JP2012517230A - RNAiに基づく選択システム - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、RNAi選択可能マーカー遺伝子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を選択するために好適な新規の選択システムに関する。本発明は、好適な発現ベクター、宿主細胞、および各発現ベクターを含む宿主細胞の選択方法を提供する。さらに、本発明は、RNAiレスキュー実験を行うための方法と共に、目的のポリペプチドを産生する方法に関する。
RNA干渉(RNAi)は、脊椎動物および無脊椎動物における機能的ゲノム研究のツールとして広く使用されるようになった。RNAiは、RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)によって対応するmRNAの破壊を引き起こす、相同性の低分子干渉dsRNA(例えば、siRNA)を介して遺伝子をサイレンシングすることによってはたらく。遺伝子発現に対するRNAiの選択的かつ強固な効果は、それを、細胞培養物および生きている生物の両方における貴重な研究手段としている。細胞に導入された合成dsRNAは、目的の具体的な遺伝子の抑制を誘導することができる。細胞の表現型に対するこれらの遺伝子の効果は、その後、遺伝子サイレンシングの効果を研究することによって解析され得る。また、RNAiは、細胞における各遺伝子を系統的にシャットダウンする大規模スクリーニングについて使用されてもよく、それは、特定の細胞プロセスや例えば細胞分裂等の事象に必要な構成成分の同定に役立つことができる。
本発明は、発現ベクターにより首尾よく形質移入された宿主細胞を選択するために好適な新規の選択システムに関する。
a)宿主細胞集団を提供すること(前記宿主細胞は少なくとも1種の細胞の生存に必須の遺伝子を内因性に発現する);
b)前記宿主細胞に発現ベクターを導入すること(ここで、前記発現ベクターは、前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする、少なくとも1種の組換えポリヌクレオチドを含む)
c)該宿主細胞を選択条件下で培養すること(ここで、該選択条件は、少なくとも、前記宿主細胞への少なくとも1種のRNAi誘導化合物の導入を含み、ここで、前記RNAi導入化合物は、少なくとも、前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子を標的とする)。
a)細胞の生存に必須の遺伝子を内因性に発現する宿主細胞へ発現ベクターを導入すること(ここで、前記発現ベクターが、少なくとも以下の工程を含む)。
i)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の遺伝子の産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子の産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子の産物の機能的等価物である産物をコードする組換えポリヌクレオチド;
ii)前記宿主細胞によって発現される目的の標的遺伝子の産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子の産物の変異体である産物もしくは該遺伝子の産物の等価物である産物をコードする組換えポリヌクレオチド;
b)前記宿主細胞によって発現される目的の前記標的遺伝子の発現を標的とする、RNAi誘導化合物を該宿主細胞へ導入すること;
c)選択条件下で前記宿主細胞を培養すること(ここで、該選択条件が、少なくとも1種のRNAi誘導化合物の導入を少なくとも含み、ここで該RNAi誘導化合物が、少なくとも、該宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の遺伝子を標的とする)。
a)宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の遺伝子に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子の機能的等価物である産物をコードする組換えポリヌクレオチドを含む該宿主細胞へ導入される発現ベクター;
b)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子を標的とするRNAi誘導化合物。
本発明の1つの側面によれば、導入された発現ベクターを含む宿主細胞を選択する方法が提供され、前記方法は少なくとも以下の工程を含む:
a)宿主細胞集団を提供すること(ここで、前記宿主細胞は内因性に少なくとも1種の細胞の生存に必須の遺伝子を発現する);
b)前記宿主細胞に発現ベクターを導入すること(ここで、前記発現ベクターは、前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする、少なくとも1種の組換えポリヌクレオチドを含む)
c)前記宿主細胞を選択条件下で培養すること(ここで、該選択条件は、少なくとも、該宿主細胞への少なくとも1種のRNAi誘導化合物の導入を含み、ここで、該RNAi導入化合物は、少なくとも、該宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子を標的とする)。
対応するmRNA転写物に結合するsiNA等の適切なRNAi誘導化合物は、先行技術において周知であって、十分に確立されている方法に従って選択された標的配列に基づいて設計され得る。RNAi誘導化合物による対応する転写物の標的化は、効率的な遺伝子サイレンシングを結果として生じる。記載された標的配列は、内因性に発現される遺伝子の転写物の3’UTRに位置される。
―目的産物を前記細胞培養媒体からおよび/または前記宿主細胞から単離すること;および/または
―単離された目的産物を処理すること。
a)細胞の生存に必須の遺伝子を内因性に発現する宿主細胞へ発現ベクターを導入すること(ここで、前記発現ベクターが、少なくとも以下を含む)。
i)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子の産物に対応する、および/または機能的変異体もしくは機能的等価物である産物をコードする組換えポリヌクレオチド;
ii)前記宿主細胞によって発現される目的の標的遺伝子の産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子の産物の変異体である産物もしくは該遺伝子の産物の等価物である産物をコードする組換えポリヌクレオチド;
b)前記宿主細胞によって発現される目的の前記標的遺伝子の発現を標的とする、RNAi誘導化合物を該宿主細胞へ導入すること;
c)選択条件下で前記宿主細胞を培養すること(ここで、該選択条件が、少なくとも1種のRNAi誘導化合物の導入を少なくとも含み、ここで、該RNAi誘導化合物が、少なくとも、該宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の遺伝子を標的とする)。
a)宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の遺伝子に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子の機能的等価物である産物をコードする組換えポリヌクレオチドを含む、該宿主細胞へ導入される発現ベクター;
b)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子を標的とするRNAi誘導化合物。
Claims (14)
- 以下の工程を含む、導入された発現ベクターを含む宿主細胞を選択するための方法:
a)宿主細胞集団を提供すること(ここで、該宿主細胞は少なくとも1種の、細胞の生存に必須の遺伝子を内因性に発現する);
b)前記宿主細胞に発現ベクターを導入すること(ここで、該発現ベクターは、該宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする、少なくとも1種の組換えポリヌクレオチドを含む);
c)前記宿主細胞を選択条件下で培養すること(ここで、該選択条件は、少なくとも、該宿主細胞への少なくとも1種のRNAi誘導化合物の導入を含み、ここで、該RNAi導入化合物は、少なくとも、該宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子を標的とする)。 - 前記方法が、以下の特徴のうち少なくとも1つを有する、請求項1に記載の方法:
a)選択的成長条件を生存する少なくとも1種の宿主細胞を選択する;および/または
b)効率的に前記発現ベクターを取り込まなかった宿主は、前記選択的培養条件下で生存しない;および/または
c)前記選択的培養条件が、前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の2番目の遺伝子を標的とする少なくとも1種のさらなるRNAi誘導化合物の導入を含む。 - 前記発現ベクターが以下の特徴の少なくとも1つを有する、請求項1または2に記載の方法:
a)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする前記組換えポリヌクレオチドが、RNAi選択可能マーカー遺伝子である;および/または
b)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記2番目の遺伝子の産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子の産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子の産物の機能的等価物である産物をコードするさらなる組換えポリヌクレオチドを含む;および/または
c)さらなる目的産物をコードする組換えポリヌクレオチドを含む;および/または
d)少なくとも1種の組換えポリヌクレオチドが、発現カセットに含まれる;および/または
e)少なくとも1種の組換えポリヌクレオチドが発現カセットに含まれ、ここで、該発現カセットが少なくとも1つの以下の要素を含む:
i.前記宿主細胞で機能的なプロモーターおよび/またはエンハンサー配列;
ii.転写終結シグナル;
iii.ポリA部位;
iv.イントロン;
v.分泌リーダー配列;
および/または
f)少なくとも1つの複製起点を含む;および/または
g)少なくとも1種の追加の選択可能マーカー遺伝子を含む;および/または
h)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする前記組換えポリヌクレオチドが、選択に使用される前記RNAi誘導化合物に耐性である。 - 前記RNAi誘導化合物が以下の1以上の特徴を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法:
a)前記RNAi誘導化合物が、前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする前記組換えポリヌクレオチドの転写物を標的としない;および/または
b)前記RNAi誘導化合物が、前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子の非翻訳領域を標的とする;および/または
c)前記RNAi誘導化合物が、前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする前記組換えポリヌクレオチドに存在しない、該宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の該遺伝子の非翻訳領域を標的とする;および/または
d)前記RNAi誘導化合物が、以下
i.siRNA、miRNAまたはshRNAである;および/または
ii.好ましくは18〜30ntのsiRNA二本鎖分子である;および/または
iii.ベクターによって発現される
からなる群より選択される。 - 前記宿主細胞が、以下の少なくとも1つの特徴を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法:
a)真核生物宿主細胞である;
b)昆虫細胞である;
c)哺乳類細胞である。 - 前記宿主細胞によって内因性に発現する、細胞の生存に必須の前記遺伝子が、以下の特徴の少なくとも1つを有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法:
a)そのノックダウンがアポトーシスを誘導または促進する;および/または
b)そのノックダウンが細胞周期を妨げる;および/または
c)前記遺伝子が以下からなる群より選択される。
- 目的産物を産生する方法であって、請求項1〜6のいずれか1項に従って選択された宿主細胞を、該目的産物の発現を可能とする条件下で培養することを含む方法。
- 以下の工程の少なくとも1つを含む、請求項7に記載の方法:
―前記細胞培養媒体からおよび/または前記宿主細胞から目的産物を単離する工程;および/または
―前記単離された目的産物を処理する工程。 - 以下の工程を含むRNAi実験を行う方法:
a)細胞の生存に必須の遺伝子を内因性に発現する宿主細胞へ発現ベクターを導入する工程(ここで、該発現ベクターが、少なくとも以下を含む)。
i)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の遺伝子の産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子の産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子の産物の機能的等価物である産物をコードする組換えポリヌクレオチド;
ii)前記宿主細胞によって発現される目的の標的遺伝子の産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子の産物の変異体である産物もしくは該遺伝子の産物の等価物である産物をコードする組換えポリヌクレオチド;
b)前記宿主細胞によって発現される目的の前記標的遺伝子の発現を標的とする、RNAi誘導化合物を該宿主細胞へ導入する工程;
c)選択条件下で前記宿主細胞を培養する工程(ここで、該選択条件が、少なくとも1種のRNAi誘導化合物の導入を少なくとも含み、ここで、該RNAi誘導化合物が、少なくとも、該宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の遺伝子を標的とする)。 - 工程a、bおよびcのうちの少なくとも2つまたは全てが並行してまたは連続的に行われる、請求項9に記載の方法。
- 請求項2〜6のうちの少なくとも1項に記載の選択方法が行われる、請求項9または10に記載の方法。
- 少なくとも以下を含むキット:
a)宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の遺伝子に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子の機能的等価物である産物をコードする組換えポリヌクレオチドを含む、該宿主細胞へ導入される発現ベクター;
b)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子を標的とするRNAi誘導化合物。 - 前記発現ベクターが以下の特徴の少なくとも1つを有する、請求項12に記載のキット:
a)目的の組換えポリヌクレオチドを挿入するための発現カセットを含む;および/または
b)目的の組換えポリヌクレオチドを含む;および/または
c)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする前記組換えポリヌクレオチドが、RNAi選択可能マーカー遺伝子である;および/または
d)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記2番目の遺伝子の産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子の産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子の産物の機能的等価物である産物をコードするさらなる組換えポリヌクレオチドを含む;および/または
e)少なくとも1種の組換えポリヌクレオチドが発現カセットに含まれる;および/または
f)少なくとも1種の組換えポリヌクレオチドが発現カセットに含まれ、ここで、該発現カセットが以下の要素の少なくとも1つを含む:
i.前記宿主細胞で機能的なプロモーター配列および/またはエンハンサー配列;
ii.転写終結シグナル;
iii.ポリA部位;
iv.イントロン;
v.分泌リーダー配列;
および/または
g)少なくとも1つの複製起点を含む;および/または
h)少なくとも1種の追加の選択マーカー遺伝子を含む;および/または
i)前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする前記組換えポリヌクレオチドが、選択に使用される前記RNAi誘導化合物に耐性である。 - 前記RNAi誘導化合物が以下の1以上の特徴を有する、請求項12または13に記載のキット:
a)前記RNAi誘導化合物が、前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする前記組換えポリヌクレオチドの転写物を標的としない;および/または
b)前記RNAi誘導化合物が、前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子の非翻訳領域を標的とする;および/または
c)前記RNAi誘導化合物が、前記宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の前記遺伝子によってコードされる産物に対応する産物をコードする、および/または該遺伝子によってコードされる産物の機能的変異体である産物もしくは該遺伝子によってコードされる産物の機能的等価物である産物をコードする組換えポリヌクレオチドに存在しない、該宿主細胞によって内因性に発現される、細胞の生存に必須の該遺伝子の非翻訳領域を標的とする;および/または
d)前記宿主細胞によって内因性に発現する、細胞の生存に必須の前記遺伝子が、以下の特徴の少なくとも1つを有する:
i.そのノックダウンがアポトーシスを誘導または促進する;および/または
ii.そのノックダウンが細胞周期を妨げる;および/または
iii.前記遺伝子が以下からなる群より選択される
e)前記RNAi誘導化合物が、以下からなる群より選択される:
i.siRNA、miRNAまたはshRNAである;および/または
ii.好ましくは18〜30ntのsiRNA二本鎖分子である;および/または
iii.ベクターによって発現される。
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