JP6676526B2 - 組換えタンパク質の生産のための哺乳動物生産細胞の生成のための手段及び方法 - Google Patents
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Description
本発明は、工業規模でタンパク質を生産することができる哺乳動物細胞の生成、並びに特にタンパク質生産のための、該細胞を得る及び使用するための手段及び方法に関する。
様々な適用及びプロセスのための組換えタンパク質の生成及び合成は、当業者に周知である。多様な異なる手段及び方法が様々な機構を用いて使用され、該タンパク質の安全かつ効率的な大規模製造を提供する。これらの細胞機構は、タンパク質生産プロセスの異なる段階で、例えば、転写、翻訳又は翻訳後レベルで、その効果を発揮し得る。翻訳、従って遺伝子発現が制御される、比較的最近発見された機構は、miRNA(マイクロRNAの略称、以下ではmiRとも称する)の発現を介するものである。これらは、miRと標的mRNAの3'-UTRとの間のRNA：RNA相互作用によって遺伝子発現の負の調節因子として一般的に作用する、長さが約22ヌクレオチド(nt)の内因性の一本鎖非コードRNAである。miRは、mRNAの翻訳に重要な調節的役割を果たすことが示されており、細胞の発生、分化、アポトーシス、抗ウイルス防御、及び最も基本的な細胞プロセスの制御に関与している。実際、miRは、ヒトゲノムの約30％の発現を調節し得ることが示唆されている。miRは、主に3'-UTRで、特異的標的細胞mRNAと相互作用することによって、mRNAの翻訳速度に影響を与え、それを調節する。さらに、1つのmiRは、複数の標的mRNAを標的とし、それらと相互作用することができ、従って、miR認識モチーフ及び標的を決定することは現状では困難である。
これまでに、miRの発現、及びこれらが遺伝子発現に対して誘発する続く制御を調査する大部分の研究は腫瘍学の分野で行われているが、この知識の多くは、どのようにこれらが細胞表現型を支持するかに関して、工業バイオテクノロジー分野に関連する。例えば、細胞増殖とmiRとの間の関係を実証する癌分野における研究は、バイオテクノロジー分野に適用できる。miRが調節することができる広範囲の潜在的な標的は、miR工学を介して遺伝子発現を操作することによって新たな表現型を有する細胞株を開発する可能性を提供する。これを行う際、単一のmiRの操作が、細胞表現型の決定に一緒に役割を果たす複数の遺伝子の調節を潜在的に標的とすることができると理解される。
miRの生合成のための経路の一部は、サイレンシング又は低分子干渉RNA(siRNA)のものと共有され、ダイサー(Dicer)及びRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)を含む(Bartel et al. 2004 Cell 116:281-297)。miR遺伝子の70％が遺伝子のイントロン又はエキソン内に見出されることが報告され、残りの30％は遺伝子間領域内に位置する。最初に、一次miR(pri-miR)は、RNase IIエンドヌクレアーゼのドローシャ(Drosha)及びパーシャ(Pasha)によって切断され、pre-miRNA(pre-miR)と呼ばれるステムループ構造を形成する。このpre-miRは、長さ約60〜70ヌクレオチドであり、5'リン酸及び3'末端に2ヌクレオチドオーバーハングを有する。輸送補因子Ran-GTPとともに、pre-miRヘアピンは受容体エクスポーチン-5(Exportin-5)を通して核から能動輸送される。細胞質では、ダイサーと呼ばれるRNase IIIエンドヌクレアーゼが、二本鎖部分を認識することによってpre-miRと相互作用し、ステムループの基部から約2個のヘリカルターン(helical turn)を切断し、miR:miR*二重鎖を残すと考えられている(pre-miRの反対のアームは、miR名の後の星印によって示される)。このmiR:miR*二重鎖はRISCに入り、miR:miR*二重鎖のmiR*成分が剥がされ、ヘリカーゼの助けによって分解される。成熟miRの5'末端は、最低の熱力学的エネルギーを有するmiR-miR*二重鎖の鎖の末端に位置する(Bartel et al. 2004 Cell 116:281-297)。
miRの5'末端における最初の1〜7ヌクレオチドは、塩基対形成を介して標的に結合し、「シード(seed)」領域と呼ばれている。哺乳動物細胞において、miRのシード領域のみが標的に完全なマッチを示す場合、miRは、通常、mRNAへの不完全な塩基対形成を介して標的遺伝子を認識する。また、miR結合部位は、mRNAの3'末端以外の他の場所、例えば、リボソームタンパク質mRNAの5'-非翻訳領域(UTR)(Orom et al. 2008 Molecular Cell 30:460-471)又はさらにはプロモーターなどのゲノム調節配列(例えばTan et al. 2009 BMC Molecular Biology 10:12)に存在することが報告されている。miRは、コード配列におけるmRNAと相互作用し得るという報告もある(Rigoutsos et al. 2009 Cancer Research 69:3245-3248)。しかし、非3'-UTR相互作用に関する情報はほとんどなく、大部分の検証されたmiR標的はmRNAの3'非翻訳領域(3'UTR)に位置する。一般的に、miRとmRNA標的との間の不完全な塩基対形成がある場合、翻訳阻害が生じ、一方、完全な塩基対形成がある場合、標的mRNAの分解が起こると考えられている。
遺伝子発現、従って高い組換えタンパク質生産性に影響を与える経路及び細胞プロセスを調節するmiRの潜在的な使用にもかかわらず、培養哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の生産を改善するためのmiRの操作は、これまで、完全に実現されてはいない。培養培地中の分泌された組換えタンパク質の濃度は、細胞比生産速度(cell-specific production rate)(qP)と生細胞濃度の時間積分(IVC)の関数である(Porter et al. 2010 Biotechnology Progress 26:1446-1455)。従って、miRは、qP(例えば、分泌経路の操作によって)又はIVC(例えば、増殖又はアポトーシス経路の操作によって)を増加させる経路に適用することができる。バイオプロセシング/バイオテクノロジー分野におけるmiR発現及び操作への大部分の研究は、異なるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系統を中心にしてきた。しかし、ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞(組換えタンパク質の一過的生産のためにしばしば使用される)においてmiRをプロファイリングした1つの研究の後に、miR発現プロファイルが、バッチ培養における異なる増殖期中にどのように変化するかが続いた(Koh et al. 2009 Journal of Biotechnology 140:149-155)。これらの著者は、14種のmiRが、指数増殖期と定常増殖期との間で発現が顕著に変化し、13種のmiRが、定常期において上方調節されたことを報告した。指数期と定常期との間で変化することが観察されたmiRの中には、miR-15a及びmiR-16があった(Koh et al. 2009 Journal of Biotechnology 140:149-155)。
最近、CHO細胞miR発現及びCHO細胞におけるmiRの操作は、多くの関心を集めているが、このような研究は、まだ初期段階である。最近の研究は、組換え細胞株間で保存されたmiR及びそれらの発現をプロファイルするために、ディープシーケンシングアプローチを使用した(Hammond et al. 2012 Biotechnology and Bioengineering 109:1371-1375)。この研究は、CHO-K1宿主、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)を発現するCHO-K1由来細胞株、及び組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク質(tPA)を発現するCHO-K1由来細胞株を調べ、173種の保存されたmiRを見出し、そのうち136種は、SEAP又はtPA組換え細胞株のいずれかで宿主と比較して異なって発現され、75種は、両方において宿主と比較して異なって発現された。異なって発現されると同定されたものには、miR-15a、-15b及び-34cが含まれた(Hammond et al. 2012 Biotechnology and Bioengineering 109:1371-1375)。別の研究は、mmu-miR-446h発現がCHO細胞のアポトーシスに影響を与えたことを報告した(Druz et al. 2011 Biotechnology and Bioengineering 108:1651-1661)。Johnsonら(2011)によって報告されたCHOにおける研究は、miRBaseデータベースからの公知のmiRとのアライメントを介して350種のmiRを同定した(Johnson et al. 2011 Biotechnology and Bioengineering 108:475-480)。この研究は、(i)調査したCHO細胞株のほぼ全ての成熟miRが、それらのヒト又はマウスの対応物に高度に相同的であったこと、及び(ii)多くのmiRの発現が、わずかな環境変動に応答して変化したことを示した。この研究はまた、ハムスターmiR cgr-let-7fが、CHO細胞において最も豊富なmiRであり、そのレベルが調べた条件にわたって同程度だったことを報告した。
CHO細胞において保存されたmiR及び新規miRの両方を同定し、注釈付けするための、同様のシーケンシングアプローチがHacklらによって報告された(Hackl et al. 2011 Journal of Biotechnology 153:62-75)。研究の時点では、著者らは、注釈付きのCHOゲノムにはアクセスできなかった。その代わりに、5'及び3'成熟miRのリードアライメントパターン(read alignment pattern)及びリードカウント比(read count ratio)を得て、miR/miR*及び5p/3p miRペアへの独立した分類、並びに他の非コードRNAからのmiRの区別に使用して、387種の成熟CHO miRのアノテーションをもたらした。この研究は、血清対無血清条件、及び宿主対誘導体組換え細胞株の比較を含んだ。宿主対組換え誘導体細胞株の比較では、彼らは、miR-16bの差次的発現を報告した(Hackl et al. 2011 Journal of Biotechnology 153:62-75)。同グループはまた、バッチ培養の異なる期でのCHO-K1懸濁細胞培養物におけるmiRの発現について報告し、100を超えるmiRがバッチ培養にわたって異なって調節されたことを報告する(Hernandez Bort et al. 2012 Biotechnology Journal 7:500-515)。別の研究では、Linら(2011)は、宿主CHO DG44細胞及び誘導体IgG生産細胞株におけるmiRのレベルを調べ、miR-221及びmiR-22が、IgG生産組換え細胞株において下方調節されたことを報告した。しかし、培養培地中に分泌されたIgGの濃度とこれらのmiRの発現との間には関係がなかった。親DG44細胞株では、miR-15bの発現も、組換えタンパク質を生産する誘導体細胞株と比較して顕著に低かった(Lin et al. 2011 Biotechnology Progress 27:1163-1171)。
CHO細胞でのmiR発現への最初の報告の1つはGammellらからのものだった(Gammell et al. 2007 Journal of Biotechnology 130:213-218)。著者らが採用したアプローチは、非ハムスターマイクロアレイを使用し、温度シフト時のmiR発現を調べることであった。結果として得られたデータは、miR-21及びmiR-24が、温度シフトによって、又は通常のバッチ培養中のいずれかで誘導され、CHO-K1増殖停止細胞株において上方調節されたことを示した(US 2010/0190258 A1)。その後、このグループは、37℃から28〜33℃に温度を低下させることが、24時間後に測定した場合、miR-219、miR-518d、miR-126、miR-30e、miR-489及びmiR-345のレベルの増加を導き、miR-7、miR-320、miR-101及びmiR-199は、下方調節されたことを報告した(Barron et al. 2011 Journal of Biotechnology 151:204-211)。miR-7の成功した外因性過剰発現は、37℃での細胞増殖の阻止及び正規化された(細胞毎)組換えタンパク質生産の増加をもたらしたが、収率は低下した温度での細胞からの収率よりも依然として低かった。
miR操作の影響は、多くの場合、レポーター遺伝子及び「スポンジベクター(sponge vector)」を使用して調査される(Ebert et al. 2007 Nature Methods 4:721-726)。工業的に関連する表現型に対するmiRの影響を実証するために、問題になっているmiRの発現を減少又は増加させることのいずれかによってこれを確認することが必要である。Jadhavら(Jadhav et al. 2012 Biotechnology and Bioengineering 109:1376-1385)は、最近、CHO細胞におけるmiRの機能解析が、組換えEPO-FC生産CHO細胞株及び4日の期間にわたる一過的トランスフェクションを使用してうまく実証され得ることを報告した。
Bartel et al. 2004 Cell 116:281-297
Orom et al. 2008 Molecular Cell 30:460-471
Tan et al. 2009 BMC Molecular Biology 10:12
Rigoutsos et al. 2009 Cancer Research 69:3245-3248
Porter et al. 2010 Biotechnology Progress 26:1446-1455
Koh et al. 2009 Journal of Biotechnology 140:149-155
Hammond et al. 2012 Biotechnology and Bioengineering 109:1371-1375
Druz et al. 2011 Biotechnology and Bioengineering 108:1651-1661
Johnson et al. 2011 Biotechnology and Bioengineering 108:475-480
Hackl et al. 2011 Journal of Biotechnology 153:62-75
Hernandez Bort et al. 2012 Biotechnology Journal 7:500-515
Lin et al. 2011 Biotechnology Progress 27:1163-1171
Gammell et al. 2007 Journal of Biotechnology 130:213-218
Barron et al. 2011 Journal of Biotechnology 151:204-211
Ebert et al. 2007 Nature Methods 4:721-726
Jadhav et al. 2012 Biotechnology and Bioengineering 109:1376-1385
商業的組換えタンパク質生産は、しばしば大規模な製造プロセスを必要とする。工業プロセスにおける最近の進歩にもかかわらず、組換えタンパク質生産は困難な課題のままである。従って、より効率的かつ最適化された方法におけるタンパク質の生産のためのさらに改良された手段及び方法を提供する必要性が依然として存在する。
本発明は、タンパク質の工業規模生産のための改良された又はさらなる手段及び方法を提供するための技術的課題にとりわけ基づいている。
本発明は、独立請求項の教示を提供することにより、その技術的課題を解決する。
特に、本発明は、哺乳動物生産細胞において目的タンパク質を生産する方法であって、以下のプロセスステップ、
(a)哺乳動物生産細胞を提供するステップ、
(b)ステップ(a)で提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRの濃度を増加させ、タンパク質生産が改変された(protein production engineered)哺乳動物生産細胞を得るステップ、
(c)目的タンパク質の生産に適した条件下で、該タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を培養するステップ、及び
(d)ステップ(c)で生産された目的タンパク質を回収するステップ
を含む方法を提供することによって、その技術的課題を解決する。
(a)哺乳動物生産細胞を提供するステップ、
(b)ステップ(a)で提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRの濃度を増加させ、タンパク質生産が改変された(protein production engineered)哺乳動物生産細胞を得るステップ、
(c)目的タンパク質の生産に適した条件下で、該タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を培養するステップ、及び
(d)ステップ(c)で生産された目的タンパク質を回収するステップ
を含む方法を提供することによって、その技術的課題を解決する。
本発明は、従って、増加した目的タンパク質の生産を提供するために、哺乳動物生産細胞において同定されたmiRの濃度を増加させ、すなわち、量、特に細胞内の量を上昇させる。
本発明の文脈において、濃度という用語は、レベルも意味すると理解される。
本発明の文脈において、増加したmiRの濃度は、ステップ(a)で提供された哺乳動物生産細胞における前記miRの濃度と比較して、前記miRのより高い濃度である。miRの濃度は、細胞におけるmiRの量を決定するための従来の方法によって、例えばqRT-PCR解析によって決定することができる。適切な対照測定及び適切な標準の設定は、当業者に公知である。
本発明の文脈において、増加した目的タンパク質の生産は、細胞における目的タンパク質、特に目的組換えタンパク質のより高い比生産速度(qP)、及び/又は生細胞濃度のより高い時間積分(IVC)を指すことを意味する。組換えタンパク質生産又は生産性は、培養培地中の前記タンパク質の濃度と定義され、Porterら(Porter et al. 2010 Biotechnology Progress 26:1446-1455)に従って計算される、これらの2つのパラメーター(qP及びIVC)の関数である。
増加したタンパク質生産を測定する方法は、当業者に周知である。例えば、組換えタンパク質生産の増加は、ELISAにより、組織培養培地中の力価を測定することによって、小規模で決定され得る(Smales et al. 2004 Biotechnology Bioengineering 88:474-488)。それはまた、例えば培地中の組換えモノクローナル抗体(mAb)濃度のハイスループット決定のための、ForteBio Octetによって定量的に決定することができ(Mason et al. 2012 Biotechnology Progress 28:846-855)、又はプロテインA HPLCによって大規模で決定することができる(Stansfield et al. 2007 Biotechnology Bioengineering 97:410-424)。細胞を計数する方法は、トリパンブルー排除法、その後の、血球計又はVi-CELL(Beckman Coulter)を用いて計数することを含むが、これに限定されない。
目的タンパク質の前記増加した生産は、一実施形態では、本プロセスのステップ(b)で得られた少なくとも1つのmiRの増加した細胞内濃度の結果としての、細胞の増加した比タンパク質生産速度(qP)によるものであってもよい。一実施形態では、前記増加したタンパク質生産は、本プロセスのステップ(b)で得られた少なくとも1つのmiRの増加した濃度の結果としての、増加した細胞増殖、特により高いIVCに代替的に又は追加的によるものであってもよい。従って、本発明は、タンパク質、特に組換えタンパク質の生成において使用される、哺乳動物生産細胞、特に細胞株の増殖及び使用に特に有用である。
本発明によれば、本方法のステップ(a)は、哺乳動物生産細胞、すなわち、目的タンパク質、特に目的組換えタンパク質を生産することができ、かつ、本方法のステップ(b)及び(c)に供することができる細胞の提供を必要とする。
本発明の好ましい実施形態では、目的タンパク質は、生産細胞株の内因性タンパク質である。
さらに好ましい実施形態では、目的タンパク質は、生産細胞に対して外因性である。すなわち、目的タンパク質は、生産細胞中に通常は存在しない。従って、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、当業者に公知の方法によって、好ましくは後述するように、生産細胞に導入され、特にトランスフェクトされなければならない。
本発明の特に好ましい実施形態では、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本方法のステップ(a)又は(x)の前にトランスフェクトされる。すなわち、目的の外因性タンパク質は、提供された生産細胞内にすでに存在する。好ましくは、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ベクター上に存在するか、又は生産細胞のゲノムに安定に組み込まれる。
本発明によれば、本方法のステップ(b)は、以下では「タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞」とも称される、操作された(改変された)哺乳動物生産細胞を得るために、ステップ(b)を実施する前の哺乳動物生産細胞に存在する前記miRのレベルと比較して、前記miRの少なくとも1つの濃度の増加を必要とする。前記タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞は、目的タンパク質の生産に適した条件下で、続いてステップ(c)で培養され、前記培養中に、前記目的タンパク質は、生産され、回収され得、特に培養培地及び細胞から分離され得る。
さらなる特に好ましい実施形態では、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本プロセスのステップ(b)又は(y)の間に少なくとも1つのmiRと同時に生産細胞にトランスフェクトされる。従って、本実施形態では、少なくとも1つのmiRの濃度だけでなく、目的タンパク質の濃度も増加する。またここで、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、別々のベクター上にあっても、又は得られたタンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞のゲノムに安定に組み込まれてもよい。
さらに別の特に好ましい実施形態では、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞に、すなわち、本プロセスのステップ(b)、(y)又は(z)の後であるがステップ(c)の前に、トランスフェクトされる。
特に好ましい実施形態では、細胞培養は、バッチ培養、フェドバッチ培養又は連続培養として実施される。さらに好ましくは、細胞培養は、懸濁培養として実施される。好ましくは、従来の細胞培養培地は、ステップ(b)において使用される。
好ましい実施形態では、本発明のステップ(b)は、従来の細胞培養培地、好ましくはステップ(c)で使用されるような細胞培養培地中で実施される。本発明の別の実施形態では、ステップ(b)は、トランスフェクション培地中で、特に、miR、又はmiR及び場合により目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、を哺乳動物生産細胞にトランスフェクトするために好適な培地中で実施される。
適切な培養及び回収方法は、当業者に公知であり、目的タンパク質及び使用される哺乳動物生産細胞に依存し得る。
好ましい実施形態では、ステップ(c)において生産された目的タンパク質は、培養ステップ(c)の間に存在する他の成分から、好ましくはタンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞から、目的タンパク質を単離、好ましくは精製することによって、ステップ(d)において回収される。ステップ(d)に従って回収した後に得られた目的タンパク質は、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を実質的に含まず、好ましくは含まない。
目的タンパク質を回収するため、物理的又は化学的又は物理化学的方法が使用される。物理的又は化学的又は物理化学的方法は、好ましくは、濾過法、遠心分離法、超遠心分離法、抽出法、凍結乾燥法、沈殿法、クロマトグラフィー法又はこれらの2つ以上の方法の組み合わせである。クロマトグラフィー法は、好ましくは、サイズ排除クロマトグラフィー法、疎水性相互作用クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法及び金属結合クロマトグラフィー法からなる群から選択される。
本発明はまた、目的タンパク質を発現することができる、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を調製する方法であって、以下のプロセスステップ、
(x)哺乳動物生産細胞を提供するステップ、
(y)ステップ(x)で提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRの濃度を増加させ、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を得るステップ、
(z)ステップ(y)で生産された、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を回収するステップ
を含む方法を提供することによって、その技術的課題を解決する。
(x)哺乳動物生産細胞を提供するステップ、
(y)ステップ(x)で提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRの濃度を増加させ、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を得るステップ、
(z)ステップ(y)で生産された、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を回収するステップ
を含む方法を提供することによって、その技術的課題を解決する。
従って、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を調製するための本方法は、好ましくは、増加した比タンパク質生産速度が可能な、及び/又は改善した、特に増加した細胞増殖が可能な、すなわち生細胞濃度のより高い時間積分(IVC)が可能な、改変された哺乳動物生産細胞の生産を提供する。
miR-15b及びmiR-16は、両者ともアポトーシス誘導miRであり、Bcl2などの抗アポトーシスタンパク質をコードするmRNAを標的とする。いくつかの他の遺伝子はまた、これらのmiRの標的として明らかにされている。例えば、miR-16はまた、サイクリンD1、サイクリンD3、サイクリンE1及びCDK6を制御し、細胞周期のG0/G1期で細胞を停止させることが報告されている。miR-21は、別のアポトーシス誘導miRであり、細胞増殖を阻止し、細胞死を誘導する。miR-21は、miR-15及びmiR-16のように、Bcl2 mRNAを標的とする。miR-34cは、細胞増殖に、主にp53媒介性アポトーシスに関与し、癌診断及び療法のための重要な標的となっている。miR-34は、腫瘍抑制因子であり、Notch、HMGA2、サイレント情報調節因子1(SIRT1)及びBcl-2、並びに腫瘍形成及び/若しくは発生に関連する他の遺伝子を標的とすることによってこれを達成する。
従って、本発明は、タンパク質生産を増強するための、特に哺乳動物生産細胞において目的タンパク質の大規模生産を可能にするための、手段及び方法を有利な様式で提供する。本発明はまた、改善された哺乳動物生産細胞、すなわち改変された哺乳動物生産細胞を提供し、それは、好ましい実施形態では、改善された、特に増加したタンパク質生産、及び/又は改善された、特に増加した細胞増殖を可能にするように改変されている。
本発明の文脈において、用語「目的タンパク質」は、グリコシル化、部分的グリコシル化又は非グリコシル化形態のオリゴペプチド又はポリペプチドを指すことを意味する。
用語「目的タンパク質」はまた、単数形で本明細書において使用される場合、一実施形態では、少なくとも1つの目的タンパク質、特に目的ポリペプチドを意味し、すなわち、とりわけ、2つ、3つ又はそれ以上の異なる目的タンパク質を意味する。本発明の一実施形態では、用語「目的タンパク質」は、その生産が増加する、好ましくは特異的に増加する、特にこの特定のタンパク質の生産だけが増加する、1つの特定のタンパク質を指す。特定の好ましい実施形態では、前記目的タンパク質、特にそれをコードするヌレオチド配列は、哺乳動物生産細胞、すなわち哺乳動物宿主細胞に対して内因性又は外因性タンパク質であってもよい。生産細胞株が外因性目的タンパク質を含む場合、それはトランスジェニックと称される。
本発明の文脈において、用語「内因性」タンパク質は、哺乳動物生産細胞株のゲノムにすでに存在する又はコードされているタンパク質を指し、従って、前記細胞株の外部から生じていない。
本発明の文脈において、用語「外因性」タンパク質は、組換え遺伝子技術の方法によって、例えば従来の遺伝子工学的手法、好ましくは、前記外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の形質転換、エレクトロポレーション又はトランスフェクションによって、前記哺乳動物生産細胞に存在しているタンパク質を指し、前記外因性ヌクレオチド配列は、その遺伝子工学ステップの前に、前記哺乳動物生産細胞に存在していなかった。
目的タンパク質は、遺伝子操作された、特に組換えタンパク質であってもよい。特に、タンパク質は、生物薬剤であってもよい。
特に、タンパク質は、哺乳動物、細菌、ウイルス又は植物タンパク質であり得る。好ましくは、タンパク質は、ヒト又はヒト化タンパク質である。
特に好ましい実施形態では、前記目的タンパク質は、抗体、特にmAb、抗原、ホルモン、酵素、サイトカイン、増殖因子、レポータータンパク質、選択可能マーカー、例えばGS選択マーカー、ハイグロマイシン選択マーカー、ピューロマイシン選択マーカー又はチミジンキナーゼ選択マーカー又はこれらのいずれかの構造的及び/若しくは機能的な部分若しくはハイブリッドであってよい。
特に好ましい実施形態では、前記目的タンパク質は、抗体、特にmAb、抗原、酵素、サイトカイン、増殖因子、レポータータンパク質、選択可能マーカー、例えばGS選択マーカー、ハイグロマイシン選択マーカー、ピューロマイシン選択マーカー又はチミジンキナーゼ選択マーカー又はこれらのいずれかの構造的及び/若しくは機能的な部分若しくはハイブリッドであってよい。
好ましい実施形態では、目的タンパク質は、mAb、組換え若しくはキメラ抗体、又はその断片、例えば抗体の重鎖又は軽鎖又は可変領域又は定常領域であってよい。さらに好ましい実施形態では、目的タンパク質は、成長ホルモン、インスリン、FSH(卵胞刺激ホルモン)、第VIII因子、TPO、EPO(エリスロポエチン)、G-CSF、GM-CSF、TPA(組織プラスミノーゲン活性化因子)、インターフェロンα、β又はγ、インスリン様増殖因子又はソマトロトロピン(somatrotropin)であってもよい。
好ましい実施形態では、目的タンパク質は、mAb、組換え若しくはキメラ抗体、又はその断片、例えば抗体の重鎖又は軽鎖又は可変領域又は定常領域であってよい。さらに好ましい実施形態では、目的タンパク質は、成長ホルモン、FSH(卵胞刺激ホルモン)、第VIII因子、TPO、EPO(エリスロポエチン)、G-CSF、GM-CSF、TPA(組織プラスミノーゲン活性化因子)、インターフェロンα、β又はγ、インスリン様増殖因子又はソマトロトロピン(somatrotropin)であってもよい。
本発明の好ましい実施形態では、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞は、Sox6又はBhlhe22又は両方をコードする遺伝子を含み、好ましくは発現する。好ましい実施形態では、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞は、Sox6は又はBhlhe22又は両方をコードする遺伝子を含まない。好ましくは、Sox6又はBhlhe22をコードする遺伝子の発現は、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞において部分的又は完全に抑制される。
用語「ヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、核酸、特に核酸分子、好ましくはDNA又はRNAを好ましくは指す。
本発明の文脈において、用語「哺乳動物生産細胞」は、目的タンパク質を生産することができる哺乳動物細胞、特に哺乳動物宿主細胞、特に目的タンパク質を生産することができ、かつ、本方法のプロセスステップ(b)及び(c)又は(y)に供することができる哺乳動物宿主細胞を指すことを意味する。
本発明の文脈において、用語「タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞」は、提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16、miR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRの増加した濃度を有する結果であり、かつ、従って、ステップ(a)又は(x)で提供された哺乳動物生産細胞と比較して、前記少なくとも1つのmiR、特に前記miRの2つ、好ましくは前記miRの3つの増加した濃度によって特徴付けられる、改変された哺乳動物生産細胞を指すことを意味する。本「タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞」は、1つの好ましい実施形態では増加したタンパク質生産によって、一実施形態では増加したqP又はIVCによって、一実施形態では前記特徴の両方によって特徴付けられる。
本発明の好ましい実施形態では、「タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞」は、増加したqP又は増加したIVC、又はその両方を示す細胞である。
好ましい実施形態では、miR-15は、miR-15a又はmiR-15bである。
好ましい実施形態では、miR-16は、miR-16-1又はmiR-16-2である。
好ましい実施形態では、miR-34は、miR-34a、miR-34b又はmiR-34cである。
好ましい実施形態では、少なくとも1つのmiRの濃度は、miR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRで、ステップ(b)又は(y)において哺乳動物生産細胞をトランスフェクトすることによって増加する。
従って、好ましい実施形態では、哺乳動物生産細胞は、本明細書で同定された少なくとも1つのmiR又はpre-miR、好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくは3つのmiR又はpre-miRでトランスフェクトされ、その増加した濃度を得る。好ましい実施形態では、生産細胞は、少なくとも1つのpre-miRをコードするベクター(複数可)で一過的にトランスフェクトされ、一方、別の好ましい実施形態では、少なくとも1つのpre-miR(複数可)を安定に発現する細胞株が構築され、すなわち、タンパク質生産が改変された生産細胞は、それらのゲノムに安定に組み込まれた少なくとも1つのpre-miRのヌクレオチド配列を含有する。
好ましい実施形態では、少なくとも1つのmiRの濃度は、少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列を含有する少なくとも1つのベクターで、ステップ(b)又は(y)において哺乳動物生産細胞をトランスフェクトすることによって増加し、ここで、少なくとも1つのmiRは、miR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、miRの少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列を含有するベクターは、発現ベクターである。
従って、好ましい実施形態では、哺乳動物生産細胞は、本明細書で同定された少なくとも1つのmiR、好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくは3つのmiRの過剰発現を、トランスフェクトされた細胞において可能にする本ベクターの少なくとも1つでトランスフェクトされ、その増加した濃度を得る。本発明の好ましい実施形態では、濃度は一過的に増加する。本発明の別の好ましい実施形態では、濃度は安定に増加する。
少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする調節エレメントは、プロモーター、又は任意の他の発現促進若しくは発現増強エレメント、例えばエンハンサーであってよい。好ましい実施形態では、少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする調節エレメントは、プロモーター、好ましくは哺乳動物又はウイルスプロモーターである。
特に好ましい実施形態では、プロモーターは、構成的又は誘導性プロモーター、例えば、温度誘導性プロモーターであってもよい。
好ましい実施形態では、ステップ(b)又は(y)で使用される少なくとも1つのベクターは、一過的又は安定に哺乳動物生産細胞にトランスフェクトされる。
好ましい実施形態では、miRの少なくとも2つ、好ましくは(i)miR-15及びmiR-16、又は(ii)miR-15及びmiR-34、又は(iii)miR-16及びmiR-34、好ましくは3つ全て、あるいはmiRの少なくとも2つ、好ましくは3つをコードするヌクレオチド配列が、トランスフェクトされる。
好ましい一実施形態では、少なくとも2つのmiRをコードするヌクレオチド配列は、同じベクター上でトランスフェクトされ得る。別の実施形態では、少なくとも2つのmiRをコードするヌクレオチド配列の共トランスフェクションは、別々のベクター上にコードされるそれぞれ個別のmiRを用いて行われる。さらに、目的タンパク質が、少なくとも1つのmiRと一緒にトランスフェクトされる場合、それは、同じベクター上に、又は個々のベクター上にコードされ得る。
少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列の、又は少なくとも1つのmiRのトランスフェクションは、当業者に周知の従来の方法を用いて達成することができる。前記方法は、好ましくは、リポフェクタミントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ウイルス媒介トランスフェクション又は直接遺伝子導入、例えばパーティクルボンバードメントであってもよい。
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で、少なくとも1つのmiR、好ましくは少なくとも1つのpre-miRをコードするヌクレオチド配列は、哺乳動物生産細胞に一過的又は安定に含有される。
好ましい実施態様では、miRは、成熟miR、前駆体miR(pre-miR)又は一次miR(pri-miR)である。成熟miRは、好ましくは、細胞によって合成され、又は外因的に添加される化学合成オリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、哺乳動物生産細胞は、好ましくは、げっ歯類細胞、ハムスター細胞、マウス細胞又はヒト細胞、Y0細胞、COS細胞、sp2/0細胞、CHO細胞、CHO-K1細胞、若しくはCHO-K1SV細胞、DG44 CHO細胞、DUXB11 CHO細胞、CHO GSノックアウト細胞、CHO FUT8 GSノックアウト細胞、NS0細胞、PERC6細胞、HEK293細胞、HT1080細胞、又はBHK細胞である。哺乳動物生産細胞はまた、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)細胞であり得る。生産細胞はまた、非哺乳動物細胞、例えば昆虫細胞などであり得、好ましくは、生産細胞は、非ヒト細胞である。
好ましい実施形態では、哺乳動物生産細胞は、CHO細胞、NS0細胞、PERC6細胞、HT1080細胞又はベビーハムスター腎臓(BHK)細胞である。好ましい実施形態では、CHO細胞は、CHO-K1細胞、CHO-K1SV細胞、DG44 CHO細胞、DUXB11 CHO細胞、CHO GSノックアウト細胞及びCHO FUT8 GSノックアウト細胞からなる群から選択される。
CHO GSノックアウト細胞は、好ましくは、CHO-K1SV GSノックアウト細胞、好ましくはLonzaのGS Xceed(商標)である。CHO FUT8ノックアウト細胞は、好ましくは、LonzaのPotelligent(登録商標)CHOK1SVである。
本発明の文脈において、用語「細胞」は、単一の細胞を指すことを意味する。用語「細胞」はまた、細胞のプールを含んでよい、細胞株、好ましくは、不死化細胞株を指すことを意味する。
本発明は、本発明の方法のいずれか1つに従って生産される「タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞」を提供することによっても、その技術的課題を解決する。
本発明は、少なくとも1つのmiRをコードする少なくとも1つのトランスジェニック核酸配列を含む、「タンパク質生産が改変された哺乳動物生産」細胞を特に提供し、そのトランスジェニック核酸配列は、前記少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で、その細胞のゲノムに一過的又は安定に組み込まれ、少なくとも1つのmiRは、miR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される。
本発明は、少なくとも1つの哺乳動物生産細胞、少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列を含有する少なくとも1つのベクター、及び少なくとも1つのベクターで少なくとも1つの細胞をトランスフェクトするための手段を含む、哺乳動物生産細胞において目的タンパク質を生産するためのキットを特に提供し、ここで、miRは、miR-15、miR-16、miR-34からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、キットは、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第二のベクターをさらに含む。
さらなる好ましい実施形態は、従属請求項の内容である。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）哺乳動物生産細胞において目的タンパク質を生産する方法であって、以下のプロセスステップ、
(a)哺乳動物生産細胞を提供するステップ、
(b)ステップ(a)で提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRの濃度を増加させ、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を得るステップ、
(c)目的タンパク質の生産に適した条件下で、該タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を培養するステップ、及び
(d)ステップ(c)で生産された目的タンパク質を回収するステップ
を含む、方法。
（２）目的タンパク質を発現することができる、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を調製する方法であって、以下のプロセスステップ、
(x)哺乳動物生産細胞を提供するステップ、
(y)ステップ(x)で提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRの濃度を増加させ、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を得るステップ、
(z)ステップ(y)で生産された、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を回収するステップ
を含む、方法。
（３）miR-15が、miR-15a又はmiR-15bである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）miR-34が、miR-34a、miR-34b又はmiR-34cである、（１）〜（３）のいずれか一に記載の方法。
（５）前記少なくとも1つのmiRの濃度が、miR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRで、ステップ(b)又は(y)において哺乳動物生産細胞をトランスフェクトすることによって増加する、（１）〜（４）のいずれか一に記載の方法。
（６）前記少なくとも1つのmiRの濃度が、該少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列を含有する少なくとも1つのベクターで、ステップ(b)又は(y)において哺乳動物生産細胞をトランスフェクトすることによって増加し、ここで、該少なくとも1つのmiRが、miR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれか一に記載の方法。
（７）前記miRの少なくとも2つ、又は前記miRの少なくとも2つをコードするヌクレオチド配列の少なくとも2つがトランスフェクトされる、（１）〜（６）のいずれか一に記載の方法。
（８）前記miRが、成熟miR、前駆体miR又は一次miRである、（１）〜（７）のいずれか一に記載の方法。
（９）ステップ(b)又は(y)における前記少なくとも1つのmiRをコードする前記少なくとも1つのベクターが、一過的又は安定にトランスフェクトされる、（１）〜（８）のいずれか一に記載の方法。
（１０）前記哺乳動物生産細胞が、ステップ(a)若しくは(x)の前、又はステップ(b)若しくは(y)の間に、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされる、（１）〜（９）のいずれか一に記載の方法。
（１１）ステップ(b)又は(y)の後に得られたタンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞が、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされる、（１）〜（９）のいずれか一に記載の方法。
（１２）前記哺乳動物生産細胞が、CHO細胞、CHO-K1細胞、又はCHO-K1SV細胞である、（１）〜（１１）のいずれか一に記載の方法。
（１３）前記少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする前記調節エレメントが、プロモーターである、（１）〜（１２）のいずれか一に記載の方法。
（１４）前記タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞が、増加した比生産速度、又は増加した生細胞濃度の時間積分、又は両方を示す細胞である、（１）〜（１３）のいずれか一に記載の方法。
（１５）（２）〜（１４）の方法のいずれか1つに従って生産される、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞。
（１６）少なくとも1つのmiRをコードする少なくとも1つのトランスジェニック核酸配列を含む、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞であって、該トランスジェニック核酸配列は、前記少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で、その細胞のゲノムに一過的又は安定に組み込まれており、該少なくとも1つのmiRは、miR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される、細胞。
（１７）少なくとも1つの哺乳動物生産細胞、少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列を含有する少なくとも1つのベクター、及び該少なくとも1つのベクターで該少なくとも1つの細胞をトランスフェクトするための手段を含む、哺乳動物生産細胞において目的タンパク質を生産するためのキットであって、該miRは、miR-15、miR-16、miR-34からなる群から選択される、キット。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）哺乳動物生産細胞において目的タンパク質を生産する方法であって、以下のプロセスステップ、
(a)哺乳動物生産細胞を提供するステップ、
(b)ステップ(a)で提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRの濃度を増加させ、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を得るステップ、
(c)目的タンパク質の生産に適した条件下で、該タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を培養するステップ、及び
(d)ステップ(c)で生産された目的タンパク質を回収するステップ
を含む、方法。
（２）目的タンパク質を発現することができる、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を調製する方法であって、以下のプロセスステップ、
(x)哺乳動物生産細胞を提供するステップ、
(y)ステップ(x)で提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRの濃度を増加させ、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を得るステップ、
(z)ステップ(y)で生産された、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を回収するステップ
を含む、方法。
（３）miR-15が、miR-15a又はmiR-15bである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）miR-34が、miR-34a、miR-34b又はmiR-34cである、（１）〜（３）のいずれか一に記載の方法。
（５）前記少なくとも1つのmiRの濃度が、miR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される少なくとも1つのmiRで、ステップ(b)又は(y)において哺乳動物生産細胞をトランスフェクトすることによって増加する、（１）〜（４）のいずれか一に記載の方法。
（６）前記少なくとも1つのmiRの濃度が、該少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列を含有する少なくとも1つのベクターで、ステップ(b)又は(y)において哺乳動物生産細胞をトランスフェクトすることによって増加し、ここで、該少なくとも1つのmiRが、miR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれか一に記載の方法。
（７）前記miRの少なくとも2つ、又は前記miRの少なくとも2つをコードするヌクレオチド配列の少なくとも2つがトランスフェクトされる、（１）〜（６）のいずれか一に記載の方法。
（８）前記miRが、成熟miR、前駆体miR又は一次miRである、（１）〜（７）のいずれか一に記載の方法。
（９）ステップ(b)又は(y)における前記少なくとも1つのmiRをコードする前記少なくとも1つのベクターが、一過的又は安定にトランスフェクトされる、（１）〜（８）のいずれか一に記載の方法。
（１０）前記哺乳動物生産細胞が、ステップ(a)若しくは(x)の前、又はステップ(b)若しくは(y)の間に、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされる、（１）〜（９）のいずれか一に記載の方法。
（１１）ステップ(b)又は(y)の後に得られたタンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞が、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされる、（１）〜（９）のいずれか一に記載の方法。
（１２）前記哺乳動物生産細胞が、CHO細胞、CHO-K1細胞、又はCHO-K1SV細胞である、（１）〜（１１）のいずれか一に記載の方法。
（１３）前記少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする前記調節エレメントが、プロモーターである、（１）〜（１２）のいずれか一に記載の方法。
（１４）前記タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞が、増加した比生産速度、又は増加した生細胞濃度の時間積分、又は両方を示す細胞である、（１）〜（１３）のいずれか一に記載の方法。
（１５）（２）〜（１４）の方法のいずれか1つに従って生産される、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞。
（１６）少なくとも1つのmiRをコードする少なくとも1つのトランスジェニック核酸配列を含む、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞であって、該トランスジェニック核酸配列は、前記少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で、その細胞のゲノムに一過的又は安定に組み込まれており、該少なくとも1つのmiRは、miR-15、miR-16及びmiR-34からなる群から選択される、細胞。
（１７）少なくとも1つの哺乳動物生産細胞、少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列を含有する少なくとも1つのベクター、及び該少なくとも1つのベクターで該少なくとも1つの細胞をトランスフェクトするための手段を含む、哺乳動物生産細胞において目的タンパク質を生産するためのキットであって、該miRは、miR-15、miR-16、miR-34からなる群から選択される、キット。
本発明は、非限定的な実施例及び添付の図面によりさらに詳細に説明される。
以下の表1は、本発明で使用されるpre-miRプライマー(配列番号1〜12)のヌクレオチド配列を特定する。
材料及び方法：
miR及びスポンジベクター(Sponge Vector)の過剰発現のためのベクター
ヒトmiRのヘアピンを発現し、pre-miRを作製するため、miRの過剰発現のためのベクターを作製した。ピューロマイシン選択マーカーを、安定な細胞株の作製のためにベクターに含めた。miR-34cの過剰発現が遺伝子サイレンシングをもたらすことを示すために、3'-UTRにおいて相補的又はほぼ相補的miR-34c標的配列を有するレニラルシフェラーゼから構成されるスポンジベクターを使用した。
miR及びスポンジベクター(Sponge Vector)の過剰発現のためのベクター
ヒトmiRのヘアピンを発現し、pre-miRを作製するため、miRの過剰発現のためのベクターを作製した。ピューロマイシン選択マーカーを、安定な細胞株の作製のためにベクターに含めた。miR-34cの過剰発現が遺伝子サイレンシングをもたらすことを示すために、3'-UTRにおいて相補的又はほぼ相補的miR-34c標的配列を有するレニラルシフェラーゼから構成されるスポンジベクターを使用した。
細胞培養
CHO-K1接着細胞(European Collection of Cell Culture)を、500μM L-グルタミン酸及び500μMアスパラギン、200 mM L-グルタミン、ヌクレオシド(10μMのチミジンと共に30μMアデノシン、シチジン、ウリジン及びグアノシン(全てSigma))、10％(v/v)熱不活性化ウシ胎児血清(PAA laboratories)及び1％(v/v)Gibco(登録商標)非必須アミノ酸(Life Technologies, UK)を補充した、Gibco(登録商標)DMEM(Life Technologies, UK)中で培養した。CHO-K1を、空気インキュベーター中、加湿5％CO2中、37℃にてTフラスコ(75 cm2, Sartorius)中で維持した。フラスコが約80％コンフルエントになった時、細胞を分割した。現在の培地を吸引し、10mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(滅菌水100mLあたり1錠(Oxide Limited))を用いて洗浄した。PBSを吸引し、細胞を空気中5％CO2(v/v)、37℃にて2〜3分間、3mLのトリプシン(Life Technologies, UK)中でインキュベートした。次いで、10 mLの培地を、トリプシンを阻害するために添加し、細胞懸濁液を50mLのファルコンチューブに注ぎ、1000rpmで5分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、細胞ペレットを10mLの新鮮な培地に再懸濁し、細胞生存率が＞95％であったことを確認した(ViCell装置を用いて決定される)。次いで、10mLの新鮮な培地を含有する新たなT75フラスコを、T75フラスコに0.25mLの細胞懸濁液を添加することによって、播種した。
CHO-K1接着細胞(European Collection of Cell Culture)を、500μM L-グルタミン酸及び500μMアスパラギン、200 mM L-グルタミン、ヌクレオシド(10μMのチミジンと共に30μMアデノシン、シチジン、ウリジン及びグアノシン(全てSigma))、10％(v/v)熱不活性化ウシ胎児血清(PAA laboratories)及び1％(v/v)Gibco(登録商標)非必須アミノ酸(Life Technologies, UK)を補充した、Gibco(登録商標)DMEM(Life Technologies, UK)中で培養した。CHO-K1を、空気インキュベーター中、加湿5％CO2中、37℃にてTフラスコ(75 cm2, Sartorius)中で維持した。フラスコが約80％コンフルエントになった時、細胞を分割した。現在の培地を吸引し、10mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(滅菌水100mLあたり1錠(Oxide Limited))を用いて洗浄した。PBSを吸引し、細胞を空気中5％CO2(v/v)、37℃にて2〜3分間、3mLのトリプシン(Life Technologies, UK)中でインキュベートした。次いで、10 mLの培地を、トリプシンを阻害するために添加し、細胞懸濁液を50mLのファルコンチューブに注ぎ、1000rpmで5分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、細胞ペレットを10mLの新鮮な培地に再懸濁し、細胞生存率が＞95％であったことを確認した(ViCell装置を用いて決定される)。次いで、10mLの新鮮な培地を含有する新たなT75フラスコを、T75フラスコに0.25mLの細胞懸濁液を添加することによって、播種した。
GS-CHO 42、56及び114懸濁細胞(Lonza Biologics plc)を、CD CHO培地(Life Technologies, UK)中で培養した。これらは、100rpmにて空気(v/v)オービタル(orbital)振とうインキュベーター中で、加湿5％CO2において、37℃にて、エルレンマイヤーフラスコ中で日常的に維持し、2×105細胞.mL-1で最初に播種した。
GS-CHO 42及びGS-CHO 114バッチ培養
両細胞株を、大きな500mLのエルレンマイヤーフラスコ中の100mLのCD CHO培地中に3×105細胞.mL-1で最初に播種し、100rpmにて空気(v/v)オービタル振とうインキュベーター中で、加湿5％CO2において、37℃にて、インキュベートした。サンプルを細胞計数のために毎日採取した(1mL)。3、5、7、及び11日の培養時間の時点で、1×107細胞のアリコートを、miR解析のために取り出した。細胞を遠心分離によって回収し、ペレットをPBSで1回洗浄し、-70℃で保存した。上清を、分泌されたmAbの濃度を決定するために保持した。
両細胞株を、大きな500mLのエルレンマイヤーフラスコ中の100mLのCD CHO培地中に3×105細胞.mL-1で最初に播種し、100rpmにて空気(v/v)オービタル振とうインキュベーター中で、加湿5％CO2において、37℃にて、インキュベートした。サンプルを細胞計数のために毎日採取した(1mL)。3、5、7、及び11日の培養時間の時点で、1×107細胞のアリコートを、miR解析のために取り出した。細胞を遠心分離によって回収し、ペレットをPBSで1回洗浄し、-70℃で保存した。上清を、分泌されたmAbの濃度を決定するために保持した。
RNA抽出
RNA抽出を、製造業者の説明書に従って、MirVANA RNA抽出キット(Life Technologies, UK)を用いて行った。ナノドロップ装置を用いて、A260nmの波長での吸光度を測定することによって得られたRNAの量を測定した。RNA抽出物の20 ng.mL-1希釈物を、その後のqRT-PCRに使用するために調製した。miR解析のために、低分子量RNAの濃縮のための製造業者のプロトコールに従った。
RNA抽出を、製造業者の説明書に従って、MirVANA RNA抽出キット(Life Technologies, UK)を用いて行った。ナノドロップ装置を用いて、A260nmの波長での吸光度を測定することによって得られたRNAの量を測定した。RNA抽出物の20 ng.mL-1希釈物を、その後のqRT-PCRに使用するために調製した。miR解析のために、低分子量RNAの濃縮のための製造業者のプロトコールに従った。
qRT-PCR解析-TaqMan
特に明記しない限り、全てのqRT-PCR材料はApplied Biosystemsから供給された。全ての実験のために、48及び96ウェル不透明プレート及び接着シート(両方ともBio-Radから入手)と共に、2ステップTaqMan(登録商標)MicroRNA Assayキットを使用した。最初のステップは、miR逆転写キットと回収されたサンプルを含む。各ウェルを、7μLのマスターミックス、3μLの適切なプライマー(キットに提供され、それぞれのmiRについて1つ)及び5μLの10 ng.mL-1の濃度のRNAサンプルを含有するように、製造業者の指示に従って調製した。RT-PCRを以下のプログラムを使用して、Eppendorf正規のサーモサイクラーで実行した:
・30分間16℃
・30分間42℃
・5分間85℃
特に明記しない限り、全てのqRT-PCR材料はApplied Biosystemsから供給された。全ての実験のために、48及び96ウェル不透明プレート及び接着シート(両方ともBio-Radから入手)と共に、2ステップTaqMan(登録商標)MicroRNA Assayキットを使用した。最初のステップは、miR逆転写キットと回収されたサンプルを含む。各ウェルを、7μLのマスターミックス、3μLの適切なプライマー(キットに提供され、それぞれのmiRについて1つ)及び5μLの10 ng.mL-1の濃度のRNAサンプルを含有するように、製造業者の指示に従って調製した。RT-PCRを以下のプログラムを使用して、Eppendorf正規のサーモサイクラーで実行した:
・30分間16℃
・30分間42℃
・5分間85℃
次いで、第二のqRT-PCRステップを実施した。各ウェルは、1μLのTaqManマイクロRNAアッセイ(20X)、1.33μLの最初のステップに由来する生成物、10μLのTaqManユニバーサルPCRミックス、及び7.67μLのヌクレアーゼフリー水から構成された。qRT-PCR実験を、以下のPCRサイクルの詳細を使用して、Mastercycler(登録商標) Eppendorf Realplex4機器で実行した;
1. 10分間95℃
2. 15秒間95℃
3. 60秒間60℃
ステップ2及び3を40サイクル繰り返す
1. 10分間95℃
2. 15秒間95℃
3. 60秒間60℃
ステップ2及び3を40サイクル繰り返す
qRT-PCRの生成物を、10bp DNAラダー(Invitrogen)と並行して2％アガロースゲルで分析した。
各miRのコピー数を決定するために、標準曲線を、既知濃度の各miRの商業的に合成された材料を使用して作製した。標準曲線を、既知のコピー数を有するTaqMan(登録商標)MicroRNAアッセイにおける合成材料を使用して作製し、続く未知のmiR濃度を標準曲線を用いてサンプルから決定した。
時点及び細胞株の間で未成熟なPre-miRの相対濃度を決定するための、SYBRグリーンを用いたqRT-PCR解析
全ての実験のために、48及び96ウェル不透明プレート及び接着シートと共に、SYBRグリーンワンステップqRT-PCRキットを使用した。各ウェルを、12.5μLのSYBRグリーンミックス、1.5μLの適切なプライマー、0.5μLのRT酵素、2μLの2.5 ng/mLの濃度のRNA、及び8.5μLのddH2Oを含有するように調製した。この研究において使用するプライマーは、以下の表1に記載される。
全ての実験のために、48及び96ウェル不透明プレート及び接着シートと共に、SYBRグリーンワンステップqRT-PCRキットを使用した。各ウェルを、12.5μLのSYBRグリーンミックス、1.5μLの適切なプライマー、0.5μLのRT酵素、2μLの2.5 ng/mLの濃度のRNA、及び8.5μLのddH2Oを含有するように調製した。この研究において使用するプライマーは、以下の表1に記載される。
qRT-PCR実験を、以下のPCRサイクルの詳細を使用して、Mastercycler(登録商標) Eppendorf Realplex4機器で実行した;
1. 10分間50℃
2. 5分間95℃
3. 10秒間95℃
4. 30秒間58℃
ステップ3及び4を40サイクル繰り返す
・融解曲線(温度0.5℃の変化で測定)
1. 10分間50℃
2. 5分間95℃
3. 10秒間95℃
4. 30秒間58℃
ステップ3及び4を40サイクル繰り返す
・融解曲線(温度0.5℃の変化で測定)
qRT-PCRの生成物を、100bp RNAラダー(Invitrogen, Life Technologies, UK)と並行して1％アガロースゲルで分析した。
リポフェクタミントランスフェクション
6ウェルプレート中の一過的トランスフェクション実験のため、細胞株を、適切な培地を含有する6ウェルプレート(Greiner, UK)に3×105細胞.mL-1で指数増殖期で播種し、空気(v/v)インキュベーター中で加湿5％CO2において、37℃で増殖させた。2つの異なるチューブにおいて、以下を調製した; (a)4μgのDNA、及び250μLのGibco(登録商標)OptiMEM培地(Life Technologies, UK)、(b)250μLのGibco(登録商標)OptiMEM培地(Life Technologies, UK)を有する、12μLのリポフェクタミン(Invitrogen, Life Technologies, UK)。次いで、これらを、室温で5分間インキュベートし、2つのチューブを混合し、室温で20分間インキュベートした。この期間の終わりに、500μLのDNA複合体を、適切なウェルに添加した。細胞を異なる期間培養し、その後、細胞を計数し、ELISAによるmAb力価決定のために培地の一部を回収した。
6ウェルプレート中の一過的トランスフェクション実験のため、細胞株を、適切な培地を含有する6ウェルプレート(Greiner, UK)に3×105細胞.mL-1で指数増殖期で播種し、空気(v/v)インキュベーター中で加湿5％CO2において、37℃で増殖させた。2つの異なるチューブにおいて、以下を調製した; (a)4μgのDNA、及び250μLのGibco(登録商標)OptiMEM培地(Life Technologies, UK)、(b)250μLのGibco(登録商標)OptiMEM培地(Life Technologies, UK)を有する、12μLのリポフェクタミン(Invitrogen, Life Technologies, UK)。次いで、これらを、室温で5分間インキュベートし、2つのチューブを混合し、室温で20分間インキュベートした。この期間の終わりに、500μLのDNA複合体を、適切なウェルに添加した。細胞を異なる期間培養し、その後、細胞を計数し、ELISAによるmAb力価決定のために培地の一部を回収した。
96ウェルディープウェルプレート中の様々なCHO-K1SV細胞株を用いた一過的トランスフェクション実験のために、6ウェルプレート一過的トランスフェクション実験のためのプロトコールを、細胞のより多い数を考慮して調整した。375rpmにて空気(v/v)オービタル振とうインキュベーター中で、加湿5％CO2において、37℃にて、96ウェルディープウェルプレート(Nunc)中に、ウェル1つあたり0.4×106細胞で指数増殖期に細胞を播種した。0.4μgのDNA、50μLのGibco(登録商標)OptiMEM培地(Life Technologies, UK)、及び1.2μLのリポフェクタミン(Invitrogen, Life Technologies, UK)をウェル1つあたりに使用し、上記のように調製した。トランスフェクトされた細胞を異なる時間置き、その後、細胞を計数し、ELISAによって培地中のmAb力価を決定するために培地を回収した。
ELISA
mAb濃度を決定するために、一過的トランスフェクションからの100μLの上清培地を標準的なELISAベースの方法(Smales et al. 2004 Biotechnology Bioengineering 88:474-488)を用いて分析した。
mAb濃度を決定するために、一過的トランスフェクションからの100μLの上清培地を標準的なELISAベースの方法(Smales et al. 2004 Biotechnology Bioengineering 88:474-488)を用いて分析した。
統計学的解析
実験条件及び対照間でIVC、qP又は上清培地中のmAbの濃度に統計学的有意差があるかどうかを決定するために、スチューデントのt検定を実施した。p値P＜0.05(95％信頼水準で)を得た場合、変化を有意とみなした。
実験条件及び対照間でIVC、qP又は上清培地中のmAbの濃度に統計学的有意差があるかどうかを決定するために、スチューデントのt検定を実施した。p値P＜0.05(95％信頼水準で)を得た場合、変化を有意とみなした。
[実施例1]
miRCURY LNAマイクロアレイを用いたmiR標的の最初の同定
その発現がqP又はIVCのいずれかと関連し得るmiRを同定する最初の研究を、市販のmiRCURY LNAマイクロアレイアプローチ(Exiqon, Denmark)を用いて実施した。2つのアプローチを取った:
miRCURY LNAマイクロアレイを用いたmiR標的の最初の同定
その発現がqP又はIVCのいずれかと関連し得るmiRを同定する最初の研究を、市販のmiRCURY LNAマイクロアレイアプローチ(Exiqon, Denmark)を用いて実施した。2つのアプローチを取った:
(A)第1のアプローチは、バッチ及びフェッドバッチモードで10Lエアリフト(airlift)バイオリアクター中で増殖させたGS-CHOK1SV細胞株(モデル組換えキメラmAb、cB72.3を発現する)におけるmiR応答を比較することであった。フェドバッチモードは、Lonzaの一般的供給レジーム(一般的プロセス-バージョン6)を使用した。GS-CHOK1SV 42細胞株(キメラmAb、cB72.3を生産する)について、3つのバッチモードバイオリアクター(n=3)を、3つのフェドバッチモードリアクター(n=3)と比較した。各増殖曲線上の5点をサンプリングするために選択した(表2)。点1〜3について、RNAサンプルを全ての6個のバイオリアクターから調製した(1＝供給1の投与直前(供給1前)、2＝供給1の48時間後、及び3＝ピーク生細胞濃度)。ピークの後、無供給(バッチモード)バイオリアクターは低下し始め、このセットのバイオリアクターからそれ以上のサンプリングは採取されなかった。2つのさらなる時点を、第2の供給の投与の48時間後(4＝供給2の48時間後)、及び収穫時(5＝収穫)に、供給を受けている3つのバイオリアクター(フェドバッチモードリアクター、F17、F18及びF19)から採取した。従って、合計24サンプルを採取し、RNAを製造業者の説明書に従ってmiRNeasyキット(Qiagen)を用いてそれらから調製した。24個のRNA調製物のそれぞれからの5μgのRNAの混合物からなる25番目の参照サンプルを調製した。
サンプルをHY3で標識し、参照をHY5で標識し、各サンプルを24個のmiRCURY LNA(ロックド核酸)マイクロアレイ上の参照に対してハイブリダイズさせた。ここに表されるデータは、ANOVAによる比較群のリアクターからの正規化した対数中央値比(log median ratio)(ln(HY3/HY5))の値である。p＜0.05を有するもののみ(表3)を、二元階層クラスタリングアルゴリズムに入力した。この解析から、増殖段階の間、又は供給プロセスの間で発現の差を示した、いくつかの興味深いmiRクラスター(mmu-miR-21、-34b、-34c、-29a、-130a及び-193を含む)を同定した。アレイ研究で同定されたmiRは、細胞周期及びアポトーシスの制御に関与し得る。大きな変化は、mmu-miR-34b及び-34cの量に観察された。miR mmu-miR-34a、-34b及び-34cは全て密接に関連し、miR-34aはアポトーシス及びG1停止をもたらすp53に対する標的であることが知られている。
(B)第2のアプローチは、異なるcB72.3 mAb生産性を有する10個のGS-CHOK1SV細胞株の一団にわたってmiRをプロファイリングすることであった。これは、バッチ懸濁培養においてcB72.3 mAbについて様々な生産性を有する10個のGS-CHO細胞株の3重のバッチ振とうフラスコ培養物から採取した細胞サンプルを分析することによって行った(表4)。
RNAを、指数増殖期の間に収集された細胞ペレットから抽出し、miRCURY LNAマイクロアレイ(Exiqon, Denmark)上で分析に供した。細胞株を、バッチ懸濁培養物からのcB72.3濃度に基づいて、ランク付けし、2つの等しいサイズのグループに分けた(表4: 「低」生産細胞株: 153、1、142、54、114; 「高」生産細胞株: 40、137、149、42、47)。次いで、各miRについての正規化した対数中央値発現比(ln(HY3/HY5))を解析し、生産性との関係を同定した。miRプロファイリングは、マウスアノテーションを用いて高及び低生産グループにおいて異なって発現される、miRCURY(商標)マイクロアレイによって分析されたmiRの総数のサブセット(15)を同定し、ヒトアノテーションを用いて18個のmiRを同定した。ヒト及びマウスアノテーションについてのヒートマップダイアグラムを作製した。ヒト及びマウスアノテーションに由来するANOVAからのp値は、表5及び6に報告される。
これらの最初のマイクロアレイ研究から、増殖(miR-21、miR-34c)又は生産性(miR-15b、miR-16及びmiR-186)に関連した発現増加を示した5個のmiRが同定された。
[実施例2]
バッチ培養にわたる、並びに「高」及び「低」生産組換えmAb生産GS-CHOK1SV細胞株における、内因性miR発現レベルの検証
実施例1に記載したように、miRCURY LNAマイクロアレイシステムを用いて、その発現がIVC又はqPのいずれかと関連し得る、いくつかのmiRを同定し、4つの標的miR、すなわち、miR-15b、miR-16、miR-21及びmiR-34cを、GS-CHOK1SV細胞株における組換えタンパク質発現に対するそれらの影響に関してさらに分析した。
バッチ培養にわたる、並びに「高」及び「低」生産組換えmAb生産GS-CHOK1SV細胞株における、内因性miR発現レベルの検証
実施例1に記載したように、miRCURY LNAマイクロアレイシステムを用いて、その発現がIVC又はqPのいずれかと関連し得る、いくつかのmiRを同定し、4つの標的miR、すなわち、miR-15b、miR-16、miR-21及びmiR-34cを、GS-CHOK1SV細胞株における組換えタンパク質発現に対するそれらの影響に関してさらに分析した。
Jadhavら(2012 Biotechnology and Bioengineering 109:1376-1385)によって概説されるものと同様のアプローチを用いて、実施例3〜5で一過的トランスフェクションによってmiRのレベルを操作する前。マイクロアレイ結果が、qRT-PCRによる組換えGS-CHOK1SV細胞株における標的miRの測定と一致したことを示すことがまず必要であった。これを達成するため、生産性(表4)及びIVC(図1を参照)において異なるこの3つの細胞株をさらなる分析のために選択した(実施例1b)。サンプルを、miR量などの分析のために矢印で示した点で培養にわたって採取した(各点において設定した数の細胞)。
MirVANA RNA抽出キットを使用してmiR抽出が完了した後、miR量を、市販の2ステップTaqMan(登録商標)MicroRNAアッセイキット(Applied Biosystems)を用いて決定した。各サンプル中の成熟miRの濃度を決定するために、標準曲線を各miRについて作製した。
このqRT-PCRを用いて、GS-CHOK1SV細胞株における4つの標的miRの濃度を、Lonza cB72.3生産GS-CHOK1SV細胞株: GS-CHO 42(「高」生産)及びGS-CHO 114(「低」生産)においてバッチ培養にわたって決定した。得られたデータは、マイクロアレイデータと矛盾しなかった。図2〜5におけるデータは、(A)β-アクチンに対して正規化し、回収された1日目のサンプルと比較した、未成熟pre-miRの量、及び(B)様々な時点で標準曲線から決定された成熟miRの濃度を示す。
バッチ培養にわたる2つの試験細胞株におけるmiR-15bの濃度は、図2に報告される。両細胞株におけるpre-miR量は、培養にわたって同様のプロファイルを示したが(図2A)、120時間及び168時間のサンプルにおけるpre-miR-15bの量は、「高」生産細胞株についてより高かった。データから分かるように、成熟miRの量の傾向は、2つの細胞株間で異なり、「低」生産では培養にわたって減少し、「高」生産では培養の終わりに現れただけだった(図2B)。従って、pre-miR-15b及び成熟miR-15bの量の間には関係がなかった。このデータは、miR-15bのレベルが、バッチ培養の4日目にいくつかの「高」生産細胞株において上昇したマイクロアレイデータと一致した。
バッチ培養にわたる「高」及び「低」生産細胞株におけるpre-miR-16の相対量及びmiR-16の濃度は、図3に報告される。「高」生産において、培養にわたり、「低」生産より40〜50％多くのpre-miR-16-1が存在する(図3A)。両細胞株についてpre-miR-16の相対量は、168時間(pre-miR-16-1について)及び120時間(pre-miR-16-2について)でピークに達し(それぞれ、図3A及び3B)、それらのプロファイルは、pre-miR-15bについて観察されるものと同様であった(図2A)。しかし、再び、成熟miR-16のプロファイルは異なった。両細胞株において成熟miRの濃度は培養にわたって減少したが、濃度は「高」生産細胞株において常により高かった(図3C)。これは、miR-16が、培養の4日目にいくつかの「高」生産細胞株において上昇することを示すマイクロアレイデータと一致する。
バッチ培養にわたる高及び低生産細胞株におけるpre-miR-21の相対量及びmiR-21の濃度は、図4に報告される。72及び120時間の培養時間の間に、pre-miR-21は、「低」生産細胞株において大きな増加を示したが、「高」生産細胞株は、120時間と168時間の培養の間にのみ増加したpre-miR-21のより低い相対量を有した(図4A)。「低」生産細胞株におけるmiR-21の濃度は、168時間の培養時間まで増加し、その後168時間と264時間の培養時間の間に減少するが、「高」生産細胞株では、miR-21の濃度は、培養にわたって増加し続ける(図4B)。
バッチ培養にわたる「高」及び「低」生産細胞株におけるpre-miR-34cの相対量及びmiR-34cの濃度は、図5に報告される。pre-miR34-c及び成熟miR-34cに関して「高」及び「低」生産細胞株の間で異なる傾向が観察された(図5)。両細胞株におけるpre-miR-34cの相対量は、培養にわたって同様のプロファイルを示したが(図5A)、120時間及び168時間のサンプルにおけるpre-miR-34cの相対量は、「高」生産細胞株についてより高かった。両細胞株について、pre-miR-34cの相対量のプロファイルは、成熟miR-34cの濃度のプロファイルを反映することが観察された。「高」生産細胞株では、pre-miR-34cの量は、培養にわたって増加するように見え、「低」生産細胞株の場合にはずっと少なくそのように見えた(図5A)。「高」生産細胞株におけるmiR-34cの濃度は、72時間及び168時間の培養時間の間に増加するが、264時間で再び低下する(図5B)。しかし、「低」生産細胞株では、miR-34cの濃度は、培養の168時間までに低下する(図5B)。
従って、上記のように、成熟miRについてのqRT-PCRデータは、マイクロアレイデータと一般的に一致した。
実施例3〜5は、成熟miRの一過的過剰発現を示し、過剰発現が、調べたGS-CHOK1SV細胞株の表現型、例えば比生産速度、qP又は生細胞濃度の積分、IVC、を変更し得ることを実証する。これらの実施例では、個々のmiR及びmiRの組み合わせの両方の一過的過剰発現を、以下のセクションに記載するように、プラスミドベースのアプローチを用いて分析した。
[実施例3]
モデルmAb(cB72.3)を発現する組換えGS-CHOK1SV細胞株における生産性に対する、外因性miR発現レベルの過剰発現の影響の調査
調べたmiRの機能的影響を確認するために、一過的研究を行った。適切なpre-miRゲノム配列が隣接したヒトpre-miRのステムループを発現するベクターを作製し、一過的発現のために使用した。予想される配列を、制限酵素消化及び配列決定によって確認した。CHO細胞におけるmiRの一過的発現は、CHOに由来するステムループを使用する場合により高いことが報告されているが、他の種もpre-miRを過剰発現するために使用することができる。しかし、外因性miRの濃度の高すぎる上昇は有害であり得るため、より低い量の過剰発現が有益であり得る。
モデルmAb(cB72.3)を発現する組換えGS-CHOK1SV細胞株における生産性に対する、外因性miR発現レベルの過剰発現の影響の調査
調べたmiRの機能的影響を確認するために、一過的研究を行った。適切なpre-miRゲノム配列が隣接したヒトpre-miRのステムループを発現するベクターを作製し、一過的発現のために使用した。予想される配列を、制限酵素消化及び配列決定によって確認した。CHO細胞におけるmiRの一過的発現は、CHOに由来するステムループを使用する場合により高いことが報告されているが、他の種もpre-miRを過剰発現するために使用することができる。しかし、外因性miRの濃度の高すぎる上昇は有害であり得るため、より低い量の過剰発現が有益であり得る。
これらのプラスミドの機能性を確認するために、CHOK1SV細胞をpre-miR-21をコードする発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。対照細胞(ブランクプラスミドでトランスフェクトした)及びpre-miR-21トランスフェクト細胞からのRNA抽出物を、ノーザンブロッティングにより分析した。成熟miR-21の量は、pre-miR-21構築物で一過的にトランスフェクトしたCHOK1SV細胞において上昇した(データは示さず)。比較的大量のpre-miRが、成熟レベルと比較して、全てのサンプルにおいて観察された。このデータは、ベクターが機能的であり、過剰発現又は「ノックアップ(knock-up)」研究のために使用できることを示す。
[実施例4]
6ウェルプレートにおける標的miRの一過的トランスフェクション及び過剰発現
ヒトpre-miR miR-15b、-16、-21及び-34cのステムループを発現する4つのベクターを構築した。これらのベクターは、マイクロアレイデータの検証で使用される「低」及び「高」生産細胞株におけるqP及びIVCに対する、外因性miRの影響を調べるために使用した(実施例4)。最初のセットの実験では、静的モードインキュベーター中の6ウェルプレートフォーマットにおいて、細胞を増殖させ、過剰発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション後に決定されるqP及びIVCに対する各ベクターの影響は、図6に示される。この細胞培養フォーマットでは、miR-15は、IVCを50％増加させる(トランスフェクタントブランクと比較して)唯一の外因的に発現されるmiRであり、「高」生産細胞株のみにおけるものであった(図6A)。qPに関しては、外因的に発現されたmiR-34cのみが、有意な増加を生じ(トランスフェクタントブランクと比較して)、これは「低」及び「高」生産細胞株の両方で生じた(図6B)。これは、miR-34cが、「高」及び「低」生産細胞株の両方に共通する、qPの決定に関与するプロセスを標的とし得ることを示唆する。
6ウェルプレートにおける標的miRの一過的トランスフェクション及び過剰発現
ヒトpre-miR miR-15b、-16、-21及び-34cのステムループを発現する4つのベクターを構築した。これらのベクターは、マイクロアレイデータの検証で使用される「低」及び「高」生産細胞株におけるqP及びIVCに対する、外因性miRの影響を調べるために使用した(実施例4)。最初のセットの実験では、静的モードインキュベーター中の6ウェルプレートフォーマットにおいて、細胞を増殖させ、過剰発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション後に決定されるqP及びIVCに対する各ベクターの影響は、図6に示される。この細胞培養フォーマットでは、miR-15は、IVCを50％増加させる(トランスフェクタントブランクと比較して)唯一の外因的に発現されるmiRであり、「高」生産細胞株のみにおけるものであった(図6A)。qPに関しては、外因的に発現されたmiR-34cのみが、有意な増加を生じ(トランスフェクタントブランクと比較して)、これは「低」及び「高」生産細胞株の両方で生じた(図6B)。これは、miR-34cが、「高」及び「低」生産細胞株の両方に共通する、qPの決定に関与するプロセスを標的とし得ることを示唆する。
これらのmiRの影響を、今回は96ウェルディープウェル振とうプレートにおいて懸濁培養で増殖させた、同じ2つのmAbを生産するGS-CHOK1SV細胞株への過剰発現ベクターの一過的発現によってさらに分析した。本特許に記載される全てのGS-CHOK1SV細胞株は懸濁培養で増殖するため、培養のこのモードは、これらの細胞株に対してより適切であり、製造プロセスにより近い。
[実施例5]
振とう96ウェルディープウェルプレートにおける標的miRの一過的トランスフェクション及び過剰発現
バイオリアクター中に見られる環境により近似し得る環境におけるmiR過剰発現、及びmiR過剰発現の組み合わせの影響を評価するために、振とう96ウェルディープウェルプレートにおいて実験を行った。cB72.3 mAbを生産するGS-CHOK1SV細胞株を、1つのmiRをコードする単一のベクターで別々に、又は2つ若しくは3つのmiRをコードするベクターが組み合わされた共トランスフェクションにおいて、懸濁液において一過的にトランスフェクトした。単一トランスフェクションについて、細胞及び培養培地をトランスフェクション後48時間でサンプリングし、共トランスフェクションはトランスフェクション後48時間又は96時間のいずれかでサンプリングした。各トランスフェクションについて、増殖(IVC)及び生成物力価(ELISAにより決定される)を決定した。3つの異なるcB72.3生産GS-CHOK1SV細胞株を使用して、任意の観察された影響が、細胞株特異的であったかどうかを決定した: それぞれ「高」及び「低」生産株CHO 42及びCHO 114に加えて、「中」生産細胞株と見なされたCHO-56。
振とう96ウェルディープウェルプレートにおける標的miRの一過的トランスフェクション及び過剰発現
バイオリアクター中に見られる環境により近似し得る環境におけるmiR過剰発現、及びmiR過剰発現の組み合わせの影響を評価するために、振とう96ウェルディープウェルプレートにおいて実験を行った。cB72.3 mAbを生産するGS-CHOK1SV細胞株を、1つのmiRをコードする単一のベクターで別々に、又は2つ若しくは3つのmiRをコードするベクターが組み合わされた共トランスフェクションにおいて、懸濁液において一過的にトランスフェクトした。単一トランスフェクションについて、細胞及び培養培地をトランスフェクション後48時間でサンプリングし、共トランスフェクションはトランスフェクション後48時間又は96時間のいずれかでサンプリングした。各トランスフェクションについて、増殖(IVC)及び生成物力価(ELISAにより決定される)を決定した。3つの異なるcB72.3生産GS-CHOK1SV細胞株を使用して、任意の観察された影響が、細胞株特異的であったかどうかを決定した: それぞれ「高」及び「低」生産株CHO 42及びCHO 114に加えて、「中」生産細胞株と見なされたCHO-56。
(i)CHO 42(「高」mAb生産)
pre-miR-34cとpre-miR-15b、pre-miR-15bとpre-miR-16、又はpre-miR-16とpre-miR-34cのいずれかをコードする別々のベクターで一過的に共トランスフェクトしたCHO 42細胞は全て、トランスフェクション後96時間の培養培地中の濃度mAbにおいて、統計学的に有意な増加(それぞれ、20.77％、33.24％及び38.7％)を示した(図7)。
pre-miR-34cとpre-miR-15b、pre-miR-15bとpre-miR-16、又はpre-miR-16とpre-miR-34cのいずれかをコードする別々のベクターで一過的に共トランスフェクトしたCHO 42細胞は全て、トランスフェクション後96時間の培養培地中の濃度mAbにおいて、統計学的に有意な増加(それぞれ、20.77％、33.24％及び38.7％)を示した(図7)。
(ii)CHO 56(「中」mAb生産)
pre-miR-15bとpre-miR-16、pre-miR-16とpre-miR-34c、又はpre-miR-16及びpre-miR-34cと共にpre-miR-15bをコードする別々のベクターで一過的に共トランスフェクトしたCHO 56細胞は全て、トランスフェクション後96時間の培養培地中のmAb濃度において、統計学的に有意な増加(それぞれ、58.7％、57.8％及び71.1％)を示した(図8)。
pre-miR-15bとpre-miR-16、pre-miR-16とpre-miR-34c、又はpre-miR-16及びpre-miR-34cと共にpre-miR-15bをコードする別々のベクターで一過的に共トランスフェクトしたCHO 56細胞は全て、トランスフェクション後96時間の培養培地中のmAb濃度において、統計学的に有意な増加(それぞれ、58.7％、57.8％及び71.1％)を示した(図8)。
(iii)CHO 114(「低」mAb生産)
CHO 114細胞株の場合では、pre-miR-34をコードするベクターでトランスフェクトされたもののみが、トランスフェクション後48時間の培養培地中のmAb濃度において、統計学的に有意な増加を示した(図9A)。しかし、トランスフェクション後96時間までに、全ての共コトランスフェクションの組み合わせは、様々な程度まで、培養培地中に分泌されたmAbの濃度における統計学的に有意な増加を示した(図9B)。
CHO 114細胞株の場合では、pre-miR-34をコードするベクターでトランスフェクトされたもののみが、トランスフェクション後48時間の培養培地中のmAb濃度において、統計学的に有意な増加を示した(図9A)。しかし、トランスフェクション後96時間までに、全ての共コトランスフェクションの組み合わせは、様々な程度まで、培養培地中に分泌されたmAbの濃度における統計学的に有意な増加を示した(図9B)。
異なる細胞株における一過的研究からの組み合わせたデータは、pre-miR-15b、pre-miR-16若しくはpre-miR-34cのいずれかの個々の過剰発現、又はこれらの組み合わせが、異なる生産性で同じmAbを生産する1つ以上の細胞株における組換えmAb発現に影響を与え得ることを示す。
このトランスフェクタントをさらに調べるために、個々のpre-miRを安定に過剰発現するように改変されたCHOK1SV宿主からプールを作製した。
[実施例6]
個々のmiRを安定に過剰発現するように改変されたCHOK1SV宿主プールの作製
個々のpre-miRを過剰発現するトランスフェクトプールを、CHOK1SV宿主細胞(Lonza Biologics)において作製した。これを達成するために、ピューロマイシン選択マーカーをさらに含有する、様々なpre-miRをコードする上述のベクターを使用した。これらのベクターを、Lonza CHOK1SV宿主細胞株にエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、その後、ピューロマイシン含有培地中での選択が続いた。特定の成熟miR(すなわち、トランスフェクトされたベクターによってpre-miRの形態でコードされ、細胞によって成熟miR形態にプロセシングされたもの)の量が、プールにおいて上昇したことを確認するために、ピューロマイシン耐性プールを、増殖(図10)及びmiR含有量(図11)について分析した。バッチ培養の間、対照プール(すなわち、pre-miRをコードしない、ピューロマイシンマーカーを含有する同じベクターで別々にトランスフェクトしたCHOK1SV)と比較して、プールの増殖特性に有意差はなかった。しかし、各プールにおける特定のmiR(プールを作製するために使用されたpre-miRコードベクターに関連した)の濃度は、対照プール及び元のCHOK1SV宿主と比較して、全てのプールで2〜3倍増加した(図11)。
個々のmiRを安定に過剰発現するように改変されたCHOK1SV宿主プールの作製
個々のpre-miRを過剰発現するトランスフェクトプールを、CHOK1SV宿主細胞(Lonza Biologics)において作製した。これを達成するために、ピューロマイシン選択マーカーをさらに含有する、様々なpre-miRをコードする上述のベクターを使用した。これらのベクターを、Lonza CHOK1SV宿主細胞株にエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、その後、ピューロマイシン含有培地中での選択が続いた。特定の成熟miR(すなわち、トランスフェクトされたベクターによってpre-miRの形態でコードされ、細胞によって成熟miR形態にプロセシングされたもの)の量が、プールにおいて上昇したことを確認するために、ピューロマイシン耐性プールを、増殖(図10)及びmiR含有量(図11)について分析した。バッチ培養の間、対照プール(すなわち、pre-miRをコードしない、ピューロマイシンマーカーを含有する同じベクターで別々にトランスフェクトしたCHOK1SV)と比較して、プールの増殖特性に有意差はなかった。しかし、各プールにおける特定のmiR(プールを作製するために使用されたpre-miRコードベクターに関連した)の濃度は、対照プール及び元のCHOK1SV宿主と比較して、全てのプールで2〜3倍増加した(図11)。
外因性miR-34cを発現するプールの性能を試験するために、それを、3'-UTRにおけるスポンジ配列(すなわち、相補的又はほぼ相補的miR標的配列; Ebert M.S. et al. 2007 Nature Methods 4:721-726)有り又は無しのルシフェラーゼレポーター遺伝子で一過的にスーパートランスフェクトした(図12)。miR-34cレベルがプールにおいて上昇するように見えるため、これは、対照に比べて低いレポーター活性をもたらすはずである。これがレポーター遺伝子活性にさらなる影響を有するかどうか決定するため、安定したプールをまた、miR-34cをコードする同じベクター(プールを作製するために使用された)で一過的にスーパートランスフェクトした。図12に示すように、ルシフェラーゼレポーターをmiR-34c発現プールにトランスフェクトした場合、miR-34c配列の存在は、約65％のルシフェラーゼ発現の減少をもたらし、過剰発現されたpre-miR-34cの成熟miR-34cへのプロセシングと一致した。追加のpre-miR-34cをコードするベクターをプールにトランスフェクトしたとき、標的配列がルシフェラーゼレポーター転写カセット中に存在した場合に、ルシフェラーゼレポーター発現のさらなる低下が唯一観察された(図12)。レポーター活性は、対照細胞株と比較して、pre-miR-34c安定プールにおいてのみ上昇した。この観察は、培地中のmAbの濃度の増加が観察された、mAb生産細胞株におけるmiR-34cの一過的過剰発現時に観察された結果と一致している。これらの結果は、pre-miR-34c過剰発現が、増強された導入遺伝子発現を導くこと(外因性pre-miR-34cの成熟miR-34cへの成功した細胞プロセシングを介する)、及びCHOK1SV細胞が、pre-miR-34cを機能的成熟miR-34cにプロセシングする能力があること(成熟miRについて特異的なqRT-PCRアッセイによって決定されるように)を示す。
Claims (13)
- 哺乳動物生産細胞において目的タンパク質を生産する方法であって、以下のプロセスステップ、
(a)哺乳動物生産細胞を提供するステップ、
(b)miR-15、miR-16、miR-15＋miR-34及びmiR-16＋miR-34から成る群から選択される少なくとも1つのmiRで、又はmiR-15、miR-16、miR-15＋miR-34及びmiR-16＋miR-34から成る群から選択される少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列を含有する少なくとも1つのベクターで、哺乳動物生産細胞をトランスフェクトすることによって、ステップ(a)で提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16、miR-15＋miR-34及びmiR-16＋miR-34から成る群から選択される少なくとも1つのmiRの濃度を増加させ、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を得るステップ、
(c)目的タンパク質の生産に適した条件下で、該タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を培養するステップ、及び
(d)ステップ(c)で生産された目的タンパク質を回収するステップ
を含み、ステップ(b)の後に得られた該タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞が、ステップ(c)の前のいずれかの段階で目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされ、且つ、該哺乳動物生産細胞がCHO細胞、CHO-K1細胞又はCHO-K1SV細胞である、前記方法。 - 目的タンパク質を発現することができる、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を調製する方法であって、以下のプロセスステップ、
(x)哺乳動物生産細胞を提供するステップ、
(y)miR-15、miR-16、miR-15＋miR-34及びmiR-16＋miR-34から成る群から選択される少なくとも1つのmiRで、又はmiR-15、miR-16、miR-15＋miR-34及びmiR-16＋miR-34から成る群から選択される少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列を含有する少なくとも1つのベクターで、哺乳動物生産細胞をトランスフェクトすることによって、ステップ(x)で提供された哺乳動物生産細胞においてmiR-15、miR-16、miR-15＋miR-34及びmiR-16＋miR-34から成る群から選択される少なくとも1つのmiRの濃度を増加させ、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を得るステップ、
(z)ステップ(y)で生産された、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞を回収するステップ
を含み、ステップ(y)の後に得られた該タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞が、ステップ(z)の前のいずれかの段階で目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされ、且つ、該哺乳動物生産細胞がCHO細胞、CHO-K1細胞又はCHO-K1SV細胞である、前記方法。 - miR-15がmiR-15a又はmiR-15bである、請求項１又は２記載の方法。
- miR-34がmiR-34a、miR-34b又はmiR-34cである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- 前記miRの少なくとも2つ、又は前記miRの少なくとも2つをコードするヌクレオチド配列の少なくとも2つがトランスフェクトされる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
- 前記miRが成熟miR、前駆体miR又は一次miRである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
- ステップ(b)又は(y)における前記少なくとも1つのmiRをコードする前記少なくとも1つのベクターが一過的又は安定にトランスフェクトされる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
- 前記哺乳動物生産細胞が、ステップ(a)若しくは(x)の前、又はステップ(b)若しくは(y)の間に、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされる、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする前記調節エレメントがプロモーターである、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
- 前記タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞が、増加した比生産速度、又は増加した生細胞濃度の時間積分、又は両方を示す細胞である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
- 請求項２〜１０の方法のいずれか1つに従って生産される、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞であって、
(a)目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターと、
(b)miR-15、miR-16、miR-15＋miR-34及びmiR-16＋miR-34から成る群から選択される少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で該少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列を含有する少なくとも1つのベクターと、
を含む、前記細胞。 - 目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するベクター及び少なくとも1つのmiRをコードする少なくとも1つのトランスジェニック核酸配列を含有する少なくとも1つのベクターを含む、タンパク質生産が改変された哺乳動物生産細胞であって、該トランスジェニック核酸配列は、前記少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で、その細胞のゲノムに一過的又は安定に組み込まれており、該少なくとも1つのmiRはmiR-15、miR-16、miR-15＋miR-34及びmiR-16＋miR-34から成る群から選択され、且つ、該哺乳動物生産細胞はCHO細胞、CHO-K1細胞又はCHO-K1SV細胞である、前記細胞。
- 少なくとも1つの哺乳動物生産細胞、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する第１のベクター、少なくとも1つのmiRの過剰発現を可能にする少なくとも1つの調節エレメントの制御下で少なくとも1つのmiRをコードするヌクレオチド配列を含有する少なくとも1つの第２のベクター、及び該第１及び第２のベクターで該少なくとも1つの細胞をトランスフェクトするための手段を含む、哺乳動物生産細胞において目的タンパク質を生産するためのキットであって、該miRはmiR-15、miR-16、miR-15＋miR-34及びmiR-16＋miR-34から成る群から選択され、且つ、該哺乳動物生産細胞はCHO細胞、CHO-K1細胞又はCHO-K1SV細胞である、前記キット。
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