細胞が培養される培地に前記ｍｉＲＮＡ及びトランスフェクタントを添加することによって、上昇させられる、方法。
13. 請求項１１または１２記載の方法において、ｍｉＲＮＡのレベルが、前記ｍｉＲＮＡをコードするもしくはその転写を調節する前記細胞のゲノムの領域を欠損させることによって、前記ｍｉＲＮＡに対して向けられるｍｉＲＮＡ阻害剤を前記細胞中で発現させることによって、前記ｍｉＲＮＡ阻害剤の存在下で前記細胞に電気穿孔を施すことによって、または前記細胞が培養される培地にｍｉＲＮＡ阻害剤及びトランスフェクタントを添加することによって、低下させられる、方法。
14. 細胞中で生体分子を生産する方法であって、
    細胞培養物中で前記細胞を繁殖させる工程と、
    配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを上昇させる工程と、
    前記細胞培養物から前記生体分子を単離する工程と
    を有する、方法。
15. 細胞中での生体分子の生産における、群１から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡと、群２から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／または群３から選択されるｍｉＲＮＡを阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ阻害剤と、群４もしくは５から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／または群４もしくは５から選択されるｍｉＲＮＡを阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ阻害剤との組合せの使用であって、
    群１は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３４、３７、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、６２、６３、６６、６７、６９、７０、７５、７６、７７、８０、８１、８２、８３、８６、８８、９０、９１、９３、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４７、１５１、１５２、１５５、１５８、１６３、１６５、１７１、１７４、１８２、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、２０１、２０３、２０７、２１１、２１２、２１４、２１７、２２２、２２３、２２８、２３０、２３３、２３８、２３９、２４０、２５４、２５５、２６９、２７６、２７８、２７９、２８５、及び２９４からなり、
    群２は、配列ＩＤ番号：１、２、３、４、６、８、９、２０、５２、９８、５、７、２４、３１、３３、５０、５４、５９、６０、６１、６４、６８、７１、７３、７４、７９、８５、８７、８９、９２、９４、９５、９７、１４５、１５３、１５４、１５６、１５９、１６１、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７２、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８４、１９１、１９２、１９４、１９５、１９６、１９７、１９９、２００、２０４、２０５、２０６、２０８、２０９、２１０、２１３、２１６、２１９、２２０、２２１、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３１、２３６、２３７、２４１、２４２、２４３、２４５、２４７、２４８、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６２、２６５、２６６、２６８、２７１、２７２、２７３、２７４、２７７、２８０、２８２、２８４、２８９、２９３、及び２９５からなり、
    群３は、配列ＩＤ番号：２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、６０５、６０７、６０８、及び６０９からなり、
    群４は、配列ＩＤ番号：５、７、６８、７９、９４、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２２、２３、３０、３５、３６、３８、４３、６５、７２、７８、８４、９６、１０５、１０７、１０８、１１９、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３９、１４０、１４４、１４６、１４８、１４９、１５０、１６０、１６２、１６４、１７３、１７７、１８７、１８９、１９３、１９８、２０２、２１５、２１８、２３２、２３４、２３５、２４４、２４６、２４９、２５０、２６１、２６３、２６４、２６７、２７０、２７５、２８１、２８３、２８７、２８８、及び２９１からなり、かつ
    群５は、配列ＩＤ番号：５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、及び６０６からなる、使用。

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