CN107988397A

CN107988397A - 一种与中国肥臀型绵羊“无尾”表型相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN107988397A
Application number: CN201810037211.0A
Authority: CN
Inventors: 韩吉龙; 杨博辉; 杨敏; 刘建斌; 郭婷婷; 岳耀敬; 牛春娥; 袁超
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2038-01-15
Also published as: CN107988397B

Abstract

本发明公开一种用于检测绵羊尾型性状相关的单核苷酸的多态性标记SNPs及其应用。本发明用于检测中国绵羊尾型性状相关的单核苷酸的多态性标记SNPs，其特征在于所述SNPs标记位于绵羊8号染色体定位于87804590/87804589的两个位点，该SNPs分子标记两个位点完全连锁，多态性为G‑G和C‑T，基因型为G‑G/G‑G；G‑G/C‑T；C‑T/C‑T三种，其中C‑T/C‑T基因型只在中国肥臀型绵羊中检出，统计检验得出C‑T/C‑T基因型与绵羊“无尾”表型显著相关。本发明可用于中国地方绵羊品种尾型性状的早期选育，甚至胚胎期或者刚出生即可进行准确地筛选，该方法用于鉴定纯种的中国肥臀型地方绵羊品种准确可靠，操作简便的优点。

Description

一种与中国肥臀型绵羊“无尾”表型相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于遗传生物学领域，涉及绵羊尾型相关的分子标记，具体与中国脂臀型绵羊无尾表型的T基因的单核苷酸的多态性（SNPs）分子标记及应用。

背景技术

为了适应不同的环境，绵羊经长期的自然选择产生了个体表型差异较大的品种，尾型的差异就是进化过程中主要的变化之一。现代家养绵羊由摩弗伦羊及羱羊进化而来，但他们的尾型都为短瘦尾，经过几千年的驯化尾型有长、短、肥、瘦的差异，依据尾巴长短和尾部脂肪体积大小可以将绵羊分为五大类型：短脂尾型如小尾寒羊、湖羊等；长脂尾型如广灵大尾羊、兰州大尾羊等；短瘦尾型如西藏羊、贵德黑裘皮羊等；长瘦尾型如甘肃高山细毛羊、新疆细毛羊等；肥臀尾型如哈萨克羊、阿勒泰羊等。绵羊的尾长由尾椎数和尾椎长度决定，而这一性状受到生殖轴发育相关的基因的调控。以哈萨克系绵羊来源的肥臀型地方绵羊品种在我国新疆、甘肃等西北地区广泛分布。肥臀型绵羊主要特点为臀部脂肪较多、尾椎发育不全、没有明显的尾巴。但是，国内外有关绵羊尾型的研究较少，目前还没有发现相关基因的突变与肥臀型绵羊尾型相关的报道，尚无通过基因标记的方式来鉴定绵羊尾型的方法。因此，设计分子标记试剂盒来鉴定绵羊的尾型，尤其是哈萨克系绵羊的无尾表型，以确定其是否为纯种羊具有重要意义和实用价值。

T基因为T-box转录因子家族成员，调控动物胚胎轴向生长的过程，进而对脊椎动物胚胎早期尾椎的发育和形成具有重要调控作用。前人研究发现，不同动物中该基因拥有多个可能影响尾椎发育相关的SNPs，且主要集中在该基因的T-box结构域中。T基因的突变已经被证实与牛、狗、猫、小鼠等动物的尾椎发育异常相关，且在狗、猫发现无尾性状与T基因的T-box结构域的错义突变相关。但是至今还没有该基因的SNPs与我国肥臀型绵羊“无尾”表型相关的报道。

发明内容

本发明公开一种用于检测绵羊尾型性状相关的单核苷酸的多态性标记SNPs及其应用。

本发明用于检测中国绵羊尾型性状相关的单核苷酸的多态性标记SNPs，其特征在于所述SNPs标记位于绵羊8号染色体定位于87804590/87804589的两个位点，该SNPs分子标记的多态性为G-G/C-T，两个位点完全连锁，基因型为G-G/G-G；G-G/C-T；C-T/C-T三种，其中C-T/ C-T只在中国肥臀型绵羊中检出，说明C-T/C-T基因型与绵羊无尾表型相关。

本发明的用于鉴定绵羊肥臀型羊品种的方法是：

1）提取待测绵羊血液基因组DNA；

2）以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；

3）经测序检测PCR扩增产物片段的8:87804590/8:87804589处的碱基种类，若碱基种类为C-T/C-T，则判定待测绵羊为肥臀型无尾性状。

本发明用于鉴定绵羊肥臀型羊品种的方法使用的的特异性引物是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

本发明的用于鉴定绵羊尾型性状试剂盒中包括有特异引物SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2。

采用上述的特异引物进行扩增的条件为：PCR反应使用的扩增体系以20 μl计为：50 ng/μl的DNA模板DNA 1 μl，10 pmol/μl正向引物和反向引物各1 μl，10 mmol/L dNTPmix 2 μl，5 U/μl TaqDNA聚合酶0.125 μl，10×PCR反应缓冲液2.5 μl，余量用双蒸水补足，扩增反应时：94 ℃预变性4分钟；94 ℃变性30秒，60 ℃退火30秒，72℃延伸30秒，共34个循环；72 ℃总延伸6分钟，15 ℃恒定温度保存。

该PCR反应条件在常规PCR仪均可成功扩增。

本发明对于检测PCR扩增产物片段的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规的检测方法进行，即可以利用测序来检测待测中国地方绵羊品种的基因型。

本发明的用于鉴定绵羊肥臀型羊品种的方法可在中国绵羊育种中的应用，也可在确定绵羊群体中“无尾”或者“小尾”表型中的应用，也可用于确定中国纯种肥臀型地方品种绵羊的尾型中的应用。

本发明的与中国地方绵羊尾型性状相关的SNP标记及其应用具有如下优点：

（1）本发明提供的分子标记不受绵羊品种、年龄等限制，可用于中国地方绵羊品种尾型性状的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，以鉴定纯种的中国肥臀型地方绵羊品种。

（2）检出中国地方绵羊品种T基因单核苷酸多态性的方法准确可靠，操作简便。

（3）中国地方绵羊品种T基因的SNPs位点的检出，为中国肥臀型绵羊无尾性状的标记辅助选择提供了科学依据。

附图说明

图1 为T基因8:87804590/8:87804589位碱基突变的三种基因型的测序峰图，其中，（A）为C-T/C-T型；（B）为G-G/C-T型；（C）为G-G/G-G型。

图2 为T基因c.333-334位碱基突变在不同绵羊群体中的基因型频率。

图3 为不同动物T基因c.333-334位点碱基保守性分析（如SEQ ID NO .3所示的核苷酸序列和编码的氨基酸序列）。经序列同源性分析可知，8:87804589位的G>T突变，该位置的碱基G在不同脊椎动物中具有高度保守性。

具体实施方式

本发明以下提供具体实施例

中国绵羊T基因8:87804590/8:87804589基因型鉴定。

1.1提取来自于中国地方绵羊品种血液中的基因组DNA

采集来自225个绵羊个体的血液样品，其中肥臀型绵羊包括32个哈萨克羊、25个阿勒泰羊、15个巴什拜羊、20个多浪羊、21个巴音布鲁克羊；长瘦尾型绵羊包括32甘肃高山细毛羊、12个高山美丽奴羊、12个特克赛尔羊；短瘦尾型绵羊包括32甘肃欧拉藏羊；短脂尾型绵羊包括 12个滩羊、12个湖羊的血样，采用常规的方法提取血液中的基因组DNA。

1.2扩增含目标SNP位点的核苷酸片段

根据Ensemble数据库收录的T基因的序列ENSOARG00000004863.1，设计出的引物如下：

正向引物：5’- GCTCTCTGCCACAAGAAGGT -3’，SEQ ID No.1；

反向引物：5’- GCATGCGGATCTAGGTGAGT -3’, SEQ ID No.2。

以1.1中的基因组DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，该SNP位点位于PCR扩增片段的213/214bp处，此处碱基为G-G或C-T。

其中PCR 反应使用的扩增体系以20 μl计为：50 ng/μl的DNA模板DNA 1 μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各1 μl，10 mmol/L dNTP mix 2 μl，5 U/μl TaqDNA聚合酶0.125 μl，10×PCR反应缓冲液2.5 μl，余量用双蒸水补足。

PCR 扩增反应的条件为：94 ℃预变性4分钟；94 ℃变性30 秒，60 ℃退火30 秒，72 ℃延伸30秒，共34个循环；72 ℃总延伸6分钟，15 ℃恒定温度保存。

对1.2中的PCR扩增产物进行Sanger测序检测，三种基因型的测序峰图如图1所示。个体基因型可分为G-G/G-G型、G-G/C-T、C-T/C-T型。三种基因型的分型结果如表1所示。如果扩增产物序列中第213/214bp处的碱基为C-T/C-T，则待测中国绵羊属于肥臀型无尾表型。进一步分析发现，8:87804589位的G>T突变即c.334 G > T (GGG > TGG)是主效突变（如SEQ ID NO .3所示的核苷酸序列），该位置的碱基G在动物中具有高度保守性，参见图3。进一步分析发现该碱基突变造成翻译蛋白序列112位处于T-box结构域的甘氨酸转化为色氨酸的错义突变（如SEQ ID NO .3所示编码的氨基酸序列）。

表1 T基因8:87804590/8:87804589位碱基突变在不同绵羊群体中的基因型个体数统计

通过以上实验表明，肥臀型绵羊无尾表型个体的基因型均为C-T/C-T型，而其他非肥臀型绵羊例如短尾的藏羊和细长尾的甘肃高山细毛羊其基因型为G-G/G-G和G-G/G-T型。根据这一特征，利用前述的方法进行检测可以区分出绵羊尾型，即当T基因8:87804590/8:87804589为C-T/C-T，被测羊尾型为肥臀型绵羊。

<110> 石河子大学

<120> 一种与中国肥臀型绵羊“无尾”表型相关的分子标记及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（正向引物）

<400> 1

gctctctgcc acaagaaggt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（反向引物）

<400> 2

gcatgcggat ctaggtgagt 20

<210> 3

<211> 1332

<212> DNA

<213> 基因Brachyury（T）

<400> 3

atg acc tcc ccg ggc acc gac agc ccg ggg aag agc ctg cag tac 45

Met Thr Ser Pro Gly Thr Asp Ser Pro Gly Lys Ser Leu Gln Tyr

1 5 10 15

cgc gtg gac cat ctg ctg agc gcc gtg gag agc gag ctg cag gcg 90

Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Ser Glu Leu Gln Ala

20 25 30

ggc agc gag aag ggc gac ccc acg gag cgc gag ctg cgc gtg ggc 135

Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly

35 40 45

ctg gag gag agc gag ctg tgg ctg cgc ttc aag gag ctc acc aac 180

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn

50 55 60

gag atg atc gtc acc aag aac ggc agg agg atg ttc ccg gtg ctg 225

Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu

65 70 75

aag gtg aac gta tcc ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc ttc 270

Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe

80 85 90

ctg ctg gac ttc gtg gcc gcc gac aac cac cgc tgg aag tac gtg 315

Leu Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val

95 100 105

aac ggg gag tgg gtg ccg ggg ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc 360

Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro

106 110 115 120

agc tgc gtc tac atc cac ccc gac tcc ccc aac ttc ggg gcg cac 405

Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His

125 130 135

tgg atg aag gca cct gtc tcc ttc agc aaa gtc aag ctc acc aac 450

Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn

140 145 150

aag ctc aat gga ggg ggc cag atc atg ttg aac tcc tta cat aag 495

Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys

155 160 165

tat gag cct cgg atc cac atc gtg aga gtt ggg ggt cca cag cgt 540

Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly Gly Pro Gln Arg

170 175 180

atg atc acc agc cac tgc ttc ccc gag acc cag ttc atc gct gtg 585

Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val

185 190 195

act gct tac caa aat gag gag atc aca gct ctt aaa att aaa tac 630

Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile Lys Tyr

200 205 210

aat ccg ttt gca aaa gct ttc ctc gac gca aag gaa aga agc gat 675

Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser Asp

215 220 225

cac aaa gag atg atg gaa gaa gcg gga gac agc cag cag cct ggg 720

His Lys Glu Met Met Glu Glu Ala Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly

230 235 240

tac agc caa tgg cgg ctc cag cca tgg cta gga tgg att gct gag 765

Tyr Ser Gln Trp Arg Leu Gln Pro Trp Leu Gly Trp Ile Ala Glu

245 250 255

acc ctg atg ggt gtt cag act ctg cag ggg gcc gcc acc ccc cac 810

Thr Leu Met Gly Val Gln Thr Leu Gln Gly Ala Ala Thr Pro His

256 260 265 270

ccc cag ttt cag ggc ccc ctc tcg ctc ccc tcc acg cac ggc tgc 855

Pro Gln Phe Gln Gly Pro Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Gly Cys

275 280 285

gaa agg ttc ccg gcc ctg agg agc cac cgg cca gcc ccc tac ccc 900

Glu Arg Phe Pro Ala Leu Arg Ser His Arg Pro Ala Pro Tyr Pro

290 295 300

agc ccg tac gcg cat cgc aac agc tct cca acc tat tcc gac agt 945

Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Ser Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Ser

305 310 315

tca tct gca tgt ctg tcc atg ctc cag ccc cat gac aac tgg tcc 990

Ser Ser Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Pro His Asp Asn Trp Ser

320 325 330

agc ctt gga atg cct gcc cac acc agc atg ctg ccc atg ggt ccg 1035

Ser Leu Gly Met Pro Ala His Thr Ser Met Leu Pro Met Gly Pro

335 340 345

aac gct ggt cct cct gcg ggc tcc agc cag tac ccc agc ctg tgg 1080

Asn Ala Gly Pro Pro Ala Gly Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp

350 355 360

tcc gtg agc agc ggt gcc gtc gcc ccg ggc gcc cag gcg gcg ggt 1125

Ser Val Ser Ser Gly Ala Val Ala Pro Gly Ala Gln Ala Ala Gly

365 370 375

gtg ccc agc ggg ctg gga gcc cag ttc ttc cga ggc tcc cct gcc 1170

Val Pro Ser Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala

380 385 390

cac tct acc ccc ctc gcc cac ccg gtc tca gcg tcc tcc tcg tcg 1215

His Ser Thr Pro Leu Ala His Pro Val Ser Ala Ser Ser Ser Ser

395 400 405

ggg tcc cca ctg tac gag ggg gcc gcc acg gcc aca gac gta gct 1260

Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Thr Ala Thr Asp Val Ala

410 415 420

gac agc cag tat gat gcc tcc gcc cag gcc cgc ctc ctg gcc tcg 1305

Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ser Ala Gln Ala Arg Leu Leu Ala Ser

425 430 435

tgg acg gcc gtg tcg ccc ccg tcc atg 1332

Trp Thr Ala Val Ser Pro Pro Ser Met

440 444

Claims

1.用于检测中国绵羊尾型性状相关的单核苷酸的多态性标记SNPs，其特征在于所述SNPs标记位于绵羊8号染色体定位于87804590/87804589的两个位点，该连锁SNPs分子标记组合的多态性基因型包括G-G / G-G、G-G / C-T、C-T / C-T。

2. 用于鉴定中国肥臀型羊品种的SNPs标记，其特征在于所述SNPs标记位于绵羊8号染色体定位于87804590/87804589的两个位点，该连锁SNPs分子标记组合基因型为C-T / C-T时，所测绵羊为肥臀型绵羊。

3.用于鉴定绵羊肥臀型羊品种中的方法，其特征在于：

1）提取待测绵羊血液基因组DNA；

2）以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用特异性引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；

3）经测序检测PCR扩增产物片段序列的213/214bp处的碱基种类，若碱基种类为C-T /C-T，则判定待测绵羊为肥臀型无尾性状。

4. 用于检测权利要求3所述的鉴定方法的特异性引物，其特征在于特异引物为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2。

5. 一种用于鉴定绵羊尾型性状试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有特异引物SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2。

6. 使用权利要求4所述的特异引物进行扩增的条件为：PCR反应使用的扩增体系以20μl计为：50 ng/μl的DNA模板DNA 1 μl，10 pmol/μl正向引物和反向引物各1 μl，10 mmol/LdNTP mix 2 μl，5 U/μl TaqDNA聚合酶0.125 μl，10×PCR反应缓冲液2.5 μl，余量用双蒸水补足，扩增反应条件：94 ℃预变性4分钟；94 ℃变性30秒，60 ℃退火30秒，72℃延伸30秒，共34个循环；72 ℃总延伸6分钟，15 ℃恒定温度保存。

7.权利要求3所述的鉴定方法在中国绵羊育种中的应用。

8.权利要求3所述的鉴定方法在确定绵羊群体中无尾或尾椎发育不全的表型中的应用。

9.权利要求3所述的鉴定方法在确定中国纯种肥臀型地方品种绵羊的尾型中的应用。