CN116676339A - 长链非编码rna neat1在调控肌纤维类型转化上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNANEAT1在调控肌纤维类型转化上的应用，是长链非编码RNANEAT1的一种新用途。本发明通过在肌细胞中干扰NEAT1表达或过表达NEAT1，来研究NEAT1对肌细胞中与肌纤维类型相关的基因及其蛋白表达的影响，发现lncRNANEAT1对肌细胞肌纤维转化具有重要调控作用：lncRNANEAT1能够促进慢肌基因及其蛋白表达，抑制快肌基因及其蛋白表达。而肌细胞中快、慢肌基因及其蛋白的表达会直接影响肌纤维类型的比例，因此可以通过调控肌细胞中lncRNANEAT1的表达来进一步影响肌纤维类型的比例，实现肌纤维类型的转化。由此，可通过抑制或过表达lncRNANEAT1的方式来调控肌纤维类型的转化，进一步调控动物的肉质，为培育瘦肉型或育肥型动物提供基础和新思路。

Description

长链非编码RNA NEAT1在调控肌纤维类型转化上的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种长链非编码RNA NEAT1在调控肌纤维类型转化上的应用。

背景技术

骨骼肌在调节动物新陈代谢和体内平衡中起关键作用。骨骼肌的主要成分为肌纤维。动物出生后肌纤维类型并不是固定不变的，不同类型的肌纤维可能在生理或外界因素影响下进行转化。肌纤维在肌肉组织中的相对丰度与动物性能和最终肉质发展变化有关。因此，肌纤维类型组成与肌肉产量、肉质密切相关。肌纤维中含量最多的蛋白是肌球蛋白，目前最常用也最准确的肌纤维类型分类方法，是根据肌纤维中肌球蛋白重链基因的多态性表达进行分类。成年哺乳动物骨骼肌中仅表达Ⅰ型、ⅡA型、ⅡB型和ⅡX型这四种MyHC异构体，它们可以通过ATP组织化学染色法进行区分肌肉品质。事实上，肌肉肌纤维的类型取决于数量占优势的肌纤维类型，一般随着Ⅱ型肌纤维比例增加而下降。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类没有或少有蛋白编码能力、且长度大于200nt的RNA分子，具有表达丰度低、外显子数目少以及组织特异性表达等特性。lncRNA的功能多样，在细胞增殖和分化、基因印记、剂量补偿、干细胞多能性、胚胎发育、免疫应答和肿瘤发生等多种生物学过程均发挥重要作用。近年来已经发现多个对肌肉发育有重要调控作用的lncRNA，但是对肌纤维类型转化有调控作用的lncRNA目前报道的较少。

NEAT1能够维持哺乳动物的特异性核体核斑点的稳定性，在许多基因调控过程中发挥重要作用，但其对肌纤维类型的影响却未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种长链非编码RNA NEAT1在调控肌纤维类型转化上的应用，可进一步为培育瘦肉型或育肥型动物提供基础和新的思路。

根据本发明的第一个方面，提供了长链非编码RNA NEAT1在调控肌纤维类型转化上的应用。由此，发现了长链非编码RNA NEAT1在调控肌纤维类型转化上的新用途，可以为其进一步在动物肉质改善上的应用提供基础和思路。

在某些实施方式中，所述应用为促进慢肌纤维向快肌纤维转化上的应用。

在某些实施方式中，所述应用为提高肌肉中快肌纤维相关基因表达及降低慢肌纤维相关基因表达；所述快肌纤维相关基因为MyHC-ⅡA、MyHC-ⅡB、MyHC-ⅡX中一种或多种；所述慢肌纤维相关基因为MyHC-Ⅰ。

在某些实施方式中，所述应用是通过抑制NEAT1表达来实现的，所述抑制NEAT1表达可通过干扰NEAT1表达来实现。

在某些实施方式中，所述应用为促进快肌纤维向慢肌纤维转化上的应用。

在某些实施方式中，所述应用为提高肌肉中慢肌纤维相关基因表达及降低快肌纤维相关基因表达；所述快肌纤维相关基因为MyHC-ⅡA、MyHC-ⅡB、MyHC-ⅡX中一种或多种；所述慢肌纤维相关基因为MyHC-Ⅰ。

在某些实施方式中，所述应用是通过过表达NEAT1来实现的。

根据本发明的第二个方面，提供了一种含有可抑制长链非编码RNA NEAT1表达的试剂盒/核酸分子/重组蛋白/重组载体/产品在促进动物肌肉类型中慢肌纤维向快肌纤维转化上的应用。由此，可提高快肌相关基因表达比例，进而提高快肌纤维比例，可进一步改善动物的肉质。

根据本发明的第三个方面，提供了一种含有可使长链非编码RNA NEAT1过表达的试剂盒/核酸分子/重组蛋白/重组载体/产品在促进动物肌肉类型中快肌纤维向慢肌纤维转化上的应用。由此，可提高慢肌相关基因表达比例，进而提高慢肌纤维比例，可进一步改善动物的肉质。

在某些实施方式中，所述应用是通过调控动物肌肉组织中糖酵解过程来实现肌纤维类型转化的。

根据本发明的第四个方面，提供了一种长链非编码RNA NEAT1在调控糖酵解过程中的应用。

本申请的有益效果：

本申请通过在肌细胞中干扰NEAT1表达或过表达NEAT1，来研究NEAT1对肌细胞中与肌纤维类型相关的基因及其蛋白表达的影响，发现lncRNA NEAT1对肌细胞肌纤维转化具有重要调控作用：lncRNA NEAT1能够促进慢肌基因及其蛋白表达，抑制快肌基因及其蛋白表达。而肌细胞中快、慢肌基因及其蛋白的表达会直接影响肌纤维类型的比例，因此可以通过调控肌细胞中lncRNA NEAT1的表达来进一步影响肌纤维类型的比例，实现肌纤维类型的转化。由此，可通过抑制或过表达lncRNA NEAT1的方式来调控肌纤维类型的转化，进一步调控动物的肉质，为培育瘦肉型或育肥型动物提供基础和新的思路。

附图说明

图1为qPCR验证过表达NEAT1基因后猪骨骼肌卫星细胞肌纤维类型相关基因表达量的结果图：其中，pcDNA3.1表示空白对照质粒，pcDNA3.1-pNEAT1表示猪NEAT1基因过表达载体，MyHC-Ⅰ/slow表示慢肌基因表达结果，MyHC-ⅡA、MyHC-ⅡB、MyHC-ⅡX表示快肌基因表达结果，**与***表示差异极显著；

图2为Western blot技术验证过表达NEAT1基因后猪骨骼肌卫星细胞肌纤维类型相关基因的蛋白表达结果图：其中，pcDNA3.1表示空白对照质粒，pcDNA3.1-pNEAT1表示猪NEAT1基因过表达载体，MyHC-Ⅰ/slow表示慢肌基因蛋白表达结果，MyHC-ⅡA、MyHC-ⅡB、MyHC-ⅡX表示快肌基因蛋白表达结果，**表示差异极显著，*表示差异显著；

图3为Western blot技术验证过表达NEAT1基因后小鼠成肌细胞C2C12细胞肌纤维类型相关基因的蛋白表达结果图：其中，pcDNA3.1表示空白对照质粒，pcDNA3.1-NEAT1表示小鼠NEAT1基因过表达载体，MyHC-Ⅰ/slow表示慢肌基因蛋白表达结果，MyHC-ⅡA、MyHC-ⅡB、MyHC-ⅡX表示快肌基因蛋白表达结果，**表示差异极显著，*表示差异显著；

图4为qPCR检测siRNA干扰lncRNA NEAT1后对猪骨骼肌卫星细胞肌纤维类型相关基因表达量结果图：其中，si-NC表示空白对照siRNA，si-pNEAT1表示猪干扰siRNA，**表示差异极显著，*表示差异显著；

图5为qPCR检测siRNA干扰lncRNA NEAT1后对小鼠成肌细胞C2C12细胞肌纤维类型相关基因表达量结果图：其中，si-NC表示空白对照siRNA，si-Neat1表示小鼠干扰siRNA，**表示差异极显著，*表示差异显著；

图6为Western blot技术检测siRNA干扰lncRNA NEAT1后对猪骨骼肌卫星细胞肌纤维类型相关基因的蛋白表达结果图：其中，si-NC表示空白对照siRNA，si-pNEAT1表示猪干扰siRNA，**表示差异极显著，*表示差异显著；

图7为Western blot技术检测siRNA干扰lncRNA NEAT1后小鼠成肌细胞C2C12细胞肌纤维类型相关基因的蛋白表达结果图：其中，si-NC表示空白对照siRNA，si-Neat1表示小鼠干扰siRNA，**表示差异极显著，*表示差异显著；

图8为RNA pulldown技术蛋白检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例一lncRNA NEAT1的获得

引物设计：利用NCBI数据库检索小鼠和猪lncRNA NEAT1序列(小鼠NCBI基因序列号：NR_003513.3、猪NCBI基因序列号：MN784916.1)，根据lncRNA NEAT1序列和载体质粒图谱设计带酶切位点的引物，引物序列如下表1所示(表中Neat1-FL表示小鼠的引物，pNEAT1-FL表示猪的引物)：

表1 lncRNA-NEAT1全长扩增引物序列

注：F代表上游引物，R代表下游引物；下划线部分为酶切位点。

PCR扩增反应：首先用质量检测合格的小鼠和猪细胞cDNA作为模板，使用不带酶切位点的NEAT1上下游全长引物进行特异性扩增，得到目的片段后进行胶回收纯化；第二步以胶回收纯化产物作为PCR模板，用设计的带酶切位点的NEAT1上下游全长引物进行扩增，得到带酶切位点的NEAT1全长，进行胶回收纯化。PCR扩增反应体系和反应条件见下表2和3。

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应条件

实施例二lncRNA NEAT1过表达载体的构建

(1)分别用相同的限制性内切酶(BamHⅠ与EcoRI)对所得带酶切位点的pNEAT1(猪NEAT1)和NEAT1(小鼠NEAT1)全长片段及pcDNA3.1(+)真核表达载体进行酶切，反应体系如下表4所示，37℃孵育2h，再用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果并回收目的片段。

表4双酶切反应体系

(2)使用T4 DNA连接酶试剂盒按照下表5反应体系混合回收的片段，22℃反应30min。

表5连接反应体系

(3)进行重组连接产物转化，具体操作如下：

①取50μL冰浴上融化的感受态细胞，加入连接产物，轻柔混匀，冰浴30min。

②42℃水浴热激45s，快速转移至冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。

③向离心管中加入500μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后37℃，220rpm摇床复苏1h。

④室温下，1500rpm离心5min，去除大部分上清，吹打混匀剩余液体，滴加到LA固体培养基上，将细胞均匀涂开。

⑤平板置于37℃培养箱中正置培养30min，倒置平板，过夜培养。

⑥超净工作台提前紫外灭菌，用灭菌枪头从抗性平板中挑取单克隆菌落，加入500μL的LA液体培养基中，37℃恒温摇床扩大培养4-6h。

⑦培养后菌液送测，利用SnapGene软件比对测序结果，鉴定序列是否正确。

⑧将连接成功且测序正确的阳性克隆菌液转入50mL离心管，按菌液：LA培养基＝1：100混匀，37℃，220rpm过夜培养。

⑨使用Endo-free Plasmid Mini KitⅡ试剂盒提取去内毒素质粒，测浓度并记录，即可获得猪和小鼠的lncRNA-NEAT1过表达载体，-20℃保存备用。

实施例三干扰片段合成

本研究所用小鼠和猪siRNA干扰片段由苏州吉玛基因股份有限公司设计合成，序列见下表6(表6中si-Neat1表示小鼠siRNA干扰片段、si-pNEAT1表示猪siRNA干扰片段、siRNA NC表示阴性对照片段)。

表6 siRNA干扰片段序列

实施例四lncRNA NEAT1过表达载体对肌纤维类型转化的影响

用实施例二中构建获得的lncRNA NEAT1过表达载体(质粒)分别转染猪和小鼠细胞，对转染后的细胞进行qPCR验证及蛋白表达验证，具体如下：

1、qPCR验证

(1)细胞RNA提取

使用购自Invitrogen的Trizol试剂提取总RNA，具体步骤如下：

①弃培养基，DPBS清洗细胞2次。

②弃DPBS，每孔加入1mlTrizol试剂，移液枪吹打数次使贴壁细胞脱落，并转移液体至1.5ml去核酸酶离心管，涡旋后室温静置10min。

③加入200μL三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温静置2-3min。

④12000rpm，4℃离心15min。

⑤取上层水相液体到新的1.5ml去核酸酶离心管，加入等体积预冷异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min。

⑥12000rpm，4℃离心10min，观察沉淀，小心弃液。

⑦往沉淀中加入1ml 75％乙醇，上下颠倒使沉淀悬浮。

⑧7500rpm，4℃离心5min，弃液，重复步骤(7-8)，室温风干。

⑨加入20μL无酶DEPC水溶解沉淀，测浓度。

(2)cDNA的制备

cDNA使用EvoM-MLV反转录试剂盒根据说明书进行合成。

(3)实时荧光定量PCR

①将所得cDNA用于RT-PCR实验，反应体系及反应条件如下表7和8：

表7 qPCR反应体系

表8 qPCR反应条件

②数据分析

实验利用Quant StudioTM 7 Flex实时荧光定量PCR系统进行，每次实验准备三个样本重复和三个技术重复，反应结束后确认溶解曲线及扩增曲线是否准确无误，检测结果应用2^-△△CT法进行分析。

2、蛋白表达验证

取转染后的六孔板细胞样品，具体操作如下：

(1)细胞蛋白提取

①全程实验注意在冰上操作。弃培养基，PBS清洗细胞2次。

②每孔加入200μL RIPA裂解液(使用前按100：1比例加入PMSF)。

③用移液枪吹打，使细胞与裂解液充分接触，使用枪头或细胞刮将细胞刮下来，将液体转移至1.5ml离心管。

④剧烈振荡，冰上孵育10min。

⑤14000×g，4℃离心7min。

⑥取上清液转移至新的1.5ml离心管，若不进行变性，-80℃保存样品。

⑦变性：按照上清液：6x protein loading buffer＝5:1的比例稀释并混匀蛋白样品，95-98℃变性5-10min，-20℃保存样品。

(2)SDS-PAGE凝胶制备

①使用洗洁精刷净玻璃长板及短板，用夹子夹紧后加入纯水验漏，10min后观察液面，若未下降则倒掉纯水，并用滤纸吸干残留液体。

②按照说明书操作，采用SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒制作12％凝胶。

③待凝胶凝固后即可使用，不立即使用则浸泡纯水中，4℃备用。(3)SDS-PAGE凝胶电泳

④制备好的凝胶取出梳子，组装至电泳槽中，加入纯水验漏，10min后若液面未下降则倒掉纯水，加入配制好的电泳液，准备上样。

⑤按顺序加样，每孔加入30μg变性后蛋白样品，在样品孔两端加入5μL彩色预染Marker，剩余孔上等量蛋白loading buffer补齐。

⑥连接电源，200V恒压电泳7min保证样品进入分离胶，120V恒压电泳直至溴酚蓝指示带到达分离胶底部。

(4)转膜

①提前用TBST浸泡转膜时使用的夹子、滤纸及海绵等，准备适当大小的0.45μmPVDF膜，预冷甲醇活化10min。

②取出电泳完成的凝胶，按照Marker指示带及目的蛋白分子量切下凝胶。

③按照负极-海绵-滤纸2张-凝胶-滤纸2张-海绵-正极的顺序组装三明治夹，放入转膜槽，灌满转膜液。

④连接电源，200mA恒流转膜，时间试目的蛋白大小而定。

(5)抗原抗体免疫反应及显影

①转膜结束后，用镊子取出PVDF膜，TBS清洗2次，每次5min。

②用TBST配制的6％脱脂奶粉封闭3h以上。

③TBS洗膜3次，每次10min。

④用TBST稀释的一抗4℃孵育过夜。

⑤一抗回收，TBST洗膜3次，TBS洗膜1次，每次10min。

⑥用TBST稀释的二抗，37℃脱色摇床孵育1h。

⑦TBST洗膜3次，TBS洗膜1次，每次10min。

⑧避光条件下，按照说明书配制ECL发光液，均匀浸泡在含有蛋白样品的PVDF膜上。

⑨使用化学发光成像仪成像，利用ImageJ软件量化灰度值并分析。

3、结果分析

将lncRNA NEAT1过表达载体分别转染到PSC猪骨骼肌卫星细胞和C2C12小鼠成肌细lncRNA NEAT1胞中，分别诱导分化3天和5天后，利用qPCR、Western blot蛋白检测lncRNANEAT1过表达载体对肌纤维类型转化的影响，结果如下(结果图中MyHC-Ⅰ为慢肌基因，MyHC-ⅡA、MyHC-ⅡB、MyHC-ⅡX为快肌基因)：

如图1所示，过表达pNEAT1显著增加猪骨骼肌卫星细胞慢肌基因的mRNA表达量，且快肌基因的mRNA表达量得到显著降低。

如图2所示，过表达pNEAT1显著增加了猪骨骼肌卫星细胞慢肌相关基因蛋白的表达，并抑制了快肌相关基因蛋白的表达。

如图3所示，过表达Neat1显著增加C2C12慢肌相关基因蛋白的表达，抑制了快肌相关基因蛋白表达。

上述结果表明过表达载体能够促进慢肌纤维表达，抑制快肌纤维表达，推断其能够促进快肌纤维向慢肌纤维的转化。

实施例五干扰NEAT1对肌纤维类型转化的影响

此实施例的qPCR和Western blot实验操作与实施例四相同。

将干扰片段分别转染到PSC猪骨骼肌卫星细胞和C2C12小鼠成肌细胞中，分别诱导分化3天和5天后，利用qPCR、Western blot检测干扰对肌纤维类型转化的影响，结果如下(结果图中MyHC-Ⅰ为慢肌基因，MyHC-ⅡA、MyHC-ⅡB、MyHC-ⅡX为快肌基因)：

如图4所示，干扰pNEAT1显著增加猪骨骼肌卫星细胞快肌相关基因的mRNA表达量。

如图5所示，干扰Neat1显著增加C2C12快肌相关基因的mRNA表达量，降低慢肌基因的mRNA表达量。

如图6所示，干扰pNEAT1显著促进猪骨骼肌卫星细胞快肌相关基因的蛋白表达，抑制慢肌相关基因蛋白表达。

如图7所示，干扰Neat1显著增加了C2C12快肌相关基因的蛋白表达，而慢肌相关基因的蛋白表达得到显著抑制。

上述结果表明干扰片段能够增加快肌相关基因表达，抑制慢肌相关基因表达，推断其可促使慢肌纤维向快肌纤维转化。

实施例六lncRNA NEAT1互作蛋白钓取

为进一步研究lncRNA NEAT1在肌纤维类型转化中发挥作用的分子机制，我们首先在分化期的PSC和C2C12细胞肌管中，利用RNA pulldown技术钓取与Neat1和pNEAT1结合的蛋白质，切下Neat1和pNEAT1特异性结合的蛋白条带，并利用蛋白质谱技术对钓取的蛋白进行鉴定。步骤如下：

1、RNA pulldown蛋白提取

①以一个10cm培养皿细胞为一个样品，加入10mL预冷DPBS清洗细胞3次。

②加入1ml RIP Buffer，用细胞刮将细胞刮下来，转移到1.5ml离心管。

③每管加入15μL PMSF，混合均匀，去除气泡。

④使用超声波细胞粉碎机破碎细胞：功率25％，开9.9s，关9.9s，时间4min。

⑤14000rpm，4℃离心10min，弃沉淀，根据说明书步骤进行BCA法测定蛋白浓度，-80℃保存。

2、RNA pulldown

①取3μg生物素标记RNA，加入2μL RNase Inhibitor，混匀，90℃孵育2min，立即冰浴2min。

②加入RNA Structure Buffer至100μL，室温孵育20min，使RNA自动形成二级结构。

③冰上溶解2.3.11.3准备的蛋白，每1mg蛋白加入1μL PMSF，5μL RNaseInhibitor，加入RIP Buffer补齐至1mL，混匀。

④每3μg生物素标记RNA与1mg蛋白混合，室温旋转孵育1h。

⑤提前准备30μL生物素标记磁珠，1mL RIP Buffer清洗3次，每次5min。

⑥将磁珠与RNA-蛋白复合物混合，室温旋转孵育1h。

⑦孵育结束后，RIP Buffer清洗5次，每次5min。

⑧弃RIP Buffer，加入20μLDEPC水和10μL蛋白loading buffer，混匀，98℃变性10min，冰上孵育5min，-20℃保存。

⑨Western blot检测，电泳后整块凝胶使用银染试剂盒根据说明书步骤进行染色，结果如图8所示。

3、测序结果

蛋白胶条测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成，部分测序结果如下表9和10：

表9 Neat1 pulldown钓取蛋白列表(猪)

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表10 pNeat1 pulldown钓取蛋白列表(小鼠)

结合表9和10中Neat1 pulldown钓取的蛋白进行分析，发现在猪中LDHB、PKM等基因编码的蛋白与lncRNA NEAT1互作，在小鼠中Ldha、Pkm等基因编码的蛋白与lncRNA NEAT1互作，这些基因均为参与糖酵解过程的关键蛋白，而糖酵解是影响肌纤维快、慢肌转化的重要环节，因此推导lncRNA NEAT1通过参与糖酵解过程来参与调控猪和小鼠肌纤维类型转化。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

Claims (10)

1.长链非编码RNANEAT1在调控肌纤维类型转化上的应用。

2.根据权利要求1中所述的应用，其中，所述应用为促进慢肌纤维向快肌纤维转化上的应用。

3.根据权利要求2中所述的应用，其中，所述应用为提高肌肉中快肌纤维相关基因表达及降低慢肌纤维相关基因表达；所述快肌纤维相关基因为MyHC-ⅡA、MyHC-ⅡB、MyHC-ⅡX中一种或多种；所述慢肌纤维相关基因为MyHC-Ⅰ。

4.根据权利要求3中所述的应用，其中，所述应用是通过抑制NEAT1表达来实现的，所述抑制NEAT1表达可通过干扰NEAT1表达来实现。

5.根据权利要求1中所述的应用，其中，所述应用为促进快肌纤维向慢肌纤维转化上的应用。

6.根据权利要求5中所述的应用，其中，所述应用为提高肌肉中慢肌纤维相关基因表达及降低快肌纤维相关基因表达；所述快肌纤维相关基因为MyHC-ⅡA、MyHC-ⅡB、MyHC-ⅡX中一种或多种；所述慢肌纤维相关基因为MyHC-Ⅰ。

7.根据权利要求6中所述的应用，其中，所述应用是通过过表达NEAT1来实现的。

8.含有可抑制长链非编码RNANEAT1表达的试剂盒/核酸分子/重组蛋白/重组载体/产品在促进动物肌肉类型中慢肌纤维向快肌纤维转化上的应用。

9.含有可使长链非编码RNANEAT1过表达的试剂盒/核酸分子/重组蛋白/重组载体/产品在促进动物肌肉类型中快肌纤维向慢肌纤维转化上的应用。

10.根据权利要求1、8、9中任一项所述的应用，其中，所述应用是通过调控动物肌肉组织中糖酵解过程来实现肌纤维类型转化的。