JP2007110995A

JP2007110995A - 遺伝子導入方法

Info

Publication number: JP2007110995A
Application number: JP2005307390A
Authority: JP
Inventors: Mikiko Sasaki; 佐々木　　美紀子; Hajime Matsumura; 肇松村; Takatsugu Ueno; 高嗣上野; Junichi Mineno; 純一峰野; Ikunoshin Kato; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2005-10-21
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2007-05-10

Abstract

【課題】細胞においてＲＮＡ干渉を起こすことのできる核酸を細胞染色体上に部位特異的に組込むための方法を提供すること。
【解決手段】外来遺伝子を細胞内に導入する方法であって、アデノ随伴ウイルスベクターを使用して、ｓｉＲＮＡもしくは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉｍｉＲＮＡ、ｐｒｅｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡを標的細胞のゲノムに部位特異的に導入することを特徴とする外来遺伝子導入方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、医学、細胞工学、遺伝子工学、発生工学などの分野において有用なＲＮＡ干渉を生じさせる方法、および前記方法に関連する一連の技術に関する。

遺伝子治療において、現在一般に使用されているウイルスベクターとしてレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等が挙げられる。レトロウイルスベクターは、標的細胞の染色体ＤＮＡに外来遺伝子を安定に組込むことができるため、長期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療に有用である。しかし、また静止期の細胞には遺伝子導入することはできない、外来遺伝子は染色体ＤＮＡ上のランダムな位置に組込まれる、といった性質も有している。近年、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子治療において、外来遺伝子の染色体ＤＮＡ上へのランダムな組込みの結果、癌などが引き起される可能性が示唆されている。アデノウイルスベクターは静止期の細胞を含む多くの細胞に高い効率で感染することができるが、標的細胞の染色体ＤＮＡに外来遺伝子を組込む機構を有していないため、通常、外来遺伝子の発現は一過的である。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは静止期の細胞に感染することができ、かつ、外来遺伝子をヒト１９番染色体のＡＡＶＳ１部位に特異的に組込むという性質を有している［特許文献１；非特許文献１］が、細胞に導入することのできる遺伝子の大きさは非常に小さい。近年ＡＡＶベクターに導入する遺伝子の大きさを大きくするため、Ｒｅｐ蛋白質をコードする領域を欠損させたベクターが使用されるようになったが、この改変によってＡＡＶベクターの特徴であるヒト１９番染色体のＡＡＶＳ１部位に特異的に組込むという性質を消失している［非特許文献２］。

以上のように、遺伝子治療に使用される従来のウイルスベクターはそれぞれに長所、短所を有している。遺伝子治療においては、治療用遺伝子が種々の細胞の染色体の安全な位置に部位特異的に組込まれて、潜在的な危険なく細胞中で長期発現されることが望まれている。

一方、ＲＮＡ干渉を起こすｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）やｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）が遺伝子の転写後調節や翻訳抑制を行う事が発見されて以来、当該技術を用いた研究が盛んになっている。

ｓｉＲＮＡは２１〜２３塩基の鎖長を有する二本鎖ＲＮＡで、ＲＩＳＣ（ＲＮＡｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ）と複合体を形成した後、配列特異的にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を切断し、ｍｉＲＮＡは、１９〜２５塩基の鎖長を有する一本鎖ＲＮＡで、ｍＲＮＡに作用してその翻訳抑制や切断を行う。ｓｉＲＮＡを利用して遺伝子発現の制御を行う場合、細胞内に二本鎖ＲＮＡを存在させる方法として、予め二本鎖ＲＮＡを作製しておいて細胞内に形質導入する方法と、発現ベクターを細胞に形質導入して二本鎖ＲＮＡを発現させる方法が一般的であり、後者にはターゲット配列に対するセンス配列とアンチセンス配列を個別に発現させてｓｉＲＮＡを生成させる方法、ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれるターゲット配列に対する［センス配列―ループ配列―アンチセンス配列］と言うステム＆ループ構造を発現させて細胞内のＤｉｃｅｒによる切断によりｓｉＲＮＡを生成させる方法の二つが知られている［非特許文献３、４、５］。

ｍｉＲＮＡの元になるＤＮＡ配列はｍｉＲＮＡより長く、ｍｉＲＮＡの配列と、それにほぼ相補的な逆向きの配列とを含む。このＤＮＡ配列が一本鎖ＲＮＡに転写されると、ｍｉＲＮＡ配列とその逆相補配列は相補的に結合して二本鎖になり、全体としてはヘアピンループ構造をとる。これをｐｒｉｍｉＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙＲＮＡ）という。核内にあるＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素がこのｐｒｉｍｉＲＮＡ分子の一部を切断してｐｒｅｍｉＲＮＡを作る。次いでｐｒｅｍｉＲＮＡ分子はＥｘｐｏｒｔｉｎ−５と呼ばれるキャリアタンパク質によって核外に輸送され、これからＤｉｃｅｒにより１９〜２５塩基のｍｉＲＮＡ配列が切り出される［非特許文献６］。

近年、本ＲＮＡ干渉技術を用いた遺伝子治療法の開発が期待されている。

米国特許第６１５３４３６号ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、第４０７巻、第７８−８４頁（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、第３８巻、第８１９−８４５頁（２００４）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、第８巻、第６８１−６８６頁（２００２）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２０巻、第５００−５０５頁（２００２）Ｎａｔｕｒｅ、第４１８巻、第３８−３９頁（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０３巻、第８３−８６頁（２００４）

本発明の目的は、細胞において標的遺伝子の発現を抑制し得るＲＮＡをコードするスモールＲＮＡ発現ユニットを細胞染色体上に部位特異的に組込むための方法を提供することにある。

既に１ｋｂｐ程度の小さなサイズのＤＮＡであればｒｅｐ遺伝子を欠損していない野生型ＡＡＶウイルスゲノムに組込まれてもパッケージング可能であること［特許文献１；非特許文献１］が知られているが、標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡをコードする発現ユニットを野生型ＡＡＶベクターに挿入し、ＲＮＡ干渉に使用するという報告はなされていない。

本発明者らは鋭意研究の結果、野生型ＡＡＶを用いる事で、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくはｐｒｉｍｉＲＮＡ（以下、前記の３種のＲＮＡをスモールＲＮＡと記載する）を細胞内で転写しうる発現ユニット（以下、スモールＲＮＡ発現ユニットと記載する）を染色体ＤＮＡ中に組込むことができることを見出した。即ち、野生型ＡＡＶゲノムをコードするＡＡＶベクターに、パッケージングされるように長さを調節したスモールＲＮＡ発現ユニットを挿入したＡＡＶ改変ベクターを作製し、該ＡＡＶ改変ベクターが導入された標的細胞においてスモールＲＮＡ発現ユニットを標的細胞の染色体ＤＮＡに組込むことができ、さらにスモールＲＮＡ発現ユニットから発現したスモールＲＮＡがＲＮＡ干渉能力を持つことができる方法を確立し、該方法に使用されるシステムを構築し、発明を完成した。

即ち、本発明の第１の発明は、少なくとも一部の配列が標的遺伝子の一部の配列と一致している核酸を有し、標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡ発現ユニットが挿入された、ｒｅｐ遺伝子を欠損していないアデノ随伴ウイルスのゲノムを調製し、前記ゲノムを含有するアデノ随伴ウイルスを細胞に感染させる工程を包含することを特徴とする、ＲＮＡ干渉を起こすことのできる核酸の細胞への導入方法に関する。

第１の発明において使用される標的遺伝子の発現を抑制し得るＲＮＡをコードするスモールＲＮＡ発現ユニットとしては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｉｍｉＲＮＡ、ｐｒｅｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡをコードするものが例示される。

本発明の第２の発明は、少なくとも一部の配列が標的遺伝子の一部の配列と一致している核酸を有し、標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡ発現ユニットが挿入された、ｒｅｐ遺伝子を欠損していないアデノ随伴ウイルスのゲノムを有し、前記ゲノムを含有するアデノ随伴ウイルスである事を特徴とする外来遺伝子導入用ベクターに関する。

第２の発明において使用される標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡ発現ユニットとしては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｉｍｉＲＮＡ、ｐｒｅｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡが例示される。

本発明の第３の発明は、アデノ随伴ウイルスのＩＴＲに挟まれた標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡ発現ユニットが染色体ＤＮＡ上に組込まれてなる形質転換細胞に関する。

本発明は、ヒト細胞およびヒト個体にスモールＲＮＡ発現ユニットを導入し、１９番染色体のＡＡＶＳ１部位に特異的に組込む遺伝子導入方法を提供する。本発明は特にＲＮＡ干渉技術を利用した遺伝子治療に有用である。

以下、さらに詳細に本発明を説明する。

ＡＡＶは線状１本鎖ＤＮＡウイルスであり、そのゲノムＤＮＡの大きさは約４．７ｋｂで、調節遺伝子のｒｅｐ遺伝子、キャプシド蛋白質をコードするｃａｐ遺伝子が存在し、ゲノムＤＮＡの両端にＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ）と呼ばれる構造が存在する。ＡＡＶは血清型により区別される１０種類が分離されている。本発明に用いられるＡＡＶの血清型には特に限定はないが、好適には、特に良く研究されていて、一般的にベクターとして使用されている２型ＡＡＶが本発明に使用される。さらに、染色体ＤＮＡ上のＡＡＶＳ１部位への組込み活性を有していれば、ＡＡＶゲノムＤＮＡ上に置換、欠失、挿入、付加を有するものであっても良く、例えば標的細胞の種類に応じて選択することができる。前記の置換、欠失等の例として、例えばマルチクローニングサイトの導入が挙げられる。

ＩＴＲは１４５塩基のＴ字型ヘアピン構造をとることのできる配列で、宿主であるヒトの第１９番染色体のＡＡＶＳ１部位へのウイルスゲノムの組込みに必須の配列を含む［平井幸彦ら、実験医学、第１２巻、第１５号、第１８１１〜１８１６頁（１９９４）］。本発明に用いられるＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶＳ１部位への組込み活性を有していれば特に限定はなく、置換、欠失、挿入、付加を有するものであっても良い。

本発明には、ｒｅｐ遺伝子を欠損していないＡＡＶ、すなわち野生型ＡＡＶがベクターとして使用される。

ＡＡＶのＲｅｐ領域は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０の４種のタンパク質をコードしている。このうちｌａｒｇｅＲｅｐと呼ばれるＲｅｐ７８タンパク質またはＲｅｐ６８タンパク質がヒト１９番染色体のＡＡＶＳ１部位へのＡＡＶゲノムの組込みに必須である。本発明に使用されるＡＡＶのｒｅｐ遺伝子は、標的細胞染色体ＤＮＡへの組込みを行なう活性を有するタンパクをコードするものであれば特に限定はなく、例えば前記したＲｅｐ７８タンパク質、Ｒｅｐ６８タンパク質をコードするものの他、これらにその活性を失わないような置換、欠失、付加、挿入がなされたタンパク質をコードするものであっても良い。

本発明は、標的遺伝子の発現を抑制し得るＲＮＡ分子であるスモールＲＮＡを発現するスモールＲＮＡ発現ユニットの細胞への導入を介して、細胞における前記遺伝子の発現の抑制を行うものである。ここで、前記のユニットにコードされるスモールＲＮＡとしては、ＲＮＡ干渉に基づいて標的遺伝子の発現を抑制しうるものであれば特に限定はないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｉｍｉＲＮＡが例示される。

本発明のスモールＲＮＡ発現ユニットのサイズは、特に限定するものではないが、前記ユニットが挿入されたＡＡＶゲノムのパッケージングの観点から、約１．０ｋｂ以下であることが望ましい。

本発明のスモールＲＮＡ発現ユニットをベクターに挿入する部位については、特に限定するものではないが、例えばＡＡＶのゲノム上に存在するポリＡシグナルの後ろなどが挙げられ、目的に応じて選択することができる。

本発明に使用されるスモールＲＮＡ発現ユニットは、スモールＲＮＡをコードするＤＮＡと、前記ＤＮＡからのスモールＲＮＡの転写を制御するプロモーターを含む。

本発明のスモールＲＮＡ発現ユニットに使用されるプロモーターは、標的細胞内で活性を示し、所望のスモールＲＮＡを発現できるものであれば特に限定はない。例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを発現するユニットの場合には、ポルＩＩＩ型のプロモーターであるヒトＨ１プロモーター、ヒトＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーター等が好適である。

また、ｐｒｅｍｉＲＮＡの発現ユニットに使用されるプロモーターとしては、例えば、ポルＩＩ型のプロモーターであるＨＣＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ＲＳＶプロモーター、β−アクチンプロモーター、γ−グロブリンプロモーター、ＳＲαプロモーター等が例示される。

本発明に使用されるｓｉＲＮＡ発現ユニットは、標的遺伝子の塩基配列に対するセンス鎖配列を有するＲＮＡとアンチセンス鎖配列を有するＲＮＡを個別に発現するものであれば特に限定はなく、例えば（プロモーター１−センス配列をコードするＤＮＡ）と（プロモーター２−アンチセンス配列をコードするＤＮＡ）がタンデムに並んだものや、ｓｉＲＮＡ配列に対応する二本鎖ＤＮＡをはさむ形で両端にプロモーター１とプロモーター２を有するようなもの等が挙げられる。

当該ｓｉＲＮＡの二本鎖部分は、哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答抑制の観点から、例えば１５〜３５塩基の鎖長を有するもの、好ましくは１５〜３０塩基の鎖長を有するもの、さらに好ましくは、２０〜３０塩基の鎖長を有するものが例示される。また、前記鎖長の塩基配列がＲＮＡ干渉を起しうる限り、標的配列のすべての塩基配列を含んでいてもよく、標的配列の一部を含んでいてもよく、標的配列以外の配列を含んでいてもよい。さらに、本発明の二本鎖ＲＮＡには、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉の有効性の観点から、例えば、３’末端側にデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドが２〜４塩基突出した二本鎖ＲＮＡの形状のもの、さらに好ましくは３’末端側に２塩基突出した二本鎖ＲＮＡの形状のものであっても良い。２〜４塩基としてはＴＴ配列〜ＴＴＴＴ配列またはＵＵ配列〜ＵＵＵＵ配列が例示される。なお、突出部分の塩基がデオキシリボヌクレオチドである場合、当該核酸を構成するオリゴヌクレオチドはＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドであるが、本明細書ではこれも二本鎖ＲＮＡと呼ぶ。また、前記二本鎖ＲＮＡが生理的条件下、細胞内において二本鎖構造をとりうる範囲内で、センス鎖に塩基の置換、挿入又は欠失を導入しても良い。この場合、ｓｉＲＮＡはミスマッチ又はバルジを有する。

ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の塩基配列またはその一部の配列のセンス鎖配列と前記センス鎖配列の相補配列（アンチセンス鎖配列）がループ配列で連結された一本鎖ＲＮＡからなる核酸であり、相補配列どうしがステムを形成したステムループ構造をとっている。本発明のｓｈＲＮＡのループ配列の長さは、例えば２〜２００塩基、好ましくは４〜５０塩基、特に好ましくは８〜２０塩基の鎖長を有するものが例示される。また、ステム領域の長さは、遺伝子抑制において利用できる二本鎖ＲＮＡを生成する長さであれば特に限定はないが、例えば、１０〜２００塩基、好ましくは１４〜３０塩基、特に好ましくは１９〜２４塩基である。

本発明のｓｈＲＮＡ発現ユニットにコードされるｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の配列に由来する配列の他、任意のループ配列を含むことができる。前記のループ配列は、ｓｈＲＮＡとして発現され、ＲＮＡ干渉効果を引き起こすものであれば特に限定はなく、例えばＵＵＣＡＡＧＡＧＡが挙げられる。この他、公知のｓｈＲＮＡに含まれるループ配列を使用してもよい。

ｓｈＲＮＡ発現ユニットは、例えば、前記のループ配列をはさんで標的遺伝子の塩基配列またはその一部とその相補配列とが配置されたＤＮＡを作製し、これを適切なプロモーター、例えばポルＩＩＩ型プロモーターの下流に接続し、構築することができる。

本発明に使用されるｍｉＲＮＡは、標的となるｍＲＮＡに作用してその翻訳抑制や切断を引き起こすものであれば特に限定はなく、例えば１０〜１００塩基、好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１７〜３０塩基、特に好ましくは１９〜２５塩基の鎖長を有する一本鎖ＲＮＡが例示される。

ｐｒｅｍｉＲＮＡ発現ユニットは、例えば、前記ｍｉＲＮＡの配列と、それにほぼ相補的な逆向きの配列を有するＤＮＡを作製し、これを適切なプロモーター、例えばポルＩＩ型プロモーターの下流に接続し、構築することができる。天然で発現されているｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡより単離し、これを適当なプロモーターの下流に接続してもよい。

上記のように構築されたスモールＲＮＡ発現ユニットが挿入されたベクターは、標的遺伝子の発現を抑制するための外来遺伝子導入用ベクターとして使用することができる。前記ベクターも本発明に包含される。

本発明の外来遺伝子導入用ベクターは、天然のＡＡＶと同様に静止期を含む多くの細胞種に感染し、そのため様々な組織または細胞に対する遺伝子治療に利用できる。また、部位特異的にスモールＲＮＡ発現ユニットを組込むことができるため、染色体のランダムな位置への組込みによって癌などが引き起こされる危険性なしに、ｓｉＲＮＡの長期にわたる発現が可能である。

即ち、本発明の遺伝子導入方法は、治療用遺伝子であるスモールＲＮＡを発現しうる核酸を目的細胞に導入する過程において、標的細胞種の限定や発現が短期に失われる問題を克服した優れたシステムであり、ＲＮＡ干渉技術を利用した遺伝子治療に使用でき、顕著な治療効果を期待できる。

本発明の遺伝子導入法は、例えば、以下のようにして行なうことができる。
ＡＡＶのゲノムＤＮＡを含むプラスミドに、目的のスモールＲＮＡ発現ユニットを挿入する。導入するＤＮＡの由来には特に限定はなく、天然のゲノムや標的遺伝子を有する組換え体から調製したもの、ＰＣＲによって増幅したもの、化学合成したもののいずれでもよく、さらにこれらを組み合わせたものであっても良い。作製した組換えプラスミドをアデノウイルス由来の遺伝子（Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡＲＮＡｓ）を有するベクター、例えばｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とともにヒト胎児腎臓由来２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３）に形質導入する。形質導入の方法は特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法、例えばＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ社製）等が使用できる。形質導入した２９３細胞からウイルス液を回収し、ＡＡＶ改変ベクターを得る。

このようにして得られたＡＡＶ改変ベクターを常法に従って、その染色体上にＡＡＶＳ１部位を有する標的細胞に導入することにより、前記部位に目的のスモールＲＮＡ発現ユニットを組込むことができる。

こうして作製される、標的遺伝子の発現が抑制された細胞も本発明の範囲内に属する。

以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。

実施例１各種ＡＡＶベクターの調製
（１）ｓｈＲＮＡ発現改変型ＡＡＶベクターの調製
配列表の配列番号１で示される塩基配列を持つＡＡＶウイルスのゲノムＤＮＡ全長を含むプラスミドｐＡＶ１（ＡＴＣＣ３７２１５）のＳｎａＢＩサイト（配列表の配列番号１の塩基番号４４９４）に、配列表の配列番号２で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドをアニールさせた、２本鎖ＥｃｏＲＶリンカーを挿入し、プラスミドｐＡＶ−ＥＲＶを得た。

次にＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩＩ系のｐｒｏｍｏｔｅｒであるｈｕｍａｎＵ６ｐｒｏｍｏｔｅｒを搭載したｓｈＲＮＡ発現用プラスミドベクターであるｐＢＡｓｉ―ｈＵ６ベクター（タカラバイオ社製）をＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、そこに配列表の配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドをアニールさせたＤＮＡ断片を挿入しプラスミドｐＢＡｓｉ−ｈＵ６−ｓｈＧＦＰを調製した。このプラスミドからは緑色蛍光タンパク質ｒｓＧＦＰをコードする遺伝子の標的配列ＧＧＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧに対するｓｈＲＮＡが発現する。このようにして作製したプラスミドをＥｃｏＲＶで消化して、切り出されたｈｕｍａｎＵ６プロモータからｓｈＲＮＡをコードする配列にわたる領域を、ｐＡＶ−ＥＲＶのＥｃｏＲＶサイトに挿入し、プラスミドｐＡＶ−ｓｈＧＦＰを調製した。得られたプラスミドｐＡＶ−ｓｈＧＦＰとＡＡＶＨｅｌｐｅｒ−ＦｒｅｅＳｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に含まれるｐＨｅｌｐｅｒとをヒト胎児腎臓由来２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３）にＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて、付属のプロトコルに従って共導入し、ｓｈＲＮＡ発現改変型ＡＡＶベクターであるＡＡＶ−ｓｈＧＦＰを得た。

（２）野生型ＡＡＶベクターの調製
コントロールとしては以下に示すウイルスを調製した。まずは、プラスミドｐＡＶ１（ＡＴＣＣ３７２１５）とｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とを２９３細胞にＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて共導入し、野生型ＡＡＶベクターであるＡＡＶ−ｗｔを得た。

（３）ＧＦＰに対してＲＮＡｉ効果を示さないｓｈＲＮＡ発現改変型ＡＡＶベクターの調製
実験の陰性コントロールとして、プラスミドｐＢＡｓｉ−ｈＵ６ベクターをＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、そこにＧＦＰに対してＲＮＡｉ効果を示さない配列ＣＣＴＣＧＡＡＡＴＣＧＴＡＣＴＧＡＧＡ［ＢＬＯＯＤ、第１０１巻、第３１５７−３１６３頁（２００３）］のｓｈＲＮＡを発現させるため、配列表の配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドをアニールさせたＤＮＡ断片を挿入したプラスミドｐＢＡｓｉ−ｓｈＮＣを調製した。このようにして作製したプラスミドをＥｃｏＲＶで消化して、切り出されたｈｕｍａｎＵ６プロモータからｓｈＮＣをコードする配列にわたる領域をｐＡＶ−ＥＲＶのＥｃｏＲＶサイトに挿入し、プラスミドｐＡＶ−ｓｈＮＣを調製した。得られたプラスミドｐＡＶ−ｓｈＮＣとＡＡＶＨｅｌｐｅｒ−ＦｒｅｅＳｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に含まれるプラスミドｐＨｅｌｐｅｒとを２９３細胞にＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて、付属のプロトコルに従って共導入し、ｓｈＲＮＡ発現改変型ＡＡＶベクターであるＡＡＶ−ｓｈＮＣを得た。

（４）従来型ＡＡＶベクターの調製
ＡＡＶベクタープラスミドｐＡＡＶ−ＬａｃＺ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＡＡＶＨｅｌｐｅｒ−ＦｒｅｅＳｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の方法に従い、２９３細胞にＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて、付属のプロトコルに従って共導入し、Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子をＡＡＶウイルスゲノムから欠損させてあるため自身のゲノムＤＮＡを宿主ゲノムＤＮＡに組込む能力を有していない従来型ＡＡＶベクターであるＬａｃＺ遺伝子発現ユニットを搭載しているＡＡＶ−ＬａｃＺを得た。

実施例２ＲＮＡｉ干渉効果の確認
（１）ｒｓＧＦＰ発現組換えレトロウイルスベクターの調製
標的遺伝子ｒｓＧＦＰを安定に発現しているＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−１２１）は以下の手順で作製した。

ｒｓＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ２５（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、７７５ｂｐのＧＦＰ遺伝子断片を得、その末端をＤＮＡｂｌｕｎｔｉｎｇｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑化した。レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）を制限酵素ＸｈｏＩとＳｐｈＩで消化して得られたベクター断片４．５８ｋｂｐの末端をＤＮＡｂｌｕｎｔｉｎｇｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑化したのち、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化した。この平滑化したベクターに先の平滑化したｒｓＧＦＰ遺伝子をＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて挿入し、ｒｓＧＦＰ発現組換えレトロウイルスベクターｐＤＯＧを得た。

これらプラスミドベクターをヒト胎児腎臓由来２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１１２６８）に、ＲｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓＰａｃｋａｇｉｎｇＫｉｔＡｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用いて、キット付属のプロトコルに従ってトランスフェクションし、アンフォトロピックウイルス上清液を獲得し、０．４５μｍフィルター（ＭｉｌｅｘＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、使用するまで−８０℃超低温フリーザーで保存した。

ＨＴ１０８０細胞を６穴組織培養用プレート（岩城硝子社製）に、１ウェルあたり５×１０^４個播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地中で５％ＣＯ_２存在下、３７℃で２４時間培養した。

アンフォトロピックＤＯＧウイルス液を段階希釈し、ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン；シグマ社製）８μｇ／ｍｌ存在下で感染を行った。感染後３日間培養し、ＧＦＰ発現をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で分析し、導入効率２０％以下のサンプルからＧＦＰ陽性細胞をソーティングにより回収し、培養を行い、ＧＦＰ安定発現細胞ＨＴ１０８０−ＧＦＰとした。

（２）ＧＦＰ蛍光強度の測定
ＨＴ１０８０−ＧＦＰ細胞を２４ウェル細胞培養用プレート（岩城硝子）に１ウェルあたり１．０×１０^５個播種し、４８時間培養した。実施例１で調製したＡＡＶ−ｓｈＧＦＰおよびＡＡＶ−ｗｔ、ＡＡＶ−ｓｈＮＣ、ＡＡＶ−ＬａｃＺをＡＡＶＨｅｌｐｅｒ−ＦｒｅｅＳｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の付属のプロトコルに従い、ＨＴ１０８０−ＧＦＰ細胞に感染させた。２日間の培養の後、感染細胞の蛍光強度をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて測定した。その結果、ＡＡＶ−ｓｈＧＦＰ感染細胞においてのみＧＦＰ蛍光強度の低下が観察でき、ノックダウン効果が示された（図１）。

実施例３部位特異的組込みの観察
感染細胞内でウイルスゲノムＤＮＡのＡＡＶＳ１部位への挿入が起こったか否かを以下のようにして調べた。

ＡＡＶ−ｓｈＧＦＰおよびＡＡＶ−ｗｔ、ＡＡＶ−ｓｈＮＣ、ＡＡＶ−ＬａｃＺを感染させた細胞それぞれからゲノムＤＮＡをＰＵＲＥＧＥＮＥＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＧＥＮＴＲＡ社製）のキット付属のプロトコルに従って調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＶＩＲＯＬＯＧＹ、第７１巻、第７９５１−７９５９頁（１９９７）記載のウイルスゲノムＤＮＡにアニールするプライマー８１（配列表の配列番号８）と、ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．、第２７３巻、第４７３−４７８頁（２０００）記載のＡＡＶＳ１部位にアニールするプライマー１７２２（配列表の配列番号９）とを用いてＡＡＶＳ１領域と挿入されたＡＡＶウイルスゲノムＤＮＡに挟まれた領域を増幅するＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物各１μｌをＪＯＵＲＮＡＬＯＦＶＩＲＯＬＯＧＹ、第７１巻、第７９５１−７９５９頁（１９９７）記載のプライマー７９（配列番号１０）およびプライマー８０（配列番号１１）を用いて、ＡＡＶウイルスゲノムＤＮＡ上流にあるＡＡＶＳ１領域を増幅するＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、目的とする大きさのＤＮＡ増幅が見られ、改変型ＡＡＶベクターであるＡＡＶ−ｓｈＧＦＰ感染細胞において、コントロールにおいた野生型ＡＡＶベクターであるＡＡＶ−ｗｔ感染細胞同様に部位特異的な組込みが起こっている事を観察した（図２）。以下図２の各レーンにアプライしたＰＣＲ産物をそれぞれ示す。レーンＭ：ＷｉｄｅＲａｎｇｅｍａｒｋｅｒ（タカラバイオ社製）、レーン１：ＨＴ１０８０ｇｅｎｏｍｅ、レーン２：ＨＴ１０８０／ＡＡＶ−ＬａｃＺｇｅｎｏｍｅ、レーン３：ＨＴ１０８０／ＡＡＶ−ｓｈＧＦＰｇｅｎｏｍｅ、レーン４：ＨＴ１０８０／ＡＡＶ−ｓｈＮＣｇｅｎｏｍｅ、レーン５：ＨＴ１０８０／ＡＡＶ−ｗｔｇｅｎｏｍｅ
従来型ＡＡＶベクターであるＡＡＶ−ＬａｃＺ感染細胞では部位特異的な組込みは観察されなかった。

本発明により、部位特異的に組込み可能で尚且つノックダウン効果を示す改変型ＡＡＶベクターが構築できた。

本発明は、ヒト細胞およびヒト個体にスモールＲＮＡ発現ユニットを導入し、１９番染色体のＡＡＶＳ１部位に特異的に組込む遺伝子導入方法を提供する。本発明は特に遺伝子治療に有用である。

ＡＡＶ改変ベクターを用いてｓｈＲＮＡ発現ユニットを標的細胞に導入し、ＲＮＡ干渉によりノックダウン効果が観察された事を示す図である。ＡＡＶ改変ベクターを用いてｓｈＲＮＡ発現ユニットを標的細胞に導入し部位特異的な組込みが起こっている事を示す図である。

SEQ ID NO:2; A synthetic MCS-sense oligonucleotide
SEQ ID NO:3; A synthetic MCS-antisense oligonucleotide
SEQ ID NO:4; A synthetic shGFP-sense oligonucleotide
SEQ ID NO:5; A synthetic shGFP-antisense oligonucleotide
SEQ ID NO:6; A synthetic shNC-sense oligonucleotide
SEQ ID NO:7; A synthetic shNC-antisense oligonucleotide
SEQ ID NO:8; Synthetic primer 81 annealing to the AAV ITR
SEQ ID NO:9; Synthetic primer 1722 annealing to the AAVS1
SEQ ID NO:10; Synthetic primer 79 annealing to the AAVS1
SEQ ID NO:11; Synthetic primer 80 annealing to the AAVS1

Claims

標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡをコードする発現ユニットが挿入された、ｒｅｐ遺伝子を欠損していないアデノ随伴ウイルスのゲノムを調製し、前記ゲノムを含有するアデノ随伴ウイルスを細胞に感染させる工程を包含することを特徴とする、標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡ発現ユニットの細胞への導入方法。
標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡ発現ユニットが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｉｍｉＲＮＡ、ｐｒｅｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡから選択されるＲＮＡをコードするものであることを特徴とする請求項１記載の標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡ発現ユニットの細胞への導入方法。
標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡをコードする発現ユニットが挿入された、ｒｅｐ遺伝子を欠損していないアデノ随伴ウイルスのゲノムを有し、前記ゲノムを含有するアデノ随伴ウイルスである事を特徴とする外来遺伝子導入用ベクター。
スモールＲＮＡ発現ユニットが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｉｍｉＲＮＡ、ｐｒｅｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡから選択されるＲＮＡをコードするものであることを特徴とする請求項３記載の外来遺伝子導入用ベクター。
アデノ随伴ウイルスのＩＴＲに挟まれた標的遺伝子の発現を抑制し得るスモールＲＮＡをコードする発現ユニットが染色体ＤＮＡ上に組込まれてなる形質転換細胞。