CN102317455B - 基于RNAi的选择系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于选择整合了表达载体的宿主细胞的基于RNAi的新型选择系统。

Description

基于RNAi的选择系统

发明领域

本发明涉及一种适用于选择包含了表达载体的宿主细胞的新型选择系统，所述表达载体包含RNAi可选择标记基因。本发明提供了合适的表达载体、宿主细胞和用于选择包含各表达载体的宿主细胞的方法。此外，本发明涉及用于进行RNAi拯救实验(rescue experiment)的方法以及用于生产感兴趣多肽的方法。

背景技术

RNA干扰(RNAi)已经成为一种广泛使用的脊椎动物和无脊椎动物中功能基因组研究工具。RNAi通过用同源的短干扰dsRNA(例如siRNA)来沉默基因起作用，该同源短干扰dsRNA通过RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex，RISC)引发相应mRNA破坏。RNAi对基因表达的选择性的和强烈的效应使其成为在细胞培养物和活的有机体中都有价值的研究工具。导入细胞的合成的dsRNA可诱导感兴趣特定基因的抑制。随后可通过研究该基因沉默的效应来分析这些基因对细胞表型的影响。RNAi也可以用作在细胞内系统化地关闭每个基因的大规模筛查，这可帮助鉴别对于具体细胞过程或事件，例如细胞分裂所必需的组分。

特别是siRNA介导的RNAi由于其优势已经成为功能基因组研究中不可或缺的工具。可获得靶向人、小鼠和大鼠基因组的每一基因的化学合成的siRNA试剂以供方便的体外递送。RNAi实验获得的数据用于支持基因如何起作用的重要结论。

因为以上原因，实验生物学中常利用RNA干扰通路研究细胞培养物和模型生物体内基因的功能。合成双链RNA，该RNA具有与感兴趣基因的靶序列互补的序列，通常是18-30聚体的，将该RNA导入细胞或有机体，其中导入的RNA被识别为外源遗传物质并激活RNAi通路。使用这个机制，研究者们可以使所靶向基因的表达剧烈减少。研究这种减少的效果可显示各靶向基因产物的生理学作用。因为RNAi无需完全消除基因表达，该技术有时称作“敲减”以便与“敲除”过程区分，后者基因的表达通过，例如在靶基因及由此的DNA中引入敲除突变而完全消除。

简易、快捷和成本效益使得RNAi成为用作基因功能缺失研究的可选方法。然而，尽管RNAi是一种有价值的工具，其在确定下游表型的特异性上也产生了一系列新问题。为了确保从RNAi实验所得出的结论是精确的，在每个RNAi实验中包含适当的对照很重要。这样的对照强化了所得出的结论并确保所进行的表达调控实验导致了预期的沉默。因此，为最大程度提高所产生数据的价值，合适的实验对照是极为重要的。

最近的出版物报道了RNAi诱导化合物除了作用于靶基因还导致其他基因在RNA以及蛋白水平表达变化的脱靶效应。一些作者还报道了IFN反应机器中涉及的基因诱导，进一步挑战了RNAi在功能缺失研究中的可信度。由于这些问题，对照试验因此对于确认RNAi表型的特异性极为重要。一种确定功能缺失表型特异性的可靠的方法是拯救实验。拯救实验依赖靶基因以RNAi介导化合物(例如siRNA)耐受形式的表达。这样，再导入的拯救基因应当对RNAi介导化合物有抗性。理想情况下，该拯救基因也应该在生理范围内表达。对于重要的模型生物，例如酵母，采用同源重组不难实现拯救实验，从而确保拯救构建物的生理性表达。然而，哺乳动物细胞中的拯救实验常常引起特定的问题。为了使拯救基因对该RNAi介导化合物耐受，可在所靶向的区域内引入一个或多个沉默第三密码子点突变(silent third-codon point mutation)，尽管意外mRNA(fortuitous mRNA)对照也是需要的。通过利用靶向质粒/载体的拯救表达不必要的3’非翻译区(UTR)的siRNA可避免翻译效果。

因此，RNAi拯救实验在RNAi实验中用作不可或缺的对照。藉此可以分析野生型表型是否回复以及相应地，RNAi介导化合物是否是靶基因特异性的以及相应地，观察到的RNAi表型是否归因于相应靶基因的沉默。然而，在做各拯救实验来验证siRNA的特异性时，共转染siRNA和相应的重组表达的质粒来源蛋白是必要的。质粒转染率低使得拯救表型的分析复杂，因为仅转染了siRNA细胞群常常高于转染了质粒和siRNA的细胞群。由于这个事实，如果不使用高度复杂的基于细胞的实验或用技术来增加质粒转染细胞，测量逆转的表型多少是不可能的。

因此，改进现有的RNAi拯救实验是本发明的一个目标。

此外，选择整合(incorporate)了包含编码感兴趣多肽的多核苷酸的表达载体的宿主细胞对于一些应用是重要的，特别是例如在实验或工业规模表达感兴趣产物。克隆和表达感兴趣产物，例如重组肽和蛋白的能力已经变得越来越重要。纯化高水平的蛋白的能力在人类制药和生物技术领域，例如产生蛋白质药物以及在基础研究，例如结晶蛋白以便确定其三维结构是重要的。可在宿主细胞中过表达并接着分离和纯化用其他手段难以大量获取的蛋白。

生产重组蛋白的表达系统的选择取决于许多因素，包括细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、翻译后修饰和感兴趣蛋白的生物活性、以及生产治疗性蛋白的管理问题和经济考虑。哺乳动物细胞相比于其他表达系统，诸如细菌或酵母表达系统的核心优势是能进行适当的蛋白折叠、复杂的N-连接糖基化和真正的O-连接糖基化、以及广谱的其他翻译后修饰。由于所述优势，真核细胞，特别是哺乳动物细胞是目前选用于生产复杂的治疗性蛋白，诸如单克隆抗体的表达系统。

获得表达(产物)的宿主细胞的最常见方法产生用于表达感兴趣产物的合适表达载体作为第一步。所述表达载体驱动编码感兴趣产物的多核苷酸在宿主细胞的表达并提供至少一个可选择标记以产生重组细胞系。哺乳动物表达载体的核心组件通常包括具有强转录活性的组成型或诱导型启动子；通常包括Kozak序列的优化的mRNA加工和翻译信号、翻译终止密码子、mRNA剪切和聚腺苷酸化信号、转录终止子和为了制备稳定细胞系以及若需要用于基因扩增的可选择标记；此外表达载体可提供用于载体在细菌内增殖的原核复制起点以及可选择标记。

近年来研发的关注点集中到了设计在宿主内特别是在哺乳动物细胞内基因表达的改良载体。尽管有太多载体可用，然而，在哺乳动物细胞内稳健地生产高产量的多肽/蛋白仍然具有挑战。

为获得高产量地表达感兴趣产物的宿主细胞，可选择标记和选择系统广泛应用于遗传工程、重组DNA技术和重组产物的生产中。各种系统也可用于产生并识别稳定或瞬时转染克隆。使用各种可选择标记和选择系统的首要目标是导入可选择基因，该可选择基因在暴露于选择性生长条件下时，能鉴别已整合有所述表达载体，因此能产生感兴趣重组产物的细胞。已知有数种选择系统/可选择标记用于真核生物，其中有二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)、新霉素、潮霉素等等。这些标记中的一些，诸如DHFR在暴露于选择性培养条件下时也能扩增基因。提供这样的选择压力的目的是分离表达所述可选择标记和相应地高产量表达感兴趣产物的细胞。

然而，已知的选择系统也有缺点。选择条件(例如在DHFR的情况中，使用诸如MTX等叶酸拮抗物时)对宿主细胞有一定程度的毒性并可能例如改变宿主细胞的基因组。基于抗生素的表达系统也有缺点。

因此，本发明的另一目标是提供选择整合了表达载体的宿主细胞的另一种选择系统，以及提供适用的表达载体和宿主细胞。

发明概述

本发明涉及新型选择系统，适用于选择成功转染了表达载体的宿主细胞。

根据一实施方式，提供了选择含有导入了表达载体的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供一群宿主细胞，其中所述宿主细胞内源性表达至少一种细胞存活必需的基因；

b)将表达载体导入所述宿主细胞，其中所述表达载体包括至少一种编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物，所述细胞存活必需基因由所述宿主细胞内源性表达；

c)在选择性条件下培养该宿主细胞，其中所述选择性条件包括至少将至少一种RNAi诱导化合物导入所述宿主细胞，其中所述RNAi诱导化合物至少靶向由所述由宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因。

为容许选择，表达载体包含编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是细胞存活必需基因的产物的功能变体或功能等价物，所述细胞存活必需基因由所述宿主细胞内源性表达。已整合了所述表达载体的宿主细胞对所施加的选择性培养条件有抗性，其中至少靶向由所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的至少一种RNAi诱导化合物被导入宿主细胞。成功转染了的宿主细胞包含所述表达载体并表达所述重组多核苷酸。因此，它们可以在选择性培养条件下存活，因为编码产物的所述重组多核苷酸接管了被用于选择的RNAi诱导化合物敲减的所述细胞存活必需的内源性表达基因的功能，所述产物对应于和/或是细胞存活必需的所述内源性表达基因的产物的功能变体或功能等价物。所述重组多核苷酸的表达基本上回复了被选择性RNA诱导化合物敲减的内源性表达的必需基因的功能。没有被表达载体成功转染的宿主细胞在选择性培养条件下不能存活/增殖，因为内源性表达的细胞存活必需基因被选择性RNAi诱导化合物敲减了，藉此优先诱导未转染的宿主细胞凋亡，因此从培养物中清除。因此，本发明提供了用于鉴别整合了表达载体的宿主细胞的基于RNAi的新型选择系统。

根据另一个实施方式，提供了一种生产感兴趣产物，特别是多肽的方法，包括在容许感兴趣产物表达的条件下培养根据本发明的教导选择的宿主细胞。

根据另一个实施方式，提供了进行RNAi实验的方法，所述方法包括如下步骤：

a)将表达载体导入内源性表达细胞存活必需基因的宿主细胞，其中所述表达载体至少包含

i)编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是细胞存活必需基因产物的功能变体或功能等价物，所述细胞存活必需基因由所述宿主细胞内源性表达；

ii)编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞表达的感兴趣靶基因产物的功能变体或功能等价物；

b)将靶向所述宿主细胞表达的所述感兴趣靶基因的RNAi诱导化合物导入所述宿主细胞；

c)在选择性条件下培养宿主细胞，其中所述选择性条件至少包括导入至少一种RNAi诱导化合物，其中所述RNAi诱导化合物至少靶向所述宿主细胞内源性表达的细胞存活必需基因。

本发明教导还提供了一种试剂盒，其中所述试剂盒至少装有：

a)待导入宿主细胞的表达载体，所述表达载体包含编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是细胞存活必需基因的功能变体或功能等价同物，所述细胞存活必需基因由所述宿主细胞内源性表达；

b)靶向由所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的RNAi诱导化合物。

通过随后的描述和所附权利要求，本领域技术人员会明白本申请的其他目标、特征、优点和各方面。然而，应当理解，虽然表明了本申请的优选实施方式，但以下描述、所附的权利要求和具体实施例仅是为了说明而给出。本领域技术人员阅读下文后不难明白属于本发明构思和范围内的各种改变和改进。

发明详述

根据本发明的一个方面，提供了选择包含导入的表达载体的宿主细胞的方法，所述方法至少包括如下步骤：

a)提供一群宿主细胞，其中所述宿主细胞内源性表达至少一种细胞存活必需的基因；

b)将表达载体导入所述宿主细胞，其中所述表达载体包含至少一种编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物，所述细胞存活必需基因由所述宿主细胞内源性表达；

c)在选择性条件下培养宿主细胞，其中所述选择性条件包括至少将至少一种RNAi诱导化合物导入所述宿主细胞，其中所述RNAi诱导化合物至少靶向由所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因。

根据本发明，“表达载体”特别指能携带至少一种重组多核苷酸的多核苷酸。载体的功能类似于分子运载体，将多核苷酸或其片段递送入宿主细胞。其可包含至少一个含有调控序列的表达盒，以便恰当地表达整合于其中的多核苷酸。待导入细胞的多核苷酸(例如编码感兴趣产物或可选择标记的多核苷酸)可插入所述载体的表达盒中以从其上表达。本发明的载体可以是环状或线形(化)形式，术语“载体”也包括载体片段以及人工染色体或容许转移外来核酸片段的各种类似多核苷酸。

“多核苷酸”特别指通常由一个脱氧核糖或核糖与另一个连接的核苷酸聚合物，根据具体情况指DNA及RNA。术语“多核苷酸”不包括任何大小限制，还包括了含有修饰，特别是修饰的核苷酸的多核苷酸。

“重组多核苷酸”特别指已经被或者要被，例如采用重组技术，如转染和/或转化而导入宿主细胞的多核苷酸。术语“转染”和“转化”在本文中作为同义词使用。根据实施方式，宿主可以包含或不含与所述重组多核苷酸分别相同的相应内源性多核苷酸。导入可通过，例如转染可能整合入宿主细胞基因组的合适载体来完成(稳定转染)。容许将多核苷酸导入宿主细胞的合适载体在下文详细描述并且在现有技术中已知。如果导入的多核苷酸没有插入基因组，则被称为瞬时转染。当进行瞬时转染时，导入的多聚核苷酸在后期，例如细胞经历有丝分裂时会丢失。然而，合适的载体还可保持在宿主细胞内而不整合入基因组，例如通过附加体复制。已知在现有技术中也有其他用于将多核苷酸导入宿主细胞的技术，其中一些也在随后进行了详细描述。

“细胞存活必需基因”特别指参与细胞必需过程，特别地参与细胞代谢的基因。细胞存活必需基因特别指至少在一定培养/生长条件下适当维持细胞活力的各相对必需基因。所述术语特别包括但不限于参与细胞周期、凋亡、细胞分裂、DNA转录、复制和修复或细胞分化和发育的基因。通过RNAi诱导下调、分别沉默各细胞存活必需基因导致或促进细胞死亡，特别是凋亡和/或抑制细胞生长/细胞增殖。各基因由所述宿主细胞内源性表达。术语“基因”还包括基因的功能变体或片段。细胞存活必需基因的合适实例详细描述如下。

术语“内源性表达”特别地用于各自区分本发明表达载体表达的多核苷酸基因和宿主细胞表达的基因。各内源性表达的基因最好由所述宿主细胞天然表达，但许多也可能通过重组技术，例如使用载体导入所述宿主细胞。内源性表达基因的决定性特征是其不从本发明表达载体上表达。

术语“所述产物对应于和/或是所述细胞存活必需基因产物的功能变体或功能等价物，所述细胞存活必需基因由所述宿主细胞内源表达”特别指当所述基因根据本发明教导被敲减后能回复所述细胞存活必需基因的产物的功能的产物，所述基因由宿主细胞内源性表达。下文中，我们也将所述产物称作“回复产物”。其由包含于表达载体中的重组多核苷酸编码。下文中，我们也将所述重组多核苷酸称作“回复多核苷酸(restoration polynucleotide)”。所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因被用作选择的RNAi诱导化合物靶向并因此被下调时，表达对应于和/或是所述宿主内源性表达的所述细胞存活必需基因的产物的功能变体或功能等价物的所述产物(回复产物)能回复和/或维持宿主细胞的细胞活力。因此，编码产物的重组多核苷酸(回复多核苷酸)保护宿主细胞抵抗RNAi诱导化合物的选择作用，所述RNAi诱导化合物靶向所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因产物的功能变体或功能等价物。相应地，修复多核苷酸基本上发挥类似RNAi可选择标记基因的功能，从而保护成功整合了表达载体的那些细胞抵抗选择条件，因此能选择包含表达载体的那些宿主细胞。回复多核苷酸的实例包括但不限于包含与内源性表达的细胞存活必需基因相同的编码序列的多核苷酸，编码源于不同物种的相同或同源产物以及前述物的功能变体和/或等价体的多核苷酸，包括但不限于编码包含一个或多个氨基酸突变、取代、缺失和/或添加的产物以及功能融合产物的多核苷酸。所述回复多核苷酸的决定性特征是当所述基因在选择过程中被敲减时能回复内源性表达的细胞存活必需基因的功能。

术语“选择性条件”或“选择性培养条件”特别可互换地指培养条件，其中将选择压力施加到宿主细胞上。该选择性培养条件有益于已经整合了本发明表达载体的宿主细胞的存活，因为包含所述载体的宿主细胞由于回复多核苷酸的表达而具有选择优势。根据本发明教导，所述选择性条件至少包括将至少一种RNAi诱导化合物导入宿主细胞，其中所述RNAi诱导化合物至少靶向所述由宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因，藉此选择压力施加到该宿主细胞上。

本发明涉及基于RNAi的新型选择系统以便选择成功转染了表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞内源性表达细胞存活必需基因。为容许选择，表达载体包含编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因产物的功能变体或功能等价物。整合了所述表达载体的宿主细胞由于包含回复多核苷酸而对所施加的选择性培养条件耐受。为了选择，将至少靶向所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的至少一种RNAi诱导化合物导入宿主细胞。因此，该内源性表达的细胞存活必需基因被导入的RNAi诱导化合物敲减。成功转染的宿主细胞包含所述表达载体并且相应地，表达回复多核苷酸的宿主细胞可以在选择性培养条件下存活，因为编码的回复产物接管了被RNAi诱导化合物敲减的所述内源性表达的细胞存活必需基因的功能。

因此，包含于表达载体的回复多核苷酸补偿了RNAi诱导内源性表达的细胞存活必需基因的敲减作用，从而容许该宿主细胞在选择性培养条件下存活并优先增殖。然而，未成功转染表达载体的宿主细胞不能在该选择性培养条件下存活/增殖，因为内源性表达的细胞存活必需基因被RNAi诱导化合物敲减，从而优先消除未转染的宿主细胞。因此，编码产物的重组多核苷酸基本上用作RNAi可选择标记基因，容许在选择性培养条件下选择整合了表达载体的宿主细胞，所述产物对应于和/或是所述内源性表达的细胞存活必需基因产物的功能变体或功能等价物。因此，本发明教导提供了用于鉴别和选择整合了表达载体的宿主细胞的基于RNAi的新型选择系统。

本发明的选择系统具有几个优势。例如，不用毒性物质，例如叶酸拮抗物或抗生素进行选择，所述毒性物质有改变宿主细胞的一定风险。通过使用靶向并相应敲减内源性表达的细胞存活必需基因的RNAi诱导化合物来产生选择性压力。一旦该RNAi诱导化合物被移去/不再导入宿主细胞，所述敲减是可逆转的。此外，如需要，本发明的选择系统容许使用野生型宿主细胞。

根据一实施方式，选择至少一种在选择性生长条件下存活的宿主细胞。也可能选择在选择性生长条件下存活的宿主细胞群作进一步使用。进一步使用包括，例如在如RNAi拯救实验中的表型分析和/或使用选择的各宿主细胞来生产感兴趣产物。实施数轮选择也在本发明的范围内。

“感兴趣产物”特别指所述表达载体所要表达的产物。感兴趣产物可以是，例如多肽或多聚核苷酸，如RNA。感兴趣产物优选多肽。更多的实施例描述如下。

优选地，未有效整合表达载体的宿主细胞不会在选择性培养条件下存活，例如经历凋亡。例如，取决于转染方法/系统，成功的瞬时或稳定转染至少需要确保编码产物的重组多核苷酸能被所述宿主细胞足量表达以在选择性生长条件下存活，所述产物对应与和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物。不符合这些标准的宿主细胞在选择性生长条件下优先死亡。本实施方式的优势在于只有那些成功地整合了表达载体的宿主细胞会生长并因此存在于培养物中。因此，当进行，例如RNAi拯救实验(见上下文)时，和/或当进行选择程序以选择表达并因此生产感兴趣产物的宿主细胞时，利用本发明的基于RNAi的选择系统不难确定表达载体是否成功导入宿主细胞。

细胞死亡诱导足以消除未整合表达载体的宿主细胞。在这方面，本发明的选择系统类似于依据使用诸如叶酸类似物或抗生素等毒性物质的常规选择系统。然而，因为使用RNAi诱导化合物来施加选择压力，对成功转染的宿主细胞产生永久的、相对不可逆转的损伤的风险极大降低，因为只要下调内源性表达的细胞存活必需基因的RNAi诱导化合物从培养基中消除(也见上文)，正常的细胞功能通常回复。此外，凋亡/细胞死亡是，例如通过显微技术非常容易确定的表型。特别是在贴壁细胞中，即濒死(凋亡或坏死)的细胞以非常典型的形式改变其形态，如它们会变圆并且从它们粘附的表面脱离。因此，如果需要，也可容易地目测确定宿主细胞是否整合了表达载体。

为了进一步增加选择压力，选择性条件可以包括导入靶向也由所述宿主细胞内源性表达的第二细胞存活必需基因的至少另一种选择性RNAi诱导化合物。在该实施方式中，表达载体包含编码产物的另一重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述第二细胞存活必需基因产物的功能变体或功能等价物。该实施方式由于靶向至少两个细胞存活必需基因，选择压力增加从而提供了非常严格的选择条件因而具有优势。因此，未转染细胞更快的被杀死，从而减少了用于选择所需的时间。

根据一实施方式，编码产物的重组多核苷酸(回复多核苷酸)是一种RNAi可选择标记基因，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的功能变体或功能等价物。RNAi可选择标记基因特别指提供对导入宿主细胞的RNAi诱导化合物的抗性并容许在选择条件下对整合了表达载体的宿主细胞进行选择的基因。因此，在选择性培养条件下，所述RNAi可选择标记基因促进/有益于整合了本发明表达载体的宿主细胞的细胞存活。

根据另一实施方式，表达载体包含编码感兴趣产物的多核苷酸。该实施方式对于几种本发明的基于RNAi的选择系统的应用/使用有优势。例如，当进行RNAi拯救实验时，编码感兴趣产物的多核苷酸可以是可回复在RNAi表达实验中被下调的内源性表达靶基因的功能的拯救基因。在RNAi拯救实验中，从本发明表达载体表达感兴趣产物目标在于在用于进行RNAi实验的RNAi诱导化合物对各靶基因具有足够特异性的情况下回复原始/野生型表型。藉此为进行RNAi实验提供了非常有价值的对照，并且由于基于RNAi的选择系统靶向细胞存活必需基因，因而这也确保了用于拯救/回复表型分析的宿主细胞整合了对进行各对照必需的表达载体。因此，本发明的选择方法是RNAi拯救实验的改进对照。

根据另一实施方式，表达载体包含编码意欲从宿主细胞中表达的感兴趣产物的重组多核苷酸，例如用于所述感兴趣产物的实验或工业生产。如说明书中所述，感兴趣产物，特别是多肽的表达，特别是过表达对于一些应用特别令人感兴趣，例如为了生产可在科学和/或工业中使用/分析的多肽，例如治疗性多肽。包含编码产物(对应于和/或是内源性表达的细胞存活必需基因编码的所述产物的功能变体或功能等价物)的重组多核苷酸作为RNAi可选择标记基因和包含编码感兴趣产物(例如多肽)的重组多核苷酸的表达载体提供了能依据RNAi机制选择的有价值且新颖的表达载体。

用于表达整合的多聚核苷酸的表达载体通常含有适合驱动所述多核苷酸转录的转录控制元件。各转录控制元件包括但不限于如启动子、增强子、多聚腺苷酸信号、转录暂停或终止信号。所述各元件经常形成表达盒的一部分。如果所需产物是多肽，优选包括适用的转录控制元件，例如适合募集核糖体的导致5’帽子结构的5’非翻译区以及用以终止翻译进程的终止密码子。能恰当地驱动整合的多核苷酸表达的功能表达单位在本文中也称作“表达盒”。表达载体的重组多核苷酸优选包含于表达盒中。数种实施方式是适用的，例如各多核苷酸可包含于不同的表达盒中。然而，各多核苷酸中的至少两个包含于一个表达盒中也属于本发明的范围。因此，本发明包括单以及双顺反子实施方式。

本发明的表达载体可包含至少一个启动子和/或增强子元件作为表达盒元件。尽管这两个控制元件之间的物理边界不总是清楚的，但术语“启动子”通常指核酸分子上的RNA聚合酶和/或任何相关因子结合以及转录起始的位点。增强子从时间上和从空间上增强启动子的活性。多数启动子在大多细胞类型范围内中具有转录活性。启动子可被分为两类，组成型发挥功能的和通过诱导或抑制调控的。用于在哺乳动物细胞中生产多肽的启动子应该是强启动子，优选在大多细胞类型范围内中有活性的。假如回复多核苷酸仅在选择过程中表达，优选使用在选择性生长条件下诱导并相应活化的诱导型启动子。

在多数细胞类型中驱动表达的强组成型启动子包括但不限于腺病毒主要晚期启动子、人巨细胞病毒立即早期启动子、β-肌动蛋白启动子，SV40和劳斯氏肉瘤病毒启动子、以及小鼠3-磷酸甘油酸激酶启动子、EF1a。当启动子和/或增强子从CMV、β-肌动蛋白和/或SV40之一中获取时，用本发明的表达载体可取得好的结果。转录启动子可选自下组：SV40启动子、CMV启动子、EF1阿尔法启动子、RSV启动子、BROAD3启动子、小鼠rosa 26启动子、pCEFL启动子和β-肌动蛋白启动子。

根据一实施方式，编码产物(对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物)的重组多核苷酸、编码感兴趣产物的多聚核苷酸和/或编码产物(对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的第二细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物)的重组多核苷酸在同一转录启动子的控制下。适用的启动子如上所述。在该实施方式中，从所述转录启动子控制下的各表达盒获得一个长转录物。根据一实施方式，至少一个IRES元件有功能地位于重组多核苷酸之间。从而确保可从所述转录物获取不同的翻译产物。然而，优选从不同的表达盒表达各多核苷酸。

此外，所述表达载体可包含合适的转录终止位点作为表达盒。因为从上游启动子的持续转录跨过第二转录单位，这可能抑制下游启动子的功能，本现象被称作启动子封堵(promoter occlusion)或转录干扰。该事件在原核生物和真核生物中均有描述。在两个转录单位/表达盒之间适当地放置转录终止信号可阻止启动子封堵。转录终止位点已经良好表征，而且它们整合在表达载体中已经显示对基因表达有多种有益影响。

大多数真核生物新生成的mRNA在复杂的过程中在其3′端加上多聚腺苷酸尾，该过程包括切割原始转录物和偶联的多聚腺苷酸化反应。该多聚腺苷酸尾巴有利于mRNA稳定和转移。因此，本发明载体的表达盒通常包括多聚腺苷酸化位点。可在哺乳动物表达载体中使用的有效多聚腺苷酸信号有几种，包括来源于牛生长激素(bgh)、小鼠β球蛋白、SV40早期转录单位和单纯性疱疹病毒胸腺激酶基因的多聚赖氨酸信号。然而，已知也有合成的多聚腺苷酸位点。所述多聚腺苷酸位点可选自下组：SV40多聚腺苷酸位点，诸如SV40晚期和早期多聚腺苷酸位点(见例如Subramani等，1981，Mol.Cell.Biol.854-864所描述的质粒pSV2-DHFR)，合成的多聚腺苷酸位点和bgh多聚腺苷酸位点(牛生长激素)。

此外，包含重组多核苷酸(例如编码感兴趣产物或回复多核苷酸)的表达盒可包含至少一个内含子。该实施方式特别适用于当真核生物，特别是哺乳动物宿主细胞用于表达感兴趣产物时。高等真核生物的大多数基因含有内含子，所述内含子在RNA加工过程中被移除。各构建物在转基因系统中比缺少内含子的相同构建物表达更有效率。通常，内含子被放置在开放读框的5’端，但也可以在3’端。因此，表达盒中可包含内含子以提高表达效率。所述内含子可位于启动子和或启动子/增强子元件和要表达的多核苷酸的开放读框的5’端之间。已知在本领域内有数种可与本发明联合使用的内含子。

假如表达载体用于表达意欲从培养基收获的感兴趣产物，表达盒可包含引导表达的感兴趣产物进入培养基的分泌性前导序列。现有技术中已知数种适用的前导序列。

为了使表达载体在原核生物和/或真核生物中复制，表达载体可包括适合的复制起点。

此外，本发明的表达载体还可包含编码一个或多个附加的可选择标记的一个或多个附加多核苷酸。在本发明的一个实施方式中，利用本发明系统和一个或多个不同的选择系统(例如neo/G418或DHFR/抗叶酸或谷氨酰胺合成酶系统)的共选择可被应用以进一步改进性能。附加的可选择标记可以是“真核可选择标记”，这样在其中的可选择标记容许在适合的选择条件下选择真核宿主细胞；所述标记可通过抗生素选择。所述真核可选择标记也可以是可扩增的标记。适用的系统在现有技术中已知。除了附加的真核可选择标记，也可使用原核可选择标记。“原核可选择标记”是容许在适合的选择条件下选择原核宿主细胞的可选择标记。各原核可选择标记的实施例是提供对抗生素，例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素和/或氯霉素耐受的标记并且也在现有技术中已知。

本发明的表达载体可以其环形或线形(线性化的)形式转染入宿主细胞。

如上所述，RNAi诱导化合物用于对转染的宿主细胞产生选择压力(本文中也被称作“选择性RNAi诱导化合物”)。用于选择性培养条件的RNAi诱导化合物靶向所述宿主细胞内源性表达的细胞存活必需基因。如上所述，也可以使用至少两种或更多种RNAi诱导化合物，所述RNAi诱导化合物优选地靶向宿主细胞内源性表达的不同细胞存活必需基因。通过靶向不同的必需基因，大大增加了选择压力。如上所述，所述表达载体因此包含两种相应的回复多核苷酸。此外，也可以使用至少两种不同的RNAi诱导化合物以有效诱导所述基因的敲减，所述RNAi诱导化合物靶向相同的必需基因，但是例如使用不同的靶位点。

优选地，用作选择的RNAi诱导化合物并不靶向包含于表达载体中的相应回复多核苷酸的转录物。根据该优选实施方式，用于施加选择压力的各RNAi诱导化合物只靶向宿主细胞内源性表达的细胞存活必需基因而非包含于所述表达载体中的相应回复基因。因此，根据优选的实施方式，所述回复多核苷酸对用作选择的RNAi诱导化合物有抗性，因此不被其靶向。获取这样的选择性靶向谱的方法有几种。根据一个实施方式，在回复多核苷酸的相应靶序列中提供了错配，使得回复多核苷酸对选择性RNAi诱导化合物耐受。适用的方法在现有技术中已知(也请参考本说明书)。

此外，例如来自不同物种的所述细胞存活必需基因的功能等价物可用作回复多核苷酸，其在內源性表达的基因的靶序列中不显示足够的同源性以便通过选择性RNAi诱导化合物敲减回复多核苷酸的表达。

根据另一实施方式，用于选择的所述RNAi诱导化合物靶向所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的表达产物的非翻译区(UTR)，优选转录物的3’UTR。为了容许选择性靶向内源性表达的基因，所述RNAi诱导化合物可靶向所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的非翻译区。优选地，所述非翻译区不存在于相应的回复多核苷酸中，因此该重组多核苷酸编码产物，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的功能变体或功能等价物。从而，该回复多核苷酸变得耐受并相应地对选择条件有抗性。通过适当设计表达载体不难获得各设置。

根据本发明教导可使用的RNAi诱导化合物的实例包括但不限于：小干扰核苷酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和短发卡RNA(shRNA)以及其在细胞内被加工为实际RNAi诱导化合物的前体。优选地，所述化合物是siRNA。作为siRNA，所述化合物是优选每条链具有3’突出端的双链分子。所述siRNA化合物可包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸以及修饰的核苷酸。siRNA化合物的一些实施方式和变体在现有技术中已知并且可连同本发明应用。所述siRNA的长度通常在18到35nt之间，优选在19和27nt之间。每一端的3’突出端如果存在优选2nt长，但平端分子也可使用。为了有效地诱导沉默，用作RNAi诱导化合物的siRNA与靶基因转录物的一部分实质性互补以通过RNA干扰抑制所述靶转录物的表达。在RNA水平靶向选择/确认的靶基因的靶序列的合适siRNA可通过采用合适的计算方法、实施某种设计算法来鉴定。数种方法是已知的并可与本发明联合使用以提供适用的siRNA。

为了获得上述结构的抗靶转录物的siRNA，该双链分子可被直接转染入细胞。或者，该结构可由dicer(一种将长dsRNA或小发卡RNA(shRNA)转变成siRNA的酶(见上文))加工而成。这些前体或最终的siRNA分子可外源(人工)生产并可随后通过多种转染方法导入要分析的细胞，以分析涉及凋亡的靶基因的特异性敲减。

根据另一实施方式，所述RNAi诱导化合物由载体表达。该实施方式是有优势的，因为例如外源siRNA的转染有时会有问题，因为基因的敲减效应仅是短暂的，特别是在快速分裂的细胞中。克服该挑战的一种方法是修饰该RNAi诱导化合物以使其被合适的载体(例如质粒)表达。对于siRNA，通过在两条链间导入环来完成这点，从而产生单个转录勿，随后可在细胞中加工成有功能的siRNA。这样的转录盒一般使用指导小核RNA(shRNA)转录的RNA聚合酶Ⅲ启动子(例如U6或H1)(U6涉及基因的放置；H1是人RNA酶p的亚单位)。估计从载体产生的shRNA转录物随后被dicer加工，从而产生了双链siRNA分子，优选具有特征性的3’突出端。

所述宿主细胞是对RNA干扰敏感的细胞，因此优选相应的真核宿主细胞。所述真核细胞最好选自下组：哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。所述宿主细胞优选昆虫或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞最好选自下组：啮齿动物细胞、灵长动物细胞，例如人细胞或猴细胞。特别优选啮齿动物细胞，其最好选自下组：CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、小鼠3T3成纤维细胞和SP2/0细胞。同样优选人细胞，其最好选自下组：HEK293细胞、MCF-7细胞、PerC6细胞和Hela细胞。进一步优选猴细胞，其最好选自下组：COS-1、COS-7细胞和Vero细胞。

现有技术已知有数种合适的方法用于将多核苷酸和相应的表达载体导入宿主细胞。各方法包括但不限于磷酸钙转染、电穿孔、脂质体转染、利用转染试剂，例如阳离子脂质，生物射弹介导或多聚体介导的转移。如果是稳定转染，除了传统的基于随机整合的方法，也可使用重组介导的方法来转移表达载体进入宿主细胞基因组。这种重组方法可包括使用可介导转基因直接插入的位点特异性重组酶如Cre、Flp或ΦC31(见例如Oumard等，Cytotechnology(2006)50：93-108)。或者，可使用同源重组的机制来插入所述多核苷酸(综述于Sorrell等，Biotechnology Advances 23(2005)431-469)。基于重组的基因插入能最大程度减小转移/导入宿主细胞的异源核酸中包含的元件数目。本发明的合适表达载体或表达载体组合以及合适宿主细胞的实施方式在上文有详细的描述；我们参考以上内容。此外，除了稳定转染系统，也可使用瞬时表达系统，特别是当时用本发明选择系统作为RNAi实验的对照时。

RNAi诱导化合物也可以通过各方法导入宿主细胞。RNAi诱导化合物和表达载体的导入可平行进行，因此可同时或顺序进行。它们也可以以混合物的形式被转染。

根据一实施方式，由宿主细胞内源性表达的细胞存活必需基因的敲减诱导或促进细胞死亡，特别是凋亡。如上所述，凋亡表型具有优势，即，未转染细胞从细胞群中有效清除，进而由于宿主细胞形态的改变，不难目测确定凋亡现象。为了快速获得各凋亡表型和/或有效地诱导细胞死亡，至少采用如上所述的靶向宿主细胞内源性表达的至少两种细胞存活必需基因的多选择方案属于本发明的范围。

根据另一实施方式，细胞存活必需基因的敲减干扰细胞周期，藉此抑制未转染宿主细胞的生长。

根据优选的实施方式，该细胞存活必需基因选自下组：

泛素是一种出现在所有真核细胞的小蛋白。其通过结合各种靶蛋白执行大量的功能。可出现各种不同的修饰。泛素蛋白在真核物种之间高度保守。蛋白通过一系列步骤被泛素标记(泛素化)。在单个的泛素部分添加于蛋白底物(单泛素化)之后，更多的泛素分子可以被添加到所述第一个泛素分子上，产生一个多聚泛素链。所述的泛素化系统在多种核心的细胞程序中发挥功能，包括凋亡、细胞周期和分化、DNA转录和修复以及分化和发育。在宿主细胞内，泛素基因，特别是泛素B的敲减诱导凋亡。

优选的用于泛素的靶序列包括但不限于如下靶序列：

结合相应的mRNA转录物的合适RNAi诱导化合物，例如siRNA可依据所选的靶序列，根据现有技术中熟知且已良好建立的方法来设计。通过RNAi诱导化合物靶向相应的转录物导致有效的基因沉默。所描述的靶序列位于内源性表达基因的转录物的3’UTR。

涉及核心代谢途径的基因的另一实例是plk1基因(Polo激酶1)。Plk1是催化ATP和一个蛋白变成ADP和磷蛋白的化学反应的酶。因此，该酶的两个底物是ATP和蛋白质，而它的两个产物是ADP和磷蛋白。这个酶属于转移酶家族，特别是那些将磷酸基团转移至蛋白质中丝氨酸或苏氨酸残基的氧原子侧链的转移酶(蛋白-丝氨酸/苏氨酸激酶)。该酶特别是参与数种代谢通路，其中包括细胞周期。在宿主细胞内，Plk1基因的敲减同样诱导凋亡。

假如利用靶向不同的细胞存活必需基因的RNAi诱导化合物组合作选择，所述RNAi诱导化合物可同时转染入细胞，例如通过使用包含两种RNAi诱导化合物的转染组合物(假使使用两种RNAi诱导化合物)或将RNAi诱导化合物顺序导入细胞。使用靶向不同基因，例如在RNAi实验中被评价的靶基因(见下文)的其它RNAi诱导化合物也属于本发明的范围。各实验性的RNAi诱导化合物也可与用于选择已经整合了表达载体的宿主细胞的RNAi诱导化合物一起或分别转染。如上所述，本发明的表达载体也可与RNAi诱导化合物共转染。

用于选择的RNAi诱导化合物或RNAi诱导化合物的组合诱导的凋亡/细胞死亡的程度优选在10％至100％、25％至100％、50％至100％或75％至100％之间。

根据一实施方式，用于选择的RNAi诱导化合物和/或各组合可在选自下组的浓度下有效用于转染：至少5nM、至少10nM、至少25nM和至少50nM。

根据本发明的选择方法还可包括选择包含导入的表达载体的至少一种宿主细胞的步骤。

作为本发明的选择程序的结果，所得细胞通常分离，从原始细胞群的非选择细胞中被富集。它们可以被作为单个细胞被分离和培养。它们也可用于一个或多个附加的选择轮次，任选附加的质量或数量分析，或可用于例如开发用于蛋白生产的细胞系。根据一个实施方式，如上所述选择的富集生产宿主细胞群直接用作高产量地生产感兴趣多肽的细胞群。

本发明还提供了一种用于生产感兴趣产物的方法，包括在容许感兴趣产物表达的条件下培养根据本发明教导选出的宿主细胞。

因为提供了有效且严格的选择系统，使用根据本发明选择的宿主细胞来生产感兴趣产物，特别是多肽，具有高产量地生产所述感兴趣产物的优势。因此，本发明也提供了用于生产感兴趣产物的改进方法，特别是因为采用本发明的基于RNAi的方法降低了选择步骤改变或损害宿主细胞的风险。上文描述了适用的宿主细胞和选择程序及表达载体的细节；我们参考以上内容。

感兴趣的表达产物可通过破碎宿主细胞获得。多肽也可以表达，例如分泌入培养基，并可从培养基中获得。各方法的组合也是可能的。藉此，可高产而有效地生产和获得/分离产物，特别是多肽。所获得的产物也可作进一步处理步骤，例如纯化和/或修饰步骤以生产出所需质量的感兴趣产物。

生产感兴趣产物的方法可包括至少一个如下步骤：

-从所述细胞培养基中和/或从所述宿主细胞中分离感兴趣产物；和/或

-加工所分离的感兴趣产物。

根据本发明生产的感兴趣产物，例如多肽，可用本领域已知的方法回收、进一步纯化、分离和/或修饰。例如，该产物可通过常规步骤从营养培养基中被回收，包括但不限于：离心、过滤、超滤、抽提或沉淀。纯化可通过本领域已知的各种过程实现，包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水作用、色谱聚焦和尺寸排阻)，电泳过程(例如制备型等电点聚焦)、差别溶解(例如硫酸氨沉淀法)或抽提。

感兴趣产物可以是通过转录、翻译或所述多核苷酸编码的遗传信息表达的任何其它事件可产生的任何生物学产物。就此而言，产物是表达产物。感兴趣产物可选自下组：多肽、核酸，特别是RNA。该产物可以是药学或治疗活性化合物，或是在实验中利用的研究工具等。在一个特别优选的实施方式中，该产物是多肽，优选药学或治疗活性多肽，或是在诊断或其他实验中利用的研究工具等。因此，所述多肽不限于任何具体的蛋白质或蛋白质类群，相反可以是期望用本文所述方法选择和/或表达的任何大小、功能或来源的任何蛋白质。因此，可以表达/生产几种不同的感兴趣多肽。术语多肽指包含通过肽键连接在一起的氨基酸聚合物的分子。多肽包括任意长度的多肽，包括蛋白质(例如具有多于50个氨基酸)和肽(例如2-49个氨基酸)。多肽包括具有任何活性或生物活性的蛋白质和/或肽，包括例如生物活性多肽，如酶性蛋白质或肽(如蛋白酶、激酶、磷酸酶)、受体蛋白或肽、转运蛋白或肽、杀菌和/或内毒素结合蛋白、结构蛋白或肽、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生长因子、疫苗等。所述多肽可选自下组：肽激素、白介素、组织纤溶酶原激活剂、细胞因子、免疫球蛋白，特别是抗体或其功能性抗体片段或变体。在最优选的实施方式中，所述多肽是免疫球蛋白分子或抗体，或其功能变体例如嵌合型，或部分或完全人源化的抗体。此类抗体可以是诊断抗体、或药学或治疗活性抗体。

还提供了通过上文及权利要求所定义的本发明方法获得的产物。所述产物优选多肽。

还提供了用于进行RNAi实验的方法，包括如下步骤：

a)将表达载体导入内源性表达细胞存活必需基因的宿主细胞，其中所述表达载体至少包括

i)编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的细胞存活必需基因的产物的功能变体或功能等价物；

ii)编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞表达的感兴趣靶基因的产物的功能变体或功能等价物；

b)将靶向所述宿主细胞表达的所述感兴趣靶基因的RNAi诱导化合物导入所述宿主细胞；

c)在选择性条件下培养该宿主细胞，其中所述选择性条件至少包括导入至少一种RNAi诱导化合物，其中所述RNAi诱导化合物至少靶向所述宿主细胞内源性表达的细胞存活必需基因。

所述的RNAi试验为RNAi分析提供有价值的对照。主要进行了RNAi拯救实验。为了确保对照(RNAi拯救实验)的宿主细胞整合了用于拯救实验的表达载体并因此可提供可靠的结果，基本上根据本发明进行选择过程。根据该实施方式的教导，表达载体至少包含用于选择整合了表达载体的宿主细胞的重组多核苷酸，即，回复多核苷酸。所述回复多核苷酸编码产物，所述产物对应于和/或是宿主细胞表达的细胞存活必需基因的功能变体或功能等价物。如上文所述，在选择性培养条件下使用靶向所述细胞存活必需基因的选择性RNAi诱导化合物，该回复多核苷酸的表达使得整合了该表达载体的宿主细胞在选择性培养条件下存活。没有整合该表达载体的宿主细胞在选择条件下死亡(见上文)。

此外，该表达载体包含编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是也由宿主细胞表达的感兴趣靶基因的功能变体或功能等价物。这个多核苷酸是感兴趣多核苷酸的一个实例，在本文中也称为拯救多核苷酸。在RNAi实验中，靶基因通过使用诸如siRNA等实验性RNAi诱导化合物敲减，以通过，例如分析因该敲减获得的宿主细胞表型来分析该靶基因的角色/功能。为了分析所用实验性RNAi诱导化合物对感兴趣靶基因的特异性，分析原始表型是否可以通过导入编码产物的所述重组回复多核苷酸而回复是重要的，所述产物对应于和/或是所述实验性RNAi诱导化合物靶向的所述感兴趣基因的功能变体或功能等价物。根据本发明的教导，所述拯救多核苷酸也包含于该表达载体。通过应用用于选择的RNAi诱导化合物和用于靶向感兴趣基因的实验性RNAi诱导化合物，可进行可信的RNAi拯救实验，其可确保所观察到的拯救表型可归因于整合了该表达载体，因此整合了编码该RNAi实验中所分析的感兴趣靶基因的回复产物的重组多核苷酸的宿主细胞。

因此，本发明的教导提供了有价值的对照。

步骤a、b和c的至少两个或全部可平行或顺序进行。该表达载体和/或RNAi诱导化合物也可以作为混合物被导入。

为选择整合了本发明表达载体和由此的拯救载体的宿主细胞，优选进行如上文所详细描述的选择方法。关于所述方法、所述表达载体及其元件、所述RNAi诱导化合物和所述选择性培养条件的细节在上文中有详细的描述。以上内容也适用于此。

本发明也提供了一种试剂盒，其中所述试剂盒至少装有：

a)待导入宿主细胞的表达载体，其包含编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的细胞存活必需基因的功能变体或功能等价物；

b)靶向所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的RNAi诱导化合物。

所述的试剂盒成分容许对整合了所述表达载体的宿主细胞的选择。各种试剂盒可以被用于例如表达感兴趣产物，特别是进行RNAi实验。取决于预期用途，优选所述表达载体被设计成能包含/整合例如编码意欲表达/生产的感兴趣产物的重组多核苷酸和/或编码产物的多核苷酸(拯救多核苷酸)，后一产物对应于和/或是RNAi实验中分析的靶基因的功能变体或功能等价物。用于表达感兴趣产物和/或用于RNAi拯救实验的各试剂盒的可能的应用/使用在上文以及下文的实施例中有详细的描述。请参考各自的内容。

根据一个实施方式，该表达载体包含用于插入其它重组多核苷酸的表达盒。所述重组多核苷酸可编码例如感兴趣产物，例如产物，所述产物对应于和/或是在RNAi实验中分析的靶基因的功能变体或功能等价物。本文中，在这方面我们也指感兴趣的多核苷酸。因此，本发明的表达载体可包含用于插入感兴趣多核苷酸的插入位点但还没有包括感兴趣的多核苷酸。各种“空”表达载体可被客户用于插入感兴趣的多核苷酸(例如要表达的产物和/或假设在RNAi拯救实验中用于回复表型的产物)，从而获得可用于转染的即用表达载体。

感兴趣重组多核苷酸的整合可采用合适的克隆方法获得，例如通过用限制酶以插入编码感兴趣产物的多核苷酸。为了这个目的，该表达载体可包含，例如可用于所有读码框的多克隆位点(MCS)。各多克隆位点作为插入位点的一个实例可位于一个表达盒中。各“空”表达载体提供了，例如用作表达不同感兴趣产物的有用工具，因为通过插入编码所期望的感兴趣产物的多核苷酸该表达载体不难适应于预期用途。

该表达载体和该RNAi诱导化合物的更多细节在上文中有详细的描述。我们参考以上内容。

本文所提到的文本和文件的全部内容通过参考全部纳入本文并因此形成本公开的一部分。

附图说明

以下附图作用是说明本发明，而没有任何的限制其范围。特别地，该附图涉及本发明的优选实施方式。

图1展示了实施方式，其中根据本发明的方法被用于生产感兴趣多肽的方法以选择整合了表达载体并因此表达感兴趣产物，例如多肽的宿主细胞。

图1a展示了转染后未整合本发明表达载体的宿主细胞的方案。在所描述的实施方式中，一种选择性RNAi诱导化合物，在这里是靶向的plk1基因的siRNA被用作细胞存活必需基因的一个实例。如图1a中可见的，该siRNA靶向plk1转录物的3’UTR从而有效地诱导该内源性表达plk1基因的沉默。由于该RNAi诱导的plk1基因的敲减，没有整合表达载体，而仅整合了靶向plk1转录物的siRNA的宿主细胞经历凋亡并因此从培养体系中清除。

图1b展示了其中成功整合了本发明表达载体的宿主细胞的方案。根据所展示的实施方式，该载体位于核中但其也可以位于细胞质中。该表达载体包含编码产物的回复多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的plk1基因并因此是细胞存活必需基因的功能变体或功能等价物。在图1b中，所述回复多核苷酸被称为QIAgene plk1。此外，该表达载体包含编码感兴趣产物的重组多核苷酸，所述产物根据所展示的实施方式应该被宿主细胞表达/生产。所述多核苷酸称为基因X。整合入表达载体的重组多核苷酸从那里被表达，标出了相应的转录物。在选择过程中，该选择性RNAi诱导化合物，此处是靶向plk1的siRNA，靶向来源于宿主细胞内源表达的plk1基因的plk1转录物从而敲减该内源plk1基因的表达。然而，所述选择性RNAi诱导化合物并不靶向QIAgene plk1并因此不靶向从表达载体获得的回复多核苷酸/转录物。该回复产物能回复敲减的内源性plk1基因的功能并因此容许在这里整合了表达载体的宿主细胞在选择条件下存活。

因此，有效的选择系统被提供以选择整合了表达载体并根据所示实施方式表达/生产感兴趣产物，此处是基因X的多肽的宿主细胞。该QIAgene plk1作为RNAi可选择标记基因起作用。

图2展示了一个实施方式，其中本发明方法用在RNAi拯救实验中以选择整合了表达载体并因此表达拯救野生型表型的拯救基因的宿主细胞。根据所展示的实施方式，使用了两种不同的RNAi诱导化合物。一个RNAi诱导化合物(实验RNAi诱导化合物)靶向宿主细胞表达的感兴趣靶基因，本文中被称为基因X。该导入的实验RNAi诱导化合物，此处是siRNA，靶向基因X的转录物的3’UTR，从而下调其表达。各种敲减诱导可以被观察/分析的表型。为了确保该观察到的表型是由内源表达的靶基因的敲减引起的而不是由脱靶效应引起的，所展示的通常作为对照平行进行的RNAi拯救实验的目的在于通过导入包含拯救多核苷酸QIAgene X的拯救表达载体来回复各表型。

在图2a中，该宿主细胞没有整合拯救表达载体，因此不适合确定回复的表型。在选择性条件下，因为选择性RNAi诱导化合物(这里也是siRNA)敲减了宿主细胞内源表达的细胞存活必需基因，在这里是plk1，没有整合拯救表达载体的宿主细胞死亡并相应的被清除。各siRNA仍靶向plk1的3’UTR。

在图2b中宿主细胞成功整合了拯救表达载体；在所展示的表达方式中再次整合入细胞核。再一次，该拯救表达载体包含编码产物的回复多核苷酸，所述产物对应于和/或是细胞存活必需基因，此处是plk1的功能变体或功能等价物。各回复多核苷酸被称为QIAgene plk1。QIAgene plk1作为RNAi可选择标记基因的表达容许在选择性培养条件下存活，其中使用靶向内源性plk1基因表达的选择性RNAi诱导化合物(见上文)。此外，拯救表达载体包括编码产物的QIAgene X，所述产物对应于和/或是被所评价的实验RNAi诱导化合物攻击的靶基因编码的产物的功能变体或功能等价物。感兴趣的各拯救多核苷酸从表达载体中表达，因此可回复补偿被敲减的内源表达的靶基因X的表达。因此，内源表达的靶基因X的敲减由于表达载体的整合而回复且无论用于靶向感兴趣基因X的RNAi诱导化合物是否对于各靶基因是特异性的，内源表达的靶基因X的敲减可以在各个成功的RNAi拯救实验中分析。如果原始表型获得，就是特异性的。如果不能通过整合表达载体回复各野生型表型，这表明所用的RNAi诱导化合物引起了脱靶效应且基因表达被敲减后观察到的实验表型不是特异性归因于各基因的敲减。

因此，本发明的教导提供了一种非常有价值和适用的RNAi回复实验/对照。

Claims (12)

1.一种选择包含导入的表达载体的真核宿主细胞的方法，包括如下步骤：

a)提供真核宿主细胞群，其中所述真核宿主细胞内源性表达至少一种细胞存活必需基因和至少一种感兴趣的靶基因；

b)将表达载体导入所述真核宿主细胞，其中所述表达载体包含至少

i)编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物，即所述产物能在所述细胞存活必需基因的内源性表达被敲减后回复所述细胞存活必需基因的产物的功能；和

ii)编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于所述真核宿主细胞内源性表达的感兴趣靶基因的产物的功能变体或功能等价物，即所述产物能在所述感兴趣靶基因的内源性表达被敲减后回复所述感兴趣靶基因的产物的功能；

c)将靶向所述真核宿主细胞表达的所述感兴趣靶基因的RNAi诱导化合物导入所述真核宿主细胞；

d)在选择性条件下培养导入有所述表达载体的真核宿主细胞群，其中所述选择性条件包括至少导入至少一种RNAi诱导化合物至所述真核宿主细胞群，所述RNAi诱导化合物至少靶向由所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因，使得没有被表达载体成功转染的宿主细胞在选择性培养条件下不能存活，

其中，步骤c和d中所用的RNAi诱导化合物各自独立地选自短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和短发卡RNA(shRNA)以及其在细胞内被加工为实际RNAi诱导化合物的前体，并且都不靶向步骤b中i)和ii)所述的两种编码产物的重组多核苷酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有至少一个以下特征：

a)至少一种在选择性条件下存活的真核宿主细胞被选择；和/或

b)所述选择性培养条件包括导入至少另一种RNAi诱导化合物，所述RNAi诱导化合物靶向所述真核宿主细胞内源性表达的第二细胞存活必需基因。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达载体具有至少一个以下特征：

a)其包含另一个编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于所述真核宿主细胞 内源性表达的所述第二细胞存活必需基因的产物的功能性变体或功能性等同物；和/或

b)其包含编码感兴趣产物的另一重组多核苷酸；和/或

c)至少一种重组多核苷酸包含在表达盒中；和/或

d)至少一种重组多核苷酸包含在表达盒中，其中所述表达盒包含至少一个如下元件：

i.在所述真核宿主细胞中有功能的启动子和/或增强子序列；

ii.转录终止信号；

iii.多聚腺苷酸位点；

iv.内含子；

v.分泌前导序列；和/或

e)其包含至少一个复制起点；和/或

f)其包含至少一个附加的可选择标记基因。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RNAi诱导化合物具有一个或多个如下特征：

a)所述RNAi诱导化合物靶向所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的非翻译区；和/或

b)所述RNAi诱导化合物靶向所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的非翻译区，该非翻译区不存在于编码产物的重组多核苷酸中，所述产物对应于所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物；和/或

c)所述RNAi诱导化合物选自下组：

i.其是siRNA、miRNA或shRNA；和/或

ii.其是18-30nt的siRNA双链分子；和/或

iii.其被载体表达。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述真核宿主细胞具有如下特征：

a)其是昆虫细胞；或

b)其是哺乳动物细胞。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因至少具有一种如下特征：

a)其的敲减诱导或促进凋亡；和/或

b)其的敲减干扰细胞周期；和/或

c)所述基因选自下组

。

7.进行RNAi实验的方法，包括如下步骤：

a)将表达载体导入内源性表达细胞存活必需基因的真核宿主细胞，其中所述表达载体至少包含

i)编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于所述真核宿主细胞内源性表达的细胞存活必需基因的产物的功能变体或功能等价物，即所述产物能在所述细胞存活必需基因的内源性表达被敲减后回复所述细胞存活必需基因的产物的功能；

ii)编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于所述真核宿主细胞内源性表达的感兴趣靶基因的产物的功能变体或功能等价物，即所述产物能在所述感 兴趣靶基因的内源性表达被敲减后回复所述感兴趣靶基因的产物的功能；

b)将靶向所述真核宿主细胞表达的所述感兴趣靶基因表达的RNAi诱导化合物导入所述真核宿主细胞；

c)选择性条件下培养真核宿主细胞，其中所述选择性条件至少包括导入至少一种RNAi诱导化合物，其中所述RNAi诱导化合物至少靶向所述真核宿主细胞内源性表达的细胞存活必需基因，

其中，步骤b和c中所用的RNAi诱导化合物各自独立地选自短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和短发卡RNA(shRNA)以及其在细胞内被加工为实际RNAi诱导化合物的前体，且都不靶向步骤a中i)和ii)所述的两种编码产物的重组多核苷酸，而且步骤c在步骤a和b之后进行。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，平行或顺序进行步骤a和b。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，实施权利要求2至6中至少一个的选择方法。

10.一种试剂盒，至少装有：

a)待导入真核宿主细胞的表达载体，所述表达载体包含

i)编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于所述真核宿主细胞内源性表达的细胞存活必需基因的功能变体或功能等价物，即所述产物能在所述细胞存活必需基因的内源性表达被敲减后回复所述细胞存活必需基因的产物的功能，

ii)用于插入感兴趣的重组多核苷酸的表达盒；和

iii)编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于所述真核宿主细胞内源性表达的感兴趣靶基因的产物的功能变体或功能等价物，即所述产物能在所述感兴趣靶基因的内源性表达被敲减后回复所述感兴趣靶基因的产物的功能；

b)靶向所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的RNAi诱导化合物；

其中，所述RNAi诱导化合物选自短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和短发卡RNA(shRNA)以及其在细胞内被加工为实际RNAi诱导化合物的前体，并且不靶向步骤a中i)和iii)所述的两种编码产物的重组多核苷酸。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述表达载体具有如下特征中至少一个：

a)其包含编码产物的另一重组多核苷酸，所述产物对应于所述真核宿主细胞内源性表达的所述第二细胞存活必需基因的产物的功能变体或功能等价物；和/或

b)至少一个重组多聚核苷酸包括在表达盒中；和/或

c)至少一个重组多聚核苷酸包含在表达盒中，其中所述表达盒包括至少一个如下组件：

i.在所述真核宿主细胞中有功能的启动子和/或增强子序列；

ii.转录终止信号；

iii.多聚腺苷酸位点；

iv.内含子；

v.分泌前导序列；和/或

d)其包含至少一个复制起点；和/或

e)其包含至少一个额外的可选择标记基因。

12.如权利要求10或11所述的试剂盒，其特征在于，所述RNAi诱导化合物具有一个或多个如下特征：

a)所述RNAi诱导化合物靶向所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞

存活必需基因的非翻译区；和/或

b)所述RNAi诱导化合物靶向所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的非翻译区，该非翻译区不存在于编码产物的重组多聚核苷酸中，所述产物对应于所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物；和/或

c)所述真核宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因具有至少一种如下特征：

i.其的敲减诱导或促进凋亡；和/或

ii.其的敲减干扰细胞周期；和/或

iii.所述基因选自下组

和/或d)所述RNAi诱导化合物选自下组

i.其是siRNA、miRNA或shRNA；和/或

ii.其是18至30nt的siRNA双链分子；和/或

iii.其被载体表达。