CN107142324A

CN107142324A - 桑树est‑ssr分子标记及其核心引物组和应用

Info

Publication number: CN107142324A
Application number: CN201710486408.8A
Authority: CN
Inventors: 王振江; 唐翠明; 戴凡炜; 罗国庆; 肖更生; 邝哲师; 黄静; 李智毅
Original assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Current assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2017-09-08
Anticipated expiration: 2037-06-23
Also published as: CN107142324B

Abstract

本发明公开了桑树EST‑SSR分子标记及其核心引物组和应用。本发明通过对桑树进行转录组测序及序列信息处理，开发出了大量的SSR分子标记，从中筛选出了6组多态性标记，并建立了其符合SSR标记荧光检测的技术体系。通过对21个桑树品种的DNA进行扩增及检测，发现上述6组EST‑SSR分子标记引物扩增多态性丰富，重复性好，遗传多样性分析结果与形态学桑属植物分类相吻合，是稳定存在的新标记，可应用于桑树种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种。

Description

桑树EST-SSR分子标记及其核心引物组和应用

技术领域：

本发明属于分子标记技术开发及应用技术领域，具体涉及桑树EST-SSR分子标记及其核心引物组和应用。

背景技术：

桑树属于桑科(Moraceae)桑属(Morus L.)，是以收获桑叶养蚕为目的的多年生木本植物，是我国重要的经济作物之一。我国是桑树的重要起源中心之一，据统计，目前我国收集保存的桑树种质分属15个桑种3个变种，种质资源多达3000余份，是世界上桑树种质保存量最多的国家。经长期自然和人工选择，桑树种质资源具有丰富的遗传多样性，在种质收集保存与应用过程中，种质同名异物或同物异名的现象十分严重，严重阻碍了桑树种质资源的利用开发。

分子标记技术在植物种质资源遗传多样性和分子辅助育种研究中有着广泛的应用。其中简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)具有共显性、数量丰富、多态性高、重复性好、易检测、操作简单等优点，成为最常用的分子标记之一。EST-SSR标记可以从表达序列标签库或转录组测序数据中开发，但目前现有的桑树EST-SSR分子标记数量还不足以满足种质资源遗传多样性、种质鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等研究，限制了桑树的分子遗传学研究，更多的具有高多态性的EST-SSR标记需要开发，这对于遗传研究与育种实践等均具有重要的利用价值。

本发明基于目前桑树SSR标记数量稀少及利用率低等现状，通过对桑树进行转录组测序及序列信息处理，开发出了大量的SSR分子标记，并从中进行了多态性筛选，得到6个不同于前人的具有多态性的通用型标记，并将它们应用于桑树遗传多样性分析和种群分类中。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种桑树EST-SSR分子标记及其核心引物组和应用。

本发明的第一个目的是提供一种桑树EST-SSR分子标记，所述的EST-SSR分子标记包括MulSSR5053、MulSSR21564、MulSSR29921、MulSSR26947、MulSSR9949和MulSSR21747；

所述的MulSSR5053的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(重复基序为(AG)₆)；

所述的MulSSR21564的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(重复基序为(AT)₉)；

所述的MulSSR29921的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(重复基序为(GT)₈)；

所述的MulSSR26947的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(重复基序为(AT)₈)；

所述的MulSSR9949的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示(重复基序为(GGA)₅)；

所述的MulSSR21747的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(重复基序为(AG)₆)。

本发明的第二个目的是提供一种桑树EST-SSR分子标记核心引物组，包括6对EST-SSR分子标记核心引物对和通用M13引物：

引物对1：针对MulSSR5053：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTCCTTTATGATCTGGTGCTTCATT-3’(如SEQ ID NO.7所示)；R：5’-CGCCATTGATCTCTCACTACTTC-3’(如SEQ ID NO.8所示)；

引物对2：针对MulSSR21564：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTTGTAAAATAAATGAACGATGGCA-3’(如SEQ ID NO.9所示)；R：5’-TATACTTTAGGCTTCGTGTTCGC-3’(如SEQ ID NO.10所示)；

引物对3：针对MulSSR29921：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTCATACTGACGGGCCATATACATT-3’(如SEQ ID NO.11所示)；R：5’-TGGTAGACAGACAGGGAACAAAT-3’(如SEQ ID NO.12所示)；

引物对4：针对MulSSR26947：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTATTGGAGGAAACCCTTTTGAATA-3’(如SEQ ID NO.13所示)；R：5’-CGGGAAAAAGAAAGAGGTAAGAA-3’(如SEQ ID NO.14所示)；

引物对5：针对MulSSR9949：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTCACCATCACCGTGGAAGTAGTA-3’(如SEQ ID NO.15所示)；R：5’-GTTGGCGCAGTGGACTAGTAA-3’(如SEQ ID NO.16所示)；

引物对6：针对MulSSR21747：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTGCTGCATCCTATCCTTCTTTCTA-3’(如SEQ ID NO.17所示)；R：5’-TGAGGACTGACCATTGACAAATA-3’(如SEQ ID NO.18所示)；

通用M13引物：5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(如SEQ ID NO.19所示)，所述的通用M13引物的5’端标记有荧光报告基团。

所述的荧光报告基团优选为FAM、HEX、TAMRA或ROX。

本发明的第三个目的是提供一种桑树品种鉴定的方法，包括以下步骤：

提取待测样品基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用上述的桑树EST-SSR分子标记核心引物组进行PCR扩增反应，所述的PCR扩增反应包括3个PCR反应，具体如下：

I：以提取待测基因组DNA为模板，以针对MulSSR5053和MulSSR21564的上下游引物以及通用M13引物作为扩增引物，在同一个反应体系中进行多重PCR反应，得到扩增产物；

II：以提取待测基因组DNA为模板，以针对MulSSR29921和MulSSR26947的上下游引物以及通用M13引物作为扩增引物，在同一个反应体系中进行多重PCR反应，得到扩增产物；

III：以提取待测基因组DNA为模板，以针对MulSSR9949和MulSSR21747的上下游引物以及通用M13引物作为扩增引物，在同一个反应体系中进行多重PCR反应，得到扩增产物；

由此得到带有荧光报告基团的不同长度的扩增产物，再对带有荧光报告基团的不同长度的扩增产物进行分型，鉴定待测样品的品种。

本发明的第四个目的是提供桑树EST-SSR分子标记在桑树种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种中的应用。

本发明的第五个目的是提供桑树EST-SSR分子标记核心引物组在桑树种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种中的应用。

利用本发明中的6对桑树EST-SSR分子标记核心引物对对21个桑树品种进行了检测，结果表明，6对桑树EST-SSR分子标记核心引物对在该群体中具有丰富的多态性，种质分类结果与传统形态学分类方法结果一致，说明本发明中的6对微卫星标记的特异性引物能够用于桑树的遗传多样性、种群遗传结构分析、亲缘关系鉴定等研究。

本发明通过桑树转录组测序，开发出了大量的SSR分子标记，筛选出了6对多态性丰富的桑树EST-SSR核心引物对，并建立了其SSR标记荧光检测技术体系，用于桑树种质遗传多样性研究和种群遗传结构鉴定。这6对标记多态性好，扩增稳定，扩增结果清晰，重复性好，可应用于桑树的遗传多样性分析、遗传结构分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等研究。

附图说明：

图1为EST-SSR分子标记MulSSR5053核心引物扩增21个供试桑树品种基因组DNA的SSR分型图，其中S1为塘10(广东桑种)、S2为粤椹大10(广东桑种)、S3为湛1432(广东桑种)、S4为上山6(广东桑种)、S5为红选3(广东桑种)、S6为选25(广东桑种)、S7为选27(广东桑种)、S8为苗66(广东桑种)、S9为6301(广东桑种)、S10为果选04-88(广东桑种)、S11为果选04-93(广东桑种)、S12为台湾长果桑(长果桑种)、S13为西藏4号(蒙桑种)、S14为西藏1号(蒙桑种)、S15为西藏5号(蒙桑种)、S16为西藏3号(蒙桑种)、S17为古白4(白桑种)、S18为古白2(白桑种)、S19为古白9(白桑种)、S20为古白10(白桑种)、S21为古白8(白桑种)。

图2为EST-SSR分子标记MulSSR21564核心引物扩增21个供试桑树品种基因组DNA的SSR分型图，其中S1为塘10(广东桑种)、S2为粤椹大10(广东桑种)、S3为湛1432(广东桑种)、S4为上山6(广东桑种)、S5为红选3(广东桑种)、S6为选25(广东桑种)、S7为选27(广东桑种)、S8为苗66(广东桑种)、S9为6301(广东桑种)、S10为果选04-88(广东桑种)、S11为果选04-93(广东桑种)、S12为台湾长果桑(长果桑种)、S13为西藏4号(蒙桑种)、S14为西藏1号(蒙桑种)、S15为西藏5号(蒙桑种)、S16为西藏3号(蒙桑种)、S17为古白4(白桑种)、S18为古白2(白桑种)、S19为古白9(白桑种)、S20为古白10(白桑种)、S21为古白8(白桑种)。

图3为EST-SSR分子标记MulSSR29921核心引物扩增21个供试桑树品种基因组DNA的SSR分型图，其中S1为塘10(广东桑种)、S2为粤椹大10(广东桑种)、S3为湛1432(广东桑种)、S4为上山6(广东桑种)、S5为红选3(广东桑种)、S6为选25(广东桑种)、S7为选27(广东桑种)、S8为苗66(广东桑种)、S9为6301(广东桑种)、S10为果选04-88(广东桑种)、S11为果选04-93(广东桑种)、S12为台湾长果桑(长果桑种)、S13为西藏4号(蒙桑种)、S14为西藏1号(蒙桑种)、S15为西藏5号(蒙桑种)、S16为西藏3号(蒙桑种)、S17为古白4(白桑种)、S18为古白2(白桑种)、S19为古白9(白桑种)、S20为古白10(白桑种)、S21为古白8(白桑种)。

图4为EST-SSR分子标记MulSSR26947核心引物扩增21个供试桑树品种基因组DNA的SSR分型图，其中S1为塘10(广东桑种)、S2为粤椹大10(广东桑种)、S3为湛1432(广东桑种)、S4为上山6(广东桑种)、S5为红选3(广东桑种)、S6为选25(广东桑种)、S7为选27(广东桑种)、S8为苗66(广东桑种)、S9为6301(广东桑种)、S10为果选04-88(广东桑种)、S11为果选04-93(广东桑种)、S12为台湾长果桑(长果桑种)、S13为西藏4号(蒙桑种)、S14为西藏1号(蒙桑种)、S15为西藏5号(蒙桑种)、S16为西藏3号(蒙桑种)、S17为古白4(白桑种)、S18为古白2(白桑种)、S19为古白9(白桑种)、S20为古白10(白桑种)、S21为古白8(白桑种)。

图5为EST-SSR分子标记MulSSR9949核心引物扩增21个供试桑树品种基因组DNA的SSR分型图，其中S1为塘10(广东桑种)、S2为粤椹大10(广东桑种)、S3为湛1432(广东桑种)、S4为上山6(广东桑种)、S5为红选3(广东桑种)、S6为选25(广东桑种)、S7为选27(广东桑种)、S8为苗66(广东桑种)、S9为6301(广东桑种)、S10为果选04-88(广东桑种)、S11为果选04-93(广东桑种)、S12为台湾长果桑(长果桑种)、S13为西藏4号(蒙桑种)、S14为西藏1号(蒙桑种)、S15为西藏5号(蒙桑种)、S16为西藏3号(蒙桑种)、S17为古白4(白桑种)、S18为古白2(白桑种)、S19为古白9(白桑种)、S20为古白10(白桑种)、S21为古白8(白桑种)。

图6为EST-SSR分子标记MulSSR21747核心引物扩增21个供试桑树品种基因组DNA的SSR分型图，其中S1为塘10(广东桑种)、S2为粤椹大10(广东桑种)、S3为湛1432(广东桑种)、S4为上山6(广东桑种)、S5为红选3(广东桑种)、S6为选25(广东桑种)、S7为选27(广东桑种)、S8为苗66(广东桑种)、S9为6301(广东桑种)、S10为果选04-88(广东桑种)、S11为果选04-93(广东桑种)、S12为台湾长果桑(长果桑种)、S13为西藏4号(蒙桑种)、S14为西藏1号(蒙桑种)、S15为西藏5号(蒙桑种)、S16为西藏3号(蒙桑种)、S17为古白4(白桑种)、S18为古白2(白桑种)、S19为古白9(白桑种)、S20为古白10(白桑种)、S21为古白8(白桑种)。

图7为基于筛选出的6对EST-SSR分子标记核心引物对在21个供试桑树品种检测结果的聚类分析图，其中S1为塘10(广东桑种)、S2为粤椹大10(广东桑种)、S3为湛1432(广东桑种)、S4为上山6(广东桑种)、S5为红选3(广东桑种)、S6为选25(广东桑种)、S7为选27(广东桑种)、S8为苗66(广东桑种)、S9为6301(广东桑种)、S10为果选04-88(广东桑种)、S11为果选04-93(广东桑种)、S12为台湾长果桑(长果桑种)、S13为西藏4号(蒙桑种)、S14为西藏1号(蒙桑种)、S15为西藏5号(蒙桑种)、S16为西藏3号(蒙桑种)、S17为古白4(白桑种)、S18为古白2(白桑种)、S19为古白9(白桑种)、S20为古白10(白桑种)、S21为古白8(白桑种)。

具体实施方式：

以下将结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例中所用植物材料如下：共21份桑树种质，其中广东桑种品种11份为塘10、粤椹大10、湛1432、上山6、红选3、选25、选27、苗66、6301、果选04-88、果选04-93；长果桑种品种1份为台湾长果桑；蒙桑种品种4份为西藏4号、西藏1号、西藏5号、西藏3号；白桑种品种5份为古白4、古白2、古白9、古白10、古白8。

实施例1：基于桑树转录组序列的EST-SSR核心引物组的开发

1、桑树转录组序列中EST-SSR引物设计与合成

利用MISA软件对桑树转录组数据库桑树unigenes中的所有SSR位点进行检索，检索的SSR基序重复单元长度为2～6个核苷酸，分别设置2个、3个、4个、5个、6个核苷酸的最少搜索重复次数为6、5、5、4、4次，且SSR位点侧翼序列的长度≥150bp，根据搜索到的SSR位点及侧翼序列用Primer3v2.3.4(http://primer3.sourcego-rge.net)软件设计特异性引物，设计标准为：引物长度为18-25bp，退火温度为57-63℃，GC含量为40-70％，PCR产物的长度为100-300bp，选取能与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对的SSR位点合成出100对引物，每对引物由一个上游引物F和一个下游引物R组成。

2、桑树DNA提取

采取改良的CTAB法提取上述21个桑树品种植物叶的DNA，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，紫外分光光度计定量后稀释到50ng/μL，-20℃保存备用，具体步骤如下：

(1)配制2％的CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammoniumbromide)缓冲液和1×TE缓冲液；2％的CTAB提取缓冲液的配方为：0.02g/mL CTAB，0.1MTris，20mM EDTA和1.4M NaCl；1×TE缓冲液的配方为：10mM Tris和1mM EDTA，pH8.0；

(2)将1g植物叶(尽量选取幼嫩叶片)放入研钵中，液氮研磨至粉末；

(3)将研磨后的材料加入10mL离心管中，加入4mL 2％的CTAB提取缓冲液和80μLβ-巯基乙醇(已在65℃中预热)混匀后65℃水浴45min，中间混匀3～4次；

(4)加入1mL 5M KAc，冰浴20min；

(5)加入4mL氯仿：异戊醇(V/V 24:1)，轻柔混匀乳化10min；

(6)室温下12000rpm离心10min，离心后将上清液转移至一新的10mL离心管中；

(7)取上清液并加入1/10～1/5体积的3M NaAc(pH 5.2)翻转混匀，加入等体积的异丙醇，混匀至出现DNA沉淀；

(8)12000rpm，4℃，离心10min，弃上清；沉淀中加入1mL 75％乙醇漂洗3～4次，并用无水乙醇漂洗1次；

(9)DNA沉淀，晾干，加入100μL含10μg/mL RNase A的1×TE缓冲液溶解沉淀，37℃水浴1h以降解RNA；

(10)用电泳法检测质量，用分光光度计法检测DNA浓度，调节DNA浓度为50ng/μL，保存于-20℃。

3、PCR扩增

以步骤2提取的桑树基因组DNA为模版，采用利用SSR荧光标记检测技术TP-M13-SSR进行PCR扩增，引物包括三条引物分别为针对EST-SSR分子标记设计的上游引物和下游引物以及一个5’端标记有荧光报告基团(荧光报告基团为FAM、HEX、TAMRA或ROX，本实施例中使用的为FAM)的通用M13引物(如SEQ ID NO.19所示)，上述的上游引物为在步骤1设计合成的上游引物的5’端拼接有5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(M13)，下游引物为步骤1合成的下游引物。拼接有“M13”的上游引物扩增后，为通用M13引物提供了反向互补序列，通用M13引物引导的PCR扩增产生带有荧光的PCR产物。

PCR反应体系为：50ng/μL DNA模板0.5μL，10×PCR buffer(without Mg²⁺)2.5μL，25mMMgCl₂ 2.0μL，10mM dNTPs 0.5μL，5U/μL Tap DNA聚合酶0.2μL，10μM上游引物0.1μL，10μM下游引物0.5μL，10μM通用M13引物0.4μL，ddH₂O 18.3μL，反应体系共25μL。

PCR反应条件采用“Touchdown”的策略，条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃(每个循环降1℃)退火30s，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min，得到扩增产物。

4、凝胶电泳检测

取2.5μL上述步骤3得到的扩增产物，加入1.5μL Loading Buffer混匀上样，2％的琼脂糖凝胶电泳25min后进行检测，筛选有扩增条带的产物用于测序分型。

5、多态性引物的筛选

将上述步骤4筛选到有扩增产物条带的产物稀释到0.5ng以内，取0.5μL至含有liz500的Hidi中，用3730XL DNA测序仪(ABI，USA)进行分型，分型结果用GeneMarker(softGeneticsLLC，USA)进行条带判别。上述步骤1合成的100对引物中共筛选出32对多态性引物，进一步在所有桑树品种中筛选出多态性高、扩增带型单一的6对核心引物，每对核心引物由一个上游引物和一个下游引物组成。筛选出的6对引物按照扩增产物的大小进行分组组合，用于多重PCR检测，进一步降低大规模检测的时间和经济成本。6对EST-SSR核心引物对如表1所示：

表1 用于桑树品种鉴定的6对EST-SSR核心引物对

实施例2：桑树EST-SSR核心引物组的应用

1、提取DNA

采取改良的CTAB法提取上述21个桑树品种(包括11份广东桑品种、5份白桑种质、4份蒙桑种质和1份长果桑种质)基因组的DNA；具体步骤同实施例1步骤2。

2、PCR扩增

以步骤1提取的DNA为模版，用实施例1开发的6对EST-SSR核心引物(见表1)，按照表1组合分为3组，进行多重PCR。

3组EST-SSR分子标记核心引物组PCR反应体系具体为：

反应体系I：50ng/μL DNA模板0.5μL，10×PCR buffer(without Mg²⁺)2.5μL，25mMMgCl₂ 2.0μL，10mM dNTPs 0.5μL，5U/μL Tap DNA聚合酶0.2μL，10μM MulSSR5053上游引物0.1μL，10μM MulSSR5053下游引物0.5μL，10μM MulSSR21564上游引物0.1μL，10μMMulSSR21564下游引物0.5μL，10μM通用M13引物0.4μL，ddH₂O 17.7μL，反应体系共25μL。

反应体系II：50ng/μL DNA模板0.5μL，10×PCR buffer(without Mg²⁺)2.5μL，25mMMgCl₂ 2.0μL，10mM dNTPs 0.5μL，5U/μL Tap DNA聚合酶0.2μL，10μM MulSSR29921上游引物0.1μL，10μM MulSSR29921下游引物0.5μL，10μM MulSSR26947上游引物0.1μL，10μMMulSSR26947下游引物0.5μL，10μM通用M13引物0.4μL，ddH₂O 17.7μL，反应体系共25μL。

反应体系III：50ng/μL DNA模板0.5μL，10×PCR buffer(without Mg²⁺)2.5μL，25mMMgCl₂ 2.0μL，10mM dNTPs 0.5μL，5U/μL Tap DNA聚合酶0.2μL，10μM MulSSR9949上游引物0.1μL，10μM MulSSR9949下游引物0.5μL，10μM MulSSR21747上游引物0.1μL，10μMMulSSR21747下游引物0.5μL，10μM通用M13引物0.4μL，ddH₂O 17.7μL，反应体系共25μL。

反应体系I、II和III的通用M13引物均为5’端标记有荧光报告基团FAM的通用M13引物(如SEQ ID NO.19所示)。

PCR反应程序采用“Touchdown”的策略，条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃(每个循环降1℃)退火30s，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min，最终得到带有荧光报告基团的不同长度的PCR扩增产物。

3、检测分析

PCR扩增产物用3730XL DNA测序仪(ABI，USA)进行分型，具体步骤同实施例1，检测结果用NTsys 2.10e软件进行聚类分析，结果见图7。分析结果表明这6对EST-SSR核心引物在上述21个不同基因型供试桑树品种上表现多态性(图1～图6分别是MulSSR5053、MulSSR21564、MulSSR29921、MulSSR26947、MulSSR9949和MulSSR21747核心引物扩增21个供试桑树品种基因组DNA的SSR分型图)。聚类分析结果表明：用这6对EST-SSR分子标记核心引物对可以将21个桑树品种区分开来，并将上述21个桑树品种材料在遗传距离0.74处分为4大类，第I类包含11份桑树品种，全部为广东桑桑种；第II类包含5份桑树品种，全部为白桑桑种；第III类包含4份桑树品种，全部为蒙桑桑种；第IV类包含1份桑树品种，为长果桑桑种，聚类分析结果与经典的形态学分类结果相符，这说明这6对引物可以用于桑树种质资源遗传多样性分析和亲缘关系研究中，可作为育种和资源评价的主要依据。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

需要特别说明的是，以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所

<120> 桑树EST-SSR分子标记及其核心引物组和应用

<160> 19

<210> 1

<211> 119

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 1

cctttatgat ctggtgcttc attttaatca atcttaggca gagaaattct gataatcaga 60

gattttgttt gtagtactca agagagagag agatcagaag tagtgagaga tcaatggcg 119

<210> 2

<211> 152

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 2

tgtaaaataa atgaacgatg gcaatacggg atactttcct gccaaatgag gtagacataa 60

tatatatata tatatatttc aagagggttg gtaatcctag aattgacatc aattactagg 120

tcgatatttg cgaacacgaa gcctaaagta ta 152

<210> 3

<211> 150

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 3

catactgacg ggccatatac attggatgtc tcgtgtgtgt gtgtgtgttt atttgtgaag 60

ccacgtgtat ggtcaaaaat gtcatctcta gaatactctt acctatcctt cacctttttg 120

ttctactatt tgttccctgt ctgtctacca 150

<210> 4

<211> 142

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 4

attggaggaa acccttttga ataaggattt atcttaggat aagattagtg gttcgttcca 60

taaatatata tatatatatt ttttggttgt acttatgttt tacatctttc gagcataatt 120

tcttacctct ttctttttcc cg 142

<210> 5

<211> 150

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 5

caccatcacc gtggaagtag taattcctca cgtccatggc cgggatttac tacttccaag 60

gcgttgggac tgggaggagg aggaggaagc ggcggctcga gcttcggcga cgccaattgc 120

atggaacagt tactagtcca ctgcgccaac 150

<210> 6

<211> 120

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 6

gctgcatcct atccttcttt ctaacaaaag aggagatgag tttttagaga gacaatatag 60

agaaagacag atagagaaag agagagagag aatgacctat ttgtcaatgg tcagtcctca 120

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 7

gtaaaacgac ggccagtcct ttatgatctg gtgcttcatt 40

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 8

cgccattgat ctctcactac ttc 23

<210> 9

<211>

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 9

gtaaaacgac ggccagttgt aaaataaatg aacgatggca 40

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 10

tatactttag gcttcgtgtt cgc 23

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 11

gtaaaacgac ggccagtcat actgacgggc catatacatt 40

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 12

tggtagacag acagggaaca aat 23

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 13

gtaaaacgac ggccagtatt ggaggaaacc cttttgaata 40

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 14

cgggaaaaag aaagaggtaa gaa 23

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 15

gtaaaacgac ggccagtcac catcaccgtg gaagtagta 39

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 16

gttggcgcag tggactagta a 21

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 17

gtaaaacgac ggccagtgct gcatcctatc cttctttcta 40

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 18

tgaggactga ccattgacaa ata 23

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 桑树

<400> 19

gtaaaacgac ggccagt 17

Claims

1.一种桑树EST-SSR分子标记，其特征在于，所述的EST-SSR分子标记包括MulSSR5053、MulSSR21564、MulSSR29921、MulSSR26947、MulSSR9949和MulSSR21747；

所述的MulSSR5053的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的MulSSR21564的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的MulSSR29921的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述的MulSSR26947的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的MulSSR9949的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的MulSSR21747的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种桑树EST-SSR分子标记核心引物组，其特征在于，包括6对EST-SSR分子标记核心引物对和通用M13引物：

引物对1：针对MulSSR5053：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTCCTTTATGATCTGGTGCTTCATT-3’；

R：5’-CGCCATTGATCTCTCACTACTTC-3’；

引物对2：针对MulSSR21564：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTTGTAAAATAAATGAACGATGGCA-3’；

R：5’-TATACTTTAGGCTTCGTGTTCGC-3’；

引物对3：针对MulSSR29921：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTCATACTGACGGGCCATATACATT-3’；

R：5’-TGGTAGACAGACAGGGAACAAAT-3’；

引物对4：针对MulSSR26947：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTATTGGAGGAAACCCTTTTGAATA-3’；

R：5’-CGGGAAAAAGAAAGAGGTAAGAA-3’；

引物对5：针对MulSSR9949：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTCACCATCACCGTGGAAGTAGTA-3’；

R：5’-GTTGGCGCAGTGGACTAGTAA-3’；

引物对6：针对MulSSR21747：

F：5’-GTAAAACGACGGCCAGTGCTGCATCCTATCCTTCTTTCTA-3’；

R：5’-TGAGGACTGACCATTGACAAATA-3’；

通用M13引物：5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’，所述的通用M13引物的5’端标记有荧光报告基团。

3.根据权利要求2所述的桑树EST-SSR分子标记核心引物组，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、TAMRA或ROX。

4.一种桑树品种鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测样品基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用权利要求2所述的桑树EST-SSR分子标记核心引物组进行PCR扩增反应，所述的PCR扩增反应包括3个PCR反应，具体如下：

5.权利要求1所述的桑树EST-SSR分子标记在桑树种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种中的应用。

6.权利要求2所述的桑树EST-SSR分子标记核心引物组在桑树种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种中的应用。