CN112779254A - 基于hdr基因编辑方法培育短尾绵羊用核酸分子、试剂盒及方法和应用 - Google Patents

基于hdr基因编辑方法培育短尾绵羊用核酸分子、试剂盒及方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用核酸分子、试剂盒及方法和应用，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明提供了一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述sgRNA能够对绵羊TBXT基因进行精准突变的编辑，所获得的基因编辑绵羊及其后代的尾巴变短、尾椎数显著减低，同时原有的生产性能保持不变。

Description

基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用核酸分子、试剂盒及方 法和应用
技术领域
本发明涉及细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及基于同源序列介导的双链DNA修复(Homology-directedrepair，HDR)基因编辑方法培育短尾绵羊用核酸分子、试剂盒及方法和应用。
背景技术
尾巴长短是绵羊品种的显著特征之一。绝大多数的专用型绵羊培育品种都具有痩长尾，如产毛为主的细毛羊、以产肉为主的萨福克羊、特克赛尔羊等品种。这些品种具备良好的毛用或肉用生产性能，能够为饲养者带来巨大的经济效益，也因此成为目前养羊业发达国家绵羊生产的主体品种。在我国，这些绵羊品种作为良种也被广泛推广和应用。由于长尾容易沾染粪便，不仅易引发感染性疾病，而且污染后躯，对细毛羊而言就会污染羊毛，降低羊毛的品质和等级，同时长尾还会影响到绵羊的自然交配。所以，绵羊生产中必须在新生羔羊阶段进行断尾，去除长尾。新生羔羊断尾是绵羊生产管理过程中必不可少的重要环节。然而，断尾不仅要消耗人力、物力和时间，而且羔羊还会因断尾造成的创伤引发蝇蛆感染、关节炎、干酪性淋巴腺炎等疾病。目前主要的断尾方法有热烧烙和结扎断尾法，这些方法既造成羔羊严重的应激反应，增加羔羊死亡的风险，导致发育受阻影响其生产性能，又直接威胁动物福利。因此，培育不需要断尾、同时生产性能优良的短尾绵羊品种是解决这一难题的有效途径。但目前并没有一种高效培育短尾绵羊品种的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用核酸分子、试剂盒及方法和应用。本发明所述sgRNA能够对绵羊TBXT基因进行精准突变的编辑，所获得的基因编辑绵羊及其后代的尾巴变短、尾椎数显著减低，同时原有的生产性能保持不变。
本发明提供了一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用sgRNA表达载体，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述表达载体的骨架载体包括pX330。
本发明还提供了一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用单链寡核苷酸ssODN，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用试剂盒，所述试剂盒包括sgRNA和单链寡核苷酸ssODN，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的是，所述试剂盒还包括Cas9 mRNA和DNA连接酶IV抑制剂SCR7。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述试剂盒的基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊的方法，包括以下步骤：
将sgRNA、单链寡核苷酸ssODN、Cas9 mRNA和DNA连接酶IV抑制剂SCR7导入绵羊受精卵中，以获得短尾绵羊。
优选的是，所述sgRNA的导入浓度为40～60ng/μL；所述单链寡核苷酸ssODN的导入浓度为40～60ng/μL；所述Cas9 mRNA的导入浓度为180～220ng/μL；所述DNA连接酶IV抑制剂SCR7的导入浓度为0.8～1.2μmol/L。
本发明还提供了上述技术方案所述sgRNA或上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述ssODN或上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述方法在培育短尾绵羊中的应用。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述sgRNA或上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述ssODN或上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述方法获得的培育短尾绵羊的基因，所述基因包括TBXT基因外显子2发生特定位点替换突变和/或发生Indel突变；所述特定位点替换突变为：TBXT基因外显子2第334位的碱基由C变成A和第333位的碱基由C变成G。
优选的是，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
本发明提供了一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用sgRNA。本发明提供的为了实现绵羊TBXT基因精准突变的sgRNA的序列能够结合TBXT基因外显子2中的序列，本发明提供的同源重组模板单链寡核苷酸ssODN是在TBXT基因重组修复时将TBXT基因外显子2第334位的碱基由C变成A(C334A)、第333位的碱基由C变成G(C333G)，本发明sgRNA和ssODN的结合进行的基因编辑能够实现降低绵羊尾椎数量，缩短尾巴长度的目的。本发明提供的核酸分子能够实现绵羊TBXT基因的高效、精准突变，个体水平突变率可达43.18％，获得的基因编辑绵羊尾巴变短，尾椎数由野生型的18.47减低到15.32，尾长和尾长/体全长的比例分别由野生型的25.71厘米、0.285减低到20.92厘米、0.229。本发明实施例中利用TBXT基因编辑效果最佳的羊进行扩繁，G1后代不仅携带了基因编辑突变，并且保持了亲本短尾性状，尾巴变短，尾椎数减少。
附图说明
图1为本发明提供的TBXT基因编辑位置、sgRNA序列和ssODN序列图；
图2为本发明提供的同源修复模板ssODN序列图；
图3为本发明提供的TBXT基因精准编辑细毛羊的基因编辑类型图；
图4为本发明提供的TBXT基因编辑羊的短尾表型图；
图5为本发明提供的TBXT编辑羊GM079后代中TM、InDel编辑羊和野生型细毛羊尾椎数比较结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：CTGCGGCTCCGGCTTGCCCCC。本发明所述sgRNA能够基于HDR方法对TBXT基因进行编辑，具体为对TBXT基因外显子2(如SEQ ID NO.3所示：CTGGCCCCCTCCATTGAGCTTGTTGGTGAGCTTGACTTTGCTGAAGGAGACAGGTGCCTTCATCCAGTGCGCCCCGAAGTTGGGGGAGTCGGGGTGGATGTAGACGCAGCTGGGCGCCTGCGGCTCCGGCTTGCCCCCCGGCACCCACTCCCCGTTCACGTACTTCCAGCGGTGGTTGTCGGCGGCCACGAAGTCCAGCAGGAAGGAGTACATGGCGTTGGGGTCCAGGCCGGATACGTTCACCTTCAGCACCGGGAACATCCTC，对应于图3中的WT)进行编辑。本发明所述sgRNA优选由表1所述核苷酸序列退火所得。
表1用于制备sgRNA的引物表
Figure BDA0002911462190000041
本发明还提供了一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用sgRNA表达载体，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述表达载体的骨架载体包括pX330。本发明所述表达载体的构建方法优选包括以下步骤：将pX330质粒经BbsI酶切，得到酶切载体，将退火所得的sgRNA与酶切载体连接，得到重组质粒；以所述重组质粒为模板，通过体外转录、纯化得到sgRNA，得到的sgRNA可用于后续的显微注射。
本发明还提供了一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用单链寡核苷酸ssODN，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：CCTTCATCCAGTGCGCCCCGAAGTTGGGGGAGTCGGGGTGGATGTAGACGCAGCTGGGCGCCTGCGGCTCCGGATTGCCCCAGGGCACCCACTCCCCGTTCACGTACTTCCAGCGGTGGTTGTCGGCGGCCACGAAGTCCAGC。本发明对所述ssODN的来源没有特殊限定，送交DNA合成公司依照该序列信息进行人工合成即可。本发明所述ssODN为用于编辑绵羊TBXT基因时的同源修复模板，sgRNA和ssODN的组合能够实现对绵羊TBXT基因进行精准突变的编辑，编辑类型为TBXT基因外显子2第334位的碱基由C变成A和第333位的碱基由C变成G，获得的基因编辑绵羊及其后代的尾巴变短、尾椎数显著减低。
本发明还提供了基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用试剂盒，所述试剂盒包括sgRNA和单链寡核苷酸ssODN，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。在本发明中，所述试剂盒优选还包括Cas9 mRNA和DNA连接酶IV抑制剂SCR7。本发明对所述Cas9 mRNA的来源没有特殊限定，在本发明实施例中，本发明优选以px330质粒为模板、表2所述序列为引物，PCR扩增Cas9序列，通过体外转录、纯化得到用于显微注射的Cas9 mRNA。
表2用于体外转录的Cas9引物表
Figure BDA0002911462190000051
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述试剂盒的基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊的方法，包括以下步骤：
将sgRNA、单链寡核苷酸ssODN、Cas9 mRNA和DNA连接酶IV抑制剂SCR7导入绵羊受精卵中，以获得短尾绵羊。本发明所述导入的方法优选为显微注射。
由上述组分组成的基于HDR基因编辑技术系统中，Cas9 mRNA翻译后形成的Cas9核酸酶具有切割双链DNA的活性结构域，使得双链DNA断裂；sgRNA通过RNA-DNA碱基互补配对将Cas9/sgRNA复合物靶向募集到目的基因，Cas9再通过识别目的基因上的PAM序列(5’-NGG-3’)定点切割双链DNA，进而对目的基因起到编辑作用。在Cas9蛋白使DNA发生双链断裂(Double-strandbreaks，DSBs)后，在基于同源序列介导的双链DNA修复(Homology-directedrepair，HDR)机制中引入同源修复模板ssODN以达到精准编辑的目的。SCR7的加入则可以有效提高HDR基因编辑效率。
在本发明中，所述sgRNA的导入浓度优选为40～60ng/μL，更优选为50ng/μL；所述单链寡核苷酸ssODN的导入浓度优选为40～60ng/μL，更优选为50ng/μL；所述Cas9 mRNA的导入浓度优选为180～220ng/μL，更优选为200ng/μL；所述DNA连接酶IV抑制剂SCR7的导入浓度优选为0.8～1.2μmol/L，更优选为1.0μmol/L。本发明所述导入浓度的设定能够保证最佳的基因编辑效果，浓度过低可能导致基因编辑效果差，过高可能会导致受精卵死亡。在本发明中，SCR7的溶剂优选为DMSO，Cas9 mRNA、sgRNA和ssODN的溶剂优选为Nuclease-FreeWater。
本发明还提供了上述技术方案所述sgRNA或上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述ssODN或上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述方法在培育短尾绵羊中的应用。本发明所述培育方法能够针对TBXT基因的具体位点进行编辑，具有准确、直接、高效的特点，育种周期短、表型预见性好。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述sgRNA或上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述ssODN或上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述方法获得的培育短尾绵羊的基因，所述基因包括TBXT基因外显子2发生特定位点替换突变和/或发生Indel突变；所述特定位点替换突变为：TBXT基因外显子2第334位的碱基由C变成A和第333位的碱基由C变成G。在本发明中，所述TBXT基因外显子2发生Indel突变优选包括TBXT基因外显子2第332位到第339位共8个碱基缺失的突变，即GM079；或TBXT基因外显子2第330位到第341位共12个碱基缺失的突变，即GM075。
在本发明中，所述基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6所示。
C334A和C333G突变后的Exon2序列如SEQ ID NO.4所示：
CTGGCCCCCTCCATTGAGCTTGTTGGTGAGCTTGACTTTGCTGAAGGAGACAGGTGCCTTCATCCAGTGCGCCCCGAAGTTGGGGGAGTCGGGGTGGATGTAGACGCAGCTGGGCGCCTGCGGCTCCGGCTTGCCCCAGGGCACCCACTCCCCGTTCACGTACTTCCAGCGGTGGTTGTCGGCGGCCACGAAGTCCAGCAGGAAGGAGTACATGGCGTTGGGGTCCAGGCCGGATACGTTCACCTTCAGCACCGGGAACATCCTC。
Indel突变(8bp删除)Exon2序列如SEQ ID NO.5所示：
CTGGCCCCCTCCATTGAGCTTGTTGGTGAGCTTGACTTTGCTGAAGGAGACAGGTGCCTTCATCCAGTGCGCCCCGAAGTTGGGGGAGTCGGGGTGGATGTAGACGCAGCTGGGCGCCTGCGGCTCCGGCTT--------GCACCCACTCCCCGTTCACGTACTTCCAGCGGTGGTTGTCGGCGGCCACGAAGTCCAGCAGGAAGGAGTACATGGCGTTGGGGTCCAGGCCGGATACGTTCACCTTCAGCACCGGGAACATCCTC。
Indel突变(12bp删除)Exon2序列如SEQ ID NO.6所示：
CTGGCCCCCTCCATTGAGCTTGTTGGTGAGCTTGACTTTGCTGAAGGAGACAGGTGCCTTCATCCAGTGCGCCCCGAAGTTGGGGGAGTCGGGGTGGATGTAGACGCAGCTGGGCGCCTGCGGATCCGGC------------ACCCACTCCCCGTTCACGTACTTCCAGCGGTGGTTGTCGGCGGCCACGAAGTCCAGCAGGAAGGAGTACATGGCGTTGGGGTCCAGGCCGGATACGTTCACCTTCAGCACCGGGAACATCCTC。
下面结合具体实施例对本发明所述的基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用核酸分子、试剂盒及方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，详见《分子克隆(第三版)》。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。
实施例1
sgRNA和ssODN的制备
1.选择位于TBXT基因第二外显子第331-333位处(即PAM序列)前21个碱基作为TBXT基因编辑细毛羊sgRNA模板序列，该序列预测脱靶效应较低。根据选择的sgRNA模板序列，合成序列互补的DNA Oligos；
TBXT基因编辑细毛羊sgRNA序列位于第二外显子第331-333位处前21个碱基，同时加入同源重组模板ssODN，即将TBXT基因外显子2第334位的碱基由C变成A(C334A)、第333位的碱基由C变成G(C333G)，这样在TBXT基因重组修复时使得TBXT基因第二外显子334、333达到精准编辑的目的(图1，TBXT基因编辑位置、sgRNA序列(图1显示为TBXT-sgRNA)和ssODN序列图示)。
2.用限制性内切酶BbsI单酶切px330质粒(Addgene 42330)，酶切体系如下：10×FastDigestBuffer2μl，px330质粒5μl，FastDigest enzyme 1μl，ddH2O补至20μl，37℃酶切2h后，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，而后将酶切产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。
3.按下述反应体系：正反向引物(10μmol/L)各1μL(表1)，10×Buffer缓冲液(Takara，9151A)2μL，高压双蒸灭菌水16μL混匀后，95℃5min，0.1℃/s冷却至室温。
4.按常规方法将步骤2得到的产物与步骤3得到的双链DNA分子连接，得到重组质粒，以用于sgRNA模板的制备。
5.以上述测序正确的重组质粒为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系：含T7启动子的上游、下游引物各0.5μl(10μmol/L)(表3)，模板DNA(50ng质粒)0.5μl，高保真PCR扩增体系(PrimeSTARMax Premix)25μL，补水至50μL；PCR反应程序：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸5s，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
表3用于体外转录的sgRNA的引物表
Figure BDA0002911462190000081
6.将上述步骤PCR产物纯化后取1μg，利用体外转录试剂盒MEGA shortscriptT7kit(ambionAM1354)进行体外转录。具体操作参见试剂盒说明书进行。
7.利用RNA纯化试剂盒(ambionAM1908)纯化体外转录的sgRNA。具体操作参见试剂盒说明书进行。收集获得用于显微注射的sgRNA。
8.用于HDR的同源修复模板ssODN，在绵羊TBXT基因位于第二外显子区域引入2个突变位点(如图2所示，斜体标注的碱基为引入的突变碱基)，即第334位的碱基由C变成A(C334A)、第333位的碱基由C变成G(C333G)。其中，C334A突变导致TBXT蛋白112位的氨基酸由甘氨酸变成色氨酸，C333G为同义突变。同时，在突变序列左右两侧各有长度分别为61bp、60bp的同源臂。ssODN全长143bp，具体序列信息如SEQ ID NO.2和图2所示(图2为同源修复模板ssODN序列图示，斜体碱基为引入的突变)。将序列信息提供给DNA合成公司进行长链DNA人工合成。用Nuclease-freeWater溶解合成的ssODN，根据其合成的质量并调整浓度。
实施例2
Cas9 mRNA的制备
以px330(Addgene 42330)序列为模板，利用Oligo6.0软件设计引物Cas9-TF(小写字母为T7启动子序列)、Cas9-TR。以px330质粒为模板，以Cas9-TF、Cas9-TR为引物按照下述体系进行PCR扩增。PCR扩增体系：10×Buffer 5μL，dNTP(2.5mM)4μL，上下游引物各1μL(10μmol/L)(表2)，高保真DNA聚合酶1.0μL，模板DNA 1.0μL，补水至50μL；PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸5min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
将上述步骤PCR产物纯化后取2μg，利用体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE T7ultrakit(ambionAM1345)进行体外转录。具体操作参见试剂盒说明书进行。获得体外转录的Cas9 mRNA，纯化后测定mRNA浓度，1％琼脂糖凝胶电泳检测，分装冻存于-70℃备用，与sgRNA一起直接用于注射绵羊体外单细胞期受精卵。
将上述制备获得的Cas9 mRNA、sgRNA和ssODN、DNA连接酶IV抑制剂SCR7(APExBIO，A8705)分别单独包装后、组装制备获得实现绵羊TBXT基因精准突变的试剂盒。
或者将上述制备获得的Cas9 mRNA、sgRNA和ssODN、DNA连接酶IV抑制剂SCR7混合获得的混合液包装获得实现绵羊TBXT基因精准突变的试剂盒；所述混合液中上述成分的浓度分别为：Cas9 mRNA 200ng/μL，sgRNA50ng/μL，ssODN 50ng/μL，DNA连接酶IV抑制剂SCR71μmol/L。
实施例3
TBXT基因编辑羊的生产
1.绵羊的同期发情与超数排卵
(1)供受体羊的选择：选取体况优良、无繁殖疾病且年龄在2～4岁的新疆细毛羊作为供体母羊。选取体重在50kg以上，年龄为2～4岁，膘情好、无繁殖疾病的阿勒泰羊作受体母羊。选取体重在70～85kg，精液检测优良且在1～3岁的新疆细毛羊做采精公羊。
(2)同期发情与超数排卵：供体母羊阴道放入CIDR阴道栓记为0天，放入CIDR阴道栓的第10天开始以递减的方式连续注射促卵泡激素，每隔12h注射一次，共3天，总剂量为240单位/只，在第12天取出CIDR栓，清洗阴道，并肌肉注射前列腺素0.1mg。撤栓12h后开始试情，早晚各试情一次，供体母羊发情时注射200IU促黄体生成素。
受体母羊与供体母羊同步埋植CIDR海绵栓，并在供体母羊撤栓前12h撤除CIDR，每只注射330IU孕马血清促性腺激素，撤栓12h后每天早晚各2次进行试情公羊试情，详细记录发情时间。
2.人工授精获得受精卵
(1)深部输精：人工采集公羊的精液，镜检，活力达0.8以上方可用于输精。对发情12～19h的供体母羊进行腹腔镜深部输精。
(2)受精卵的获得：供体母羊输精后19～21h，注射静松灵将供体羊麻醉，将腹中线两侧羊毛剃除并进行消毒处理，用手术法将子宫及输卵管暴露于体外，将粗细合适的软管从输卵管口引出置于塑料小皿内，再用吸有冲胚液的注射器从子宫角推冲胚液，在体式显微镜下检出胚胎。挑选出胞质均匀、形态规则的受精卵用作显微注射。
3.受精卵的显微注射、体外培养及胚胎移植
(1)将上述制备获得的Cas9 mRNA、sgRNA和ssODN、DNA连接酶IV抑制剂SCR7混合，所述混合液中上述成分的浓度分别为：Cas9 mRNA200ng/μL，sgRNA50ng/μL，ssODN 50ng/μL，DNA连接酶IV抑制剂SCR71μmol/L。
(2)采用NIKON公司的显微注射仪将Cas9 mRNA、sgRNA、ssODN、DNA连接酶IV抑制剂SCR7混合液注射入步骤2得到的处于单细胞期的受精卵的胞质内(每个受精卵注射80～100pL混合液)，此步严格要求无RNase操作。注射结束后，将受精卵用胚胎培养液洗涤2～3次，按50～60枚/孔的密度移入装有培养液的四孔培养板内，做好标记，38.6℃、5％CO2、5％O2、90％N2，饱和湿度的二氧化碳培养箱内进行体外培养。
(3)将卵裂至2～4细胞期的胚胎，移植到同期发情处理的受体母羊的输卵管中，每侧输卵管移植1～2枚胚胎，移植60天后对受体母羊进行B超妊娠诊断(表4)。妊娠诊断检测结果显示：接受胚胎移植的216只受体羊中，有45只受体羊成功怀孕，怀孕效率达22.59％。
表4 TBXT基因精准编辑细毛羊的生产
Figure BDA0002911462190000111
4.TBXT基因编辑羊的鉴定
(1)羔羊组织DNA的提取
用无菌剪刀、镊子剪取羔羊小块尾部皮肤组织放入离心管，迅速投入液氮带回实验室。采用酚-氯仿抽提法从新生羔羊的组织中提取基因组DNA，测定基因组DNA浓度和纯度，稀释DNA样品至100ng/μL，用于PCR扩增的模板。
(2)PCR扩增及测序、鉴定
用PCR方法特异性地扩增目的片段。PCR扩增体系如下：10×Buffer 5μl，MgCl23.5μl，dNTP(each 2.5mM)2μl，上下游引物各0.5μl(表5)，DNA聚合酶0.5μl，模板5μl补水至50μl。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min。用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增产物的理论长度为417bp。将与理论值片段长度一致、条带单一的PCR产物，送交上海生工生物公司进行测序。随后，利用Chromas软件对测序结果进行分析，比对目的片段的序列，判读变异位点基因型。
表5用于TBXT基因编辑羔羊检测引物表
引物名称 序列(5'to3')
TBXT-T334HDR-F ACAAGAAGGTGCAGAGTCACAGGCCCCTC(SEQ ID NO.13)
TBXT-T334HDR-R GAGCTTCCTGCCCCAAATGACAGATGCC(SEQ ID NO.14)
PCR产物测序统计结果显示：在44只羔羊中共获得TBXT基因编辑细毛羊19只，基因编辑效率为43.18％(表4)，其中有14只羊发生C334A和C333G两个突变位点的精准替换突变，简称为靶向编辑(Targeted modification，TM)，约占基因编辑羊总数的78％(14/19)，其余5只羊发生的突变形式为Indel突变(如SEQ ID NO.6(GM075)、SEQ ID NO.15(GM074)、SEQ ID NO.16(GM227)、SEQ ID NO.17(GM484)和SEQ ID NO.18(GM078))。在发生了靶向编辑的个体中，有1只羊(羊号为GM079)同时发生了两种突变形式，即精准替换突变(TM)和编辑位点8bp删除的Indel突变。具体的基因编辑形式见图3，TBXT基因精准编辑细毛羊的基因编辑类型。
SEQ ID NO.15(GM074，-110bp)的核苷酸序列为：
CTGGCCCCCTCCATTGAGCTTGTTGGTGAGCTTGACTTTGCTGAAGGAGACAGGTGCCTTCATCCAGTGCGCCCCGAAGTTGGGGGAGTCGGGGTGGATGTAGACGCAGCTGGGCGCC--------------------------------------------------------------------------------------------------------------GCCGGATACGTTCACCTTCAGCACCGGGAACATCCTC。
SEQ ID NO.16(GM227，-1bp)的核苷酸序列为：
CTGGCCCCCTCCATTGAGCTTGTTGGTGAGCTTGACTTTGCTGAAGGAGACAGGTGCCTTCATCCAGTGCGCCCCGAAGTTGGGGGAGTCGGGGTGGATGTAGACGCAGCTGGGCGCCTGCGGCTCCGGCTTGCCCCC-GGCACCCACTCCCCGTTCACGTACTTCCAGCGGTGGTTGTCGGCGGCCACGAAGTCCAGCAGGAAGGAGTACATGGCGTTGGGGTCCAGGCCGGATACGTTCACCTTCAGCACCGGGAACATCCTC。
SEQ ID NO.17(GM484，-12bp)的核苷酸序列为：
CTGGCCCCCTCCATTGAGCTTGTTGGTGAGCTTGACTTTGCTGAAGGAGACAGGTGCCTTCATCCAGTGCGCCCCGAAGTTGGGGGAGTCGGGGTGGATGTAGACGCAGCTGGGCGCCTGCGGCTCCGGC------------ACCCACTCCCCGTTCACGTACTTCCAGCGGTGGTTGTCGGCGGCCACGAAGTCCAGCAGGAAGGAGTACATGGCGTTGGGGTCCAGGCCGGATACGTTCACCTTCAGCACCGGGAACATCCTC。
SEQ ID NO.18(GM078，+1bp)的核苷酸序列为：
CTGGCCCCCTCCATTGAGCTTGTTGGTGAGCTTGACTTTGCTGAAGGAGACAGGTGCCTTCATCCAGTGCGCCCCGAAGTTGGGGGAGTCGGGGTGGATGTAGACGCAGCTGGGCGCCTGCGGCTCCGGCTTGCCCCCCCGGCACCCACTCCCCGTTCACGTACTTCCAGCGGTGGTTGTCGGCGGCCACGAAGTCCAGCAGGAAGGAGTACATGGCGTTGGGGTCCAGGCCGGATACGTTCACCTTCAGCACCGGGAACATCCTC。
实施例4
TBXT基因编辑羊及其后代尾巴长度的表型鉴定
1.TBXT基因编辑羊尾巴长度的测定
保定羊只使其处于自然站立状态，用软尺测量羊尾巴根部到尾尖的长度以及羊头部到尾尖的全身体长长度，测量时精确到0.5厘米。用尾巴长度(即尾根部到尾尖的长度)、尾巴长度与全身体长的比值度量羊尾巴的长短。运用SPSS软件对相关数据进行统计学分析。
与野生型细毛羊相比，所获得的19只TBXT基因编辑羊的尾长、尾长与体长的比值存在极显著差异(P<0.01)，TBXT基因编辑羊的平均尾长仅为20.92厘米，野生型细毛羊尾长25.71厘米；TBXT基因编辑羊尾长与体长的比值为0.229，野生型细毛羊尾长与体长的比值为0.285(表6)。
表6 TBXT基因编辑与野生型细毛羊尾长、尾长与体长比值的对比
Figure BDA0002911462190000141
Figure BDA0002911462190000151
注：*差异显著，P<0.05，**差异极显著P<0.001。
2.TBXT基因编辑羊尾椎数目的测定
对活羊体侧位的后躯进行X光扫描，拍摄X光照片，用于读取尾椎的数目。运用SPSS软件对相关数据进行统计学分析。P>0.05表示差异不显著，用相同的字母表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
与野生型细毛羊比，所获得的19只TBXT基因编辑羊的尾椎数差异极显著(P<0.01)，野生型细毛羊尾椎数平均为18.47，TBXT基因编辑羊尾椎数显著减低，尾椎数仅为15.32，(表7)。
表7 TBXT基因编辑与野生型细毛羊尾椎数的比较
Figure BDA0002911462190000152
Figure BDA0002911462190000161
注：*差异显著，P<0.05，**差异极显著P<0.001。
3.TBXT基因编辑羊的后代扩繁、TBXT基因型和尾巴长度的鉴定
羊号为GM079的TBXT基因编辑羊不仅发生了C334A和C333G两个突变位点的精准替换突变，而且在编辑位点区域同时鉴定到8bp删除的Indel突变(外显子2第332-339共8个碱基发生删除)。与野生型细毛羊相比，TBXT基因编辑羊GM079的尾巴显著变短，尾椎数仅为11(图4，TBXT基因编辑羊的短尾表型)。这只短尾TBXT基因编辑公羊性成熟后，采用人工授精方式将其与野生型长瘦尾细毛羊成年母羊交配，对获得的TBXT基因编辑羊G1后代的基因型、尾椎数目采用前述的方法进行测量、比较。
结果显示：TBXT基因编辑羊GM079共获得24只G1后代，发生突变的TBXT基因在后代的遗传符合孟德尔遗传规律，其后代的基因型均为亲本基因型，分别携带C334A的TM突变或8bp删除的Indel突变两种基因型(表8)。24只G1后代的平均尾椎数为14.54，显著低于野生型细毛羊的尾椎数。进一步比较G1后代中TBXT靶向编辑细毛羊(TM)、InDel编辑细毛羊(InDel)和野生型细毛羊(WT)，TM、InDel编辑细毛羊和野生型细毛羊的尾椎数分别为15.50±1.54、11.67±4.08和18.47±0.40，TM、InDel编辑细毛羊的尾椎数低于野生型细毛羊，差异极显著。TM、InDel编辑细毛羊的尾椎数无显著性差异(表9和图5，TBXT编辑羊GM079后代中TM、InDel编辑羊和野生型细毛羊尾椎数比较结果(*差异显著，P<0.05，***差异极显著P<0.001，****差异极显著P<0.0001))。
表8 TBXT基因编辑羊G1后代的基因型、尾椎数数据
Figure BDA0002911462190000171
Figure BDA0002911462190000181
表9 TBXT编辑羊G1后代中TM、InDel细毛羊和野生型细毛羊的尾椎数统计
Figure BDA0002911462190000182
注：*差异显著，P<0.05，***差异极显著P<0.001，****差异极显著P<0.0001。
本发明基于HDR基因编辑技术实现了绵羊TBXT基因的高效、精准突变，个体水平突变率可达43.18％，获得的基因编辑绵羊尾巴变短，尾椎数由野生型的18.47减低到15.32，尾长和尾长/体全长的比例分别由野生型的25.71厘米、0.285减低到20.92厘米、0.229。进一步利用TBXT基因编辑效果最佳的羊进行扩繁，G1后代不仅携带了基因编辑突变，并且保持了亲本短尾性状，尾巴变短，尾椎数减少。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 新疆畜牧科学院生物技术研究所（新疆畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心）
<120> 基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用核酸分子、试剂盒及方法和应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgcggctcc ggcttgcccc c 21
<210> 2
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttcatcca gtgcgccccg aagttggggg agtcggggtg gatgtagacg cagctgggcg 60
cctgcggctc cggattgccc cagggcaccc actccccgtt cacgtacttc cagcggtggt 120
tgtcggcggc cacgaagtcc agc 143
<210> 3
<211> 265
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctggccccct ccattgagct tgttggtgag cttgactttg ctgaaggaga caggtgcctt 60
catccagtgc gccccgaagt tgggggagtc ggggtggatg tagacgcagc tgggcgcctg 120
cggctccggc ttgccccccg gcacccactc cccgttcacg tacttccagc ggtggttgtc 180
ggcggccacg aagtccagca ggaaggagta catggcgttg gggtccaggc cggatacgtt 240
caccttcagc accgggaaca tcctc 265
<210> 4
<211> 265
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggccccct ccattgagct tgttggtgag cttgactttg ctgaaggaga caggtgcctt 60
catccagtgc gccccgaagt tgggggagtc ggggtggatg tagacgcagc tgggcgcctg 120
cggctccggc ttgccccagg gcacccactc cccgttcacg tacttccagc ggtggttgtc 180
ggcggccacg aagtccagca ggaaggagta catggcgttg gggtccaggc cggatacgtt 240
caccttcagc accgggaaca tcctc 265
<210> 5
<211> 257
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctggccccct ccattgagct tgttggtgag cttgactttg ctgaaggaga caggtgcctt 60
catccagtgc gccccgaagt tgggggagtc ggggtggatg tagacgcagc tgggcgcctg 120
cggctccggc ttgcacccac tccccgttca cgtacttcca gcggtggttg tcggcggcca 180
cgaagtccag caggaaggag tacatggcgt tggggtccag gccggatacg ttcaccttca 240
gcaccgggaa catcctc 257
<210> 6
<211> 253
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggccccct ccattgagct tgttggtgag cttgactttg ctgaaggaga caggtgcctt 60
catccagtgc gccccgaagt tgggggagtc ggggtggatg tagacgcagc tgggcgcctg 120
cggatccggc acccactccc cgttcacgta cttccagcgg tggttgtcgg cggccacgaa 180
gtccagcagg aaggagtaca tggcgttggg gtccaggccg gatacgttca ccttcagcac 240
cgggaacatc ctc 253
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccgctgcg gctccggctt gcccccc 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacgggggg caagccggag ccgcagc 27
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taatacgact cactataggg agaatggact ataaggacca cgac 44
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcgagctcta ggaattctta c 21
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
taatacgact cactataggc tgcggctccg gcttgccccc 40
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acaagaaggt gcagagtcac aggcccctc 29
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagcttcctg ccccaaatga cagatgcc 28
<210> 15
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctggccccct ccattgagct tgttggtgag cttgactttg ctgaaggaga caggtgcctt 60
catccagtgc gccccgaagt tgggggagtc ggggtggatg tagacgcagc tgggcgccgc 120
cggatacgtt caccttcagc accgggaaca tcctc 155
<210> 16
<211> 264
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctggccccct ccattgagct tgttggtgag cttgactttg ctgaaggaga caggtgcctt 60
catccagtgc gccccgaagt tgggggagtc ggggtggatg tagacgcagc tgggcgcctg 120
cggctccggc ttgcccccgg cacccactcc ccgttcacgt acttccagcg gtggttgtcg 180
gcggccacga agtccagcag gaaggagtac atggcgttgg ggtccaggcc ggatacgttc 240
accttcagca ccgggaacat cctc 264
<210> 17
<211> 253
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctggccccct ccattgagct tgttggtgag cttgactttg ctgaaggaga caggtgcctt 60
catccagtgc gccccgaagt tgggggagtc ggggtggatg tagacgcagc tgggcgcctg 120
cggctccggc acccactccc cgttcacgta cttccagcgg tggttgtcgg cggccacgaa 180
gtccagcagg aaggagtaca tggcgttggg gtccaggccg gatacgttca ccttcagcac 240
cgggaacatc ctc 253
<210> 18
<211> 266
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctggccccct ccattgagct tgttggtgag cttgactttg ctgaaggaga caggtgcctt 60
catccagtgc gccccgaagt tgggggagtc ggggtggatg tagacgcagc tgggcgcctg 120
cggctccggc ttgccccccc ggcacccact ccccgttcac gtacttccag cggtggttgt 180
cggcggccac gaagtccagc aggaaggagt acatggcgtt ggggtccagg ccggatacgt 240
tcaccttcag caccgggaac atcctc 266

Claims (10)

1.一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用sgRNA表达载体，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述表达载体的骨架载体包括pX330。
3.一种基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用单链寡核苷酸ssODN，其特征在于，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括sgRNA和单链寡核苷酸ssODN，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述所述试剂盒还包括Cas9 mRNA和DNA连接酶IV抑制剂SCR7。
6.一种基于权利要求4或5所述试剂盒的基于HDR基因编辑方法培育短尾绵羊的方法，包括以下步骤：
将sgRNA、单链寡核苷酸ssODN、Cas9 mRNA和DNA连接酶IV抑制剂SCR7导入绵羊受精卵中，以获得短尾绵羊。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的导入浓度为40～60ng/μL；所述单链寡核苷酸ssODN的导入浓度为40～60ng/μL；所述Cas9 mRNA的导入浓度为180～220ng/μL；所述DNA连接酶IV抑制剂SCR7的导入浓度为0.8～1.2μmol/L。
8.权利要求1所述sgRNA或权利要求2所述表达载体或权利要求3所述ssODN或权利要求4或5所述试剂盒或权利要求6或7所述方法在培育短尾绵羊中的应用。
9.一种基于权利要求1所述sgRNA或权利要求2所述表达载体或权利要求3所述ssODN或权利要求4或5所述试剂盒或权利要求6或7所述方法获得的培育短尾绵羊的基因，其特征在于，所述基因包括TBXT基因外显子2发生特定位点替换突变和/或发生Indel突变；所述特定位点替换突变为：TBXT基因外显子2第334位的碱基由C变成A和第333位的碱基由C变成G。
10.根据权利要求9所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
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