CN103320520A

CN103320520A - 一种辅助鉴定绵羊的脂尾性状的方法及其专用分子标记

Info

Publication number: CN103320520A
Application number: CN2013102961009A
Authority: CN
Inventors: 王新华; 刘守仁; 甘尚权; 张伟; 沈敏; 周平; 王立民; 高磊; 杨井泉; 梁耀伟; 宿俊吉; 李晓兰; 王开胜; 吴向未
Original assignee: Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences
Current assignee: Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences
Priority date: 2013-07-15
Filing date: 2013-07-15
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-07-15
Also published as: CN103320520B

Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定绵羊的脂尾性状的方法及其专用分子标记。本发明提供了一种辅助鉴定待测绵羊群体为哪种脂尾性状的群体的方法，包括如下步骤：（1）从待测绵羊群体中随机抽取具有统计意义的待测样本；（2）检测待测样本中X染色体59383635位点的T/C比值；（3）按照如下标准进行评判：如果T/C比值为5以上、待测绵羊群体为脂臀型群体，如果T/C比值为0.5以下、待测绵羊群体为瘦尾型群体，如果T/C比值为1-2之间、待测群体为短脂尾型群体。本发明的实验结果表明，绵羊X染色体59383635位点在脂尾（臀）与瘦尾绵羊群体中分布存在较大差异，该SNP可作为一个理想的分子标记应用于低脂绵羊品种选育。

Description

一种辅助鉴定绵羊的脂尾性状的方法及其专用分子标记

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定绵羊的脂尾性状的方法及其专用分子标记。

背景技术

绵羊是最早被驯化的草食家畜，动物考古学家研究发现，早在9000年前的新石器时代，家绵羊就已经出现在伊拉克北部及毗邻伊朗的中东地区。随着不断的进化与选择，家绵羊具有适应营养匮乏、气候条件极端恶劣地理环境的能力，广泛地分布于从低洼的沼泽、平原、荒漠到高原高寒等广阔地区。

绵羊脂尾（臀）性状是一种逆境生存所必需的生物性状，在特定的历史时期发挥着不可替代的作用。脂尾型（fat tail）绵羊品种的形成最早可追溯于5000年前伊拉克的乌鲁克石器时期，伊朗学者认为脂尾绵羊品种由瘦尾绵羊品种进化而来，并由中东地区向欧洲和其他地区扩散。我国新疆古称西域，毗邻中亚，素以出产大尾羊而著称，最早记载“西域大尾羊”的文献出现在唐代的《酉阳杂俎》。考古学家根据大尾巴羊频繁出现在新疆各地的岩画中，认为新疆的大尾羊可能在石器时代就已形成。农业部编撰的《中国畜禽遗传资源志.羊志》里记载了13个新疆地方优良品种，其中有7个品种属于脂尾巴（臀）绵羊品种，可见新疆是名副其实的“大尾巴羊”故乡。与骆驼驼峰、灰熊皮下大量储存脂肪一样，绵羊尾（臀）大量聚集脂肪组织，可以很好地维系其在逆境生存时之所需。全世界大约有25%的绵羊品种属于脂尾（臀）型（fattail/fat rump）绵羊品种，这类品种具有超强的尾部脂肪沉积能力，一些品种如大尾寒羊尾脂含量甚至超过总胴体重的25%。阿勒泰羊就是“大尾巴羊”品种中的突出代表。阿勒泰羊在生态恶劣、冬季严寒的地理环境下长期进化与选择中形成了储脂能力超强的巨型脂臀尾，当夏季凉爽牧草丰茂时，能够在其臀部迅速积蓄大量脂肪以供天寒、草枯、牧草营养不足时维持机体的新陈代谢，其臀脂占胴体重的15-25%。

随着人们生活水平的不断提高、牧民定居点的兴建、牧草种植等配套技术的不断提高以及人们对心血管疾病的高度关切等因素的影响，脂臀绵羊品种越来越不受欢迎，其臀脂的“保命”作用已显微不足道，且在当前存在如下局限性：羊肉销售时大多剔除尾脂，从而降低了它的经济价值；人们基于健康因素的考量、饮食倾向于“喜瘦厌肥”；从饲养成本角度思考，1公斤脂肪所耗饲草料相当于2公斤瘦肉所需的饲草料，过多的尾部脂肪沉积不符合经济原则。以上因素致使农牧民大量淘汰脂尾型绵羊品种，引进低脂绵羊品种对其进行盲目的杂交，一些具有优良的耐粗饲、抗病性和适应性的本地脂尾（臀）品种已面临灭绝的险境。如不对其进行品种改良和基因保护，将逐渐丧失其优良的遗传基因，并且面临灭绝的危险。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定绵羊的脂尾性状的方法及其专用分子标记。

本发明提供了一种辅助鉴定待测绵羊群体为哪种脂尾性状的群体的方法，包括如下步骤：（1）从待测绵羊群体中随机抽取具有统计意义的待测样本；（2）检测所述待测样本中X染色体59383635位点的T/C比值；所述T/C比值为等位基因T的频率与等位基因C的频率的比值；所述X染色体59383635位点为以所述待测样本的基因组DNA为模板用特异引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物中自5’末端第133位核苷酸；所述特异引物对为序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成的引物对；（3）按照如下标准进行评判：如果T/C比值为5以上、待测绵羊群体为脂臀型群体，如果T/C比值为0.5以下、待测绵羊群体为瘦尾型群体，如果T/C比值为0.8-2之间、待测群体为短脂尾型群体。

所述待测绵羊群体可为阿勒泰羊群体、湖羊群体、小尾寒羊群体、中国美利奴细毛羊群体或黑头萨福克羊群体。所述脂臀型群体可为阿勒泰羊群体。所述瘦尾型群体可为中国美利奴细毛羊群体或黑头萨福克羊群体。所述短脂尾型群体可为湖羊群体或小尾寒羊群体。

本发明还保护一种绵羊脂尾性状的分子标记，为X染色体59383635位点，所述X染色体59383635位点为以所述待测样本的基因组DNA为模板用特异引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物中自5’末端第133位核苷酸；所述特异引物对为序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成的引物对。

本发明还保护序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成的特异引物对。

本发明还保护所述分子标记或所述特异引物对在辅助鉴定待测绵羊群体为哪种脂尾性状的群体中的应用。所述待测绵羊群体可为阿勒泰羊群体、湖羊群体、小尾寒羊群体、中国美利奴细毛羊群体或黑头萨福克羊群体。所述脂尾性状为脂臀型、瘦尾型或短脂尾型。脂臀型群体可为阿勒泰羊群体。瘦尾型群体可为中国美利奴细毛羊群体或黑头萨福克羊群体。短脂尾型群体可为湖羊群体或小尾寒羊群体。

本发明还保护所述分子标记或所述特异引物对在辅助筛选具有不同脂尾性状的绵羊群体中的应用。所述脂尾性状为脂臀型、瘦尾型或短脂尾型。脂臀型群体可为阿勒泰羊群体。瘦尾型群体可为中国美利奴细毛羊群体或黑头萨福克羊群体。短脂尾型群体可为湖羊群体或小尾寒羊群体。

本发明还保护所述分子标记或所述特异引物对在辅助比较不同绵羊群体的脂尾性状中的应用。所述脂尾性状为脂臀型、瘦尾型或短脂尾型。脂臀型群体可为阿勒泰羊群体。瘦尾型群体可为中国美利奴细毛羊群体或黑头萨福克羊群体。短脂尾型群体可为湖羊群体或小尾寒羊群体。

本发明还保护一种辅助比较属于同一群体的不同待测绵羊个体的尾重系数的方法，包括如下步骤：检测待测绵羊的X染色体59383635位点的基因型，TT基因型的待测绵羊的尾重系数大于TC基因型的待测绵羊，TC基因型的待测绵羊的尾重系数大于CC基因型的待测绵羊；所述尾重系数为尾重占胴体重的百分比；所述X染色体59383635位点为以所述待测样本的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物中自5’末端第133位核苷酸。

本发明还保护所述分子标记或所述特异引物对在辅助鉴定待测绵羊个体的尾重系数中的应用。所述待测绵羊具体可为阿勒泰羊。

本发明还保护所述分子标记或所述特异引物对在辅助筛选具有不同尾重系数的绵羊个体中的应用。所述绵羊具体可为阿勒泰羊。

本发明还保护所述分子标记或所述特异引物对在辅助比较同一群体中的不同待测绵羊个体的尾重系数中的应用。所述群体具体可为阿勒泰羊群体。

分子标记由于其拥有诸多优点，被广泛地应用与动、植辅助选择育种。发明人所在的实验室曾利用分子标记辅助选择技术结合传统育种方法成功培育中国美利奴多胎肉用品系，并于2007年获得国家科技进步二等奖。SNP作为一种新型的分子遗传标记，已倍受育种学家关注，是近年来育种领域的热点之一。本发明的发明人在前期高密度SNP芯片已发现数百个在脂尾与瘦尾绵羊品种间存在差异的SNP位点，其中含13个X染色体上SNP。本发明证实了绵羊X染色体59383635位点与脂肉兼用型绵羊品种的关联性，进而对采用该SNP进行分子辅助育种具有一定的理论研究和实践研究意义。阿勒泰羊、小尾寒羊、湖羊、中国美利奴羊和萨福克羊的臀尾表型存在较大差异，逐次等级分明，本发明首次证实，绵羊X染色体59383635位点的SNP在上述五个尾型极端差异的绵羊品种群体中差异极其显著。等位基因T在阿勒泰羊群体中处于绝对优势等位基因，并且随着臀尾表型分值的降低、等位基因T也随之降低，等位基因C在阿勒泰羊群体中的比率不足10%，而在萨福克羊群体中的比例却高达99.2%，随着表型分值增加而剧烈下降的趋势明显。以上数据提示该SNP与绵羊脂尾（臀）性状高度关联，模型数据进一步表明T/C比值与五个绵羊品种的尾型丰满度呈指数倍相关，T/C比值可以作为衡量脂尾型与瘦尾型绵羊品种的一个实用指标。本发明的实验结果表明，绵羊X染色体59383635位点在脂尾（臀）与瘦尾绵羊群体中分布存在较大差异，该SNP可作为一个理想的分子标记应用于低脂绵羊品种选育。

附图说明

图1为部分PCR扩增产物的电泳图。

图2为部分测序结果。

图3为T/C比值与尾（臀）表型相关性分析结果。

图4为部分PCR扩增产物SSCP电泳后的照片。

图5为X染色体59383635位置SNP所属序列与UCSC Genome Browser绵羊基因组比对图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。dNTPs：天根生化科技(北京)有限公司。10×PCR buffer、Taq酶：Fermentas公司。100bp间隔的marker：Takara公司。

待测样本分别为：226只阿勒泰羊（采自阿勒泰羊种群核心区阿勒泰富蕴县）、144只湖羊（采自江苏省泰州海伦羊业有限公司）、104只小尾寒羊、132只中国美利奴细毛羊（采自新疆紫泥泉绵羊种羊场）和60只黑头萨福克羊的耳组织或血液样本。阿勒泰羊属于脂臀型绵羊品种，臀尾较大，臀型丰满。小尾寒羊和湖羊属于短脂尾型绵羊品种，尾型丰满度适中。中国美利奴细毛羊与黑头萨福克羊属长瘦尾型绵羊品种，尾部脂肪含量极少，尾型丰满度较差。阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊分属我国三大粗毛羊中的哈萨克羊与蒙古羊的支系，中国美利奴细毛羊含大量澳洲美利奴羊血液，黑头萨福克羊完全属于引进品种，因此上述五个品种在地域间隔、品种形态和培育历史上都有较大差异，进行基因交流的可能性较小，有利于进行多态与性状的关联分析研究。

实施例1、特异引物对的设计与合成

基于大量序列比对、分析和预实验，设计特异引物对如下：

F（上游引物，序列表的序列1）：5’-AGGTAGGGAGATTATCCAGGGAG-3’；

R（下游引物，序列表的序列2）：5’-ACAGCAGGGTTCTCTGCTCAGAG-3’。

实施例2、应用特异引物对鉴定多态性与性状的关系

1、提取待测样本的基因组DNA，使用Nanodrop2000仪器检测DNA样品的纯度和浓度，选留OD260/OD280比值在1.7-1.9之间的DNA样品，加ddH₂O稀释至100ng/L，-20℃冷冻保存。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用实施例1设计的特异引物对进行PCR扩增。

PCR反应体系（25μL）：模板100ng，10×PCR buffer2.5μL，2.5mmol/L MgCl₂，150mol/L dNTPs，上游引物0.2pmol/L，下游引物0.2pmol/L，Taq DNA聚合酶2.5U，加ddH₂O至25μL。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，部分PCR扩增产物的电泳图见图1（M代表100bp间隔的marker，1至15分别代表不同的PCR扩增产物）。以各个待测样本的基因组DNA为模板均可成功地扩增出300bp左右的条带且条带均一。回收PCR扩增产物并进行测序，测序结果表明，以各个待测样本的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物均为327bp。某一个PCR扩增产物的测序结果见序列表的序列3。

PCR扩增产物中存在一个SNP位点（即PCR扩增产物自5’末端第133位核苷酸，X染色体59383635位点），基于该位点的SNP，所有实验羊分为三种情况：即TT基因型、CC基因型和TC基因型。阿勒泰羊、小尾寒羊、湖羊以及中国美利奴细毛羊群体均检测出三种基因型。黑头萨福克羊群体中缺少TT基因型，只检测出TC基因型和CC基因型。部分测序结果见图2：最上面的图为TT基因型，第14位的双等位基因序列一致，表现为“TT”纯合子；中间的图为TC基因型，第14位的测序峰图为“N”，表现为双峰“TC”杂合子；最下面的图为CC基因型，第14位的双等位基因序列一致，表现为“CC”纯合子。

采用卡方检验的方法分析各群体中基因型是否处于Hardy-weinberg平衡。根据尾臀脂肪含量（丰满度）将实验羊分为5个等级，建立T/C比值（T/C比值即等位基因T的频率与等位基因C的频率的比值）与绵羊尾（臀）表型相关性分析模型。其中黑头萨福克羊、中国美利奴细毛羊均属于长瘦尾型绵羊品种，尾型分值分别定为1和2；湖羊、小尾寒羊均属于短脂尾型绵羊品种，尾型分值分别定为3和4；阿勒泰羊属于臀脂型绵羊品种，尾型分值定为5，并采用SAS软件拟合模型函数。等位基因频率和基因型频率在绵羊中的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方检验的结果见表1。

表1等位基因频率和基因型频率在绵羊中的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方检验

注:数据单元格中，括号外的数据为频率，括号内的数据为个体数；*:P＜0.05(χ² _0.05=5.99)。

从表1的结果可以看到，在五个绵羊品种中长瘦尾型的中国美利奴羊细毛羊和黑头萨福克羊群体以CC基因型为主要基因型，黑头萨福克羊的CC基因型频率高达98.3%。脂尾型的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊同时检测到三种基因型，阿勒泰羊群体中TT基因型的比率高达83.2%，而CC基因型的比例仅为2.7%。尾型极端差异的黑头阿勒泰羊与萨福克羊群体中T与C等位基因的频率存在极端差异，T等位基因在黑头萨福克羊群体中的频率仅为0.008，而在阿勒泰羊群体中的频率高达0.903。卡方检验表明阿勒泰羊在该位点上处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05），表明阿勒泰羊形成受到选择、突变或迁移等因素的影响，这基本与当地农牧民对阿勒泰羊进行“胡交串配”以减少尾脂产量的这一事实相符。

T/C比值与尾（臀）表型相关性分析结果见图3。由图3可知，T/C比值与不同脂尾（臀）型绵羊品种呈强正相关性。尾型表型分值最低的萨福克羊的T/C比值仅为0.008，表型分值最高的阿勒泰羊的T/C比值则高达9.309，两群体该比率相差1164倍。采用SAS软件拟合模型数值，T/C比值与表型分值相关性模型接近于函数y=0.0055e^1.4829x（y为T/C比值，x为表型分值）。由图像可知，T/C比值与表型分值呈指数倍增长关系，表明随着表型分值的增加，T等位基因在该群体中的频率随之剧烈增加。

阿勒泰羊中各个基因型与尾重系数（所述尾重系数为尾重占胴体重的百分比）的关联分析见表2。TT基因型的羊的尾重系数大于TC基因型的羊，TC基因型的羊的尾重系数大于CC基因型的羊。

表2阿勒泰羊中基因型与尾重系数的关联分析

	TT基因型(188只)	TC基因型(32只)	CC基因型(6只)
				尾重系数(%)	15.43±1.87	14.38±O.32	12.97±1.19

4、取步骤2得到的PCR扩增产物，98℃变性10min后立即置于冰中，通过12%非变性聚丙烯酰胺凝胶在0.5×TBE条件下进行SSCP电泳（电压300V电泳5min，然后电压120V电泳12-15h），电泳结束后取下凝胶,进行固定、银染、显色并使用凝胶成像仪器拍照。部分PCR扩增产物SSCP电泳后的照片见图4，TT基因型显示相同带型、TC基因型显示相同带型、CC基因型显示相同带型，因此，在实际应用中可以采用SSCP电泳进行基因型分型，从而避免测序成本高、时间长的问题。

5、绵羊X染色体59383635位点的基因定位

将序列4使用UCSC Genome Browser数据库中Blast在线程序，与绵羊基因组进行比对，检索参数修改为：Base Position（dense），Blat Sequence（dense），RefSeqGenes（pack），Other RefSeq（pack），Sheep mRNAs（pack），Spliced ESTs（pack），Other mRNA（dense）。图5为X染色体59383635位置SNP所属序列与UCSC GenomeBrowser绵羊基因组比对图，图中黑色的Blat Sequence为所比对的150bp序列，其所在位置处于山羊EST所涵盖的基因组序列上，突变位点距离牛、人、猕猴、大鼠以及小鼠的PSMA1基因上游约75Kb，其附近区域未见NCBI收录的绵羊源参考基因和表达序列标签信息。比较基因组比对结果同时还显示人、猕猴、大鼠、小鼠和牛源Psma1基因高度保守，由于牛与绵羊的亲缘关系较近，大约200万年前才出现进化分支，其基因组同源性高达94%以上，据此推测该SNP可能位于绵羊源Psma1基因上游约75kb处。以上数据均提示绵羊X染色体59383635位置SNP可能位于新基因的内含子中或者Psma1基因的调控区域，这些位置均具有调控基因表达的潜能。

Claims

1.一种辅助鉴定待测绵羊群体为哪种脂尾性状的群体的方法，包括如下步骤：（1）从待测绵羊群体中随机抽取具有统计意义的待测样本；（2）检测所述待测样本中X染色体59383635位点的T/C比值；所述T/C比值为等位基因T的频率与等位基因C的频率的比值；所述X染色体59383635位点为以所述待测样本的基因组DNA为模板用特异引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物中自5’末端第133位核苷酸；所述特异引物对为序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成的引物对；（3）按照如下标准进行评判：如果T/C比值为5以上、待测绵羊群体为脂臀型群体，如果T/C比值为0.5以下、待测绵羊群体为瘦尾型群体，如果T/C比值为0.8-2之间、待测群体为短脂尾型群体。

2.绵羊脂尾性状的分子标记，为X染色体59383635位点，所述X染色体59383635位点为以所述待测样本的基因组DNA为模板用特异引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物中自5’末端第133位核苷酸；所述特异引物对为序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成的引物对。

3.序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成的特异引物对。

4.权利要求2所述分子标记或权利要求3所述特异引物对在辅助鉴定待测绵羊群体为哪种脂尾性状的群体中的应用。

5.权利要求2所述分子标记或权利要求3所述特异引物对在辅助筛选具有不同脂尾性状的绵羊群体中的应用。

6.权利要求2所述分子标记或权利要求3所述特异引物对在辅助比较不同绵羊群体的脂尾性状中的应用。

7.一种辅助比较属于同一群体的不同待测绵羊个体的尾重系数的方法，包括如下步骤：检测待测绵羊的X染色体59383635位点的基因型，TT基因型的待测绵羊的尾重系数大于TC基因型的待测绵羊，TC基因型的待测绵羊的尾重系数大于CC基因型的待测绵羊；所述尾重系数为尾重占胴体重的百分比；所述X染色体59383635位点为以所述待测样本的基因组DNA为模板用权利要求3所述特异引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物中自5’末端第133位核苷酸。

8.权利要求2所述分子标记或权利要求3所述特异引物对在辅助鉴定待测绵羊个体的尾重系数中的应用。

9.权利要求2所述分子标记或权利要求3所述特异引物对在辅助筛选具有不同尾重系数的绵羊个体中的应用。

10.权利要求2所述分子标记或权利要求3所述特异引物对在辅助比较同一群体中的不同待测绵羊个体的尾重系数中的应用。