TWI646194B - 用於產生供製造重組蛋白之哺乳動物製造細胞之手段和方法 - Google Patents

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Abstract

本發明關於能以產業規模製造蛋白之哺乳動物細胞的產生及取得和使用該細胞之手段和方法，尤其是使用該細胞以製造蛋白之手段和方法。

Description

用於產生供製造重組蛋白之哺乳動物製造細胞之手段和方法
本發明關於能以產業規模製造蛋白之哺乳動物細胞的產生及取得和使用該細胞之手段和方法，尤其是使用該細胞製造蛋白之手段和方法。
產生及合成用於各種應用及過程之重組蛋白的方法為熟習本技藝之人士所周知。多種採用各種機制之不同手段和方法可用來安全且有效地大規模製造該蛋白。這些細胞機制可在蛋白之製造過程的不同階段(例如在轉錄、轉譯或轉譯後層級)發揮其作用。最近發現一種機制，藉由此機制可經由控制miRNA(此為微RNA之簡稱，下文中亦稱為miR)之表現來控制轉譯，因此而控制基因之表現。這些為長度約22個核苷酸(nt)之內源性單股非編碼RNA，其通常藉由miR與標的mRNA的3'-UTR之間的RNA：RNA交互作用來作為基因表現之負調節子。miR已被證明 在mRNA轉譯中具有重要的調節作用，並參與控制細胞的發育、分化、凋亡、抗病毒防禦及最基本的細胞過程。的確，這表明miR可能調節約30%之人基因組的表現。miR藉由與特定的靶細胞mRNA交互作用(主要是在3'-UTR)來影響並調節mRNA轉譯速率。此外，一個miR可以瞄準並與多個標的mRNA交互作用，因此目前很難決定miR鑑別模體(motif)及目標。
迄今為止，大多數調查miR表現及隨後之控制這些miR表現來誘發基因表現的研究係在腫瘤學領域中經開展，雖然這方面的知識很多是與工業生物技術領域中涉及如何加强細胞表型之技術有關。例如，癌症領域中證明細胞生長與miR之間的關係之研究可能適用於生物技術領域中。miR可調節之潛在目標的廣泛範圍提供藉由miR遺傳工程來操縱基因表現，以研發具有新表型之細胞株的潛力。這樣做時可實現操縱單一miR即可調節多個一起參與決定細胞表型之基因。
用於生物發生miR之通路的一部分與用於生物發生涉及Dicer及RNA誘導之沉默複合體(RISC)的沉默或短干擾RNA(siRNA)的通路共有(Bartel等人，2004 Cell 116：281-297)。據報導，70%之miR基因係在基因之內含子或外顯子中發現，剩餘之30%係位在基因間區段內。最初，由核糖核酸酶Ⅱ(RNase Ⅱ)內切核酸酶Drosha和Pasha裂解初級miR(pri-miR)而形成稱為前-miRNA(前-miR)之莖環結構。此前-miR長度約為60至70個核苷 酸，且具有5'磷酸及懸垂在3'端上的2個核苷酸。隨著轉運輔助因子Ran-GTP，前-miR髮夾從細胞核主動轉運通過受體Exportin-5。在細胞質中，稱為Dicer之核糖核酸酶Ⅲ內切核酸酶被認為經由識別雙股部分來與前-miR交互作用，並切割大約兩個轉離莖-環基部之螺旋，留下miR：miR*雙鏈體(前-miR之對向臂係以miR名稱後面之星號表示)。此miR：miR*雙鏈體進入RISC，該miR：miR*雙鏈體之miR*組分被剝離，並藉由解旋酶之協助降解。成熟miR之5'端位於具有最低熱力學能量之miR-MIR*雙鏈體的一股之末端(Bartel等人，2004 Cell 116：281-297)。
miR之5'端的前一至七個核苷酸經由鹼基配對結合標的並稱為“種子”區。在哺乳動物細胞中，miR通常經由與mRNA之不完全鹼基配對來識別標的基因(其中僅miR之種子區顯示出與標的完美配對)。亦有報導，miR結合位點存在於除了mRNA之3'端外的其他位置(諸如核糖體蛋白mRNA之5'-非轉譯區(UTR)(rom等人，2008 Molecular Cell 30：460-471))，或甚至是基因組調節序列，諸如啟動子(例如Tan等人，2009 BMC Molecular Biology 10：12)。亦有報導，miR可與編碼序列中之mRNA交互作用(Rigoutsos等人，Cancer Research 69：3245-3248)。然而，現有之關於非3'-UTR交互作用的信息少且最有效之miR標的位於mRNA 3'-非轉譯區(3'UTR)。一般而言，若miR與mRNA標的之間存有不完全鹼基配對， 則發生轉譯抑制，然而當有完整的鹼基配對時則認為標的mRNA會發生降解。
儘管可能使用miR來調節基因表現，因此而調節影響高重組蛋白產製率之通路和細胞過程，迄今為止，操縱miR以改善從培養的哺乳動物細胞製造重組蛋白尚未被充分實現。分泌在培養基中之重組蛋白的濃度為細胞比製造率(qP)及活細胞濃度(IVC)之時間積分的函數(Porter等人，2010 Biotechnology Progress 26：1446-1455)。因此，可將miR施用在通路以增加qP(例如透過操縱分泌途徑)或IVC(例如透過操縱增殖和凋亡通路)。大多數在生物加工/生物技術領域中之miR表現和操縱的研究都集中在不同的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。然而，一項分析人胚胎腎293(HEK293)細胞(通常用於瞬時製造重組蛋白)中之miR的研究追踪在分批培養之不同生長階段中miR之表現略圖如何改變(Koh等人，2009 Journal of Biotechnology 140：149-155)。這些作者報導14種miR的表現在指數期和穩定生長期之間顯著改變、13種miR的表現在穩定期被上調。其中，那些在指數期和穩定期之間被觀察到有變化的miR為miR-15a和miR-16(Koh等人，2009 Journal of Biotechnology 140：149-155)。
最近，CHO細胞之miR表現及操縱CHO細胞中之miR已吸引很大的興趣，但這些研究仍處於起步階段。最近一項研究使用深度測序方法來分析保守miR及其橫跨重組細胞株之表現(Hammond等人，2012 Biotechnology and Bioengineering 109：1371-1375)。本研究調查CHO-K1宿主、源自CHO-K1之表現分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)及組織纖溶酶原激活蛋白(tPA)的細胞株，並發現與宿主細胞相比較，173個保守miR中有136個在SEAP或tPA重組細胞株中有差別表現，有75個在二者中有差別表現。那些被鑑定為差別表現者包含miR-15a、miR-15b及miR-34c(Hammond等人，2012 Biotechnology and Bioengineering 109：1371-1375)。另一項研究報告mmu-miR-446h表現會影響CHO細胞中之細胞凋亡(Druz等人，2011 Biotechnology and Bioengineering 108：1651-1661)。Johnson等人(2011)所報告之在CHO中進行的一項研究係藉由與來自miR-Base數據庫之已知miR進行比對而鑑別出350種miR(Johnson等人，2011 Biotechnology and Bioengineering 108：475-480)。此研究顯示出(i)所調查之CHO細胞株中，幾乎所有成熟的miR均與其人類或小鼠對應部分高度同源；及(ii)許多miR之表現在回應小環境擾動時會改變。這項研究亦報告倉鼠miR cgr-let-7f為CHO細胞中最豐富的miR且其量在各調查的情況中彼此相當。
Hackl等人報告類似之測序方法(Hack等人，2011 Journal of Biotechnology 153：62-75)來鑑別並標註CHO細胞中之保守和新穎miR。在研究時，作者没有取得標註之CHO基因組。相反地，取得5'和3'成熟miR之閱讀比對樣式及閱讀計數比，並用來獨立分類成miR/miR*及 5p/3p miR對及區分miR與其他非編碼RNA可造成387個成熟CHO miR之標註。該研究包括比較血清與不含血清之條件及宿主與衍生型重組細胞株。在宿主與重組衍生型細胞株之比較中，他們報導miR-16b之差別表現(Hackl等人，2011 Journal of Bio technology 153：62-75)。該相同群組亦報告在分批培養之CHO-K1懸浮細胞培養的不同階段中之miR的表現並報告各分批培養間超過100種miR被差別調節(Hernandez Bort等人，2012 Biotechnology Journal 7：500-515)。於另一研究中，Lin等人(2011)調查宿主CHO DG44細胞及衍生型IgG製造細胞株中之miR的量，報導IgG製造重組細胞株中之miR-221和miR-22的表現被下調。然而，分泌入培養基中之IgG的濃度與這些miR的表現之間沒有任何關係。與製造重組蛋白之衍生型細胞株相比較，母DG44細胞株中之miR-15b的表現亦明顯較低(Lin等人，2011 Biotechnology Progress 27：1163-1171)。
CHO細胞中之miR表現的第一批報告的其中之一來自Gammell等人。(Gammell等人，2007 Journal of Biotechnology 130：213-218)。作者所採取之方法係使用非倉鼠微陣列並調查溫度轉移時之miR表現。所產生之數據顯示出miR-21及miR-24在CHO-K1生長受抑制的細胞株(由溫度轉移誘導或在正常分批培養期間被誘導)中表現上調(美國2010/0190258 A1)。隨後，此群組報導將溫度從37℃降至28-33℃後24小時測量時，發現溫度降低會導致 miR-219、miR-518d、miR-126、miR-30e、miR-489和miR-345的量增加，而miR-7、miR-320、miR-101及miR-199被下調(Barron等人，2011 Journal of Biotechnology 151：204-211)。成功之外源性miR-7的過度表現造成細胞增殖被阻斷，並增加在37℃下之正常化(每一細胞)的重組蛋白製造，但該產量仍然低於在降低之溫度下的細胞之產量。
操縱miR的影響通常利用報告子基因及“海綿載體”調查(Ebert等人，2007 Nature Methods 4：721-726)。為了證明miR對工業相關表型之影響，有必要經由減少或增加所討論之miR的表現來驗證此點。Jadhav等人(Jadhav等人，2012 Biotechnology and Bioengineering 109：13761385)最近報導CHO細胞株中之miR的功能分析可利用製造重組EPO-FC之CHO細胞株及在四天之期間內的瞬時轉染CHO細胞成功證明。
商業製造重組蛋白通常需要大規模的製造過程。儘管最近在工業過程中有所進展，製造重組蛋白仍然是具有挑戰性的任務。因此，仍需要提供被進一步改善之手段及方法，以更有效和優化的方式製造蛋白。
本發明特別根據技術問題來提供經改善或進一步之用於產業規模製造蛋白的手段和方法。
本發明經由提供獨立申請專利項的教示內容來解決其 技術問題。
尤其是，本發明經由提供用於在哺乳動物製造細胞中製造所欲蛋白之方法來解決其技術問題，其包含下列製程步驟：a)提供哺乳動物製造細胞，b)增加步驟a)所提供之哺乳動物製造細胞中至少一種選自由下列所組成之群組的miR之濃度，從而取得製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞：miR-15、miR-16及miR-34，c)在適合製造所欲蛋白之條件下培養該製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞，及d)回收步驟c)所製造之所欲蛋白。
因此，本發明增加在哺乳動物製造細胞中之經鑑別的miR之濃度，意指提高該經鑑別之miR的量，尤其是細胞內的量，以增加所欲蛋白之製造。
在本發明的背景中，術語濃度應被理解為亦指量。
在本發明的背景中，miR之濃度增加係指與步驟a)所提供之哺乳動物製造細胞中該miR的濃度相比較時，該miR之濃度較高。miR之濃度可藉由習知之測定細胞中之miR量的方法來測定，例如藉由qRT-PCR分析測定。熟習本技藝之人士已知適當之管理措施及適當標準之建立。
在本發明的背景中，所欲蛋白之製造增加意指細胞中之所欲蛋白(尤其是所欲之重組蛋白)比製造率比(qP)較高，和/或意指活細胞濃度(IVC)的時間積分較高。根據 Porter等人(Porter等人，2010 Biotechnology Progress 26：1446-1455)計算，重組蛋白之製造或製造率(其被定義為培養基中之蛋白的濃度)為這兩個參數(qP及IVC)的函數。
增加之蛋白製造的測量方法為熟習本技藝之人士所周知。例如，重組蛋白之製造增加可藉由ELISA測量組織培養基中之滴度小規模地測定(Smales等人，2004 Biotechnology Bioengineering 88：474-488)。其亦可藉由ForteBio Octet，例如高通量測定培養基中之重組單株抗體(mAb)濃度來定量測定(Mason等人，2012 Biotechnology Progress 28：846-855)，或藉由蛋白A HPLC來大規模地測定(Stansfield等人，2007 Biotechnology Bioengineering 97：410-424)。用於計算細胞之方法包括，但不限於錐蟲藍(trypan blue)排除法，隨後使用血球計或Vi-CELL(Beckman-Coulter)計數。
於一實施態樣中，該所欲蛋白的製造增加可能是由於在本方法之步驟b)達成增加至少一種miR的細胞內濃度而造成細胞之蛋白比製造率(qP)增加。此外，或另外，於一實施態樣中，該增加之蛋白製造可能係由於在本方法之步驟b)達成增加至少一種miR的細胞內濃度而造成細胞生長，尤其是較高之IVC。因此，本發明對用於產生蛋白，尤其是重組蛋白的哺乳動物製造細胞，尤其是細胞株之生長和利用特別有用。
根據本發明，本方法之步驟a)需要提供哺乳動物製造 細胞，此意指能製造所欲蛋白(尤其是所欲之重組蛋白)，且能夠經受本方法之步驟b)和c)的細胞。
於本發明之較佳的實施態樣中，所欲蛋白為製造細胞株之內源性蛋白。
於更佳之實施態樣中，所欲蛋白對製造細胞而言為外源性的。這意指所欲蛋白並非正常存在於製造細胞中。因此，必須藉由熟習本技藝之人士已知的方法(尤其是如下述者)將編碼所欲蛋白之核苷酸序列引入製造細胞中。
本發明之特佳的實施態樣係在本方法之步驟a)或x)之前轉染一種編碼所欲蛋白之核苷酸序列。此意指該外源性所欲蛋白已經存在於所提供之製造細胞中。較佳地，該編碼所欲蛋白之核苷酸序列係存在於載體中或被穩定地整合在該製造細胞之基因組。
根據本發明，本發明之方法中的步驟b)需要至少一種該miR之濃度當與進行步驟b)前存在於哺乳動物製造細胞中之該miR相比較時是增加的，以取得被操縱(經遺傳工程處理)之哺乳動物製造細胞(下文中亦稱為“製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞”)。接著，在步驟c)中將該製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞在適合製造所欲蛋白的條件下培養，其中在該培養期間可製造該所欲蛋白且可以回收，尤其是可從培養基和細胞分離出。
於另一特佳之實施態樣中係在本方法之步驟b)或y)的期間將編碼所欲蛋白之核苷酸序列與至少一種miR同時 轉染入製造細胞中。因此，於本實施態樣中，不僅該至少一種miR的濃度增加，且該所欲蛋白之濃度亦增加。再有，編碼該所欲蛋白之核苷酸序列可在分開的載體中或可被穩定地整合入所取得之製造蛋白的經遺傳工程處理之哺乳動物製造細胞的基因組。
再於另一特佳之實施態樣中係將編碼所欲蛋白之核苷酸序列轉染入製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞，即，在本方法之步驟b)、y)或z)之後，但在步驟c)之前。
於一特佳之實施態樣中，該細胞培養係以分批培養、餵料分批培養或連續培養之形式進行。更佳地，該細胞培養係以懸浮培養之形式進行。較佳地，在步驟b)使用習知之細胞培養基。
於一較佳之實施態樣中，本發明之步驟b)係在習知之細胞培養基中進行，較佳地，諸如步驟c)所使用之細胞培養基。於本發明之另一實施態樣中，步驟b)係在轉染培養基中進行，尤其是在適合用於將miR或包含編碼miR，及可能地，所欲之蛋白的核苷酸序列之載體轉染入哺乳動物製造細胞中的培養基。
合適之培養及回收方法已為熟習本技藝之人士所知且可取決於所欲蛋白及所使用之哺乳動物製造細胞。
於一較佳之實施態樣中，步驟c)所製造之所欲蛋白係經由在步驟d)將所欲蛋白從其他在培養步驟c)期間存有的組分中分離出，較佳為從製造蛋白之經遺傳工程處理的哺 乳動物製造細胞中分離出(較佳為純化)來回收。根據步驟d)回收後所取得之所欲蛋白基本上不含，較佳為不含製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞。
回收所欲蛋白係使用物理或化學或物理-化學方法來進行。較佳地，該物理或化學或物理-化學方法為過濾法、離心法、超速離心法、萃取法、冷凍乾燥法、沉澱法、色層分析法或彼等之兩種或多種方法之組合。較佳地，該色層分析法係選自尺寸排阻色層分析法、疏水交互作用色層分析法、離子交換色層分析法、親和力色層分析法及金屬結合色層分析法。
本發明亦經由提供製備能表現所欲蛋白之製造蛋白的經遺傳工程處理之哺乳動物製造細胞的方法來解決其技術問題，此方法包含下列製程步驟：x)提供哺乳動物製造細胞，y)增加步驟x)所提供之哺乳動物製造細胞中至少一種選自由下列所組成之群組的miR之濃度：miR-15、miR-16及miR-34，從而取得製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞，及z)回收步驟y)所製造之製造蛋白的經遺傳工程處理之哺乳動物製造細胞。
因此，用於製備製造蛋白的經遺傳工程處理之哺乳動物製造細胞的本發明方法提供用於製造經遺傳工程處理之哺乳動物製造細胞，較佳地，其能夠增加蛋白比製造率及/或能夠改善，尤其是增加細胞生長，即，較高之活細胞 濃度(IVC)的時間積分。
miR-15b及miR-16均為誘導細胞凋亡之miR，瞄準編碼抗細胞凋亡之蛋白的mRNA，諸如BcI2。數種其他基因亦顯示為這些miR的目標。例如，據報導，miR-16亦調節細胞週期蛋白D1、細胞週期蛋白D3、細胞週期蛋白E1及CDK6，使細胞在細胞週期之G0/G1期中進入停滯。miR-21為另一種誘導細胞凋亡的miR，其阻止細胞增殖並誘導細胞死亡。miR-21，如同miR-15和miR-16，瞄準BcI2 mRNA。miR-34c涉及細胞增殖(主要在p53介導之細胞凋亡中)，這使其成為癌症診斷和療法的重要標的。miR-34為腫瘤抑制子，其藉由瞄準Notch、HMGA2、沉默信息調節子1(SIRT1)及Bcl-2和其他與腫瘤形成和/或發展相關的基因來達成抑制腫瘤。
因此，本發明提供增加蛋白製造之有利的手段和方法，尤其是允許在哺乳動物製造細胞中大規模製造所欲蛋白。本發明亦提供改進之哺乳動物製造細胞，此意指經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞，該哺乳動物製造細胞係經遺傳工程處理以允許在較佳之實施態樣中改善，尤其是增加製造蛋白和/或改善，尤其是增加細胞生長。
在本發明之背景中，術語“所欲蛋白”意指糖基化、部分糖基化或非糖基化形式之寡肽或多肽。
於一實施態樣中，如本文所使用之單數形式的術語“所欲蛋白”亦指至少一種所欲蛋白，尤其是所欲多肽，其尤其指兩種、三種或更多種不同的所欲蛋白。於本發明之 一實施態樣中，術語“所欲蛋白”係指一種特定蛋白之製造增加，較佳為特異地增加，尤其是僅增加此特定蛋白之製造。於一特定且較佳之實施態樣中，該所欲蛋白，尤其是編碼該所欲蛋白的核苷酸序列，相對於該哺乳動物製造細胞(即，該哺乳動物宿主細胞)而言可為內源性或外源性蛋白。在該製造細胞株包含外源性所欲蛋白的情況中，其被稱為轉基因的。
在本發明之背景中，術語“內源性”蛋白係指已經存在於或正被編碼在哺乳動物製造細胞株之基因組中的蛋白，因此並非源自該細胞株外面。
在本發明之背景中，術語“外源性”蛋白係指由於重組基因技術之方法(例如習知之遺傳工程方法，較佳為藉由轉化、電穿孔或轉染編碼該外源性蛋白之核苷酸序列的手段)而存在於該哺乳動物製造細胞中之蛋白，其中該外源性核苷酸序列在遺傳工程製程步驟之前並不存在於該哺乳動物製造細胞中。
所欲蛋白可為經遺傳工程處理的，尤其是，重組蛋白。尤其是，該蛋白可為生藥的。
尤其是，該蛋白可為哺乳動物、細菌、病毒或植物蛋白。較佳地，該蛋白為人蛋白或人化蛋白。
於一特佳之實施態樣中，該所欲蛋白可為抗體，尤其是單株抗體、抗原、激素、酶、細胞因子、生長因子、報告蛋白、可選擇之標記，例如GS-選擇標記、潮黴素可選擇標記、嘌呤黴素選擇標記或胸苷激酶可選擇標記或彼等 之任一結構和/或功能性部分或雜合體。
於一特佳之實施態樣中，該所欲蛋白可為抗體，尤其是單株抗體、抗原、酶、細胞因子、生長因子、報告蛋白、可選擇之標記，例如GS-選擇標記、潮黴素可選擇標記、嘌呤黴素選擇標記或胸苷激酶可選擇標記或彼等之任一結構和/或功能部分或雜合體。
於一較佳之實施態樣中，該所欲蛋白可為單株抗體、重組或嵌合抗體、或彼等之片段，例如抗體之重或輕鏈、或可變區或恆定區。於更佳之實施態樣中，該所欲蛋白可為生長激素、胰島素、FSH(卵泡刺激素)、第V Ⅲ因子、TPO、EPO(紅血球生成素(erythropoietin))、G-CSF、GM-CSF、TPA(組織纖溶酶原活化劑)、干擾素α、β或γ、胰島素樣生長因子或生長激素(somatrotropin)。
於一較佳之實施態樣中，該所欲蛋白可為單株抗體、重組或嵌合抗體、或彼等之片段，例如抗體之重或輕鏈、或可變區或恆定區。於更佳之實施態樣中，該所欲蛋白可為生長激素、FSH(卵泡刺激素)、第V Ⅲ因子、TPO、EPO(紅血球生成素)、G-CSF、GM-CSF、TPA(組織纖溶酶原活化劑)、干擾素α、β或γ、胰島素樣生長因子或生長激素。
於本發明之較佳實施態樣中，該製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞包含(較佳地，表現)編碼Sox6或Bhlhe22或兩者之基因。於一較佳之實施態樣中，該製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞不含編碼 Sox6或Bhlhe22或兩者之基因。較佳地，該製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞中之編碼Sox6或Bhlhe22之基因的表現被部分或完全抑制。
較佳地，本文所使用之術語“核苷酸序列”或“多核苷酸”係指核酸，尤其是核酸分子，較佳為DNA或RNA。
在本發明之背景中，術語“哺乳動物製造細胞”係指能夠製造所欲蛋白之哺乳動物細胞(尤其是哺乳動物宿主細胞)，尤其是能夠製造所欲蛋白且能夠經受本發明方法之製程步驟b)和c)或y)之哺乳動物宿主細胞。
在本發明之背景中，術語“製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞”意指增加所提供之哺乳動物製造細胞中至少一種選自由下列所組成之群組的miR之濃度而產生之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞：miR-15、miR-16及miR-34，因此，其特點為與步驟a)或x)所提供之哺乳動物製造細胞相比較，該至少一種miR，尤其是兩種該miR，較佳為三種該miR之濃度增加。於一較佳之實施態樣中，本發明之“製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞”的特徵為蛋白之製造增加，於一實施態樣中，其特徵為qP或IVC增加，且於一實施態樣中，其特徵為該二種特性。
於本發明之一較佳實施態樣中，該“製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞”為顯現出qP增加或IVC增加或該兩者均增加的細胞。
於一較佳之實施態樣中，該miR-15為miR-15a或 miR-15b。
於一較佳之實施態樣中，該miR-16為miR-16-1或miR-16-2。
於一較佳之實施態樣中，該miR-34為miR-34a、miR-34b或miR-34c。
於一較佳之實施態樣中，該至少一種miR之濃度的增加係藉由以至少一種選自由下列所組成之群組的miR轉染在步驟b)或y)之哺乳動物製造細胞：miR-15、miR-16及miR-34。
因此，於一較佳之實施態樣中係以至少一種如本文所鑑別之miR或前miR(較佳為至少兩種，最佳為3種miR或前miR)轉染該哺乳動物製造細胞，從而使彼等之濃度增加。於一較佳之實施態樣中，以至少一種編碼前miR之載體瞬時轉染該製造細胞，而於另一較佳之實施態樣中係構建穩定地表現至少一種前miR之細胞株，此意指該製造蛋白之經遺傳工程處理的製造細胞含有至少一種被穩定地整合入其基因組的前-miR之核苷酸序列。
於一較佳之實施態樣中，該至少一種miR之濃度的增加係藉由以至少一種含有編碼至少一種miR之核苷酸序列的載體轉染步驟b)或y)之哺乳動物製造細胞，且該核苷酸序列係受至少一種允許該至少一種miR過度表現的調控元件控制，其中該至少一種miR係選自由下列所組成之群組：miR-15、miR-16及miR-34。
於較佳之實施態樣中，該含有編碼至少一種miR之核 苷酸序列的載體為表現載體。
因此，於一較佳之實施態樣中係以至少一種允許該至少一種(較佳為至少兩種，最佳為3種)如本文所鑑別之miR在經轉染之細胞中過度表現的本發明載體來轉染該哺乳動物製造細胞，從而使該miR之濃度增加。於本發明之一較佳的實施態樣中，該濃度被瞬時增加。於本發明之另一較佳的實施態樣中，該濃度被穩定地增加。
允許至少一種miR過度表現之調控元件可為啟動子或任何其他促進表現或增強表現之元件，諸如增強子。於一較佳之實施態樣中，該允許至少一種miR過度表現之調控元件為啟動子，較佳為哺乳動物或病毒啟動子。
於一特佳之實施態樣中，該啟動子可為組成型或誘導型啟動子，例如溫度誘導型啟動子。
於一較佳之實施態樣中，該步驟b)或y)所使用之至少一種載體被瞬時或穩定轉染入該哺乳動物製造細胞中。
於一較佳之實施態樣中，至少有兩種，較佳地，i)miR-15及miR-16、或ii)miR-15及miR-34、或iii)miR-16及miR-34，較佳為全部三種miR或編碼至少兩種，較佳為3種miR之核苷酸序列被轉染。
於一較佳之實施態樣中可將至少兩種編碼miR之核苷酸序列在相同的載體上轉染。於另一實施態樣中係將至少兩種編碼miR之核苷酸序列共同轉染，且個別miR係編碼在分開之載體上。此外，若所欲蛋白係與至少一種miR一起轉染，其可以被編碼在相同載體上，或在個別之載體 上。
編碼該至少一種miR之核苷酸序列或該至少一種miR可使用熟習本技藝之人士所周知的習知方法來進行轉染。較佳地，該方法可為轉染劑lipofectamine轉染、電穿孔、脂質體介導之轉染、磷酸鈣介導之轉染、病毒介導之轉染或直接基因轉移，例如粒子轟擊(particle bombardment)。
於本發明之一較佳實施態樣中，該編碼至少一種miR(較佳為至少一種前-miR)之核苷酸序列係在至少一種允許該至少一種miR過度表現的調控元件之控制下被瞬時或穩定地包含在該哺乳動物製造細胞中。
於一較佳之實施態樣中，該miR為成熟的miR、前體miR(前-miR)或初級miR(pri-miR)。較佳地，成熟miR係由細胞合成或為外源添加之化學合成的寡核苷酸。
於一較佳之實施態樣中，該哺乳動物製造細胞宜為囓齒動物細胞、倉鼠細胞、小鼠細胞或人類細胞、YO細胞、COS細胞、sp2/0細胞、CHO細胞、CHO-K1細胞或CHO-K1SV細胞、DG44 CHO細胞、DUXB11 CHO細胞、CHO GS基因剔除細胞、CHO FUT8 GS基因剔除細胞、NS0細胞、PERC6細胞、HEK293細胞、HT1080細胞或BHK細胞。該哺乳動物製造細胞亦可為幼倉鼠腎細胞(BHK)。該製造細胞亦可為非哺乳動物細胞，即，昆蟲細胞，等，較佳地，該製造細胞為非人類細胞。
於一較佳之實施態樣中，該哺乳動物製造細胞為CHO細胞、NS0細胞、PERC6細胞、HT1080細胞或幼倉 鼠腎細胞(BHK)。於一較佳之實施態樣中，該CHO細胞係選自由下列所組成之群組：CHO-K1細胞、CHO-K1SV細胞、DG44 CHO細胞、DUXB11 CHO細胞、CHO GS基因剔除細胞及CHO FUT8 GS基因剔除細胞。
較佳地，該CHO GS基因剔除細胞為CHO-K1SV GS基因剔除細胞，較佳為Lonza之GS XceedTM。較佳地，該CHO FUT8基因剔除細胞為Lonza之Potelligent®CHOK1SV。
於本發明之背景中，術語“細胞”意指單一細胞。術語“細胞”亦指細胞株，較佳為永生化之細胞株，其可包含細胞匯集體。
本發明亦經由提供根據本發明之任一方法製造的“製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞”來解決其技術問題。
尤其是，本發明提供包含至少一個編碼至少一種miR之轉基因核酸序列的“製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞”，該轉基因核酸序列係被瞬時或穩定地併入該受至少一種調控元件控制，以允許該至少一種miR在其中過度表現的細胞之基因組，其中該至少一種miR係選自由下列所組成之群組：miR-15、miR-16及miR-34。
尤其是，本發明提供用於在哺乳動物製造細胞中製造所欲蛋白的套組，其包含至少一種哺乳動物製造細胞、至少一種含有編碼至少一種miR之核苷酸序列的載體及用於以該至少一種載體轉染至少一種細胞的機構，其中該編碼 至少一種miR之核苷酸序列係受至少一種允許至少一種miR過度表現的調控元件控制，其中該至少一種miR係選自由下列所組成之群組：miR-15、miR-16及miR-34miR。
於一較佳之實施態樣中，該套組進一步包含含有編碼所欲蛋白之核苷酸序列的第二載體。
更佳之實施態樣為從屬申請專利範圍之主題。
本發明現在將藉由非限制性實施例和附圖更詳細地說明。
第1圖. 生長在CD-CHO培養基中之表現單株抗體cB72.3的兩個重組GS-CHOK1SV細胞株的分批生長曲線(■=完成搖瓶分批培養時單株抗體滴度為550±4毫克/升之“高”製造CHO 42細胞株，△=完成搖瓶分批培養時單株抗體滴度為313±64毫克/升之“低”製造CHO 114細胞株)。在整個分批培養期間，在箭頭所指定之時間採取樣本以從細胞小丸萃取用於qRT-PCR分析的miR物質。
第2圖. 在“高”製造CHO 42(■)及“低”製造CHO 114(□)cB72.3單株抗體製造GS-CHOK1SV細胞株的整個分批培養期間，前-miR-15b(A)及成熟miR-15b(B)的變化形廓。誤差棒=±標準差(n=3)。
第3圖. 在CHO 42(■)及CHO 114(□)cB72.3單株抗體製造GS-CHOK1SV細胞株的整個分批培養期間，(A) 前-miR-16-1、(B)前miR16-2及成熟(C)miR-16的變化形廓。誤差棒=±標準差(n=3)。
第4圖. 在“高”製造CHO 42(■)及“低”製造CHO 114(□)cB72.3單株抗體製造GS-CHOK1SV細胞株的整個分批培養期間，(A)前-miR-21及(B)成熟miR-21的變化形廓。誤差棒=±標準差(n=3)。
第5圖. 在“高”製造CHO 42(■)及“低”製造CHO 114(□)cB72.3單株抗體製造GS-CHOK1SV細胞株的整個分批培養期間，(A)前-miR-34c及(B)成熟miR-34c的變化形廓。誤差棒=±標準差(n=3)。
第6圖. 在“高”製造CHO 42(■)及“低”製造CHO 114(□)cB72.3單株抗體製造GS-CHOK1SV細胞株轉染後之24-96小時的期間內所測定之miR的瞬時過度表現對IVC和qP之影響。
第7圖. 轉染後96小時，在“高”製造CHO 42 cB72.3單株抗體製造GS-CHOK1SV細胞株中前miR的瞬時過度表現對培養基中之單株抗體濃度的影響。各時間點之單株抗體濃度已對培養中之活細胞濃度正常化。*=與轉染劑空白對照組相比較，單株抗體之表現為統計上顯著增加(P<0.05)。誤差棒=±SD(n=3)。
第8圖. 轉染後96小時，在“中”製造CHO56 cB72.3單株抗體製造GS-CHOK1SV細胞株中前miR的瞬時過度表現對培養基中之單株抗體濃度的影響。*=與轉染劑空白對照組相比較，單株抗體之表現為統計上顯著增 加(P<0.05)。誤差棒=±SD(n=3)。
第9圖. 轉染後(A)48小時及(B)96小時，在“低”製造CHO114 cB72.3單株抗體製造GS-CHOK1SV細胞株中miR的瞬時過度表現對培養基中之單株抗體濃度的影響。*=與轉染劑空白對照組相比較，單株抗體之表現為統計上顯著增加(P<0.05)。誤差棒=±SD(n=3)。
第10圖.以編碼個別前miR之載體轉染所創建之CHOK1SV匯集體的生長曲線。A=miR-21匯集體(編碼前miR-21之載體JR03)，B=miR-34c匯集體(編碼前miR-34c之載體JR04)，C=miR-15b匯集體(編碼前miR-15b之載體JR04)，D=miR-16匯集體(編碼前miR-16之載體JR06)。CHOK1SV宿主旁邊顯示各匯集體之三種培養。
第11圖. 以編碼個別前miR之載體轉染所創建之源自CHOK1SV的匯集體的分批培養在第5天(■)和7天(□)之成熟miR的表現。A=miR-21(編碼前miR-21之載體JR03)，B=miR-34c(編碼前miR-34c之載體JR04)，C=miR-15b(編碼前miR-15b之載體JR04)，D=miR-16(編碼前miR-16之載體JR06)CHOK1SV宿主細胞株，RY05=以未編碼miR之miR表現載體轉染所創建之匯集體。誤差棒=±SD(n=3)。
第12圖. 轉染後48小時各種miR受操縱之細胞株中的螢光素酶之表現。(■)以在螢光素酶轉錄單位之3'-UTR具有或不具有miR-34c標的序列(不具有=“螢光素酶載體”，具有=“螢光素酶加含有miR-34c標的序列之海 綿載體”)之螢光素酶報告基因載體轉染的匯集體。(□)以額外之編碼miR-34c的載體加上在螢光素酶轉錄單位之3'-UTR中具有或不具有miR-34c標的序列的螢光素酶報告基因載體超共轉染的匯集體。所有數據之顯示係相對於無miR-34c之標的序列存在時，穩定匯集體中之螢光素酶的表現。
下列表1鑑別本發明中所使用之前miR引物(SEQ ID No：1至12)的核苷酸序列。
材料及方法： 用於過度表現miR之載體和海綿載體
產生用於過度表現miR之載體以表現人miR之髮夾-產生前miR。將嘌呤黴素選擇標記包含在用於產生穩定之細胞株的載體中。使用由3'-UTR中具有互補或幾乎互補的miR-34c標的序列之海腎螢光素酶所組成的海綿載體來證明miR-34c之過度表現會造成基因沉默。
細胞培養
將CHO-K1黏附細胞(European Collection of Cell Culture)培養在輔以500μM L-麩胺酸及500μM天門冬醯胺、200mM L-麩胺醯胺、核苷(30μM腺苷、胞苷、尿苷及鳥苷加上10μM胸苷(均來自Sigma公司))、10%(體積/體積)經熱滅活之胎牛血清(PAA實驗室)及1%(體積/體 積)Gibco ®非必需胺基酸(Life Technologies公司，英國)的Gibco ® DMEM(Life Technologies公司，英國)中。將CHO-K1保持在37℃，潮濕之5%CO2空氣下的培養箱中之T培養瓶(75厘米2，Sartorius)中。當培養瓶中之細胞達到約80%匯合時，將細胞分裂增殖。將目前的培養基吸出並以10毫升磷酸鹽緩衝之生理鹽水(PBS)(每100毫升無菌水(Oxide Limited)使用1片)清洗之。吸出PBS並將細胞在37℃，5%CO2(體積/體積)空氣下，培育在3毫升胰蛋白酶(Life Technologies，英國)中2-3分鐘。然後，加入10毫升培養基以抑制胰蛋白酶並將細胞懸浮液倒入50毫升之Falcon管中，再在1000rpm下離心5分鐘。然後，將上清液移除，將細胞沉澱小丸重新懸浮於10毫升之新鮮培養基中以確認該細胞存活率>95%(當使用ViCell儀器測定時)。然後，將0.25毫升之細胞懸浮液加入含有10毫升新鮮培養基之T75培養瓶中，以將細胞接種在T75瓶中。
將GS-CHO42、56和114懸浮細胞(Lonza Biologics plc)培養在CD CHO培養基(Life Technologies公司，英國)中。將這些培養例行保持在Erlenmeyer燒瓶中，培養在37℃，100rpm迴轉式震盪培養箱中之潮濕的5%CO2(體積/體積)空氣下，初始接種密度為2×105細胞/毫升。
GS-CHO42和GS-CHO114分批培養
將兩種細胞株最初以3×105細胞/毫升之密度接種在 500毫升Erlenmeyer燒瓶中之100毫升CD CHO培養基中，並培養在37℃，100rpm迴轉式震盪培養箱中之潮濕的5%CO2(體積/體積)空氣下。每日採取樣本以計算細胞數(1毫升)。在培養時間之第3、5、7和11天的時間點移出具1×107細胞之等分試樣以供分析miR。經由離心來收穫細胞，以PBS清洗沉澱小丸一次並儲存於-70℃。保留上清液以測定分泌出之單株抗體的濃度。
RNA萃取
使用MirVANA RNA萃取套組(Life Technologies公司，英國)按照製造商的說明萃取RNA。使用NanoDrop儀器，經由測定在A260nm波長處之吸收來測量RNA之量。製備RNA萃取物之20奈克/毫升稀釋液以用於接下去之qRT-PCR。在miR分析方面，依循製造商之用於富集小RNA的方案。
qRT-PCR分析-TaqMan
除非另有說明，所有qRT-PCR材料係源自Applied Biosystems。在所有實驗方面，使用兩步驟TaqMan®MicroRNA分析套組(均取自Bio-Rad公司)與48和96孔不透明盤及黏合片。第一步驟涉及miR逆轉錄套組及收集樣本。根據製造商之指示準備各個孔以含有7微升之主混合物、3微升之合適的引物(其提供在套組中，每一miR一種)及5微升之濃度為10奈克/毫升的RNA樣 本。使用下列程式，在Eppendorf授權之熱循環儀上運行RT-PCR：
˙在16℃下30分鐘
˙在42℃下30分鐘
˙在85℃下5分鐘
然後，進行第二個qRT-PCR步驟。每個孔包含1微升之TaqMan microRNA Assay(20×)、1.33微升來自第一步驟之產物、10微升TaqMan Universal PCR混合物及7.67微升不含核酸酶之水。使用下列PCR循環細節，在Mastercycler®Eppendorf Realplex4儀器上運行qRT-PCR實驗；
1.在95℃下10分鐘
2.在95℃下15秒
3.在60℃下60秒
重複步驟2和3，共進行40個循環
在2%瓊脂糖凝膠上分析qRT-PCR的產物，旁邊為10 bp DNA梯狀條帶(Invitrogen)。
為了測定各miR之複本數，使用具已知濃度之各miR的市售之合成物質來產生標準曲線。使用TaqMan microRNA Assay中具有已知複本數之合成物質來產生標準曲線，接著使用該標準曲線從樣本測定未知之miR濃度。
使用SYBR Green進行qRT-PCR分析以測定各時間點和 細胞株之間的不成熟前miR之相對濃度
在所有實驗中，使用SYBR Green單一步驟qRT-PCR套組與48和96孔不透明盤和黏合片。準備各個孔以含有12.5微升SYBR Green混合物、1.5微升合適之引物、0.5微升RT酶、2微升之濃度為2.5奈克/毫升的RNA及8.5微升之二次蒸餾水。本研究期間所使用之引物描述於下列表1中。
使用下列PCR循環細節，在Mastercycler®Eppendorf Realplex4儀器上運行qRT-PCR實驗；
1.在50℃下10分鐘
2.在95℃下5分鐘
3.在95℃下10秒
4.在58℃下30秒
重複步驟3和4，共進行40個循環
˙熔解曲線(在溫度改變0.5℃時測量)
在1%瓊脂糖凝膠上分析qRT-PCR的產品，旁邊為100 bp RNA梯狀條帶(Invitrogen，Life Technologies公司，英國)。
Lipofectamine轉染
為了在6孔盤中進行瞬時轉染實驗，將指數生長期之細胞株以3×105細胞/毫升之密度接種在含有適當培養基之6孔盤(Greiner公司，英國)中，並培養在37℃，潮濕之5%(體積/體積)CO2空氣下的培養箱中。在2個不同的管中製備下列者；(a)4微克之DNA及250微升之Gibco®OptiMEM培養基(Life Technologies公司，英國)，(b)12微升之Lipofectamine(Invitrogen，Life Technologies公司，英國)加250微升之Gibco®OptiMEM培養基(Life Technologies公司，英國)。然後，將這些在室溫下培育5分鐘，將兩支試管混合並在室溫下培育20分鐘。此期間結束時，將500微升之DNA複合物加入適當的孔中。將細胞培養不同的期間，再計算細胞數目並收集一部分培養基，以藉由ELISA測定單株抗體的滴度。
當使用各種CHO-K1SV細胞株在96孔深孔盤中進行瞬時轉染實驗時，調整用於6孔盤瞬時轉染實驗之方案以考慮數目較多之細胞。將數量為每孔0.4×106個之指數生長期的細胞接種在96孔深孔盤(Nunc)中，並將盤培養在37℃，速率為375rpm之迴轉式振盪培養箱中之潮濕的5%(體積/體積)CO2空氣中。每孔使用0.4微克之DNA、50微升之Gibco®OptiMEM培養基(Life Technologies公司，英國)及1.2微升之Lipofectamine(Invitrogen，Life Technologies公司，英國)，並依上述製備。將經轉染之細胞留置不同的期間，再計算細胞的數目並收集培養基，以藉由ELISA測定單株抗體的滴度。
ELISA
為了測定單株抗體之濃度，使用以標準ELISA為基礎的方法分析100微升來自瞬時轉染之培養上清液(Smales等人，2004 Biotechnology Bioengineering 88：474-488)。
統計分析
為了測定培養上清液中之IVC、qP或單株抗體濃度在各實驗條件與對照組之間是否具有統計上之顯著差異，進行學生t檢驗。當所取得之p值為P<0.05(在95%之信賴水準下)時，變化被認為是顯著的。
實施例1： 使用miRCURY LNA微陣列初步鑑定miR標的
鑑定其表現可能與qP或IVC相關聯之miR的初步工作係經由使用市售之miRCURY LNA微陣列方法(Exiqon，丹麥)進行。採取兩種方法：A)第一種方法是比較以分批和餵料-分批模式生長在10升之氣升式生物反應器中之GS-CHOK1SV細胞株(表現典型之重組嵌合型單株抗體，cB72.3)中的miR反應。餵料-分批模式係使用Lonza通用餵養方法(通用方法-第6版)。將GS-CHOK1SV 42細胞株(製造嵌合型單株抗體cB72.3)之3個分批模式生物反應器(n=3)與3個分批餵料模式反應器(n=3)相比較。在各生長曲線上選擇五個採樣點(表2)。在1至3個採樣點方面，從所有六個生物反應器製備RNA樣本(1=第1次餵料前不久(第1次餵料前)，2=第1次餵料後48小時且3=活細胞濃度峰值)。峰值後，未餵料(分批模式)之生物反應器開始降低且未進一步從此組生物反應器採樣。另外兩個時間點係在第2次餵料後48小時(4=第2次餵料後48小時)及收穫時(5=收穫)從接受餵料的3個生物反應器(分批餵料模式反應器，F17、F18及F19)採樣。因此，共採取24個樣本並使用miRNeasy套組(Qiagen)，根據製造商的說明從這些樣本製備RNA。製備第25個參考樣本，其係由5微克各來自該24個樣本之RNA的混合物所組成。
以Hy3標記樣本並以Hy5標記該參考物質，在24 miRCURY LNA(鎖核酸)微陣列上將各樣本對參考物質雜交。此處所呈現之數據為藉由ANOVA比較各反應器組所得之miR的正常化中位數比(In(Hy3/Hy5))對數。只有那些p<0.05者(表3)進入雙向階層式群集演算法(2-way hierarchical clustering algorithm)。從此分析鑑定出一些顯示出在生長階段之間或餵料過程之間的表現有差異的令人感興趣的miR集群(含mmu-miR-21、mmu-miR-34b、mmu-miR-34c、mmu-miR-29a、mmu-miR-130a及mmu-miR-193)。在陣列研究中鑑定之miR可能涉及控制細胞週期和細胞凋亡。在mmu-miR-34b及mmu-miR-34c之量中 可觀察到大改變。miR中之mmu-miR-34a、-34b及-34c均密切相關且已知miR-34a為導致細胞凋亡及遏制G1之p53的標的。
B)第二種方法係在具有不同cB72.3單株抗體生產率之10種GS-CHOK1SV細胞株小組之間描寫miR。此係經由分析自10種GS-CHO細胞株的分批搖瓶培養中所採取的一式三份之細胞樣本來進行，該10種GS-CHO細胞株之分批懸浮培養中之cB72.3單株抗體的產量幅度變化很大(表4)。
從在指數生長期收集之細胞沉澱小丸中萃取RNA，並在miRCURY LNA微陣列(Exiqon，丹麥)上進行分析。根據來自分批懸浮培養之cB72.3濃度將細胞株分級並分成兩組相等大小的群組(表4：“低”製造細胞株：153、1、142、54、114；“高”製造細胞株：40、137、149、42、47)。然後，分析各miR之正常化中位數表現比(In(Hy3/Hy5))對數以鑑定與生產率的關係。在藉由miRCURYTM微陣列分析之在高和低製造組中差別表現的全數miR中，miR描寫使用老鼠基因註解鑑定出一組miR子集(15)，使用人類基因註解鑑定出18個miR。製備用於人和老鼠基因註解之熱圖圖表。表5和6中報導從人和老鼠基因註解結果之ANOVA所取得之p值。
從這些初步微陣列研究鑑定出5種顯示增加之表現係與生長(miR-21、miR-34c)或生產率(MIR-15b、miR-16及miR-186)有關之miR。
實施例2 在整個分批培養期間及製造單株抗體之“高”和“低”製 造重組GS-CHOK1SV細胞株中驗證內源性miR之表現量。
依實施例1使用miRCURY LNA微陣列系統鑑定出其表現可能與IVC或qP相關的一些miR後，進一步分析四種標的miR，即，miR-15b、miR-16、miR-21及miR-34c對GS-CHOK1SV細胞株中之重組蛋白表現的影響。
藉由瞬時轉染操縱miR之量(實施例3至5，使用類似於Jadhav等人(2012 Biotechnology and Bioengineering 109：1376-1385)概述的方法)前，首先必須證明微陣列結果與藉由qRT-PCR測量之重組GS-CHOK1SV細胞株中的標的miR是一致的。為了達成此目的，選擇三種細胞株(實施例1b)以用於進一步分析生產率(表4)和IVC(見第1圖)中之不同。在整個培養期間，在箭頭所指示之時點採樣(每一個時點採取一定數量之細胞)以供分析miR之量等。
使用MirVANA RNA萃取套組完成萃取miR後，使用市售之兩步驟TaqMan®MicroRNA分析套組(Applied Biosystems公司)測定miR之量。為了測定各樣本中之成熟miR的濃度，製備各miR之標準曲線。
使用此qRT-PCR，在下列Lonza之製造cB72.3的GS-CHOK1SV細胞株的各批培養中測定GS-CHOK1SV細胞株中之四種標的miR之濃度：GS-CHO42(“高”製造細胞株)及GS-CHO114(“低”製造細胞株)。所取得之數據與微陣列數據相合。第2圖至第5圖中之數據顯示出(A) 對β-肌動蛋白正常化及相對於第一天收集之樣本的不成熟前miR的量及(B)在不同時點從標準曲線測定之成熟miR的濃度。
在整個分批培養期間，兩種測試細胞株中的miR-15b之濃度報告於第2圖中。雖然在整個培養期間，兩種細胞株中的前miR之量顯示出類似的變化形廓(第2A圖)，在“高”製造細胞株方面，在120小時和168小時樣本中之前miR-15b的量較多。從數據中可知，成熟miR之量在兩種細胞株之間的趨勢不同，在整個培養期間，“低”製造細胞株中之成熟miR量逐漸降低，而“高”製造細胞株只在培養結束時降低(第2B圖)。因此，前miR-15b和成熟miR-15b的量之間沒有關係。此數據與微陣列數據一致，其中有些“高”製造細胞株在分批培養之第4天miR-15的量提高。
第3圖報告在整個分批培養期間，“高”和“低”製造細胞株中的前miR-16之相對量及miR-16的濃度。在整個培養期間，“高”製造細胞株中存有較“低”製造細胞株多出40-50%之前miR-16-1(第3A圖)。兩種細胞株之前miR-16的相對量在168小時(在前miR-16-1方面)和120小時(在前miR-16-2方面)達到峰值(分別為第3A圖和第3B圖)且其變化形廓類似於在前miR-15b中所觀察到者(第2A圖)。然而，再次地，成熟miR-16之變化形廓與其不同。在兩種細胞株中之成熟miR的濃度在培養期間均降低，儘管在“高”製造細胞株中之濃度總是較高(第3C圖)。此與 微陣列數據相一致，其顯示出有些“高”製造細胞株在分批培養第4天miR-16的量提升。
第4圖報告在整個分批培養期間，“高”和“低”製造細胞株中之前miR-21的相對量及miR-21之濃度。在培養時間72至120小時之間，“低”製造細胞株中之前miR-21顯示出大量增加，而“高”製造細胞株中之前miR-21的相對量較低，僅在培養之120小時至168小時之間增加(第4A圖)。在“低”製造細胞株中，前miR-21的濃度增加直到培養時間為168小時，然後在168小時至264小時之間下降，而在“高”製造細胞株中，miR-21之濃度在整個分批培養期間持續增加(第4B圖)。
第45圖報告在整個分批培養期間，“高”和“低”製造細胞株中的前miR-34c的相對量及miR-34c之濃度。在前miR-34c及成熟miR-34c方面，“高”和“低”製造細胞株之間可觀察到不同的趨勢(第5圖)。雖然在整個培養期間，兩種細胞株中的前miR-34c之相對量顯示出類似的變化形廓(第5A圖)，在“高”製造細胞株中，120小時和168小時之樣本中的前miR-34c之相對量較高。在兩種細胞株中可觀察到前miR-34c之相對量的變化形廓反映出成熟miR-34c濃度的變化形廓。在整個培養期間，“高”製造細胞株中之前miR-34c的量似乎增加，但“低”製造細胞株中所增加者則少得多(第5A圖)。“高”製造細胞株中之miR-34c的濃度在培養時間72小時至168小時之間增加，但在264小時的時候再次下降(第5B圖)。然而，在 “低”製造細胞株中，miR-34c之濃度在培養168小時之前即下降(第5B圖)。
因此，成熟miR之qRT-PCR數據大致上與上述之微陣列數據一致。
實施例3至5顯示出成熟miR之瞬時過度表現，並證明過度表現可修改所調查之GS-CHOK1SV細胞株的表型，例如比製造率、qP或活細胞濃度的積分、IVC。在這些實施例中，依下列段落中之描述，使用以質粒為基礎的方法分析個別miR和miR組合之瞬時過度表現。
實施例3 調查表現典型mAb(cB72.3)之重組GS-CHOK1SV細胞株中過度表現之外源性miR的表現量對製造率之影響
為了確認所調查之miR的功能影響，進行瞬時研究。產生表現人前miR之莖環(側邊鄰接適當之前miR基因組序列)的載體，並用於瞬時表現。藉由限制酶切和測序確認預期之序列。據報導，當使用源自CHO之莖環時，miR在CHO細胞中之瞬時表現較高，但亦可使用其他物種來過度表現前miR。然而，過度表現之量較少可能是有益的，因為外源性miR之濃度提升過高可能是有害的。
為了確認這些質粒之功能性，以編碼前miR21之表現載體瞬時轉染CHOK1SV細胞。藉由北方點墨法分析來自對照細胞(以空白質粒轉染)及經前miR-21轉染之細胞的RNA萃取物。以前miR-21構建體瞬時轉染之CHOK1SV 細胞中的成熟miR-21之量升高(數據未顯示)。與成熟miR之量相比較，所有樣本中均觀察到相對大量的前miR。此數據顯示出載體為功能性且可用於過度表現或“喚醒(knock-out)”研究中。
實施例4： 在6孔盤中瞬時轉染及過度表現標的miR
構建四個表現人前miR miR-15b、-16、-21及-34c之莖環的載體。使用這些載體來調查外源性miR對驗證微陣列數據(實施例4)時所使用之“低”和“高”製造細胞株的qP及IVC之影響。在第一組實驗中，在靜態模式培育箱中，以6孔盤格式生長細胞並以過度表現載體轉染之。各載體對轉染後所測定之qP和IVC的效果呈現於第6圖中。
在此細胞培養格式中，miR-15是唯一一種增加50%IV(與空白轉染相比較)C之外源表現的miR，且僅在“高”製造細胞株中發生(第6A圖)。在qP方面，僅外源表現之miR-34c使其顯著增加(與空白轉染相比較)，此發生在“低”和“高”製造細胞株中(第6B圖)。這表明miR-34c可能對準該涉及決定“高”和“低”製造細胞株中共有之qP的過程。
藉由在相同的兩個製造單株抗體的GS-CHOK1SV細胞株(此係生長在96孔深孔摇動盤中之懸浮培養中)中瞬時表現過度表現載體來進一步分析這些miR的作用。由於 本專利中所描述的所有GS-CHOK1SV細胞株均生長在懸浮培養中，此種培養模式更適合這些細胞株且更接近製造過程。
實施例5： 在96孔深孔搖動盤中瞬時轉染及過度表現標的miR
為了評估miR之過度表現及miR組合之過度表現在更近似生物反應器之環境中的影響，在96孔深孔搖動盤中進行實驗。以編碼一種miR之單一載體分別在懸浮液中瞬時轉染製造cB72.3單珠抗體的GS-CHOK1SV細胞株，或以組合二或三種編碼miR之載體共同轉染之。在單次轉染方面，在轉譯後48小時採取細胞和培養基之樣本，在轉譯後48小時採取或96小時採取共同轉染之樣本。在每次轉染時，測定生長(IVC)及產品滴度(藉由LISA測定)。使用三種不同之製造cB72.3的GS-CHOK1SV細胞株來測定是否有任何所觀察之影響為細胞株特異性：“高”和“低”製造細胞株，分別為CHO 42和CHO 114，加上被視為“中等”製造細胞株之CHO-56。
(i)CHO42(“高”單株抗體製造株)
以編碼前miR-34c及miR-15b、前miR-15b及前miR-16、或前miR-16和前miR-34c之分開載體瞬時共同轉染CHO42細胞，全部均顯示在轉染後96小時，培養基中之單株抗體的濃度為統計上顯著增加(分別為20.77%、 3.24%和38.7%)(第7圖)。
(ii)CHO56(“中等”單株抗體製造株)
以編碼前miR-15b及前miR-16、前miR-16及前miR-34c或前miR-15b之分開載體瞬時共同轉染CHO56細胞，前miR-16及前miR-34c顯示出在轉染後96小時，培養基中之單株抗體濃度為統計上顯著增加(分別為58.7%、57.8%及71.1%)(第8圖)。
(iii)CHO114(“低”單株抗體製造株)
在CHO114細胞株的情況中，只有那些以編碼前miR-34之載體轉染者顯示出在轉染後48小時，培養基中之單株抗體的濃度為統計上顯著增加(第9A圖)。然而，在轉染後96小時前，所有共同轉染組合均顯示出分泌到培養基中之單株抗體濃度為不同程度之統計學上顯著增加(第9B圖)。
在不同細胞株中之瞬時研究的組合數據顯示出任一前miR-15b、前miR-16或前miR-34c的任何個別過度表現、或彼等之組合的過度表現可影響一或多種具有不同生產率的製造該相同單株抗體之細胞株中的重組單株抗體之表現。
為了進一步調查，從經遺傳工程處理以穩定地過度表現個別之前miR的CHOK1SV宿主細胞中產生此轉染子匯集體。
實施例6： 產生經遺傳工程處理，以穩定地過度表現個別miR之CHOK1SV宿主匯集體
在CHOK1SV宿主細胞中(Lonza Biologics)創建過度表現個別前miR的轉染子匯集體。為了達成此點，使用額外含有嘌呤黴素選擇標記之編碼各種前miR的上述載體。藉由電穿孔法將這些載體轉染入Lonza CHOK1SV宿主細胞株中，再在含有嘌呤黴素的培養基中選擇。分析抗嘌呤黴素之匯集體的生長(第10圖)及miR含量(第11圖)以確認在匯集體中之特定成熟miR(即，該由轉染之載體以前miR形式編碼者，其再由細胞加工處理成成熟miR形式)的量升高。在分批培養期間，與對照匯集體(即，以含有嘌呤黴素標記，但不編碼前miR之同一載體分開轉染的CHOK1SV)相比較，匯集體之生長特性沒有顯著差別。然而，與對照匯集體及原始CHOK1SV宿主相比較，在所有匯集體中，各匯集體中之特定miR(與用於創建該匯集體之編碼前miR的載體有關)的濃度增加2至3倍(第11圖)。
為了測試該表現外源性miR-34c之匯集體的性能，以3'-UTR中具有或不具有海綿序列(即，互補或幾乎互補之miR標的序列；Ebert M.S.等人，2007 Nature methods 4：721-726)之螢光素酶報告基因將其瞬時超轉染(第12圖)。由於該匯集體中之miR-34c的量顯示出有所提刊，這將導致報告基因活性較對照組低。亦以編碼miR-34c之相同的 載體(用於創建該匯集體)將該穩定之匯集體瞬時超轉染，以測定其對報告基因活性是否有任何進一步的效果。如第12圖所示，當將螢光素酶報告基因轉染入該miR-34c表現匯集體時，該miR-34c序列之表現導致螢光素酶之表現降低大約65%，此與過度表現之前miR-34c被加工成成熟miR-34c之過程相一致。當將額外之編碼前miR-34c的載體轉染入匯集體時，僅當該螢光素酶報告基因轉錄盒中存有標的序列時能觀察到螢光素酶報告基因的表現進一步減少(第12圖)。與對照細胞株相比較，僅前miR-34c穩定匯集體中之報告基因活性升高。此觀察與miR-34c在製造單株抗體之細胞株中瞬時過度表現時所觀察到的結果相一致，其中觀察到培養基中之單株抗體的濃度增加。這些結果顯示出前miR-34c過度表現會導致轉基因表現增加(經由細胞來成功地將外源性前miR-34c加工為成熟miR-34c)，且CHOK1SV細胞有能力將前miR-34c加工成功能性成熟miR-34c(藉由特異於成熟miR之qRT-PCR分析測定)。
<110> Lonza
<120> 用於產生供製造重組蛋白之哺乳動物製造細胞之手段和方法
<130> 204939
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (16)

  1. 一種於哺乳動物製造細胞中製造所欲蛋白之方法，其包含下列製程步驟：a)提供哺乳動物製造細胞，b)增加步驟a)所提供之哺乳動物製造細胞中一或多種選自由下列所組成之群組的miR之濃度：miR-15、miR-16、miR-15+miR-34及miR-16+miR-34，從而取得製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞，c)在適合製造所欲蛋白之條件下培養該製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞，及d)回收步驟c)所製造之所欲蛋白，其中該哺乳動物製造細胞為CHO細胞、CHO-K1細胞或CHO-K1SV細胞。
  2. 一種用於製備供製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞之方法，該哺乳動物製造細胞能表現所欲蛋白，該方法包含下列製程步驟：x)提供哺乳動物製造細胞，y)增加步驟x)所提供之哺乳動物製造細胞中一或多種選自由下列所組成之群組的miR之濃度：miR-15、miR-16、miR-15+miR-34及miR-16+miR-34，從而取得製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞，及z)回收步驟y)所製造之製造蛋白的經遺傳工程處理之哺乳動物製造細胞，其中該哺乳動物製造細胞為CHO細胞、CHO-K1細胞或CHO-K1SV細胞。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該miR-15為miR-15a或miR-15b。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該miR-34為miR-34c。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該一或多種miR之濃度的增加係藉由以一或多種選自由下列所組成之群組的miR轉染步驟b)或y)之哺乳動物製造細胞：miR-15、miR-16、miR-15+miR-34及miR-16+miR-34。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該一或多種miR之濃度的增加係藉由以至少一種含有編碼一或多種miR之核苷酸序列的載體轉染步驟b)或y)之哺乳動物製造細胞，該編碼一或多種miR之核苷酸序列係受至少一種允許該一或多種miR過度表現的調控元件控制，其中該一或多種miR係選自由下列所組成之群組：miR-15、miR-16、miR-15+miR-34及miR-16+miR-34。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中轉染該等miR之兩者或編碼該兩種miR之兩種核苷酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該miR為成熟miR、前體miR或初級miR。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該至少一種編碼步驟b)或y)之一或多種miR的載體係經瞬時或穩定轉染。
  10. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中在步驟a)或x)之前或在步驟b)或y)期間以編碼所欲蛋白之核苷酸序列轉染該哺乳動物製造細胞。
  11. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中以編碼所欲蛋白之核苷酸序列轉染在步驟b)或y)之後取得的製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞。
  12. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該允許一或多種miR過度表現之調控元件為啟動子。
  13. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞為顯現比製造率(specific production rate)增加或活細胞濃度之時間積分增加或該兩者均增加的細胞。
  14. 一種如申請專利範圍第2至13項中任一項之方法所製造的製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞。
  15. 一種製造蛋白之經遺傳工程處理的哺乳動物製造細胞，其包含至少一種編碼一或多種miR之轉基因核酸序列，該轉基因核酸序列係在至少一種允許該一或多種miR過度表現的調控元件之控制下瞬時或穩定地併入該細胞之基因組，其中該一或多種miR係選自由下列所組成之群組：miR-15、miR-16、miR-15+miR-34及miR-16+miR-34，且其中該哺乳動物製造細胞為CHO細胞、CHO-K1細胞或CHO-K1SV細胞。
  16. 一種用於在哺乳動物製造細胞中製造所欲蛋白之套組，其包含至少一種哺乳動物製造細胞、至少一種含有編碼一或多種miR之核苷酸序列的載體及用於以該至少一種載體轉染至少一種哺乳動物製造細胞的機構，其中該編碼一或多種miR之核苷酸序列係受至少一種允許該一或多種miR過度表現的調控元件控制，其中該一或多種miR係選自由下列所組成之群組：miR-15、miR-16、miR-15+miR-34及miR-16+miR-34，且其中該哺乳動物製造細胞為CHO細胞、CHO-K1細胞或CHO-K1SV細胞。
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